Plaanid puhkusele minna? Võta endale majutus AirBnb kaudu ja saad 37€ kontoraha Tee konto Sulge
Facebook Like

Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid (0)

1 Hindamata
Punktid

Esitatud küsimused

  • Miks on nii vähe 54-sõltuvaid promootoreid ?
  • Mis võimaldab valgul jääda membraani koostisesse ?
  • Mis põhjustab promootori äratundmise ES poolt ?
  • Mis võiks olla ajutise mutaatorfenotüübi põhjuseks statsionaarse faasi rakkudes ?
 
Säutsu twitteris

1. Sissejuhatus

Metaboolne ja geneetiline regulatsioon bakterites


Bakterirakkude efektiivseks kasvuks on vaja, et kõiki raku põhilisi ehitusblokke ja nendeks vajalikke makromolekule produtseeritaks õiges vahekorras. Selleks, et sünteesi lõpp-produktide kontsentratsioon rakus liiga kõrgele ei tõuseks, on rakus välja kujunenud kaks kontrollmehhanismi:
  • Ensüümiaktiivsuse tagasisidestuslik inhibitsioon (feedback inhibition)metaboolne regulatsioon
  • Ensüümi sünteesi repressioon – geneetiline regulatsioon
    Tagasisidestusliku inhibitsiooni tulemusena inhibeeritakse rakus juba olemasoleva ensüümi aktiivsus reaktsiooni lõpp- produkti poolt. Inhibitsiooni võib esile kutsuda ka teatav metabolismiraja vaheprodukt. Geneetilise repressiooni korral inhibeerib tavaliselt lõpp- produkt metabolismiraja esimese ensüümi sünteesi vastava geeni avaldumise pärssimise kaudu. Metaboolne regulatsioon tagasisidestusliku inhibitsiooni kaudu ja geneetiline regulatsioon ensüümi sünteesi repressiooni kaudu võivad toimuda kombineeritult.. Selline kombinatoorika on väga oluline olukorras, kus tegemist on metaboolsete radade hargnemisega. Seda eriti just siis, kui raja hargnemisel katalüüsivad reaktsioone isoensüümid. Isoensüümid võivad erineda üksteisest selle poolest, millised lõpp- produktid nende aktiivsust inhibeerivad või nende sünteesi represseerivad.
    Bakterid on ainuraksed organismid ning puutuvad seetõttu väliskeskkonnaga vahetult kokku. Bakterite geeniregulatsioon on väga operatiivne, võimaldades kiireid ümberlülitusi rakkude metabolismis ja füsioloogilises seisundis. Kui teatavate geenide produkte pole rakkude kasvuks vaja, siis toimub vastavate geenide väljalülitamine, vajaduse korral lülitatakse aga kiiresti tööle need geenid , mille produkte rakk antud olukorras vajab. Selline regulatsioon geenide sisse-välja lülitamise kaudu on rakule ökonoomne ning võimaldab bakteritel optimaalsete kasvutingimuste korral väga kiiresti paljuneda.
    Geenide avaldumine prokarüootsetes rakkudes on mitmetasandiline, toimudes nii transkriptsiooni, mRNA metabolismi (mRNA-de protsessing ja degradatsioon ), translatsiooni kui ka valkude translatsioonijärgse aktiivsuse regulatsiooni kaudu. Enamus regulatoorseid mehhanisme toimivad siiski transkriptsiooni tasemel. Regulatsioon transkriptsiooni tasemel võib toimuda vastusena keskkonna muutunud signaalidele geenide kiire sisse või välja lülitamise kaudu. Osade geenide puhul toimub nende regulatsioon kaskaadselt, mis seisneb selles, et järgmine rühm geene lülitatakse sisse või välja alles siis, kui on sisse või välja lülitatud eelmine rühm geene. Sellist regulatsioonitüüpi on kirjeldatud detailselt näiteks bakterite sporulatsiooni korral ja bakteriofaagide puhul nende bakterirakus paljunemisel ja morfogeneesis.

    Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid


    Rakkude kasvamine on kompleksne protsess, mille realiseerumiseks peavad toimuma järgmised sündmused:
  • Toitainete sisenemine rakku
  • Rakku sisenenud toitainete konverteerimine energiaks ja rakukomponentideks
  • Kromosoomi replikatsioon
  • Raku suuruse ja massi suurenemine
  • Raku jagunemine tütarrakkudeks, millest mõlemad sisaldavad koopia genoomist ja mis on identsed ka teiste eluliste komponentide poolest.
    Rakkude kasvu tulemusena rakupopulatsioon suureneb. Ideaalsetes tingimustes, kus kasvuks vajalikke toitaineid jagub piisavalt, suureneb rakkude arv populatsioonis eksponentsiaalselt. Sel juhul on iga individuaalse raku generatsiooniaeg (aeg, mille tagant toimub raku pooldumine ) minimaalne. Bakteri E. coli puhul kestab see ligikaudu 20 minutit.
    Rakkude füsioloogiline seisund kajastub nendes toimuva makromolekulide biosünteesi kiiruses ja rakkude suuruses. Kui toitaineid on kasvukeskkonnas rikkalikult, toimub rakkudes aktiivne valgusüntees. Sellised rakud on suuremad, nad sisaldavad rohkem ribosoome ning neis toimub ka aktiivne DNA replikatsioon ja transkriptsioon . Mida rikkalikumalt on keskkonnas rakkudele kasvuks vajalikke komponente, seda vähem kulub energiat nende ühendite de novo sünteesiks ning seda efektiivsemalt saavad rakud paljuneda.
    Reaalses elus on bakterite eksponentsiaalne kasvufaas suhteliselt lühiajaline. Kui rakkude kasvukeskkonnas on toitaineid, eristatakse kasvus :
  • lag faasi, mille käigus rakud kohastuvad kasvukeskkonnaga ja hakkavad jagunema
  • log e. eksponentsiaalset faasi, milles rakkude arv populatsioonis kasvab eksponentsiaalselt
  • statsionaarset faasi, kus rakkude arv populatsioonis on maksimaalne ja ei muutu.

    Stress


    Üldiselt mõeldakse stressi põhjustavate faktorite all kõiki keskkonnamuutusi, mis kutsuvad esile muutusi raku füsioloogilises seisundis. Tegelikult on kõige raskem defineerida olukorda, kus rakud ei ole stressis . Pigem on suvalistel kasvutingimustel rakkudele mingit stressi põhjustav toime ja rakud adapteeruvad antud tingimustega. Teatava stressi süvenemisel toimuvad rakus nii kvalitatiivsed muutused, kus lülitatakse tööle uued süsteemid, kui ka kvantitatiivsed muutused, mille käigus muutuvad juba töös olevate süsteemide ekspressioonitasemed. Sageli võidakse stressivastusena võimendada nende ensüümide ekspressioonitaset, mis töötavad ka n. ö. normaalsetes tingimustes. Küsimus, mis on normaalne, varieerub organismiti.
    Bakterite kohanemine ekstreemsete kasvutingimustega võib olla kas lühiajaline või pikaajaline. Pikaajalise adapteerumise puhul leiavad populatsioonis aset evolutsioonilised muutused. Selle tagajärjel kohaneb grupp organisme eluks antud keskkonnatingimustel, paljunedes neis tingimustes maksimaalse kiirusega. Lühiajaline adapteerumine võib kesta minuteid, tunde või päevi ja muutused, mis sel juhul rakkudes toimuvad, võimaldavad bakteritel antud stressitingimused üle elada. Sel juhul on rakkude kasv enamasti kas peatunud või aeglustunud.
    Stressiga kohanemisel toimuvad füsioloogilised muutused ning muutused geenide ekspressiooni tasemes
    Esmane stressivastus seisneb selles, et toimuvad muutused teatavate biokeemiliste süsteemide ekspressioonitasemes. Muutub geenide transkriptsioonitase, tööle võidakse lülitada ka seni vaikivaid geene. Kui esialgsetest muutustest stressiga toimetulekuks ei piisa, toimuvad raku metabolismis juba globaalsemad ümberkorraldused. Sel juhul esineb kattuvus teiste stressifaktorite poolt stimuleeritud regulatoorsete ümberkorraldustega. Rakus tõuseb universaalsete stressivalkude ekspressioonitase. Suvaline stress , mis mõjutab rakkude kasvukiirust, kutsub esile globaalsed ümberkorraldused biokeemiliste süsteemide aktiivsuses, mis seostuvad rakkude kasvu aeglustumisega või peatumisega.
    Järk-järgulised muutused metaboolsete süsteemide aktiivsuses leiavad aset sõltuvalt sellest, milline on raku varustatus biosünteesiradade lõpp-produktidega. Rikkas kasvukeskkonnas, kus vastavad komponendid on juba valmis kujul olemas, on biosünteetiliste ensüümide ekspressioonitase rakus võrreldes vaese kasvukeskkonnaga vähemalt 10 korda alla surutud. Regulatsioon toimub nii struktuurgeenide transkriptsiooni tasemel (repressioon, attenuatsioon) kui ka biosünteetiliste ensüümide tagasisidestusliku inhibeerimise kaudu. Juhul, kui suvaline komponent keskkonnast ammendub, katkeb koheselt tagasisidestuslik inhibitsioon. Kui sellest ei piisa, tõuseb vastava biosünteesiraja struktuurgeenide transkriptsioonitase. Kui ka sellest ei piisa, vallandub rakus nn. “stringent response”, mille tulemusena toimuvad geenide ekspressioonitasemes globaalsed ümberkorraldused.
    Raku seisukohalt on oluline, et kõik rakusisesed protsessid toimuksid antud tingimustel optimaalsel tasemel. Kuigi üks ja sama stressistiimul on võimeline mõjutama korraga paljude erinevate geenide ekspressioonitaset, täheldatakse antud stimuloni kuuluvate geenide avaldumises hierarhiat. Hierarhia on tagatud reguleeritavate geenide transkriptsiooni kontrollivate regulaatorvalkude seondumissaitide erineva afiinsuse kaudu.
    Stressi tunnetamiseks on mitmeid viise. Valdavaks viisiks on spetsiifilise efektorvalgu aktiivsuse muutmine selle fosforüleerimise/defosforüleerimise kaudu. Sageli vallandub signaali ülekanne kahekomponendiliste regulaatorsüsteemide kaudu. Esmane sensorvalk seondub kas väikese efektormolekuliga või tunnetab muutusi füüsikalistes parameetrites nagu näiteks pH või temperatuur.
    Alarmoonid on väikesed molekulid, mida rakk sünteesib vastusena muutustele keskkonnatingimustes. Näitena võib tuua cAMP , ppGpp ja AppppA sünteesi või siis K-glutamaadi akumuleerumise tsütoplasmasse vastusena osmootsele stressile. Kuna alarmoonid sünteesitakse tsütoplasmas, peavad signaalid väliskeskkonna muutustest eelnevalt sinna jõudma. Spetsiaalseid vaheülekandjaid pole signaali rakkutoomiseks vaja ainult siis, kui signaalmolekulid läbivad rakumembraani vabalt (näiteks superoksiidi ioonid või nõrgad orgaanilised happed ) või kui stressi põhjustav füüsikaline tegur toimib raku sisemistele komponentidele otseselt (näiteks temperatuuri tõus mõjutab otseselt tsütoplasma valkude aktiivsust ja konformatsiooni).

