Otsi
Vajad kellegagi rääkida?
Küsi julgelt abi LasteAbi
Logi sisse ☰

Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid (0)

Eesti Maaülikool - Bioloogia - Mikrobioloogia
1 Hindamata
Punktid

Esitatud küsimused

  • Miks on nii vähe 54-sõltuvaid promootoreid?
  • Mis võimaldab valgul jääda membraani koostisesse?
  • Mis põhjustab promootori äratundmise ES poolt?
  • Mis võiks olla ajutise mutaatorfenotüübi põhjuseks statsionaarse faasi rakkudes?

1. Sissejuhatus

Metaboolne ja geneetiline regulatsioon bakterites


Bakterirakkude efektiivseks kasvuks on vaja, et kõiki raku põhilisi ehitusblokke ja nendeks vajalikke makromolekule produtseeritaks õiges vahekorras. Selleks, et sünteesi lõpp-produktide kontsentratsioon rakus liiga kõrgele ei tõuseks, on rakus välja kujunenud kaks kontrollmehhanismi:
  • Ensüümiaktiivsuse tagasisidestuslik inhibitsioon (feedback inhibition) – metaboolne regulatsioon
  • Ensüümi sünteesi repressioon – geneetiline regulatsioon
    Tagasisidestusliku inhibitsiooni tulemusena inhibeeritakse rakus juba olemasoleva ensüümi aktiivsus reaktsiooni lõpp- produkti poolt. Inhibitsiooni võib esile kutsuda ka teatav metabolismiraja vaheprodukt. Geneetilise repressiooni korral inhibeerib tavaliselt lõpp- produkt metabolismiraja esimese ensüümi sünteesi vastava geeni avaldumise pärssimise kaudu. Metaboolne regulatsioon tagasisidestusliku inhibitsiooni kaudu ja geneetiline regulatsioon ensüümi sünteesi repressiooni kaudu võivad toimuda kombineeritult.. Selline kombinatoorika on väga oluline olukorras, kus tegemist on metaboolsete radade hargnemisega. Seda eriti just siis, kui raja hargnemisel katalüüsivad reaktsioone isoensüümid. Isoensüümid võivad erineda üksteisest selle poolest, millised lõpp- produktid nende aktiivsust inhibeerivad või nende sünteesi represseerivad.
    Bakterid on ainuraksed organismid ning puutuvad seetõttu väliskeskkonnaga vahetult kokku. Bakterite geeniregulatsioon on väga operatiivne, võimaldades kiireid ümberlülitusi rakkude metabolismis ja füsioloogilises seisundis. Kui teatavate geenide produkte pole rakkude kasvuks vaja, siis toimub vastavate geenide väljalülitamine, vajaduse korral lülitatakse aga kiiresti tööle need geenid , mille produkte rakk antud olukorras vajab. Selline regulatsioon geenide sisse-välja lülitamise kaudu on rakule ökonoomne ning võimaldab bakteritel optimaalsete kasvutingimuste korral väga kiiresti paljuneda.
    Geenide avaldumine prokarüootsetes rakkudes on mitmetasandiline, toimudes nii transkriptsiooni, mRNA metabolismi (mRNA-de protsessing ja degradatsioon ), translatsiooni kui ka valkude translatsioonijärgse aktiivsuse regulatsiooni kaudu. Enamus regulatoorseid mehhanisme toimivad siiski transkriptsiooni tasemel. Regulatsioon transkriptsiooni tasemel võib toimuda vastusena keskkonna muutunud signaalidele geenide kiire sisse või välja lülitamise kaudu. Osade geenide puhul toimub nende regulatsioon kaskaadselt, mis seisneb selles, et järgmine rühm geene lülitatakse sisse või välja alles siis, kui on sisse või välja lülitatud eelmine rühm geene. Sellist regulatsioonitüüpi on kirjeldatud detailselt näiteks bakterite sporulatsiooni korral ja bakteriofaagide puhul nende bakterirakus paljunemisel ja morfogeneesis.

    Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid


    Rakkude kasvamine on kompleksne protsess, mille realiseerumiseks peavad toimuma järgmised sündmused:
  • Toitainete sisenemine rakku
  • Rakku sisenenud toitainete konverteerimine energiaks ja rakukomponentideks
  • Kromosoomi replikatsioon
  • Raku suuruse ja massi suurenemine
  • Raku jagunemine tütarrakkudeks, millest mõlemad sisaldavad koopia genoomist ja mis on identsed ka teiste eluliste komponentide poolest.
    Rakkude kasvu tulemusena rakupopulatsioon suureneb. Ideaalsetes tingimustes, kus kasvuks vajalikke toitaineid jagub piisavalt, suureneb rakkude arv populatsioonis eksponentsiaalselt. Sel juhul on iga individuaalse raku generatsiooniaeg (aeg, mille tagant toimub raku pooldumine ) minimaalne. Bakteri E. coli puhul kestab see ligikaudu 20 minutit.
    Rakkude füsioloogiline seisund kajastub nendes toimuva makromolekulide biosünteesi kiiruses ja rakkude suuruses. Kui toitaineid on kasvukeskkonnas rikkalikult, toimub rakkudes aktiivne valgusüntees. Sellised rakud on suuremad, nad sisaldavad rohkem ribosoome ning neis toimub ka aktiivne DNA replikatsioon ja transkriptsioon . Mida rikkalikumalt on keskkonnas rakkudele kasvuks vajalikke komponente, seda vähem kulub energiat nende ühendite de novo sünteesiks ning seda efektiivsemalt saavad rakud paljuneda.
    Reaalses elus on bakterite eksponentsiaalne kasvufaas suhteliselt lühiajaline. Kui rakkude kasvukeskkonnas on toitaineid, eristatakse kasvus :
  • lag faasi, mille käigus rakud kohastuvad kasvukeskkonnaga ja hakkavad jagunema
  • log e. eksponentsiaalset faasi, milles rakkude arv populatsioonis kasvab eksponentsiaalselt
  • statsionaarset faasi, kus rakkude arv populatsioonis on maksimaalne ja ei muutu.

    Stress


    Üldiselt mõeldakse stressi põhjustavate faktorite all kõiki keskkonnamuutusi, mis kutsuvad esile muutusi raku füsioloogilises seisundis. Tegelikult on kõige raskem defineerida olukorda, kus rakud ei ole stressis . Pigem on suvalistel kasvutingimustel rakkudele mingit stressi põhjustav toime ja rakud adapteeruvad antud tingimustega. Teatava stressi süvenemisel toimuvad rakus nii kvalitatiivsed muutused, kus lülitatakse tööle uued süsteemid, kui ka kvantitatiivsed muutused, mille käigus muutuvad juba töös olevate süsteemide ekspressioonitasemed. Sageli võidakse stressivastusena võimendada nende ensüümide ekspressioonitaset, mis töötavad ka n. ö. normaalsetes tingimustes. Küsimus, mis on normaalne, varieerub organismiti.
    Bakterite kohanemine ekstreemsete kasvutingimustega võib olla kas lühiajaline või pikaajaline. Pikaajalise adapteerumise puhul leiavad populatsioonis aset evolutsioonilised muutused. Selle tagajärjel kohaneb grupp organisme eluks antud keskkonnatingimustel, paljunedes neis tingimustes maksimaalse kiirusega. Lühiajaline adapteerumine võib kesta minuteid, tunde või päevi ja muutused, mis sel juhul rakkudes toimuvad, võimaldavad bakteritel antud stressitingimused üle elada. Sel juhul on rakkude kasv enamasti kas peatunud või aeglustunud.
    Stressiga kohanemisel toimuvad füsioloogilised muutused ning muutused geenide ekspressiooni tasemes
    Esmane stressivastus seisneb selles, et toimuvad muutused teatavate biokeemiliste süsteemide ekspressioonitasemes. Muutub geenide transkriptsioonitase, tööle võidakse lülitada ka seni vaikivaid geene. Kui esialgsetest muutustest stressiga toimetulekuks ei piisa, toimuvad raku metabolismis juba globaalsemad ümberkorraldused. Sel juhul esineb kattuvus teiste stressifaktorite poolt stimuleeritud regulatoorsete ümberkorraldustega. Rakus tõuseb universaalsete stressivalkude ekspressioonitase. Suvaline stress , mis mõjutab rakkude kasvukiirust, kutsub esile globaalsed ümberkorraldused biokeemiliste süsteemide aktiivsuses, mis seostuvad rakkude kasvu aeglustumisega või peatumisega.
    Järk-järgulised muutused metaboolsete süsteemide aktiivsuses leiavad aset sõltuvalt sellest, milline on raku varustatus biosünteesiradade lõpp-produktidega. Rikkas kasvukeskkonnas, kus vastavad komponendid on juba valmis kujul olemas, on biosünteetiliste ensüümide ekspressioonitase rakus võrreldes vaese kasvukeskkonnaga vähemalt 10 korda alla surutud. Regulatsioon toimub nii struktuurgeenide transkriptsiooni tasemel (repressioon, attenuatsioon) kui ka biosünteetiliste ensüümide tagasisidestusliku inhibeerimise kaudu. Juhul, kui suvaline komponent keskkonnast ammendub, katkeb koheselt tagasisidestuslik inhibitsioon. Kui sellest ei piisa, tõuseb vastava biosünteesiraja struktuurgeenide transkriptsioonitase. Kui ka sellest ei piisa, vallandub rakus nn. “stringent response”, mille tulemusena toimuvad geenide ekspressioonitasemes globaalsed ümberkorraldused.
    Raku seisukohalt on oluline, et kõik rakusisesed protsessid toimuksid antud tingimustel optimaalsel tasemel. Kuigi üks ja sama stressistiimul on võimeline mõjutama korraga paljude erinevate geenide ekspressioonitaset, täheldatakse antud stimuloni kuuluvate geenide avaldumises hierarhiat. Hierarhia on tagatud reguleeritavate geenide transkriptsiooni kontrollivate regulaatorvalkude seondumissaitide erineva afiinsuse kaudu.
    Stressi tunnetamiseks on mitmeid viise. Valdavaks viisiks on spetsiifilise efektorvalgu aktiivsuse muutmine selle fosforüleerimise/defosforüleerimise kaudu. Sageli vallandub signaali ülekanne kahekomponendiliste regulaatorsüsteemide kaudu. Esmane sensorvalk seondub kas väikese efektormolekuliga või tunnetab muutusi füüsikalistes parameetrites nagu näiteks pH või temperatuur.
    Alarmoonid on väikesed molekulid, mida rakk sünteesib vastusena muutustele keskkonnatingimustes. Näitena võib tuua cAMP , ppGpp ja AppppA sünteesi või siis K-glutamaadi akumuleerumise tsütoplasmasse vastusena osmootsele stressile. Kuna alarmoonid sünteesitakse tsütoplasmas, peavad signaalid väliskeskkonna muutustest eelnevalt sinna jõudma. Spetsiaalseid vaheülekandjaid pole signaali rakkutoomiseks vaja ainult siis, kui signaalmolekulid läbivad rakumembraani vabalt (näiteks superoksiidi ioonid või nõrgad orgaanilised happed ) või kui stressi põhjustav füüsikaline tegur toimib raku sisemistele komponentidele otseselt (näiteks temperatuuri tõus mõjutab otseselt tsütoplasma valkude aktiivsust ja konformatsiooni).

    2. Transkriptsiooni initsiatsiooni kontroll bakterites


    RNA polümeraas
    Geenide avaldumist kontrollitakse esmalt RNA sünteesi e. transkriptsiooni tasemel. Transkriptsiooni algatab ja viib läbi DNA-st sõltuv RNA polümeraas, mis on enamasti multimeerne ensüüm. Monomeerseid RNA polümeraase on kirjeldatud lüütilistel bakteriofaagidel (näit. T7, T3, SP6). Enamasti on nende suurus üle 100 kDa. Transkriptsiooni initsiatsioonil tunnevad nad ära väga spetsiifilisi DNA järjestusi ning ei vaja aktivatsioonil lisafaktoreid. Monomeersed RNA polümeraasid on 5-10 korda kiiremad, nad sünteesivad 200 nt/sek (bakteri RNA polümeraas sünteesib 40 nt/sek). Erinevalt bakteriaalsetest RNA polümeraasidest ei ole nad Zn-metalloensüümid. Tänu efektiivsusele ja spetsiifilisusele on monomeersed ensüümid leidnud rakendust nii rekombinantse DNA tehnoloogias kui ka RNA produtseerimises in vitro .
    Komplekssed , multimeersed RNA polümeraasid on kirjeldatud bakteritel, kuid nad on lihtsamad kui eukarüootidel. Eubakterite RNA polümeraasi holoensüüm koosneb viiest subühikust - α2ßß‘ + σ. Arhebakterite ensüüm on keerulisem, enam sarnane eukarüootide polümeraasidele.
    Arhede RNA polümeraas sisaldab üle 10 subühiku. Need subühikud sarnanevad RNA pol II ja RNA pol III subühikutega. Arhede RNA polümeraas ei seostu E. coli promootoritele. RNA polümeraasi seondumiseks promootorile ja transkriptsiooni initsiatsiooniks on alati vajalikud lisafaktorid. Osa transkriptsioonifaktoreid (TF) on homoloogsed eukarüootsete basaalsete TF-dega (TBP, TFIIB ).
    Arhede promootorite konsensusjärjestused on leitud 80 geeni põhjal.
    TTTA(A/T)T – boxA, positsioonides -32 kuni -25 = euk. TATA box
    väga tugevalt konserveerunud
    (A/T)TG(A/C) – boxB, kattub transkriptsiooni stardisaidiga
    Eubakterite RNA polümeraas, suurusega 480 kDa, koosneb viiest subühikust.
    α2ßß‘ - apoensüüm - koosneb neljast subühikust ja on võimeline katalüüsima RNA sünteesi. Apoensüümi subühikud on erinevates organismides struktuurselt lähedased.
    α - apoensüümi assambleerumine (N-terminus) ja interaktsioon TF-dega või promootori UP- elemendiga (C-terminus)
    ß - katalüüsib RNA sünteesi
    ß‘ - seondumine DNA matriitsahelaga.
    Holoensüümi koosseisu kuulub ka σ faktor. σ faktor on vajalik RNA polümeraasi spetsiifiliseks seondumiseks promootoralale ja transkriptsiooni avatud kompleksi moodustumiseks. Pärast esimese 10 nukleotiidi sünteesi (abortiivne transkriptsioon) vabaneb σ faktor multiensüümkompleksist ning RNA polümeraas on võimeline DNA-l edasi liikuma. Toimub RNA ahela elongatsioon .
    Lisaks eelpool mainitud subühikutele on osades artiklites mainitud, et RNA polümeraasi koostisesse kuulub veel kuues subühik – ω, mis on oma funktsioonilt shaperonivalk ja aitab RNA polümeraasil assambleeruda. Selle subühiku puudumine ei mõjuta RNA polümeraasi aktiivsust.
    RNA polümeraasi subühikud on eraldivõttes inaktiivsed. Ainult ß‘on võimeline DNA-ga mittespetsiifiliselt seonduma. Seetõttu seondub ka RNA polümeraasi apoensüüm DNA-ga mittespetsiifiliselt. σ faktori lisandumisel toimub RNA polümeraasi spetsiifiline seondumine promootoralale ligikaudu 1000 korda kõrgema efektiivsusega. Sageli on transkriptsiooni initsiatsiooniks vajalik ka spetsiifiliste TF-de olemasolu.
    Lisaks TF-dele toimub transkriptsiooni regulatsioon ka erinevate σ faktorite kaudu. σ70 on vajalik bakterile eluliselt tähtsate geenide, nn. “house keeping” geenide avaldumiseks eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes. Seetõttu nimetatakse seda põhiliseks σ faktoriks. Bakteris Escherichia coli on põhiliseks σ faktoriks σ70, Bacillus ’es σ43. Stressitingimustes (näit. temperatuuri tõus kasvukeskkonnas, toitainete nälg, oksüdatiivne stress) lülitatakse tööle geenid, mille promootoreid tunnevad ära alternatiivsed σ faktorid . σ faktorite tähistamisel kasutati algul indeksit, mis iseloomustas vastava valgu liikuvust SDS geelis. Paljud σ faktorid liikusid aga anomaalselt ning sellepärast hakati indeksina kasutama arvestuslikku molekulmassi kDa-nites, mis tuletati geeni pikkusest. Näit. Bacillus subtilise σ43 algne tähis oli σ55. Bacilluse puhul jäädi ka selle nomenklatuuriga hätta, kuna mitmete faktorite molekulass oli ligikaudu 30 kDa. Seetõttu võeti kasutusele tähestik. Viimasel ajal on σ43 asemel kasutusel tähis σA.
    Bakteris E. coli on teada 7 erinevat sigma faktorit Alternatiivsed σ faktorid bakteris E. coli teatud geenirühmade avaldumist:
    σ32 , σE - kuumashoki ( heat shock ) geenid; σE aktiveerub vastusena valkude denaturatsioonile
    periplasmas
    σS - statsionaarne faasi ja oksüdatiivse stressi geenid
    σ54 - N- metabolism , dikarboksüülhapete transport, pilide süntees, tolueeni/ksüleeni katabolism
    σF - viburite süntees
    fecI – Fe-tsitraadi transportsüsteemi regulaator
    Osades graam-negatiivsetes bakterites, näiteks perekonda Pseudomonas kuuluvates bakterites on kirjeldatud ligikaudu 20 erinevat sigma faktorit.
    Bacillus subtilis’el on 9 σ faktorit: σA, σB, σC, σD on seotud vegetatiivse kasvuga; σE, σF, σG, σH, σK aga sporulatsiooniga. Nende faktorite avaldumine on kaskaadselt reguleeritud.
    Oma toime iseloomult ja järjestuse homoloogialt jaotub enamus σ faktoreid 2 klassi:
    σ70 perkond
    σ54 perekond
    Sigma faktorite vahel toimub konkurents RNA polümeraasiga seondumisele. E. coli rakus on ligikaudu 2000 RNA polümeraasi molekuli, millest 2/3 on parasjagu seotud transkriptsiooniga. seega jääb vaba apoensüümi, millega sigma faktor saaks seonduda, 600 – 700 molekuli. Kõiki sigma faktoreid on aga rikkal söötmel kasvavates rakkudes kokku 1200 molekuli.
    Eraldi rühma moodustavad faagide poolt kodeeritud σ faktorid. Näiteks faag T4 kodeerib faktorit gp55, mis aitab RNA polümeraasil spetsiifiliselt seonduda T4 hiliste geenide promootoritele.
    Selleks, et bakteri RNA polümeraas transkribeeriks bakteri geenide asemel faagi geene, toimub bakteri RNA polümeraasi modifikatsioon faagi poolt kodeeritud faktorite kaudu. Modifitseeerimine võib toimuda erinevate mehhanismide alusel. α subühiku modifikatsioon võimendab anti-σ interaktsiooni , ß‘ subühiku fosforüleerimine aga inaktiveerib ensüümi.
    Transkriptsiooni initsiatsioon σ70 promootoritelt.
    E. coli σ70 poolt äratuntavate promootorite konsensusjärjestuse aluseks on võetud 298 promootorit.
    -35 -10
    T69T79G61A56C54A54 N16-18 T77A76T60A61A56T82
    Transkriptsioon algab 6-7 nt -10 heksameerist geeni poole ning peaaegu alati on esimeseks nukleotiidiks puriin (A või G). Eristatakse mitut etappi , kus RNA polümeraas on DNA-ga seotud erinevas ulatuses:
  • Suletud kompleksi (closed complex ) moodustumine. Holoensüüm on seondunud spetsiifiliselt promootorile, kattes regiooni -55 kuni +20 (80 bp).
  • Avatud kompleksi moodustumine, isomerisatsioon. Tekib mull, kus DNA ahelad on lahti sulanud. DNA ahelate lahtisulamine toimub regioonis -10 kuni +2. Järgneb abortiivne transkriptsioon, 2 kuni 9 nt süntees, mille käigus RNA polümeraas jääb seotuks samade DNA aladega kui alguses ning ei liigu edasi. DNA kodeeriv ahel on seondunud sigma faktoriga ning vaba matriitsahel on liikunud RNA polümeraasi aktiivtsentrisse.
  •  faktori vabanemine võimaldab elongatsiooni, jääb kontakt kuni -35 heksameeriga (60 bp).
  • Pärast seda, kui on sünteesitud on 15 kuni 20 nt pikkune RNA ahel, jääb kontakt 30 bp-ga. Lahtisulanud ala on 17 bp pikkune, DNA:RNA hübriid 12 bp pikkune.
    RNA ahela elongatsioonikiirus on 40 nt/sek.

    Transkriptsiooni positiivne ja negatiivne regulatsioon transkriptsiooni aktivaatorite ja repressorite kaudu


    Tugevad promootorid, mille äratundmiseks piisab ainult RNA polümeraasist, langevad konsensusjärjestusega hästi kokku. Sellegipoolest pole leitud looduslikke promotoreid, mille järjestus langeks konsensusjärjestusega 100%-liselt kokku.
    Transkriptsiooni aktivaatorite ja repressorite seondumisalad promootor -regioonis on erinevad. Repressorite seondumisalad võivad kattuda promootoriga, jääda sellest üles- või allapoole. Näiteks lac repressor (lacI produkt) seondub tetrameerina operaatoralaga regiooni -5 kuni +21. Repressori seondumine dsDNA-ga takistab polümeraasil avatud kompleksi moodustamist. Mõned promootorid on nii aktiveeritavad kui ka represseeritavad (näiteks lac promootor).
    Repressor võib toimida ka mitte DNA konformatsiooni muutmise kaudu, vaid otseselt, valk-valk interaktsiooni kaudu, käitudes anti- faktorina. Sel juhul inaktiveerib ta  faktori. Näiteks 70 assotsieerub anti-sigma faktoriga Rsd, statsionaarse faasi sigma faktori S aktiivsust aga mõjutab negatiivselt RssB ja Crl positiivselt.
    Erinevalt repressorite seondumissaitidest jäävad aktivaatoreid siduvad järjestused alati -10 heksameersest järjestusest ülespoole, sest vastasel juhul takistaks nende seondumine DNA ahelate lahtisulamist.
    Aktivaatori spetsiifika on määratud tema seondumissaidi olemasoluga aktiveeritava geeni promootoralas või selle läheduses. Sageli seonduvad transkriptsioonifaktorid DNA-le kooperatiivselt. Tüüpiline DNA-ga seonduv valk sisaldab nii DNA-ga seondumise kui ka teiste valkudega interakteerumise domeene. Ühe valgu seondumine promootoralale võib soodustada teiste transkriptsiooni aktivatsioonil osalevate valkude seondumist DNA-le.Valkude kooperatiivsel seondumisel DNA-le on oluline, et nad oleksid üksteisega interakteerumiseks seondunud DNA-le samas faasis. Kui kahe seondumissaidi vaheline kaugus ei ole täispöördeline, ei pruugi valkudel transkriptsiooni aktivatsioonile efekti olla.
    Aktiveeritavatel promootoritel on -35 heksameer konsensusjärjestusest TTGACA märkimisväärselt erinev ja sel juhul soodustab aktivaator polümeraasi seondumist promootorile. Sama aktivaator võib erinevate promootorite transkriptsiooni aktivatsioonil toimida erinevalt. Aktivatsiooni mehhanism sõltub sellest, kui kaugele regulaator promootorist seondub.
    CRP (cAMP Receptor Protein ), tuntakse ka nimetuse all CAP (Catabolite Gene Activator Protein), on dimeerne valk, mis koosneb 2-st identsest 22,5 kDa suurusest subühikust (209 aminohapet). Ta on aktiivne ainult cAMP juuresolekul. CRP dimeer seondub 22 bp pikkusele palindroomsele järjestusele, mõlemale poolsaidile üks subühik. Erinevate promootorite puhul seondub CRP promootorist erinevale kaugusele:
    1) lac promootor – seondumine regiooni -72 kuni -52
    2) gal promootor – seondumine regiooni -50 kuni -25
    3) ara promootor – seondumine regiooni -107 kuni -78
    Aktivaatori ja RNA polümeraasi interaktsioon sõltub sellest, kui kaugele aktivaator transkriptsiooni alguspunktist seondub. Vastavalt interaktsiooni tüübile liigitatakse aktivaatoreid klass I ja klass II aktivaatoriteks. Klass I või klass II aktivaatorina võib sõltuvalt oma seondumiskohast käituda ka üks ja sama aktivaator (näit. CRP).
    Klass I aktivaatorid
    Aktivaator interakteerub RNA polümeraasiga, seondudes  subühiku C-terminusega (CTD), tõstes sel viisil RNA polümeraasi afiinsust promootorile. Kontaktsaidid (5 - 19 ah) on erinevate aktivaatorite puhul erinevad. Klass I aktivaatorid on näiteks Ada - aktiveerib geenid, mis osalevad oksümetüülguaniini poolt indutseeritud DNA kahjustuste reparatsioonil; IHF - stimuleerib transkriptsiooni faag lambda promootorilt pL; OmpR - osmoregulatsioon; OxyR - oksüdatiivse stressi vastus; CRP lac promootori puhul - interaktsioon soodustab CTD seondumist DNA regiooniga, mis külgneb CRP saidiga. CTD-ga seondub promootori poole jääv CRP monomeer .
    Klass II aktivaatorid
    Aktivaatori seondumisala kattub promootori -35 heksameeriga. Klassikaliseks näiteks on CRP interaktsioon RNA polümeraasiga gal promootori puhul, samuti kuulub sellesse klassi PhoB, mis kontrollib bakterirakus fosfaadi nälja puhul indutseeritavaid geene.
    CRP-l on kaks RNA polümeraasiga interakteeruvat domääni:
  • AR1 - 8 aminohapet Asp-156, Met-157, Thr-158, His-159, Pro-160, Gly-162, Met-163 ja Gln-164
  • AR2 - aktiveeriv domeen , kuhu kuuluvad aminohapped His-19, His-21, Glu-96 ja Lys-101
    gal promootori puhul on näidatud, et CRP ja RNA polümeraasi vahel toimub 2 erinevat interaktsiooni. RNA polümeraas seondub DNA-ga nii eespool kui ka tagapool CRP-d. Erinevad interaktsioonid mõjutavad transkriptsiooni aktivatsiooni erinevaid etappe :
    I CRP(AR1) - CTD kõrvaldab CTD inhibeeriva efekti, soodustades CTD seondumist ülespoole CRP sidumisala. Selle tulemusena tugevneb RNA polümeraasi ja promootori vaheline seondumine. CTD deleteerimisel kaob vajadus RNA polümeraasi interaktsiooniks CRP AR1-ga. CTD-ga seondub CRP monomeer, mis paikneb promootorist kaugemal.
    II CRP(AR2) - NTD kiirendab suletud kompleksist avatud kompleksi moodustumist. Interaktsioonil osaleb CRP monomeer, mis paikneb promootorile lähemal.
    Seega võib sama aktivaator interakteeruda RNA polümeraasi erinevate piirkondadega ja mõjutada seeläbi transkriptsiooni initsiatsiooni erinevaid etappe.
    Faag lambda CI promootori PRM aktivatsioonil on näidatud, et interaktsioon toimub aktivaatori ja  subühiku vahel.

    Transkriptsiooni aktivatsiooni kontroll DNA topoloogia kaudu


    DNA bending ja UP-elemendid


    Transkriptsiooni aktivatsioonil on sageli oluline roll DNA bendingul (paindel). Näiteks lac promootori puhul on CRP-DNA kompleksis DNA oma sümeetriatelje suhtes 90 paindunud. Leiti, et kui asendada gal promootoril CRP seondumise sait DNA järjestusega, mis on looduslikes tingimustes paindunud (pikad polü-A järjestused), toimub transkriptsiooni aktivatsioon sellelt promootorilt ka ilma CRP-ta.
    DNA bendingut on võimalik geel -elektroforeetiliselt tuvastada. Paindega DNA fragmendid liiguvad geelis aeglasemalt. Kõige aeglasemalt liigub geelis DNA fragment siis, kui paindumiskoht jääb fragmendi keskele .
    Lisaks -35 ja -10 heksameeridele on mõnede promootorite puhul leitud veel kolmas promootorelement - UP element. See on A-T rikas järjestus promootori -35 elemendist ülalpool. UP elemendi olemasolu on näidatud näiteks ribosomaalse rRNA geenide operoni rrnB promootoril P1 (regioon -40 kuni -60), flagelliini geeni promootoril B. subtilises ja faag lambda PL promootorregioonis. UP elemendiga seondub -CTD ning selle tulemusena seondub RNA polümeraas promootoriga tugevamalt. Näiteks rrnB promootori puhul võimendab UP element transkriptsiooni vähemalt 30 korda. Osade promootorite puhul võib UP elemendi mõju olla aga tunduvalt nõrgem. Selliste UP elementide järjestus erineb tunduvalt konsensusjärjestusest nnAAA(A/T)(A/T)T(A/T)TTTTnnAAAAnnn. Viimaste aastate tulemused viitavad sellele, et UP element võiks olla küllaltki levinud komponent paljude promootorite puhul. Seda on näidatud DNaas I protektsiooni katsetel (“footprinting” analüüs), kus on leitud, et -CTD protekteerib A-rikkad järjestused promootori –35 elemendist ülalpool. Seega omavad enamus A-rikkaid järjestusi, mis põhjustavad DNA paindumist (bendingut), transkriptsiooni aktivatsioonil positiivset rolli eeskätt UP-elemendina. Teatud juhtudel võib UP-element transkriptsiooni mõjutata ka negatiivselt. Seda juhul, kui -CTD seondub UP-elemendiga liiga tugevalt. Siis on raskendatud RNA polümeraasi promootorilt edasi liikumine (ingl. k. promoter clearance).
    DNA bendingut võivad põhjustada ka nukleoidiga (bakterikromosoomiga) assotsieerunud valgud , näiteks IHF (Integration Host Factor ) . IHF on heterodimeerne valk, mis seondub DNA-ga spetsiifiliselt ja painutab seda 160 kuni 180. IHF-il on enamasti arhitektuurne funktsioon – ta soodustab valk-DNA komplekside moodustumist. Selle tulemusena võib muutuda DNA heeliksi struktuur, mis omakorda soodustab avatud kompleksi teket transkriptsiooni initsiatsioonil (näiteks ilvPG promootor). Faag lambda PL promootori ja Mu Pe promootori puhul võimaldab IHF-i poolt põhjustatud DNA paindumine kontakteeruda RNA polümeraasil UP-elemendiga. 54 tüüpi promootorite puhul toob IHF-i poolt indutseeritud DNA ling kontakti promootoralaga seondunud RNA polümeraasi ja promootorist kaugemale (vähemalt 100 bp kaugusele) seondunud aktivaatorvalgu, võimaldades sel viisil nende valkude otsest interakteerumist. Nagu jällegi näha, võib sama valk erinevate promootorite puhul aktiveerida transkriptsiooni erinevate mehhanismidega.

    DNA superspiralisatsioon


    Normaaltingimustel pöörab iga aluspaar kaksikheeliksi telge 34,5 nurga võrra. DNA heeliksi täispööre saavutatakse 10,4 aluspaariga. Promootorjärjestuse TTGACA N17 TATAAT puhul on -35 ja -10 heksameerid DNA heeliksis samasse suunda eksponeeritud. See võimaldab RNA polümeraasil kontakteeruda mõlema heksameeriga. Juhul, kui heksameerid asuvad teineteisest kaugemal või lähemal kui 17 bp, on RNA polümeraasi kontakteerumine mõlema heksameeriga korraga takistatud. Heksameeride ebaoptimaalset asetust võib kompenseerida DNA superspiralisatsioon.
    Negatiivne superspiralisatsioon vähendab aluspaaride pöördumist teineteise suhtes. Sel juhul võivad DNA ahelad lahti keerduda ja eralduda. Negatiivset superspiralisatsiooni tekitab näiteks güraas.
    Positiivse superspiralisatsiooni puhul (seda tekitab näiteks topoisomeraas I) kulub ühe DNA heeliksi täispöörde saavutamiseks vähem aluspaare.
    Näited:
    mer operoni (Hg resistentsus ) ja Mu faagi mom geeni (faagi DNA modifikatsioon) promootori regulatsioonil mõjutab DNA lokaalset superspiralisatsiooni spetsiifiline regulaatorvalk. Mõlema promootori heksameeride vaheala on 19 bp pikkune. Hg(II) - MerR kompleks seondub vahealale ja põhjustab DNA ahelate lokaalset lahtikeerdumist, mis võimaldab -10 ja -35 heksameeride asetumist õige nurga alla. Sarnane mehhanism on kirjeldatud ka MuC valgu seondumisel mom promootori –28 kuni –57 regiooni.
    recA promootoril on heksameeride vaheline ala 16 bp pikkune. Promootori maksimaalne aktiivsus on saavutatud siis, kui heeliks on tihedamalt kokku keeratud. Näit. külmashoki puhul suureneb RecA valgu kogus rakus positiivse superspiralisatsiooni tõttu. Samuti on leitud, et topoisomeraas I-defektsetes tüvedes on recA geeni ekspressioonitase madalam kui mittemutantsetes tüvedes.
    lac promootoril on heksameeride vaheala 18 bp pikkune. Aeroobsetest tingimustest anaeroobsetesse üleminekul suureneb DNA negatiivne superspiralisatsioon ja transkriptsioonitase sellelt promootorilt tõuseb.
    Transkriptsiooni aktivatsioon 54 promootoritelt
    Esmalt kirjeldati 54 osalemist transkriptsiooni aktivatsioonil seoses lämmastiku metabolismis osalevate geenide regulatsiooniga (nif geenid bakteris Klebsiella pneumoniae). Sellest tulenevalt on kasutusel ka teine tähistus - N. Lisaks kontrollib 54 veel dikarboksüülhapete transporti, tolueeni ja ksüleeni katabolismi, glutamiini sünteesi, piilide, jne. sünteesi kodeerivate geenide avaldumist.
    Erinevate bakterite genoomide analüüsi põhjal võib väita, et 54 on levinud paljudes bakterites, ka graam-positiivsetes (näit. B. subtilis), puudub aga kõrge G + C sisaldusega bakterites Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia prowazekii, Mycobacterium genitalium ja M. pneumoniae.
    Erinevalt 70-tüüpi promootoritest on 54-tüüpi promootorite järjestus märksa enam konserveerunud: järjestus TGGCAC-N5-TTGCa/t paikneb regioonis -26 kuni -11, kusjuures GG ja GC vahelist kaugust (10 bp) ei tohi muuta.
    Erinevalt 70-st on 54 võimeline seonduma promootoriga ka ilma RNA polümeraasi koostisesse kuulumata. 54 võimaldab RNA polümeraasil seonduda spetsiifiliselt promootoriga, kuid sellest ei piisa avatud kompleksi tekkeks. Avatud kompleksi moodustumiseks on vajalik RNA polümeraasi interaktsioon aktivaatorvalguga ja ATP hüdrolüüs. Ilma aktivaatorita on promootor inaktiivne. Seega on 54-sõltuvad geenid kas vaikivas olekus või kõrgel tasemel ekspresseeritud.
    Transkriptsiooni võimendajad (enhancers)
    Bakterites kirjeldati transkriptsiooni võimendajaid (transcriptional enhancers – TE) esmakordselt 1986. a. Enne seda arvati, et TE-d on iseloomulikud ainult eukarüootsele rakule. TE-dele on iseloomulik, et nad:
  • toimivad distantsi tagant;
  • võivad paikneda nii promootori ees kui taga;
  • toimivad sõltumatult nende orientatsioonist.
    TE-dele seonduvad transkriptsiooni aktivaatorid (enhancer binding protein – EBP). Enamasti seonduvad EBP-d promootorist 70 - 150 bp ülespoole. On ka erandeid. Näiteks RocR, mis reguleerib B. subtilise arginiini ja ornitiini transpordi ning metabolismi geene, seondub promootorist 1500 bp ülespoole. Enterobakteritel vastutavad N-assimileerimise eest gln geenid, mis aktiveeritakse NtrC poolt. NtrC on võimeline gln promootorilt transkriptsiooni aktiveerima ka siis, kui tema seondumissaidid on viidud promootorist 3000 bp kaugusele.
    EBP-d seonduvad enamasti dimeerina ning dimeeride seondumissaite on 2 või enam. Dimeeride seondumine toimub kooperatiivselt. Skanneeriva mikroskoobi abil on näha, et NtrC oligomeriseerub gln TE-l. Kompleks sisaldab 4 NtrC dimeeri, millest 2 seonduvad otse DNA-le, järgmised 2 dimeeri seonduvad aga juba DNA-le seondunud dimeeridele läbi valk-valk interaktsioonide .
    EBP-d tuuakse 54-holoensüümkompleksiga kontakti DNA lingu abil. Selleks on 2 võimalust:
  • DNA ling moodustub juhuslikult DNA konformatsiooniliste muutuste tulemusena;
  • DNA lingu stabiliseerib spetsiifiline faktor, näiteks IHF, mis DNA-le tugeva painde.
    Transkriptsiooni aktivatsioonil toimub EBP-vahendatud ATP hüdrolüüs. Selleks, et aktivaatoril avalduks ATP-aasne aktiivsus, tuleb ta viia aktiivsesse konformatsiooni. Selleks on erinevaid võimalusi:
  • Aktivaatori fosforüleerimine. Näiteks NtrC puhul toimib NtrB-vahendatud fosforüleerimise kaskaad , fosforüleeritud NtrC-l suureneb afiinsus TE suhtes ja toimub valgu oligomeriseerumine;
  • Seondumine efektormolekuliga.
    E. coli rakus on 600-700 70 ja 100 54 molekuli. Samas on E. coli genoomis ainult 20 54–sõltuvat promootorit. Seega on isegi madalama afiinsusega promootorid 54-holoensüümi poolt okupeeritud ja valmis aktivatsiooniks.
    Miks on nii vähe 54-sõltuvaid promootoreid? Arvatakse, põhjus on selles, et bakterigenoomis on geenidevahelised alad liiga lühikesed, et EBP-d saaksid seonduda reguleeritavast promootorist sobivale kaugusele, ilma et see häiriks teiste geenide tööd.
    Nii see, et transkriptsiooni aktivatsioon 54 tüüpi promootorilt saab toimuda ainult transkriptsiooni aktivaatori juuresolekul kui ka see, et aktivaator toimib distantsi kaudu, võimaldab tuua paralleele RNA polümeraas II poolt läbiviidava transkriptsiooni aktivatsiooni mehhanismidega eukarüootses rakus.
    Transkriptsiooni vaigistamine (transcriptional silencing) bakterites
    Geeniregulatsiooni negatiivne kontroll võib toimuda kahel viisil:
  • Repressioon;
  • Vaigistamine
    Repressiooni puhul seondub repressorvalk spetsiifiliselt promootorregiooni kindlasse saiti, pärssides RNA polümeraasi funktsiooni lokaalselt. Vaigistamise puhul katavad valgud ühtlaselt teatava DNA regiooni ja takistavad sinna teiste valkude seondumist. Selle tulemusena ei ole DNA kättesaadav ei DNA-d modifitseerivatele ensüümidele ega ka ligipääsetav RNA polümeraasile. Transkriptsiooni vaigistamine on üks põhilisi transkriptsiooni kontrollmehhanisme eukarüootides, bakterites on see vähem levinud.
    Mõned näited:
    H-NS (histone-like nucleoid-structuring protein) kondenseerib sarnaselt histoonidele DNA-d (samas on ta histoonidest struktuuri poolest erinev ning laengult neutraalne). H-NS vaigistab näiteks βD-glükosiidide kasutamisega seotud bgl geene, seondudes 100-bp pikkusele AT-rikkale alale , mis asub nende geenide promootorist ülalpool. H-NS seondub eelistatult korduvat AT-motiivi sisaldavale paindega DNA-le ja oligomeriseerub seal. H-NS mõjutab ka DNA topoloogiat, suurendades DNA negatiivset superspiralisatsiooni.
    Dps (DNA-binding protein from starved cells) hulk suureneb drastiliselt statsionaarse faasi rakkudes. Dps seondub DNA-ga mittespetsiifiliselt, on DNA-d kaitsva funktsiooniga ja arvatakse, et tema seondumine DNA-ga võib pärssida ka osade geenide transkriptsiooni statsionaarses faasis.

    3. Geeniekspressiooni regulatsioon transkriptsiooni terminatsiooni tasemel


    Transkriptsiooni elongatsioon ei toimu ühtlase kiirusega. RNA polümeraas võib transkriptsiooni käigus peatuda (ingl. k. “pausing”) juuksenõelastruktuuride moodustumise tõttu vast-sünteesitud mRNA-s. Peatumise aeg varieerub, sõltudes RNA järjestusest. Terminaatoritena toimivate sekundaarstruktuuride puhul peatub RNA polümeraas ligikaudu 60 sekundit. RNA sekundaarstruktuuri tekkimine võib destabiliseerida DNA::RNA hübriidi. Selle tulemusena RNA dissotseerub ja transkriptsiooni elongatsioonikompleks laguneb. Terminatsiooni võib põhjustada ka spetsiifilise terminatsioonifaktori seondumine RNA-le. Sellest tulenevalt on bakterites kirjeldatud 2 erinevat terminatsioonimehhanismi:
  • rho-sõltuva mehhanismi puhul seondub heksameerne rho valk RNA 5´ otsast spetsiifilisele järjestusele ja jõuab järele RNA polümeraasile, mis on peatunud RNA sekundaarstruktuuri tõttu. Selle tulemusena dissotseerub RNA rho-sõltuva terminaatorjärjestuse kohal matriitsilt. Näiteks faag lambdal termineeruvad promootoritelt pL ja pR algavad transkriptid järjestustel tL1 ja tR1.
  • rho-sõltumatu terminatsiooni mehhanismi korral on terminaatoriks järjestus, mis kodeerib stabiilset G-C rikast juuksenõelastruktuuri ning sellest 3’ suunas jääb mitu U-d. Terminatsioon toimub pärast U-de lülitumist. Juuksenõela moodustumine viib RNA:DNA hübriidi lahutamisele U-rikkast järjestusest. rU::dA RNA-DNA hübriid võib olla piisavalt ebastabiilne, et RNA vabaneks transkriptsioonikompleksist. Sellised terminaatorsignaalid paiknevad sageli operonide lõpus mittetransleeritavates järjestustes pärast stop koodoneid (näiteks trp operoni lõpus).
    Mittetransleeritavate RNA-de (rRNA ja tRNA) transkriptsiooni peatumist või termineerumist soodustavad nendele molekulidele iseloomulikud sekundaarstruktuurid. Selleks, et vastavaid geene siiski transkribeeritaks, vajatakse spetsiaalseid antiterminatsiooni faktoreid nagu näiteks Nus valk (N-utilization, kirjeldatud esmalt faag lambda puhul) ja ribosoomi valk S10.
    Transkriptsiooni attenuatsioon
    Bakteritel on transkriptsioon ja translatsioon omavahel väga tihedalt seotud: parasjagu sünteesitavalt mRNA-lt algab kohe ka translatsioon. Nende kahe protsessi praktiliselt samaaegne toimumine võimaldab reguleerida transkriptsiooni termineerumist transkriptsiooni ja translatsiooni elongatsiooni kiiruste kaudu. Regulatsioon toimub spetsiifilistelt liiderjärjestustelt, millel on potentsiaal moodustada RNA sekundaarstruktuure ning sellesse ei ole kaasatud regulaatorvalke. Transkriptsiooni attenuatsioonil osalevad nii rho-sõltuvad kui ka rho-sõltumatud terminaatorid. Regulatsiooni transkriptsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud näiteks aminohapete biosünteesi operonidel, pürimidiini biosünteesi operonil, aminoatsüül tRNA süntetaasi operonil ja trüptofaani degradatsiooni operonil.
    Aminohapete biosünteesi operonid
    Enamasti on klassikaliseks attenuatsiooni näiteks toodud trp operoni transkriptsiooni regulatsioon. Operoni mRNA liiderjärjestuses on 4 regiooni, mille baasil võivad moodustuda alternatiivsed sekundaarstruktuurid. Regioonide 3 ja 4 paardumisel moodustub rho-sõltumatu transkriptsiooni terminaator . Omavahel võivad paarduda ka regioonid 1 ja 2 või 2 ja 3. Just regioonide 2 ja 3 paardumine takistab teminaatorstruktuuri moodustumist. Milliste regioonide baasil juuksenõelastruktuurid moodustuvad, sõltub sellest, kui palju on rakkudes trüptofaani. Operon kodeerib liiderpeptiidi, milles asuvad nn. kontrollkoodonid, antud juhul Trp koodonid . Trüptofaani defitsiidi korral peatub translatsioon kontrollkoodoni kohal ja liider-RNA-s paarduvad regioonid 2 ja 3. Regioonide 3 ja 4 omavaheline paardumine on takistatud. Selle tulemusena trp operoni transkriptsioon jätkub. Kui aga rakus on piisavalt trüptofaani, peatub ribosoom alles liiderpeptiidi kodeeriva mRNA lõpus, regioonide 2 ja 3 omavaheline paardumine on takistatud ja omavahel saavad paarduda regioonid 3 ja 4, termineerides transkriptsiooni. Sarnane regulatsioon toimub ka teiste aminohapete biosünteesi operonide transkriptsioonil. Juhul, kui operon kodeerib rohkem kui ühe aminohappe biosünteesi, sisaldavad vastavate operonide liiderpeptiidi kodeerivad järjestused kõigi nende aminohapete koodoneid. Näiteks ilvGDMEA kodeerib isoleutsiini, valiini ja leutsiini biosünteesi ning sel juhul on liiderpeptiidi kodeerivas järjestuses kontrollkoodoniteks Ile, Val ja Leu.
    Pürimidiini biosünteesi operonid
    Pürimidiini biosünteesi kodeeriv pyrB1 operon kodeerib samuti liiderpeptiidi. Transkriptsiooni terminatsiooni põhjustav sekundaarstruktuur lõhutakse transkriptsiooni ja translatsiooni koosmõjul. 20 nt enne liiderpeptiidis olevat terminatsioonisaiti asuvad 8 uridiinnukleotiidi. UTP madala kontsentratsiooni korral aeglustub traskriptsiooni elongatsioon U-järjestuse sünteesil. Sel juhul jõuab transleeriv ribosoom RNA polümeraasile järele ning nende koostoime tulemusena lõhutakse transkriptsiooni terminaatorina toimiv sekundaarstruktuur. Kõrge UTP kontsentratsiooni korral RNA polümeraas U-järjestuse kohal ei peatu, mistõttu translatsiooni ja transkriptsiooni koosmõjul ilmnevat RNA sekundaarstruktuuri lõhkumist ei toimu. Esitatud mudeli tõepärasust kinnitavad katsed ribosoomi mutantidega, kus translatsiooni elongatsioon toimub aeglasemalt ning sel juhul väheneb proportsionaalselt ka operoni transkriptsioonitase.
    Aminoatsüül tRNA süntetaasid
    Aminohapete nälja korral tõuseb rakkudes aminoatsüül tRNA süntetaaside hulk. See võimaldab efektiivsemalt kasutada veel olemasolevaid aminohapete ressursse enne, kui vastavad biosünteesirajad on uuesti tööle lülitatud. Süntetaaside geenidel on konserveerunud sekundaarstruktuuridega liiderjärjestus, mis sisaldab ka potentsiaalset transkriptsiooni terminaatorjärjestust. Terminaatorjärjestuse destabiliseerib vastava tRNA antikoodonjärjestuse ja süntetaasi geeni mRNA liiderjärjestuses asuva koodonjärjestuse interaktsioon. Erinevate tRNA süntetaaside liiderjärjestused sisaldavad erinevaid koodonjärjestusi sõltuvalt sellest, millise tRNA süntetaasiga on tegemist. Kui teatavat aminohapet on rakus vähe, on enamus sellele aminohappele vastavaid tRNA molekule vabad ja võimelised interakteeruma liiderjärjestuses paikneva koodonjärjestusega. Aminohappe kõrge kontsentratsiooni korral on enamus tRNA molekule laetud ja seega võimetud interakteeruma liiderjärjestuses asuva koodoniga. Tulemuseks on aminoatsüül tRNA süntetaasi geeni transkriptsiooni terminatsioon.
    Trüptofaani degradatsioon
    Transkriptsiooni regulatsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud ka kataboolsetel operonidel. Üheks näiteks on trüptofaani katabolismi operoni tnaAB regulatsioon. Operoni 319 nt- pikkuses liider-RNA-s moodustub rho-sõltuv transkriptsiooni terminaator. Liiderjärjestus kodeerib 24 aminohappe pikkust liiderpeptiidi ning kodeeriva järjestuse kindlas positsioonis asub Trp koodon . Kui trüptofaani rakus pole, translatsioon sellel kohal peatub ning rho-faktor saab seonduda RNA-ga, mille tulemusena transkriptsioon termineerub. Trüptofaani ülehulgas tõuseb tnaAB transkriptsioonitase rakus 100 korda, kuna rho-sõltuvat transkriptsiooni terminatsiooni ei toimu.
    Transkriptsiooni antiterminatsioon regulaatorvalkude abil
    Transkriptsiooni antiterminatsiooni spetsiifiliste valkude abil on kirjeldatud eeskätt suurte operonide puhul, kus geenide avaldumine toimub etapiviisiliselt. Antiterminatsioonil on kirjeldatud 2 mehhanismi:
  • RNA polümeraasi modifitseerimine nii, et transkriptsioon ei termineeru terminaatorjärjestusel (faag lambda terminaatorid, rrn operonid).
  • Terminaatori moodustumine on takistatud valgulise faktori abil, mis seondub mRNA-ga.
    Antiterminatsioon valgulise faktori abil, mis seondub mRNA-ga
  • Biosünteesi regulatsioon
    Bacillus subtilise trp operon on negatiivselt reguleeritud TRAP (Trp Attenuator Protein) poolt. Trp olemasolul seondub see valk (G/U)AG kordusjärjestustele, mis asuvad trp mRNA liiderjärjestuses. Trp puudumisel TRAP ei seondu ja moodustub antiterminaator – alternatiivne sekundaarstruktuur, mis kattub terminaatorjärjestusega).
    b) Kataboolsete operonide regulatsioon
    B. subtilis’el on kirjeldatud 6 transkriptsiooni antiterminatsiooni kaudu reguleeritavat süsteemi (näiteks sahharoosi ja -glükosiidide metabolism), E. coli ja P. aeruginosa puhul 3.
    E. coli bgl operonis paikneb 3 geeni, mis on vajalikud aromaatsete -glükosiidide (salitsiin) kasutamiseks:
    ter ter
    bglG bglF bglB orf
    antiterminaator- -glükosiidide fosfo --
    valk transporter, glükosidaas
    fosfotransferaas
    BglG on antiterminaatorvalk, mis seondub spetsiifiliselt operoni liiderjärjestusele. Seostumine toimub 32 nt-pikkusele märklaudjärjestusele RAT (ribonucleic antiterminator). Selle tulemusena stabiliseerub alternatiivne sekundaarstruktuur, mis lõhub transkriptsiooni terminaatori. -glükosiidide puudumisel on BglG fosforüleeritud BglF poolt, jääb monomeerseks ning pole võimeline seonduma RAT-ile. Fosforüleerimata BglG vorm aga dimeriseerub ja seondub RAT-ile, mille tulemusena transkriptsioon ei termineeru.
    Antiterminatsioon RNA polümeraasi modifitseerimise kaudu
  • Faag lambda lüütilise tsükli geenide transkriptsioon
    RNA polümeraasi modifitseerimine faag lambda N valgu poolt võimaldab transkribeerida faag lambda lüütilise tsükli geene. Antiterminatsioonil osalevad ka E. coli valgud NusA, NusB, NusE (ribosoomi valk S10) ja NusG. Antiterminatsioonikompleks moodustub promootoripoolsel RNA järjestusel (nut sait) ning ei lase rho- valgul seonduda. Selleks interakteerub NusA otseselt antiterminatsioonivalguga N ning RNA polümeraasi CTD seondub NusA-ga.
    b) Ribosomaalse rRNA operonide rrn transkriptsioon
    rrn operonid sisaldavad faag lambdale sarnast nut elementi (boxA, boxB). Erinevus on selles, et lambda antiterminatsioonikompleks on resistentne ka rho-sõltumatutele terminaatoritele. rrn operoni RNA 5’ ots jääb antiterminatsioonikompleksi moodustumise kaudu seotuks RNA polümeraasiga. See soodustab 16S rRNA ja 23S rRNA protsessingut 30S rRNA prekursorist.

    4. Geeniekspressiooni regulatsioon mRNA stabiilsuse kaudu


    mRNA hulk rakus sõltub sellest, kui kiiresti mRNA-d sünteesitakse ja degradeeritakse. Seega on geeniekspressiooni seisukohalt lisaks transkriptsiooni aktivatsiooni regulatsioonile oluline ka mRNA stabiilsus rakus. Kui teatavat geeni enam ei transkribeerita, kuna vastavat geeniprodukti pole hetkel rakus vaja, tuleb vastav mRNA kiiresti lagundada. mRNA degradatsioonil on sageli oluline roll ka geenide ekspressiooni taseme reguleerimisel operonisiseselt. Erinevate mRNA-de poolestusaeg bakterirakus varieerub enamasti vahemikus poolest minutist kuni 5 minutini. Nii võib ka erinevate geenide mRNA eluiga operonisiseselt olla väga erinev.
    mRNA degradatsioonil puudub ühtne rada. Iga individuaalse mRNA stabiilsuse seisukohalt on olulised nii tema sekundaarstruktuur kui ka translatsiooni kiirus. Teatavad sekundaarstruktuurid stabiliseerivad mRNA-d, osa on aga substraadiks endonukleaasidele. Degradatsiooni viivad läbi erinevad ekso - ja endoribonukleaasid. Paljud mRNA-d on stabiilsemad siis, kui neid efektiivselt transleeritakse, sest siis on nad ribosoomidega tihedalt kaetud ja seetõttu kaitstud RNaaside toime eest. Degradatsiooniradade suhtes esineb komplementatsioon. Kui rakk on defektne ühe degradatsiooniraja suhtes, võib mRNA degradatsioon toimuda ka teise degradatsiooniraja kaudu, nii et silmatorkavat efekti mRNA stabiilsusele ei pruugi alati ilmneda. Kui ka komplementeeriv degradatsioonirada on defektne, on see rakkudele letaalne .

    Ensüümid, mis osalevad mRNA degradatsioonil


    Bakterites on kirjeldatud üle 20 RNaasi, mis osalevad tRNA-de ja rRNA protsessingul. Mõned neist osalevad ka mRNA degradatsioonil. Vastavalt sellele, kas nad lõikavad RNA molekulide sisemistesse järjestustesse, lõhkudes fosfodiestersidemeid või lagundavad RNA molekule otsast, jaotatakse RNaase endo - ja eksoribonukleaasideks.
    Eksoribonukleaasid
    Erinevalt eukarüootidest on bakteritel kirjeldatud ainult 3’  5’ suunas mRNA-d lagundavaid eksoribonukleaase. Põhilised mRNA-d degradeerivad eksoribonukleaasid on polünukleotiidi fosforülaas ja RNaas II. Juhul, kui degradatsiooni käigus ei tule ette ületamatuid sekundaarstruktuure, jäävad algsetest mRNA molekulidest järele ainult lühikesed, 10 – 20 nt-pikkused oligonukleotiidid molekulide 5’ otstest . Tekkinud oligod degradeerib RNaas I. Paljudel mRNA-del on 3’ otsas juuksenõelastruktuur, mis on mRNA-d stabiliseeriva toimega. Arvatakse, et see juuksenõelastruktuur ei pruugi alati sugugi olla transkriptsiooni terminaator, vaid hoopis pikema transkripti 3’  5’ suunas toimunud degradatsiooni produkt. mRNA 3’ otsas moodustunud juuksenõelastruktuuride stabiliseeriva toime uurimine in vivo ja in vitro katsetes on andnud vastuolulisi tulemusi. In vitro tingimustes on mRNA 3’ otsas asuva juuksenõelastruktuuri eksonukleaasi pärssiv mõju tunduvalt lühiajalisem kui in vivo tingimustes. Seega peavad rakus olema veel mõned lisafaktorid, mis stabiliseerivad juuksenõelastruktuure.
    Polünukleotiidi fosforülaas (PNPaas)
    PNPaas on pnp geeni produkt, mis degradeerib mRNA-d fosforolüütiliselt. Lagundamise käigus vabaneb fosfodiestersidemetest energia, mis võib stressis olevatele rakkudele olla oluliseks energiaallikaks ja aidata neil ellu jääda. Degradatsiooniproduktideks on nukleosiid difosfaadid ja 10 - 20 nt oligod mRNA-de 5’ otstest.
    RNaas II
    RNaas II on rnb geeni produkt. RNA hüdrolüüsi tulemusena vabanevad nukleosiid 5’ monofosfaadid. Võrreldes PNPaasiga on RNaas II puhul mRNA 3’ otsas paiknevate juuksenõelastruktuuride mRNA-d stabiliseeriv toime efektiivsem.
    Ühe eksonukleaasi suhtes mutantsed rakud kasvavad normaalselt, mõlema ensüümi defektsus on rakkudele aga letaalse toimega. RNaas II ja PNPaas-i topeltmutantide puhul toimub rakkudes 150 – 1500 nt pikkuste mRNA fragmentide akumuleerumine.
    Endonukleaasid
    Endonukleaaside poolt teostatavad atakid määravad sageli mRNA degradatsiooni edasise kiiruse, kuna aitavad kõrvaldada mRNA 3’ otsast juuksenõelastruktuure. Sageli lõikavad nad 5’ otsa lähedalt, mille tulemusena mRNA destabiliseerub ja allub edasisele kiirele lagundamisele.
    RNaas E
    RNaas E on rne geeni produkt. See ensüüm on üks põhilisi mRNA degradatsioonil osalevaid endoribonukleaase. Kuna RNaas E-defektsetes mutantides pikeneb mRNA-de eluiga, viitab see sellele, et RNaas E poolne atakk on mRNA degradatsiooni kiirust mõjutav etapp. RNaas E tunneb ära spetsiifilisi sekundaarstruktuure, kuid lõikab nende kõrvalt üksikahelalist RNA-d, mille puhul on erinevate mRNA-de degradatsiooni uurides pakutud välja erinevaid konsensusjärjestusi. Enamasti pakutakse konsensuseks järjestust RAUUW, kus R = A või G ja W = A või U ning eelistatult toimub lõige AU dinukleotiidist 5’ suunas.
    RNaas E lõikespetsiifikat on detailsemalt uuritud pBR322 108 nt-pikkuse mittetransleeritava RNA, RNA I puhul. Leiti, et RNA I 5’ otsas olev juuksenõelastruktuur stabiliseerib RNA-d, kuid 5 mittepaardunud nt enne seda sruktuuri on destabiliseeriva toimega, võimaldades RNaas E-l mRNA 5’ otsale seonduda ja RNA-d lõigata. Seega on RNaas E lõikamissaidi puhul olulised nii mRNA primaarjärjestus kui ka sekundaarstruktuurid.
    RNaas III
    RNaas III on rnc geeni produkt, mis lõikab peamiselt rRNA-d. Ensüüm tunneb ära lühikesi mittepaardunud regioone sisaldavaid juuksenõelastruktuure ja lõikab mittepaardunud kohtadesse kas ühes või mõlemas kaksikahelalise struktuuri ahelas. Siiski ei allu RNaas III lõikusele suvaline kaksikahelaline RNA struktuur. Kuigi on üritatud välja tuua konsensust ka primaarstruktuuri tasemel, võivad ensüümi spetsiifika suhtes määravaks osutuda eeskätt just kõrgemat järku struktuurid .
    RNaas III osalust on näidatud faagi T4 varajaste geenide mRNA protsessingul, kus mRNA muutub tranlatsiooniliselt aktiivseks alles pärast selle ensüümi lõiget algsesse mRNA molekuli. Faag lambda int geeni mRNA (kodeerib integraasi) puhul aga soodustab RNaas III selle edasist degradatsiooni. Vastava mRNA atakeeritavus RNaas III poolt sõltub int geeni transkriptsiooni terminatsioonist. int geeni transkriptsioon võib toimuda kahelt promootorilt:
  • Transkriptsioon promootorilt pI lõpeb terminaatoriga tI, mis kattub osaliselt järjestusega sib. Sellelt mRNA-lt sünteesitakse Int valk.
  • Transkriptsioon promootorilt pL, mis ei termineeru tänu N valgule (kuna transkribeeritakse ka N valgu geeni). Selle tulemusena transkribeeritakse sib järjestus, mis on atakeeritav RNaas III poolt.
    RNaas III poolt on lõigatavad näiteks sellised bakteriaalsed mRNA-d nagu RNA polümeraasi  ja ’ subühikuid kodeerivad mRNA-d ja PNPaasi mRNA.
    RNaasI/I*
    Eksoribonukleaasid RNaas II ja PNPaas degradeerivad mRNA molekule 3’ otsast kuni nende 5’ otsa lähedale. Järelejäänud 10 – 20 nt pikkuseid oligonukleotiide degradeerib tsütoplasmaatiline RNaas I või tema periplasmas asuv vorm RNaas I*. Tsütoplasmaatiline vorm degradeerib lisaks oligonukleotiididele ka polümeerseid RNA molekule.
    RNaas P
    RNaas P on ribosüüm, mis protsessib peamiselt tRNA-de 5’ otsi, kuid osaleb ka mRNA degradatsioonil.

    RNA degradasoom


    Bakteriaalse mRNA degradatsioonil osalevad kombineeritult nii ekso- kui endonukleaasid. RNA degradasoom on multiensüümkompleks, kuhu kuuluvad RNaas E ja PNPaas. Lisaks neile kuuluvad kompleksi veel RhlB (DEAD-box RNA helikaas ) ja glükolüütiline ensüüm enolaas. RNA degradasoomiga on assotsieerunud ka shaperonid DnaK ja GroEL ja polüfosfaadi kinaas PPK.
    RNaas E N- terminaalne domeen on endonukleaasse aktiivsusega. Samasse domeeni lokaliseeriti hiljuti veel RNA 3’ otsas olevate polü(A) ja polü (U) järjestuste degradatsiooniline aktiivsus. Ensüümi C-terminaalne domeen interakteerub degradasoomi 3 ülejäänud komponendiga. RhlB on ATP-sõltuv RNA helikaas, mis sisaldab konserveerunud aminohappeid D-E-A-D ning aitab lahti harutada RNA sekundaarstruktuure, mis vastasel korral blokeeriksid PNPaasi töö. RhlB helikaasne aktiivsus avaldub ainult siis, kui ensüüm on interakteerunud RNaas E-ga.
    mRNA stabiilsust mõjutavad tegurid
    Translatsioon
    Bakterirakus on transkriptsioon ja translatsioon omavahel tihedalt seotud. Alles sünteesitavalt mRNA-lt algab koheselt translatsioon, mistõttu ta on ribosoomidega kaetud. Translatsioon kaitseb mRNA-d degradatsiooni eest, sest sel juhul on mRNA tänu ribosoomidele vähem nukleaasidele eksponeeritud. Samas on kirjeldatud ka mRNA-sid (näiteks lac operoni mRNA), mille eluiga ei sõltu nende translatsiooni efektiivsusest. Seega sõltub konkreetse mRNA stabiilsus sellest, kas mRNA ribosoomidega katmata ala on nukleaaside poolt atakeeritav või mitte.
    mRNA stabiilsust mõjutavad järjestused
    mRNA stabiliseerimisel on näidatud nii 5’ kui ka 3’ otsas paiknevate sekundaarstruktuuride mõju. Samas ei ole sekundaarstruktuuride mRNA-d protekteeriv toime universaalne, vaid sõltub iga konkreetse mRNA atakeeritavate saitide kontekstist ja sellest, millised nukleaasid seda mRNA-d veel atakeerivad.
    UTR järjestused
    ompA (kodeerib välismembraani valku A) mRNA 5’ otsas on 133 nt mittetransleeritav regioon UTR, mis stabiliseerib mRNA-d. Selle järjestuse effekt sõltub ka rakkude kasvukiirusest. E. coli rakkude pooldumisel 40 minuti tagant on ompA mRNA poolestusaeg 17 minutit, UTR puudumisel 3 - 4 minutit. Rakkude kasvu aeglustumisel väheneb ompA mRNA poolestusaeg 5 minutile ka UTR-i olemasolul. UTR moodustab 3 juuksenõelastruktuuri. Stabiliseeriva toime seisukohalt on oluline, et nende ette ei jääks üksikahelalist ala.
    Katseliselt on näidatud, et ompA UTR-i kloneerimine teiste mRNA-de ette tõstab ka nende stabiilsust. Näiteks bla mRNA (kodeerib -laktamaasi) poolestusaeg tõuseb 3 minutilt 18 minutini. E. coli, Serratia marrescenc’i ja Enterobacter aerogenes’e ompA geenide 5`otste UTR-de võrdlemisel ilmnes, et nende järjestus on erinev, kuid sekundaarstruktuur sarnane. Kõik nad stabiliseerivad E. coli’s mRNA-d.
    mRNA-d stabiliseerivad ka molekuli 3’ otsas mittetransleeritavasse alasse jäävad juuksenõelastruktuurid. Arvatakse, et eksonukleaaside kinnitumiseks 3’ otsale on vaja üksikahelalist ala vahetult molekuli otsas. Lisaks võib mRNA 3’ otsast sissepoole jääv sekundaarstruktuur nii stabiilne olla, et takistab eksonukleaasil mRNA edasist degradeerimist.
    REP järjestused
    REP järjestused on lühend inglisekeelsest terminist “ Repetitive extragenic palindromic sequences”. Need on kõrgelt konserveerunud pöördkordusjärjestused, mis võivad mRNA-s olla aluseks juuksenõelastruktuuride moodustumisele. E. coli genoomis on REP järjestusi 500 - 1000 koopiat (1% genoomist). mRNA-dest sisaldab REP järjestusi 25%. Enamasti asuvad nad geenidevahelistes alades. Mõnedel juhtudel (näiteks his ja mal operonid, mis on vastutavad histidiini ja maltoosi transpordi eest) on REP järjestustel mRNA-d stabiliseeriv toime. Samas aga cat geeni puhul (kodeerib kloroamfenikooli atsetüültransferaasi) geeni 3’ otsas olevad REP järjestused mRNA-d ei stabiliseeri, sest endonukleaasid tunnevad ära sellest järjestusest ülespoole jäävaid alasid.
    Polü(A) järjestused 3’ otsas
    Bakterirakus on kirjeldatud 2 polü(A) polümeraasi – PAP I ja hiljuti PAP II. PAP I on pcnB geeni produkt. PAP I mõju RNA stabiilsusele kirjeldati esmakordselt RNA I puhul. RNA I on ColE1 plasmiidide replikatsioonil repressorina toimiv antisens-RNA, mis interakteerub plasmiidi replikatsiooni initsiatsioonil praimerina toimiva RNA-ga.
    PAP I-defektsetes mutantides on kirjeldatud mitmete mRNA-d stabiliseerumist:
    lpp - lipovalk
    ompA - välismembraani valk A
    trxA - tioredoksiin
    rpsO - ribosoomi valk S15
    3’ otsas polü(A)-järjestust sisaldavad RNA molekulid on PNPaasi ja RNaas II poolt paremini atakeeritavad, kuna polü(A)-järjestus võib olla nende nukleaaside kinnitumiskohaks muidu vahetult 3’ otsas sekundaarstruktuuri sisaldavatele mRNA-dele. Kui rakud on defektsed nii PAP I kui ka PAP II suhtes, on see rakkudele letaalne. Arvatakse, et mRNA polüadenüleerimine on bakterirakus pidevalt toimuv protsess, mis aitab kaasa mRNA molekulide täielikule degradeerimisele. Näiteks PNPaasi- ja RNaas II-defektsetes tüvedes on rakku kuhjuvad mRNA degradatsiooni vaheproduktid polüadenüleeritud.
    Operonisisene geeniekspressiooni regulatsioon
    Kuigi geenide transkriptsioon võib alata sama(de) promootori(te) alt, vajab rakk vastavaid geeniprodukte sageli erinevas koguses. Operoni geenidevahelises alas on leitud järjestusi, mille baasil võivad tekkida RNA sekundaarstruktuurid. Polütsistroonse mRNA lõikamine algab enamasti geenide vahelt ning kuna tekkinud mRNA segmendid on erineva elueaga, võib see olla üheks mehhanismiks , mis aitab reguleerida geenide ekspressioonitaset operonisiseselt. Näiteks laktoosioperoni puhul toimub lacY-spetsiifilise mRNA degradatsioon ligikaudu 2-korda kiiremini kui lacZ mRNA lagundamine.
    Geenide ekspressioonitaset kontrollitakse operonisiseselt mRNA stabiilsuse kaudu F plasmiidi tra operonis. See operon on 32 kb-pikkune ja sisaldab hulgaliselt geene, mille produktide järele on rakus erinev vajadus. Kõige enam vajatakse traA geeni produkti piliin, mis on piilide koostisosa . Piliini kodeerivad mRNA segmendid on teistest tunduvalt stabiilsemad. Kuigi nad on 5’ otstest heterogeensed, on kõigi segmentide 3’ otsad identsed mRNA-d stabiliseeriva juuksenõelastruktuuri tõttu.
    5. Translatsiooni regulatsioon
    Translatsiooni regulatsioon võib toimuda kas initsiatsiooni, elongatsiooni või terminatsiooni kaudu. Regulatsioon translatsiooni tasemel võimaldab samuti täpsemalt moduleerida polütsistroonse mRNA-na transkribeeritavate geenide avaldumist.

    Translatsiooni pärssimine valkude või antisens RNA poolt


    Translatsiooni initsiatsiooniks peab mRNA seonduma ribosoomis asuva 16S rRNA 3’otsaga. Seondumine toimub spetsiifilise järjestuse – RBS (ribosome binding site) abil. Translatsiooni initsiatsiooni efektiivsust mõjutavad RBS-i homoloogia 16S rRNA-ga, RBS-i ja initsiaatorkoodoni vaheline kaugus ja teised mRNA järjestuse elemendid. Osade polütsistroonsete mRNA-de puhul paiknevad geenid nii lähestikku, et lõppeva geeni stop koodon ja temale järgneva geeni initsiaatorkoodon asuvad kõrvuti või kattuvalt. Sel juhul ei dissotseeru ribosoomid pärast stop koodonit mRNA-lt, vaid difundeeruvad külgneva geeni initsiaatorkoodonini ning alustavad järgmise polüpeptiidi sünteesi. Selline mehhanism võimaldab erinevate valkude sünteesi täpsemalt koordineerida. Sel viisil (protsessi inglisekeelne nimetus on “ translational coupling”, maakeeles sobib vast termin “translatsiooni sidumine”) on sünteesitud näiteks faag lambda hiliste geenide poolt kodeeritud kapsiidivalgud, mida on vaja kindlal ajal kindlas hulgas ja vahekorras faagipartiklite assambleerimisel.
    Juhul, kui RBS on blokeeritud kas teda sisaldava mRNA järjestuse paardumise tõttu antisens RNA-ga või on RBS-i maskeeriv sekundaarstruktuur moodustunud mRNA enda järjestuse baasil, on translatsiooni initsiatsioon pärsitud. Translatsiooni initsiatsioonisaiti võib olla seondunud ka spetsiifiline repressorvalk.
    Ribosoomivalkude operonide translatsiooni regulatsioon
    Ribosoomivalkude (R-valgud) geenid rps ja rpl asuvad mitmes operonis ning nende süntees on kontrollitud R-valkude endi poolt. Sellise autoregulatsiooni puhul seondub üks reguleeritava operoni poolt kodeeritud R-valkudest vastava polütsistroonse mRNA spetsiifilisele järjestusele, mis külgneb RBS-iga ja sisaldab initsiaatorkoodonit AUG. See spetsiifiline järjestus sarnaneb rRNA järjestusele, kuhu vastav regulatoorne R-valk seondub ribosoomis. Mida aeglasem on rakkude kasvukiirus, seda vähem on neis ribosoome. R-valkude sünteesi autoregulatsioon võimaldab hoida rakkude kasvukiiruse muutumisel proportsioonis erinevate ribosoomikomponentide sünteesi. Rakkude kasvukiiruse aeglustumisel väheneb rRNA sünteesi hulk. Kui rakud kasvavad kiiresti, on rakusisene rRNA hulk kõrge ja regulatoorsed R-valgud seonduvad rRNA-ga, kuna nende seondumisafiinsus rRNA-le on kõrgem kui mRNA-le. Kui kogu rRNA on asambleeritud ribosoomidesse, seonduvad regulatoorsed R-valgud mRNA-le ja pärsivad iseenda ja ka teiste sama polütsistroonse mRNA poolt kodeeritud R-valkude sünteesi.
    Faagi T4 ssDNA -ga seonduva valgu translatsioon
    T4 valk gp32 on ssDNA-ga valk, mis osaleb faag T4 replikatsioonil. Kui ssDNA on ära seotud, seondub gp32 enda mRNA-le, pärssides sellelt translatsiooni. Seega on gp32 hulk rakus otseselt seotud vaba ssDNA hulgaga .
    Translatsiooni initsiatsiooni pärssimine antisens-RNA abil
    micF on iseseisva geeni poolt kodeeritud antisens-RNA, mis paardub endale osaliselt komplementaarse mRNA 5’ otsaga. micF RNA on translatsiooniline repressor. Ta paardub ompF (kodeerib välismembraani valku F) mRNA RBS-i ja initsiaatorkoodonit AUG sisaldava alaga, blokeerides ompF geeni translatsiooni. Need micF RNA molekulid, mis ei ole paardunud ompF mRNA-ga, võtavad sekundaarstruktuuri, mis soodustab nende degradatsiooni. micF RNA ekspressioonitase on rakus maksimaalne madala temperatuuri ja madala osmootse rõhu korral.
    Antisens-RNA-de kaudu on kontrollitud ka näiteks IS10 transposaasi translatsioon ja raku jagunemise initsiaatorvalgu FtsZ translatsioon. Ka neil juhtudel seondub antisens-RNA märklaud-mRNA-de RBS-i sisaldava regiooniga, takistades sel viisil translatsiooni initsiatsiooni. IS10 transposaasi mRNA muutub lisaks sellele veel ka RNaas III poolt atakeeritavaks.
    Translatsiooni attenuatsioon
    Translatsiooni attenuatsiooni on kirjeldatud MLS (makroliid, linkosamiid, streptogramiin) tüüpi antibiootikumide resistentsuse kujunemisel. Stafülokokid, streptokokid ja streptomütseedid saavutavad resistentsuse MLS antibiootikumide suhtes 23S rRNA modifitseerimise tulemusena. Staphylococcus aureus ’e resistentsus erütromütsiini suhtes tekib tänu RNA metülaasi kodeeriva geeni erm translatsiooni induktsioonile erütromütsiini madala kontsentratsiooni puhul. Selle tulemusena metüleeritakse 23S rRNA, muutes rakud resistentseks erütromütsiini kõrge kontsentartsiooni suhtes. erm operoni liider-mRNA kodeerib liider- peptiidi , mis on 19 aminohappe pikkune. Liider-mRNA sisaldab järjestusi, mille baasil võivad moodustuda alternatiivsed sekundaarstruktuurid. Kui induktorina toimivat erütromütsiini pole, transleerivad ribosoomid liiderpeptiidi tervikuna . See võimaldab liiderjärjestuses omavahel paarduda regioonidel 1 ja 2 ning 3 ja 4. Regioonide 3 ja 4 paardumise tulemusena on blokeeritud erm geeni RBS ja initsiaatorkoodon ning metülaasi ei sünteesita. Erütromütsiini madala kontsentratsioni puhul peatub liiderpeptiidi translatsioon 9-nda koodoni juures, mille tulemusena regioon 2 paardub hoopis regiooniga 3 ning erm geeni translatsiooni pärssivat sekundaarstruktuuri ei moodustu.
    Lugemisraami nihkumine (translational frame shifting) ja ribosoomide hüppamine translatsiooni elongatsioonil
    Arvatakse, et valgusünteesi ümberlülitamine ühelt lugemisraamilt teisele (lugemisraami nihkumine) toimub kohtades, kus translatsiooni elongatsioon korraks peatub, andes ribosoomile võimaluse mRNA-l “ libiseda ”. Mõne polüpeptiidi sünteesil toimub ühelt lugemisraamilt teisele nihkumine kindlates kohtades kõrge sagedusega. Lugemisraami muutumist translatsiooni käigus on kirjeldatud näiteks DNA polümeraasi III subühikute sünteesil. Bakteris E. coli kodeerib DNA polümeraasi III tau ja gamma subühikuid dnaX geen. Tau subühik koosneb 643-st aminohappest ja on transleeritav ühe lugemisraamina. Positsioonides 428 – 432 asuvates koodonites sisaldub 6 järjestikust adeniini ning seejärel raamis –1 järjestus UGA, mis võib toimida stop koodonina. Gamma subühik on 431 aminohappe pikkune. See valk on järjestuselt identne tau subühiku N-terminaalse järjestusega, kuid tema translatsioon on termineerunud varem teises lugemisraamis asuva stop koodoni poolt. - 1 raaminihe tekib A-järjestustel kõrge sagedusega. Seetõttu sünteesitakse gamma ja tau subühikuid bakterirakus suhtes 1:4. Raaminihke toimumist soodustab mRNA-s UGA koodonile järgnev juuksenõelastruktuur.
    Polüpeptiidide sünteesi terminatsioonil osaleva faktori RF-2 (release factor-2) süntees saab toimuda ainult tänu raaminihkele. Kui RF-2 kogus on rakus madal, on seda valku kodeeriva mRNA algusosas sisalduv stop koodon UGA translatsiooni terminatsiooniks ebapiisav. Sel juhul ribosoom küll peatub, kuid nihkub 3 U kohal +1 lugemisraami transleerimisele. Ainult nii sünteesitakse funktsionaalne valk. Programmeeritud lugemisraami muutmist on kirjeldatud ka mobiilsete DNA elementide transpositsioonil osalevate valkude sünteesil. Sünteesitakse näiteks transposaasi ja tema lühemat varianti , mis toimib transposaasi repressorina.
    Mõningatel juhtudel võib ribosoom jätta mRNA-st transleerimata mitukümmend nukleotiidi. Sellist programmeeritud ribosoomide “hüppamist” translatsioonil on kirjeldatud näiteks T4 faagi topoisomeraasi subühiku gp60 translatsioonil, kus koodonid 46 ja 47 on teineteisest eraldatud 50 nukleotiidiga. Arvatakse, et ribosoomi hüppamist põhjustab koodonite vaheala baasil moodustuv sekundaarstruktuur.
    Koodonkasutus
    Sama aminohapet kodeeriva koodoni kolmas nukleotiid on (v. a. Met ja Trp puhul) varieeruv. Osa koodoneid on haruldasemad kui teised. Vastavalt sellele on rakus erineval hulgal ka neile koodonitele antikoodoneid kandvaid tRNA molekule. Kui bakteri genoom on G + C-rikas, esineb sagedamini G + C-rikkamaid koodoneid, A + T-rikka genoomi puhul aga jälle harvamini. Mõned geenid, mille ekspressioonitase on rakus madal, sisaldavad sagedamini haruldasi koodoneid kui need, mille ekspressioonitase on kõrge. Ühest organismist pärineva geeni avaldumine teises organismis võib samuti olla takistatud nende organismide erineva koodonkasutuse tõttu.

    6. Valkude posttranslatsiooniline regulatsioon ja modifikatsioon


    Rakkude kohanemisel keskkonna muutustega toimuvad muutused geenide ekspressioonitasemes. Kui regulatsioon toimuks ainult geeniekspressiooni tasemel, kuluks rakkude adapteerumiseks üksjagu aega. Seda eriti siis, kui teatud süsteeme on vaja kiiresti represseerida. Olemasolevate valkude hulga rakusiseseks vähenemiseks kuluks mitmeid põlvkondi ja nende aktiivsus püsiks rakus pikka aega, kui neid valke ei inaktiveeritaks või degradeeritaks. Geenide induktsiooniks kuluv aeg võib samuti liiga pikk olla. Selleks, et kiirendada rakkude adapteerumist muutunud keskkonnatingimustega, on rakus välja kujunenud valkude aktiivsust kontrollivad posttranslatsioonilised mehhanismid . Posttranslatsiooniline regulatsioon võimaldab bakterirakkudes metaboolseid ümberlülitusi juba mõne sekundi jooksul. Kontrollmehhanismid toimivad kas ensüümide aktiivsuse mittekovalentse moduleerimise (allosteeriline regulatsioon), valkude kovalentse modifitseerimise (enamasti fosforüleerimine) või valkude kompartmentalisatsiooni näol.
    Allosteerilised ensüümid on aktiveeritavad või inaktiveeritavad metaboliitide mittekovalentse seondumise kaudu ensüümide aktiivtsentri regulatoorsetesse saitidesse, mis paiknevad aktiivtsentrist eraldi. Sel viisil toimub näiteks biosünteetiliste ensüümide tagasisidestuslik inhibitsioon. Allosteeriline regulatsioon põhjustab ensüümi ajutisi konformatsioonilisi muutusi, kuna inhibiitori või aktivaatori seondumine on pöörduv. Lisaks allosteerilisele regulatsioonile võib ensüüm olla ka kovalentselt modifitseeritav – fosforüleeritud, metüleeritud, atsetüleeritud, adenüleeritud või uridüleeritud. Ka see protsess võib olla pöörduv. Valkude pöördumatu modifikatsioon seisneb nende proteolüüsis.

    Ensüümiaktiivsuse allosteeriline regulatsioon


    Allosteerilisele regulatsioonile alluvad nii anaboolsed kui ka kataboolsed rajad.
    Anaboolsete radade puhul toimub peamiselt tagasisidestuslik inhibitsioon biosünteesiraja lõpp-produkti poolt. Sel viisil on reguleeritud näiteks aminohapete, nukleotiidide ja vitamiinide biosünteesirajad. Hargnevate biosünteesiradade korral, kus ühest prekursorist sünteesitakse mitu erinevat lõpp-produkti, võib toimuda kas:
  • järjestikuline (ingl. k. sequential) tagasisidestuslik inhibitsioon, kus iga lõpp-produkt reguleerib esimese tema sünteesirajale unikaalse ensüümi aktiivsust;
  • kumulatiivne tagasisidestuslik inhibitsioon, mille puhul inhibeerib iga lõpp-produkt sünteesiraja alguses olevat ensüümi osaliselt (näiteks NH3 assimilatsioonil osaleva glutamiini süntetaasi regulatsioon AMP, CTP, karbamüülfosfaadi, glükoosamiin 6-fosfaadi, L-alaniini, glütsiini, L-histidiini ja L-trüptofaani poolt);
  • kooskõlastatud (ingl. k. concerted) tagasisidestuslik inhibitsioon, kus sünteesiradade lõpp-produktidel eraldivõttes inhibeerivat toimet pole, vaid see avaldub koos.
    Mõnede biosünteesiradade puhul on kasutusel isoensüümid, mis katalüüsivad sama reaktsiooni, kuid on reguleeritavad erinevate lõpp-produktide poolt (näteks aspartaat -perekonna aminohapete biosünteesiradajas aspartaatkinaaside regulatsioon lüsiini, isoleutsiini, treoniini ja metioniini poolt).
    Anaboolseid radu võib ka aktiveerida. Sel juhul pole aktivaator reguleeritava raja metaboliit , kuid selle molekuli olemasolu rakus on signaaliks, et sünteesiraja lõpp-produkti on vaja juurde sünteesida.
    Kataboolsete radade regulatsioon võib toimuda samuti tagasisidestusliku inhibitsiooni kaudu. Inhibiitorina toimivad tavaliselt degradatsiooniraja vaheühendid, mõjutades raja esimesi ensüüme. Kataboolsete radade ensüümide aktivaatorid võivad olla kas sama raja või mõne teise raja metaboliidid. Mõnel juhul on kirjeldatud nn. “feedforward” regulatsiooni, kus vaheühend moduleerib ensüümi aktiivsust selle ühendi katabolismiraja toimumise kasuks. Omavahel seotud tsentraalsete metabolismiradade puhul nagu glükolüüs, glükoneogenees ja TCA tsükkel on regulatsioon kompleksne.

    Valkude posttranslatsiooniline kovalentne modifikatsioon


    Regulatsioon valkude fosforüleerimise kaudu
    Valkude fosforüleerimine (ja mõnel juhul metüleerimine) toimub näiteks signaalse transduktsiooni radades, kus esmalt autofosforüleerub välise signaali mõjul spetsiifiline sensorvalk ning seejärel kantakse fosforüülrühm sensorvalgu poolt äratuntavale regulaatorile (response regulator) (näiteks viburi pöörlemissuuna muutus kemotaksisel, N-fikseerimisel osalevate geenide transkriptsiooni regulatsioon, Bacillus’e sporulatsioon jt.). Signaali ülekanderadadest tuleb täpsemalt juttu hiljem, seoses globaalse geeniregulatsiooniga. Fosfotransferaasi süsteemi, PTS valkude fosforüleerimise/defosforüleerimise kaudu kontrollitakse süsivesinike transportimist rakku ja nende ühendite katabolismiradade tööd. Fosforüleerimine ja fosforüleeritud valkude defosforüleerimine toimub spetsiifilistest histidiini, tsüsteiini, türosiini, aspartaadi , treoniini või seriini jääkidest.
    Lisaks eelpooltoodud näidetele võidakse fosforüleerimise kaudu kontrollida metabolismiraja ensüümide aktiivsust. Näitena on toodud isotsitraadi dehüdrogenaasi IDH aktiivsuse regulatsioon.
    Isotsitraadi dehüdrogenaas IDH on tsitraaditsükli (TCA) ensüüm, mille aktiivsuse kaudu kontrollitakse, kas isotsitraat metaboliseeritakse TCA või glüoksülaadi raja kaudu. TCA tsüklis oksüdeeritakse isotsitraat IDH toimel -ketoglutaraadiks. Kui E. coli rakud kasvavad atsetaadil või rasvhapetel, on IDH fosforüleerimise tulemusena inhibeeritud. Sel juhul viiakse isotsitraat isotsitraadi lüaasi abil glüoksalaadiks. Vastasel juhul konverteeritaks kogu atsetaat CO2-ks ning rakkude kasvuks vajalikke metaboolseid vaheühendeid ei tekiks. IDH fosforüleerimist viib läbi IDH kinaas/ fosfataas , mis on kodeeritud aceK geeni poolt. aceK mutandid ei ole võimelised atsetaadil kui ainsal C-allikal kasvama. AceK kinaasi aktiivsus avaldub siis, kui metabolismi vaheühendite kontsentratsioon rakus on madal (see olukord tekib siis, kui rakud atsetaadil kasvavad). Isotsitraat ja 3-fosfoglütseraat aktiveerivad AceK fosfataasse aktiivsuse ja IDH defosforüleerimise, soodustades sel viisil isotsitraadi metaboliseerimist TCA tsükli kaudu.
    Valkude metülatsioon ja atsetüleerimine
    Valkude metülatsiooni kaudu reguleeritakse näiteks E. coli rakkude kemotaksisel osalevate membraanseoseliste retseptorvalkude MCP-de ( methyl -accepting chemotaxis proteins) aktiivsust. MCP-de metülatsiooni viib läbi CheR metüültransferaas, kasutades metüülrühma doonorina S-adenosüülmetioniini. MCP-de tsütoplasmaatiline C-terminaalne domään on transmitter -domään, mis signaliseerib rakku kemo-effektori olemasolust kasvukeskkonnas. Signaal kantakse viburi mootorile läbi CheA ja CheY valkude fosforüleerimise/defosforüleerimise. Vastavalt viburi pöörlemissuunale liiguvad rakud kas kemoefektori kontsentratsiooni tõusu või languse suunas. Kui MCP valgud on metüleeritud, on rakud antud efektori kontsentratsiooniga adapteerunud ning võimelised reageerima efektori kontsentratsiooni muutustele. MCP demetüleerimise eest vastutab CheB , mille metüülesteraasi aktiivsus avaldub siis, kui ta on CheA poolt fosforüleeritud.
    Valkude atsetüleerimist on täheldatud näiteks ribosoomivalgu L7 puhul. Selle füsioloogilist tähtsust seni siiski veel ei teata.
    Glutamiini süntetaasi aktiivsuse regulatsioon uridülüül- ja adenülüültransferaaside kaudu
    Glutamiini süntetaas GlnS osaleb ammooniumi assimileerimisel, kui ammooniumi kontsentratsioon on madal. GlnS sünteesi ja aktiivsust kontrollib glutamiini/-ketoglutaraadi suhe rakkudes. Kui see suhe on kõrge (viitab ammooniumi ülehulgale), on GlnS inhibeeritud, et mitte raisata ATP-d glutamiini sünteesile. Madala suhte korral aga GlnS aktiveeritakse.
    GlnS-i aktiivsust kontrollitakse kumulatiivse tagasisidestusliku inhibitsiooni ja kovalentse modifikatsiooni kaudu. Valgu 12 subühikut on adenüleeritavad adenülüültransferaasi ATaasi abil, mis kannab ATP-st AMP rühma spetsiifilisele türosiini jäägile. Täielikult adenüleeritud GlnS on inaktiivne, aktiivsus väheneb proportsionaalselt modifitseeritud subühikute arvule. Kumulatiivne tagasisidestuslik inhibitsioon toimib kõige efektiivsemalt osaliselt modifitseeritud ensüümile.
    Valkude proteolüütiline protsessing
    E. coli rakkudes on identifitseeritud üle 20 endoproteaasi. Paljudel neist on nn. “housekeeping” funktsioon – nad kõrvaldavad rakkudest vigaselt transleeritud, kahjustatud, valesti volditud või organismile võõraid valke. Osadel proteaasidel on regulatoorne funktsioon, et hoida teatavate valkude hulk rakus madal kas pidevalt või muuta valkude ekspressioonitaset vastusena keskkonna signaalidele (näiteks nälg). Samuti osalevad proteaasid komplekssete struktuuride nagu viburid ja fimbriad sünteesil. Enamus E. coli proteaase kasutavad ATP energiat. Pulss-märkimise katsetega on selgitatud , et ühe rakupõlvkonna vältel degradeeritakse 20% valkudest. Samas on individuaalsete valkude poolestusaeg rakus väga erinev, varieerudes eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes 3-st päevast vähem kui 5 tunnini, mõnedel ka vähem kui 1 tunnini. Näiteks valgud, mis reguleerivad DNA replikatsiooni või rakkude jagunemist, alluvad väga kergesti proteolüüsile ja nende poolestusaeg võib olla isegi alla paari minuti. Väga ebastabiilne on näiteks SulA valk. Valkude allumine proteolüütilisele degradatsioonile sõltub märkimisväärselt rakkude kasvutingimustest. Kui eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes degradeeritakse 15% valke poolestusajaga alla 5 tunni, siis nälgivates rakkudes tõuseb selliste valkude osakaal juba 50%-ni.
    Kasvavates E. coli rakkudes degradeeritakse 60% valkudest ATP-sõltuvate proteaaside Lon ja Clp poolt.
    Lon proteaas
    Lon proteaas on ATP-sõltuv seriini endoproteaas, mis degradeerib nii ebanormaalseid valke kui ka spetsiifilisi regulaatorvalke. Lon on tetrameerne valk, mis koosneb 87 kDa suurustest subühikutest. Substraadi lagundamise tulemusena tekivad 5 – 20 aminohappe pikkused oligopeptiidid. lon mutantides tõuseb looduslikult ebastabiilsete valkude eluiga, samuti temperatuuri-tundlike valkude ning organismile võõraste valkude (näiteks teisest organismist kloneeritud geenide produktid) eluiga. In vitro katsetes on näidatud, et Lon eelistab degradeerida kas osaliselt või täielikult denatureerunud valke. Samas on Lon-i substraadiks ka spetsiifilised valgud, näiteks SulA, mida vajatakse rakus ainult ajutiselt . SulA indutseeritakse SOS vastusena. See valk inhibeerib septumi moodustumise raku jagunemisel. Kui SulA-d rakus ei degradeerita, moodustuvad pikad rakkude filamendid ning rakud surevad.
    Clp proteaas
    ClpP-ClpA proteaas molekulmassiga 750 kDa on dodekameerne 21,5 kDa suuruste ClpP subühikute osas ja heksameerne ClpA subühikute osas. ClpA-l on ATPaasne aktiivsus, ClpP-l proteaasne aktiivsus. ClpA puudumisel võib ClpP degradeerida väikesi peptiide ning denatureerida suuri valke. Suuremate valkude degradatsioonil on oluline, et ClpP subühikud oleksid assotsieerunud ClpA-ga. ClpP ja ClpA hulk tõuseb rakkudes eksponentsiaalse kasvufaasi lõpus.
    LexA repressori autoproteolüütiline inaktivatsioon
    DNA kahjustuste tulemusena (näiteks UV kiirguse toimel) vallandub rakkudes SOS vastus. Aktiveeruvad geenid, mis olid inaktiveeritud LexA repressori kaudu. LexA inaktivatsioon toimub autokatalüüütiliselt Gly-Ala sideme degradeerimise kaudu. LexA proteolüütiline aktiivsus avaldub ssDNA-ga assotsieerunud RecA. Proteolüüsil kulutatakse ATP energiat. RecA on allosteeriline aktivaator ka faag lambda CI valgu ja UmuD autoproteaassele aktiivsusele. CI proteolüüs viib profaagi induktsioonile, UmuD lõikus aga aktiveerib UmuD valgu.