    2. Transkriptsiooni initsiatsiooni kontroll bakterites


    RNA polümeraas
    Geenide avaldumist kontrollitakse esmalt RNA sünteesi e. transkriptsiooni tasemel. Transkriptsiooni algatab ja viib läbi DNA-st sõltuv RNA polümeraas, mis on enamasti multimeerne ensüüm. Monomeerseid RNA polümeraase on kirjeldatud lüütilistel bakteriofaagidel (näit. T7, T3, SP6). Enamasti on nende suurus üle 100 kDa. Transkriptsiooni initsiatsioonil tunnevad nad ära väga spetsiifilisi DNA järjestusi ning ei vaja aktivatsioonil lisafaktoreid. Monomeersed RNA polümeraasid on 5-10 korda kiiremad, nad sünteesivad 200 nt/sek (bakteri RNA polümeraas sünteesib 40 nt/sek). Erinevalt bakteriaalsetest RNA polümeraasidest ei ole nad Zn-metalloensüümid. Tänu efektiivsusele ja spetsiifilisusele on monomeersed ensüümid leidnud rakendust nii rekombinantse DNA tehnoloogias kui ka RNA produtseerimises in vitro .
    Komplekssed , multimeersed RNA polümeraasid on kirjeldatud bakteritel, kuid nad on lihtsamad kui eukarüootidel. Eubakterite RNA polümeraasi holoensüüm koosneb viiest subühikust - α2ßß‘ + σ. Arhebakterite ensüüm on keerulisem, enam sarnane eukarüootide polümeraasidele.
    Arhede RNA polümeraas sisaldab üle 10 subühiku. Need subühikud sarnanevad RNA pol II ja RNA pol III subühikutega. Arhede RNA polümeraas ei seostu E. coli promootoritele. RNA polümeraasi seondumiseks promootorile ja transkriptsiooni initsiatsiooniks on alati vajalikud lisafaktorid. Osa transkriptsioonifaktoreid (TF) on homoloogsed eukarüootsete basaalsete TF-dega (TBP, TFIIB ).
    Arhede promootorite konsensusjärjestused on leitud 80 geeni põhjal.
    TTTA(A/T)T – boxA, positsioonides -32 kuni -25 = euk. TATA box
    väga tugevalt konserveerunud
    (A/T)TG(A/C) – boxB, kattub transkriptsiooni stardisaidiga
    Eubakterite RNA polümeraas, suurusega 480 kDa, koosneb viiest subühikust.
    α2ßß‘ - apoensüüm - koosneb neljast subühikust ja on võimeline katalüüsima RNA sünteesi. Apoensüümi subühikud on erinevates organismides struktuurselt lähedased.
    α - apoensüümi assambleerumine (N-terminus) ja interaktsioon TF-dega või promootori UP- elemendiga (C-terminus)
    ß - katalüüsib RNA sünteesi
    ß‘ - seondumine DNA matriitsahelaga.
    Holoensüümi koosseisu kuulub ka σ faktor. σ faktor on vajalik RNA polümeraasi spetsiifiliseks seondumiseks promootoralale ja transkriptsiooni avatud kompleksi moodustumiseks. Pärast esimese 10 nukleotiidi sünteesi (abortiivne transkriptsioon) vabaneb σ faktor multiensüümkompleksist ning RNA polümeraas on võimeline DNA-l edasi liikuma. Toimub RNA ahela elongatsioon .
    Lisaks eelpool mainitud subühikutele on osades artiklites mainitud, et RNA polümeraasi koostisesse kuulub veel kuues subühik – ω, mis on oma funktsioonilt shaperonivalk ja aitab RNA polümeraasil assambleeruda. Selle subühiku puudumine ei mõjuta RNA polümeraasi aktiivsust.
    RNA polümeraasi subühikud on eraldivõttes inaktiivsed. Ainult ß‘on võimeline DNA-ga mittespetsiifiliselt seonduma. Seetõttu seondub ka RNA polümeraasi apoensüüm DNA-ga mittespetsiifiliselt. σ faktori lisandumisel toimub RNA polümeraasi spetsiifiline seondumine promootoralale ligikaudu 1000 korda kõrgema efektiivsusega. Sageli on transkriptsiooni initsiatsiooniks vajalik ka spetsiifiliste TF-de olemasolu.
    Lisaks TF-dele toimub transkriptsiooni regulatsioon ka erinevate σ faktorite kaudu. σ70 on vajalik bakterile eluliselt tähtsate geenide, nn. “house keeping” geenide avaldumiseks eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes. Seetõttu nimetatakse seda põhiliseks σ faktoriks. Bakteris Escherichia coli on põhiliseks σ faktoriks σ70, Bacillus ’es σ43. Stressitingimustes (näit. temperatuuri tõus kasvukeskkonnas, toitainete nälg, oksüdatiivne stress) lülitatakse tööle geenid, mille promootoreid tunnevad ära alternatiivsed σ faktorid . σ faktorite tähistamisel kasutati algul indeksit, mis iseloomustas vastava valgu liikuvust SDS geelis. Paljud σ faktorid liikusid aga anomaalselt ning sellepärast hakati indeksina kasutama arvestuslikku molekulmassi kDa-nites, mis tuletati geeni pikkusest. Näit. Bacillus subtilise σ43 algne tähis oli σ55. Bacilluse puhul jäädi ka selle nomenklatuuriga hätta, kuna mitmete faktorite molekulass oli ligikaudu 30 kDa. Seetõttu võeti kasutusele tähestik. Viimasel ajal on σ43 asemel kasutusel tähis σA.
    Bakteris E. coli on teada 7 erinevat sigma faktorit Alternatiivsed σ faktorid bakteris E. coli teatud geenirühmade avaldumist:
    σ32 , σE - kuumashoki ( heat shock ) geenid; σE aktiveerub vastusena valkude denaturatsioonile
    periplasmas
    σS - statsionaarne faasi ja oksüdatiivse stressi geenid
    σ54 - N- metabolism , dikarboksüülhapete transport, pilide süntees, tolueeni/ksüleeni katabolism
    σF - viburite süntees
    fecI – Fe-tsitraadi transportsüsteemi regulaator
    Osades graam-negatiivsetes bakterites, näiteks perekonda Pseudomonas kuuluvates bakterites on kirjeldatud ligikaudu 20 erinevat sigma faktorit.
    Bacillus subtilis’el on 9 σ faktorit: σA, σB, σC, σD on seotud vegetatiivse kasvuga; σE, σF, σG, σH, σK aga sporulatsiooniga. Nende faktorite avaldumine on kaskaadselt reguleeritud.
    Oma toime iseloomult ja järjestuse homoloogialt jaotub enamus σ faktoreid 2 klassi:
    σ70 perkond
    σ54 perekond
    Sigma faktorite vahel toimub konkurents RNA polümeraasiga seondumisele. E. coli rakus on ligikaudu 2000 RNA polümeraasi molekuli, millest 2/3 on parasjagu seotud transkriptsiooniga. seega jääb vaba apoensüümi, millega sigma faktor saaks seonduda, 600 – 700 molekuli. Kõiki sigma faktoreid on aga rikkal söötmel kasvavates rakkudes kokku 1200 molekuli.
    Eraldi rühma moodustavad faagide poolt kodeeritud σ faktorid. Näiteks faag T4 kodeerib faktorit gp55, mis aitab RNA polümeraasil spetsiifiliselt seonduda T4 hiliste geenide promootoritele.
    Selleks, et bakteri RNA polümeraas transkribeeriks bakteri geenide asemel faagi geene, toimub bakteri RNA polümeraasi modifikatsioon faagi poolt kodeeritud faktorite kaudu. Modifitseeerimine võib toimuda erinevate mehhanismide alusel. α subühiku modifikatsioon võimendab anti-σ interaktsiooni , ß‘ subühiku fosforüleerimine aga inaktiveerib ensüümi.
    Transkriptsiooni initsiatsioon σ70 promootoritelt.
    E. coli σ70 poolt äratuntavate promootorite konsensusjärjestuse aluseks on võetud 298 promootorit.
    -35 -10
    T69T79G61A56C54A54 N16-18 T77A76T60A61A56T82
    Transkriptsioon algab 6-7 nt -10 heksameerist geeni poole ning peaaegu alati on esimeseks nukleotiidiks puriin (A või G). Eristatakse mitut etappi , kus RNA polümeraas on DNA-ga seotud erinevas ulatuses:
  • Suletud kompleksi (closed complex ) moodustumine. Holoensüüm on seondunud spetsiifiliselt promootorile, kattes regiooni -55 kuni +20 (80 bp).
  • Avatud kompleksi moodustumine, isomerisatsioon. Tekib mull, kus DNA ahelad on lahti sulanud. DNA ahelate lahtisulamine toimub regioonis -10 kuni +2. Järgneb abortiivne transkriptsioon, 2 kuni 9 nt süntees, mille käigus RNA polümeraas jääb seotuks samade DNA aladega kui alguses ning ei liigu edasi. DNA kodeeriv ahel on seondunud sigma faktoriga ning vaba matriitsahel on liikunud RNA polümeraasi aktiivtsentrisse.
  •  faktori vabanemine võimaldab elongatsiooni, jääb kontakt kuni -35 heksameeriga (60 bp).
  • Pärast seda, kui on sünteesitud on 15 kuni 20 nt pikkune RNA ahel, jääb kontakt 30 bp-ga. Lahtisulanud ala on 17 bp pikkune, DNA:RNA hübriid 12 bp pikkune.
    RNA ahela elongatsioonikiirus on 40 nt/sek.

    Transkriptsiooni positiivne ja negatiivne regulatsioon transkriptsiooni aktivaatorite ja repressorite kaudu