    Valkude kompartmentalisatsioon


    Selleks, et vältida kasutuid reaktsioone, on samast ühendist lähtuvate biosünteesi ja degradatsiooniradade avaldumine (näiteks aminohapete biosüntees) rakus ajaliselt lahutatud (ajaline kompartmentalisatsioon). See võimaldab rakkudel reageerida muutuvatele kasvutingimustele ilma, et vastassuunaliselt toimuvad metaboolsed reaktsioonid oleksid üksteisest füüsiliselt lahutatud. Valkude füüsiline kompartmentalisatsioon võimaldab aga ensüümide aktiivsust märksa efektiivsemalt kontrollida. Sel juhul viiakse valgud pärast nende sünteesi kindlasse kohta (fotosünteesiaparaat fotosünteetilistel bakteritel, graamnegatiivsete bakterite membraan -seoselised ja periplasmaatilised valgud, ekstratsellulaarsed valgud).

    Valkude eksport ja sekretsioon


    Rakumembraanis on ligikaudu 300 erinevat valku; lisaks on graam-negatiivsete bakterite periplasmas veel 100 ja välismembraanis 50 erinevat valku. Sisemembraani valgud on näiteks tsütokroomid, F1F0 ATP süntaas ja spetsiifilised transportvalgud . Periplasmasse viiakse hüdrolaase, antibiootikumi resistentsust tagavaid valke, eksotoksiine, ensüüme, mis osalevad rakukesta sünteesil ja mingi kasvusubstraadiga seonduvaid valke. Väliskeskkonda ja raku pinnale eksporditakse viburite ja piilide valke, hüdrolüütilisi ensüüme (proteaasid, lipaasid, nukleaasid). Patogeensed bakterid sekreteerivad toksiine , mis kahjustavad lisaks hüdrolüütilistele ensüümidele bakteri poolt rünnatava organismi rakke. Valkude transportimisel on olulised spetsiifilised signaaljärjestused. Kõige põhjalikumalt on sekretsioonisüsteeme uuritud bakteril E. coli.
    Põhiline sekretsioonirada (general secretory pathway) GSP – Sec valkudest sõltuv sekretsioon
    Transporditavate valkude (pre-proteiinide) N-terminaalses otsas on spetsiifiline signaaljärjestus, mida nimetatakse ka liiderjärjestuseks. Selle funktsiooniks on:
  • Takistada sünteesitud pre- proteiini voltumist enne selle eksportimist läbi membraani;
  • Signaaljärjestuse hüdrofoobne osa initsieerib valgu translokatsiooni, sisenedes membraani lipiidsesse kaksikkihti;
  • Signaaljärjestus sisaldab peptidaasi lõikesaiti.
    SecB, mis on oma toimelt molekulaarne shaperon, seondub pre-proteiiniga, hoides seda translokatsiooni-kompetentses konformatsioonis. SecB ei tunne ära spetsiifilist aminohappelist järjestust vaid seda, et valk on struktureerimata. Samuti takistab SecB valgu agregeerumist. SecB asemel võib olla ka GroEL. [Pre- proteiin SecB] kompleks seondub tsütoplasmaatilise membraani sisepinnaga assotsieerunud SecA valguga pre-proteiini signaaljärjestuse ja muude regioonide ning SecB determinantide kaudu. SecA-l on ATPaasne aktiivsus, mis avaldub siis, kui [Pre-proteiinSecBSecA] kompleks on seondunud membraanse SecY/E/G sekretsiooni-kompleksiga. ATP hüdrolüüsi tulemusena vabaneb pre-proteiin SecA-st ja viiakse SecY/E/G translokaasi abil läbi membraani. Seejärel protsessib membraani periplasmaatilisel poolel asuv signaal- peptidaas Lep sekreteeritud valgu küpsesse vormi, lõigates ära signaaljärjestuse. SecY läbib membraani mitmeid kordi , moodustades transporditavate valkude jaoks kanali.
    Sisemembraani koostisesse kuuluvate valkude translokatsioon on enamasti samuti Sec-sõltuv.
    Mis võimaldab valgul jääda membraani koostisesse? Transporditaval valgul on sisemised hüdrofoobsed järjestused, mis peatavad translokatsiooni ja ankurdavad ta membraani külge. Mõnel juhul võib selleks olla signaaljärjestus, mis ei ole peptidaasi poolt äratuntav ja lõigatav. Sellistel valkudel on kirjeldatud „stop- transfer “ regioone (15 või enam hüdrofoobset aminohapet). Valgud, mis läbivad membraani mitmeid kordi, sisaldavad neid enam. Viimasel juhul toimub valgu translokatsioon mitmeetapiliselt. Translokatsioonikanal sulgub, kui stop-signaal difundeerub lateraalselt lipiidse kaksikkihini. Seejärel reinitseerib sekundaarne signaaljärjestus translokatsiooni. Sama protsess kordub, kuni kogu valk on membraani paigutatud.
    Mõnede sisemembraani valkude puhul osaleb nende translokatsioonil SRP – signal recognition particle – mille koostisesse kuuluvad 4,5 S RNA ja 48 kDa suurune valk. SRP membraanseks retseptorvalguks on FtsY.
    Ekstratsellulaarsete valkude sekreteerimine
    Kirjeldatud on nii Sec-sõltuvaid kui ka sõltumatuid süsteeme.
    Tüüp II ja tüüp IV sekretsioonisüsteemide puhul viiakse valgud periplasmasse Sec-süsteemi abil. Valgu translokatsioonil läbi välismembraani osalevad teised spetsiifilised valgud. Näiteks taimepatogeenidel (taimedel valgemädanikku põhjustav Erwinia) on kirjeldatud Out-süsteem (tüüp II sekretsioonisüsteem), milles osaleb 12-14 valku, ja mille kaudu viiakse välja pektaadi lüaas, tsellulaas , galakturonidaas. Tüüp IV sekretsioonisüsteemi puhul on kirjeldatud autotransportereid, kus valk moodustab välismembraani ise poori . Näiteks gonorröad põhjustava Neisseria immunoglobuliini puhul on selleks valgu C-terminuses paiknev autotransporter-järjestus. Valgu liikumisel läbi membraani järgneb autokatalüütiline lõikus valgu C-terminusse – selle tulemusena valk vabaneb membraanilt.
    Tüüp I ja tüüp III sekretsioonisüsteemide puhul Sec-süsteem ei osale. Sel viisil transporditavatel valkudel puudub ka eelpool-kirjeldatud signaaljärjestus. Tüüp I sekretsioonisüsteemi abil viiakse rakust välja näiteks E. coli hemolüsiini. Sekreteerimisel osalevaid valke kodeerivad geenid on enamasti samas operonis sekreteeritavat valku kodeeriva geeniga. Süsteem koosneb kolmest komponendist – kaks sisemembraani valku (üks neist ATP-d siduv) ja üks välismembraanis asuv valk moodustavad kanali, võimaldades valgul väljuda ilma periplasmasse sisenemata.
    Tüüp III sekretsioonisüsteemi kasutatakse erinevate looma- ja taimepatogeenide virulentsusfaktorite sekretsioonil, mis on tsütotoksilised (näit. Yersinia pestis’e Yops valgud). Sekretsiooniaparaat koosneb ligikaudu 20 erinevast valgust. Sekretsioon algab pärast aktiveeriva signaali saabumist; sageli tulevad signaalid märklaud-rakkudelt.
    Eraldi sekretsioonisüsteemina (tüüp V) on käsitletud sekretsioonisüsteemi, mille abil toimub näiteks DNA ja valkude liikumine rakust rakku. Süsteemi kuulub ligikaudu 10 valku, mis võimaldavad plasmiidide konjugatiivset ülekannet rakust rakku graam-negatiivsetel bakteritel, onkogeense T-DNA ülekannet taimerakku bakterilt Agrobacterium tumefaciens.

    7. Globaalne geeniregulatsioon bakterirakus

    Bakterite elukeskkonna tingimused on muutlikud. Muutused, millega näiteks E. coli peab kohanema, on järgmised:
  • Sattumine toitaineterikkast kasvukeskkonnast toitainetevaesesse keskkonda
  • Kasvuks vajaliku C-allika asendumine teisega
  • Aminohapete hulk on limiteeritud
  • Aeroobse kasvukeskkonna asendumine anaeroobsega või vastupidi
  • Temperatuuri shokk
  • C-, N- või P-nälgimine
    Hoolimata keskkonna muutustest peavad DNA replikatsioon, rakkude kasv ja jagunemine olema balansseeritud. Translatsiooniaparaadis osalevad vähemalt 150 erinevat geeniprodukti (rRNA-d ja ribosoomi valgud, tRNA-d, aminoatsüül-tRNA süntetaasid, translatsiooni initsiatsiooni, elongatsiooni ja terminatsiooni faktorid). Erinevaid bioloogilisi protsesse koordineeritakse globaalse regulatsiooni kaudu. Globaalsele regulatsioonile alluvad kõik operonid. Operonid, mida kontrollib üks regulaatorvalk, moodustavad reguloni. Samasse reguloni kuuluvate operonide induktsioon võib üsna ulatuslikult varieeruda. Näiteks temperatuurishoki reguloni (Htp) puhul täheldatakse osade HSP-de (heat shock proteins) puhul temperatuuri tõusu korral 5- kuni 7-kordset induktsiooni, mõnede HSP-de tase rakus tõuseb aga üle 70 korra. Stressivastuse käigus võidakse produtseeritakse rakus signaalmolekule e. alarmoone. Tuntumad signaalmolekulid on näiteks cAMP ja guanosiintetrafosfaat ppGpp.
    Erinevaid regulone kontrollivad regulaatorid võivad transkriptsiooni kas stimuleerida (näiteks PhoB), inhibeerida (näiteks LexA) või mõnede geenide puhul stimuleerida ja teiste puhul inhibeerida (näiteks Lrp – leucine response protein). Osa regulone on kontrollitud alternatiivsete sigma faktorite poolt (näiteks 32 regulon). Regulatsioon võib toimuda mitmel erineval viisil:
  • regulaatori kovalentne modifitseerimine – enamasti fosforüleerimine/defosforüleerimine (PhoB, NtrI),
  • negatiivse regulaatori degradeerimine (näit. LexA),
  • sigma faktori rakulise hulga tõstmine (32),
  • valgu konformatsiooni muutmine ligandi sidumisel.
    Bakteris E. coli on kirjeldatud ligikaudu 1000 erinevat operoni ning paarsada erinevat reguloni. Erinevatesse regulonidesse kuuluvad operonid või geenid võivad kuuluda modulonidesse. Samasse moduloni kuuluvaid geene/operone kontrollib lisaks nende erinevatele regulaatoritele ka ühine globaalne regulaator (näiteks cAMP retseptorvalk CRP e. CAP).
    Globaalse regulatsiooni kirjeldamiseks on võetud kasutusele veel mõiste stimulon. Stimuloni kuuluvad geenid, operonid, regulonid ja modulonid, mille tööd mõjutab üks ja sama keskkonnastiimul. Samasse stimuloni kuuluvate regulatoorsete üksuste tööd kontrollivad erinevad regulaatorid.
    Näiteks temperatuuri tõusu korral aktiveerub Htp (RpoH) regulon ja P-nälja puhul PhoB regulon, kuid lisaks nendesse regulonidesse kuuluvatele geenidele aktiveeruvad veel paljud teised. Näiteks P-nälja puhul on indutseeritud 145 erinevat valku, millest ainult 38 on kodeeritud PhoB reguloni kuuluvate geenide poolt.
    Nälja korral lähevad rakud statsionaarsesse faasi ja neis indutseeritakse ka RpoH regulon (kuumashokk), Lrp regulon (Lrp aktiveerib aminohapete biosünteesi geenid ja represseerib aminohapete katabolismi geenid), LexA-kontrollitud SOS regulon (vastus DNA kahjustustele) ja OxyR regulon (vastus oksüdatiivsetele kahjustustele). Lisaks paljude valkude induktsioonile põhjustab P-nälg osade valkude repressiooni.

    Raku kommunikatsioon väliskeskkonnaga


    Muutused geenide transkriptsioonitasemes toimuvad vastusena kasvukeskkonnastiimulitele. Vastavalt nende toimespetsiifikale võib stiimuleid klassifitseerida järgmiselt:
  • Laia toimega keskkonnastiimulid nagu näiteks temperatuur, osmolaarsus , pH, DNA-d kahjustavad agensid.
  • Raku toitumisega seotud stiimulid (mineraalainete olemasolu, energiaallikad , elektronide aktseptorid, spetsiifilised metaboliidid).
  • Signaalid samatüüpi rakkudelt (näiteks quorum sensing e. hulgatunnetus).
  • Signaalid, mida edastatakse peremees- parasiit interaktsioonidel ja rakkude diferentseeerumisel.
    Suur osa neist stiimulitest on tunnetatavad rakusiseselt. Sel juhul peab stiimul sisenema rakku ja mõjutama seal toimuvaid protsesse. Näiteks DNA kahjustusi indutseerivate keskkonnatingimuste tunnetamine võib toimuda rakus oleva DNA olukorra hindamise kaudu DNA replikatsioonil (DNA katked ja muud kahjustused blokeerivad replikatsiooni). Temperatuuritõusu tunnetamine toimub nii otseselt kui ka denatureerunud ja valesti volditud valkude rakku akumuleerumise kaudu. Paljusid raku toitumisega seotud stiimuleid tunnetatakse samuti kaudselt , nende mõju kaudu raku metabolismile. Näiteks ammooniumi olemasolu tunnetatakse glutamiini ja -ketoglutaraadi rakusisese kontsentratsiooni kaudu. Enamuse kataboolsete radade puhul kontrollib substraadi või selle laguprodukti olemasolu rakus seda, kas vastava raja geenid avalduvad või mitte. Stiimulite mõjul võidakse sünteesida väikeseid signaalmolekule nagu näiteks cAMP, ppGpp või homoseriin laktoon, mis mõjutavad transkriptsiooni kas otseselt või interakteerudes transkriptsioonifaktoritega.
    Signaalne transduktsioon
    Lisaks rakusiseselt tunnetatavatele stiimulitele on neid, mida tunnetatakse rakupinnal. Sel juhul on tegemist väliskeskkonna otsese tunnetamisega spetsiifiliste transmembraansete retseptorite abil, mis kannavad signaali rakku. Vastavat protsessi nimetatakse signaalseks transduktsiooniks. Tavaliselt toimub signaali ülekandumine kahekomponendilise süsteemi abil. Stiimuliteks, mida tunnetatakse kahekomponendiliste süsteemide abil, on näiteks pH, osmolaarsus, kemoatraktandid ja repellandid (eemaletõukajad), taimepatogeenide puhul taime pinnal kahjustatud kohtades sisalduvad signaalmolekulid.
    Kahekomponendiline süsteem koosneb sensorist (sageli on selleks histidiini kinaas) ja tsütoplasmas asuvast vastuvõtvast (ingl. k. response) regulaatorist. Väliskeskkonna stiimuli tunneb ära sensorvalgu N-terminaalne domään. Selle tulemusena muutub sensori aktiivsus. Näiteks histidiini kinaasi puhul toimub autofosforüleerumine, kus ATP-lt kantakse fosforüülrühm üle konserveerunud histidiini jäägile valgu C-termiaalses transmitter-domäänis. See omakorda on signaaliks tsütoplasmaatilisele regulaatorile. Regulaatori N-terminaalses vastuvõtvas (receiver) domäänis asub konserveerunud aspartaatjääk. Fosforüülrühm kantakse sensorvalgult regulaatori aspartaadile. Fosfoaspartaat omakorda põhjustab valgu C-terminaalses otsas paikneva efektor -domeeni aktivatsiooni, mille tulemusena valk käitub transkriptsiooni aktivaatorina. Näiteks kemotaksise puhul on sensorvalguks histidiini kinaas CheA, mis pärast autofosforüleerumist interakteerub regulaatorvalkudega CheB ja CheY ja fosforüleerib need.
    Fosforüülrühma ülekande ja kinaasse aktiivsusega domäänid histidiini kinaasil ning response regulaatori vastuvõttev (receiver) domään on konserveerunud sama perekonna valkude piires. Varieeruvad sensorvalgu signaali äratundev N-terminaalne domeen ja regulaatorvalgu efektor-domeen. Mida detailsemalt signaali ülekandesüsteeme uuritakse, seda kirjumaks pilt muutub. Signaali tunnetavad retseptorid võivad asuda nii transmembraanses kui ka periplasmaatilises või tsütoplasmaatilises sensor -domäänis. Sama sensor võib anda signaali mitmele erinevale regulaatorile ja sama regulaator võib saada signaale erinevatelt sensoritelt. Kirjeldatud on ka ühekomponendilisi signaali ülekandesüsteeme. Näiteks Vibrio cholerae ToxR valk on transmembraanne. ToxR tunneb ära raku väliseskkonna signaali, mille tulemusena ta aktiveerub ning seondub seejärel tsütoplasmaatilise domeeniga virulentsusgeenide promootorregiooniga.
    Regulatoorse võrgustiku uurimine bakterirakus
    Organismi adapteerumisel teatud keskkonnastiimuliga muutub koordineeritult paljude geenide avaldumistase. Regulatsioon toimub nii transkriptsiooni tasemel, mRNA transleeritavuse ja stabiilsuse tasemel kui ka valkude posttranslatsioonilise modifitseerimise ja valkude stabiilsuse tasemel. Globaalse regulatoorse võrgustiku uurimine eeldab erinevate meetodite kombineeritud rakendamist, kus lähtutakse nii genoomi järjestuste analüüsist, geenide transkriptsiooni ja translatsiooni tasemest kui ka valkude hulgast.
  • Genoomi järjestuse analüüs võimaldab identifitseerida potentsiaalseid promootoreid ja motiive, mis on konserveerunud sama regulaatori poolt kontrollitavate geenide ees. Regulaatori seondumisala suurem kokkulangevus konsensusjärjestusega esineb geenide puhul, mille avaldumisele on uuritaval regulaatoril tugevam efekt ja siis, kui regulaatorvalk seondub ühte kindlasse saiti promootorala ees. Samas valgud, mis seonduvad paljudesse saitidesse, interakteeruvad tavaliselt ka teiste valkudega. Valkude kooperatiivsel seondumisel DNA-ga ei pruugi uuritava valgu seondumissait olla DNA järjestuse põhjal ennustatav. Suur osa operone on reguleeritavad mitmete erinevate faktorite kooperatiivse seondumise kaudu. Lisaks raskesti ennustatavusele on sellised saidid sageli ka eksperimentaalselt raskesti tõestatavad.
  • Reportergeenide kasutamine transkriptsiooni liitjärjestuste konstrueerimiseks. Promootorita reportergeen (näiteks lacZ) inserteeritakse genoomi erinevatesse piirkondadesse, nii et see satub erinevate promootorite kontrolli alla. Edaspidi on võimalik uurida, milliste geenide promootorite kontrolli all muutub reportergeeni ekspressioonitase (tõuseb või langeb) vastusena stressifaktoritele. Näiteks P-nälja korral indutseerub bakteris E. coli üle 50 geeni ekspressioonitase. Ka selle meetodi rakendamisel on probleeme. Kromosomaalsete liitjärjestuste tekkimine viib märklaudgeeni aktiivsuse pärssimisele ja nii on võimatu isoleerida promootor-reportergeeni liitjärjestusi, kus promootor kontrollib rakule eluliselt tähtsate geenide tööd. Ainus võimalus on konstrueerida genoomseid raamatukogusid, kus DNA fragmendid viiakse plasmiidis asuva reportergeeni ette. Reportergeeni poolt kodeeritud valk võib rakus ka ise stressi indutseerida. Näiteks, kui kasutada reporterina GFP-d ( green fluorescent protein) kodeerivat geeni, võivad rakus indutseeruda kuumashoki geenid. Kuumashoki vastuse kutsub esile GFP aeglane voltumine rakus.
  • Geenikiibid (gene chips, microarrays). Tahkele kandjale viidud DNA järjestused pärinevad organismi erinevatest geenidest ning neile hübridiseeritakse rakkudest eraldatud totaalsele mRNA-le sünteesitud cDNA proov . Sel viisil võrreldakse erinevate mRNA-de ekspressioonitaset bakterirakus nii erinevate stressitingimuste korral kui ka teatava regulaatori olemasolu või puudumise või üleekspressiooni korral. Seda meetodit on hea rakendada organismide puhul, kelle genoomi primaarjärjestus on teada. Praegu rakendatakse seda meetodit paljudes suurtes uurimiskeskustes, et luua infobaas erinevatel tingimustel üles või alla reguleeritavatest geenidest.
  • Translatsiooni liitjärjestused. Bakterirakus mõõdetud mRNA hulk ja sellelt sünteesitud valgu hulk ei ole üks-üheses vastavuses. Translatsiooni efektiivsuse uurimiseks konstrueeritakse translatsiooni liitjärjestusi. Sel juhul liidetakse reportergeenile (millel puudub promootor ja mRNA 5´otsas ribosoomiga seondumise ala) samas lugemisraamis uuritava geeni valgu N-terminaalset osa kodeeriv DNA järjestus ja mõõdetakse liitvalgu ekspressiooni. Arvestama peab võimalusega, et sellise liitjärjestuse puhul võib olla muutunud mRNA stabiilsus ning see võib samuti mõjutada liitvalgu ekspressioonitaset.
  • 2-D geelid ja mass- spektromeetria . Erinevate valkude hulga hindamiseks bakterirakus kasutatakse totaalvalgu lahutamist 2-D polüakrüülamiid-geelelektroforeesil. Igale valgule vastab geelis kindel koht, kus valk on visualiseeritav täpina. Mida rohkem on valku, seda intensiivsem on vastav täpp. Kui eraldada totaalvalk erinevates tingimustes kasvatatud bakterirakkudest, näeme täppide mustris erinevusi. Mass-spektromeetria võimaldab määrata valgu järjestusi ka väga väikeste valgukoguste (pikomoolide ja isegi femtomoolide) korral, mida on võimalik saada valkude puhastamisel 2-D geelist. Geelist isoleeritud valkude aminohappelist järjestust võrreldakse bakteri geenijärjestustelt tuletatud aminohappelise järjestusega ja saadakse teada, milliste geenide poolt on uuritavad valgud kodeeritud. See meetod annab jällegi üldist informatsiooni erinevatel tingimustel üles või alla reguleeritavatest geenidest, kuid seda valgu hulga tasemel. Paljudel juhtudel ei pruugi antud geeni mRNA hulk ja sellelt sünteesitud valgu hulk rakus proportsionaalselt muutuda.
    Erinevate valkude funktsioonide uurimisel tuleb arvestada järgmiset asjaoludega:
  • Paljud valgud on multifunktsionaalsed;
  • Varusüsteemide (backup systems) olemasolu teatava funktsiooni täitmiseks.
    Multifunktsionaalsus: Samal valgul võib olla erinevaid ensümaatilisi aktiivsusi. Näiteks RecA valk on nii rekombinaas kui ka koproteaas. Sellest tulenevalt võivad mutatsioonid uuritavat valku kodeerivas geenis olla pleiotroopse efektiga ning muuta fenotüübi tõlgendamise raskeks.
    Varusüsteemide olemasolu: Rakule eluliselt tähtsa geeni duplitseerumise korral ei ole mutatsioonid geeni ühes koopias enam rakule letaalsed, kui temaga lähedases suguluses olevas geenis säilib esialgne funktsioon. Duplitseerumine on aluseks evolutsioneerumisele. Kahel valgul võib olla sama funktsioon, kuid rakkude sattumisel teatud tingimustesse võivad ilmneda erinevused – varieerub ensüümi aktiivsus, substraadi spetsiifilisus, vastus aktivaatoritele ja inhibiitoritele, jne.
    Reaalsema pildi rakuliste protsesside toimumise kohta annab erinevate in vitro meetodite kombineeritud kasutamine ja nende kombineerimine omakorda in vivo meetoditega (näiteks fluorestsentsmikroskoopia jälgimaks huvipakkuvate valkude asukohta rakus; in vivo DNA protektsioonikatsed; erinevate molekulide in vivo krosslinkimine; läbivoolutsütomeetria mõõtmaks nukleiinhappe või eelnevalt märgistatud individuaalsete valkude hulka erinevates rakkudes).
    Nukleoidiga assotsieerunud valkude osalus transkriptsiooni regulatsioonis
    Bakterikromosoom esineb rakus nukleoproteiinkompleksina, mida nimetatakse nukleoidiks. 1,5 mm kontuurpikkusega E. coli kromosoom on ligikaudu 1000 korda kokku pakitud. Erinevalt eukarüootsetest histoonidest moodustavad bakteri nukleoidivalgud DNA-ga ebapüsivaid komplekse. Need valgud muudavad nii lokaalselt kui ka globaalselt kromosoomi struktuuri ja osalevad sel viisil globaalses geeniregulatsioonis. DNA-ga on üle genoomi pidevalt seondunud ligikaudu 10 valku, mille hulk varieerub rakus kasvufaas-sõltuvalt. Kõige domineerivamad nukleoidivalgud on HU, IHF, H-NS, StpA, Fis ja Dps.
    HU ja IHF subühikud on 45% ulatuses aminohappeliselt järjestuselt identsed ja väga sarnased 3-D struktuurilt . StpA on 58% ulatuses identne H-NS-ga ja võib asendada H-NS-i ning moodustada sellega heterodimeere. Nukleoidivalgud seovad DNA-d üldjuhul mittespetsiifiliselt, kuid füsioloogiliselt arvestatava afiinsusega. Osadel valkudel on DNA järjestuse osas siiski teatud eelistusi (näit. IHF, Fis, H-NS). Nende valkude hulk sõltub rakkude kasvufaasist. Eksponentsiaalses kasvufaasis on valdavad Fis, HU, StpA, IHF ja H-NS; statsionaarses faasis on aga põhilised DpS, IHF (hulk suurenenud 7 korda) ja HU (hulk vähenenud 3 korda). Neist muutustest tingituna toimuvad globaalsed muutused nukleoidi struktuuris ja DNA transkriptsioonilises aktiivsuses. Näiteks IHF mõjutab kas otseselt või kaudselt üle 100 geeni transkriptsiooni.
    Näiteks Fis-i hulk suureneb drastiliselt eksponentsiaalses kasvufaasis – 25000- 40000 molekuli raku kohta ( stats . faasis detekteerimatu). Ta reguleerib positiivselt rRNA ja tRNA-de transkriptsiooni, kuid negatiivselt neid geene, mis aktiveeruvad bakterite kehvades kasvutingimustes. Dps-i hulk suureneb 30 korda statsionaarses faasis (15000 molekuli rakus). Immunofluorestsentskatsed näitsid, et nii HU, IHF, H-NS, StpA kui ka Dps jaotuvad ühtlaselt üle nukleoidi, kuid Fis on eeskätt assotsieerunud rRNA operonidega.
    Vastavalt sellele muutub DNA konformatsioon . Lisaks üleüldistele muutustele DNA superspiralisatsioonis (näiteks statsionaarse faasi rakkudes suureneb negatiivne superspiralisatsioon) ja DNA kompaktsuse astmes mõjutab transkriptsiooni regulaatorite seondumisefektiivsust DNA-le ka spetsiifiliste DNA regioonide lokaalne konformatsiooni muutus.
    Järgnevalt on toodud detailsem informatsioon nukleoidi valkude kohta.
    CbpA (curved DNA-binding protein A) seondub DNA-ga mittespetsiifiliselt ja on detekteeritav alles hilises statsionaarses faasis. 36 tunni vanuses rakukultuuris on seda valku 3% totaalvalgust, mis teeb ligikaudu 15000 valgumolekuli raku kohta.
    CbpB (Rob) (curved DNA-binding protein B, right origin binding protein) ekspresseerub maksimaalsel tasemel eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes, kus teda on üle 10000 molekuli raku kohta. Statsionaarse faasi rakkudes väheneb CppB hulk 60%-le maksimaalsest tasemest. Selle valgu osalust on näidatud nii transkriptsiooni kui ka replikatsiooni kontrollis.
    DnaA (DNA-binding protein A) on DNA-ga järjestus-spetsiifiliselt seonduv valk, mis on olulise tähtsusega DNA replikatsiooni initsiatsioonil, kuid käitub paljudel juhtudel ka transkriptsiooni aktivaatorina või repressorina. DnaA-d on rakus 900 – 2700 molekuli: maksimaalne kontsentratsioon on tuvastatav eksponentsiaalse faasi keskmises osas ning teine kontsentratsioonitõus ilmneb statsionaarses faasis.
    Dps (DNA-binding protein from starved cells) rakusisene hulk on maksimaalne (150000 – 200000 molekuli raku kohta) statsionaarses faasis või oksüdatiivse stressi korral. Selle valgu seondumine DNA-ga näib toimuvat mittespetsiifiliselt. Eksponentsiaalse faasi rakkudes on ligikaudu 6000 Dps molekuli raku kohta. Valgu hulk suureneb statsionaarse faasi käigus. Dps-i funktsiooniks on kaitsta DNA-d kahjustuste eest.
    Fis (factor for inversion stimulation) on väike aluseline DNA-ga järjestusspetsiifiliselt seonduv valk, mis kirjeldati esmalt sait-spetsiifilisel rekombinatsioonil. Fis on oluline ka eksponentsiaalses faasis tugevalt ekspresseeruvate geenide (rRNA ja tRNA geenid) transkriptsioonil ja DNA replikatsioonil. Eksponentsiaalses faasis on Fis valku 60000 molekuli raku kohta, kuid statsionaarses faasis jääb ta detekteerimatuks (alla 100 molekuli). Seega on Fis kasvavates rakkudes üheks põhiliseks nukleoidiga assotsieeruvaks valguks.
    Hfq (host factor for phage Q), tuntud ka faktori i nimetuse all, seondub nii DNA-ga kui ka RNA-ga. Seondumine on mittespetsiifiline, kuid toimub eelistatult paindunud DNA-le. Eksponentsiaalses faasis on Hfq-d ligikaudu 55000 molekuli raku kohta. Statsionaarses faasis valgu hulk langeb järk-järgult, jõudes tasemeni, mis vastab 1/3-le maksimaalsest. Lisaks DNA-le on Hfq assotsieerunud ka ribosoomidega ning kontrollib mitmete mRNA-de translatsiooni (näiteks statsionaarse faasi sigma faktorit kodeeriva rpoS mRNA ja DNA mismatch-reparatsiooni ensüümi MutS kodeeriva mutS mRNA translatsiooni).
    H-NS (histone-like nucleoid structuring protein) on globaalne transkriptsiooni repressor, mis kontrollib üle 35 geeni ja operoni tööd. Eksponentsiaalses kasvufaasis on 20000 H-NS-i molekuli raku kohta, kuid statsionaarses faasis tema hulk langeb ja jõuab 40%-ni maksimaalsest tasemest.
    HU (heat-unstable nucleoid protein) on eukarüootsete histoonide prokarüootne homoloog, mis on koos Fis valguga üks põhilisi nukleoidi komponente. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on 30000 – 55000 HU molekuli raku kohta ning sel juhul peaks teoreetiliselt olema DNA-ga seondunud üks HU dimeer iga 300 – 400 bp tagant. Statsionaarses faasis langeb HU hulk raku kohta 1/3-le eksponentsiaalses faasis mõõdetust.
    IciA (inhibitor of chromosome initiation A) seondub spetsiifiliselt 3-le 13 nt pikkusele kordusjärjestusele DNA replikatsiooni alguspunkti oriC piirkonnas ning inhibeerib DNA replikatsiooni initsiatsiooni, blokeerides DnaA poolt vahendatud DNA ahelate lahtisulamise oriC regioonis. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on 400 IcaA dimeeri ja statsionaarses faasis on IcaA hulk langenud 250 dimeerile.
    IHF (integration host factor) seondub DNA-ga spetsiifiliselt heterodimeerina. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on üle 12000 IHF-i monomeeri raku kohta ning IHF-i hulk hakkab tõusma rakkude kasvu aeglustumisel, jõudes statsionaarses faasis 55000 monomeerini raku kohta. Sügavamas statsionaarses faasis langeb IHF-i hulk poolele maksimaalsest väärtusest. IHF on DNA-d tugevalt painutav valk, mistõttu tema seondumine DNA-ga on nii struktuurse kui ka funktsionaalse tähtsusega. IHF osalust on näidatud nii transkriptsiooni aktivatsiooni regulatsioonil, DNA replikatsiooni initsiatsioonil kui ka geneetilise materjali ümberkorraldustel. E. coli IHF-defektsete mutantide puhul on mõningates süsteemides täheldatud IHF-i funktsiooni komplementeerimist HU poolt.
    Lrp (leucine-responsive regulatory protein) on globaalne transkriptsiooni regulaator mis kontrollib nii positiivselt kui ka negatiivselt rohkem kui 75 geeni transkriptsiooni. Kasvavates rakkudes on 1200 – 1300 Lrp dimeeri, kuid statsionaarse faasi rakkudes langeb nende hulk 10 korda. Võrreldes rikka söötmega on minimaalsöötmel kasvates rakkudes Lrp hulk ligikaudu 2,5-korda kõrgem. Nälgivates rakkudes aktiveeritud geenide puhul toimib Lrp positiivse transkriptsiooni faktorina.
    StpA (supressor of td mutant phenotype A) on H-NS-i homoloog, mis avastati faagi T4 td fenotüübi supressorina. StpA on võimeline komplementeerima H-NS-i mutante. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on 25000 StpA molekuli raku kohta, statsionaarse faasi rakkudes 8000 – 10000.
    Kokkuvõtvalt võib öelda, et kõigi eelpoolkirjeldatud valkude hulk muutub rakkudes sõltuvalt rakkude kasvufaasist. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on maksimaalne tase 9-l valgul – CbpB, DnaA, Fis, Hfq, H-NS, HU, IciA, Lrp ja StpA. Statsionaarse faasi rakkudes tõuseb 3 valgu (CbpA, Dps ja IHF) hulk. Kuna enamus neist valkudest mõjutavad transkriptsiooni aktivatsiooni kas siis positiivselt või negatiivselt, võimaldab nende valkude rakusisese hulga kasvufaasist sõltuv muutumine moduleerida paljude geenide transkriptsioonitaset vastavalt rakkude kasvukiirusele. Järgmises peatükis tulebki täpsemalt juttu geeniregulatsioonist rakkude erinevatel kasvukiirustel.

    8. Stress. Rakkude kasvukiiruse muutustega kaasnevad füsioloogilised muutused ning geeniregulatsioon


    Alati, kui bakterite paljunemine on takistatud kas toitainete nappuse või ebasobivate keskkonna füüsikalis-keemiliste parameetrite tõttu (kõrvalekalded optimaalsest temperatuurist, pH-st, osmolaarsusest, hapnikuga varustatusest, jne.), tekitab see neile stressi. Põhiline bakterite kasvu piirav tegur on toitainete nappus. Patogeensete bakterite paljunemist takistavad lisaks veel sellised tegurid nagu peremeesorganismi immuunvastus, antibiootikumi ravi. Bakterid on võimelised väga kiiresti kohastuma muutunud keskkonnatingimustega. Esmane kohastumine on kiire, füsioloogiline ja võimaldab bakteritel mõnda aega elus püsida neile ebasoodsas keskkonnas. Sel juhul bakterite kasv peatub. Vähejagunevates või mittejagunevates bakterirakkudes (neid nimetatakse statsionaarse kasvufaasi rakkudeks) langeb järsult valgusünteesi ja DNA replikatsiooni tase. Samas sünteesitakse neis rakkudes spetsiifilisi valke, mille hulk on kiiresti paljunevates rakkudes väga madal ja mis kaitsevad rakke ebasoodsate keskkonnamõjutuste eest.

    Stress


    Stressina toimivad kõik keskkonnamuutused, mille tulemusena bakterite kasvukiirus aeglustub. Stressi põhjustavad faktorid kutsuvad esile muutusi rakkude füsioloogilises seisundis. Rakkude füsioloogiline seisund kajastub nendes toimuva makromolekulide biosünteesi kiiruses ja rakkude suuruses. Näiteks, kui toitaineid on kasvukeskkonnas rikkalikult, toimub rakkudes aktiivne valgusüntees. Sellised rakud on suuremad, nad sisaldavad rohkem ribosoome ning neis toimub ka aktiivne DNA replikatsioon ja transkriptsioon. Mida rikkalikumalt on keskkonnas rakkudele kasvuks vajalikke komponente, seda vähem kulub energiat nende ühendite de novo sünteesiks ning seda efektiivsemalt saavad rakud paljuneda.
    Enamasti on bakterite kasvuks vajalike toitainete hulk limiteeritud. Seega on kõige raskem defineerida olukorda, kus bakterid ei ole stressis. Pigem on suvalistel kasvutingimustel rakkudele mingit stressi põhjustav toime ja rakud adapteeruvad antud tingimustega. Lisaks näljastressile on palju teisi stressi põhjustavaid olukordi :
  • Kuumashokk - valgud denatureeruvad.
  • Külmashokk - väheneb membraanide voolavus . Madalal temperatuuril stabiliseeruvad DNA ja RNA sekundaarstruktuurid, vähendades translatsiooni, transkriptsiooni ja DNA replikatsiooni toimumise efektiivsust.
  • Oksüdatiivne stress - rakus tõuseb superoksiidi anioonide, hüdroksüülradikaalide ja vesinikperoksiidi hulk, millega kaasnevad kahjustused valkudes ja nukleiinhappes.
  • Aeroobse/ anaeroobse kasvukeskkonna vaheldumine - fakultatiivsetel anaeroobidel on erinevad mehhanismid energia genereerimiseks sõltuvalt sellest, mis on terminaarseks elektronaktseptoriks.
  • Osmootne stress - käivituvad mehhanismid, kus rakk püüab säilitada normaalset siserõhku, turgorit. Äärmuslikes tingimustes aga raku tsütoplasma kas dehüdreerub (hüpertooniline keskkond) või rakud ei suuda piisavalt vett välja viia ja lõhkevad (hüpotooniline keskkond).
  • Keskkonna pH muutustest põhjustatud stress - muutused makromolekulide struktuuris ja biokeemiliste reaktsioonide toimumises. Happestressiga puutuvad kokku näiteks patogeenid .
  • Na+ ioonide kõrge kontsentratsioon.
  • DNA kahjustused - rakus indutseeritakse SOS vastus, käivitub DNA reparatsioon (rekombinatsiooniline reparatsioon), SOS mutagenees ning alternatiivne DNA replikatsioon.
    Bakterite kohanemine muutunud keskkonnatingimustega võib olla kas lühiajaline või pikaajaline.
  • Pikaajalise adapteerumise (geneetiline kohastumus) puhul on muutused toimunud bakteri genoomis. Selle tagajärjel kohaneb grupp organisme eluks antud keskkonnatingimustel, paljunedes neis tingimustes maksimaalse kiirusega.
  • Lühiajaline adapteerumine (füsioloogiline) võib kesta minuteid, tunde või päevi ja muutused, mis sel juhul rakkudes toimuvad, võimaldavad bakteritel antud stressitingimused üle elada. Sel juhul on rakkude kasv enamasti kas peatunud või aeglustunud. Geenide avaldumist kontrollivad kahekomponendilised regulaatorsüsteemid (fosforüleerimiste/defosforüleerimiste kaudu), sigma faktorid ja anti-sigma faktorid, regulaatorid, mille aktiivsus on allosteeriliselt kontrollitud kas väikeste molekulide või redoksreaktsioonide poolt, regulaatorite translatsioon või proteolüüs ja regulatoorsed RNA-d.
    Järgnevalt tuleb põhjalikumalt juttu bakterite füsioloogilisest kohastumisest.
    Üldine stressivastus
    Viimastel aastatel on võetud kasutusele üldise stressivastuse mõiste. Üldise stressiga kaasnevad muutused raku füsioloogias ja morfoloogias, mis suurendavad raku resistentsust erinevatele stressidele. Üldine stressivastus pigem kaitseb rakku kahjustuste eest kui kõrvaldab tekkinud kahjustusi. Üldise stressivastuse kutsuvad esile näiteks rakkude nälgimine (mille tulemusena rakkude kasv peatub ja nad püsivad statsionaarses kasvufaasis), kõrge osmolaarsus, kõrge või madal temperatuur ja keskkonna happesus.
    Paljud valgud, mis erinevate stresside toimel indutseeritakse, kattuvad. Seetõttu ongi rakud ühe stressi puhul taluvamad ka teiste stresside osas. Näiteks temperatuuri tõstmine 57 C-ni on rakkudele letaalne. Kui rakke on eelnevalt 2 tundi näljutatud, jääb neis 57 C juures 7 minuti vältel hoidmisel 40% ellu, 4 tunnise näljutamise tagajärjel aga isegi 85%. Kui rakkude hoidmine 20 tunni vältel pH 5 juures on neile samuti letaalne, siis eelnevalt 3 tundi näljutatud rakkudest jääb ellu 40%.
    Üldise stressivastuse käigus on indutseeritud paljud “heat shock” valgud, millest osa on molekulaarsed shaperonid. Molekulaarsed shaperonid osalevad valkude pakkimisel, makromolekulide assambleerimisel ning valkude transpordil ja translokatsioonil läbi membraani. Olles oma funktsiooni täitnud, vabanevad nad lõpproduktilt ilma seda eelnevalt keemiliselt muutmata. GroEL seondub eelistatult helikaalsetele peptiididele, DnaK ei vaja nii struktureeritud konformatsiooni. DnaK interaktsioonil DnaJ ja GrpE-ga muutub DnaK afiinsus substraatide suhtes ja suureneb ATPaasne aktiivsus. Selle tulemusena vabaneb DnaK substraadilt ja seondub mujale.

    Transkriptsioon ja kasvukiirus


    Bakterirakkude kasvukiirus sõltub toitainete kättesaadavusest kasvukeskkonnast ning keskkonna füüsikalistest parameetritest nagu näiteks temperatuur, osmootne rõhk ja pH. Selleks, et rakud suudaksid adapteeruda muutunud keskkonnatingimustega, toimuvad muutused paljude geenide transkriptsioonitasemes.
    Vastavalt sellele, kas ja kuidas transkriptsioonitase promootoritelt erinevatel kasvukiirustel bakterirakus on muutunud, liigitatakse promootoreid kolme klassi. Liigitusel on kasutatud inglisekeelseid termineid.
  • “Housekeeper” promootorid - transkriptsioonitase on ühesugune erinevatel kasvukiirustel. Need promootorid kontrollivad selliste geenide tööd, mille avaldumine on rakule alati vajalik.
  • “Stringent” promootorid - töötavad efektiivsemalt rakkudes, mille kasvukiirus on suurem. Siia kuuluvad promootorid, mis kontrollivad näiteks ribosomaalse RNA operonide tööd.
  • Stressipromootorid - promootorid, millelt lähtuva transkriptsiooni tase on kõrgem rakkude kasvukiiruse aeglustumisel ja statsionaarse faasi rakkudes.
    Selgitamaks erinevate promootorite erinevat aktiivsust rakkude erinevatel kasvukiirustel, lähtusid Jensen ja Pedersen sellest, et rakus on üleüldine transkriptsioonitase limiteeritud vaba RNA polümeraasiga. E. coli rakus on ~2000 RNA polümeraasi apoensüümi, transkribeeritavaid geene aga 4000. Kuigi nn. “stringent” promootorid on tugevad, on nende afiinsus RNA polümeraasile väiksem kui teistel. Nii transkriptsiooni kui ka translatsiooni elongatsiooni kiirused on erinevatel kasvukiirustel erinevad: kehvades kasvutingimustes väheneb transkriptsiooni elongatsiooni kiirus ja seega ka vaba RNA polümeraasi hulk. Kui vaba RNA polümeraasi hulk on muutunud rakus limiteerivaks, langeb konkurentsi tingimustes transkriptsioonitase “stringent” promootoritelt. Samas, kui 70 asemel on RNA polümeraasi apoensüümiga seondunud S või mõni teine faktor, on seondub RNA polümeraas stressipromootoritele suurem afiinsusega ja transkriptsioonitase neilt promootoritelt tõuseb. Sigma faktorite konkureerimisest tuleb täpsemalt juttu hiljem.