    Tugevad promootorid, mille äratundmiseks piisab ainult RNA polümeraasist, langevad konsensusjärjestusega hästi kokku. Sellegipoolest pole leitud looduslikke promotoreid, mille järjestus langeks konsensusjärjestusega 100%-liselt kokku.
    Transkriptsiooni aktivaatorite ja repressorite seondumisalad promootor -regioonis on erinevad. Repressorite seondumisalad võivad kattuda promootoriga, jääda sellest üles- või allapoole. Näiteks lac repressor (lacI produkt) seondub tetrameerina operaatoralaga regiooni -5 kuni +21. Repressori seondumine dsDNA-ga takistab polümeraasil avatud kompleksi moodustamist. Mõned promootorid on nii aktiveeritavad kui ka represseeritavad (näiteks lac promootor).
    Repressor võib toimida ka mitte DNA konformatsiooni muutmise kaudu, vaid otseselt, valk-valk interaktsiooni kaudu, käitudes anti- faktorina. Sel juhul inaktiveerib ta  faktori. Näiteks 70 assotsieerub anti-sigma faktoriga Rsd, statsionaarse faasi sigma faktori S aktiivsust aga mõjutab negatiivselt RssB ja Crl positiivselt.
    Erinevalt repressorite seondumissaitidest jäävad aktivaatoreid siduvad järjestused alati -10 heksameersest järjestusest ülespoole, sest vastasel juhul takistaks nende seondumine DNA ahelate lahtisulamist.
    Aktivaatori spetsiifika on määratud tema seondumissaidi olemasoluga aktiveeritava geeni promootoralas või selle läheduses. Sageli seonduvad transkriptsioonifaktorid DNA-le kooperatiivselt. Tüüpiline DNA-ga seonduv valk sisaldab nii DNA-ga seondumise kui ka teiste valkudega interakteerumise domeene. Ühe valgu seondumine promootoralale võib soodustada teiste transkriptsiooni aktivatsioonil osalevate valkude seondumist DNA-le.Valkude kooperatiivsel seondumisel DNA-le on oluline, et nad oleksid üksteisega interakteerumiseks seondunud DNA-le samas faasis. Kui kahe seondumissaidi vaheline kaugus ei ole täispöördeline, ei pruugi valkudel transkriptsiooni aktivatsioonile efekti olla.
    Aktiveeritavatel promootoritel on -35 heksameer konsensusjärjestusest TTGACA märkimisväärselt erinev ja sel juhul soodustab aktivaator polümeraasi seondumist promootorile. Sama aktivaator võib erinevate promootorite transkriptsiooni aktivatsioonil toimida erinevalt. Aktivatsiooni mehhanism sõltub sellest, kui kaugele regulaator promootorist seondub.
    CRP (cAMP Receptor Protein ), tuntakse ka nimetuse all CAP (Catabolite Gene Activator Protein), on dimeerne valk, mis koosneb 2-st identsest 22,5 kDa suurusest subühikust (209 aminohapet). Ta on aktiivne ainult cAMP juuresolekul. CRP dimeer seondub 22 bp pikkusele palindroomsele järjestusele, mõlemale poolsaidile üks subühik. Erinevate promootorite puhul seondub CRP promootorist erinevale kaugusele:
    1) lac promootor – seondumine regiooni -72 kuni -52
    2) gal promootor – seondumine regiooni -50 kuni -25
    3) ara promootor – seondumine regiooni -107 kuni -78
    Aktivaatori ja RNA polümeraasi interaktsioon sõltub sellest, kui kaugele aktivaator transkriptsiooni alguspunktist seondub. Vastavalt interaktsiooni tüübile liigitatakse aktivaatoreid klass I ja klass II aktivaatoriteks. Klass I või klass II aktivaatorina võib sõltuvalt oma seondumiskohast käituda ka üks ja sama aktivaator (näit. CRP).
    Klass I aktivaatorid
    Aktivaator interakteerub RNA polümeraasiga, seondudes  subühiku C-terminusega (CTD), tõstes sel viisil RNA polümeraasi afiinsust promootorile. Kontaktsaidid (5 - 19 ah) on erinevate aktivaatorite puhul erinevad. Klass I aktivaatorid on näiteks Ada - aktiveerib geenid, mis osalevad oksümetüülguaniini poolt indutseeritud DNA kahjustuste reparatsioonil; IHF - stimuleerib transkriptsiooni faag lambda promootorilt pL; OmpR - osmoregulatsioon; OxyR - oksüdatiivse stressi vastus; CRP lac promootori puhul - interaktsioon soodustab CTD seondumist DNA regiooniga, mis külgneb CRP saidiga. CTD-ga seondub promootori poole jääv CRP monomeer .
    Klass II aktivaatorid
    Aktivaatori seondumisala kattub promootori -35 heksameeriga. Klassikaliseks näiteks on CRP interaktsioon RNA polümeraasiga gal promootori puhul, samuti kuulub sellesse klassi PhoB, mis kontrollib bakterirakus fosfaadi nälja puhul indutseeritavaid geene.
    CRP-l on kaks RNA polümeraasiga interakteeruvat domääni:
  • AR1 - 8 aminohapet Asp-156, Met-157, Thr-158, His-159, Pro-160, Gly-162, Met-163 ja Gln-164
  • AR2 - aktiveeriv domeen , kuhu kuuluvad aminohapped His-19, His-21, Glu-96 ja Lys-101
    gal promootori puhul on näidatud, et CRP ja RNA polümeraasi vahel toimub 2 erinevat interaktsiooni. RNA polümeraas seondub DNA-ga nii eespool kui ka tagapool CRP-d. Erinevad interaktsioonid mõjutavad transkriptsiooni aktivatsiooni erinevaid etappe :
    I CRP(AR1) - CTD kõrvaldab CTD inhibeeriva efekti, soodustades CTD seondumist ülespoole CRP sidumisala. Selle tulemusena tugevneb RNA polümeraasi ja promootori vaheline seondumine. CTD deleteerimisel kaob vajadus RNA polümeraasi interaktsiooniks CRP AR1-ga. CTD-ga seondub CRP monomeer, mis paikneb promootorist kaugemal.
    II CRP(AR2) - NTD kiirendab suletud kompleksist avatud kompleksi moodustumist. Interaktsioonil osaleb CRP monomeer, mis paikneb promootorile lähemal.
    Seega võib sama aktivaator interakteeruda RNA polümeraasi erinevate piirkondadega ja mõjutada seeläbi transkriptsiooni initsiatsiooni erinevaid etappe.
    Faag lambda CI promootori PRM aktivatsioonil on näidatud, et interaktsioon toimub aktivaatori ja  subühiku vahel.

    Transkriptsiooni aktivatsiooni kontroll DNA topoloogia kaudu


    DNA bending ja UP-elemendid


    Transkriptsiooni aktivatsioonil on sageli oluline roll DNA bendingul (paindel). Näiteks lac promootori puhul on CRP-DNA kompleksis DNA oma sümeetriatelje suhtes 90 paindunud. Leiti, et kui asendada gal promootoril CRP seondumise sait DNA järjestusega, mis on looduslikes tingimustes paindunud (pikad polü-A järjestused), toimub transkriptsiooni aktivatsioon sellelt promootorilt ka ilma CRP-ta.
    DNA bendingut on võimalik geel -elektroforeetiliselt tuvastada. Paindega DNA fragmendid liiguvad geelis aeglasemalt. Kõige aeglasemalt liigub geelis DNA fragment siis, kui paindumiskoht jääb fragmendi keskele .
    Lisaks -35 ja -10 heksameeridele on mõnede promootorite puhul leitud veel kolmas promootorelement - UP element. See on A-T rikas järjestus promootori -35 elemendist ülalpool. UP elemendi olemasolu on näidatud näiteks ribosomaalse rRNA geenide operoni rrnB promootoril P1 (regioon -40 kuni -60), flagelliini geeni promootoril B. subtilises ja faag lambda PL promootorregioonis. UP elemendiga seondub -CTD ning selle tulemusena seondub RNA polümeraas promootoriga tugevamalt. Näiteks rrnB promootori puhul võimendab UP element transkriptsiooni vähemalt 30 korda. Osade promootorite puhul võib UP elemendi mõju olla aga tunduvalt nõrgem. Selliste UP elementide järjestus erineb tunduvalt konsensusjärjestusest nnAAA(A/T)(A/T)T(A/T)TTTTnnAAAAnnn. Viimaste aastate tulemused viitavad sellele, et UP element võiks olla küllaltki levinud komponent paljude promootorite puhul. Seda on näidatud DNaas I protektsiooni katsetel (“footprinting” analüüs), kus on leitud, et -CTD protekteerib A-rikkad järjestused promootori –35 elemendist ülalpool. Seega omavad enamus A-rikkaid järjestusi, mis põhjustavad DNA paindumist (bendingut), transkriptsiooni aktivatsioonil positiivset rolli eeskätt UP-elemendina. Teatud juhtudel võib UP-element transkriptsiooni mõjutata ka negatiivselt. Seda juhul, kui -CTD seondub UP-elemendiga liiga tugevalt. Siis on raskendatud RNA polümeraasi promootorilt edasi liikumine (ingl. k. promoter clearance).
    DNA bendingut võivad põhjustada ka nukleoidiga (bakterikromosoomiga) assotsieerunud valgud , näiteks IHF (Integration Host Factor ) . IHF on heterodimeerne valk, mis seondub DNA-ga spetsiifiliselt ja painutab seda 160 kuni 180. IHF-il on enamasti arhitektuurne funktsioon – ta soodustab valk-DNA komplekside moodustumist. Selle tulemusena võib muutuda DNA heeliksi struktuur, mis omakorda soodustab avatud kompleksi teket transkriptsiooni initsiatsioonil (näiteks ilvPG promootor). Faag lambda PL promootori ja Mu Pe promootori puhul võimaldab IHF-i poolt põhjustatud DNA paindumine kontakteeruda RNA polümeraasil UP-elemendiga. 54 tüüpi promootorite puhul toob IHF-i poolt indutseeritud DNA ling kontakti promootoralaga seondunud RNA polümeraasi ja promootorist kaugemale (vähemalt 100 bp kaugusele) seondunud aktivaatorvalgu, võimaldades sel viisil nende valkude otsest interakteerumist. Nagu jällegi näha, võib sama valk erinevate promootorite puhul aktiveerida transkriptsiooni erinevate mehhanismidega.