    “Stringent response”


    Rakkude pooldumiseks kuluv aeg võib sõltuvalt bakterite kasvutingimustest varieeruda 20 minutist kuni nädalani. Rakkude füsioloogiline seisund, mis väljendub makromolekulide biosünteesi kiiruses ja rakusuuruses, on seotud rakkude kasvukiirusega. Rakkude kasvukiirus on aga omakorda mõjutatud toitainete kättesaadavusest väliskeskkonnast. Mida rikkalikumalt toitaineid, seda kiiremini rakud kasvavad. Sellised rakud on suuremad, nad sisaldavad rohkem DNA-d, RNA-d, valke, fosfolipiide ja rakuseina materjale. Kiiremalt kasvavates rakkudes on raku kohta rohkem ribosoome kui aeglaselt kasvavates rakkudes. Näiteks rikkal söötmel generatsiooniajaga 20 min kasvanud rakkudes on 20000 ribosoomi raku kohta, vaesel söötmel generatsiooniajaga 180 min kasvanud rakkudes on ribosoome raku kohta aga 10 korda vähem – 2000. Normaalsetes kasvutingimustes katalüüsivad ribosoomid valgusünteesi maksimaalse kiirusega (ligikaudu 16 polümerisatsioonisündmust sekundis) ning sel juhul saab valgusünteesi taset rakus tõsta ainult ribosoomide arvu suurendamise teel.
    Rakud jagunevad antud kasvukeskkonnas optimaalse kiirusega. Kui keskkonnatingimused muutuvad toitainete ammendumise tõttu ebasoodsamaks , vallandub rakkudes esmalt nn “stringent response” (SR). SR vallandub rakkudes vastusena aminohapete näljale ja võimaldab neil adapteeruda tingimustes, kus energiaressursid on väiksemad. Selle tulemusena pikeneb rakkude generatsiooniaeg. Pikemaajalise nälgimise puhul võib rakkude kasv hoopis peatuda ja rakud püsivad puhkeasendis e. statsionaarses faasis. Statsionaarsesse faasi minekul võib olla ka muid põhjuseid kui ainult nälg.
    SR tulemusena väheneb nii RNA kui ka valkude süntees, võimaldades rakkudel adapteeruda uue keskkonnaga. Eriti markantselt langeb rRNA ja tRNA geenide transkriptsioon ning sellest tulenevalt väheneb ka ribosoomide hulk antud tingimustel optimaalse tasemeni. Samuti on inhibeeritud DNA replikatsiooni initsiatsioon ning rakukesta komponentide ja fosfolipiidide biosüntees. Samas on aktiveeritud aminohapete biosüntees ning tõusnud translatsiooni täpsus. SR-i vallandumiseks sünteesitakse alarmooni ppGpp ning eespool kirjeldatud muutused rakkude füsioloogilises seisundis leiavad suures osas aset just vastusena selle molekuli olemasolule rakkudes.
    ppGpp süntees
    ppGpp-d sünteesitakse siis, kui rakus on aminohapete nälg ja selle tulemusena seondub transleeriva ribosoomi aktseptorsaiti laadimata tRNA molekul . Siis translatsioon peatub ning aktiveerub ribosoomi 50S subühikuga seondunud RelA . RelA on (p)ppGpp süntetaas I, mis katalüüsib ATP-lt pürofosforüülrühma ülekande GTP 3’ hüdroksüülrühmale. ppGpp snteesi puhul on kirjeldatud ka RelA-sõltumatu rada, milles osaleb (p)ppGpp süntetaas II nimetusega SpoT . SpoT aktiveerub vastusena pikemaajalisele C-näljale ja ei sõltu ribosoomide seisundist. Kui vajadus SR-ile kaob, rakkudes on piisavalt energiat ja aminohappeid valgusünteesiks ning kasvukeskkonnas toitaineid, ppGpp lagundatakse. ppGpp degradatsiooni GDP-ks viib läbi SpoT.
    ppGpp mõjutab otseselt geeniekspressiooni, seda nii transkriptsiooni kui ka translatsiooni tasemel. Kaudselt on ppGpp olemasolust mõjutatud DNA sünteesi, rekombinatsiooni ja reparatsiooniga seotud protsessid. ppGpp effekti erinevatele bioloogilistele protsessidele on kirjeldatud erinevates bakteriliikides ja isegi taimedes.
    Näiteks on ppGpp hulga kaudu mõjutatud Myxococcus xanthus’e rakkude morfoloogia ja diferentseerumine , Mycobacterium tuberculosis’e virulentsuse kujunemine ja sekundaarsete metaboliitide ( antibiootikumid ) süntees. M. tuberculosis’e RelA-defektne mutant ei ela üle pikaajalist nälgimist ja anaeroobseid kasvutingimusi. Just selliste tingimustega peab patogeen organismis toime tulema ).
    ppGpp mõju transkriptsioonile
    Kuigi ppGpp mõju transkriptsioonile on juba aastakümneid uuritud, pole selle molekulaarseid mehhanisme kuni seniseni veel lõpuni suudetud selgitada. Seni läbiviidud uuringute tulemused võib kokku võtta järgnevalt. In vitro katsetega on näidatud, et ppGpp mõjutab transkriptsiooni otseselt. ppGpp resistentsed RNA polümeraasi mutandid sisaldavad mutatsioone -subühikut kodeerivas rpoB geenis. Stabiilse RNA (rRNA ja tRNA) geenide transkriptsioon on ppGpp poolt inhibeeritud. Samas on ka ppGpp poolt positiivselt kontrollitavaid geene. Näiteks aminohapete biosünteesi ja C-allikate degradatsioonil osalevate operonide transkriptsioonitase suureneb ppGpp olemasolu korral. Promootorite puhul, mis on ppGpp poolt kas positiivselt või negatiivselt kontrollitud, jääb –10 heksameeri ja transkriptsiooni alguspunkti vahele nn. “diskriminaatorjärjestus”. ppGpp negatiivse toime korral on diskriminaatorjärjestus GC-rikas, positiivselt reguleeritud geenide korral on see järjestus aga AT-rikas. Mutatsioonid selles piirkonnas võivad viia ppGpp-sõltumatule transkriptsioonile. rrn operonide transkriptsioonil mõjutab ppGpp ka transkriptsiooni elongatsiooni kiirust, põhjustades RNA polümeraasi peatumist spetsiifilistel järjestustel.
    ppGpp poolt negatiivselt reguleeritavate promootorite puhul põhjustab see nukleotiid RNA polümeraasi dissotseerumise avatud kompleksist. ppGpp interaktsioone on näidatud RNA polümeraasi rinevate subühikute kindlate regioonidega (β-subühiku C-terminus; β´-subühiku N-terminus; sigma faktori σ70 regioon 3).
    ppGpp mõju translatsioonile
    ppGpp translatsiooni pärssiv mõju ilmneb mitmeti. ppGpp interakteerub translatsiooni initsiatsioonifaktoriga IF-2 ning blokeerides initsiaator -tRNA-kompleksi seondumise ribosoomiga. ppGpp võib mõjutada ka translatsiooni elongatsiooni, seondudes elongatsioonifaktoritega EF-TU ja EF-G (seondub eeskätt EF-G-ga) ja inhibeerida sel viisil elongatsiooni. Translatsioonil kulutatakse GTP energiat. Kuna ppGpp on sünteesitud GTP-st, langeb rakkudes GTP kontsentratsioon ja ka see võib hakata translatsiooni piirama.

    Statsionaarne faas


    Ebasoodsates tingimustes on bakteritel ellujäämiseks 2 strateegiat:
  • Sporulatsioon (Bacillus, Myxobacteria). Bacillus subtilis’e sporulatsiooniga on seotud üle 125 geeni. Nende geenide transkriptsioon on nii ajaliselt kui ka ruumiliselt kontrollitud RNA polümeraasi alternatiivse  faktorite ja transkriptsiooni regulaatorite poolt.
  • Rakud jäävad stressitingimustes metaboolselt aktiivseteks , kuid nad ei jagune (E. coli, Salmonella , Vibrio, Pseudomonas). Geeniregulatsiooni mehhanisme statsionaarse faasi rakkudes on valdavalt uuritud E. coli puhul.
    Üleminek eksponentsiaalsest faasist statsionaarsesse faasi on järk-järguline protsess, kus rakkude kasvukiirus järjest aeglustub. Kasvu aeglustumise peamisteks põhjusteks on kasvuks vajalike komponentide ammendumine keskkonnast (C, P ja N nälg), toksiliste produktide akumuleerumine kasvukeskkonda, hapnikunälg, kasvukeskkonna pH muutumine ebasoodsaks, ulatuslikud temperatuurimuutused jne. Statsionaarse faasi rakud säilitavad mõne aja potentsiaali paljuneda. Seejärel hakkab elusrakkude arvukus populatsioonis langema . Samas tuleb arvestada ka seda, et rakupopulatsioon on statsionaarses faasis dünaamiline. Osa rakke populatsioonist adapteeruvad keskkonnaga ja on võimelised kasvama surnud rakkudest vabanevate resursside arvel. Kui keskkonnatingimused paranevad, hakkab rakkude arvukus populatsioonis jällegi tõusma. Enamasti ei ole looduslikes tingimustes elavatele bakteritele kasvuks piisavalt toitaineid. Seega on rakkude kasv üldjuhul limiteeritud ning rakkude väga aeglane paljunemine või viibimine statsionaarses faasis pigem reegel kui erand .
    Sisenemine statsionaarsesse kasvufaasi
    Rakkude sisenemine statsionaarsesse kasvufaasi ei ole järsk. Mida aeglasemalt rakud kasvavad, seda enam meenutavad nad statsionaarse faasi rakke. Uued ensüümsüsteemid limiteeriva komponendi juurdehankimiseks indutseeritakse juba C, N või P vaeguse esmaste signaalide ilmnemisel. Näiteks NH4 vaegus on signaaliks NtrB kinaasse aktiivsuse avaldumisele. Aktiivne NtrB fosforüleerib NtrC ning see omakorda aktiveerib transkriptsiooni ntr geenide 54-sõltuvalt promootorilt. Kui limiteerivat komponenti ei õnnestu juurde hankida, rakkude kasv aeglustub, kuni rakupopulatsioon jõuab statsionaarsesse kasvufaasi.
    Statsionaarsesse faasi sisenemisel sünteesitakse uusi valke, millest paljud muudavad rakud resistentsemaks ka teistele stressidele nagu näiteks oksüdatiivne stress, osmootne stress ja temperatuuristress. Mõnede patogeenide puhul avalduvad virulentsusfaktorid alles rakkude nälgimise korral.
    Muutused statsionaarse faasi rakkudes:
  • Membraanis muutub rasvhapete sisaldus, suureneb rakkude adhesioon ning rakud agregeeruvad. Rakud on ka väiksemad ja ümaramad. Suureneb rakkude liikuvus. Viburite süntees on siiski ajutine, kuna nõuab liialt energiat.
  • Toimuvad muutused kromosoomi topoloogias, väheneb DNA superspiralisatsioon. Rakus muutub DNA-ga seonduvate valkude tase (H-NS, IHF, Dps). Need valgud reguleerivad geenide ekspressiooni taset rakus ning kaitsevad DNA-d füüsiliste ja keemiliste atakkide eest. Eksponentsiaalses kasvufaasis on IHF-i molekule raku kohta 10000-15000, statsionaarsesse faasi sisenemisel nende hulk viiekordistub ning valk seondub ka väiksema afiinsusega saitidesse. Dps seondub DNA-ga mittespetsiifiliselt, kaitstes DNA-d oksüdatiivsete kahjustuste eest. Paljud valgud degradeeritakse ja väheneb ka RNA stabiilsus.
  • Toimub valkude denaturatsioon ja proteolüüs. Selle kaitseks on indutseeritud HSP valgud ja valgud, mis parandavad kahjustusi aminohapetes (Pcm, MsrA).
  • Sünteesitakse uusi valke. Praeguseks on bakteris E. coli identifitseeritud ligi 100 statsionaarsele faasile spetsiifilist geeni.
  • Ribosoomide arv rakus väheneb. 70S ribosoome konverteeritakse 100S dimeerideks. Dimeriseerumisel osaleb 55 aminohappe suurune aluseline valk RMF (ribosome modulation factor). RMF-defektsed rakud elavad statsionaarset faasi halvasti üle. Dimeersed ribosoomid on resistentsemad proteaasidele ja nukleaasidele ning translatsiooniliselt inaktiivsed. Seni puuduvad andmed, kuidas toimub sellistel ribosoomidel statsionaarse faasi-spetsiifilise mRNA translatsioon.
  • Märgatavat DNA degradatsiooni esialgu pole.
  • Statsionaarse faasi rakkudes tõuseb mitmete tsütoplasma komponentide rakusisene kontsentratsioon. Nende komponentide hulka kuuluvad näiteks K-glutamaat, trehhaloos , glütsiin, betaiin, glükogeen ja polüfosfaat (polü P).
    Rakkude ellujäämine statsionaarses kasvufaasis sõltub nende elukeskkonnast. Näiteks P nälgimine viib kiiremini E. coli rakkude suremiseni kui C nälgimine ning rikkal söötmel statsionaarsesse faasi jõudnud rakkude suremus on samuti kõrgem, kui võrrelda seda minimaalsöötmel kasvatatud rakkude eluvõimelisuse säilumisega. Rakkude hoidmisel glükoosil ( MOPS puhvris) märgatavat suremust 7 päeva jooksul ei ole täheldatud. LB-s kasvatatud rakukultuuris langeb CFU/ml 2 kuni 5 päeva jooksul 2 suurusjärku ja jääb siis pikaks ajaks püsima.
    On kirjeldatud mutante, mis on kohastunud eluks statsionaarses faasis. Mutatsioonid on toimunud S C-terminuses, regioonis, mis võiks interakteeruda promootoralaga.
    Väljumine statsionaarsest faasist.
    Sporulatsioonist väljatulekuks on vaja kuumutamist, järsku pH muutust või redutseerivate ainete toimet. Statsionaarsest faasist väljatulekuks piisab tingimuste loomisest, mis võimaldavad rakkudel kasvada. E. coli rakkudes on jälgitav Fis valgu taseme järsk tõus. Fis- mutantidel on väga pikk lag periood. SurB mutandid on samuti tundlikud statsionaarsest faasist väljumise suhtes.
    Statsionaarse faasi faktor S.
    S, geeni rpoS produkt (tuntud ka kui RpoS) on üks olulisi faktoreid nende geenide avaldumiseks, mida bakterid vajavad tingimustes, kus nende kasv on pärsitud.
    RpoS-i poolt on mõjutatud paljud bioloogilised protsessid:
    1) Stressi taluvus
    Oksüdatiivse stressi vastus (katalaasid, glutatiooni reduktaas, superoksiidi dismutaas); Dps
    Trehhaloosi süntees; trehhaloos on osmoprotektant ja tagab kuumataluvuse;
    Happe resistentsus
    Etanooli resistentsus
    2) Rakkude programmeeritud suremine (enteritsidiini lookus ecnAB kodeerib antidoot/ toksiin süsteemi.
    3) Rakukest , morfoloogia – RpoS mõjul on rakud väiksemad, sfäärilisemad (soodustab bolA transkriptsiooni, bolA reguleerib pBP6 avaldumist. PBP6 on karboksüpeptidaas, mis on vajalik raku jagunemisel septumi moodustumiseks; välismembraani lipoproteiini OsmB hulga suurenemisel rakud agregeeruvad).
    4) Metabolism – RpoS kontrollib näiteks atsetüül-CoA süntaasi geeni transkriptsiooni. See ensüüm on oluline atsetaadi reutiliseerimisel (kiire kasvu korral produtseerivad E. coli rakud atsetaati ja viivad selle rakust välja).
    5) Virulentsus – RpoS poolt on positiivselt reguleeritud geenid, mis osalevad patogeensete bakterite kolonisatsioonil ja ellujäämisel tingimustes, kus käivituvad peremehe kaitsemehhanismid .
    6) Pseudomonas aeruginosa (inimese oportunistlik patogeen) biofilmi moodustumine ja hulgatunnetus (quorum sensing).
    S-i taset kontrollivad mehhanismid bakterirakus
    Eksponentsiaalselt kasvavates E. coli rakkudes on S ebastabiilne, poolestusajaga 1,5 kuni 2,5 minutit. See näitab, et S avaldumist kontrollitakse põhiliselt transkriptsioonijärgselt. Lisaks sõltub S ekspressioonitase rakkude kasvukeskkonna temperatuurist. 30 C juures kasvavates rakkudes on S tase kõrgem kui 37 C juures, 20 C juures on S tase kõrge aga isegi eksponentsiaalselt kasvavates bakterites.
  • Transkriptsioon. Rakkude üleminekul eksponentsiaalsest kasvufaasist statsionaarsesse tõuseb rpoS mRNA kogus raku kohta 20 korda, valgu hulk aga 100 korda. rpoS transkriptsioon on kontrollitud 4-lt promootorilt, neist peamine on p1 (70-sõltuv ja ppGpp poolt stimuleeritud). Transkriptsiooni stimuleerivad nõrgad happed (atsetaat, bensoaat) ning rakkude viimine rikkalt söötmelt vaesele (tagab 10-kordse transkriptsiooni tõusu).
  • Translatsioon. rpoS mRNA moodustab sekundaarstruktuuri, mis takistab mRNA transleerimist. Selleks, et mRNA muutuks transleeritavaks, peab temaga seonduma RNA shaperon Hfq (varem tuntud nimetuse all Host Factor I, HF-I osalust on näidatud veel RNA faagi Q replikatsioonil). S ekspressiooniks madalal temperatuuril kasvavates eksponentsiaalse kasvufaasi rakkudes on vajalik väike RNA molekul dsrA, mis muudab rpoS mRNA transleeritavaks madalal temperatuuril. Arvatakse, et H-NS-i negatiivne mõju S-i ekspressioonile on samuti seletatav rpoS mRNA sekundaarstruktuuri kontrolliga . H-NS soodustab sellise rpoS mRNA sekundaarstruktuuri teket, mis takistab translatsiooni.
  • Valgu stabiilsus. S stabiilsust bakterirakus kontrollivad ClpXP proteaas ja RssB. RssB eksponeerib valgu proteaasile.
    RpoS on indutseeritud ka homoseriin laktooni (HSL) poolt. HSL on difundeeruv bakteriaalne feromoon, mida bakterirakud sünteesivad statsionaarsesse kasvufaasi jõudes või nälgides. Kirjeldatud on veel teisi väikeseid rakus S taset mõjutavaid signaalmolekule nagu ppGpp (positiivne mõju) ning cAMP ja UDP-glükoos (negatiivne mõju).
    RpoS ei ole ainuke faktor, mis kontrollib statsionaarses faasis indutseeritud geenide avaldumist. Rakkude süsiniku-nälgimisel on tuvastatud 20 S-st sõltumatu valgu induktsioon.
    Mis põhjustab promootori äratundmise ES poolt?
    ES poolt transkribeeritavad promootorid on sageli äratuntavad ka E70 poolt (v. a. fic promootor). Osade S-st sõltuvate promootorite puhul on leitud spetsiifilisust määravaid determinante promootori -10 regioonist. Võrreldes erinevate S-st sõltuvate promootorite järjestusi, on välja pakutud konsensusjärjestus CTATACT. Andmed on mõnevõrra vastuolulised. Mitmed katsetulemused viitavad sellele, et tegelikult S-spetsiifilist konsensusjärjestust polegi – teatud tingimustel on teatud promootorid ES poolt paremini äratuntavad kui E70 poolt. Näiteks geenide osmY ja osmB puhul on näidatud, et 0,5 M või kontsentreeritum K-glutamaat inhibeerib in vitro katsetes selektiivselt E70, kuid samas toimub nende geenide transkriptsioon efektiivselt ES poolt. K-glutamaadi kontsentratsioon rakkudes on nende geenide töölelülitamisel ligikaudu sama kõrge kui seda eelpoolkirjeldatud in vitro katsetes. Trehhaloosi kontsentratsiooni tõus 0,5 M-lt 1,0 M-le kontsentratsioonile soodustab samuti ES formeerumist ning võrreldes E70-ga on ES transkriptsiooniliselt aktiivsem just kõrgematel trehhaloosi kontsentratsioonidel.
    E70 ja ES afiinsust DNA-le mõjutavad veel DNA superspiralisatsioon ja RNA polümeraasi modifitseerimine. Aeglaselt jagunevates ja statsionaarse faasi rakkudes väheneb DNA superspiralisatsioon. ES seondub efektiivsemalt promootorile tingimustes, kus DNA superspiralisatsioon on vähenenud. Statsionaarse faasi rakkudes on RNA polümeraas assotsieerunud happeliste ühenditega nagu näiteks polüfosfaat (polü-P). Polü-P akumuleerub statsionaarse faasi rakkudes. Arvatakse, et polü-P modifitseerib apoensüümi statsionaarse faasi rakkudes, nii et see seob eelistatult S molekule. Polüfosfaadi kinaasi PPK defektse tüve ellujäävus statsionaarses kasvufaasis on võrreldes algse baktritüvega langenud.
    Sigma faktorite konkureerimine vabale RNA polümeraasile
    E. coli rakkudes on ligikaudu 2000 RNA polümeraasi molekuli. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on 500-700 molekuli 70, kuid S tase jääb detekteerimispiirile. Ligikaudu 2/3 RNA polümeraasi molekulidest tegeleb transkriptsiooni elongatsiooniga ning 1/3 on seotud 70-ga. Kuigi 70 molekulide rakusisene hulk statsionaarses faasis ei lange, tõuseb statsionaarse faasi rakkudes ES poolt initsieeritud transkriptsiooni tase. Statsionaarses faasis suureneb S kogus 250 – 300 molekulini raku kohta. See on ikkagi ainult 30 – 35% 70 tasemest. Seega peavad sigma faktorid vaba RNA polümeraasiga seondumiseks omavahel konkureerima. T. Nyströmi laboris näidati, et S üleekspressioon põhjustas transkriptsioonitaseme langust 70-sõltuvalt promootorilt ja vastupidi, 70 üleekspressiooni korral langes transkriptsioon S-st sõltuvatelt promootoritelt. Ka “kuumashoki” vastusel osalev 32 konkureerib 70-ga.
    Hiljuti identifitseeriti valk Rsd (regulator of sigma D), mis seondub spetsiifiliselt 70-ga, toimides anti-sigma faktorina. Seondumine toimub piirkonda, mis kattub promootorite –35 heksameerset järjestust äratundva domääniga. Rsd hulk tõuseb siis, kui rakkude kasv aeglustub ja on maksimaalne statsionaarsesse faasi rakkudes. Kuna enamus 70-st on statsionaarse faasi rakkudes inaktiivses olekus, seondub RNA polümeraasiga eelistatult S. Lisaks on kirjeldatud veel faktor Crl, mis soodustab S-i seondumist RNA polümeraasiga.
    6S RNA mõju transkriptsioonile
    6S RNA-d on eksponentsiaalselt jagunevates rakkudes 1000 koopiat, statsionaarse faasi rakkudes aga 10 korda enam. See väike RNA interakteerub otseselt RNA polümeraasi erinevate subühikutega β, β´ ja σ70. 6S RNA pärsib transkriptsiooni 70-sõltuvatelt promootoritelt ja soodustab transkriptsiooni statsionaarse faasi-spetsiifilistelt promootoritelt.
    9. Transport
    Raku elutegevuseks on vaja, et raku kasvuks vajalikud komponendid pääseksid sisse ning et välja viidaks metabolismi käigus tekkinud, rakule mittevajalikke või kahjulikke ühendeid. Kui ainete liikumine läbi raku välismembraanis olevate kanalite ja pooride võib toimuda difusiooni teel, siis sisemembraani läbimiseks on vaja energiat nõudvaid transportsüsteeme.
    Lähtudes transportimise viisist ja energiaallikast on transportsüsteemid klassifitseeritavad järgmiselt:
  • Kanalid ja poorid – molekulid läbivad membraani passiivselt, ei vaja energiaallikat;
  • Elektrokeemilise potentsiaali varal töötavad porterid (sekundaarne transportsüsteem), kuhu kuuluvad sümporterid, antiporterid ja laenguga molekulide uniporterid;
  • Primaarsed aktiivsed transporterid – kasutavad primaarseid energiaallikaid, mille tagajärjel tekib ioongradient, mis on omakorda energiaallikaks sekundaarsetele transportsüsteemidele;
  • Rühma translokaatorid (group translocators) – substraadi transportimisega kaasneb selle keemiline modifitseerimine (näiteks glükoosi fosforüleerimine glükoos-6-fosfaadiks PTS süsteemis).
    Järgnevalt kõigest täpsemalt.
    Passiivne difusioon
    Graamnegatiivsete bakteritel on välismembraanis kitsad kanalid, mis võimaldavad hüdrofiilsete ühendite (näiteks suhkrud , aminohapped, teatud ioonid) passiivset difusiooni periplasmasse. Sellistest kanalitest pääsevad läbi molekulid, mis on väiksemad kui 600-700 Da. See on ainuke transportsüsteem, mis ei vaja energiat. Osa välismembraanis asuvaid poore on mittespetsiifilised, nad on moodustunud üldistest poriinivalkudest OmpF, OmpC ja PhoE. Selliseid poore on E. coli raku välismembraanis üle 100 000. Paljud bakterite kasvuks vajalikud komponendid, näiteks oligosahhariidid , vajavad välismembraani läbimiseks spetsiifilisi poore. Näiteks maltoos läbib välismembraani maltoporiini LamB abil. Spetsiifilisi kanaleid läbivad ka sahharoos ja nukleotiidid .
    Kui substraat liigub spetsiifiliste pooride kaudu kontsentratsioonigradiendi languse suunas, ei tõuse substraadi rakusisene kontsentratsioon kunagi kõrgemaks rakuvälisest. Kuigi teatud ühendid võivad läbi membraani difundeeruda suhteliselt vabalt, toimub see protsess substraadi kontsentratsiooni madala gradiendi korral liiga aeglaselt, et võimaldada rakkude kiiret kasvu. Soodustatud difusiooni (faciliated diffusion) puhul osaleb spetsiifiline difusiooni soodustav valk ( facilitator ). Glütserooli difusioon rakkudesse toimub poriini tüüpi kanalite kaudu, mis on moodustunud GlpF valgu baasil. Läbi nende pooride liiguvad ka uurea ja glütsiin. Bakteritel Zymomonas mobilis ja Streptococcus bovis toimub samal põhimõttel ka glükoosi transportimine.
    Kuigi paljud ühendid läbivad difusiooni teel välismembraani, on sisemembraan nende poolt läbitav ainult energiat nõudvate transportsüsteemide abil, kuna enamasti töötavad need süsteemid vastu kontsentratsioonigradienti. Seega on tegemist aktiivse transpordiga. Tsütoplasmaatiline membraan toimib hüdrofoobse barjäärina enamuse hüdrofiilsete molekulide suhtes.
    Primaarsed ja sekundaarsed transportsüsteemid
    Primaarsed transportsüsteemid on otseselt seotud kas keemiliste või fotokeemiliste reaktsioonidega. Nende süsteemide töö tulemusena tekkiv elektrokeemiline ioonpotentsiaal on kasutatav sekundaarsete transportsüsteemide poolt. Primaarseid transportsüsteeme jaotatakse nende toimimise alusel:
  • klass 1 – hingamise (või fototroofsetel bakteritel ka fotosünteesi) käigus toimuv H+ ioonide translokatsioon, mille tulemusena tekib membraani sise- ja välispinna vahele prootonpotentsiaal.
  • klass 2 – komponendi membraani läbimisega kaasneb ATP süntees või hüdrolüüs. Siia kuuluvad F tüüpi ATP süntaasid (F1F0 ATPaas ), mis on seotud primaarse energia konversiooniga ja mis toimivad mõlemas suunas. Oksüdatiivsel fosforüleerimisel (hingamisahel) sünteesivad nad ATP-d prootonite rakku pumpamisel. Fermenteerimisel luuakse aga plasmamembraani elektrokeemiline potentsiaal prootonite väljapumpamisel ja sel juhul toimub ATP hüdrolüüs. Kirjeldatud on ka P-tüüpi ATPaase, mis vastutavad K+, Ca+ või Mg2+ transpordi eest. Osmootse stressi korral osaleb K+ transpordil näiteks Kdp-ATPaas.
    K+ on bakterirakus oluline katioon. Lisaks normaalse pH ja osmootse rõhu säilitamisele on ta oluline kofaktor paljudele ensüümidele. E. coli’s on kaks K+ transportsüsteemi. Kdp süsteem on kõrge afiinsusega, ATP-d tarbiv ja indutseeritav kaaliumi limitatsiooni korral. teine süsteem, Trk süsteem, on pidevalt olemas, kuid madala afiinsusega (kõrge Km, 2 mM).
    Omaette alamklassi moodustab ATP-d tarbiv substraadiga seonduvate valkude kaudu vahendatud transportsüsteem (binding protein- dependent system). Periplasmaatilised valgud seonduvad spetsiifiliste substraatidega nagu näiteks sulfaadid, aminohapped, suhkrud ja kannavad need sobivatele membraanseoselistele kompleksidele. Edasi toimub nende transportimine tsütoplasmasse läbi ühesuunaliselt avaneva poori. Transportimisel hüdrolüüsitakse ATP-d. E. coli puhul transporditakse sel viisil rakku ligikaudu 40% substraatidest. Seda süsteemi nimetatakse ka osmootse shoki tundlikuks (shock sensitive) transportsüsteemiks. See süsteem ei toimi rakkudes, millel on osmootne shokk, kus välismembraan on muutunud läbilaskvaks ja selle kaudu saavad väluda periplasmaatilised valgud.
    Sellesse alajaotusesse kuulub ka transpordisüsteem, mida inglisekeelses terminoloogias tuntakse “ traffic ATPases” nimetuse all. Üheks detailsemalt uuritud transporteriks on histidiini permeaas. Histidiini permeaasi moodustavad histidiini siduv valk HisJ ning 3 membraanseoselist valku HisQ, HisM ja HisP . HisP on ATP-ga seonduv valk. Kui HisJ seondub histidiiniga, muutub tema konformatsioon ning HisJ interakteerub membraanseoseliste valkudega. Histidiini translokatsiooni käigus läbi HisQ ja HisM baasil moodustunud poori toimub ATP hüdrolüüs. Histidiini permeaasi abil tuuakse rakku ka arginiin ja ornitiin, mis on seondunud HisJ-le analoogilise valguga.
    Sarnaselt toimub ka maltoosi transportimine rakku. Kui maltoos on väliskeskkonnast sisenenud periplasmasse (kasutades selleks maltoosi-spetsiifilist poriini LamB), seondub ta MalE -ga, mille konformatsioon seeläbi muutub, nii et substraadiga seondunud MalE interakteerub sisemembraani valkudega MalF ja MalK . Maltoosi translokatsiooniga läbi membraani kaasneb MalK-vahendatud ATP hüdrolüüs. ATP-d siduvaid transportereid nimetatakse nende sarnast ATP saiti sisaldava järjestusmotiivi põhjal ka ABC (ATP binding cassette) perekonna transporteriteks.
  • klass 3 – Na+ ioonide transport dekarboksüleerimisel vabaneva energia baasil. Sel viisil tekib membraani sise- ja väliskülje vahel Na+ ioonide potentsiaal. Energiaallikaks on näiteks oksaloatsetaat. Selline süsteem on kirjeldatud bakteril Klebsiella pneumoniae.
    Sekundaarne transportsüsteem võimaldab molekulidel läbida membraani olemasoleva, primaarse transportsüsteemi abil loodud ioongradiendi arvelt, kasutades näiteks prootonpotentsiaali (mõnikord ka Na+-ioonide potentsiaali). Kirjeldatud on nii uniport , sümport kui ka antiport mehhanisme. Üheks kõige paremini iseloomustatud süsteemiks on laktoosi transport rakku laktoosi permeaasi LacY abil. Laktoosi sümportimisega kaasneb prootonite läbi membraani pumpamine.
    Eristatakse 3 süsteemi:
  • Sümport – ühe kandja poolt vahendatud kahe substraadi samaaegne transport samas suunas. Prootongradient võimaldab sümportida vastupidiselt laetud ioone või neutraalseid molekule (näiteks laktoosi transportimine rakku laktoosi permeaasi LacY abil). Sümporterid töötavad enamasti H+ gradiendi varal, kuid alkalofiilidel ja atsidofiilidel on kirjeldatud ka Na+ sümportereid.
  • Antiport – kahe sarnaselt laetud ühendi samaaegselt vastassuunaline transportimine. Sellesse süsteemi kuulub näiteks Na+ ja H+ ioonide transportimine NhaA ja NhaB abil, mis võimaldab rakkudel aluselises keskkonnas kasvamisel säilitada tsütolasmas neutraalse pH.
  • Uniport – transporditava substraadi membraani läbimine ei sõltu teiste ühendite kontsentratsioonist või transportimisest. Põhimõtteliselt toimub sel viisil eelpoolkirjeldatud glütserooli soodustatud difusioon.
    Substraadi translokatsioon fosfoenoolpüruvaadi (PEP) fosfotransferaasi süsteemi (PTS) abil
    Mõnikord on PTS toodud ka primaarsete transporterite alla. Transpordi käigus toimub fosfoenoolpüruvaadi PEP hüdrolüüs.
    Substraadi transportimisega rakku kaasneb selle keemiline modifitseerimine, kus substraat fosforüülitakse. Praeguseks on iseloomustatud üle 20 erineva süsteemi, mis võimaldavad rakku tuua erinevaid suhkruid või nende alkohole (näiteks mannitool , glükoos, mannoos ). Kui suhkur seondub transporteriga, ta fosforüleeritakse. Fosforüülrühm pärineb PEP-ilt ja kantakse üle proteiini kinaasi Ensüüm I (EI) ning fosfoaktseptorvalkude HPr (Histidine Protein) ja Ensüüm II (EII) abil. EI ja HPr on kõigi PTS-de puhul ühised, EII on substraadile spetsiifiline. EII-l on identifitseeritud 3 autonoomset domääni. Hüdrofiilne domään IIA (varem tuntud ka nimetuse all EIII või III) sisaldab esimest fosforüleerimise saiti (P~His). Hüdrofiilne domään IIB sisaldab teist fosforüleerimise saiti (P~Cys, mõnedel ensüümidel ka P~His). Membraanseoseline hüdrofoobne transporterdomään IIC võib osade substraatide puhul (näiteks mannoos) jaotuda kaheks domääniks – IIC ja IID. Fosforüülrühma ülekandmine PEP-ilt substraadile toimub järjekorras PEP  EI  HPr  IIA  IIB  IIC-ga (või IIC ja IID-ga) seondunud substraat. Võrreldes fosforüleerimata substraadiga toimub fosforüleeritud substraadi transport rakku tunduvalt efektiivsemalt.
    Metabolismi lõpp-produktide rakust väljutamine
    Metabolismi lõpp-produktide rakust väljutamine võib toimuda samuti mitmel viisil. Väljutamise mehhanism sõltub konkreetsest ühendist. Hüdrofoobsed metabolismi lõpp-produktid nagu alkoholid (näiteks butanool), atsetoon ja dissotseerumata vormis orgaanilised happed läbivad membraani difusiooni teel. Teiste ühendite nagu näiteks aminohapped ja karboksüülhapped väljutamist vahendab kandja-molekul. Sekundaarsete transportsüsteemide abil toimub ekskreteerimine näiteks prekursor/produkt antiport-süsteemi kaudu (vt. laktaat / malaat antiport, millest tuleb juttu transpordi regulatsioonis). Glükoosi kääritamisel tekkiv laktaat sümporditakse rakust välja koos prootonitega ja see võimaldab genereerida elektrokeemilise prootonpotentsiaali, mis on rakkudele energiaallikaks. Sekundaarsete transportsüsteemide osalemist on näidatud veel antibiootikumide rakust väljaviimisel – oluline mehhanism antibiootikumi resistentsus-mehhanismides. Primaarseid ATP-sõltuvaid ekskreteerimise süsteeme on kirjeldatud mitmete toksiliste ühendite (näiteks raskemetallide ioonid) väljutamisel.

    Transpordi regulatsioon


    Transportsüsteemidel on raku elutegevuse seisukohalt mitmeid erinevaid funktsioone – toitainete rakku toomine, metabolismi lõpp-produktide ja rakuseina komponentide eksportimine ning väliskeskkonna signaalide protsessimine. Need protsessid peavad olema väga täpselt reguleeritud. Erinevate transportsüsteemide kasutatavus sõltub kasvukeskkonnas olevate toitainete kontsentratsioonist. Mitmete erinevate C-allikate korraga esinemisel aktiveeruvad spetsiifilised transportsüsteemid vastavalt substraatide metaboolsele kvaliteedile. Transportsüsteemide kaudu tagatakse rakus optimaalne K+, Na+, H+ ja Ca2+ ioonide kontsentratsioon. Substraadid võivad membraani läbida kas passiivselt või aktiivselt ning antipordi ja sümpordi puhul toimub lisaks konkreetse substraadi transpordile ka teiste komponentide transportimine. Ka samal organismil võib ühe ja sama substraadi rakkutoomiseks olla kasutusel mitu erinevat süsteemi. Näiteks E. coli puhul on kirjeldatud vähemalt 7 erinevat süsteemi, mis osalevad D-glükoosi ja D-galaktoosi rakkutoomisel ning vähemalt 5 süsteemi glutamaadi ja aspartaadi transpordil.
    Mehhanismide paljusus on seletatav erinevustega konkreetse komponendi hulgas rakkude kasvukeskkonnas. Seda, millist mehhanismi kasutada, määrab ka antud substraadi transportimiseks ja metabolismiks kuluv energia. Primaarsed transportsüsteemid ja PTS on komplekssed, mitmest subühikust koosnevad. Neil süsteemidel on kõrge afiinsus substraadile ja enamasti töötavad nad ühesuunaliselt, võimaldades substraadi akumuleerumist rakku väga suurel hulgal ka siis, kui seda on väliskeskkonnas vähe. Näiteks maltoosi transpordil rakku ATP-d tarbiva substraadiga seonduvate valkude kaudu vahendatud transportsüsteemi (MalE, MalF ja MalK) abil toimub maltoosi 2x105 kordne kontsentreerimine.
    Sekundaarsed transportsüsteemid on lihtsad, koosnedes ühest subühikust ning nad toimivad primaarsete süsteemide poolt tekitatud membraanpotentsiaali varal. Sekundaarsed süsteemid toimivad sageli mõlemasuunaliselt. Vastassuunaline protsess võib käivituda vähese energia korral või siis, kui transporditava komponendi rakuväline kontsentratsioon on väga madal. Sekundaarsete transportsüsteemide puhul ei ületa transporditava substraadi akumuleerumise suhe (rakusisene/rakuväline) väärtust 102-103. Näiteks käärimine toodab rakule suhteliselt vähe kasulikku energiat. Seetõttu on oluline, et substraadi rakku transportimiseks kuluks võimalikult vähe energiat. Siin on ökonoomne kasutada süsteemi, kus sama transporter toob rakku prekursori ja viib välja käärimise lõpp-produkti. Sellistel tingimustel töötab näiteks malaat/laktaat antiport-süsteem bakteris Lactococcus lactis, kus rakku tuuakse malaati ja väljutatakse fermenteerimise tagajärjel tekkinud laktaati. Malaadi rakusisene metaboliseerimise tulemusena tekib raku sise- ja välikeskkonna vahele malaadi gradient , kus malaadi kontsentratsioon on rakus madalam. Käärimise tulemusena akumuleeruva laktaadi suhtes tekib aga vastupidine gradient, mis võimaldab laktaati rakust väljutada. Kuna malaati imporditakse anioonina ning ekporditav laktaat on neutraalne, moodustub membraani sise- ja välispinna vahel prootonpotentsiaal, mis on rakule energiaallikaks (seda kasutatakse ATP sünteesiks).
    Konkreetse substraadi rakku transportimiseks on mitu erinevat süsteemi välja kujunenud tavaliselt siis, kui vastav substraat on rakkude kasvu seisukohalt oluline, kuid selle kontsentratsioon võib ulatuslikult varieeruda. Sel juhul on üks süsteemidest konstitutiivne ning substraadi suhtes madala afiinsusega. Konstitutiivse süsteemi puhul on Vmax (maksimaalne substraadi transportimise kiirus) väärtus kõrge ja Km (substraadi kontsentratsioon, mille juures selle transportimise kiirus on pool maksimaalsest) väärtus madal. Indutseeritavad süsteemid on kõrge afiinsusega. Indutseeritavad transportsüsteemid aktiveeritakse sageli transportsüsteemi põhilise substraadi poolt. Geenid, mis kodeerivad selle substraadi transportsüsteemi ja katabolismil osalevaid ensüüme, paiknevad sageli samas operonis või regulonis (näiteks laktoosi operon). Lisaks võib transporterite aktiivsust mõjutada raku energiastaatus, rakusisene ja rakuväline pH või raku väliskeskkonna osmolaarsus. Samuti võib transporterite aktiivsust mõjutada mõni rakusisene regulaatorvalk, teise transportsüsteemi komponent või metaboliit (näiteks cAMP). Tänu paindlikule süsteemile avaldub E. coli puhul näiteks nn. glükoosiefekt (kataboliitne repressioon), kus olukorras, kus bakterite kasvukeskkonnas on korraga C-allikatena nii glükoos kui ka laktoos , kasutatakse esmalt ära energiarikkam glükoos.