    DNA superspiralisatsioon


    Normaaltingimustel pöörab iga aluspaar kaksikheeliksi telge 34,5 nurga võrra. DNA heeliksi täispööre saavutatakse 10,4 aluspaariga. Promootorjärjestuse TTGACA N17 TATAAT puhul on -35 ja -10 heksameerid DNA heeliksis samasse suunda eksponeeritud. See võimaldab RNA polümeraasil kontakteeruda mõlema heksameeriga. Juhul, kui heksameerid asuvad teineteisest kaugemal või lähemal kui 17 bp, on RNA polümeraasi kontakteerumine mõlema heksameeriga korraga takistatud. Heksameeride ebaoptimaalset asetust võib kompenseerida DNA superspiralisatsioon.
    Negatiivne superspiralisatsioon vähendab aluspaaride pöördumist teineteise suhtes. Sel juhul võivad DNA ahelad lahti keerduda ja eralduda. Negatiivset superspiralisatsiooni tekitab näiteks güraas.
    Positiivse superspiralisatsiooni puhul (seda tekitab näiteks topoisomeraas I) kulub ühe DNA heeliksi täispöörde saavutamiseks vähem aluspaare.
    Näited:
    mer operoni (Hg resistentsus ) ja Mu faagi mom geeni (faagi DNA modifikatsioon) promootori regulatsioonil mõjutab DNA lokaalset superspiralisatsiooni spetsiifiline regulaatorvalk. Mõlema promootori heksameeride vaheala on 19 bp pikkune. Hg(II) - MerR kompleks seondub vahealale ja põhjustab DNA ahelate lokaalset lahtikeerdumist, mis võimaldab -10 ja -35 heksameeride asetumist õige nurga alla. Sarnane mehhanism on kirjeldatud ka MuC valgu seondumisel mom promootori –28 kuni –57 regiooni.
    recA promootoril on heksameeride vaheline ala 16 bp pikkune. Promootori maksimaalne aktiivsus on saavutatud siis, kui heeliks on tihedamalt kokku keeratud. Näit. külmashoki puhul suureneb RecA valgu kogus rakus positiivse superspiralisatsiooni tõttu. Samuti on leitud, et topoisomeraas I-defektsetes tüvedes on recA geeni ekspressioonitase madalam kui mittemutantsetes tüvedes.
    lac promootoril on heksameeride vaheala 18 bp pikkune. Aeroobsetest tingimustest anaeroobsetesse üleminekul suureneb DNA negatiivne superspiralisatsioon ja transkriptsioonitase sellelt promootorilt tõuseb.
    Transkriptsiooni aktivatsioon 54 promootoritelt
    Esmalt kirjeldati 54 osalemist transkriptsiooni aktivatsioonil seoses lämmastiku metabolismis osalevate geenide regulatsiooniga (nif geenid bakteris Klebsiella pneumoniae). Sellest tulenevalt on kasutusel ka teine tähistus - N. Lisaks kontrollib 54 veel dikarboksüülhapete transporti, tolueeni ja ksüleeni katabolismi, glutamiini sünteesi, piilide, jne. sünteesi kodeerivate geenide avaldumist.
    Erinevate bakterite genoomide analüüsi põhjal võib väita, et 54 on levinud paljudes bakterites, ka graam-positiivsetes (näit. B. subtilis), puudub aga kõrge G + C sisaldusega bakterites Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia prowazekii, Mycobacterium genitalium ja M. pneumoniae.
    Erinevalt 70-tüüpi promootoritest on 54-tüüpi promootorite järjestus märksa enam konserveerunud: järjestus TGGCAC-N5-TTGCa/t paikneb regioonis -26 kuni -11, kusjuures GG ja GC vahelist kaugust (10 bp) ei tohi muuta.
    Erinevalt 70-st on 54 võimeline seonduma promootoriga ka ilma RNA polümeraasi koostisesse kuulumata. 54 võimaldab RNA polümeraasil seonduda spetsiifiliselt promootoriga, kuid sellest ei piisa avatud kompleksi tekkeks. Avatud kompleksi moodustumiseks on vajalik RNA polümeraasi interaktsioon aktivaatorvalguga ja ATP hüdrolüüs. Ilma aktivaatorita on promootor inaktiivne. Seega on 54-sõltuvad geenid kas vaikivas olekus või kõrgel tasemel ekspresseeritud.
    Transkriptsiooni võimendajad (enhancers)
    Bakterites kirjeldati transkriptsiooni võimendajaid (transcriptional enhancers – TE) esmakordselt 1986. a. Enne seda arvati, et TE-d on iseloomulikud ainult eukarüootsele rakule. TE-dele on iseloomulik, et nad:
  • toimivad distantsi tagant;
  • võivad paikneda nii promootori ees kui taga;
  • toimivad sõltumatult nende orientatsioonist.
    TE-dele seonduvad transkriptsiooni aktivaatorid (enhancer binding protein – EBP). Enamasti seonduvad EBP-d promootorist 70 - 150 bp ülespoole. On ka erandeid. Näiteks RocR, mis reguleerib B. subtilise arginiini ja ornitiini transpordi ning metabolismi geene, seondub promootorist 1500 bp ülespoole. Enterobakteritel vastutavad N-assimileerimise eest gln geenid, mis aktiveeritakse NtrC poolt. NtrC on võimeline gln promootorilt transkriptsiooni aktiveerima ka siis, kui tema seondumissaidid on viidud promootorist 3000 bp kaugusele.
    EBP-d seonduvad enamasti dimeerina ning dimeeride seondumissaite on 2 või enam. Dimeeride seondumine toimub kooperatiivselt. Skanneeriva mikroskoobi abil on näha, et NtrC oligomeriseerub gln TE-l. Kompleks sisaldab 4 NtrC dimeeri, millest 2 seonduvad otse DNA-le, järgmised 2 dimeeri seonduvad aga juba DNA-le seondunud dimeeridele läbi valk-valk interaktsioonide .
    EBP-d tuuakse 54-holoensüümkompleksiga kontakti DNA lingu abil. Selleks on 2 võimalust:
  • DNA ling moodustub juhuslikult DNA konformatsiooniliste muutuste tulemusena;
  • DNA lingu stabiliseerib spetsiifiline faktor, näiteks IHF, mis DNA-le tugeva painde.
    Transkriptsiooni aktivatsioonil toimub EBP-vahendatud ATP hüdrolüüs. Selleks, et aktivaatoril avalduks ATP-aasne aktiivsus, tuleb ta viia aktiivsesse konformatsiooni. Selleks on erinevaid võimalusi:
  • Aktivaatori fosforüleerimine. Näiteks NtrC puhul toimib NtrB-vahendatud fosforüleerimise kaskaad , fosforüleeritud NtrC-l suureneb afiinsus TE suhtes ja toimub valgu oligomeriseerumine;
  • Seondumine efektormolekuliga.
    E. coli rakus on 600-700 70 ja 100 54 molekuli. Samas on E. coli genoomis ainult 20 54–sõltuvat promootorit. Seega on isegi madalama afiinsusega promootorid 54-holoensüümi poolt okupeeritud ja valmis aktivatsiooniks.
    Miks on nii vähe 54-sõltuvaid promootoreid? Arvatakse, põhjus on selles, et bakterigenoomis on geenidevahelised alad liiga lühikesed, et EBP-d saaksid seonduda reguleeritavast promootorist sobivale kaugusele, ilma et see häiriks teiste geenide tööd.
    Nii see, et transkriptsiooni aktivatsioon 54 tüüpi promootorilt saab toimuda ainult transkriptsiooni aktivaatori juuresolekul kui ka see, et aktivaator toimib distantsi kaudu, võimaldab tuua paralleele RNA polümeraas II poolt läbiviidava transkriptsiooni aktivatsiooni mehhanismidega eukarüootses rakus.
    Transkriptsiooni vaigistamine (transcriptional silencing) bakterites
    Geeniregulatsiooni negatiivne kontroll võib toimuda kahel viisil:
  • Repressioon;
  • Vaigistamine
    Repressiooni puhul seondub repressorvalk spetsiifiliselt promootorregiooni kindlasse saiti, pärssides RNA polümeraasi funktsiooni lokaalselt. Vaigistamise puhul katavad valgud ühtlaselt teatava DNA regiooni ja takistavad sinna teiste valkude seondumist. Selle tulemusena ei ole DNA kättesaadav ei DNA-d modifitseerivatele ensüümidele ega ka ligipääsetav RNA polümeraasile. Transkriptsiooni vaigistamine on üks põhilisi transkriptsiooni kontrollmehhanisme eukarüootides, bakterites on see vähem levinud.
    Mõned näited:
    H-NS (histone-like nucleoid-structuring protein) kondenseerib sarnaselt histoonidele DNA-d (samas on ta histoonidest struktuuri poolest erinev ning laengult neutraalne). H-NS vaigistab näiteks βD-glükosiidide kasutamisega seotud bgl geene, seondudes 100-bp pikkusele AT-rikkale alale , mis asub nende geenide promootorist ülalpool. H-NS seondub eelistatult korduvat AT-motiivi sisaldavale paindega DNA-le ja oligomeriseerub seal. H-NS mõjutab ka DNA topoloogiat, suurendades DNA negatiivset superspiralisatsiooni.
    Dps (DNA-binding protein from starved cells) hulk suureneb drastiliselt statsionaarse faasi rakkudes. Dps seondub DNA-ga mittespetsiifiliselt, on DNA-d kaitsva funktsiooniga ja arvatakse, et tema seondumine DNA-ga võib pärssida ka osade geenide transkriptsiooni statsionaarses faasis.

    3. Geeniekspressiooni regulatsioon transkriptsiooni terminatsiooni tasemel


    Transkriptsiooni elongatsioon ei toimu ühtlase kiirusega. RNA polümeraas võib transkriptsiooni käigus peatuda (ingl. k. “pausing”) juuksenõelastruktuuride moodustumise tõttu vast-sünteesitud mRNA-s. Peatumise aeg varieerub, sõltudes RNA järjestusest. Terminaatoritena toimivate sekundaarstruktuuride puhul peatub RNA polümeraas ligikaudu 60 sekundit. RNA sekundaarstruktuuri tekkimine võib destabiliseerida DNA::RNA hübriidi. Selle tulemusena RNA dissotseerub ja transkriptsiooni elongatsioonikompleks laguneb. Terminatsiooni võib põhjustada ka spetsiifilise terminatsioonifaktori seondumine RNA-le. Sellest tulenevalt on bakterites kirjeldatud 2 erinevat terminatsioonimehhanismi:
  • rho-sõltuva mehhanismi puhul seondub heksameerne rho valk RNA 5´ otsast spetsiifilisele järjestusele ja jõuab järele RNA polümeraasile, mis on peatunud RNA sekundaarstruktuuri tõttu. Selle tulemusena dissotseerub RNA rho-sõltuva terminaatorjärjestuse kohal matriitsilt. Näiteks faag lambdal termineeruvad promootoritelt pL ja pR algavad transkriptid järjestustel tL1 ja tR1.
  • rho-sõltumatu terminatsiooni mehhanismi korral on terminaatoriks järjestus, mis kodeerib stabiilset G-C rikast juuksenõelastruktuuri ning sellest 3’ suunas jääb mitu U-d. Terminatsioon toimub pärast U-de lülitumist. Juuksenõela moodustumine viib RNA:DNA hübriidi lahutamisele U-rikkast järjestusest. rU::dA RNA-DNA hübriid võib olla piisavalt ebastabiilne, et RNA vabaneks transkriptsioonikompleksist. Sellised terminaatorsignaalid paiknevad sageli operonide lõpus mittetransleeritavates järjestustes pärast stop koodoneid (näiteks trp operoni lõpus).
    Mittetransleeritavate RNA-de (rRNA ja tRNA) transkriptsiooni peatumist või termineerumist soodustavad nendele molekulidele iseloomulikud sekundaarstruktuurid. Selleks, et vastavaid geene siiski transkribeeritaks, vajatakse spetsiaalseid antiterminatsiooni faktoreid nagu näiteks Nus valk (N-utilization, kirjeldatud esmalt faag lambda puhul) ja ribosoomi valk S10.
    Transkriptsiooni attenuatsioon
    Bakteritel on transkriptsioon ja translatsioon omavahel väga tihedalt seotud: parasjagu sünteesitavalt mRNA-lt algab kohe ka translatsioon. Nende kahe protsessi praktiliselt samaaegne toimumine võimaldab reguleerida transkriptsiooni termineerumist transkriptsiooni ja translatsiooni elongatsiooni kiiruste kaudu. Regulatsioon toimub spetsiifilistelt liiderjärjestustelt, millel on potentsiaal moodustada RNA sekundaarstruktuure ning sellesse ei ole kaasatud regulaatorvalke. Transkriptsiooni attenuatsioonil osalevad nii rho-sõltuvad kui ka rho-sõltumatud terminaatorid. Regulatsiooni transkriptsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud näiteks aminohapete biosünteesi operonidel, pürimidiini biosünteesi operonil, aminoatsüül tRNA süntetaasi operonil ja trüptofaani degradatsiooni operonil.
    Aminohapete biosünteesi operonid
    Enamasti on klassikaliseks attenuatsiooni näiteks toodud trp operoni transkriptsiooni regulatsioon. Operoni mRNA liiderjärjestuses on 4 regiooni, mille baasil võivad moodustuda alternatiivsed sekundaarstruktuurid. Regioonide 3 ja 4 paardumisel moodustub rho-sõltumatu transkriptsiooni terminaator . Omavahel võivad paarduda ka regioonid 1 ja 2 või 2 ja 3. Just regioonide 2 ja 3 paardumine takistab teminaatorstruktuuri moodustumist. Milliste regioonide baasil juuksenõelastruktuurid moodustuvad, sõltub sellest, kui palju on rakkudes trüptofaani. Operon kodeerib liiderpeptiidi, milles asuvad nn. kontrollkoodonid, antud juhul Trp koodonid . Trüptofaani defitsiidi korral peatub translatsioon kontrollkoodoni kohal ja liider-RNA-s paarduvad regioonid 2 ja 3. Regioonide 3 ja 4 omavaheline paardumine on takistatud. Selle tulemusena trp operoni transkriptsioon jätkub. Kui aga rakus on piisavalt trüptofaani, peatub ribosoom alles liiderpeptiidi kodeeriva mRNA lõpus, regioonide 2 ja 3 omavaheline paardumine on takistatud ja omavahel saavad paarduda regioonid 3 ja 4, termineerides transkriptsiooni. Sarnane regulatsioon toimub ka teiste aminohapete biosünteesi operonide transkriptsioonil. Juhul, kui operon kodeerib rohkem kui ühe aminohappe biosünteesi, sisaldavad vastavate operonide liiderpeptiidi kodeerivad järjestused kõigi nende aminohapete koodoneid. Näiteks ilvGDMEA kodeerib isoleutsiini, valiini ja leutsiini biosünteesi ning sel juhul on liiderpeptiidi kodeerivas järjestuses kontrollkoodoniteks Ile, Val ja Leu.
    Pürimidiini biosünteesi operonid
    Pürimidiini biosünteesi kodeeriv pyrB1 operon kodeerib samuti liiderpeptiidi. Transkriptsiooni terminatsiooni põhjustav sekundaarstruktuur lõhutakse transkriptsiooni ja translatsiooni koosmõjul. 20 nt enne liiderpeptiidis olevat terminatsioonisaiti asuvad 8 uridiinnukleotiidi. UTP madala kontsentratsiooni korral aeglustub traskriptsiooni elongatsioon U-järjestuse sünteesil. Sel juhul jõuab transleeriv ribosoom RNA polümeraasile järele ning nende koostoime tulemusena lõhutakse transkriptsiooni terminaatorina toimiv sekundaarstruktuur. Kõrge UTP kontsentratsiooni korral RNA polümeraas U-järjestuse kohal ei peatu, mistõttu translatsiooni ja transkriptsiooni koosmõjul ilmnevat RNA sekundaarstruktuuri lõhkumist ei toimu. Esitatud mudeli tõepärasust kinnitavad katsed ribosoomi mutantidega, kus translatsiooni elongatsioon toimub aeglasemalt ning sel juhul väheneb proportsionaalselt ka operoni transkriptsioonitase.
    Aminoatsüül tRNA süntetaasid
    Aminohapete nälja korral tõuseb rakkudes aminoatsüül tRNA süntetaaside hulk. See võimaldab efektiivsemalt kasutada veel olemasolevaid aminohapete ressursse enne, kui vastavad biosünteesirajad on uuesti tööle lülitatud. Süntetaaside geenidel on konserveerunud sekundaarstruktuuridega liiderjärjestus, mis sisaldab ka potentsiaalset transkriptsiooni terminaatorjärjestust. Terminaatorjärjestuse destabiliseerib vastava tRNA antikoodonjärjestuse ja süntetaasi geeni mRNA liiderjärjestuses asuva koodonjärjestuse interaktsioon. Erinevate tRNA süntetaaside liiderjärjestused sisaldavad erinevaid koodonjärjestusi sõltuvalt sellest, millise tRNA süntetaasiga on tegemist. Kui teatavat aminohapet on rakus vähe, on enamus sellele aminohappele vastavaid tRNA molekule vabad ja võimelised interakteeruma liiderjärjestuses paikneva koodonjärjestusega. Aminohappe kõrge kontsentratsiooni korral on enamus tRNA molekule laetud ja seega võimetud interakteeruma liiderjärjestuses asuva koodoniga. Tulemuseks on aminoatsüül tRNA süntetaasi geeni transkriptsiooni terminatsioon.
    Trüptofaani degradatsioon
    Transkriptsiooni regulatsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud ka kataboolsetel operonidel. Üheks näiteks on trüptofaani katabolismi operoni tnaAB regulatsioon. Operoni 319 nt- pikkuses liider-RNA-s moodustub rho-sõltuv transkriptsiooni terminaator. Liiderjärjestus kodeerib 24 aminohappe pikkust liiderpeptiidi ning kodeeriva järjestuse kindlas positsioonis asub Trp koodon . Kui trüptofaani rakus pole, translatsioon sellel kohal peatub ning rho-faktor saab seonduda RNA-ga, mille tulemusena transkriptsioon termineerub. Trüptofaani ülehulgas tõuseb tnaAB transkriptsioonitase rakus 100 korda, kuna rho-sõltuvat transkriptsiooni terminatsiooni ei toimu.
    Transkriptsiooni antiterminatsioon regulaatorvalkude abil
    Transkriptsiooni antiterminatsiooni spetsiifiliste valkude abil on kirjeldatud eeskätt suurte operonide puhul, kus geenide avaldumine toimub etapiviisiliselt. Antiterminatsioonil on kirjeldatud 2 mehhanismi:
  • RNA polümeraasi modifitseerimine nii, et transkriptsioon ei termineeru terminaatorjärjestusel (faag lambda terminaatorid, rrn operonid).
  • Terminaatori moodustumine on takistatud valgulise faktori abil, mis seondub mRNA-ga.
    Antiterminatsioon valgulise faktori abil, mis seondub mRNA-ga
  • Biosünteesi regulatsioon
    Bacillus subtilise trp operon on negatiivselt reguleeritud TRAP (Trp Attenuator Protein) poolt. Trp olemasolul seondub see valk (G/U)AG kordusjärjestustele, mis asuvad trp mRNA liiderjärjestuses. Trp puudumisel TRAP ei seondu ja moodustub antiterminaator – alternatiivne sekundaarstruktuur, mis kattub terminaatorjärjestusega).
    b) Kataboolsete operonide regulatsioon
    B. subtilis’el on kirjeldatud 6 transkriptsiooni antiterminatsiooni kaudu reguleeritavat süsteemi (näiteks sahharoosi ja -glükosiidide metabolism), E. coli ja P. aeruginosa puhul 3.
    E. coli bgl operonis paikneb 3 geeni, mis on vajalikud aromaatsete -glükosiidide (salitsiin) kasutamiseks:
    ter ter
    bglG bglF bglB orf
    antiterminaator- -glükosiidide fosfo --
    valk transporter, glükosidaas
    fosfotransferaas
    BglG on antiterminaatorvalk, mis seondub spetsiifiliselt operoni liiderjärjestusele. Seostumine toimub 32 nt-pikkusele märklaudjärjestusele RAT (ribonucleic antiterminator). Selle tulemusena stabiliseerub alternatiivne sekundaarstruktuur, mis lõhub transkriptsiooni terminaatori. -glükosiidide puudumisel on BglG fosforüleeritud BglF poolt, jääb monomeerseks ning pole võimeline seonduma RAT-ile. Fosforüleerimata BglG vorm aga dimeriseerub ja seondub RAT-ile, mille tulemusena transkriptsioon ei termineeru.
    Antiterminatsioon RNA polümeraasi modifitseerimise kaudu
  • Faag lambda lüütilise tsükli geenide transkriptsioon
    RNA polümeraasi modifitseerimine faag lambda N valgu poolt võimaldab transkribeerida faag lambda lüütilise tsükli geene. Antiterminatsioonil osalevad ka E. coli valgud NusA, NusB, NusE (ribosoomi valk S10) ja NusG. Antiterminatsioonikompleks moodustub promootoripoolsel RNA järjestusel (nut sait) ning ei lase rho- valgul seonduda. Selleks interakteerub NusA otseselt antiterminatsioonivalguga N ning RNA polümeraasi CTD seondub NusA-ga.
    b) Ribosomaalse rRNA operonide rrn transkriptsioon
    rrn operonid sisaldavad faag lambdale sarnast nut elementi (boxA, boxB). Erinevus on selles, et lambda antiterminatsioonikompleks on resistentne ka rho-sõltumatutele terminaatoritele. rrn operoni RNA 5’ ots jääb antiterminatsioonikompleksi moodustumise kaudu seotuks RNA polümeraasiga. See soodustab 16S rRNA ja 23S rRNA protsessingut 30S rRNA prekursorist.

    4. Geeniekspressiooni regulatsioon mRNA stabiilsuse kaudu


    mRNA hulk rakus sõltub sellest, kui kiiresti mRNA-d sünteesitakse ja degradeeritakse. Seega on geeniekspressiooni seisukohalt lisaks transkriptsiooni aktivatsiooni regulatsioonile oluline ka mRNA stabiilsus rakus. Kui teatavat geeni enam ei transkribeerita, kuna vastavat geeniprodukti pole hetkel rakus vaja, tuleb vastav mRNA kiiresti lagundada. mRNA degradatsioonil on sageli oluline roll ka geenide ekspressiooni taseme reguleerimisel operonisiseselt. Erinevate mRNA-de poolestusaeg bakterirakus varieerub enamasti vahemikus poolest minutist kuni 5 minutini. Nii võib ka erinevate geenide mRNA eluiga operonisiseselt olla väga erinev.
    mRNA degradatsioonil puudub ühtne rada. Iga individuaalse mRNA stabiilsuse seisukohalt on olulised nii tema sekundaarstruktuur kui ka translatsiooni kiirus. Teatavad sekundaarstruktuurid stabiliseerivad mRNA-d, osa on aga substraadiks endonukleaasidele. Degradatsiooni viivad läbi erinevad ekso - ja endoribonukleaasid. Paljud mRNA-d on stabiilsemad siis, kui neid efektiivselt transleeritakse, sest siis on nad ribosoomidega tihedalt kaetud ja seetõttu kaitstud RNaaside toime eest. Degradatsiooniradade suhtes esineb komplementatsioon. Kui rakk on defektne ühe degradatsiooniraja suhtes, võib mRNA degradatsioon toimuda ka teise degradatsiooniraja kaudu, nii et silmatorkavat efekti mRNA stabiilsusele ei pruugi alati ilmneda. Kui ka komplementeeriv degradatsioonirada on defektne, on see rakkudele letaalne .