    10. C-metabolismi regulatsioon


    Kui bakterite kasvukeskkonnas on korraga erinevaid C- allikaid , mille kontsentratsioon on suurem kui 1 mM, kasutatakse esmalt ära need, mis võimaldavad rakkude kiiremat kasvu. Sel juhul on rakus indutseeritud ainult need ensüümid, mis osalevad eelistatud substraadi kasutamisel . Teiste substraatide kasutamisel osalevate ensüümsüsteemide süntees on maha surutud. Sellist regulatoorset mehhanismi nimetatakse kataboliitseks repressiooniks. Bakteril E. coli ja teistel enterobakteritel on kataboliitset repressiooni kirjeldatud glükoosi puhul. Kui kasvukeskkonnas on lisaks glükoosile ka teisi C-allikaid, näiteks laktoosi, kasutab rakk toiduks ainult glükoosi, laktoosi kasutamisel osalevad ensüümid on represseeritud. Kui glükoos on ära kasutatud, järgneb bakterite kasvu aeglustumine, mil nad adapteeruvad teise substraadiga.
    Erinevate C-allikate poolt põhjustatud kataboliitse repressiooni efektid on erinevad. bakteri E. coli puhul on leitud, et tugev efekt on glükoosil, glükonaadil ja glükoos-6-fosfaadil, nõrk efekt aga glütseroolil ja laktaadil. Perekonda Pseudomonas kuuluvatel bakteritel põhjustavad kataboliitset repressiooni peamiselt orgaanilised happed, glükoosi-vahendatud repressioon on aga nõrk.
    Lisaks süsivesinike transporterite ja kataboolsete ensüümide tööle mõjutab kataboliitne repressioon ka viburite sünteesi, glükogeeni ( varuaine ) sünteesi, sporulatsiooni ning ekstratsellulaarsete ensüümide sünteesi, mis osalevad polümeeride degradatsioonil.
    Suhkrute transportimisel rakku ja fosforüleerimisel osaleb fosfoenoolpüruvaadi (PEP) fosfotransferaasi süsteem (PTS). See süsteem osaleb ka kataboliitsel repressioonil. PTS-i moodustavad kaks fosfotransferaasi – Ensüüm I (EI) ja HPr ning erinevad suhkru-spetsiifilised permeaasid Ensüüm II (EII). EII koosneb kolmest kuni neljast erinevast funktsionaalsest üksusest, millest kaks vastutavad fosfaadi ülekande eest (IIA ja IIB) ja ülejäänud osa on membraani läbiv. EII moodustab üks või mitu erinevat polüpeptiidi. Fosforüülrühma ülekandmisel PEP-ilt suhkrule osalevad EI, Hpr, EIIA ja EIIB. Lisaks kataboliitsele repressioonile osalevad PTS-i komponendid ka N-metabolismi, kemotaksise ja rakkude transformatsiooni kompetentsuse regulatsioonis.
    PTS on levinud nii graam-negatiivsetes kui ka graam-positiivsetes bakterites fakultatiivsetes ja obligatoorsetes anaeroobides, vähem obligatoorsetes aeroobides.
    Kataboliitne repressioon bakteris E. coli
    Transkriptsiooni aktivaator CAP (CRP) aktiveerib transkriptsiooni lac operoni (laktoosi metabolism) promootorilt ainult siis, kui ta on seondunud cAMP-ga. cAMP sünteesi eest vastutab adenülaadi tsüklaas (kodeeritud cya lookuse poolt). cAMP tase varieerub rakus vahemikus 1-10 μM. Glükoosi-nälgimisel on cAMP alarmooniks, mis on vajalik lisaks laktoosile paljudel teistel C-allikatel kasvamiseks. cAMP on fosfodiesteraasi poolt kiiresti AMP-ks degradeeritav. Kui bakterite kasvukeskkonnas on glükoosi, on cAMP süntees inhibeeritud.
    Glükoosi-spetsiifiline permeaas EIIGlc koosneb kolmest domäänist IIA, IIB ja IIC. Regulatsiooni seisukohalt on keskse tähtsusega EIIAGlc (osades õpikutes ja varasemas kirjanduses on seda tähistatud ka kui IIIGlc). EIIAGlc, kui ta on fosforüleerimata (fosforüülrühm on üle kantud glükoosile), seondub ja inhibeerib teiste C-allikate permeaasid (laktoosi, melibioosi, maltoosi permeaasid ning glütserooli kinaasi). Fosforüleeritud vorm ei seondu nende permeaasidega, kuid aktiveerib adenülaadi tsüklaasi. ja rakkudes sünteesitakse cAMP-d.
    Glükoosi olemasolul bakterite kasvukeskkonnas on EIIAGlc fosforüleerimata, adenülaadi tsüklaasi ei aktiveerita ning inhibeeritud on ka laktoosi permeaas. Kuna laktoosi permeaas on inaktiivne, ei saa laktoos rakku ning rakus ei saa tekkida laktoosi operoni induktormolekuli allolaktoosi, mis pärsiks repressori seondumise operoni operaatoralale. Sellist kontrollmehhanismi nimetatakse induktori välistamiseks (inducer exclusion). EIIAGlc defosforüleerimist põhjustab glükoos-6-fosfaadi olemasolu rakkudes. Kui EIIAGlc molekulide arv langeb rakus alla 20000, jäävad mõned permeaaside molekulidest mõjutamata ja toovad rakku induktorit – sel viisil toimub induktori välistamise süsteemi kontrolli alt vabanemine. EIIAGlc seondub laktoosi permeaasi ja glütserooli kinaasiga vaid siis, kui, need on seondunud vastavate substraatidega. Sel viisil välditakse EIIAGlc asjatut seondumist alternatiivsete substraatide transporteritega.
    Adenülaadi tsüklaasi CyaA-defektsed E. coli rakud ei kasva laktoosil, maltoosil, glütseroolil, mannitoolil ja tsitraaditsükli vaheühenditel. Vastavate substraatide metabolismiga seotud ensüüme kodeerivad operonid kuuluvad CRP moduloni. CRP on transkriptsiooni aktivaatorvalk, mis seondub nende operonide promootoralale ainult cAMP juuresolekul.
    Viimaste aastate uurimistulemused viitavad sellele, et glükoosi poolt vahendatud kataboliitses repressioonis on põhiroll just induktori välistamise mehhanismil. Seda kinnitavad katsed aktivaatori CRP mutantidega, kus transkriptsiooni aktivatsioon lac promootorilt toimub ka ilma cAMP-ta, kuid glükoosi juuresolekul on operoni repressiooniefekt sama suur kui metsiktüüpi CRP valgu korral. Samas kaob glükoosi efekt, kui kasutatakse lac repressori inaktiivseid mutante.
    Lisaks lac operonile alluvad bakteris E. coli kataboliitsele repressioonile näiteks gal operon (galaktoosi kasutamine C- allikana ) ja ara operon (L-arabinoosi kasutamine).
    Adenülaadi tsüklaasi kodeeriva geeni cya ja CRP-d kodeeriva geeni crp avaldumine on samuti mõjutatud sellest, kas bakterite kasvukeskkonnas on glükoosi või mitte. cya geeni transkriptsiooni kontrollivad kolm promootorit. Geeni transkriptsioonitase võib varieeruda 2 – 4 korda. cAMP-CRP kompleks represseerib cya geeni transkriptsiooni. Seega on selle geeni transkriptsioonitase maksimaalne siis, kui bakterite kasvukeskkonnas on glükoosi. Samas tuleb arvestada seda, et glükoosi negatiivne efekt adenülaadi tsüklaasi aktiivsusele on ligikaudu 100-kordne. cya geeni transkriptsioonitaseme tõus glükoosi olemasolu korral kasvukeskkonnas suurendab rakkude potentsiaali cAMP produktsiooniks olukorras, kus glükoos ammendub ja kasutama hakatakse teisi suhkruid. See kiirendab bakterite adaptatsiooni muutunud keskkonnatingimustes.
    cya geeni translatsioon toimub madalal tasemel, kuna mRNA ribosoomiga seonduv sait (RBS) sisaldab vähe homoloogiat 16S rRNA-ga ja initsiaatorkoodon on ebatavaline , UUG. Kui UUG koodon asendada AUG-ga, tõuseb adenülaadi tsüklaasi hulk rakus 6 korda. Selline tõus on rakkudele letaalse toimega.
    crp geeni transkriptsioonitase on samuti cAMP-CRP kompleksi poolt reguleeritav. Glükoosi olemasolu korral kasvukeskkonnas (madal cAMP tase rakkudes) CRP hulk rakus langeb. Kui glükoosi pole (cAMP hulk rakus on kõrge), CRP rakusisene kontsentratsioon tõuseb.
    Glükonaat ja glükoos-6- fosfaat , mis võimaldavad samuti bakterite kiiret kasvu, ei kasuta transportimiseks PTS-i, kuid põhjustavad samuti kataboliitset reoressiooni, mõjutades CRP taset.
    Kataboliitne repressioon teistes bakterites
    Erinevalt E. coli’st, kus glükoosi poolt vahendatud kataboliitse repressiooni toimel väheneb teiste C-allikate katabolismiradade positiivse regulaatori (cAMP-CRP kompleks) hulk, suureneb näiteks graam-positiivsetes bakterites negatiivse regulaatori hulk, mis pärsib alternatiivsete C-allikate kasutamise. Näiteks Bacillus’e puhul on kataboliitse repressiooni seisukohalt oluline hoopis valgu HPr fosforüleerimise viis. Kui bakterite kasvukeskkonnas on glükoosi, on valgu HPr seriin 46-ndast positsioonist (Ser46) HPr kinaasi poolt fosforüleeritud. Sel viisil fosforüleeritud HPr toimib koos fosforüleeritud valguga Crh korepressorina valgule CcpA ja kõik need valgud koos represseerivad teiste suhkrute katabolismiradade operonide transkriptsiooni. Kui glükoosi keskkonnas pole, toimub valgu HPr alternatiivne fosforüleerimine PTS ensüümi EI poolt valgu 15-ndas positsioonis asuvast histidiinist ( His15 ) ning operonide transkriptsioon on aktiveeritud.
    Pseudomonas spp. bakteritel klassikalist glükoosi poolt vahendatud kataboliitset repressiooni ei toimu. Neil on ka glükoosi metabolismirada erinev. Kui E. coli rakkudes toimub glükoosi kasutamine läbi EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) raja, kus glükoos 6-fosfaat konverteeritakse püruvaadiks, siis pseudomonaadides metaboliseeritakse glükoos Entner-Doudoroff’i raja kaudu, mida E. coli’s kasutatakse glükonaadi lagundamiseks. Rajas on 2 esüümi, 6-fosfoglükonaadi dehüdrataas, mis on kodeeritud geeni edd poolt ja 2-keto-3-deoxy-6-fosfoglükonaadi (KDPG) aldolaas, mis on kodeeritud eda geeni poolt. E. coli’s on dehüdrataasi aktiivsus glükoosil detekteerimatu ning on indutseeritud ainult glükonaadi juuresolekul. Pseudomonas’e rakkudes püsib cAMP tase konstantsena sõltumata C-allikast. Kataboliitset repressiooni kutsuvad esile hoopis orgaanilised happed nagu TCA vaheühendid suktsinaat ja tsitraat.
    Glükoneogenees
    Bakterite kasvamisel n.ö. vaesematel C-allikatel nagu näiteks L-malaat, suktsinaat, atsetaat või glütserool on vaja sünteesida heksoose. Heksoose vajatakse rakukesta komponentide sünteesiks, säilitusaine glükogeeni tootmiseks ja riboos 5-fosfaadi sünteesiks, mis omakorda on aluseks nukleiinhapete biosünteesil. Heksoosi süntees toimub püruvaadist glükoneogeneesi teel, kus EMP glükolüütiline rada on pandud vastupidi tööle. Samas ei ole kõik ensüümid (näiteks püruvaadi kinaas) võimelised vastupidiseid reaktsioone läbi viima, kuna see on energeetiliselt liiga kulukas . Seetõttu on PEP-i moodustumine oksaloatsetaadist (oksaloatsetaat tekib püruvaadist püruvaadi karboksülaasi toimel) katalüüsitud PEP karboksükinaasi poolt. See ensüüm kasutab fosforüülrühma doonorina GTP-d:
    oksaalatsetaat + GTP  PEP + CO2 + GDP
    Teine pöördumatu reaktsioon EMP rajas on katalüüstud fosfofruktokinaasi poolt, mis viib fruktoos 6-fosfaadi fruktoos 1,6-bisfosfaadiks:
    FBP + H2O  F-6-P + Pi
    Glükoneogeneesis viib pöördreaktsiooni läbi fruktoosi 1,6-bifosfataas. Nende kahe vastandliku ensüümi suhe rakus määrabki, kumb rada töötab. Näiteks E. coli mutandid, mis on defektsed fruktoos 1,6-bisfosfataasi geeni fbp suhtes, ei ole võimelised kasvama glükoneogeneetilistel substraatidel malaat, suktsinaat, glütserool või atsetaat. EMP rajas katalüüsib glükoosist glükoos 6-fosfaadi moodustumise heksokinaas. Ka see reaktsioon ei ole sama ensüümi poolt pööratav. Glükoneogeneesis defosforüleerib glükoos 6-fosfaadi glükoos 6-fosfataas:
    G-6-P + H2O  glükoos + Pi
    Glükoneogenees on energeetiliselt kulukas:
    2püruvaat + 4ATP + 2GTP + 2NADH + 2H+ + 4 H2O  glükoos + 2NAD+ + 4ADP + 2GDP + 6 Pi
    Glükoneogeneesis on krutsiaalse tähtsusega PEP-i karboksükinaasi geeni pckA regulatsioon. Selle geeni transkriptsioon allub kataboliitsele repressioonile. Glükoneogenees on inhibeeritud, kui bakterite kasvukeskkonnas on glükoosi. PEP-i karboksükinaasi maksimaalne tase on rakkudes detekteeritav ka üleminekul eksponentsiaalsest kasvufaasist statsionaarsesse kasvufaasi. Lisaks on vajalik cAMP juuresolek . Vajadus glükoneogeneetiliste produktide sünteesi järele statsionaarsesse faasi sisenevates rakkudes arvatakse seisnevat selles, et neist produktidest lähtudes sünteesitakse varuaineid ja aminohappeid.
    Glükogeeni sünteesi regulatsioon
    Glükogeen on rakus varuaine, millesse on talletatud energia. Glükogeeni sünteesil glükoosist allub kõige tugevamalt regulatsioonile ADP-glükoosi fosforülaas, mis on kodeeritud geeni glgC poolt. Ka glg geenide transkriptsiooon allub kataboliitsele repressioonile. Glükogeeni süntees on kompleksselt kontrollitud – seda mõjutavad nii cAMP tase rakus kui ka ppGpp (juhul, kui aminohapete nälg avaldub glükoosi juuresolekul, glütserooli kasutamisel efekt ei ilmne).
    cAMP-st sõltumatu C-metabolismi tsentraalsete radade FruR (Cra)-vahendatud globaalne regulatsioon
    Süsivesinike tsentraalsete metabolismiradade võtmeensüümid alluvad ka cAMP-st sõltumatule kataboliitsele repressioonile. Eksogeense suhkru olemasolul kasvukeskkonnas on aktiveeritud glükolüüsi raja (EMP), Entner-Doudoroffi raja ja mõnede fosfotransferaasi süsteemi (PTS) ensüümide geenid. Samal ajal on inhibeeritud need geenid, mis kodeerivad glükoneogeneesis, glüoksalaadi harus ja TCA tsüklis osalevaid ensüüme. Nende geenide avaldumist kontrollib fruktoosi reguloni repressor FruR. FruR aktiveerib kolme viimatimainitud raja ensüümide geenide transkriptsiooni ning represseerib glükolüütilise raja ja Entner-Doudoroffi raja ensüüme kodeerivate geenide avaldumise.
    FruR (Cra) valgu N-terminaalses domeenis on “helix- turn -helix” motiiv . FruR on aminohappelise järjestuse homoloogia alusel paigutatud suhkrut siduvate repressorvalkude perekonda (sinna kuulub ka LacI). FruR poolt reguleeritavate geenide regulatoorses alas on konserveerunud FruR-i seondumissaidid. Sõltuvalt sellest, kas FruR seondub reguleeritavate geenide operaatoralale, mis jääb promootorist geeni poole või promootorist ülespoole, ta kas represseerib või aktiveerib vastavate geenide transkriptsiooni. FruR-i efektormolekuliks on kas fruktoos 1-fosfaat või fruktoos 1,6-bifosfaat. Pärast efektoriga seondumist dissotseerub FruR DNA-lt ning selle tulemusena toimub negatiivselt reguleeritavate geenide (glükolüütilised geenid) derepressioon ja positiivselt reguleeritavate geenide (glükoneogeneetilised) deaktivatsioon. FruR-i poolt vahendatud positiivse regulatsiooni puhul aravatakse, et FruR soodustab RNA polümeraasi kontakteerumist promootoralaga. Negatiivse regulatsiooni korral toimib ta analoogiliselt Lac repressorile LacI-le.
    FruR-defektsed mutandid ei suuda kasvada laktaadil, püruvaadil ja tsitraaditsükli vaheühenditel.
    Alternatiivsed sigma faktorid C-allikate metabolismi regulatsioonis
    C-allikate nälja puhul rakkude kasvukiirus aeglustub ja rakud lähevad statsionaarsesse faasi. Aktiveeruvad geenid, mille transkriptsioon oli enne kataboliitse repressiooni tõttu pärsitud. Paljude sellistes tingimustes aktiveeritud geenide transkriptsioon on kontrollitud statsionaarse faasi-spetsiifilise sigma faktori S poolt. Üldjuhul on nendeks geenid, mille transkriptsiooni aktivatsioonil ei osale cAMP-CRP. Seega toimib ka S poolt vahendatud transkriptsiooni aktivatsioon kataboliitsele repressioonile vastandlikult. S-sõltuvat transkriptsiooni aktivatsiooni C-allikate metabolismis on täheldatud näiteks periplasmas paikneva trehalaasi geeni treA, trehaloosi süntaasi geeni otsAB ja glgS geeni (glükogeeni süntees) transkriptsioonil. Paljud rakkude liikumist ja kemotaksist kontrollivad geenid, mis alluvad kataboliitsele repressioonile, on kontrollitud teise alternatiivse sigma faktori, F (28) poolt.
    Muud faktorid, mis mõjutavad kataboliitsele repressioonile alluvate geenide transkriptsiooni
    Lisaks cAMP-CRP-sõltuvale transkriptsiooni aktivatsioonile ja alternatiivsete sigma faktorite poolt vahendatud transkriptsiooni aktivatsioonile mõjutab kataboliitsele repressioonile alluvate geenide aktivatsiooni rakusisene ppGpp kontsentratsioon. ppGpp hulk suureneb nälgivates rakkudes. Samuti mõjutab nende geenide transkriptsiooni indool-3-äädikhappe, -ketovõihappe ning dinukleotiidi AppppA rakusisese kontsentratsiooni muutus.

    11. N-allikate kasutamise regulatsioon


    Enterobakterid kasutavad N-allikana erinevaid lämmastikku sisaldavaid ühendeid, kuid eelistatuim neist on ammoonium . Seda on lihtne jälgida näiteks rakkude kasvukiiruste võrdlemisel minimaalsöötmetel, mis sisaldavad erinevaid N-allikaid.
    N2 fikseerimine atmosfäärist
    N2 fikseerivad bakterid (näiteks mitmed Rhizobium’i liigid, Klebsiella pneumoniae) on võimelised siduma lämmastikku atmosfäärist ja konverteerima seda ammooniumiks. N2 fikseerimisel osaleb multikomponentne nitrogenaasi süsteem, mis koosneb kahest komponendist:
  • Komponent I – dinitrogenaas (molübdeeni ja rauda sisaldav kahest erinevast subühikust koosnev MoFe-valk), tetrameer
  • Komponent II – dinitrogenaasi reduktaas (raua ja väävli- seoseline Fe-valk, mis kannab elektronid dinitrogenaasile). Töötab dimeerina, sisaldab Fe4S4 klastrit, mis on vajalik FeMo redutseerimiseks lämmastiku fikseerimisel.
    Erinevatel bakteritel on see süsteem sarnane nii funktsiooni kui ka valkude aminohappelise järjestuse põhjal. N2 fikseerimine on energiakulukas protsess. Nitrogenaasi reaktsiooni tulemusena tekib ammoonium ning vabaneb ka H2. Elektronide allikaks on ferredoksiinid ja flavoproteiinid, mis on saanud elektronid näiteks püruvaadi oksüdeerimisel atsetüül-CoA-ks.
    N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP  2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi
    Lämmastiku fikseerimine toimub ainult siis, kui molekulaarne lämmastik N2 on ainus N-allikas. Fikseeritud N, näiteks ammooniumi NH3, nitraatide, aminohapete ja uurea olemasolul on N-fikseerimisega seotud geenid represseeritud. N-fikseerimine on ka hapnikutundlik, sest hapniku juuresolekul nitrogenaas inaktiveerub. Seetõttu toimub N-fikseerimine kas anaeroobsetes või mikroaerofiilsetes tingimustes.
    Järgnevalt tuleb detailsemalt juttu K. pneumoniae nitrogenaasi kompleksist. Bakteri K. pneumoniae nitrogenaasi kompleks I (dinitrogenaas) on tetrameerne multiensüümkompleks, mis on kodeeritud geenide nifK ja nifD poolt. Rauda ja molübdeeni sisaldav kofaktor FeM-Co on kodeeritud 6 erineva nif geeni (nifQBVNEH) poolt. Dinitrogenaasi reduktaas (komponent II) on kodeeritud nifH geeni poolt. nif geenide transkriptsiooni reguleerivad geenid nifLA, mis on lämmastiku limitatsioonis aktiveeritavad NtrC poolt. NifA on positiivne transkriptsiooni aktivaator, mis aktiveerib transkriptsiooni 54-sõltuvalt promootorilt. nifL geeni produkt interakteerub NifA-ga, takistades NifA-vahendatud transkriptsiooni aktivatsiooni fikseeritud lämmastiku (ammoonium või aminohapped) olemasolul. NtrC aktiivsuse regulatsioonist tuleb detailsemalt juttu hiljem.
    Lämmastiku fikseerimise regulatsioon sümbioosis elavatel bakteritel
    Rhizobium’i rakud elavad sümbioosis liblikõieliste taimedega, moodustades taime juurtel mügaraid e. nooduleid (nodules). Noodulid on kõrgelt diferentseerunud taimeorganid . Nooduli sisemine kude sisaldab baktereid. Sattudes taimeraku tsütoplasmasse, bakterirakud paljunevad ning diferentseeruvad lämmastikku fikseerivateks bakterioidideks. Bakterioidid on taimeraku tsütosoolist eraldatud peribakterioidse membraaniga. Lõpuni diferentseerunud noodulites on taimerakud bakterioididega täidetud. Bakterid kasutavad kasvuks toitaineid, mida produtseerivad taimerakud, vastutasuks omastavad taimerakud bakterite poolt fikseeritud lämmastikku ammooniumi näol. Ajajooksul taimerakud ja bakterioidid vananevad. Võrreldes välise hapniku kontsentratsiooniga (250 mM) on noodulisisene hapnikukontsentratsioon peaaegu kümme korda madalam (30 mM). Selle eest, et bakterioididel jaguks hingamiseks hapnikku, vastutab taimevalk leghemoglobiin, mida sünteesitakse vahetult pärast seda, kui algab lämmastiku fikseerimine.
    Bakterirakud produtseerivad noodulite kujunemisel nodulatsioonifaktoreid – lipooligosahhariide, mida kodeerivad nod geenid. Noduleerivad faktorid indutseerivad juurekarvade deformeerumist ja hargnemist ning infektsiooniala laienemist. nod geenide avaldumist indutseerivad taimeraku poolt produtseeritud flavonoidid ja isoflavonoidid. Erinevad taimeliigid sünteesivad nooduli arengu erinevatel etappidel erinevaid flavonoid -induktoreid. Osa flavonoide soodustavad bakterite kasvu või indutseerivad positiivset kemotaksist. nod geenid paiknevad suures plasmiidis, mida nimetatakse Sym plasmiidiks (tuletatud terminist sümbioos) ning on reguleeritavad positiivse transkriptsioonifaktori NodD poolt, mis aktiveerib transkriptsiooni flavonoid-induktorite juuresolekul.
    Nagu juba eelpool märgitud, toimub lämmastiku fikseerimine Rhizobium’i bakterioidides hapniku madalal kontsentratsioonil. Nitrogenaasi mõlemad komponendid on hapniku-tundlikud ning hapniku juureolekul pöördumatult inaktiveeritavad. Lisaks nif geenidele osalevad lämmastiku fikseerimisel fix geenid. Näiteks fixABCX operon kodeerib ensüüme, mis osalevad elektronide transpordil nitrogenaasi kompleksile. Need geenid on analoogilised K. pneumoniae nifF ja nifLJ geenidele, mis kodeerivad samuti elektronide transpordi süsteemi. fixNOQP geenid kodeerivad membraanseoselist tsütokroomi oksüdaasi, mis osaleb bakterioidi-spetsiifilises hingamisahelas, võimaldades hingamist madalal hapniku kontsentratsioonil. nif ja fix geenide derepressiooniga koordineeritult avaldub dctA (dikarboksülaadi transport), mis kodeerib permeaasi. Permeaas transpordib dikarboksüülhappeid nagu näiteks suktsinaat, malaat ja fumaraat lämmastikku fikseerivatesse bakterioididesse. Need ühendid on energiaallikaks lämmastiku fikseerimisel, kus kulub palju ATP-d. TCA tsükli ensüümid töötavad bakterioidis täie võimsusega. Sel ajal, kui nif, fix ja dct geenid avalduvad, on ammooniumi assimileerimine represseeritud. Tänu sellele saab taimerakk omastada suurema osa fikseeritud lämmastikust.
    nif ja fix geenide regulatsioon Rhizobium’is
    Response regulaatorid, mille aktiivsust kontrollitakse läbi bakterioidi elukeskkonnas oleva hapnikuhulga, vallandavad lämmastiku fikseerimise protsessi kontrolliva signaalse transduktsiooniraja. nif ja fix geenide transkriptsiooni 54-sõltuvatelt promootoritelt aktiveerib NifA. NifA on hapniku-tundlik valk. Ta sisaldab tsüsteiini motiivi, mis seob rauda ning arvatakse, et Fe-ioonide oksüdatsiooniaste mõjutab valgu konformatsiooni ja aktiivsust. Madalal hapniku kontsentratsioonil toimub NifA autoregulatsioon nifA geeni transkriptsiooni tasemel.
    Valgud FixL ja FixJ moodustavad kahekomponendilise regulaatorsüsteemi, mis aktiveerib märklaud-geenid madala hapniku kontsentratsiooni tingimustes. FixL on hapniku sensoriks. Tegemist on hemoproteiiniga, mis autofosforüleerub tingimustes, kus hapnikku on vähe. Seejärel fosforüleerib FixL efektorvalgu FixJ, mis omakorda aktiveerib nifA geeni transkriptsiooni. Sama valk aktiveerib ka fixK geeni transkriptsiooni. fixK kodeerib osade fix geenide transkriptsiooni aktivaatorit.
    NifA C-terminaalne domeen sisaldab “helix-turn-helix” motiivi, mille abil NifA seondub tema poolt reguleeritavate promootorite transkriptsiooni initsiatsioonisaidist 100 bp ülespoole UAS ( upstream activating sequence) järjestustele. Valgu keskmine domeen vastutab RNA polümeraasiga seondumise ja ATP hüdrolüüsi eest. ATP hüdrolüüsi on vaja transkriptsiooni aktivatsioonil avatud kompleksi moodustumiseks.
    Anorgaaniliste lämmastikühendite metabolism
    Ammoonium on ainuke anorgaaniline ühend, mida bakterid saavad orgaaniliste ühendite (aminohapped) sünteesiks otseselt kasutada. Teiste anorgaaniliste ainete (näiteks nitraadid ) koostises olev lämmastik tuleb eelnevalt viia ammooniumiks. Vastavat protsessi nimetatakse denitrifitseerimiseks. Kirjeldatud on ka vastupidist protsessi - nitrifitseerimist, kus ammoonium konverteeritakse nitraadiks ja nitritiks. Osa baktereid kasutavad nitraate näiteks hapniku asemel terminaalsete elektroniaktseptoritena. Nitraatne hingamine on bioloogiliselt oluline energia tootmiseks anaeroobsetes tingimustes.
    Ammoonium on otseseks substraadiks ainult väheste aminohapete (glutamaat, alaniin , aspartaat) sünteesil. Need aminohapped käituvad ülejäänud aminohapete sünteesil aminorühma doonorina ketohapete prekursorite transamineerimisel. Põhilised ensüümid, mis osalevad ammooniumi assimileerimisel, on glutamaadi dehüdrogenaasid (GDH), glutamiini süntetaas (GS) ja glutamaadi süntaas (GOGAT). Alaniini ja aspartaadi sünteesil osalevad alaniini dehüdrogenaas ja aspartaas. Põhiline ühend, mida sünteesitakse, on siiski glutamaat (85%).
    Sõltuvalt ammooniumi hulgast domineerivad enterobakteritel erinevad metabolismirajad:
  • Ammooniumi ülehulgas domineerib glutamaadi süntees -ketoglutaraadist ja ammooniumist glutamaadi dehüdrogenaasi GDH toimel, kasutades NADPH -d. Glutamiini süntetaasi GS toimel sünteesitakse vähesel hulgal ka glutamiini (glutamaat + ammoonium, toimub ATP hüdrolüüs)
  • Ammooniumi madala kontsentratsiooni puhul (rakuväline kontsentratsioon madalam kui 1 mM), siis on ka glutamiini tase madal, on GDH poolt läbiviidava reaktsiooni tasakaal nihutatud, mistõttu glutamaadi sünteesi enam ei toimu (glutamaadi sünteesiks on vaja glutamiini!). Glutamiini rakusisene kontsentratsioon langeb ning selle tulemusena aktiveeritakse seni osaliselt inaktiivne GS. Tõuseb ka GS-i kodeeriva glnA transkriptsioonitase. GS katalüüsib glutamiini sünteesi, glutamiini hulk rakus tõuseb ja sellest sünteesitakse glutamaadi süntaasi GOGAT toimel glutamaati (reaktsioonis osalevad glutamiin, -ketoglutaraat ja NADPH).
    NtrB/NtrC süsteem ammooniumi assimileerimise regulatsioonis
    Lisaks glutamiini süntetaasi kodeerivale geenile glnA asuvad samas operonis veel geenid glnL ja glnG, mis kodeerivad kahe-komponendilist regulaatorsüsteemi. GlnL on tuntud ka nimetuste all NtrB ja NRII ning GlnG asemel kasutatakse sageli nimetusi NtrC ja NRI. Enamlevinud on siiski nimetused NtrB ja NtrC (tuletatud terminist “nitrogen regulation ”). Juhul, kui N-allikat on bakterite kasvukeskkonnas piisavalt, toimub transkriptsioon nõrkadelt 70-sõltuvatelt promootoritelt. Lämmastiku limitatsiooni tingimustes aktiveerib fosforüleeritud NtrC (P-NtrC) transkriptsiooni tugevalt 54-sõltuvalt promootorilt ja inaktiveerib teistelt promootoritelt.
    NtrC fosforüleeritakse sensorvalgu NtrB poolt. NtrB-l on nii autokinaasi kui ka fosfataasi aktiivsus, mida kontrollib bifunktsionaalne ensüüm PII. Sellel ensüümil on uridüültransferaasi (UT) aktiivsus türosiinile ja uridüülrühma kõrvaldav (UR) aktiivsus. UT aktiivsus on stimuleeritud N-vaeguse korral, kus glutamiini kontsentratsioon on rakus madal ja -ketoglutaraadi kontsentratsioon kõrge. Selle tulemusena tekib PII uridüleeritud vorm UMP-PII, mis stimuleerib NtrB-l kinaasi aktiivsust ja NtrC fosforüleeritakse. Vastupidises olukorras, kus ammooniumi hulk on kõrge (suurem kui 1 mM), domineerib PII puhul UR-aktiivsus. UR-aktiivsusega valk valk interakteerub NtrB-ga, stimuleerides NtrB fosfataasset aktiivsust, mille tulemusena NtrB defosforüleerib NtrC.
    Kokkuvõttvalt: Kõrge ammooniumi kontsentratsiooni puhul on NtrB regulaator PII uridüleerimata, NtrB-l avaldub fosfataasne aktiivsus, NtrC ei ole fosforüleeritud ja glutamiini süntetaasi geeni transkriptsioon toimub madalal tasemel. Kui aga ammooniumi kontsentratsioon on madal, on PII uridüleeritud, NtrB-l avaldub kinaasne aktiivsus, mille tulemusena NtrC fosforüleeritakse ja glnA transkriptsioonitase tõuseb.
    Glutamiini süntetaasi aktiivsuse kontroll valgu kovalentse modifitseerimise kaudu
    Lisaks glnA transkriptsiooni regulatsioonile toimub glutamiini süntetaasi aktiivsuse kontroll ka valgu kovalentse modifitseerimise kaudu. E. coli rakkudes olev adenüültransferaas (AT) on samuti bifunktsionaalne ensüüm. AT võib glutamiini süntetaasi türosiinile adenüülrühma kas üle kanda või kõrvaldada. Adenülüülrühma kandev GS-i vorm on inaktiivne. Selle vormi tekkkimist soodustab PII see vorm, mis ei sisalda uridüülgruppi. GlnA inhibeeritakse ka allosteeriliselt (vt. allosteeriline inhibitsioon!).
    NtrC teised funktsioonid
    Bakteris Klebsiella pneumoniae on nitrogenaasi sünteesi eest vastutavad geenid nifHDK samuti fosforüleeritud NtrC poolt aktiveeritavad. N-limitatsioonis aktiveerib P-NtrC NifA transkriptsiooni ning nifA omakorda nifHDK geenide transkriptsiooni. NtrB/NtrC poolt on kontrollitud ka selliste operonide transkriptsioon nagu näiteks hut operon, mis kodeerib histidiini utiliseerimist ja put operon, mis kodeerib proliini utiliseerimist.

    12. Fosfori assimileerimine ja fosfaadi reguloni (Pho) kontroll


    Rakukoostise seisukohalt on fosfor süsiniku ja lämmastiku järel kolmanda tähtsusega element. Fosfor on oluline komponent membraansetes lipiidides, lipopolüsahhariidides, nukleotiidides, samuti lisatakse fosfor posttranslatsiooniliselt paljudele valkudele . Fosforit sisaldavad ühendid on olulised raku energiametabolismis. Seetõttu osaleb P-metabolismis palju erinevaid radu:
  • P assimileerine eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes
  • P assimileerimine P-limitatsiooni korral
  • Energiarikaste fosforühendite süntees.
    E. coli rakud kasutavad P-allikatena kolme tüüpi ühendeid:
  • Anorgaanilised fosfaadid (Pi, pürofosfaat PPi, polüfosfaat polüPi,)
  • Orgaanilised fosfaadid (transporditavad – glütseeraldehüüdfosfaat G3P, heksoos 6-fosfaadid, fosfoenoolpüruvaat PEP, fosfoglütseraat; mittetransporditavad – pärast periplasmasse sisenemist hüdrolüüsitakse aluselise fosfataasi BAP poolt).
  • Fosfonaadid (sisaldavad estersidemete asemel C-P sidemeid, näiteks 2-aminoetüülfosfonaat).
    Anorgaaniliste fosfaatide metabolism
    Anorgaaniliste fosfaatide metabolismiradu on erinevaid:
  • Monofosfaadi Pi inkorporeerimine ATP-sse
    oksüdatiivne fosforüleerimine ADP + Pi  ATP
    glükolüüs
    TCA tsükkel
    käärimine
  • Pürofosfaadi PPi metabolism
    süntees trinukleotiididest nukleiinhapete biosünteesil
  • Polü(Pi) metabolism
  • energiat konserveeriv rada – süntees ATP-st polüfosfaadi kinaasi PpK toimel. PpK võib katalüüsida ka vastupidist reaktsiooni – ATP sünteesi terminaalse fosforüülrühma ülekandmisel polü(Pi)-lt ADP-le.
    b) hüdrolüüs polüfosfataasi PpX toimel.
    Pi rakusisene kontsentratsioon varieerub erinevate kasvutingimuste korral kuni 4 korda (5-18 mM). Rakusisene PPi hulk püsib üldjuhul muutumatuna (0,5 mM), kuid muutub detekteerimatuks stressitingimustes, näiteks glükoosi limitatsiooni puhul. Pi rakku transportimisel osalevad 2 süsteemi – Pst ja Pit süsteemid. Pst süsteem on kõrge afiinsusega, Pit aga madala afiinsusega. Olukorras, kus Pi kontsentratsioon on kõrge, transporditakse seda rakku Pit transporteri abil, mida sünteesitakse rakus konstitutiivselt. Pi limitatsiooni korral aga indutseeritakse Pst süsteem (ligi 100-kordne aktivatsioon) ja Pi viiakse rakku Pst abil. Samas arvatakse, et Pst süsteem toimib basaalsel tasemel ka Pi kõrge kontsentratsiooni korral, kuna Pst süsteem kontrollib Pho reguloni negatiivselt. Intaktset Pst süsteemi on vaja Pho reguloni Pi – poolsel inhibitsioonil. Pst süsteem koosneb mebraaniga assotsieerunud kompleksist, mille moodustavad 4 valku. Tegemist on ABC transportersüsteemiga, kuhu kuuluvad ka näiteks histidiini ja maltoosi transporterid. 2 valku on transmembraansed, moodustades transpordikanali, ülejäänud 2 sisaldavad ATP-d siduvat motiivi. Pit on ühe-komponendiline transporter, mis on analoogiline LacY-le.
    Orgaaniliste fosfaatide transportimine rakku
    E. coli puhul on kirjeldatud 3 süsteemi – GlpT ja Ugp glütseeraldehüüd-3-fosfaadi G3P transpordiks ja UhpT heksoos 6-fosfaatide transpordiks. Ugp süsteem, mis kuulub samuti Pho reguloni, on indutseeritud Pi limitatsiooni korral, võimaldades kasutada G3P-d alternatiivse fosforiallikana. Vastavate geenide transkriptsioon on aktiveeritud veel vastusena C-nälgimisele. Transkriptsiooni aktivatsioonil osalevad cAMP ja CRP valk. Teiste süsteemide regulatsioon allub samuti kataboliitsele repressioonile.
    Pho regulon
    Fosfonolipiidid sisaldavad fosfonaate. Bakterid on võimelised fosforit hankima fosfonaatide lagundamisel, kasutades selleks fosfonataasi ja C-P lüaasi radu. Neid radu kodeerivad geenid kuuluvad Pho reguloni. Bakteris E. coli on kirjeldatud 8 Pho reguloni kuuluvat operoni. Pho reguloni ekspressioonitaset kontrollitakse Pi rakusisese kontsentratsiooni kaudu. Reguloni kuuluvad geenid aktiveeritakse Pi limitatsiooni korral ja inhibeeritakse siis, kui Pi kontsentratsioon on kõrge. Pi sensoriks on PhoR, mille kontrolli all on response-regulaator PhoB. PhoB aktiveerib Pho reguloni geenide transkriptsiooni siis, kui ta on fosforüleeritud. Osade promootorite puhul indutseeritakse transkriptsioon lisaks Pi limitatsioonile ka vastusena C, N või O2-vaegusele (vt. näide Ugp süsteemi aktivatsiooni kohta). Samas on kirjeldatud ka mitmeid Pi limitatsiooni korral aktiveeritavaid promootoreid, mille kontrolli all olevad geenid ei kuulu mitte Pho reguloni vaid mõnda teise reguloni (näiteks LexA poolt kontrollitud SOS regulon, Lrp regulon, OxyR regulon, 32 regulon). Fosfaadi nälja korral on aktiveeritud näiteks Pho reguloni mittekuuluv IHF-i subühikut kodeeriv geen ihfA.
    Kõigi Pho reguloni kuuluvate geenide või operonide promootorite puhul on leitud konserveerunud DNA järjestus, mida nimetatakse Pho boksiks. Sinna seondub fosforüleeritud PhoB. Pho boksi moodustavad kaks 7-bp pikkust otsekordusjärjestust CTGTCAT, mis on teineteisest eraldatud 4-bp pikkuse järjestusega. Pho boks kattub osaliselt promootori –35 heksameeri alaga, millel puudub arvestatav sarnasus –35 elemendi konsensusjärjestusega. Arvatakse, et PhoB kontakteerub otseselt RNA polümeraasiga.
    Lisaks Pi kontsentratsioonist sõltuvale kontrollile koordineerivad Pho reguloni geenide transkriptsiooni veel 2 signaalse transduktsiooni rada, mis seovad nende geenide regulatsiooni C- ja energiametabolismiga:
  • Sensorkinaasi CreC poolt kontrollitud signaali ülekandesüsteem
  • Regulatsioon atsetüülfosfaadi kaudu.
    Atstüülfosfaat tekib vaheühendina fosfotransatsetülaasi Pta ja atsetaadi kinaasi AckA reaktsioonis:
    Pta AckA
    Atsetüül CoA + Pi  atsetüülfosfaat  atsetaat + ATP
    CoA ADP
    Nende reaktsioonide tulemusena inkorporeeritakse Pi ATP-sse, mis on metabolismis esmaseks fosforüülrühma doonoriks. Pta ja AckA ekspresseeruvad rakus konstitutiivselt. Anaeroobsetes tingimustes on nende tase siiski 2 korda kõrgem ning märkimisväärne efekt nende ekspressioonitasemele ilmneb glükoosi nälja korral.
    Atsetüülfosfaadi olemasolu võimaldab rakkudel glükoosi näljas elus püsida. Atsetüülfosfaadist AckA toimel tekkinud atsetaati kasutatakse sel juhul C-allikana. Atsetüülfosfaat võib toimida ka energiaallikana ABC perekonna transportersüsteemis. In vitro katsetes on näidatud, et atsetüülfosfaadi kõrge kontsentratsiooni korral toimub mitmete response regulaatorite (näiteks CheY, NtrC, PhoB) autofosforüleerumine. Seetõttu arvatakse, et atsetüülfosfaat võiks toimida otsese efektormolekulina valkude fosforüleerimisel (ja atsetüleerimisel?). PhoB puhul on leitud sensor-kinaas EnvZ, mis fosforüleerib PhoB, kasutades doonorina atsetüülfosfaati.

    13. Hingamise ja fermenteerimise (käärimise) regulatsioon


    Bakterites on metaboolse energia genereerimiseks 3 viisi. Metaboolse energia genereerimisel toimub elektronide astmeline ülekanne kas aeroobse hingamise, anaeroobse hingamise või käärimise e. fermenteerimise käigus. Kõige detailsemalt on hingamise ja fermenteerimise regulatsiooni uuritud bakteri E. coli puhul, kes on fakultatiivne anaeroob. Selleks, et E. coli’s toimuks aeroobne hingamine, peab hapniku rõhk olema 5 millibaari; anaeroobne hingamine toimub 1-5 millibaarise hapnikurõhu korral ning kui see jääb alla 1 millibaari, lülitub metabolism fermenteerimisele.
  • Aeroobne hingamine (oksüdatiivne fosforüleerimine) on kõige efektiivsem energia genereerimise viis. Rakumembraanis töötab elektronide transpordi ahel (hingamisahel), kus terminaalseks elektroniaktseptoriks on molekulaarne hapnik. Elektronide doonoriks on enamasti NADH. Elektronid kantakse NADH dehüdrogenaasi abil kinoonidele, sealt tsütokroom o või d oksüdaasile ja lõpuks hapnikule; tekib H2O. Elektronid võivad pärineda ka oksüdeeritavatelt C-allikatelt nagu suktsinaat, laktaat, glütserool ning elektronide ülekannet hingamisahela ensüümidele vahendavad siis spetsiifilised dehüdrogenaasid. Elektronide transpordi käigus viiakse läbi tsütoplasms membraani prootoneid H+, mille tulemusena tekib elektrokeemiline gradient (prootonpotentsiaal). Prootonite läbi tsütoplasma membraani tagasipumpamisel sünteesitakse F1F0 ATPaasi abil ATP-d.
  • Anaeroobne hingamine on samuti membraanis toimuv elektronide ülekandmise protsess, kuid kasutab hapnikule alternatiivseid elektronaktseptoreid nagu nitraat , nitrit , fumaraat, dimetüülsulfoksiid ( DMSO ) ja trimetüülamiin N- oksiid ( TMAO ), mis saavad elektrone spetsiifiliste terminaalsete reduktaaside kaudu. Elektronid pärinevad kas glütseroolilt, formiaadilt ( sipelghape ), NADH-lt või vesinikult; elektronide ülekannet vahendavad spetsiifilised dehüdrogenaasid.
  • Fermenteerimisel e. käärimisel (toimub anaeroobsetes tingimustes terminaalsete elektronaktseptorite puudumisel) genereeritakse energiat (ATP süntees) substraadi tasemel fosforüleerimisel. Siia kuuluvad näiteks glükolüüsi tulemusena tekkinud püruvaadi metabolismirajad. Ühe glükoosimolekuli metaboliseerimisel fosfoenoolpüruvaadiks (PEP) genereeritakse 2-st ADP molekulist 2 ATP-d ja moodustub 4H+ + e- paari. Fermenteerimise käigus käigus moodustuvad fosforüleeritud vaheühendid ja koensüümid (trioosfosfaadid, NADH/NAD+, ja ADP/ATP) suunduvad paljudesse teistesse metaboolsetesse radadesse.
    Hapniku ja erinevate lämmastikühendite hulk määrab, milline energiagenereerimise süsteem käivitub:
    Aeroobsetes tingimustes on represseeritud geenid, mis kodeerivad nitraadi reduktaasi, fumaraadi reduktaasi ja teisi reduktaase ning toimub ainult aeroobne hingamine. Hapniku puudumisel, kuid nitraadi olemasolul on aktiveeritud ainult nitraadi reduktaasi geen. Samas on teiste lämmastikühendite reduktaaside geenid inaktiivsed – toimub nitraatne hingamine.
    Aeroobsetes tingimustes moodustub püruvaadist püruvaadi dehüdrogenaasi toimel atsetüül-CoA. Anaeroobsetes tingimustes on püruvaadi dehüdrogenaasi geeni avaldumine aga pärsitud ja püruvaadist tekivad püruvaadi-formiaadi lüaasi (Pfl) toimel atsetüül-CoA ja formiaat, millest lähtuvad fermenteerimisrajad.
    Sõltuvalt hapniku kontsentratsioonist on aeroobsel hingamisel aktiivne kas hapniku suhtes madala afiinsusega tsütokroom o oksüdaas (kõrgel hapniku kontsentratsioonil) või hapniku suhtes kõrge afiinsusega tsütokroom d oksüdaas (madalamal hapniku kontsentratsioonil).
    Seda, millised süsteemid parasjagu aktiveeruvad, on kontrollitud nelja regulaatorite rühma kaudu.
    ArcA /ArcB represseerib peamiselt aeroobse hingamisega ja tsitraaditsükli tööga seotud funktsioone.
    FnR toimib peamiselt anaeroobsete radade aktivaatorina, kuid represseerib ka mõningaid geene, mis on aktiivsed bakterite aeroobsel kasvul.
    NarL/NarP/NarX/NarQ on aktiveeritavad anaeroobsetes tingimustes nitraadi ja nitriti poolt. Need regulaatorid stimuleerivad nitraadi reduktaasi geeni transkriptsiooni ning nitraadi ja nitriti metabolismiga seotud geenide transkriptsiooni; teiste terminaalsete reduktaaside geenid on inhibeeritud.
    FhlA regulon aktiveeritakse anaerobioosis ja formiaadi poolt, represseeritakse aga hapniku ja nitraadi poolt. Aeroobsetes tingimustes formiaati püruvaadist ei teki, kuna vastav ensüüm Pfl (püruvaadi-formiaadi lüaas) ei tööta. Pfl kodeeriva geeni transkriptsiooni aktiveerib Fnr.
    Järgnevalt kõigest detailsemalt.

    Aeroobse hingamise regulatsioon


    Elektrontranspordi süsteemi komponendid


    E. coli rakumembraanis töötab elektrontranspordi süsteem (ETS), kus elektronid kantakse doonorilt aktseptorile. Aeroobse hingamise puhul on terminaalseks elektronaktseptoriks molekulaarne hapnik. Elektronid kantakse üle kas NADH-lt või teistelt substraatidelt (laktaat, suktsinaat, formiaat, glütserool 3-fosfaat) dehüdrogenaaside abil. ETS koosneb mitmest komponendist:
  • heemi sisaldavad komponendid – tsütokroomid
  • Fe/S valgud
  • flavoproteiinid (sisaldavad flaviinmononukleotiidi FMN)
  • kinoonid
    E. coli elektrontranspordi ahel (ETA) näeb välja järgmine:
  • NADH-lt kantakse NADH dehüdrogenaasi abil 2 elektroni ja 2 prootonit flavoproteiinkompleksis sisalduvale FMN-le  tekib FMNH2.
  • Elektronide ülekanne Fe-S rühmale. Selle käigus vabaneb 2 prootonit H+, genereerides prootonpotentsiaali (proton motive force PMF).
  • Elektronide ülekanne Fe-S rühmalt ubikinoonile, 2 elektroni (2 e-) ja 2 prootoni (2 H+) ülekande tulemusena moodustub hüdrokinoon.
  • Kui hapniku hulk on kõrge, kantakse elektronid hüdrokinoonilt tsütokroom o kompleksile (kodeeritud geenide cyoABCDE poolt). Raku väliskeskkonda vabaneb 2 prootonit (2 H+), suurendades prootonpotentsiaali. Vähese hapniku korral antakse elektronid tsütokroom d kompleksile (kodeeritud geenide cydAB poolt), mis sisaldab hapnikule kõrge afiinsusega terminaalset oksüdaasi. Sel juhul on madala afiinsusega terminaalset oksüdaasi sisaldav tsütokroom o kompleks represseeritud ja tsütokroom d kompleks indutseeritud. Vastavate geenide transkriptsiooni reguleerib ArcB/ArcA 2-komponendiline süsteem.
    Mõlemad tsütokroomid on Fnr poolt represseeritavad. Nagu juba eelpool mainitud, reguleerib Fnr geenide ekspressioonitaset nii positiivselt kui ka negatiivselt. Fnr on võimeline transkriptsiooni reguleerima anaeroobsetes tingimustes. Anaeroobsetes tingimustes käivitub teistsugune hingamisahel, kus elektronide terminaalseks aktseptoriks on kas nitraat, nitrit, DMSO, TMAO või fumaraat. Elektronide ülekandmiseks on vaja, et aktiveeritud oleksid elektronaktseptoritele vastavad reduktaasid, mis on kodeeritud nar operonide, dms operoni ja frd operoni poolt. Nende operonide transkriptsioon on Fnr valgu poolt aktiveeritav.
    Hingamise käigus tekib raku sise- ja välispinna vahel elektrokeemiline gradient. Prootonid (H+) on rakust välja viidud. Prootonpotentsiaali PMF kasutatakse ATP genereerimiseks. Selle käigus pumbatakse prootonid rakku tagasi. Ühe ATP molekuli genereerimiseks toimetatakse 3 prootonit läbi membraani. Bakteri E. coli puhul on kirjeldatud F1F0 ATPaasi kompleks (kodeeritud atp operoni poolt), mis koosneb kahest oma struktuurilt ja funktsioonilt erinevast üksusest. F1 asub tsütoplasmas ja sünteesib ATP-d, kui prootonid on F0 baasil moodustunud pooride kaudu rakku sisenenud.
    Prootonpotentsiaali kasutatakse ka mõnede metaboliitide transportimisel rakku. Näiteks laktoosi permeaas LacY transpordib laktoosi rakku. Protsessiks vajaminev energia saadakse tänu sellele, et koos laktoosiga pumbatakse läbi membraani H+ ioone. PMF-i energial töötab näiteks viburi mootor. Ühele viburi pöördele kulub 256 H+ iooni sissetoimetamisel saadud energia.
    ATPaasi regulatsioon
    ATPaasi F1 komponent koosneb kolmest alfa ja beeta subühikust, kuhu võivad lisanduda veel gamma, delta ja epsilon . Ainult alfa ja beeta subühikutest koosnev F1 komponent hüdrolüüsib ATP-d. Selleks, et F1 komponent oleks võimeline sünteesima ATP-d, peab ta kompleksseeruma gamma, delta ja epsiloni subühikutega ning kinnituma F0 komponendi külge.
    Anaeroobsetes tingimustes, kus saavad töötada ainult käärimisrajad (juhul, kui puuduvad hapnikule alternatiivsed elektronaktseptorid), vajavad rakud elutegevuseks samuti prootonpotentsiaali energiat. Sel juhul toimub F1F0 ATPaasi manulusel ATP hüdrolüüs ning hüdrolüüsi käigus vallandunud energia abil pumbatakse prootonid rakust välja. Laborikatsetes on näidatud, et F1F0 ATPaasi-defektsed mutandid pole võimelised kasvama anaeroobses keskkonnas. Samuti ei suuda nad kasvada aeroobses keskkonnas olukorras, kus C-allikaks on ainult TCA tsükli vaheproduktid. Tsitraaditsükli vaheühenditel kasvavates rakkudes ei toimu substraadi tasemel fosforüleerimist ning ATP süntees on võimalik ainult H+ ioone pumpava F1F0 ATPaasi abil.
    F1F0 ATPaasi kompleks on kodeeritud atp operoni poolt. Kuigi kõiki geene transkribeeritakse koos ühelt promootorilt, on nende geenide poolt kodeeritud ensüümkompleksi kuuluvate subühikute arv erinev. Polütsistroonselt mRNA-lt sünteesitavate polüpeptiidide erinev hulk saavutatakse tänu sellele, et erinevate geenide ees asuvad translatsiooni initsiatsiooni signaalid on erineva efektiivsusega (erinevused Shine - Dalgarno järjestuses ja järjestustes, mis moodustavad potentsiaalseid sekundaarstruktuure, blokeerimaks ribosoomide juurdepääsu Shine-Dalgarno järjestusele).
    ArcB – ArcA–vahendatud metabolismi regulatsioon
    ArcB on sensor-kinaas ja ArcA signaalile vastav (response) regulaator. Nimetus Arc tuleneb inglise keelest (aerobic respiration control ). ArcB autofosforüleerib ennast vastusena stiimulile ja seejärel toimub ArcA fosforüleerimine. Arvatakse, et stiimuliks on mingi metaboliidi redutseeritud vorm (näiteks NADH, D-laktaat, atsetaat) soodustavad ArcB autofosforüleerimist in vitro. Kui stiimul keskkonnast kaob, toimub ArcB ja ArcA defosforüleerimine. Mõlemaid reaktsioone teostab ArcB.
    Kahe-komponendiline Arc süsteem kontrollib mitmete metaboolsete radade tööd:
  • tsitraaditsükkel
  • glüoksülaadi rada
  • terminaalne elektronide transport molekulaarsele hapnikule – aeroobne hingamine
  • rasvhapete degradatsioon
    ArcA võib käituda nii aktivaatorina kui ka repressorina. Näiteks tsütokroom d operon (cydAB) on fosforüleeritud ArcA poolt aktiveeritav, tsütokroom o operon cyoABCDE aga represseeritav. Paljud arc moduloni kuuluvad geenid on ArcA poolt represseeritavad.
    Anaeroobse hingamise regulatsioon
    Aeroobsetes tingimustes ja olukorras, kus kataboolse repressiooni mõju on nõrk, suunatakse püruvaat TCA tsüklisse. Määravaks on siin püruvaadi dehüdrogenaasi ekspressioonitase. Selle ensüümkompleksi süntees on represseeritud anaerobioosis ja kompleks ise inhibeeritav NADH poolt.
    Anaeroobsetes tingimustes metaboliseeritakse püruvaat peamiselt püruvaadi-formiaadi lüaasi toimel, mille tulemusena moodustuvad atsetüül-CoA ja formiaat. Juhul, kui puuduvad hapnikule alternatiivsed elektronaktseptorid, metaboliseeritakse need ühendid fermenteerimise käigus lõpp-produktideks. Anaeroobsel hingamisel on terminaalseteks elektronide aktseptoriteks fumaraat, dimetüülsulfoksiid (DMSO), trimetüülamiin N-oksiid (TMAO), nitrit ja nitraat. Nende ühendite koosesinemisel kasutatakse neid samaaegselt, kuid nitraat on võrreldes teistega eelistatud. Valiku tegemine anaeroobse hingamise ja käärimisradade töötamise vahel on kontrollitud globaalsete regulaatorite abil. Samuti ka see, kas domineeriv on anaeroobne nitraatne hingamine või mõni teine anaeroobne hingamisrada.
    Anaeroobse hingamise kontroll kahe-komponendiliste süsteemide abil vastusena nitraadile ja nitritile
    Enamus geene, mis on seotud anaeroobse hingamisega, vajavad aktivatsiooniks Fnr valku. Juhul, kui elektronide aktseptoriteks on nitraat või nitrit, osalevad regulatsioonis Nar (nitrate reduction) transkriptsiooni regulaatorid. Nar valgud toimivad kahes signaaliülekande rajas:
  • NarX membraanne sensor – NarL tsütoplasmaatiline regulaator
  • NarQ membraanne sensor – NarP tsütoplasmaatiline regulaator.
    Nitraat stimuleerib mõlema sensori autofosforüleerumist. Fosforüleeritud sensorvalgud toimivad kinaasidena NarL-le ja NarP-le. Nitrit seevastu stimuleerib küll NarQ-vahendatud NarP ja NarL fosforüleerimist, kuid samas põhjustab NarL fosfaadi defosforüleerimist NarX poolt. Funktsionaalsete transkriptsiooniregulaatoritena käituvad ainult fosforüleeritud NarL ja NarP. Nitraadi kasutamine on nitriti suhtes eelistatud, kuna nitraat on parem elektronaktseptor. Nitriti kontsentratsioon ei tohi tõusta üle teatava piirväärtuse, kuna nitrit on rakkudele toksiline .
    Nar valgud reguleerivad paljude operonide transkriptsiooni. Näitena on toodud neist 4:
  • fdn operon - kodeerib formiaadi dehüdrogenaas N kompleksi
  • frdABCD operon - kodeerib fumaraadi reduktaasi
  • nap-ccm operon - kodeerib periplasmaatilist nitraadi reduktaasi kompleksi
  • narGHJ operon - kodeerib põhilist nitraadi reduktaasi kompleksi.
    Fosforüleeritud NarL aktiveerib nar (nitraadi reduktaas) ja fdn (formiaadi dehüdrogenaas) transkriptsiooni ning pärsib frd (fumaraadi reduktaas) ja nap (periplasmaatiline nitraadi reduktaas) transkriptsiooni.
    Fosforüleeritud NarP aktiveerib fdn ja nap transkriptsiooni ja surub maha fosforüleeritud NarL negatiivse toime nap-le. Nitraadi reduktaasid vajavad kofaktorina molübdeeni.
    Fosforüleeritud NarL ja NarP represseerivad püruvaadi-formiaadi lüaasi operoni pfl. Kuna püruvaadi-formiaadi lüaasi reaktsioonist lähtuvad mitmed erinevad fermenteerimise rajad, on Nar valkude vahendatud repressioon nitraadi olemasolu korral väga efektiivne mehhanism, vähendamaks nitraatse hingamise korral fermenteerimise üldist taset rakus.
    Teiste elektronaktseptorite kasutamine
    Fumaraadi, DMSO ja TMAO reduktaasid avalduvad vastavalt substraatide olemasolule ja nende redokspotentsiaalidele. Substraate kasutatakse järjekorras DMSO > TMAO > fumaraat.
    Metaboolse energia genereerimisel peetakse evolutsiooniliselt kõige vanemaks käärimist. Arvatakse, et anaeroobne hingamine tekkis fumaraadi reduktaasi kasutusele võtmisega. Fumaraadi reduktaas (kodeeritud frdABCD poolt) on membraanne ensüümkompleks, mille toimel kantakse prootonid rakust välja. Operoni transkriptsioon on aktiveeritud Fnr valgu poolt ja tugevalt maha surutud nitraadi olemasolu korral (vt. eelpooltoodud Nar valkude regulatsiooniskeemi!).
    DMSO reduktaas on samuti Nar süsteemi poolt represseeritav ja stimuleeritav Fnr poolt. Ensüüm vajab kofaktorina molübdeeni. TMAO reduktaas ei allu Nar valkude poolsele repressioonile ja on Fnr-st sõltumatu. Vastav operon on indutseeritav anaeroobses keskkonnas TMAO, DMSO ja püridiin N-oksiidi olemasolul, mis kõik on selle ensüümi substraatideks. DMSO reduktaas asub periplasmas ja arvatakse, et tema funktsiooniks on pigem detoksifikatsioon kui hingamine.

    Fermenteerimise regulatsioon bakterites


    Bakteris E. coli moodustuvad fermenteerimise tulemusena (läbi vaheühendite PEP ja püruvaat) suktsinaat, D-laktaat, atsetaat, etanool , formiaat, CO2 ja H2.
    Regulatsioon globaalse regulaatori Fnr kaudu
    Fnr on tuletatud inglisekeelsest terminist “fumarate nitrate reduction”. Fnr on transkriptsiooniregulaator, mis kontrollib nii fermenteerimise kui ka anaeroobse hingamise radade ekspressiooni. Vastavad geenid ja operonid kuuluvad fnr moduloni ning on aktiveeritavad anaeroobsetes ja represseeritavad aeroobsetes tingimustes. Fnr on aminohappeliselt järjestuselt väga sarnane CRP valgule (v.a. tsüsteiini-rikas järjestus valgu N-terminuses). Samuti on sarnased mõlema valgu seondumisjärjestused. Fnr boksi moodustavad 5-bp pikkused pöördkordusjärjestused TTGAT----ATCAA, CRP boksi aga järjestused TGTGA----TCACA. Arvatakse, et Fnr on evolutsioneerunud CRP-st crp geeni duplitseerumise järel.
    Fnr tunnetab väliskeskkonna redoks -staatust. [4Fe-4S]2+ klaster võimaldab siduda kaks Fnr subühikut ja selline kompleks seondub DNA-ga. Hapniku toimel moodustuv [2Fe-2S]2+ klaster muudab Fnr-i konformatsiooni nii et see ei ole enam võimeline dimeriseeruma. Fnr-i monomeerid DNA-ga ei seondu.
    Püruvaadist lähtuvaid reaktsioone läbiviivate radade regulatsioon
    NAD+-seoseline D-laktaadi oksüdoreduktaas (kodeeritud geeni ldhA poolt) katalüüsib püruvaadi redutseerimist D-laktaadiks, kasutades elektrondoonoriks NADH-d. Ldh tase on rakus kõrge madala pH korral.
    Kõige tugevamalt on rakus kontrollitud püruvaadi-formiaadi lüaasi Pfl ekspressioon . See ensüüm viib püruvaadi atsetüül-CoA ja formiaadiks. Pfl-i kodeerival pfl operonil on 7 promootorit. Bakterite kasvamisel anaeroobsetes või aeroobsetes tingimustes on Pfl-i aktiivsuses täheldatav 15-kordne vahe. Transkriptsiooni aktivatsioonil osalevad nii aktiveeritud Fnr kui ka ArcA fosforüleeritud vorm. Operoni transkriptsioon on represseeritav nitraadi poolt (vahendatud fosforüleeritud NarL poolt). Lisaks transkriptsioonitasemele kontrollitakse Pfl-i aktiivsust ka posttranslatsiooniliselt. Anaeroobsetes tingimustes aktiveerib ensüümi aktivaas Act. Pfl-i deaktiveerib etanooli dehüdrogenaas ja seda juhul, kui dehüdrogenaasi on rakus ülehulgas.
    Atsetüül-CoA metabolismi regulatsioon
    Atsetüül-CoA viiakse käärimisel kas etanooliks või atsetaadiks. Etanooli moodustumisel osaleb alkoholi dehüdrogenaas (adhE poolt kodeeritud), mida tema füsioloogilise funktsiooni põhjal nimetatakse ka atsetüül-CoA reduktaasiks:
    Atsetüül-CoA + 2 NADH  2 etanool + 2 NAD+
    adhE geeni transkriptsioonitase tõuseb kõrge NADH/NAD+ suhte korral. Transkriptsiooni represseerib NarX/NarL süsteem. Lisaks kontrollitakse adhE geeni ekspressiooni ka translatsiooni tasemel. Selleks, et translatsioon saaks toimuda, on vaja, et RNaas III lõikaks adhE geeni mRNA sekundaarstruktuuri. Aeroobsetes tingimustes on ensüüm kiiresti lagundatav. Ensüümi eluea lühenemine aeroobsetes tingimustes aitab atsetüül-CoA suunata eelistatult TCA tsüklisse, vältides sel viisil süsiniku ja energia raiskamist etanooli produtseerimiseks, mida niikuinii rakust väljutatakse. Alkoholi dehüdrogenaas sisaldab Fe2+, mis aeroobsetes tingimustes reageerib vesinikperoksiidiga. Selle tulemusena tekib hüdroksüülradikaal, mis inaktiveerib ensüümi.
    Lisaks etanoolile toimub anaeroobsetes tingimustes atsetüül-CoA konverteerimine atsetüülfosfaadiks fosfotransatsetülaasi Pta toimel. Atsetüülkinaasi AckA toimel genereeritakse ADP-st atsetüülfosfaadilt fosforüülrühma lisamisel ATP (vt. fosfori metabolismi regulatsioon!).
    Formiaadi metabolismi regulatsioon
    Formiaat kas väljutatakse rakust või metaboliseeritakse süsinikdioksiidiks ja veeks . Formiaadi lagundamist katalüüsib formiaat-vesiniklüaasi kompleks, milles sisalduvad formiaadi dehüdrogenaas H (fdhF geen) ja hüdrogenaas 3 (hycE). Kompleks on membraaniga assotsieerunud ja koosneb paljudest komponentidest. Kompleksi katalüütilise aktiivsuse avaldumiseks on vaja molübdeeni kofaktorit, Ni ja Fe. Formiaadi dehüdrogenaas H 140-ndas positsioonis asub selenotsüsteiin (tsüsteiini S on asendatud seleeniga), mis on kodeeritud terminaatorkoodoni UGA poolt. Selenotsüsteiini lülitamine UGA vastu kasvavas polüpeptiidahelas toimub tRNASec ja terve rea translatsioonifaktorite toimel. Kui ensüümis on selenotsüsteiini asemel tsüsteiin, langeb ensüümi katalüütiline aktiivsus ligi 2 suurusjärku.
    Formiaadi metabolismil osalevat ensüümkompleksi kodeerivad geenid on rakkude anaeroobsel kasvul aktiveeritud regulaatorvalgu FhlA poolt. Transkriptsiooni aktivatsiooni signaalmolekuliks on formiaat. Formiaadi tunnetamise mehhanism pole veel selge. Tegelikult on regulatsioon veelgi komplekssem: leitud on veel lisaregulaatorgeen fhlB. Kõigi eelpoolnimetatud geenide promootorid on äratuntavad alternatiivse sigma faktori 54 poolt, mis näitab, et nende geenide avaldumine on seotud N-metabolismiga.
    Mehhanismid, mis kaitsevad rakku oksüdatiivsete kahjustuste eest
    Aeroobse hingamise puhul on terminaalseks elektroniaktseptoriks molekulaarne hapnik. Aeroobse hingamise käigus tekivad rakus reaktiivsed hapniku vormid ROS (reactive oxygen species ). ROS mitteensümaatiline kahjutustamine toimub glutatiooni toimel. O2- , OH ja H2O2 redutseerimisel glutatiooni abil tekib H2O. Glutatiooni rakusisene kontsentratsioon on kõrge (kuni 10 mM).
    ROS ensümaatiline kahjutustamine
    Põhiline reaktiivse hapniku detoksifitseerimine toimub ensümaatilisel teel. Selleks on katalaasid, peroksüdaasid ja superoksiidi dismutaasid. O2-  konverteeritakse superoksiidi dismutaasi (SOD) abil vesinikperoksiidiks, mis on vähem toksiline. Katalaasi reaktsiooni tulemusena moodustuvad H2O2-st vesi ja hapnik:
    H2O2  2 H2O + O2
    Hüdroksüülradikaali OH kõrvaldamiseks ei ole spetsiifilist ensüümsüsteemi välja kujunenud, kuna see ühend on keemiliselt nii reaktiivne , et teoreetiliselt reageeriks ta alati enne aktiivtsentrisse jõudmist muude potentsiaalsete märklaudadega. Hüdroksüülradikaalid moodustuvad siis, kui vesinikperoksiid reageerib Fe2+-ga.
    H2O2 + Fe2+  OH + Fe3+
    Fe2+ on enamasti seotud valkudega, asudes nende aktiivtsentris. Seega on OH märklauaks sageli ensüümi aktiivtsentris asuvad aminohapped ja lõpptulemuseks on ensüümi inaktiveerimine. Teatud juhtudel võib selline ensüümi inaktivatsiooni mehhanism olla regulatoorse tähtsusega. Näiteks oksüdoreduktaasid (redutseerivad fermenteerimisel NADH manulusel karbonüülrühma alkoholirühmaks) sisaldavad aktiivtsentris Fe2+. Kui rakus toimub ümberlülitus aeroobsele metabolismile, on kasulik näiteks etanooli oksüdoreduktaasi töö pärssida, et mitte raisata metaboliite rakust väljaviidava etanooli tootmiseks. Ensüümi inaktivatsiooni põhjustab vesinikperoksiidi reageerimine Fe2+-ga ja sellele järgnev hüdroksüülradikaali reaktiivsus . Neil oksüdoreduktaasidel, mida vajatakse nii aeroobsetes kui ka anaeroobsetes tingimustes, on Fe2+ asemel aktiivtsentris Zn2+, millega H2O2 ei reageeri.
    Superoksiidi dismutaasid on esindatud peaaegu kõigis aeroobsetes bakterites. Leitud on nii Fe3+ kui ka Mn3+ seoselisi ensüüme. Bakteris E. coli on olemas mõlemad SOD-id. Fe-seoseline SOD ekspresseerub nii aeroobsetes kui ka anaeroobsetes tingimustes, Mn-seoseline (SodA) on aga indutseeritud ainult rakkude aeroobse kasvu korral. Katalaasid on esindatud nii aeroobsetes kui ka fakultatiivselt anaeroobsetes bakterites. Bakteris E. coli asuvad reaktiivse hapniku kahjutustamisel osalevaid ensüüme kodeerivad geenid kahes oksüdatiivse stressi modulonis, mida kontrollivad SoxS ja OxyR.
    SoxS modulon
    soxSR geenid on vastassuunaliselt transkribeeritavad. SoxR on FeS-sisaldav valk, mis kontrollib SoxS geeni transkriptsiooni. SoxR aktiveerub vastusena signaalile, milleks on kas O2-  või NO. Seejärel aktiveerib SoxR globaalse transkriptsiooniregulaatori SoxS, mis kontrollib ligikaudu 40 geeni transkriptsiooni. Enamus neid geene kodeerivad valke, mis kaitsevad rakku oksüdatiivse stressi puhul ja peaaegu kõik neist on SoxS poolt positiivselt reguleeritavad. SoxS moduloni kuulub ka SodA – Mn-seoseline superoksiidi dismutaas, millest oli juttu eelpool. SodA-d kodeeriva operoni transkriptsioon on tegelikult väga kompleksselt reguleeritud – praeguseks on kirjeldatud vähemalt 6 regulaatorit.
    OxyR modulon
    Globaalne transkriptsiooniregulaator OxyR on otseselt aktiveeritav vesinikperoksiidi poolt (kahe tsüsteiini vahel moodustub disulfiidsild). OxyR kontrollib positiivselt vähemalt 30 geeni transkriptsiooni. Need geenid kodeerivad valke, mis osalevad raku antioksüdantsetes kaitsemehhanismides ja tagavad resistentsuse paljudele antibiootikumidele (Mar valgud – multiple antibiotic resistance). OxyR kontrolli all on näiteks HPI katalaas (katG geeni produkt). oxyS kodeerib väikest mittetransleeritavat RNA molekuli, mis on samuti OxyR poolt aktiveeritav ning vajalik raku kaitsmisel oksüdatiivse stressi poolt põhjustatud kahjustuste vastu. oxyS RNA reguleerib translatsiooni, seondudes mitmete geenide mRNA-ga (kaasaarvatud rpoS mRNA).
    Teised kaitsemehhanisme ROS vastu
    ROS toimel tekib rakkudes nii DNA kui ka valkude kahjustusi, seda nii kasvavates kui ka statsionaarse faasi rakkudes. Lisaks ROS ensümaatilisele kõrvaldamisele on rakkudel ka teisi kaitsemehhanisme.
  • DNA kahjustused on seotud peamiselt hüdroksüülradikaalide toimega, mida stimuleerib Fe2+. Dps, mis seondub statsionaarses faasis DNA-ga, kaitseb DNA-d Fe-ioonide eest. Lisaks on mitmeid DNA reparatsioonisüsteeme, mis kõrvaldavad DNA-st hapnikukahjustusi (sellest täpsemalt hiljem).
  • Stressivalgu UspA üleproduktsioon surub alla Fe rakku transportimisega seotud geenide cirA, fepA ja pbuA ekspressiooni, vähendades sel viisil hüdroksüülradikaalide tekkevõimalust.
  • Enamus superoksiidi anioone genereeritakse NADH dehüdrogenaasi ja ubikinooni saitides aeroobsel hingamisel. Paljud tsitraaditsükli ensüümid on hapniku-tundlikud ja kontrollivad tagasisidestuslikult hingamist. Kui elektronide transport toimub aeroobsel hingamisel liiga aktiivselt, suureneb ROS produktsioon ning tsitraaditsükli ensüümide aktiivsus langeb. Selle tulemusena muutub NADH (põhiline elektronide doonor hingamisahelale) limiteerivaks ning aeroobse hingamine tase langeb.
  • DnaK on molekulaarne shaperon, mis hoiab kuumashoki sigma faktorit inaktiivsena. DnaK on tundlik oksüdatiivsele karbonüülimisele. Kui DnaK on kahjustatud, see sigma faktor vabaneb ning seondub RNA polümeraasiga, indutseerides kuumashoki geenide transkriptsiooni tugevatelt promootoritelt. Kuumashoki valgud (enamus neist on molekulaarsed shaperonid) on vajalikud kahjustatud valkude aktiivsesse konformatsiooni viimisel või kõrvaldamisel.

    14. Kohanemine temperatuuri muutustega


    Ulatuslikumad kasvukeskkonna temperatuurimuutused (20C või enam) viivad enne, kui rakud muutustega adapteeruvad, rakkude kasvu aeglustumisele või peatumiseni. Suurte temperatuurilanguste ja tõusude korral lakkavad membraanid funktsioneerumast. Temperatuuritõusu korral suureneb membraanide lipiidse kihi voolavus, mille tulemusena ioonid pääsevad vabalt läbi membraani liikuma. Selle tulemusena kaob prootongradient. Termofiilidel (kasvavad edukalt 80C juures) on seetõttu välja kujunenud energiagenereerimise süsteem, mis pumpab prootonite (H+) asemel rakku Na+ ioone, kuna membraani läbilaskvus Na+ ioonide suhtes temperatuuritõusu korral märkimisväärselt ei suurene. Selleks, et membraanide läbilaskvus püsiks enam-vähem ühesugune, sünteesitakse erinevatel temperatuuridel erinevaid rasvhappeid. Madalal temperatuuril sünteesitakse lühikese ahelaga ja lahustuvaid (unsaturated) rasvhappeid, temperatuuritõusu korral aga lahustumatuid, pika ahelaga rasvhappeid. Muutused membraani lipiidses komponendis ei vaja üldjuhul uute ensüümide sünteesi, kuna vastavate ensüümide aktiivsust mõjutab temperatuur. Termofiilsetel arhedel on membraani stabiilsus kõrgel temperatuuril tagatud tänu eeter-lipiidide kasutamisele membraanis.
    Temperatuuritõus viib valkude denatureerumisele ning selle tulemusena väheneb raku metaboolne aktiivsus. Põhimõtteliselt tõuseb ensüümi aktiivsus temperatuuri tõstmisel 10C võrra ligikaudu 2-korda. Ülempiiriks on ensüümi stabiilsus. Seega kaasneb temperatuuritõusuga üle kriitilise väärtuse valkude denatureerumine , mille tulemusena raku metaboolne aktiivsus väheneb.
    Termofiilsete bakterite ensüümid on termostabiilsemad tänu mittekovalentsetele interaktsioonidele aminohapete vahel. Üldist seaduspärasust on siin raske välja tuua, kuna iga ensüümi puhul on sidemete kombinatsioon erinev. Nende valkude glütsiinisisaldus on võrreldes mesofiilse päritoluga ensüümidega väiksem (muutes nad inertsemaks), nad on tihedamalt kokku pakitud ning nende südamik on apolaarne. Hüdrofoobne südamik takistab solventide ligipääsu valgu sisemistele regioonidele, muutes valgud sel viisil denatureerumise suhtes resistentsemateks. Valkude termoresistentsust suurendavad shaperonid. Termofiilsete bakterite valgud ei ole resistentsemad mitte ainult kõrgele temperatuurile vaid ka ekstreemsele pH-le, rõhule, sooladele, orgaanilistele solventidele ja detergentidele.
    Termofiilide puhul tekib ka see küsimus, kuidas on stabiliseeritud nende DNA. Üheks kaitsemehhanismiks on DNA positiivse superspiralisatsiooni suurendamine pöördgüraasi abil ( unikaalne topoisomeraas, mis on olemas ainult termofiilidel). Lisaks on DNA kaetud histoonilaadsete ja teiste DNA-ga seonduvate valkudega. Mitmete hüpertermofiilide puhul on leitud, et nende rakkudes on kõrge (>1mM) K-ioonide kontsentratsioon, mis peaks DNA-d kaitsma kõrgel temperatuuril toimuva depurineerimise vastu.
    Võrreldes DNA-ga on RNA denaturatsioonile ja termodegradatsioonile tundlikum , kuna:
  • ta on üksikahelaline;
  • riboosi 2´ OH-rühm on kõrge reaktiivsusega fosfodiestersidemele.
    Kuumashoki valgud
    Kuumashoki valgud HSP-d (heat shock proteins) ekspresseeruvad basaalsel tasemel ka normaalsel temperatuuril. Nagu juba eespool mainitud, on enamus HSP-sid molekulaarsed shaperonid ja ATP-sõltuvad proteaasid (Lon, ClpAP), mis osalevad valkude voltimisel, assambleerimisel, transpordil, reparatsioonil ja degradatsioonil. Järgnevalt käsitlen põhjalikumalt molekulaarseid shaperone.
    Molekulaarsed shaperonid jaotatakse kahte perekonda – Hsp70 ja Hsp60, seda nende sarnasuse alusel eukarüootsetele HSP-dele.
    Hsp70 perekond - siia kuulub DnaK, mis toimib koos GrpE ja DnaJ-ga ning on eeskätt stabiliseeriva funktsiooniga.
    Hsp60 perekond - siia kuulub GroEL kompleks, mis on tõeline shaperon, organiseerides valkude voltimist aktiivsesse konformatsiooni.
    DnaK takistab sünteesitud valkude agregeerumist ja valesti voltimist. Kui valku sünteesitakse, võivad polüpeptiidahela hüdrofoobsed piirkonnad omavahel assotsieeruda. DnaK tunneb ära 7-8 aminohappe pikkuseid hüdrofoobseid regioone, seondub sinna, takistades valede interaktsioonide toimumist. DnaK osaleb ka SecB-sõltumatul valkude transportimisel läbi tsütoplasmaatilise membraani. Tavaliselt on valgud transportimisel väljavenitatud kujuga, nii et hüdrofoobsed piirkonnad, mis muidu asuvad valgu südamikus, jäävad pinnale. Hsp70 valgud seonduvad hüdrofoobsete järjestustega ja takistavad sel viisil valkude agregeerumist.
    Hsp70 perekonna valkude N-terminus on konserveerunud - seob ATP-d ja teostab ATP hüdrolüüsi. Voltimata või denatureerunud valkudega interakteerub esmalt DnaJ; seejärel seondub kompleksiga DnaK (C-terminuse abil) ja moodustub kolmikkompleks ATP juuresolekul. Järgneb ATP hüdrolüüs. Just ADP-DnaK kompleksil on kõrge afiinsus struktureerimata valkude osas. GrpE stimuleerib ADP dissotseerumise kompleksist ja soodustab ATP seondumist DnaK-ga. ATP-DnaK kompleks on valgu suhtes madala afiinsusega ja vabastab valgu, andes selle üle GroEL ja GroES kompleksile. Järgneb valgu korrektne voltimine .
    Kuumashoki (“heat-shock”) HS vastus bakteris E. coli
    E. coli rakkudes on kuumashoki vastus kontrollitud 2 alternatiivse sigma faktori - 32 ja E poolt. 32 poolt kontrollitavad geenid aktiveeruvad temperatuuri tõstmisel 37C-lt 42C-ni. Lisaks temperatuuritõusule võivad signaaliks olla ka pH ja osmootse rõhu muutused, UV kiirgus, etanool, antibiootikumid, raskemetallid, DNA-d kahjustavad ained ja komplekssed metaboolsed protsessid (nälgimine, oksüdatiivne stress ning viirusinfektsioon).
    Temperatuuritõusul 30C  42C suureneb HSP-de süntees 5 -10 min vältel ligikaudu 10 korda, hõlmates ligikaudu 20% kogu valgusünteesist. Järgneb 20-30 minutiline adapteerumise periood, kus HSP-de sünteesitase ületab HS-i eelse taseme 2-3 korda. Juhul, kui temperatuur tõuseb üle 50C , toimub transkriptsioon ainult 32 ja E –sõltuvatelt promootoritelt. 70-tüüpi promootoritelt on transkriptsiooni initsiatsioon pärsitud 70 inaktivatsiooni tõttu. Sel juhul sünteesitakse rakus ainult HSP-sid seni, kuni translatsiooniaparaat veel töötab.

    Transkriptsioon “heat shock” promootoritelt


    HS geenide transkriptsiooni aktivatsiooniks on vaja alternatiivset  faktorit 32. 32 poolt kontrollitavad promootorid erinevad järjestuselt 70-tüüpi promootoritest. 32 poolt äratuntava promootori konsensusjärjestus on järgmine:
    -35 -10
    A-T-rikas ala-TCTCNCCCTTGAA- N13-14-CCCCATNTA
    32 geeni rpoH mRNA toimib termosensorina
    32 rakusisene hulk on reguleeritud peamiselt transkriptsioonijärgselt. Regulatsioon toimub nii translatsiooni efektiivsuse, mRNA stabiilsuse kui ka valgu stabiilsuse kaudu. 32 geeni rpoH mRNA 5’ otsas on järjestus, mille baasil moodustub sekundaarstruktuur, mis blokeerib osaliselt translatsiooni initsiatsiooni regiooni. Selle sekundaarstruktuuri püsivus rakus sõltub temperatuurist. Kõrgemal temperatuuril sekundaarstruktuur laguneb, muutes mRNA on ribosoomidele kättesaadavaks. Seega toimib rpoH mRNA termosensor. 32 geenil rpoH on mitu promootorit. Promootorid P1, P4 ja P5 on transkribeeritavad normaalsel temperatuuril, P3 HS vastusena (E kontrolli all) ja P5 on reguleeritud cAMP poolt. Promootorite P4 ja P3 ees on DnaA boxid.
    32 konkurents 70-ga
    32 konkureerib 70-ga. Kuna 32 ja 70 on RNA polümeraasi suhtes ühesuguse afiinsusega, toimub regulatsioon  faktorite aktiivsuse kaudu. 70 on RNA polümeraasi subühikutest temperatuurile kõige tundlikum. Temperatuuritõusu tagajärjel on 70 inaktiivne, agregeerunud vormis. Nii saab RNA polümeraasi apoensüüm siduda teist  faktorit. DnaJ, DnaK ja GrpE moodustavad 32-ga stabiilse kompleksi, eksponeerides teda proteaasidele (membraanseoseline ATP-sõltuv proteaas FtsH e. HflB ning tsütoplasmaatilised ClpAP, SslVU ja Lon). HS tagajärjel on shaperonid hõivatud denatureerunud valkude kõrvaldamisega rakust. Selle tagajärjel vabaneb 32 shaperonidest ning seondub RNA polümeraasi apoensüümiga, olles seal paremini kaitstud ka proteaaside eest. 32 toimub suureneb drastiliselt HS geenide transkriptsioonitase, mis võimaldab kiiresti sünteesida HS valke, k.a. shaperone. Shaperonide toimel 70 reaktiveeritakse ning ta on jällegi võimeline seonduma konkureerivalt RNA polümeraasi apoensüümiga. 70 kogus raku kohta on võrreldes 32 hulgaga märksa kõrgem. Nii  faktorite kontsentratsioonide erinevus kui ka shaperonide ülehulk rakus viivad 32 konkurentsist välja.
    32 –defektsed E. coli mutandid kasvavad ainult temperatuuril 20C või madalamal. Seda võimaldab 32-sõltumatute nõrkade promootorite olemasolu shaperone kodeerivate geenide ees.
    Transkriptsiooni regulatsioon ekstreemse kuumashoki korral
    E regulon, mis kodeerib näiteks periplasmaatilist proteaasi DegP ja polüpeptiidahelaid voltivat ensüümi FkpA, indutseerub vastusena ekstratsütoplasmaatilisele stressile (denatureerunud välismembraani või periplasma valgud), kuid temperatuuritõusul üle 50C osaleb ta ka 32 kodeeriva geeni rpoH transkriptsioonitaseme tõstmisel. E aktiivsus on kontrollitud 2 negatiivse regulaatori, RseA ja RseB poolt. RsaA on transmembraanne valk, mille üks osa ulatub tsütoplasmasse ja toimib anti-sigma faktorina, inaktiveerides E. RseB paikneb periplasmas ning seondub RseA-ga, moduleerides RseA aktiivsust. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes sünteesitakse küll E-d, kuid RseA inaktiveerib selle. Kui periplasmasse koguneb valesti volditud või denatureerunud valke, seondub RseB mujale, vabastades RseA. Nii kaotab RseA oma aktiivsuse anti-sigma faktorina ja E aktiveerub.
    Kuumashoki vastus teistes bakterites
    Sigma faktori 32 homolooge on leitud paljudest bakteritest, kuid osades bakterites erineb HS geenide regulatsioon oluliselt eelpool-kirjeldatust. Bakteris E. coli alluvad HS geenid positiivsele kontrollile – alternatiivsed sigma faktorid aktiveerivad transkriptsiooni. Osades organismides on HS geenid aga hoopis negatiivselt reguleeritud. Sel juhul tunneb HS geenide promootori ära põhiline sigma faktor, kuid transkriptsioon on pärsitud repressori poolt. Kui temperatuur tõuseb, dissotseerub repressor DNA-lt, võimaldades transkriptsiooni initsiatsiooni.
    Näiteks perekonda Chlostridium, Bacillus, Mycoplasma ja Alcaligenes kuuluvates bakterites on kirjeldatud negatiivne regulaator HrcA, mis seondub shaperone kodeerivate geenide promootori läheduses asuvale DNA pöördkodusjärjestusele CIRCE (controlling inverted repeat of shaperone expression), takistades RNA polümeraasi ligipääsu promootorile. HrcA repressori aktiivse konformatsiooni tagab GroEL shaperon. Normaalsel temperatuuril on GroEL-i piisavalt säilitamaks HrcA transkriptsiooni represseerivad omadused. Temperatuuri tõusu korral on GroEL aga seotud eeskätt suure hulga denatureerunud valkude uuest voltimisega ning selle käigus kaotab enamus HrcA-st oma aktiivse konformatsiooni.
    Temperatuuritundlik geeniregulatsioon
    Lisaks klassikalisele HS-vastusele on väliskeskkonna temperatuuri muutuste kaudu mõjutatud ka paljude teiste geenide ekspressioon. Nii võib olla temperatuurist mõjutatud teatavate virulentsusfunktsioonide (peremeesorganismi invasioon ja/või kolonisatsioon) avaldumine. Näiteid:
  • Yersinia pestis’e virulentsusgeenide mRNA 5´otsas asuv ribosoomiga seondumiseks vajalik Shine-Dalgarno ala on blokeeritud sekundaarstruktuuri tõttu, mis sulab lahti alles kõrgemal temperatuuril;
  • Vibrio cholerae ToxR/ ToxS süsteemi ( koolera toksiin) ja Tcp fimbriate (vajalikud koloniseerimisel) ekspressioon on temperatuuril 30C kõrgem võrreldes ekspressiooniga temperatuuril 37C.

    Külmashoki (“cold-shock”) vastus


    Külmashoki (CS) puhul väheneb rakumembraanide läbilaskvus. Sellest ülesaamiseks asendatakse membraanis olevad lahustumatud rasvhapped lahustuvatega. E. coli’l kulub temperatuurilangusel 10C-ni ümberkohastumiseks 4 tundi, seejärel jätkub rakkude aeglane kasv generatsiooniajaga 24 tundi. DNA ja RNA sekundaarstruktuuride stabiliseerumise tõttu langeb rakkudes DNA replikatsiooni, transkriptsiooni ja translatsiooni tase.
    CS vastuse indutseerivad ka valgusünteesi inhibiitorid kloroamfenikool ja tetratsükliin, mis näitab, et peamiseks CS sensoriks rakkudes on ribosoomide füsioloogiline seisund. CS vastuse funktsiooniks on ületada translatsiooni initsiatsiooni blokk .
    Rakkude külmaga adapteerumiseks sünteesitakse mitmeid valke. Neist osade valkude ekspressioon on 37C juures praktiliselt tuvastamatu või äärmiselt madal. Neid valke liigitatakse klass I CS valkudeks. Klass II CS valgud on need, mis ekspresseeruvad olulisel määral ka 37C juures ning temperatuurilanguse korral indutseeritakse neid vähem kui 10 korda.
  • Klassi I kuuluvad valgud – CspA, CspB, CspG, CsdA, RbfA, NusA ja PNPaas. CspA, CspB ja CspG on RNA/DNA shaperonid, CsdA on ribosoomiga assotsieerunud valk, millel on RNA sekundaarstruktuure lahtikeerav aktiivsus. RbfA on ribosoomiga seonduv valk. NusA osaleb transkriptsiooni terminatsioonil ja antiterminatsioonil. PNPaas on ribonukleaas.
  • Klassi II kuuluvad valgud – RecA, translatsiooni initsiatsioonifaktor IF-2, H-NS, DNA güraas GyrA.
    CS-spetsiifilisi  faktoreid pole leitud. CS vastusega kaasnevad regulatoorsed muutused toimuvad transkriptsiooni aktivatsiooni järgselt. CS valkude induktsioonitase sõltub temperatuurilanguse ulatusest. Hiljuti leiti veel valk TF (trigger factor), mille madalal tasemel süntees indutseeritakse vastusena külma-shokile pärast 2 – 3- tunnist lag perioodi. TF katalüüsib peptiidsidemete cis/trans isomerisatsiooni, mis aitab valke säilitada ja repareerida madalal temperatuuril. Külmakahjustustega valke volditakse uuesti. TF soodustab GroEL-ga assotsieerudes GroEL shaperoni funktioone.
    Põhiline CS valk E. coli’s on CspA. CspA funktsioon on komplementeeritav tema homoloogide CspB ja CspG poolt. 10C juures moodustab CspA 13% kogu raku valgust. csp geenidel on 5’ otsas konserveerunud 159 bp-pikkune mittetransleeritav järjestus UTR. See regioon sisaldab unikaalset 11 bp pikkust “külmaboksi” (CB, cold box), mis on kõrgelt konserveerunud kõigil CS geenidel. Normaalsel temperatuuril transkriptsioon CB järjestusel peatub, kuid temperatuurilangusel liigub RNA polümeraas sellelt järjestuselt edasi. Mis mehhanismi abil, on seni veel selgusetu. csp geenide UTR järjestus mõjutab ka mRNA eluiga. 37C juures kasvanud rakkudes on 5’-UTR järjestusega mRNA väga ebastabiilne (poolestusaeg 12 sekundit), kuna ta on atakeeritav RNaas E poolt. 10C juures on sellel järjestusel aga mRNA-d stabiliseeriv funktsioon. Stabiliseeriv efekt on ajutine ja kaob, kui rakud on külmaga adapteerunud.
    CS valkude ekspressiooni regulatsioon toimub ka translatsiooni tasemel. cspA, cspB, cspG, csdA ja rbfA mRNA-del asub 14 nukleotiidi translatsiooni initsiaatorkoodonist allpool DB-järjestus (downstream box), mis on komplementaarne 16S rRNA regiooniga. Temperatuuri langemisel alla 15C on translatsiooni initsiatsioon häiritud. DB järjestuse paardumine 16S rRNA järjestusega võimaldab translatsiooni preinitsiatsioonikompleksi moodustumist madalal temperatuuril. Pärast aklimatiseerumise perioodi on ribosoomid võimelised transleerima ka teisi mRNA-sid. Selleks ajaks on rakus sünteesitud piisaval hulgal CS-spetsiifilisi ribosoomi faktoreid RbfA (30S ribosoomi subühikuga assotsieerunud valk) ja CsdA (DEAD-box perekonna helikaas).
    CspA aktiveerib transkriptsiooni H-NS-i ja güraas-i geenide promootoritelt, seondudes järjestusele ATTGG. Samuti interakteerub CspA RNA-ga ning harutab lahti mRNA-de sekundaarstruktuure, muutes nende transleeritavust. Seetõttu nimetatakse CspA-d ka RNA shaperoniks.
    E. coli’s kirjeldatud CspA homolooge on leitud paljudes teistes bakteriliikides, kaasa arvatud termofiilid.
    Psührofiilsed bakterid
    Psührotolerantsetel bakteritel on metaboolne aktiivsus maksimaalne temperatuurivahemikus 20 - 30C. Psührofiilsed bakterid kasvavad maksimaalse kiirusega 15C ja madalamal temperatuuril. See tekitab probleeme toidu säilitamisega külmkapis.
    Psührofiilsetel bakteritel on CspA-laadsete valkude tase rakus pidevalt kõrge. Just see on üks põhjusi, miks need bakterid paljunevad pidevalt ka madalamal temperatuuril, kuna tänu CspA ekspressioonile valgusünteesi ei represseerita.
    Temperatuuri langemisel alla 0C hakkab tekkima jää, mis on bakterirakkudele eluohtlik. Jääkristallid kahjustavad valke ja rakumembraane. Selleks, et hoida ära jääkristallide teke, suureneb rakkudes glütserooli, suhkrute ja dimetüülsulfoksiidi hulk.
    Mõnede madalal temperatuuril elavate bakteriliikide puhul on välja kujunenud spetsiifilised kaitsemehhanismid. Nad sünteesivad välismembraani valke, mis soodustavad enda ümber jää teket (ice-nucleation proteins). Valk INA (ice nucleation activity) on 1200 aminohappe pikkune polüpeptiid, mis sisaldab 122 kordust oktapeptiidi Ala-Gly-Tyr-Gly-Ser-Thr-Leu-Thr. Selline valk seob vett korrapäraselt ning kindla lokalisatsiooniga jäästruktuurid kahjustavad rakke vähem. Samas indutseerivad INA valku produtseerivad bakterid, näiteks taimede pinnal elavad Pseudomonas syringae, P. fluorescens, Erwinia herbicola ja Xanthomonas campestris taimedel külmakahjustusi juba temperatuuril -2C, kusjuures bakterivabadel taimedel tekivad külmakahjustused madalamal temperatuuril (-6C). Kui vesi külmub taimede pinnal, taimerakud surevad ja on toiduks bakteritele.

    15. Osmootne stress ja pH muutused


    Vee olemasolu on üks olulisi keskkonna parameetreid, mis mõjutab mikroorganismide kasvu ja ellujäämist. Bakteritel puuduvad aktiivsed vee transportsüsteemid – vesi liigub läbi rakumembraani osmoosi teel. Selle tulemusena raku ruumala suureneb ning rakumembraan surutakse vastu peptidoglükaankesta. Raku siserõhk ( turgor ) peab püsima kogu rakutsükli vältel, kui rakk kasvab pikkusesse.
    Osmolüüdid
    Kui raku väliskeskkonna osmootne rõhk tõuseb, peab turgori säilimiseks tõusma ka tsütoplasma osmootne rõhk. Kui osmootne rõhk rakus suureneks ainult soolade kontsentratsiooni tõusu arvel, inhibeeriks see ensüümid. Selleks, et ensüümid ei inaktiveeruks, kuid turgor rakus siiski püsiks, sünteesitakse rakkudes osmolüüte - betaiini, ektoiini, trehhaloosi, glütserooli, sahharoosi, proliini ja väikeseid peptiide. Need ühendid on lahustuvad kõrgel kontsentratsioonil, keemiliselt neutraalsed, ei mõjuta ensüümide aktiivsust vaid pigem stabiliseerivad ensüüme denatureerivate soolade suhtes ning tagavad rakus kõrge osmootse rõhu. Osmolüüte on rakkudel võimalik hankida ka kasvukeskkonnast. Kui osmolüütide kontsentratsioon rakus on kõrgem kui väliskeskkonnas, võimaldab see vee liikumist rakku. Selleks, et rakud ei lõhkeks hüpotoonilises keskkonnas ega dehüdreeruks hüpertoonilises keskkonnas (et säiliks turgor ning oleks vajalikul hulgal vett tsütoplasmas) on bakteritel kaitsemehhanismid, mis tagavad rakus optimaalse osmootse rõhu osmolüütide akumuleerumise või rakust väljaviimise teel.
    Osmolüüdid kaitsevad rakke lisaks dehüdreerimisele ka muude stresside eest. Näiteks suureneb glütsiin-betaiini akumuleerumise tulemusena bakterite külmatolerantsus. Osmolüüdid stabiliseerivad valke ja soodustavad valkude voltimist aktiivsesse konformatsiooni. Seetõttu on nad rakendatavad biotehnoloogias kui ensüümide stabilisaatorid, vähendamaks kuumutamise, külmutamise ja kuivatamisprotsesside kahjulikku mõju.
    Graam-positiivsetel bakteritel on võrreldes graam-negatiivsete bakteritega märksa kõrgem siserõhk – 20 atm. Graam-negatiivsetel on see 5-6 atm. Graam-positiivsetel bakteritel on kõrgem siserõhk, et avaldada vajalikku survet paljudest peptidoglükaankihtidest koosnevale rakukestale. Selleks, et ensüümid graam-positiivsetes bakterirakkudes aktiivsed püsiksid, on seal osmootset rõhku tõstvate sobivate komponentide kontsentratsioon kõrge isegi suhteliselt madala välise osmootse rõhu korral.
    Erinevate organismide tolerantsus kõrgele osmootsele rõhule on tagatud erinevate mehhanismide kaudu. Ensüümid, mis lokaliseeruvad periplasmas ja on eksponeeritud raku välispinnale, on soola suhtes tolerantsematel bakteritel teistsuguse struktuuriga, kui vähem osmotolerantsetel bakteritel. Halobakterid kasvavad näiteks optimaalselt 3 M NaCl lahuses ning rakkudes on kõrge KCl kontsentratsioon (4 M). Halobakterite valkudes on suur osakaal happelistel aminohapetel ja hüdrofoobseid aminohappeid on minimaalselt. Sellised valgud seovad vett 2-4 korda efektiivsemalt kui valgud, mis on iseloomulikud madala osmolaarsusega keskkonnas kohanenud bakteritele.