    Ensüümid, mis osalevad mRNA degradatsioonil


    Bakterites on kirjeldatud üle 20 RNaasi, mis osalevad tRNA-de ja rRNA protsessingul. Mõned neist osalevad ka mRNA degradatsioonil. Vastavalt sellele, kas nad lõikavad RNA molekulide sisemistesse järjestustesse, lõhkudes fosfodiestersidemeid või lagundavad RNA molekule otsast, jaotatakse RNaase endo - ja eksoribonukleaasideks.
    Eksoribonukleaasid
    Erinevalt eukarüootidest on bakteritel kirjeldatud ainult 3’  5’ suunas mRNA-d lagundavaid eksoribonukleaase. Põhilised mRNA-d degradeerivad eksoribonukleaasid on polünukleotiidi fosforülaas ja RNaas II. Juhul, kui degradatsiooni käigus ei tule ette ületamatuid sekundaarstruktuure, jäävad algsetest mRNA molekulidest järele ainult lühikesed, 10 – 20 nt-pikkused oligonukleotiidid molekulide 5’ otstest . Tekkinud oligod degradeerib RNaas I. Paljudel mRNA-del on 3’ otsas juuksenõelastruktuur, mis on mRNA-d stabiliseeriva toimega. Arvatakse, et see juuksenõelastruktuur ei pruugi alati sugugi olla transkriptsiooni terminaator, vaid hoopis pikema transkripti 3’  5’ suunas toimunud degradatsiooni produkt. mRNA 3’ otsas moodustunud juuksenõelastruktuuride stabiliseeriva toime uurimine in vivo ja in vitro katsetes on andnud vastuolulisi tulemusi. In vitro tingimustes on mRNA 3’ otsas asuva juuksenõelastruktuuri eksonukleaasi pärssiv mõju tunduvalt lühiajalisem kui in vivo tingimustes. Seega peavad rakus olema veel mõned lisafaktorid, mis stabiliseerivad juuksenõelastruktuure.
    Polünukleotiidi fosforülaas (PNPaas)
    PNPaas on pnp geeni produkt, mis degradeerib mRNA-d fosforolüütiliselt. Lagundamise käigus vabaneb fosfodiestersidemetest energia, mis võib stressis olevatele rakkudele olla oluliseks energiaallikaks ja aidata neil ellu jääda. Degradatsiooniproduktideks on nukleosiid difosfaadid ja 10 - 20 nt oligod mRNA-de 5’ otstest.
    RNaas II
    RNaas II on rnb geeni produkt. RNA hüdrolüüsi tulemusena vabanevad nukleosiid 5’ monofosfaadid. Võrreldes PNPaasiga on RNaas II puhul mRNA 3’ otsas paiknevate juuksenõelastruktuuride mRNA-d stabiliseeriv toime efektiivsem.
    Ühe eksonukleaasi suhtes mutantsed rakud kasvavad normaalselt, mõlema ensüümi defektsus on rakkudele aga letaalse toimega. RNaas II ja PNPaas-i topeltmutantide puhul toimub rakkudes 150 – 1500 nt pikkuste mRNA fragmentide akumuleerumine.
    Endonukleaasid
    Endonukleaaside poolt teostatavad atakid määravad sageli mRNA degradatsiooni edasise kiiruse, kuna aitavad kõrvaldada mRNA 3’ otsast juuksenõelastruktuure. Sageli lõikavad nad 5’ otsa lähedalt, mille tulemusena mRNA destabiliseerub ja allub edasisele kiirele lagundamisele.
    RNaas E
    RNaas E on rne geeni produkt. See ensüüm on üks põhilisi mRNA degradatsioonil osalevaid endoribonukleaase. Kuna RNaas E-defektsetes mutantides pikeneb mRNA-de eluiga, viitab see sellele, et RNaas E poolne atakk on mRNA degradatsiooni kiirust mõjutav etapp. RNaas E tunneb ära spetsiifilisi sekundaarstruktuure, kuid lõikab nende kõrvalt üksikahelalist RNA-d, mille puhul on erinevate mRNA-de degradatsiooni uurides pakutud välja erinevaid konsensusjärjestusi. Enamasti pakutakse konsensuseks järjestust RAUUW, kus R = A või G ja W = A või U ning eelistatult toimub lõige AU dinukleotiidist 5’ suunas.
    RNaas E lõikespetsiifikat on detailsemalt uuritud pBR322 108 nt-pikkuse mittetransleeritava RNA, RNA I puhul. Leiti, et RNA I 5’ otsas olev juuksenõelastruktuur stabiliseerib RNA-d, kuid 5 mittepaardunud nt enne seda sruktuuri on destabiliseeriva toimega, võimaldades RNaas E-l mRNA 5’ otsale seonduda ja RNA-d lõigata. Seega on RNaas E lõikamissaidi puhul olulised nii mRNA primaarjärjestus kui ka sekundaarstruktuurid.
    RNaas III
    RNaas III on rnc geeni produkt, mis lõikab peamiselt rRNA-d. Ensüüm tunneb ära lühikesi mittepaardunud regioone sisaldavaid juuksenõelastruktuure ja lõikab mittepaardunud kohtadesse kas ühes või mõlemas kaksikahelalise struktuuri ahelas. Siiski ei allu RNaas III lõikusele suvaline kaksikahelaline RNA struktuur. Kuigi on üritatud välja tuua konsensust ka primaarstruktuuri tasemel, võivad ensüümi spetsiifika suhtes määravaks osutuda eeskätt just kõrgemat järku struktuurid .
    RNaas III osalust on näidatud faagi T4 varajaste geenide mRNA protsessingul, kus mRNA muutub tranlatsiooniliselt aktiivseks alles pärast selle ensüümi lõiget algsesse mRNA molekuli. Faag lambda int geeni mRNA (kodeerib integraasi) puhul aga soodustab RNaas III selle edasist degradatsiooni. Vastava mRNA atakeeritavus RNaas III poolt sõltub int geeni transkriptsiooni terminatsioonist. int geeni transkriptsioon võib toimuda kahelt promootorilt:
  • Transkriptsioon promootorilt pI lõpeb terminaatoriga tI, mis kattub osaliselt järjestusega sib. Sellelt mRNA-lt sünteesitakse Int valk.
  • Transkriptsioon promootorilt pL, mis ei termineeru tänu N valgule (kuna transkribeeritakse ka N valgu geeni). Selle tulemusena transkribeeritakse sib järjestus, mis on atakeeritav RNaas III poolt.
    RNaas III poolt on lõigatavad näiteks sellised bakteriaalsed mRNA-d nagu RNA polümeraasi  ja ’ subühikuid kodeerivad mRNA-d ja PNPaasi mRNA.
    RNaasI/I*
    Eksoribonukleaasid RNaas II ja PNPaas degradeerivad mRNA molekule 3’ otsast kuni nende 5’ otsa lähedale. Järelejäänud 10 – 20 nt pikkuseid oligonukleotiide degradeerib tsütoplasmaatiline RNaas I või tema periplasmas asuv vorm RNaas I*. Tsütoplasmaatiline vorm degradeerib lisaks oligonukleotiididele ka polümeerseid RNA molekule.
    RNaas P
    RNaas P on ribosüüm, mis protsessib peamiselt tRNA-de 5’ otsi, kuid osaleb ka mRNA degradatsioonil.

    RNA degradasoom


    Bakteriaalse mRNA degradatsioonil osalevad kombineeritult nii ekso- kui endonukleaasid. RNA degradasoom on multiensüümkompleks, kuhu kuuluvad RNaas E ja PNPaas. Lisaks neile kuuluvad kompleksi veel RhlB (DEAD-box RNA helikaas ) ja glükolüütiline ensüüm enolaas. RNA degradasoomiga on assotsieerunud ka shaperonid DnaK ja GroEL ja polüfosfaadi kinaas PPK.
    RNaas E N- terminaalne domeen on endonukleaasse aktiivsusega. Samasse domeeni lokaliseeriti hiljuti veel RNA 3’ otsas olevate polü(A) ja polü (U) järjestuste degradatsiooniline aktiivsus. Ensüümi C-terminaalne domeen interakteerub degradasoomi 3 ülejäänud komponendiga. RhlB on ATP-sõltuv RNA helikaas, mis sisaldab konserveerunud aminohappeid D-E-A-D ning aitab lahti harutada RNA sekundaarstruktuure, mis vastasel korral blokeeriksid PNPaasi töö. RhlB helikaasne aktiivsus avaldub ainult siis, kui ensüüm on interakteerunud RNaas E-ga.
    mRNA stabiilsust mõjutavad tegurid
    Translatsioon
    Bakterirakus on transkriptsioon ja translatsioon omavahel tihedalt seotud. Alles sünteesitavalt mRNA-lt algab koheselt translatsioon, mistõttu ta on ribosoomidega kaetud. Translatsioon kaitseb mRNA-d degradatsiooni eest, sest sel juhul on mRNA tänu ribosoomidele vähem nukleaasidele eksponeeritud. Samas on kirjeldatud ka mRNA-sid (näiteks lac operoni mRNA), mille eluiga ei sõltu nende translatsiooni efektiivsusest. Seega sõltub konkreetse mRNA stabiilsus sellest, kas mRNA ribosoomidega katmata ala on nukleaaside poolt atakeeritav või mitte.
    mRNA stabiilsust mõjutavad järjestused
    mRNA stabiliseerimisel on näidatud nii 5’ kui ka 3’ otsas paiknevate sekundaarstruktuuride mõju. Samas ei ole sekundaarstruktuuride mRNA-d protekteeriv toime universaalne, vaid sõltub iga konkreetse mRNA atakeeritavate saitide kontekstist ja sellest, millised nukleaasid seda mRNA-d veel atakeerivad.
    UTR järjestused
    ompA (kodeerib välismembraani valku A) mRNA 5’ otsas on 133 nt mittetransleeritav regioon UTR, mis stabiliseerib mRNA-d. Selle järjestuse effekt sõltub ka rakkude kasvukiirusest. E. coli rakkude pooldumisel 40 minuti tagant on ompA mRNA poolestusaeg 17 minutit, UTR puudumisel 3 - 4 minutit. Rakkude kasvu aeglustumisel väheneb ompA mRNA poolestusaeg 5 minutile ka UTR-i olemasolul. UTR moodustab 3 juuksenõelastruktuuri. Stabiliseeriva toime seisukohalt on oluline, et nende ette ei jääks üksikahelalist ala.
    Katseliselt on näidatud, et ompA UTR-i kloneerimine teiste mRNA-de ette tõstab ka nende stabiilsust. Näiteks bla mRNA (kodeerib -laktamaasi) poolestusaeg tõuseb 3 minutilt 18 minutini. E. coli, Serratia marrescenc’i ja Enterobacter aerogenes’e ompA geenide 5`otste UTR-de võrdlemisel ilmnes, et nende järjestus on erinev, kuid sekundaarstruktuur sarnane. Kõik nad stabiliseerivad E. coli’s mRNA-d.
    mRNA-d stabiliseerivad ka molekuli 3’ otsas mittetransleeritavasse alasse jäävad juuksenõelastruktuurid. Arvatakse, et eksonukleaaside kinnitumiseks 3’ otsale on vaja üksikahelalist ala vahetult molekuli otsas. Lisaks võib mRNA 3’ otsast sissepoole jääv sekundaarstruktuur nii stabiilne olla, et takistab eksonukleaasil mRNA edasist degradeerimist.
    REP järjestused
    REP järjestused on lühend inglisekeelsest terminist “ Repetitive extragenic palindromic sequences”. Need on kõrgelt konserveerunud pöördkordusjärjestused, mis võivad mRNA-s olla aluseks juuksenõelastruktuuride moodustumisele. E. coli genoomis on REP järjestusi 500 - 1000 koopiat (1% genoomist). mRNA-dest sisaldab REP järjestusi 25%. Enamasti asuvad nad geenidevahelistes alades. Mõnedel juhtudel (näiteks his ja mal operonid, mis on vastutavad histidiini ja maltoosi transpordi eest) on REP järjestustel mRNA-d stabiliseeriv toime. Samas aga cat geeni puhul (kodeerib kloroamfenikooli atsetüültransferaasi) geeni 3’ otsas olevad REP järjestused mRNA-d ei stabiliseeri, sest endonukleaasid tunnevad ära sellest järjestusest ülespoole jäävaid alasid.
    Polü(A) järjestused 3’ otsas
    Bakterirakus on kirjeldatud 2 polü(A) polümeraasi – PAP I ja hiljuti PAP II. PAP I on pcnB geeni produkt. PAP I mõju RNA stabiilsusele kirjeldati esmakordselt RNA I puhul. RNA I on ColE1 plasmiidide replikatsioonil repressorina toimiv antisens-RNA, mis interakteerub plasmiidi replikatsiooni initsiatsioonil praimerina toimiva RNA-ga.
    PAP I-defektsetes mutantides on kirjeldatud mitmete mRNA-d stabiliseerumist:
    lpp - lipovalk
    ompA - välismembraani valk A
    trxA - tioredoksiin
    rpsO - ribosoomi valk S15
    3’ otsas polü(A)-järjestust sisaldavad RNA molekulid on PNPaasi ja RNaas II poolt paremini atakeeritavad, kuna polü(A)-järjestus võib olla nende nukleaaside kinnitumiskohaks muidu vahetult 3’ otsas sekundaarstruktuuri sisaldavatele mRNA-dele. Kui rakud on defektsed nii PAP I kui ka PAP II suhtes, on see rakkudele letaalne. Arvatakse, et mRNA polüadenüleerimine on bakterirakus pidevalt toimuv protsess, mis aitab kaasa mRNA molekulide täielikule degradeerimisele. Näiteks PNPaasi- ja RNaas II-defektsetes tüvedes on rakku kuhjuvad mRNA degradatsiooni vaheproduktid polüadenüleeritud.
    Operonisisene geeniekspressiooni regulatsioon
    Kuigi geenide transkriptsioon võib alata sama(de) promootori(te) alt, vajab rakk vastavaid geeniprodukte sageli erinevas koguses. Operoni geenidevahelises alas on leitud järjestusi, mille baasil võivad tekkida RNA sekundaarstruktuurid. Polütsistroonse mRNA lõikamine algab enamasti geenide vahelt ning kuna tekkinud mRNA segmendid on erineva elueaga, võib see olla üheks mehhanismiks , mis aitab reguleerida geenide ekspressioonitaset operonisiseselt. Näiteks laktoosioperoni puhul toimub lacY-spetsiifilise mRNA degradatsioon ligikaudu 2-korda kiiremini kui lacZ mRNA lagundamine.
    Geenide ekspressioonitaset kontrollitakse operonisiseselt mRNA stabiilsuse kaudu F plasmiidi tra operonis. See operon on 32 kb-pikkune ja sisaldab hulgaliselt geene, mille produktide järele on rakus erinev vajadus. Kõige enam vajatakse traA geeni produkti piliin, mis on piilide koostisosa . Piliini kodeerivad mRNA segmendid on teistest tunduvalt stabiilsemad. Kuigi nad on 5’ otstest heterogeensed, on kõigi segmentide 3’ otsad identsed mRNA-d stabiliseeriva juuksenõelastruktuuri tõttu.
    5. Translatsiooni regulatsioon
    Translatsiooni regulatsioon võib toimuda kas initsiatsiooni, elongatsiooni või terminatsiooni kaudu. Regulatsioon translatsiooni tasemel võimaldab samuti täpsemalt moduleerida polütsistroonse mRNA-na transkribeeritavate geenide avaldumist.