    Osmootse rõhu muutustega kaasnev geeniregulatsioon enterobakterites


    Osmootse stressiga kaasnevad ulatuslikud muutused raku üldises metabolismis. Rakkude kasv on ajutiselt inhibeeritud. Toimuvad muutused DNA topoloogias ning aktiveerub statsionaarse faasi-spetsiifiline sigma faktor S. Rakkudesse koguneb ppGpp. Metaboolsete radade ümberlülituste käigus koguneb rakkudesse toksilisi produkte, mis indutseerivad kaitsemehhanismide käivitumist (DNA reparatsioon, peroksiidi kõrvaldamine).
    Kui E. coli kasvukeskkonna osmolaarsus tõuseb, liigub vesi aquaporiinide kaudu rakust välja ning turgor langeb. Selle tulemusena aktiveeritakse TrkAEH kaaliumi rakkutoomise süsteem. Süsteem töötab seni, kuni turgor on taastatud. Kui sellest ei piisa ning turgori vähenemisest põhjustatud stress kestab, aktiveeritakse Kdp transportsüsteem, mis on K suhtes kõrge afiinsusega. K-limitatsiooni korral on kdp geenid pidevalt ativeeritud.
    Samaaegselt sünteesitakse (või transporditakse väliskeskkonnast) proportsionaalses hulgas rakku toodava K hulgaga glutamaati. Väliskeskkonna kõrge osmootse rõhu korral võib sel viisil K-glutamaadi tase tõusta ajutiselt kuni 0,7-0,8 M kontsentratsioonini, mis pärsib ensüümide aktiivsuse. Seetõttu lülitatakse kiiresti tööle süsteemid, mis võimaldavad betaiini, proliini ja trehhaloosi akumuleerumist rakkudesse. Aktiveeruvad nii vastavate ühendite sünteesirajad kui ka rakku transportimise süsteemid. Samal ajal väheneb proportsionaalselt K ja K-glutamaadi rakusisene kontsentratsioon.
    Osmolüütide sünteesi regulatsioon
    Trehhaloosi produktsioon
    Trehhaloosi süntees lähtub UDP glükoosist. Sünteesi viivad läbi kaks ensüümi, mis on kodeeritud otsAB operoni poolt. Geenide transkriptsioonitase on maksimaalne väliskeskkonna kõrge osmolaarsuse korral. Samuti võimendub otsAB geenide transkriptsioon statsionaarse faasi rakkudes, olles positiivselt mõjutatud statsionaarse faasi sigma faktori RpoS poolt. Samas on statsionaarse faasi rakkudes trehhaloosi kontsentratsioon siiski 7 korda madalam kui osmootse stressi korral. Seega ei taandu statsionaarse faasi rakkude osmotolerantsus üksnes trehhaloosi akumuleerumisele statsionaarses faasis. Kasvukeskkonna madalama osmolaarsuse korral võib trehhaloos olla ka energiaallikaks. Sel juhul transporditakse rakuväline trehhaloos rakku trehhaloosi-spetsiifilise PTS-i abil. Tsütoplasmas degradeeritakse trehhaloos-6-fosfaat trehhaloosi 6-fosfaadi hüdrolaasi toimel glükoosiks ja glükoos 6-fosfaadiks.
    Väliskeskkonna kõrge osmolaarsuse korral hüdrolüüsitakse trehhaloos periplasmaatilise trehhalaasi TreA toimel glükoosiks ning glükoos tuuakse rakku PTS-i abil. Periplasmas asuv TreA võimaldab säästa ja uuesti kasutusele võtta läbi rakumembraani välja viidud trehhaloosi. TreA geeni transkriptsioon aktiveeritakse rakkude hüperosmootsetel kasvutingimustel.
    Glütsiin-betaiini produktsioon
    Osa mikroorganisme sünteesivad glütsiin-betaiini glütsiini metüleerimise teel, kasutades S-adenosüül metioniini metüülrühma doonorina. Enimkasutatav on aga teine rada – koliini ensümaatiline oksüdeerimine. Kuna bakterid ise koliini ei sünteesi, hangivad nad seda väliskeskkonnast. Koliini allikaks on näiteks kõdunevad taimed ja loomsed koed . Bakteril E. coli on leitud transporter BetT, mis kasutab koliini transportimiseks prootonpotentsiaali. Bacillus’el on selleks aga kõrge afiinsusega multikomponentne ABC transporter.
    Rakku transporditud koliin metaboliseeritakse koliini dehüdrogenaasi BetT toimel glütsiin-betaiin aldehüüdiks ja seal edasi BetA ning BetB dehüdrogenaaside abil glütsiin-betaiiniks. Vastavaid ensüüme kodeerivad geenid avalduvad ainult siis, kui bakterite väliskeskkonnas on koliini. Koliini oksüdeerimine toimub ainult aeroobsetes tingimustes. Anaeroobses keskkonnas represseerib ArcA betT ja betBA geenide promootoritelt lähtuva transkriptsiooni. Nende geenide transkriptsiooni stimuleerib ka osmootne stress.
    Proliini produktsioon
    Nii proliini rakku transportimine kui ka süntees on stimuleeritud osmootse stressi korral. Lisaks toimub proliini toimel proliini sünteesiraja esimese ensüümi tagasisidestuslik inhibitsioon.
    Transpordi regulatsioon rakusisese turgori säilitamiseks
    Graam-negatiivsetel bakteritel toimub osmoprotektantide transport rakku 2-etapiliselt. Esimene etapp on seotud nende sisenemisega läbi välismembraani, kasutades aquaporiinide OmpC ja OmpF kanaleid, mille kaudu liiguvad rakku lisaks veele ka paljud teised madalmolekulaarsed ühendid.
    Raku väliskeskkonna osmootse rõhu muutustega kaasnevad muutused OmpC ja OmpF ekspressioonitasemes. Väliskeskkonna madala osmolaarsuse korral on ülekaalus OmpF poorid, kõrge osmolaarsuse korral aga OmpC poorid. OmpC baasil moodustunud kanal on väiksem kui OmpF kanal. Looduslikes tingimustes, kus keskkonna temperatuur ja osmolaarsus on madalamad (jõed, järved), on eelistatud suuremad, OmpF kanalid. Ühe poriini eelistamine teisele ei muuda rakusisest osmootset rõhku. Arvatakse, et poori suurus võib mõjutada toitainete ja muude komponentide difusiooni väliskeskkonnast läbi membraani. Seega – suuremad poorid lasevad läbi välismembraani sisse rohkem toitaineid. OmpC kanalitel on eelised soolestikus elavatel bakteritel, sest väiksema kanali tõttu pääseb läbi välismembraani sisse vähem toksilisi ühendeid.
    OmpC ja ompF poriinide ekspressioonitaset kontrollib kahekomponendiline süsteem EnvZ-OmpR. EnvZ on transmembraanne sensorvalk, mis kõrge osmolaarsuse korral autofosforüleerub. EnvZ-P stimuleerib OmpR fosforüleerimist.OmpR on ompC ja ompF geenide transkriptsiooni regulaator. Geenid paiknevad kromosoomi erinevates piirkondades. OmpR-P madala kontsentratsiooni korral (keskkonna madal osmolaarsus) on aktiveeritud ainult ompF transkriptsioon, kuna sel juhul toimub regulaatori seondumine ainult kõrge afiinsusega saitidele. Kui OmpR-P kontsentratsioon suureneb, jätkub teda ka seondumaks madala afiinsusega saitidele. Selle tulemusena aktiveeritakse ompC geeni transkriptsioon ning pärsitakse ompF geeni transkriptsiooni.
    Madala osmolaarsuse korral avaldub EnvZ-il fosfataasne aktiivsus, mille tulemusena defosforüleeritakse nii EnvZ kui ka OmpR. OmpF-i ekspressioonitaset kontrollitakse ka antisens-RNA kaudu. ompF-i mRNA translatsiooni inhibeerib antisens-RNA micF, mida transkribeeritakse ompC geenist vastupidises suunas ja mis on komplementaarne ompF mRNA 5’ otsaga. micF transkriptsioon on aktiveeritud kõrge osmolaarsuse korral.
    Üldjuhul on osmoprotektantide kontsentratsioon väliskeskkonnas madal (nM – μM kontsentratsioonid). Molaarse kontsentratsiooni saavutamiseks on vaja kõrge afiinsusega transportereid. Sellised transporterid peavad olema võimelised töötama tingimustes, mis tavalised transporterid inaktiveerib (kõrge osmolaarsus ja ioonide kontsentratsioon).
    ProU ja ProP transporterid avastati kui proliini transporterid, mis töötavad hüperosmootsetes tingimustes. Hiljem selgus, et nad on laiema substraadi-spetsiifilisusega – nad toovad rakku ka glütsiin-betaiini. ProP on H+ sümporter; mida kodeeriva geeni üks promootoritest on RpoS-sõltuv. ProU on multikomponentne ABC transporter, ning selle transporteri geenide ekspressioonitase tõuseb osmootse stressi korral ligikaudu 100 korda. ProU geenide transkriptsiooni reguleerivad nii DNA-ga seonduvad valgud H-NS, HU, IHF kui ka rakusisene K-glutamaadi akumuleerumine ja muutused DNA superspiralisatsioonis.
    Sel juhul, kui osmoprotektantide rakuväline kontsentratsioon on kõrge, on eelistatud nende rakku transportimine. Osmoprotektantide sünteesirajad on samal ajal pärsitud.
    Kui rakusisene osmootne rõhk tõuseb väliskeskkonnaga võrreldes liiga kõrgele (see võib juhtuda väliskeskkonna osmootse rõhu languse korral - looduslikus keskkonnas näiteks puhta vee juurdevool, vihm), siis selleks, et rakud ei lõhkeks vee sissetungimise tõttu, väljutatakse rakust kiiresti orgaanilisi osmoprotektante ja K ioone, vähendamaks vee juurdevoolu. Töötavad spetsiifilised surve poolt aktiveeritavad kanalid, mis on laia spetsiifikaga, võimaldades rakust välja viia betaiini, proliini ja K+ ioone.

    Kohanemine pH muutustega


    Vastavalt kasvukeskkonna pH-le klassifitseeritakse baktereid atsidofiilideks (optimaalne pH i) neutraalse ning säilitavad ekskreteeritud ja rakupinnale eksponeeritud valkude aktiivsuse.

    Tsütoplasmaatilise pH (pHi) regulatsioon


    Võimet hoida tsütoplasmaatilist pH-d (pHi) konstantsena sõltumata väliskeskkonna pH (pH0) kõikumisest nimetatakse pH homöostaasiks. E. coli kasvab maksimaalse kiirusega väliskeskkonna pH 6,0-8,0 piires, väljaspool seda vahemikku rakkude kasv aeglustub. Väliskeskkonna pH 5,0-9,0 juures püsib raku sisemine pH 7,4-7,8 vahel, muutudes seega vähem kui 0,1 ühikut väliskeskkonna pH ühe ühiku võrra muutuse kohta. Kui väliskeskkonna pH muutused on ulatuslikumad, põhjustab see tsütoplasma pH-s suuremaid muutusi. Tsütoplasma pH väärtuse langemine alla 5,0 on E. coli rakkudele letaalne. Seetõttu lülituvad äärmuslikes tingimustes tööle spetsiifilised kaitsemehhanismid. Rakusisene pH homöostaas saavutatakse passiivsete ja aktiivsete mehhanismide toimimise kooskõlana.
    Passiivne homöostaas
    Väliskeskkonna pH muutustest põhjustatud pHi kõikumisi takistab prootonite ja teiste ioonide vilets membraaniläbimise võime. Lisaks on rakkudel on loomulik puhverdamisvõime, mis on tagatud nukleiinhapete, tsütoplasmaatiliste valkude ning tsütoplasmas sisalduva glutamaadi ja polüamiinide poolt. Madalate pH väärtuste juures on kõige paremaks puhverdajaks glutamaat.
    Aktiivne homöostaas
    Aktiivne homöostaas saavutatakse ioonide – prootonite, kaaliumi- ja naatriumiioonide ringlemisega. Na+ ioonide translokatsioon on oluline komponent homöostaasi säilitamisel alkalofiilidel (Na+/H+ antiport süsteem soodustab aluselises keskkonnas prootonite rakku sisenemist). Prootonite translokatsioon läbi membraani genereerib membraanpotentsiaali, mis seab prootonite edasisele liikmisele läbi membraani piirangud. Membraanpotentsiaali genereerimiseks piisab juba vähese arvu prootonite translokatsioonist läbi membraani. Prootonite rakust väljaviimine jätkub siis, kui nad vahepeal uuesti energiat muundavate valk-komplekside (näiteks ATP süntaaside ja transportvalkude) abil rakku sisenevad. Ulatuslikum prootonite liikumine läbi membraani toimub juhul, kui membraanpotentsiaal on ajutiselt katioonide (näiteks K+ ioonide) rakku sisenemise tulemusena muutunud.
    pH muutustest põhjustatud geenide transkriptsiooni aktivatsioon
    Muutused tsütoplasma pH-s indutseerivad teatud geenide avaldumise. Need geenid on seotud madalast pH-st põhjustatud metaboolsete defektide korrigeerimisega ja kaitsefunktsioonidega, mis võimaldavad rakkudel madala pH tingimustes ellu jääda. Madala pH korral derepresseeritakse näiteks aminohapete dekarboksülaasid. Tänu nendele ensüümidele tekivad rakkudes ühendid, mille rakust väljaviimine aitab keskkonda neutraliseerida. Näiteks lüsiini dekarboksülaas (kodeeritud cadA geeni poolt) degradeerib lüsiini ja selle tulemusena moodustub aluseline kadaveriin . Kadaveriin transporditakse kadaveriini transporteri CadB abil rakust välja. Lisaks happelisele keskkonnale aktiveerib cadBA geenide transkriptsiooni lüsiini olemasolu keskkonnas ja anaerobioos. Geenide ekspressioonitase on maksimaalne nende kolme komponendi koosesinemisel. Vastusena happelisele keskkonnale indutseeritakse veel arginiini dekarboksülaas Adi ja ornitiini dekarboksülaas SpeF. Nende ensüümide toimel tekivad aluselised ühendid agmatiin ja putrestsiin, mis transporditakse samuti väliskeskkonda.
    Aluselise pH korral ekspresseeruvad deaminaasid, mida on vaja ammooniumi genereerimiseks. Ensüümreaktsioonide kaasproduktina tekivad nõrgad happed, mis langetavad rakust väljaviidutena väliskeskkonna pH-d.
    Kui bakterirakke on lühiajaliselt inkubeeritud pH 4,3-6,0 juures, on nende ellujäävus pH 3,0 juures märksa kõrgem, kui neutraalse pH juures kasvanud sama organismi rakkudel. Rakud on adapteerunud tänu uute valkude sünteesile. Happeline keskkond indutseerib statsionaarse faasi sigma faktori S ekspressiooni, mis kutsub rakus esile üleüldise stressivastuse. Aeglase kasvukiirusega või statsionaarse faasi rakud on happelise keskkonna suhtes märksa resistentsemad kui eksponentsiaalse faasi rakud. Tsütoplasma pH muutustega tõuseb ka DNA reparatsioonisüsteemide valmidus DNA vigu parandada. Aluseline pH indutseerib näiteks SOS DNA reparatsiooni moduloni. Happelise pH korral tõuseb resistentsus mutageenidele ning elektrofiilsetele reagentidele.
    pH muutused kutsuvad esile ka muutusi rakkude käitumises. Happelise keskkonna korral ilmneb rakkudel negatiivne kemotaksis – rakud eemalduvad ebasoodsast keskkonnast. Sel juhul ei ole tegemist muutustega geeniekspressioonis, vaid kemoretseptoritele saabunud signaalide alusel muutub viburite pöörlemissuund.

    16. DNA replikatsiooni ja rakutsükli regulatsioon


    Bakteril E. coli on 5 DNA polümeraasi. DNA polümeraas III on põhiline DNA replikatsiooni läbiviiv ensüüm. DNA polümeraasid I ja II osalevad DNA reparatsioonil, Pol I ka Okazaki fragmentide protsessimisel. DNA polümeraasid IV (DinB) ja V (UmuD´2C) on seotud vigaderohke DNA sünteesiga olukorras, kus DNA polümeraasi III poolt läbiviidav replikatsioon on blokeerunud DNA kahjustuste tõttu.
    DNA polümeraas III ensüümkompleks
    DNA polümeraas III on põhiline bakteri DNA replikatsioonil osalev ensüüm. Multiensüümkompleks on V- kujuline, mõlemad õlad sisaldavad apoensüümi, kuid erinevad teineteisest ülejäänud subühikute osas. Apoensüümi moodustavad subühikud ,  ja . Polümeraasi õlad sünteesivad erinevaid ahelaid - vasak õlg pidevalt sünteesitavat juhtivat ahelat ( leading strand ) ning parem õlg Okazaki fragmentidena sünteesitavat mahajäävat ahelat (lagging strand).
    Selleks, et DNA replikatsiooni läbiviiv ensüümkompleks koos püsiks, on Okazaki fragmentidena sünteesitav DNA ahel linguna replikatsioonikahvlis. -kompleks võimaldab ensüümikompleksi liikumist valmissünteesitud Okazaki fragmendi otsast järgmise praimeri 3’ OH otsa. Mutatsioonisagedus Okazaki fragmentidena sünteesitavas DNA ahelas on 20 korda suurem kui pidevalt sünteesitavas ahelas – ensüümkompleks liigub kahjustustest kõrgema sagedusega üle.
    DNA polümeraas III subühik  (epsilon) vastutab DNA replikatsiooni täpsuse eest, tal on 3’  5’ eksonukleaasne aktiivsus, mis võimaldab valesti DNA ahelasse lülitatud nukleotiidid kõrvaldada (tagab DNA polümeraasi „korrigeeriva“ (proofreading) aktiivsuse). -klambriga (β-subühikute dimeer, mis paikneb ümber DNA; ingl. k. β-clamp) seondumine suurendab polümeraasi protsessiivsust 20 nt/sek kuni 750 nt/sek. -klambriga on võimelised seonduma kõik 5 DNA polümeraasi ning -klambriga seondumise kaudu reguleeritakse erinevate DNA polümeraaside osalemist DNA sünteesil.
    Rakutsükkel
    Raku kasv  Initsiatsiooni mass  Replikatsiooni initsiatsioon, elongatsioon  Replikatsiooni terminatsioon  Terminatsioonijärgne valkude süntees  Raku jagunemine.
    E. coli tüve K-12 kromosoom on 4639221 bp pikkune. Replikatsioon algab oriC-lt ja toimub mõlemas suunas. Kogu genoomi replikatsiooniks (C periood, eukarüootidel vastab sellele S-faas) kulub 40 minutit. Replikatsiooni terminatsioonijärgselt toimub tütarmolekulide dekatenatsioon ja jaotumine , septumi moodustumine ning 20 minutit pärast replikatsiooni terminatsiooni tütarrakud jagunevad (D periood, eukarüootidel vastavalt mitoos ja tsütokinees). Seega kulub replikatsiooni initsiatsioonist rakkude jagunemiseni kokku 60 minutit (C + D periood). Aeglaselt kasvavate rakkude puhul (generatsiooniajaga üle 60 minuti) eristatakse ka B perioodi (eukarüootidel vastavalt G1 faas), kus tütarrakkudes ei toimu seni replikatsiooni, kuni nad on saavutanud teatud suuruse, initsiatsiooni massi.
    Erinevalt eukarüootsest rakutsüklist ei ole bakterirakkude puhul vaja, et eelmine etapp tsüklis oleks lõpule viidud. See võimaldab rakkudel poolduda sagedamini kui kord 60 minuti jooksul. DNA replikatsioonitsüklid võivad olla kattuvad. Replikatsiooni initsiatsioonide arv raku kohta sõltub rakkude kasvukiirusest. Kiiresti kasvavate rakkude puhul toimub nende jagunemine märksa sagedamini kui 60 minuti järel, rakud võivad poolduda isegi kuni 20 minuti tagant. Sellepärast toimub sagedamini jagunevates rakkudes mitu replikatsiooni korraga ning C ja D perioodid rakutsüklis kattuvad. Sõltuvalt rakkude jagunemise kiirusest võib samas rakus liikuda korraga mitu replikatsioonikahvlit, sest järgmine replikatsioon initsieeritakse veel lõpuni sünteesimata tütarmolekulidelt. Maksimaalselt võib ühe rakutsükli vältel olla toimunud 4 replikatsiooni initsiatsiooni initsiatsiooni.
    Kromosoomi replikatsioon ja raku jagunemine on eraldikontrollitavad protsessid. Arvatakse, et ka tütarmolekulide segregatsioon ja jaotumine ei ole otseses sõltuvuses. Raku jagunemist on kirjeldatud ka siis, kui replikatsioon on blokeeritud. Siiski on need protsessid omavahel koordineeritud. DNA replikatsiooni blokeerimine kutsub esile SOS vastuse, mille tulemusena aktiveerub SulA valk, pärssides raku jagunemise. Tütarkromosoomide dekatenatsiooni häirete puhul tekivad mõne aja pärast filamentsed rakud.
    DNA replikatsiooni initsiatsioon
    DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Nimetus ori tuleneb inglisekeelsest terminist “origin of replication”. Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel ( faagid T4, T7, mõned ColE1 replikoni sisaldavad plasmiidid E. coli´s) või spetsiifiliste valkude seondumise tulemusena (DnaA oriC puhul, O ori puhul). Kuna DNA dupleksi avamine on lihtsam A-T rikastest regioonidest, on ori regioonid alati A-T rikkad. Bakterikromosoomi replikatsioon toimub rakutsükli teatud etapil.
    DNA replikatsiooni initsiatsioon oriC-lt
    Minimaalne oriC on 245 bp pikkune ning eubakterites tugevalt konserveerunud. Funktsionaalne oriC sisaldab kindlaid DNA järjestusi, mis esinevad kordustes:
    1) DnaA boksid initsiaatorvalgu DnaA seondumiseks (4 koopiat)
    5’-TTAT(C/A)CA(C/A)A-3’
    2) 11 koopiat Dam metülaasi poolt äratuntavat järjestust 5’-GATC-3’, nendest 8 asukoht on tugevalt konserveerunud
    3) DnaA boksidest vasakule jääb 3 AT-rikast 13 nukleotiidi pikkust järjestust, mis on määrava tähtsusega DNA ahelate lokaalsel lahtisulamisel.
    DnaA seondumiseks oriC-le on vajalik dsDNA-ga seonduva valgu HU juuresolek, mis soodustab DNA paindumist ja DNA ahelate lahtikeerdumist. Lisaks seob oriC DNA-d painutavaid valke IHF ning Fis. Ahelate lahtisulamist oriC regioonis stimuleerib ka transkriptsioon. oriC läheduses on 2 promootorit, mioC, millelt toimub transkriptsioon oriC suunas ning gidA , millelt transkriptsioon oriC suhtes eemaldub:
    gidA oriC mioC
     
    Enne replikatsiooni initsiatsiooni on transkriptsioon mioC-lt inhibeeritud. mioC promootor ei kontrolli replikatsiooni initsiatsiooni. Transkriptsioon gidA promootorilt toimub nii enne kui ka replikatsiooni initsiatsiooni käigus. Transkriptsioonist tingitud negatiivne superspiralisatsioon soodustab DNA lahtikeerdumist AT-rikkast 13-meersest DNA järjestusest. Pärast replikatsiooni initsiatsiooni on gidA transkriptsioon pärsitud, sest vastav DNA regioon on seotud rakumembraaniga.
    Algne initsiatsioonikompleks moodustub 20-30 DnaA monomeeri sidumisel. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine, kusjuures DNA ahelate lahtikeerdumine algab kõige parempoolsemast 13-meerist. Seejärel moodustavad DnaB ja DnaC denatureerunud DNA-ga prepraimingkompleksi. SSB (üksikahelalise DNA-ga seonduv valk) ja güraasi juuresolekul jätkub DNA ahelate lahtikeerdumine mõlemas suunas. Järgneb praimeri süntees DnaG poolt, DNA polümeraas III moodustab replikatsioonikahvli ning edasi toimub oriC-st lähtuv tütarmolekulide süntees mõlemas suunas.
    Limiteeriv faktor DNA replikatsiooni initsiatsioonil.
    GATC saitide metülatsioon oriC regioonis
    Bakteri DNA-s on A nukleotiid GATC järjestustes Dam metülaasi poolt metüleeritud. DNA replikatsiooni käigus jääb sünteesitud tütarahel mõneks minutiks metüleerimata. DnaA seondub ainult metüleeritud DNA-ga. oriC regioonis jäävad GATC saidid metüleerimata pikemaks ajaks kui mujal (30-40% rakutsükli ajast). Sel ajal on oriC assotsieerunud rakumembraaniga. Membraaniga seondumine on oluline ka kromosoomi segregatsioonil, võimaldades tütarmolekulidel teineteisest eemalduda. Seda, et GATC saitide metüleeritus on replikatsiooni initsiatsiooni kontrolliks oluline, näitavad katsed Dam- tüvedega. Dam- tüved on Dam metüültrasferaasi defektsed ning sellistes rakkudes toimub DNA replikatsiooni initsiatsioon asünkroonselt, st. ei alga, juhul kui rakutsükli vältel on käigus korraga mitu replikatsiooni, kõigilt oriC-delt korraga.
    DNA replikatsiooni initsiatsiooni sünkroonsust on võimalik testida DNA replikatsiooni “runout” katsetega. DNA replikatsiooni elongatsioon ei vaja de novo valgusünteesi. Kui rakkudes blokeerida kas valgusüntees (kloroamfenikooli lisamisel) või transkriptsioon (rifampitsiini lisamisel), viiakse parasjagu pooleliolev replikatsioon lõpuni. Samas on pärsitud replikatsiooni initsiatsioon. Cephalexiini lisamisega on võimalik blokeerida rakkude jagunemine. Sõltuvalt sellest, kas replikatsiooni initsiatsioon toimus kõigilt oriC-delt või mitte, on pärast replikatsiooni lõpuni jõudmist (runout replication) rakus paaris või paaritu arv genoomi ekvivalente. Paaritu arv viitab DNA replikatsiooni asünkroonsusele.
    DnaA tase rakus
  • Totaalne rakusisene DnaA tase hoitakse erinevatel kasvukiirustel konstantsena. dnaA geeni ekspressioonitase tõuseb, kui rakkude kasvukiirus suureneb. Aeglasemalt kasvavates toitainete vaeguses olevates rakkudes suureneb ppGpp hulk, mis viib transkriptsioonitaseme dnaA promootoritelt alla.
  • DnaA valgu puhul on kirjeldatud autoregulatsioon. dnaA geenil on 2 promootorit ning nende vahel on DnaA seondumise järjestus. DnaA seondumine sellele järjestusele represseerib transkriptsiooni 1p promootorilt.
  • dnaA promootorregioonis on mitu GATC saiti. Transkriptsioon promootorilt 2p on represseeritud, kui GATC saidid on metüleerimata.
    1p 2p dnaA

    dnaA geeniga samas operonis asuvad veel geenid, mis kodeerivad RNA polümeraasi  subühikut, DNA rekombinatsiooni valku RecF ja ühte DNA güraasi subühikutest.
    Rakus on leitud erinevaid DnaA vorme - DnaA, DnaA-ADP ja DnaA-ATP. In vitro katsetes on näidatud, et DNA replikatsiooni initsiatsioonil on võimeline osalema ainult DnaA-ATP. Aktiivse vormi teke on katalüüsitud fosfolipaasi A2 poolt, interaktsioon membraankompleksis olevate fosfolipiididega viib DnaA inaktiivsesse vormi.
    DNA replikatsiooni initsiatsiooni negatiivne regulatsioon.
    IciA toimib DNA replikatsiooni initsiatsioonile pärssivalt. Ta seondub A-T rikastele 13-meersetele järjestustele oriC piirkonnas ning takistab DNA ahelate lahtikeerdumist.
    SeqA on DNA replikatsiooni initsiatsiooni negatiivne regulaator, mis seondub oriC-le enne initsiatsiooni. oriC sisaldab GATC saite, mis on metüleeritavad. Initsiatsioon toimub ainult täielikult metüleeritud DNA-lt. Pärast replikatsiooni initsiatsiooni jääb oriC 1/3 rakutsükli vältel ainult ühest DNA ahelast metüleerituks. Võimalik, et GATC saite aitab hemimetüleerituna hoida SeqA. Nimelt on näidatud, et SeqA-defektsetes mutantides toimub GATC saitide metüleerimine oriC piirkonnas varem kui metsiktüüpi bakterites.

    Replikatsiooni terminatsioon ja tütarmolekulide dekatenatsioon


    terC ja terB blokeerivad replikatsioonikahvli liikumist vasakult ning terD ja terA paremalt. Nende kahe regiooni vahe on 275 kb. ter järjestused seovad valku Tus, mis blokeerib replikatsioonikahvli liikumiseks vajaliku helikaasi töö. Rekombinatsioon dif saitidest Xer rekombinaasi toimel tagab tütarmolekulide teineteisest eraldumise, dekatenatsiooni. Vajalik on ka DNA güraasi ja topoisomeraasi IV juuresolek.

    Tütarkromosoomide jaotumine


    Septumi moodustumine raku pooldumiseks toimub siis, kui raku pikkus L (E. coli puhul on see 2,8 m) on kahekordistunud (2L). Tütarkromosoomid liiguvad teineteisest kaugusele 1L. Üks võimalikke jaotumisprotsessis osalevaid valke on MukB - 177 kDa suurune valk, mille ennustatud sekundaarstruktuur sarnaneb müosiini raskele ahelale . Samuti on leitud, et ka DnaK-defektsetes tüvedes on tütarmolekulide jaotumine häiritud. DnaK on molekulaarne shaperon.

    Raku jagunemisel osalevad valgud


    Raku jagunemise mehhanismide uurimiseks kasutatakse tavaliselt temperatuuritundlikke mutante, mis kasvavad normaalselt 30C juures, kuid defektne fenotüüp avaldub 42C juures. Seda põhjusel, et enamus raku jagunemist pärssivaid mutatsioone on rakkudele letaalse toimega. Raku jagunemisega on seotud kas otseselt või kaudselt paljud valgud. Järgnevalt on kirjeldatud neid, mille osalus selles protsessis on silmatorkavam.
    Primaarse tähtsusega on FtsZ, mida on 5000 kuni 20000 molekuli raku kohta. Molekulid agregeeruvad ning kogunevad raku pooldumissaiti, moodustades tsütoplasmaatilise membraani sisepinnale ringi, mis on signaaliks tsütokineesile ja septumi moodustumisele. FtsZ on GTP-aasse aktiivsusega ja sisaldab eukarüootsetele tubuliinidele kõrgelt konserveerunud järjestusega GGGTGSG sarnanevat järjestust GGGTGT. Mutatsioonide teke sellesse regiooni viib valgu aktiivsuse kadumisele. Arvatakse, et eukarüootne tubuliin on evolutsioneerunud FtsZ-ist.
    Raku jagunemisega on seotud ka valgud FtsA, FtsQ, FtsI (PBP3), FtsW ning FtsE. PBP3 on peptidoglükaani transpeptidaas, mis viib läbi peptidoglükaani transglükosüleerimise ning ahelate krosslinkimise. Arvatakse, et FtsZ interakteerub FtsA-ga, mis seejärel aktiveerib PBP3. PBP3 ning temaga assotsieerunud valkude toimel moodustub peptidoglükaani kaksikkiht jaguneva raku keskele. EnvA toimel toimub nende kihtide eemaldumine ja sellele järgneb välismembraani sissekasvamine.
    Raku jagunemisel osalevate valkude regulatsioon
    Suur osa raku jagunemisel osalevatest geenidest on kodeeritud mra operoni poolt. Selles operonis on leitud 16 avatud lugemisraami (ORF-i). Valgulised produktid on identifitseeritud 14 ORF-i puhul. Operonis on sisemisi promootoreid. ORF-ide vahed on väga lühikesed ning sageli asuvad kodeerivale järjestusele eelnevad RBS järjestusi sisaldavad regioonid eespoololevate ORF-ide lõpus.
    Geenide ftsQ, ftsA ja ftsZ translatsiooni efektiivsus on erinev.
    ftsQ ftsA ftsZ
      
    25 150 5000-20000 valgumolekuli raku kohta.
    Neid geene sisaldavas regioonis on 7 sisemist promootorit, 4 neist paiknevad ftsA ja 1 ftsQ geenis. See võimaldab erinevaid geene erineval tasemel transkribeerida. Lisaks on promootorid veel erineva tugevusega . Aeglaselt kasvavates rakkudes on fts geenide transkriptsioonitase kõrgem, kiiresti kasvavates madalam. Sellest tulenevalt on kiirema kasvukiirusega rakud suuremad.

    Raku jagunemise koht ja ajastamine


    Kui blokeerida DNA replikatsioon, rakk ei jagune. DNA replikatsiooni blokeerimine põhjustab SOS vastuse, mille tulemusena aktiveerub SulA valk ning raku jagunemine pärsitakse. Arvatakse, et SulA inaktiveerib FtsZ-i. DNA replikatsioon ja raku jagunemine ei ole aga otseses sõltuvuses, sest kui blokeerida replikatsiooni initsiatsioon, jätkub rakkude kasv ning nad jagunevad, kuigi sel juhul jääb osa rakke ilma DNA-ta. Ilma DNA-ta rakud on väiksemad, mistõttu neid nimetatakse minirakkudeks.
    Normaalne raku jagunemine toimub jaotunud tütarkromosoomide vahelt, raku keskelt, nii et raku pooldumiskoht jääks kromosoomist L/2 kaugusele. Põhimõtteliselt võivad rakud jaguneda ka poolustelt ning moodustada DNA-ta minirakke. MinC ja MinD on raku jagunemise inhibiitorid, mis blokeerivad septumi moodustumise kõigis potentsiaalsetes raku jagunemise kohtades. MinE tagab selle, et septumi jagunemine oleks inhibeeritud ainult raku poolustelt. Ta lokaliseerub eelistatult raku keskel olevasse regiooni. Sinna koguneb ka FtsZ, raku jagunemise initsiaatorvalk, kuigi MinE ja FtsZ omavahel otseselt ei interakteeru. MinE N-terminaalne domään kõrvaldab MinC-MinD inhibeeriva toime, C terminaalne domään eristab jagunemise koha raku keskel potentsiaalsetest saitidest poolustel. Et selektiivsus säiluks, peab MinE kontsentratsioon rakus olema limiteeriv (200 molekuli raku kohta). Kui MinE kontsentratsiooni tõsta, tekivad minirakud.
    Minirakkude moodustumine toimub ka Par- mutantides, kus tütarkromosoomide lahknemine on häiritud.
    Ka molekulaarsete shaperonide GroES ja GroEL-defektsed rakud ei jagune. Nende valkude üleekspressioon aga supresseerib DnaA ja FtsZ mutante.

    Rakkude kuju


    RodA kodeerib peptidoglükaani transglükosülaasi ning PBP2 peptidoglükaani transpeptidaasi. Nende valkude suhtes defektsed rakud on sfäärilised ja kuna nende pikkuse ning laiuse suhe on rikutud, siis ka polüploidsed.

    Sünteesitavate vaheseinade arv


    Rakutsükli kohta sünteesitakse üks vahesein . Kui FtsZ-i hulka rakus suurendada, septumite hulk rakutsükli kohta suureneb ning toimub nii tsentraalne jagunemine kui ka minirakke tekitav jagunemine poolustelt. FtsZ-i ekspressioonitaseme veelgi kõrgemale tõstmine viib aga filamentsete rakkude moodustumiseni, sest raku jagunemisel on oluline, et proportsioonid jagunemisel osalevate valkude vahel oleksid paigas.

    Raku jagunemise mehhanismid teistes bakterites


    FtsZ-i homolooge on leitud kõigist seniuuritud bakteritest ja ka arhedest. Teised raku jagunemisel osalevad valgud ei ole nii universaalsed . Graampositiivse bakteri Bacillus subtilis’e rakud võivad jaguneda kas vegetatiivsel teel, raku keskelt või asümeetriliselt. Rakkude ebavõrdne pooldumine toimub siis, kui nad sporuleeruvad. Ümberlülitumine vegetatiivselt raku jagunemiselt asümeetrilisele toimub transkriptsiooni faktori Spo0A toimel. Algselt moodustub 2 polaarset FtsZ-i ringi, seejärel üks neist degradeeritakse. Caulobacter crescentus’el on 2 rakutüüpi – liikuvad ja paigalpüsivad. FtsZ-i taset kontrollitakse nii transkriptsiooni kui ka proteolüüsi kaudu. Liikuvates rakkudes, mis ei jagune, FtsZ ei ekspresseeru. Liikumisvõimetud rakud jagunevad ja neis on FtsZ-i tase kõrge.

    SOS vastus


    DNA kahjustuste või DNA replikatsiooni inhibeerimise tagajärjel tekib rakkudes SOS vastus. Induktoriteks on UV-kiirgus, alküleerivad ühendid, tümiini vaegus ja ravimid . DNA replikatsiooni blokeerimine kahjustuste kohas toob esile ssDNA, kuna DNA polümeraasi III peatumisel jätkab DNA helikaas DnaB DNA ahelate lahtikeeramist. ssDNA aktiveerib RecA valgu ning moodustub nukleoproteiinne filament. RecA aktiveeritud vorm RecA* interakteerub LexA-ga, mis on SOS reguloni repressoriks. RecA*-ga interakteerumise tagajärjel toimub LexA autoproteolüüs ning SOS geenid saavad avalduda. Ka RecA enda tase tõuseb rakus 50 korda.
    SOS vastusena käivitub DNA reparatsioon (rekombinatsiooniline reparatsioon), SOS mutagenees (Pol V poolt läbiviidav) ning alternatiivne DNA replikatsioon.
    SOS vastuse käigus indutseeritakse E. coli rakkudes DNA polümeraasid Pol II, Pol IV ja Pol V. Pol IV ja Pol V viivad DNA sünteesi läbi vigaderohkelt.
    DinB e. DNA polümeraas IV
    Pol IV-l puudub “proofreading” aktiivsus ning ta on võimeline jätkama DNA replikatsiooni olukorras, kus praimer ei ole DNA-ga täies ulatuses paardunud (misaligned primer/ template structures). Kui matriitsahel on näiteks järjestusega 3´CAAGGGCCCAA ja DNA süntees lähtub sellega komplementaarselt praimerilt 5´GTTCCG, kus üks komplementaarne C nukleotiid praimeri 3´otsas on puudu, tekib sünteesitavasse DNA ahelasse 1-nukleotiidne deletsioon . Pol IV bioloogiliseks funktsiooniks on jätkata DNA replikatsiooni kohalt, kus DNA polümeraas III kompleks on peatunud. Sellega kaasneb mutatsioonisageduse tõus rakkudes – võimenduvad 1-nukleotiidsed deletsioonid.
    UmuD´2C e. DNA polümeraas V
    SOS vastusena derepresseeritakse umuDC operon. UmuD autokatalüüs aktiveeritud RecA toimel viib aktiivse UmuD’tekkele. Mutageenselt aktiivne on UmuD2’C kompleks. UmuD intaktne valk on SOS mutageneesi inhibiitoriks, ta moodustab UmuD-UmuD’ heterodimeeri, mis on märkimisväärselt stabiilsem kui UmuD2 või UmuD’2 . RecA soodustab Umu valkude korrektset paigutumist DNA kahjustuse kohta. UmuD2´C-l on DNA polümeraasne aktiivsus, mistõttu seda kompleksi nimetatakse ka DNA polümeraas V-ks. Arvatakse, et UmuD2’C võib lülituda DNA replisoomi ja jätkata kahjustuse kohal peatunud DNA polümeraasi III asemel lühiajaliselt vigaderohket DNA sünteesi. Seejärel jätkub DNA replikatsioon jällegi DNA polümeraas III toimel.
    Selleks, et hoida rakus ära võimalikku edasist mutatsioonide kuhjumist UmuD2’C toimel, on E. coli’s proteaasid, mis kahjutustavad SOS vastusena indutseeritud Umu valgud. DNA pol V poolt läbiviidav vigaderohke DNA süntees leiab rakus aset alles siis, kui kõik teised võimalused replikatsiooni blokki kõrvaldada on ebaõnnestunud. Arvatakse, et DNA kahjustustest indutseeritud mutagenees võiks olla üks mehhanismidest, mis viib mikroobipopulatsiooni geneetilisele kohastumisele muutunud keskkonnatingimustes.
    DNA polümeraasid teistes bakterites
    DNA polümeraasi Pol V kodeerivad geenid puuduvad paljude bakterite genoomist, küll on neis aga leitud ülejäänud DNA polümeraase kodeerivate geenide homolooge mitmes koopias. Geen dnaE kodeerib replikatiivse DNA polümeraasi Pol III katalüütilist subühikut. Ligikaudu pooltes praeguseks sekveneeritud bakterigenoomidest on leitud 2 kuni 3 dnaE geeni homoloogi. Näiteks patogeenses bakteris Mycobacterium tuberculosis on nende geenide poolt kodeeritud valgud DnaE1 ja DnaE2. DnaE1 on replikatiivse DNA polümeraasi koostises, kuid DnaE2 osaleb stressi poolt indutseeritud mutageneesil. DnaE2 olemasolu suurendas antibiootikumiresistentsuse mutantide tekkesagedust ligikaudu 10 korda ja soodustas mükobakteri kolonisatsiooni katseloomade kopsudes. Ka Pol IV homolooge võib samal bakteril olla mitu.
    Alternatiivne DNA replikatsioon
    Bakterikromosoomi replikatsiooni initsiatsioon toimub kindlast kohast, mida nimetatakse oriC-ks. Sellele piirkonnale seondub initsiaatorvalk DnaA, põhjustades DNA lokaalset lahtikeerdumist. Seejärel tuuakse kohale DnaB helikaas, mis on komplekseerunud DnaC-ga ja praimeri sünteesiks praimaas DnaG. Teatud juhtudel võib DNA replikatsioon alata ka DnaA-st sõltumatult ning teistest kromosoomipiirkondadest. Sel juhul on tegemist stabiilse DNA replikatsiooniga SDR. Nimetus tuleneb sellest, et SDR ei vaja de novo valgusünteesi.
    Indutseeritud stabiilne DNA replikatsioon
    Indutseeritud stabiilne DNA replikatsioon ( iSDR ) ei vaja replikatsiooni initsiatsiooniks DnaA valku. iSDR toimub rakkudes, kus on indutseeritud SOS vastus ning sõltub homoloogilisest rekombinatsioonist. iSDR algab nii oriC piirkonnast kui ka terC-st (nimet. ka oriM). Initsiatsiooniks vajaliku praimeri genereerimiseks toimub DNA rekombinatsioon, mille käigus tekib D-ling. D-ling on 3-st DNA ahelast moodustunud struktuur vaba 3´-OH otsaga. D-ling moodustub kaksikahelalise katke tulemusena oriM regioonis. ssDNA 3’-OH otsaga genereerivad RecBCD helikaas või ExoVIII. RecA toimel assimileerub see ssDNA homoloogilise dsDNA-ga. iSDR tekitab võrreldes tavalise DNA replikatsiooniga rohkem vigu.
    Konstitutiivne stabiilne DNA replikatsioon
    Lisaks iSDR-le võib bakterites toimuda ka konstitutiivne stabiilne DNA replikatsioon (cSDR), mis ei vaja SOS vastuse esilekutsumist bakterirakus. cSDR algab oriK-delt ja sõltub transkriptsioonist. cSDR saab toimuda ainult siis, kui RNaas H on inhibeeritud, kuna vajab initsiatsiooniks R-lingu moodustumist. R-ling on DNA-RNA hübriid, mis on substraadiks RNaas H-le. DNA-RNA hübriidi pikkuse (võib olla mõningail juhtudel pikem kui 12 bp) määrab ära RNA polümeraasi  subühik. cSDR vajab initsiatsioonil RecA valku.
    Transkriptsiooni ja replikatsiooni omavaheline seos
    Transkriptsioon ja replikatsioon ei ole bakterirakus ajaliselt lahutatud. Eriti tihedalt on need protsessid seotud kiiresti kasvavates bakterirakkudes, kus korraga töötavad 6 või rohkem replikatsioonikahvlit. Replikatsiooni kiirus on transkriptsiooni kiirusest ligikaudu 20 korda suurem. Seega peaksid RNA-d ja DNA-d sünteesivad ensüümkompleksid omavahel kokku põrkuma. Eelistatult toimuvad replikatsioon ja transkriptsioon samasuunaliselt . Kui replikatsioonikahvel jõuab järele RNA polümeraasile, pühib ta selle teelt ning liigub edasi. Promootorilt toimub uus transkriptsiooni initsiatsioon. Kui replikatsioon ja transkriptsioon toimuvad vastassuunaliselt, on replikatsioonikahvli liikumine tugevasti pidurdatud ning ka sel juhul toimub RNA polümeraasi kõrvaldamine DNA ahelalt. Lisaks, kui replikatsioon ja transkriptsioon toimuvad vastassuunaliselet ning replikatsioon toimub operoni lõpust promootori suunas, on transkriptsioon inhibeeritud kogu selle aja vältel, mis kulub operoni replitseerumiseks. Seega on geenide avaldumise seisukohalt väga oluline, kas neid transkribeeritakse replikatsioonikahvli liikumisega samas suunas või sellele vastu. > 90% geenidest paiknevadki E. coli kromosoomis nii, et nende transkriptsioonisuund ühtib replikatsioonisuunaga. Eriti kehtib see geenide kohta, mille avaldumine on oluline rakkude kiire kasvu korral. Geenid, mille transkriptsioon toimub harva või neid transkribeeritakse kehvades kasvutingimustes, on kromosoomis juhuslikult orienteeritud.
    rrnB operoni (kodeerib ribosomaalset rRNA-d) transkriptsiooni ja replikatsiooni jälgiti elektronmikroskoopiliselt ning näidati, et transkriptsioonikompleksi ja replikatsioonikahvli kohtumisel toimub RNA polümeraasi kõrvaldamine DNA-lt.
    in vitro katsetes T4 replikatsioonisüsteemi ning bakteri RNA polümeraasiga on näidatud DNA replikatsioonikahvli möödumist transkriptsioonikompleksist, ilma et transkriptsioon selle tagajärjel termineeruks. Transkriptsioon viidi läbi T4 hiliselt promootorilt, kasutades E. coli RNA polümeraasi apoensüümi ja T4  faktorit. Samad tulemused saadi ka 70 promootori puhul E. coli RNA polümeraasi holoensüümiga.
    Võimalik mudel: Transkriptsiooni elongatsiooni kolmikkompleksis on RNA polümeraasil 2 DNA-ga interakteeruvat domääni. Üks neist võib olla DNA-st lahutatud, ilma et kompleks dissotseeruks. Kasvav RNA ahel ei ole väga tugevalt DNA-RNA hübriidina seotud, perioodiliselt võib ta tugevamini seostuda RNA polümeraasiga. Replikatsioonikahvli möödumisel on RNA polümeraas DNA-ga seotud korra ühe ja siis teise domeeni kaudu. Hiljem toimub RNA ahela tagasihübridisatsioon DNA ahelale.