    Translatsiooni pärssimine valkude või antisens RNA poolt


    Translatsiooni initsiatsiooniks peab mRNA seonduma ribosoomis asuva 16S rRNA 3’otsaga. Seondumine toimub spetsiifilise järjestuse – RBS (ribosome binding site) abil. Translatsiooni initsiatsiooni efektiivsust mõjutavad RBS-i homoloogia 16S rRNA-ga, RBS-i ja initsiaatorkoodoni vaheline kaugus ja teised mRNA järjestuse elemendid. Osade polütsistroonsete mRNA-de puhul paiknevad geenid nii lähestikku, et lõppeva geeni stop koodon ja temale järgneva geeni initsiaatorkoodon asuvad kõrvuti või kattuvalt. Sel juhul ei dissotseeru ribosoomid pärast stop koodonit mRNA-lt, vaid difundeeruvad külgneva geeni initsiaatorkoodonini ning alustavad järgmise polüpeptiidi sünteesi. Selline mehhanism võimaldab erinevate valkude sünteesi täpsemalt koordineerida. Sel viisil (protsessi inglisekeelne nimetus on “ translational coupling”, maakeeles sobib vast termin “translatsiooni sidumine”) on sünteesitud näiteks faag lambda hiliste geenide poolt kodeeritud kapsiidivalgud, mida on vaja kindlal ajal kindlas hulgas ja vahekorras faagipartiklite assambleerimisel.
    Juhul, kui RBS on blokeeritud kas teda sisaldava mRNA järjestuse paardumise tõttu antisens RNA-ga või on RBS-i maskeeriv sekundaarstruktuur moodustunud mRNA enda järjestuse baasil, on translatsiooni initsiatsioon pärsitud. Translatsiooni initsiatsioonisaiti võib olla seondunud ka spetsiifiline repressorvalk.
    Ribosoomivalkude operonide translatsiooni regulatsioon
    Ribosoomivalkude (R-valgud) geenid rps ja rpl asuvad mitmes operonis ning nende süntees on kontrollitud R-valkude endi poolt. Sellise autoregulatsiooni puhul seondub üks reguleeritava operoni poolt kodeeritud R-valkudest vastava polütsistroonse mRNA spetsiifilisele järjestusele, mis külgneb RBS-iga ja sisaldab initsiaatorkoodonit AUG. See spetsiifiline järjestus sarnaneb rRNA järjestusele, kuhu vastav regulatoorne R-valk seondub ribosoomis. Mida aeglasem on rakkude kasvukiirus, seda vähem on neis ribosoome. R-valkude sünteesi autoregulatsioon võimaldab hoida rakkude kasvukiiruse muutumisel proportsioonis erinevate ribosoomikomponentide sünteesi. Rakkude kasvukiiruse aeglustumisel väheneb rRNA sünteesi hulk. Kui rakud kasvavad kiiresti, on rakusisene rRNA hulk kõrge ja regulatoorsed R-valgud seonduvad rRNA-ga, kuna nende seondumisafiinsus rRNA-le on kõrgem kui mRNA-le. Kui kogu rRNA on asambleeritud ribosoomidesse, seonduvad regulatoorsed R-valgud mRNA-le ja pärsivad iseenda ja ka teiste sama polütsistroonse mRNA poolt kodeeritud R-valkude sünteesi.
    Faagi T4 ssDNA -ga seonduva valgu translatsioon
    T4 valk gp32 on ssDNA-ga valk, mis osaleb faag T4 replikatsioonil. Kui ssDNA on ära seotud, seondub gp32 enda mRNA-le, pärssides sellelt translatsiooni. Seega on gp32 hulk rakus otseselt seotud vaba ssDNA hulgaga .
    Translatsiooni initsiatsiooni pärssimine antisens-RNA abil
    micF on iseseisva geeni poolt kodeeritud antisens-RNA, mis paardub endale osaliselt komplementaarse mRNA 5’ otsaga. micF RNA on translatsiooniline repressor. Ta paardub ompF (kodeerib välismembraani valku F) mRNA RBS-i ja initsiaatorkoodonit AUG sisaldava alaga, blokeerides ompF geeni translatsiooni. Need micF RNA molekulid, mis ei ole paardunud ompF mRNA-ga, võtavad sekundaarstruktuuri, mis soodustab nende degradatsiooni. micF RNA ekspressioonitase on rakus maksimaalne madala temperatuuri ja madala osmootse rõhu korral.
    Antisens-RNA-de kaudu on kontrollitud ka näiteks IS10 transposaasi translatsioon ja raku jagunemise initsiaatorvalgu FtsZ translatsioon. Ka neil juhtudel seondub antisens-RNA märklaud-mRNA-de RBS-i sisaldava regiooniga, takistades sel viisil translatsiooni initsiatsiooni. IS10 transposaasi mRNA muutub lisaks sellele veel ka RNaas III poolt atakeeritavaks.
    Translatsiooni attenuatsioon
    Translatsiooni attenuatsiooni on kirjeldatud MLS (makroliid, linkosamiid, streptogramiin) tüüpi antibiootikumide resistentsuse kujunemisel. Stafülokokid, streptokokid ja streptomütseedid saavutavad resistentsuse MLS antibiootikumide suhtes 23S rRNA modifitseerimise tulemusena. Staphylococcus aureus ’e resistentsus erütromütsiini suhtes tekib tänu RNA metülaasi kodeeriva geeni erm translatsiooni induktsioonile erütromütsiini madala kontsentratsiooni puhul. Selle tulemusena metüleeritakse 23S rRNA, muutes rakud resistentseks erütromütsiini kõrge kontsentartsiooni suhtes. erm operoni liider-mRNA kodeerib liider- peptiidi , mis on 19 aminohappe pikkune. Liider-mRNA sisaldab järjestusi, mille baasil võivad moodustuda alternatiivsed sekundaarstruktuurid. Kui induktorina toimivat erütromütsiini pole, transleerivad ribosoomid liiderpeptiidi tervikuna . See võimaldab liiderjärjestuses omavahel paarduda regioonidel 1 ja 2 ning 3 ja 4. Regioonide 3 ja 4 paardumise tulemusena on blokeeritud erm geeni RBS ja initsiaatorkoodon ning metülaasi ei sünteesita. Erütromütsiini madala kontsentratsioni puhul peatub liiderpeptiidi translatsioon 9-nda koodoni juures, mille tulemusena regioon 2 paardub hoopis regiooniga 3 ning erm geeni translatsiooni pärssivat sekundaarstruktuuri ei moodustu.
    Lugemisraami nihkumine (translational frame shifting) ja ribosoomide hüppamine translatsiooni elongatsioonil
    Arvatakse, et valgusünteesi ümberlülitamine ühelt lugemisraamilt teisele (lugemisraami nihkumine) toimub kohtades, kus translatsiooni elongatsioon korraks peatub, andes ribosoomile võimaluse mRNA-l “ libiseda ”. Mõne polüpeptiidi sünteesil toimub ühelt lugemisraamilt teisele nihkumine kindlates kohtades kõrge sagedusega. Lugemisraami muutumist translatsiooni käigus on kirjeldatud näiteks DNA polümeraasi III subühikute sünteesil. Bakteris E. coli kodeerib DNA polümeraasi III tau ja gamma subühikuid dnaX geen. Tau subühik koosneb 643-st aminohappest ja on transleeritav ühe lugemisraamina. Positsioonides 428 – 432 asuvates koodonites sisaldub 6 järjestikust adeniini ning seejärel raamis –1 järjestus UGA, mis võib toimida stop koodonina. Gamma subühik on 431 aminohappe pikkune. See valk on järjestuselt identne tau subühiku N-terminaalse järjestusega, kuid tema translatsioon on termineerunud varem teises lugemisraamis asuva stop koodoni poolt. - 1 raaminihe tekib A-järjestustel kõrge sagedusega. Seetõttu sünteesitakse gamma ja tau subühikuid bakterirakus suhtes 1:4. Raaminihke toimumist soodustab mRNA-s UGA koodonile järgnev juuksenõelastruktuur.
    Polüpeptiidide sünteesi terminatsioonil osaleva faktori RF-2 (release factor-2) süntees saab toimuda ainult tänu raaminihkele. Kui RF-2 kogus on rakus madal, on seda valku kodeeriva mRNA algusosas sisalduv stop koodon UGA translatsiooni terminatsiooniks ebapiisav. Sel juhul ribosoom küll peatub, kuid nihkub 3 U kohal +1 lugemisraami transleerimisele. Ainult nii sünteesitakse funktsionaalne valk. Programmeeritud lugemisraami muutmist on kirjeldatud ka mobiilsete DNA elementide transpositsioonil osalevate valkude sünteesil. Sünteesitakse näiteks transposaasi ja tema lühemat varianti , mis toimib transposaasi repressorina.
    Mõningatel juhtudel võib ribosoom jätta mRNA-st transleerimata mitukümmend nukleotiidi. Sellist programmeeritud ribosoomide “hüppamist” translatsioonil on kirjeldatud näiteks T4 faagi topoisomeraasi subühiku gp60 translatsioonil, kus koodonid 46 ja 47 on teineteisest eraldatud 50 nukleotiidiga. Arvatakse, et ribosoomi hüppamist põhjustab koodonite vaheala baasil moodustuv sekundaarstruktuur.
    Koodonkasutus
    Sama aminohapet kodeeriva koodoni kolmas nukleotiid on (v. a. Met ja Trp puhul) varieeruv. Osa koodoneid on haruldasemad kui teised. Vastavalt sellele on rakus erineval hulgal ka neile koodonitele antikoodoneid kandvaid tRNA molekule. Kui bakteri genoom on G + C-rikas, esineb sagedamini G + C-rikkamaid koodoneid, A + T-rikka genoomi puhul aga jälle harvamini. Mõned geenid, mille ekspressioonitase on rakus madal, sisaldavad sagedamini haruldasi koodoneid kui need, mille ekspressioonitase on kõrge. Ühest organismist pärineva geeni avaldumine teises organismis võib samuti olla takistatud nende organismide erineva koodonkasutuse tõttu.

    6. Valkude posttranslatsiooniline regulatsioon ja modifikatsioon


    Rakkude kohanemisel keskkonna muutustega toimuvad muutused geenide ekspressioonitasemes. Kui regulatsioon toimuks ainult geeniekspressiooni tasemel, kuluks rakkude adapteerumiseks üksjagu aega. Seda eriti siis, kui teatud süsteeme on vaja kiiresti represseerida. Olemasolevate valkude hulga rakusiseseks vähenemiseks kuluks mitmeid põlvkondi ja nende aktiivsus püsiks rakus pikka aega, kui neid valke ei inaktiveeritaks või degradeeritaks. Geenide induktsiooniks kuluv aeg võib samuti liiga pikk olla. Selleks, et kiirendada rakkude adapteerumist muutunud keskkonnatingimustega, on rakus välja kujunenud valkude aktiivsust kontrollivad posttranslatsioonilised mehhanismid . Posttranslatsiooniline regulatsioon võimaldab bakterirakkudes metaboolseid ümberlülitusi juba mõne sekundi jooksul. Kontrollmehhanismid toimivad kas ensüümide aktiivsuse mittekovalentse moduleerimise (allosteeriline regulatsioon), valkude kovalentse modifitseerimise (enamasti fosforüleerimine) või valkude kompartmentalisatsiooni näol.
    Allosteerilised ensüümid on aktiveeritavad või inaktiveeritavad metaboliitide mittekovalentse seondumise kaudu ensüümide aktiivtsentri regulatoorsetesse saitidesse, mis paiknevad aktiivtsentrist eraldi. Sel viisil toimub näiteks biosünteetiliste ensüümide tagasisidestuslik inhibitsioon. Allosteeriline regulatsioon põhjustab ensüümi ajutisi konformatsioonilisi muutusi, kuna inhibiitori või aktivaatori seondumine on pöörduv. Lisaks allosteerilisele regulatsioonile võib ensüüm olla ka kovalentselt modifitseeritav
  • 80% sisust ei kuvatud. Kogu dokumendi sisu näed kui laed faili alla
    Vasakule Paremale
    Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #1 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #2 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #3 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #4 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #5 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #6 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #7 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #8 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #9 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #10 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #11 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #12 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #13 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #14 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #15 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #16 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #17 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #18 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #19 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #20 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #21 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #22 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #23 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #24 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #25 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #26 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #27 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #28 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #29 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #30 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #31 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #32 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #33 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #34 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #35 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #36 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #37 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #38 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #39 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #40 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #41 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #42 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #43 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #44 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #45 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #46 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #47 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #48 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #49 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #50 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #51 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #52 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #53 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #54 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #55 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #56 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #57 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #58 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #59 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #60 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #61 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #62 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #63 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #64 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #65 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #66 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #67 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #68 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #69 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #70 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #71 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #72 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #73 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #74 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #75 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #76 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #77 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #78 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #79 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #80 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #81 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #82 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #83 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #84 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #85 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #86 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #87 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #88 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #89 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #90 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #91
    Punktid 50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.
    Leheküljed ~ 91 lehte Lehekülgede arv dokumendis
    Aeg2009-02-14 Kuupäev, millal dokument üles laeti
    Allalaadimisi 66 laadimist Kokku alla laetud
    Kommentaarid 0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid
    Autor mary-liz Õppematerjali autor

    Lisainfo

    Põhjalik
    mikrobiolooga

    Mõisted

    kombinatoorika, bakterid, geeniregulatsioon, rakkude kasvamine, sellised rakud, log, raku seisukohalt, valdavaks viisiks, alarmoonid, arhebakterite ensüüm, subühikud, lisaks tf, kda, bakteris, osades graam, coli rakus, holoensüüm, lahtisulanud ala, aktivaatori spetsiifika, tüüpiline dna, seondumist dna, crp, transkriptsiooni aktivatsioonil, sarnane mehhanism, reca promootoril, lac promootoril, järjestus tggcac, ilma aktivaatorita, ebp, ebp, ebp, atp, seondub dna, seondumine rna, mittetransleeritavate rna, mrna liiderjärjestuses, süntetaaside geenidel, antiterminatsioonil, antiterminaator, bglg, mrna degradatsioonil, erinevate mrna, bakterites, endo, erinevalt eukarüootidest, vitro katsetes, pnpaas, degradatsiooniproduktideks, võrreldes pnpaasiga, rnaas iii, sellelt mrna, järelejäänud 10, rnaas p, degradasoom, ensüümi c, bakterirakus, mrna stabiliseerimisel, stabiliseerib mrna, katseliselt, rep järjestused, coli genoomis, bakterirakus, rna i, pap i, segmendid, mõjutavad rbs, rrna, micf, micf rna, translatsiooni attenuatsiooni, bakteris, positsioonides 428, gamma subühik, lugemisraami muutmist, koodoneid, vastavalt sellele, ekspressioonitase, allosteerilised ensüümid, näitena, mcp, valkude atsetüleerimist, glns, coli rakkudes, pulss, kasvavates, lon, clpp, clpa, degradatsioonil, reca, membraan, rakumembraanis, sisemembraani valgud, seca, sellistel valkudel, sekretsioonisüsteemi puhul, tuntumad signaalmolekulid, osa regulone, bakteris, vastavat protsessi, termiaalses transmitter, regulaatori n, rakendamisel, ainus võimalus, duplitseerumine, kontuurpikkusega, dna, osadel valkudel, eksponentsiaalses kasvufaasis, dps, dnaa, dps, fis, eksponentsiaalses faasis, seondumine, lisaks dna, eksponentsiaalses kasvufaasis, kasvavates rakkudes, kasvavates rakkudes, ihf osalust, stpa, bakterid, lisaks näljastressile, kuumashokk, külmashokk, oksüdatiivne stress, osmootne stress, dna kahjustused, liigitusel, stressipromootorid, coli rakus, rakkude kasvukiirus, energiaressursid, ppgpp, rela, ppgpp, ppgpp interaktsioone, initsiatsioonifaktoriga if, ebasoodsates tingimustes, vaegus, rakud, viburite süntees, dna, rmf, mutatsioonid, sporulatsioonist väljatulekuks, fis, mutandid, rpos, pbp6, eksponentsiaalselt kasvavates, rpos transkriptsioon, hsl, coli rakkudes, 500, 6s rna, raku elutegevuseks, graamnegatiivsete bakteritel, primaarsed transportsüsteemid, kdp süsteem, välismembraan, atp, membraani sise, energiaallikaks, eii, resistentsus, transportsüsteemidel, erinevate c, mehhanismide paljusus, membraani sise, vastav substraat, süsteemile avaldub, bakteril, erinevate c, fosfotransferaasi, crp, kasutamine c, camp, tsüklaasi aktiivsusele, hulk rakus, vaesematel c, glükoos 6, glükoneogenees, glükoneogeneesis, glükoneogenees, pep, glükogeen, glükogeeni süntees, frur, frur, frur, lisaks camp, komponent i, erinevatel bakteritel, elektronide allikaks, nifa, noodulid, bakterioidid, erinevaid flavonoid, geenid, bakterioidi, nifa c, atp hüdrolüüsi, ammoonium, vastavat protsessi, hingamine, ammoonium, kodeerivad kahe, glnl, ntrb, rakukoostise seisukohalt, pst süsteem, 2 valku, coli puhul, transkriptsioon, bakterid, bakteris, pi sensoriks, bakterites, elektroniaktseptoriks, anaeroobne hingamine, fermenteerimisel, aeroobsetes tingimustes, inaktiivsed, anaeroobsetes tingimustes, sisalduvale fmn, mõlemad tsütokroomid, fnr, terminaalseks aktseptoriks, prootonid, pmf, laborikatsetes, polütsistroonselt mrna, arcb, määravaks, anaeroobsel hingamisel, elektronide aktseptoriteks, kinaasidena narl, nitraadi kasutamine, näitena, toime nap, transkriptsioon, dmso reduktaas, vastav operon, bakteris, fnr, fnr, redutseerimist d, pfl, kontrollitakse pfl, pfl, atsetüül, atsetüül, atsetüül, aeroobsetes tingimustes, aitab atsetüül, katalüüsib formiaat, o 2, o 2, bakteris, katalaasid, soxsr geenid, termofiilsetel arhedel, eeter, ülempiiriks, üldist seaduspärasust, ekstreemsele ph, võrreldes dna, hsp70 perekond, just adp, atp, coli rakkudes, järgneb 20, konsensusjärjestus, temperatuuritõusu tagajärjel, hs tagajärjel, rsaa, osades organismides, transkriptsioon, shine, rbfa, soodustab groel, cspa funktsioon, csp geenidel, stabiliseeriv efekt, psührotolerantsetel bakteritel, vee olemasolu, osmolüüte, graam, halobakterite valkudes, rakkude kasv, kuni turgor, geenide transkriptsioonitase, trehhaloosi 6, glütsiin, bakteril, graam, kanalitel, envz, ompr, ompr, ompf, ompf, micf transkriptsioon, prop, valgud h, osmoprotektantide sünteesirajad, geenide ekspressioonitase, rakud, negatiivne kemotaksis, bakteril, raku jagunemist, minimaalne oric, oric läheduses, lahtikeerdumist at, bakteri dna, membraaniga seondumine, dam, oric, dnaa geenil, seqa, regiooni vahe, coli puhul, dnak, raku jagunemisega, primaarse tähtsusega, eukarüootne tubuliin, raku jagunemisega, orf, inaktiveerib ftsz, mine n, ftsz, ftsz, ftsz, pol iv, mutageenselt aktiivne, kõrvaldada, bakterigenoomidest, mycobacterium tuberculosis, lisaks isdr, replikatsiooni kiirus, replikatsioonikahvli möödumisel, alka, guaniini oksüdatsiooniproduktiks, pikk reparatsioonirada, uvrb, uvrabc kompleksi, muts, ssdna, graampositiivsetes bakterites, reca homolooge, rad51, recbcd kompleksil, sellistes regioonides, recbcd rekombinatsioonirada, reca, recbcd, algatatakse oric, looduslikes populatsioonides, coli vedelkultuuriga, gasp fenotüüpi, 120, rakkude puhul, bakterist, pol iv, mutante, dna elemendid, vanades säilituskultuurides, coli puhul, sagedusega 10, pol iv, vastavad lookused, teisalt, sporulatsiooni, dna süntees, eelpoolkirjeldatud 3, spo0f, sporulatsiooni, sait, seonduda dna, lisaks a, myxococcus xanthus, ensüümidele, viljakeha, kirjeldatud a, stiimulite puudumisel, enterobakteritel, mcp, viburi mootor, chey, domeen, metüülgrupi s, cher, stiimuli puudumisel, seondumisele, eta, analoogilised

    Kommentaarid (0)

    Kommentaarid sellele materjalile puuduvad. Ole esimene ja kommenteeri


    Sarnased materjalid

    37
    doc
    Eksam molekulaarbioloogia
    147
    docx
    Mikroobifusioloogia
    194
    docx
    Molekulaarbioloogia
    106
    pdf
    Bioloogia Eksam TÜ arstiteaduskond-I kursus 2017 2018
    98
    docx
    Kogu keskkooli bioloogia konspekt
    94
    docx
    Rakubioloogia II
    38
    pdf
    Molekulaarbioloogia konspekt
    150
    docx
    Bioloogia gümnaasiumi materjal 2013



    Faili allalaadimiseks, pead sisse logima
    Kasutajanimi / Email
    Parool

    Unustasid parooli?

    UUTELE LIITUJATELE KONTO MOBIILIGA AKTIVEERIMISEL +50 PUNKTI !
    Pole kasutajat?

    Tee tasuta konto

    Sellel veebilehel kasutatakse küpsiseid. Kasutamist jätkates nõustute küpsiste ja veebilehe üldtingimustega Nõustun