    17. DNA reparatsioon. Mikroobipopulatsiooni evolutsioneerumine stressitingimustes


    DNA reparatsioon
    DNA kahjustuste kõrvaldamiseks on mitmeid strateegiaid. Kõige lihtsamaks ja otsesemaks mehhanismiks on vea parandamine kohapeal, ilma nukleotiidide DNA ahelast kõrvaldamiseta. Nii toimub näiteks alküleerivate ühendite poolt tekitatud kahjustuste kõrvaldamine metüültransferaaside abil. Metüültransferaas Ada kannab metüülguaniinilt O6-MeG metüülrühma iseenda tsüsteiini jäägile (Cys-321). Selle tulemusena valk inaktiveerub. Seega kulub iga metüülrühma kõrvaldamisele DNA-st üks Ada valgu molekul. Ada ekspressioonitase on rakus reguleeritav. Tegemist on autoregulatsiooniga, kus metüleeritud Ada valk seondub teda kodeeriva geeni promootoralale, mille tulemusena ada geeni transkriptsioonitase rakus tõuseb. Metüleerimata Ada valk on samuti võimeline promootoralale seonduma, kuid tunduvalt väiksema efektiivsusega ning sel juhul ada geeni transkriptsioonitase rakus langeb. Nii on võimalik Ada valgu ekspressioonitaset kontrollida vastavalt DNA kahjustuste hulgale rakkudes.
    Lisaks Ada valgule on bakterites veel konstitutiivselt ekspresseeruv O6-MeG metüültransferaas Ogt.
    UV kiirgusest põhjustatud pürimidiini dimeeride lahutamine fotolüaasi abil toimub samuti kohapeal. Fotolüaas võib substraadile seonduda pimedas , kuid dimeeride lahutamiseks kasutab ta valguseenergiat. Seetõttu nimetatakse seda reparatsiooniprotsessi ka fotoreaktivatsiooniks.
    Ülejäänud DNA reparatsioonisüsteemid kas kõrvaldavad DNA kahjustust sisaldava segmendi ühest ahelast ja kopeerivad tekkinud tühiku teise ahela nukleotiidse järjestuse põhjal või siis toimub ebakorrektse järjestuse asendamine korrektsega rekombinatsioonilise vahetuse teel.

    Lämmastikaluste väljalõikamine


    Kahjustatud lämmastikaluste kõrvaldamisel DNA-st osalevad N-glükosülaasid. Selle tulemusena tekib DNA ahelas AP sait (abasic site), mida atakeerib AP endonukleaas, lõhkudes fosfodiestersideme. Seejärel kõrvaldab desoksüriboosi DNA ahelast eksoribonukleaas või desoksüribofosfodiesteraas. Osadel glükosülaasidel (näiteks MutM) on ka AP endonukleaasne aktiivsus.
    Uratsiil DNA glükosülaas (ung geeni produkt) on väga spetsiifiline ja kõrvaldab DNA ahelast ainult uratsiili. Uratsiil tekib tsütosiini deamineerimise tulemusena. Sellel ensüümil AP endonukleaasne aktiivsus puudub.
    3-MeA DNA glükosülaasid I (Tag) ja II (AlkA) on erineva substraadispetsiifilisusega. AlkA on laiema substraadispetsiifilisusega, kõrvaldades nii 3-MeA, 3-MeG kui ka hüpoksantiini (hüpoksantiin tekib adeniini deamineerimisel). Tag ekspresseerub rakkudes konstitutiivselt, AlkA geeni transkriptsioon on aga samuti Ada valgu poolt reguleeritav.
    Oksüdeeritud guaniini GO reparatsioon
    Guaniini oksüdatsiooniproduktiks on 8-hüdroksüguaniin (GO). GO kahjustusi põhjustavad hapnikuradikaalid tekivad rakus ka tavaliste protsesside (elektronide transport, lipiidide peroksüdatsioon) tulemusena. Seetõttu on GO reparatsioon bakterirakus üks olulisemaid vigade ärahoidmise ja korrigeerimise süsteeme. GO-defektsetes tüvedes tõuseb mutatsioonisagedus võrreldavalt mutatsioonisageduse tõusuga, mis ilmneb replikatiivse DNA polümeraasi korrigeeriva (proofreading) funktsiooni rikkumise või DNA metülatsioonist sõltuva DNA “mismatch” reparatsioonisüsteemi defektsusel.
    Replikatsioonil viib DNA polümeraas GO võrdse efektiivsusega nii C kui A vastu (3% efektiivsusest, millega ta õiget nukleotiidi inkorporeerib). GO valepaardumisest põhjustatud asendusmutatsioonide vältimiseks on E. coli’s olemas 3 valku – MutM, MutT ja MutY.
    MutT on ennetava funktsiooniga – ta lagundab rakkudes GO-d. MutT omab dGTPaasset aktiivsust, mis on 8-oxodGTP suhtes võrreldes dGTP-ga 3 suurusjärku kõrgem.
    MutM ja MutY on glükosülaasid. MutM ja MutY-defektsetes rakkudes tõuseb GC  TA transversioonide osakaal. MutM kõrvaldab DNA ahelast GO. MutY kõrvaldab valesti paardunud A nii A/G kui A/GO puhul. Kahjustuste kõrvaldamine võib toimuda ka valesti. Näiteks, kui A vastu lülitub GO, võib MutY DNA ahelast kõrvaldada hoopis A ning kui järgmise replikatsioonitsükli käigus lülitub GO vastu C, toimub selle tulemusena asendus AT  CG.
    GO reparatsiooniensüümide homolooge on leitud ka eukarüootsetest rakkudest.
    Nukleotiidide DNA ahelast väljalõikamine
    Pikk reparatsioonirada - kõrvaldatakse 1500 nt, osaleb DNA pol I.
    Lühike reparatsioonirada - kõrvaldatakse 12 - 13 nt, osalevad UvrABC ekstsinukleaas ja UvrD.
    UvrA (kahjustust tundev valk) ning UvrB (helikaas) tunnevad DNA-d skanneerides ära defekti. Kahjustuse kohal toimuvad valkudes konformatsioonilised muutused, mille tagajärjel UvrA dissotseerub ning UvrB ja defektse ala kompleksiga seostub UvrC. UvrB-l on endonukleaasne aktiivsus, ta tekitab katke 5-ndasse fosfodiestersidemesse kahjustusest 3´ suunas. 8-nda fosfodiestersideme katke kahjustusest 5´suunas teostatakse UvrC poolt. Seejärel kõrvaldavad UvrD helikaas ja DNA polümeraas I oligo ning toimub tühiku täissüntees. UvrABC kompleksi nimetatakse ka UvrABC ekstinukleaasiks. Kuigi uvrA, uvrB ja uvrD geene transkribeeritakse rakus pidevalt, on nende transkriptsioonitase LexA repressori poolt mahareguleeritud ning tõuseb SOS vastuse käigus, kus DNA on kahjustatud.
    DNA “mismatch” reparatsioon MMR
    DNA “mismatch” reparatsioon MMR korrigeerib DNA replikatsioonijärgset järjestust, kõrvaldades valestipaardunud nukleotiide sellest DNA ahelast, mida pole jõutud veel metüleerida.
    MutS seondub otseselt mittepaarduva alaga, seejärel liitub MutL. MutS-MutL-DNA kompleks translokeerub hemimetüleeritud GATC saidiga seondunud endonukleaasi MutH juurde, stimuleerides MutH endonukleaasset aktiivsust. MutH lõikab fosfodiestersidet ajutiselt metüleerimata DNA ahelast. MutH poolne lõige võib toimuda kahjustusest kas 5´ või 3´ suunas. Seejärel toimub valestipaardunud nukleotiidi sisaldava regiooni kõrvaldamine eksonukleaaside toimel. DNA ahelate lahtikeeramisel osaleb helikaas UvrD. ssDNA-le sünteesib komplementaarse DNA ahela DNA polümeraas III kompleks.
    Graampositiivsetes bakterites on MutHLS reparatsioonisüsteem samuti olemas, kuid seal ei toimu vahettegemist metüleeritud ja metüleerimata DNA ahelate vahel. MutS ja MutL homolooge on leitud ka eukarüootsetes rakkudes. MutS homoloogide defektsus võib neis rakkudes põhjustada vähi teket (näit. soolevähki).
    Lisaks DNA vigade parandamisele raskendab MMR liikidevahelist geneetilise informatsiooni kombineerumist, inhibeerides rekombinatsiooni toimumist DNA järjestuste vahel, kus homoloogia ei ole täielik.
    Transkriptsioon ja DNA reparatsioon.
    mfd geen (mutation frequency decline) kodeerib valku TRCF (transcription- repair coupling factor). Kui transkriptsioon peatub DNA kahjustuse tõttu, seonduvad sellesse regiooni MMR valgud MutS ja MutL, sest transkriptsioonimull või selle ümbrus meenutavad heterodupleksit, mis on MutS-i seondumissaidiks. Seejärel dissotseeruvad TRCF (Mfd) toimel kahjustuse kohast RNA polümeraas ning mRNA. Järgnevalt toimub kahjustuse väljalõige UvrABC ekstsinukleaasi toimel.
    Transkriptsiooniga seotud DNA reparatsiooni on kirjeldatud ka pärmi ja inimese rakus. Osa vähirakke on selle süsteemi suhtes defektsed.
    Rekombinatsiooniline DNA reparatsioon
    Rekombinatsiooniline DNA reparatsioon on RecA valgust sõltuv ning käivitub SOS vastusena. DNA replikatsioonikahvel peatub, kui DNA ahelas on kas DNA kahjustus, üksikahelaline või kaksikahelaline katke. RecA valk aktiveerub kokkupuutes ssDNA-ga ning viib kontakti rekombineeruvad DNA molekulid. RecA soodustab DNA ahelate ülekannet, aitab neil paarduda ning osaleb DNA ahelate hargnemiskoha migratsioonil. RecA homolooge on leitud ka eukarüootides. Näiteks Rad51 defektsus põhjustab hiire embrüol letaalset fenotüüpi ning kõrgenenud tundlikkust ioniseeriva kiirguse suhtes. Rad51-ga interakteeruvad mitmed kartsinogeneesis osalevad valgud nagu näiteks BRCA1, BRCA2 ning p53. Pärmis kirjeldatud Dmc1-l on samuti rekombinatsioonil oluline rolli.
    DNA rekombinatsiooniline reparatsioon ssDNA katke puhul
    Kui replikatsioonikahvel jõuab DNA kahjustuseni või ssDNA katkeni, DNA replikatsioon blokeerub ning toimub rekombinatsiooniline reparatsioon RecF, RecO ja RecR osalusel. RecA viib homoloogia alusel omavahel kontakti kahjustusega ja intaktse DNA molekuli.
    DNA rekombinatsiooniline reparatsioon dsDNA katke puhul
    Juhul, kui DNA-s on tekkinud kaksikahelaline katke, on lisaks RecA valgule vajalik RecBCD osalemine. RecBCD kompleksil on helikaasne aktiivsus, mis ilmneb dsDNA katke korral. Helikaasse aktiivsusega kaasneb ka eksonukleaasne aktiivsus, mis avaldub seni, kuni kompleks jõuab Chi saidini (asümeetriline 8-nukleotiidne järjestus) ning seal toimib RecBCD endonukleaasina. Chi sait inaktiveerib RecBCD eksonukleaasse aktiivsuse ning edasi käitub RecBCD kompleks ainult kui helikaas. RecA valgu abil moodustub dupleks homoloogilise alaga. Tekib “Holliday” struktuur kus DNA ahelad on risti. Kuna “Holliday” riststruktuur liigub helikaaside RuvA ja RuvB toimel edasi, võivad moodustuda dupleksid uuesti sünteesitud DNA ahelate vahel, mis ei ole veel metüleeritud. Sellistes regioonides on rohkem mutatsioone, kuna metülatsioonist sõltuv DNA “mismatch” reparatsioon ei toimi. “Holliday” struktuuri lahutab hiljem RuvC ning replikatsioonikahvel saab edasi liikuda.
    RecBCD rekombinatsioonirada on aktiivselt kasutatav veel bakterite konjugatsiooniprotsessis, kus toimub geneetilise informatsiooni vahetus.
    Igas E. coli rakus tekib generatsiooni kohta 3000 - 5000 DNA kahjustust, enamus neist on oksüdatiivsed DNA kahjustused. RecA-defektsed rakud on kõrgema suremusega (kuni 50% rakke sureb ) ning see on enamasti tingitud replikatsioonikahvli peatumisest. RecBCD-defektsetes rakkudes akumuleeruvad kaksikahelalised DNA katked. Iga replikatsiooni initsiatsiooni korral oriC-lt on aeroobsetes tingimustes kasvavate rakkude puhul 10-45%-line tõenäosus, et üks või mõlemad replikatsioonikahvlitest peatuvad DNA kahjustuste tõttu, mida pole jõutud parandada ning vajavad replikatsiooni jätkumiseks rekombinatsioonilist DNA reparatsiooni. Olukorras, kus replikatsioonikahvel peatub sageli DNA kahjustuste tõttu, näiteks SOS vastuse korral, kus bakterirakus on tekkinud hulgaliselt DNA katkeid, algatatakse oriC-sõltumatu alternatiivne DNA replikatsioon.
    Mikroobipopulatsiooni evolutsioneerumine statsionaarses faasis
    Traditsiooniliselt defineeritakse statsionaarset faasi kui olukorda, kus rakupopulatsiooni optiline tihedus või CFU ( colony forming units ) väärtus ei tõuse. Rakud püsivad statsionaarses faasis nälgimise korral. Looduslikes populatsioonides on nälgimine (ja seega statsionaarne faas) bakteritele tavaline seisund. Pigem on erandiks eksponentsiaalne paljunemine. Viimaste aastate uuringud on näidanud, et statsionaarses faasis olev rakupopulatsioon on dünaamiline, pidevalt evolutsioneeruv. Osadel rakkudel ilmneb kultuuri vananedes GASP ( growth advantage in stationary phase) fenotüüp. Suurem osa rakke sureb nälgimise käigus. GASP fenotüübiga mutandid on võimelised surnud rakkudest vabanenud toitaineid (näiteks aminohappeid) paremini omastama kui metsiktüüpi rakud. E. coli vedelkultuuriga on tehtud katseid, kus näidati, et kui 10 päeva vanusest LB söötmes hoitud kultuurist võetud rakud viidi kokku 1 päeva vanuse kultuuriga, olid 10 päeva vanusest kultuurist pärit rakud võrreldes 1 päeva vanuse kultuuri rakkudega edukamad. Nad konkureerisid segakultuuris nooremad rakud välja. Vana ja noore kultuuri rakkude eristamiseks kasutati erinevaid neutraalse toimega geneetilisi markereid nagu näiteks resistentsust nalidiksiinhappele ja streptomütsiinile.
    GASP fenotüüpi on kirjeldatud ka teiste bakteriliikide puhul ja ka teistel söötmetel (nii vedelsöötmes kui ka tardsöötmel, erinevatel minimaalsöötmetel). Eluvõimelisi rakke võib statsionaarse faasi kultuuris leida isegi kuude ja aastate pärast. Kultuuris toimub pidev evolutsioneerumine: esimesed GASP fenotüübiga mutandid konkureeritakse varsti välja uute GASP mutantide poolt, need hiljem omakorda järgmiste poolt. Nii on näidatud, et 10 päeva vanuse kultuuri mutandid konkureeritakse välja 20 päeva vanuse kultuuri GASP mutantide poolt ja need omakorda 30 päeva vanuse kultuuri mutantide poolt. Ja nii edasi... Näiteks 120 päeva inkubeeritud kultuuri rakud konkureerivad välja 90 päeva vanuse kultuuri mutante. Samas leiti, et 120-150 päeva inkubeeritud kultuuri GASP mutandid ei ole enam konkurentsivõimelised värske kultuuri rakkudega. Ilmselt on keskkond, milles need mutandid välja selekteeruvad, juba liiga erinev üleöö kasvanud kultuuri keskkonnast.
    Statsionaarses faasis oleva rakupopulatsiooni evolutsioneerumist on võimalik hinnata ka kolooniate morfoloogia alusel. Näiteks kultuur, mis oli LB tardsöötmele plaaditud kolooniate morfoloogia suhtes homogeenne esimesed 120 päeva, andis 3 erinevat tüüpi kolooniaid 150 päeva vanuselt, 4 tüüpi 180 ja 5 tüüpi 240 päeva vanuselt.
    Ühest inokulumist kasvatatud kultuuride GASP fenotüüp võib erineda. Näiteks lasti kuu aega evolutsioneeruda kahte algselt isogeenset streptomütsiini-resistentset kultuuri ja uuriti seejärel nende võimet konkureerida 1 kuu vanuse nalidiksiin-resistentse kultuuri rakkudega. Ainult ühe kultuuri rakud olid konkurentsivõimelised. See näitab, et erinevates populatsioonides tekkisid erinevad mutatsioonid, erinevate mutatsioonide tulemusena toimusid rakkudes erinevad füsioloogilised muutused ja rakukultuuride keskkond kujunes erinevaks. Sellest tulenevalt sattusid rakupopulatsioonid erineva selektsiooni alla ning eelise said erinevad mutandid.
    GASP mutatsioonide geneetiline tagapõhi.
    Esimesed GASP mutandid, mis isoleeriti 10 päeva vanusest kultuurist, sisaldasid mutantset rpoS alleeli (rpoS819). Mutantses alleelis oli geeni 3' otsas toimunud lühike duplikatsioon, mille tulemusena RpoS valgu 4 viimast aminohapet asendusid 39 uue aminohappega. Selle tulemusena langes RpoS valgu (statsionaarse faasi-spetsiifiline sigama faktor) aktiivsus. GASP fenotüübi tagas just sigma faktori osaline funktsiooni kadu. Mutandid, kus RpoS on täielikult inaktiveeritud, GASP fenotüüpi ei oma. RpoS osalist funktsiooni kadu mutatsioonide tõttu rpoS geenis on täheldatud ka paljudel looduslikel isolaatidel. Eraldi tasub rõhutada, et rpoS geenis toimunud mutatsioonidest põhjustatud GASP fenotüüp ilmneb bakteritel ainult teatud kasvutingimustel (rikas aereeritud sööde).
    Bakterikultuuri vananedes ilmuvad uued GASP mutandid, mis sisaldavad lisaks rpoS mutatsioonidele mutatsioone ka teistes alleelides. Nii on leitud mutatsioonid geenides sgaA, sgaB ja sgaC (stationary-phase growth advantage). Kõik need mutandid kasvavad võrreldes metsiktüüpi rakkudega kiiremini teatud aminohapetel, kasutades neid C-allikana. Erinevad mutandid eelistavad kasvuks erinevaid aminohappeid. Aminohapete katabolismiradade ekspressioonitaseme tõus võimaldab mutantidel kasutada efektiivsemalt surnud rakkudest vabanenud toitaineid.
    Mutatsioonid statsionaarse faasi rakkudes
    DNA replikatsioon toimub ka statsionaarse faasi rakkudes. Sel juhul võib olla tegemist ka oriC-sõltumatu, alternatiivse DNA replikatsiooniga. Kui DNA replitseerub, saavad tekkida ka mutatsioonid. Nälgivas rakupopulatsioonis (sisuliselt statsionaarse faasi rakud) on täheldatud selliste mutatsioonide akumuleerumist, mis võimaldavad mutantsetel bakteritel selektiivsetes tingimustes kasvama hakata. Statsionaarse faasi rakkudes tekkinud mutatsioonide spekter erineb kasvavate rakkude mutatsioonide spektrist: kui kasvavate rakkude puhul on korraga esindatud palju eritüübilisi mutatsioone, siis nälgivate rakkude puhul on sageli domineerivaks üks kindel tüüp.
    Mutatsioonide tekkimise kohta statsionaarse faasi rakkudes on pakutud välja mitmeid mehhanisme, mis eraldi või kombineerituna võimaldavad mutantide akumuleerumist nälgivas rakupopulatsioonis. Nagu eelpool mainitud, toimub ka statsionaarse faasi rakupoplatsioonis surnud rakkude arvelt aeglane kasv. Samuti on näidatud DNA replikatsiooni toimumist statsionaarse faasi rakkudes. Statsionaarse faasi rakkudest on leitud kuni 8 kromosoomi koopiat. Sellegipoolest on mutantide akumuleerumissagedus rakupopulatsioonis nälgivates rakkudes toimuva DNA replikatsiooni taset arvestades üle ootuste kõrge. Osa uurimistulemusi viitavad sellele, et nälgivas rakupopulatsioonis võib mutatsioonisagedus ajutiselt tõusta, mille põhjuseks võib olla näiteks DNA replikatsiooni täpsuse ja DNA reparatsiooniradade aktiivsuse vähenemine.
    DNA polümeraasid
    Bakterist E. coli kirjeldatud 5 DNA polümeraasi, millest 3 on indutseeritavad DNA kahjustuste tulemusena - DNA polümeraas II, mis on täpne ja vigaderohked Pol IV (DinB) ja Pol V (UmuDC), mis võimaldavad jätkata DNA replikatsiooni kahjustatud kohtadest . Vigaderohked polümeraasid lülitavad sünteesitavasse DNA ahelasse vale nukleotiidi keskmiselt iga 100-1000 nt tagant, teised polümeraasid teevad seda iga 104-106 nt tagant. Pol IV on võimeline jätkama DNA sünteesi olukorras, kus praimeri viimane nukleotiid ei ole komplementaarne matriitsahelaga. Pol V lisab tümidiini dimeeride vastu eelistatult G nukleotiidi. Pol IV osalust on näidatud näiteks E. coli tüve FC40 nälgivas rakukupopulatsioonis akumuleerunud lacZ geeni raaminihke mutatsioonide tekkel (50% mutatsioonidest). Pol V osalust on samuti statsionaarse faasi mutageneesil näidatud.
    Hiljuti avaldatud andmed (Yeiser jt., 2002) näitavad, et kui kultiveerida koos E. coli rakke, milles töötavad kõik viis DNA polümeraasi ja mutantseid rakke, mis on defektsed kas pol IV, pol V või pol II suhtes, siis sellises segapopulatsoonis väheneb võrreldes algse E. coli’ga vigutekitavate DNA polümeraaside suhtes defektsete mutantide kohasus (fitness), ja seda tingimustes, kus võime genereerida GASP fenotüübiga mutante on positiivse selektsiooni all.
    DNA reparatsioonisüsteemid
    Statsionaarse faasi mutantide iseloomustamisel on leitud, et neis on võrreldes kasvava kultuuri mutantidega mutatsioonide spekter kitsam - domineerib teatud mutatsioonitüüp. Näiteks geeni lacZ raaminihke taastumisel domineerib 1-nukleotiidne deletsioon C nukleotiidsest kordusjärjestusest. Samasugune mutatsioonitüüp domineerib ka DNA "mismatch"-reparatsiooni MMR defektsetes tüvedes, kus geen mutS on inaktiivne. DNA "mismatch"-reparatsiooni ensüümide puhul on näidatud, et nende ekspressioonitase statsionaarse faasi rakkudes on võrreldes eksponentsiaalse faasi rakkudega madalam. Samas on ka eksperimentaalseid andmeid, mis ei kinnita seda, et MMR muutub statsionaarse faasi rakkudes limiteerivaks.
    Geneetilised ümberkorraldused
    Geneetilise mitmekesisuse tekkimisel statsionaarse faasi rakkude populatsioonis osalevad ka mobiilsed DNA elemendid - IS elemendid ja transposoonid . Vanades säilituskultuurides on täheldatud IS elementide ringihüppamist. Samuti on kirjeldatud kromosoomipiirkondade deletsioone, inversioone, duplikatsioone ja amplifikatsioone.
    Mutaatorid
    Mutaatorfenotüüp kaasneb enamasti kas defektsusega DNA reparatsioonisüsteemides või DNA polümeraasi ebatäpsuses (puudub polümeraasi vigu korrigeeriv "proofreading" aktiivsus). DNA polümeraasi korrigeeriv aktiivsus võib kaduda ka näiteks mutantsete tRNA-de tõttu, mis põhjustavad teatud koodoni puhul vale aminohappe lülitumist polüpeptiidi. Eristatakse geneetiliselt fikseeritud mutaatorfenotüüpi ja ajutist mutaatorfenotüüpi e. hüpermutabiilset seisundit .
    Päranduv mutaatorfenotüüp.
    E. coli puhul on kirjeldatud 30 geeni, mille defektsus põhjustab mutaatorfenotüüpi. Mutaatorid tekivad sagedusega 10-5. Samas on E. coli ja Salmonella typhimuriumi looduslikes isolaatides leitud 1-3% mutaatoreid, mis näitab, et looduslikes tingimustes, kus keskkonnatingimused alatasa muutuvad, võib mutaatorfenotüüp, kuigi sellega kaasneb ka kahjulike mutatsioonide akumuleerumise oht, olla teatud olukorras rakkudele kasulik. Mutaatorite hulk tõuseb populatsioonis olukorras, kus bakterid on tugva selektiivse surve all ja kus eelise saavad rakud, milles on toimunud mitu mutatsiooni. Tegelikult võib siin rääkida mutaatoralleeli n.ö. "hitchhiking" fenomenist, kus mutaatorfenotüüp kaasneb antud olukorras bakterile kasulike mutatsioonidega.
    Üheks selliseks näiteks on Pseudomonas aeruginosa mutaatorite kõrge esinemissagedus tsüstilist fibroosi põdevatel patsientidel. Tsüstilist fibroosi põdevad patsiendid kannatavad kroonilise P. aeruginosa infektsiooni all. Kuna patsiente püütakse ravida erinevate antibiootikumidega, toimib bakteritele mitmekülgne selektsioon . 30-lt CF patsiendilt isoleeritud 128-st P. aeruginosa isolaadist olid 19,5% mutaatorfenotüübiga. Mutaatortüvesid leiti 36% patsientidest. Enamasti oli tegemist mutatsioonidega mutS geenis, kuid leiti ka mutY defektseid tüvesid.
    Hüpermutabiilsed piirkonnad geenides
    Pol IV-l puudub “proofreading” (vigu korrigeeriv) aktiivsus ning ta on võimeline jätkama DNA replikatsiooni olukorras, kus praimer ei ole DNA-ga täies ulatuses paardunud (misaligned primer/template structures). Sellega kaasneb mutatsioonisageduse tõus rakkudes – võimenduvad raaminihke mutatsioonid (1-deletsioonid, insertsioonid). Raaminihke mutatsioonid tekivad kergemini DNA regioonides, mis sisaldavad pikki mononukleotiidseid (või dinukleotiidseid) kordusi.
    Osadel patogeensetel mikroorganismidel (Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis) on kirjeldatud nähtust, kus nende bakterite infektsioonivõimet suurendavad mutatsioonid tekivad väga kõrge sagedusega teatud geenides asuvates hüpermutabiilsetes DNA kordusjärjestustes (contingency loci). Selline faasi varieeruvus (phase variation ) e. fenotüübiline ümberlülitus (phenptypic switching) on oluline just selliste bakteriaalsete infektsioonide korral, kus algne bakteripopulatsioon on väga väike ning peab limiteeritud toitainete tingimuses olema konkurentsivõimeline teiste mikroorganismidega. Samuti peab ta püsima ja suutma oma arvukust tõsta peremeesorganismis ka siis, kui organismi immuunsüsteem püüab patogeeni organismist välja tõrjuda. Sellise olelusvõitluse tingimustes ongi evolutsiooni käigus välja kujunenud molekulaarsed mehhanismid, mis võimaldavad bakteritel teatud lookuste osas lühikese aja jooksul genereerida populatsioonisiseselt suurt geneetilist varieeruvust. Kuna vastavad lookused on hüpermutabiilsed, võivad nad ka kiiresti reverteeruda, tagades bakterite teistes elutingimustes algsete lookuste taastumise.
    Mutatsioonide tulemusena muutub kas märklaudgeeni geeni järjestus või promootori tugevus. Mida suurem on nukleotiidse järjestuse korduse aste, seda kõrgem on mutatsioonisagedus. Enamasti on tegemist mutatsioonidega geenides, mis kodeerivad bakteriraku pinnal olevaid komponente, mis on märklauaks immuunsüsteemile (lipoproteiinid, lipopolüsahhariidid, adhesiinmolekulid), aga samti ka fimbriaid ja valke, mis seovad väliskeskkonnast rauda. Nii põhjustavad näiteks mutatsioonid lipopolüsahhariide kodeerivates geenides ulatuslikku antigeenset varieeruvust, võimaldamaks bakteritel end paremini kaitsta peremeesorganismi immuunvastuse eest.
    On ka näiteid, kus sedatüüpi fenotüübiliste ümberkorralduste sagedus võib olla reguleeritud keskkonnatingimuste poolt. Näiteks E. coli tüüp I fimbriate puhul on leitud, et ümberlülitused ühelt variandilt teisele, mis on bakterile vajalikud imetajate kuseteede koloniseerimisel, on mõjutatud bakterite elukeskkonna temperatuurist, toitainete kättesaadavusest, samuti osalevad protsessis mitmed globaalsed DNA-ga seonduvad valgud.
    Ajutised mutaatorid.
    Ajutiste mutaatorite olemasolule nälgivas rakupopulatsioonis viitab asjaolu, et selektiivsetes tingimustes on isoleeritud mutante, kus lisaks bakteriraku kasvu võimaldavatele mutatsioonile on tekkinud veel teisigi, antud tingimustes ebaolulisi mutatsioone. Samas ei täheldata nende mutantide puhul kõrgenenud mutatsioonisagedust.
    Mis võiks olla ajutise mutaatorfenotüübi põhjuseks statsionaarse faasi rakkudes? Arvatakse, et transkriptsiooni või translatsiooni vigade tõttu võidakse rakus sünteesida defektseid DNA reparatsiooni ensüüme või defektset DNA Pol III vigu korrigeerivat subühikut epsiloni. Teisalt on võimalus, et osades rakkudes on DNA reparatsiooniensüümide hulk selleks liiga madal, et tulla toime vigade parandamisega. Samuti võib mutaatorfenotüüp ilmneda SOS-vastuse tagajärjel. Näiteks leiti, et E. coli laktoosil nälgivatest FC40 tüve rakkudest olid 0,1% filamentsed, mis viitab neis indutseeritud SOS-vastusele. SOS vastusega kaasneb vigaderohke DNA süntees juba eelpoolmainitud DNA polümeraaside kaasabil. Nagu juba eelpool mainitud, võib nälgivas rakupopulatsioonis võib mutatsioonisagedus ajutiselt tõusta, mille põhjuseks võib olla näiteks vigutekitavate DNA polümeraaside (Pol IV, Pol V) aktiivsuse suurenemine. Kui DNA süntees muutub vigaderohkemaks, ei pruugi ka DNA reparatsioonisüsteemid vigade kõrvaldamisega toime tulla ja mutatsioonisagedus suureneb. Mis iganes on ajutise mutaatorfenotüübi põhjuseks, on see võrreldes päranduva mutaatorfenotüübiga antud rakule ja tema järglastele märksa soodsam lahendus - kaob oht, et hetkeline väljapääs olukorrast viib hiljem rakkudele kahjulike mutatsioonide akumuleerumisele.

    18. Sporulatsioon ja rakkude diferentseerumine


    Sporogeensete bakterite (Bacillus, Clostridium, Streptomyces, müksobakterid) spoorid on võimelised pikaajaliselt taluma ekstreemseid keskkonnatingimusi. Sõltuvalt organismist toimub sporulatsioonil kas individuaalsete rakkude etapiviisiline diferentseerumine spoorideks või kompleksne multitsellulaarne areng, kus spoorid arenevad ainult osadest rakkudest.
    Bacillus subtilis’e sporulatsioon
    Soodsates kasvutingimustes jagunevad B. subtilis’e rakud vegetatiivselt, kuid nälgimisel või suure rakutiheduse korral hakkavad järk-järgult toimuma morfoloogilised muutused. Rakud valmistuvad jagunema asümeetriliselt. Sporulatsioonil eristatakse erinevaid staadiume.
    Enne sporulatsiooniseptumi moodustumist (see koosneb 2-st membraanist, mille vahel on õhuke peptidoglükaani kiht) on rakud 0 – I staadiumis .
    II staadiumis eristuvad bakterirakus 2 üksust – suurem üksus, millest areneb emarakk, ja väiksem üksus, millest areneb spoor . Sporulatsiooniseptumisse moodustunud peptidoglükaankiht degradeeritakse ja membraanid liituvad.
    III staadiumi alguseks on tekkinud prespoor e. eelspoor (ingl. k. forespore), mis on emarakus ümbritsetud 2-kihilise membraaniga.
    IV staadiumis moodustub prespoori ümber korteks. Korteksi moodustumise käigus ladestub membraanide vahele peptidoglükaan.
    V – VI staadiumis toimub areneva spoori küpsemine endospooriks. Spoori ümber moodustub paks kest, mille tulemusena spoor muutub resistentseks temperatuuri ja kemikaalide suhtes. Bioloogilised protsessid spooris soikuvad, kuid selline spoor on soodsates tingimustes võimeline idanema.
    VII staadiumis emarakk lüüsub ja tugevalt dehüdreerunud spoor vabaneb.
    Igas sporulatsiooni staadiumis avalduvad kindlad geenid.

    Sporulatsiooni initsiatsiooni kontroll


    Sporulatsiooni-spetsiifiliste geenide avaldumist kontrollivad regulaatorvalgud, mis toimivad vastusena teatud signaalidele:
  • Toitainete ammendumine. Kergesti metaboliseeritavate C- ja N-allikate ammendumise tõttu kasvukeskkonnast langeb rakkudes GTP tase. Kuna GTP sünteesi inhibeerimine indutseerib sporulatsiooni ka sel juhul, kui rakkudel on piisavalt toitaineid, peetakse just GTP kontsentratsiooni langust üheks sporulatsiooni stimuleerivaks signaaliks. Arvatavasti muutub rakus GTP hulga vähenemisel spetsiifilise regulaatorvalgu aktiivsus.
  • Rakkude tihedus. Sporuleerumine sõltub rakukultuuri tihedusest. Väikese tiheduse korral ei aita isegi näljutamine. Sporulatsiooni indutseerivad ekstratsellulaarsed faktorid, mida produtseerivad hilises eksponentsiaalses faasis sporuleeruma hakkavad rakud. Kui viia rakud hõredast rakukultuurist tiheda rakukultuuri filtraati , hakkavad ka need sporuleeruma. Seega ilmneb sporuleerumisel “quorum sensing” e. hulgatunnetuse efekt. Rakud produtseerivad väliskeskkonda teatud autoinduktormolekule, mis toimivad alates teatavast lävikontsentratsioonist. Mida tihedam on rakukultuur, seda kõrgem on autoinduktori kontsentratsioon.
  • DNA süntees. DNA süntees on obligatoorne emaraku ja spoori kromosoomi tekkeks. Kui DNA süntees inhibeerida, pärsitakse sporulatsiooni varajasel etapil avalduvad geenid.
    Eelpoolkirjeldatud 3-st signaalist saab alguse fosforüleerimise kaskaad, mis toimub Spo0 signaalse transduktsiooni raja kaudu. See signaali ülekandesüsteem koosneb Spo0A, Spo0F ja Spo0B valkudest. Spo0F on märklauaks histidiini proteiini kinaasidele KinA ja KinB. Fosforüleeritud Spo0F kannab fosfaadi edasi proteiini fosfotransferaasile Spo0B, mis omakorda fosforüleerib globaalse transkriptsiooniregulaatori Spo0A aspartaadi. Fosforüleeritud Spo0A (Spo0A-P) võib toimida nii transkriptsiooni aktivaatorina kui ka repressorina:
  • Spo0A-P represseerib geenid, mis suruvad maha sporulatsiooni tekke. Siia rühma kuulub AbrB repressor, mis pärsib paljude nälgimisel ja sporulatsioonil avalduvate geenide transkriptsiooni. AbrB represseerib ka sigma faktori H transkriptsiooni. H kontrollib paljude geenide transkriptsiooni, mis aktiveeritakse sporulatsiooni stimuleerimisel ning osaleb ka transkriptsiooni aktivatsioonil ühelt spo0A promootoritest.
  • Spo0A-P aktiveerib otseselt transkriptsiooni SpoIIA ja SpoIIG operonidelt, mis on vajalikud raku diferentseerumisel üksusteks, millest kujunevad emarakk ja prespoor. Diferentseerumisel moodustub sporulatsiooniseptum. Septumi moodustumise asukohta koguneb rakujagunemise initsiaatorvalk FtsZ.

    Sporulatsiooni erinevatel staadiumidel avalduvad sigma faktorid


    B. subtilis’e põhiline sigma faktor (E. coli 70 analoog) on A. Sporulatsiooni-spetsiifiliste geenide avaldumist kontrollivad sigma faktorid on σE, σF, σG ja σK. Sporulatsiooni erinevatel etappidel ekspresseeruvad erinevad sigma faktorid. Sporulatsioonis osalevate geenide avaldumine on kontrollitud nii ajaliselt kui ka ruumiliselt:
  • Faktorid σE ja σK on seotud emaraku varajaste ja hiliste geenide avaldumisega
  • Faktorid σF ja σG kontrollivad varajasi ja hiliseid prespooris avalduvaid geene.
    Üldse on B. subtilis’el kirjeldatud 9 erinevat sigma faktorit.
    Faktorid σA (põhiline sigma faktor), σB (üldine stressi sigma faktor), σC (?) ja σD (rakkude liikumisorganid) on seotud rakkude vegetatiivse kasvuga ning eelpoolmainitud H ekspressioon kaasneb regulatoorsete ümberkorraldustega, mis ilmnevad sporulatsiooni induktsioonil.
    Sporulatsiooni varajaste geenide avaldumine
    Prespooris avalduv sigma faktor σF on kodeeritud Spo0A-P poolt aktiveeritava SpoIIA operoni viimase geeni spoIIAC poolt. Sellele geenile eelnevate geenide spoIIAA ja spoIIAB produktid kontrollivad σF aktiivsust. SpoIIAB on anti-sigma faktor, mis inaktiveerib σF-i. SpoIIAB võib siduda nii ATP-d kui ka ADP-d. σF-iga seondub SpoIIAB-ATP, SpoIIAB-ADP seondub aga eelistatult SpoIIAA-ga. Seega sõltub σF-i aktiivsus ATP/ADP suhtest prespooris.
    Emarakus avalduv spoIIG operon sisaldab kahte geeni, spoIIGA, mis kodeerib membraan-seoselist proteaasi ja spoIIGB, mis kodeerib σE prekursorit. σE aktiveeritakse proteaasi poolt vahetult pärast septumi moodustumist. σE protsessingu käivitab prespooris avalduva σF poolt kontrollitud SpoIIR ning SpoIIGA proteaas lõikab σE prekursori N-terminusest maha 27 aminohapet.
    Sporulatsiooni hiliste geenide avaldumine
    σF-i ekspressiooni tagajärjel transkribeeritakse geeni spoIIIG, mis kodeerib prespoori-spetsiifilist sigma faktorit σG. σG aktiivsus on samuti SpoIIAB poolt kontrollitud. Lisaks aktiveerib teda σE poolt kontrollitav hüpoteetiline faktor Y.
    σK ekspressiooni kontrollitakse nii transkriptsiooni, sait-spetsiifilise rekombinatsiooni kui ka valgu protsessingu kaudu. σE aktiveerib transkriptsiooni aktivaatori spoIIID transkriptsiooni. SpoIIID omakorda aktiveerib σE-sõltuva spoIVCB geeni transkriptsiooni, mis kodeerib σK N-terminaalset segmenti . Samas operonis sisalduv geen spoIVCA kodeerib sait-spetsiifilist rekombinaasi. σK C-terminaalne osa on kodeeritud spoIIIC geeni poolt, mis paikneb sigma faktori N-terminaalset poolt kodeerivast geenist 42 kb kaugusel. Sait-spetsiifiline rekombinaas katalüüsib nende 2 regiooni liitumist geeniks sigK. Rekombinatsiooni käigus deleteerub vahepealne 42 kb-pikkune DNA lõik. sigK kodeerib prekursorvalku, mis protsessitakse aktiivseks valguks. Seejärel aktiveeritakse σK moduloni geenid, millest paljud on seotud spoori kesta sünteesiga.
    Streptomyces’e sporulatsioon
    Perekonda Streptomyces kuuluvad bakterid kuuluvad aktinomütseetide gruppi. Need graampositiivsed mullas elavad bakterid moodustavad hargnevaid niidistikke e. mütseeliume. Streptomütseetide puhul toimub kompleksne multitsellulaarne diferentseerumine, millel 2 faasi:
  • Vegetatiivne mütseeliumi kasv optimaalsetes tingimustes;
  • Reproduktiivne mütseeliumi kasv nälgimise korral.
    Reproduktiivsel kasvamisel mütseelium diferentseerub – niidistiku pinnalt kasvavad välja õhu kätte ulatuvad spoore moodustuvad struktuurid, mida nimetatakse sporangiumiks. Sporangiumiks spetsialiseerunud hüüfid võivad koosneda pikkadest, 50 või enamat spoori moodustavast rakkudeahelast. Diferentseerumise käigus produtseerivad streptomütseedid sekundaarseid metaboliite, milleks on enamasti mitmesugused antibiootikumid.

    Streptomütseetide diferentseerumise regulatsioon


    Streptomütseetide mütseeliumi reproduktiivne diferentseerumine toimub vastusena toitainete näljale. Diferentseerumist indutseerivad mitmed erinevad signaalid.
  • Metaboolsete signaalidena toimivad nii GTP kontsentratsiooni langus kui ka ppGpp kontsentratsiooni tõus rakkudes, kusjuures GTP kontsentratsiooni muutus on otsesema toimega kui ppGpp hulga muutus.
  • Autoregulatoorsed faktorid. Osa streptomütseete produtseerivad difundeeruvaid faktoreid, mis indutseerivad sporulatsiooni juba väga madalal kontsentratsioonil. Neid faktoreid nimetatakse bakteriaalseteks feromoonideks. Üheks selliseks feromooniks on A-faktor (2-isokaprüloüül-3R-hüdroksümetüül -butüroollaktoon). A-faktori sünteesiga kaasneb ka streptomütsiini sünteesi induktsioon. Kui streptomütsiini produktsioon on jõudnud maksimaalsele tasemele, A-faktorit enam ei sünteesita. A-faktor seondub spetsiifilise repressorvalguga, mis kontrollib sporulatsiooni ja streptomütsiini biosünteesi geenide transkriptsiooni. Selle tulemusena kaotab repressor võime seonduda DNA-ga ja tema poolt pärsitud geenid aktiveeruvad. Lisaks A-faktorile sünteesitakse ka teisi autoregulatsoorseid faktoreid nagu B-faktor (sarnaneb struktuurselt cAMP-le) ja panamütsiin (seente ja bakterite vastase toimega makroliidide segu, mis madalal kontsentratsioonil indutseerib sporangiumi teket).
  • SapB valk (small aerial mycelium protein). SapB assotsieerub S. coelicolor’i spoorideks diferentseeruvate rakkude pinnaga ja toimib diferentseerumise ekstratsellulaarse induktorina.
    Streptomütseetide sporulatsiooniga seotud geenide identifitseerimisel on kirjeldatud terve rida mutante.
  • bld ( bald ) mutandid – spoore moodustavat mütseeliumi ei arene ja spoore ei teki;
  • whi (white) – moodustub küll spoorideks diferentseeruv mütseelium, kuid erinevalt metsiktüüpi bakteritest spoorid ei pigmenteeru.
    Myxococcus xanthus’e multitsellulaarne diferentseerumine
    Myxococcus xanthus on graamnegatiivne mullabakter. Tänu ekstratsellulaarsetele hüdrolüütilistele ensüümidele on ta võimeline toiduks kasutama mittelahustuvat orgaanilist materjali. Ekstratsellulaarsete ensüümide kontsentratsioon tõuseb tänu rakupopulatsiooni suurele tihedusele ning see omakorda soodustab rakkude kasvu. Sellisel kollektiivsel toitumisel hakkavad rakud diferentseeruma ning moodustavad viljakeha (fruiting body ).

    Viljakeha teket indutseerivad signaalid


    Rakutiheduse tõusuga jääb toitaineid (eeskätt aminohappeid) väheseks ja see on signaaliks viljakeha moodustumisele. Viljakeha on enamasti 0,2 mm kõrgune ning koosneb ligikaudu 100000-st rakust. Diferentseerumise algstaadiumil (esimese 4 tunni jooksul), kui rakkude kasv aeglustub ja rakutihedus on kõrge, rakud agregeeruvad. 12 tunni pärast hakkab tekkima elliptiline või ümar kuhil. 24-ks tunniks on osa rakke kuhilas diferentseerunud spoorideks, osa aga lüüsunud. Diferentseerumise käigus sünteesitakse vähemalt 30 uut valku.
    Multitsellulaarse diferentseerumise käigus produtseerivad rakud ekstratsellulaarseid signaale. Isoleeritud on 4 mutantide klassi, mille diferentseerumine peatub erinevatel etappidel. Kõige paremini on iseloomustatud asg ja csg mutante.
    asg geenid vastutavad A-signaalmolekulide sünteesi eest. Need erinevad streptomütseetide puhul kirjeldatud A-faktorist. A-signaalmolekulid jaotuvad temperatuuristabiilseks ja temperatuuritundlikuks fraktsiooniks. Temperatuuristabiilne fraktsioon koosneb aminohapetest proliin, türosiin, fenüülalaniin, trüptofaan, leutsiin , isoleutsiin ja alaniin ning polüpeptiididest, mis koosnevad eeskätt just neist aminohapetest. Temperatuuritundlik fraktsioon sisaldab vähemalt kahte ebaspetsiifilist proteaasi. Arvatavasti on ekstratsellulaarsed aminohapped ja lühikesed peptiidid saadud just tänu nendele proteaasidele. Alates teatavast A-signaalmolekulide kontsentratsioonist on diferentseerumine pärsitud. Kui nende kontsentratsioon langeb aga alla kriitilise piiri, indutseeritakse viljakeha arenemine.
    csg geen kodeerib C-faktorit, milleks on 17 kDa-suurune valk. See valk moduleerib vähemalt 50 rakkude liikumise, agregeerumise ja morfogeneesiga seotud geeni transkriptsiooni. C-signaal on vajalik rakkude agregeerumise lõpuleviimiseks ja sporulatsiooni initsiatsiooniks.
    Diferentseerumise käigus toimuva signaalse transduktsiooni kaskaadis osalevad treoniin /seriin kinaasid , mis sarnanevad eukarüootidest leitud kinaasidele.

    19. Kemotaksis


    Enamus bakterirakke on liikumisvõimelised, nad liiguvad atraktandi suunas ja eemalduvad ebasoodsatest signaalidest. Liikumist e. taksist stimuleerivad kas teatavad lahustunud ained (kemotaksis), hapnik (aerotaksis), osmootne rõhk (osmotaksis), valgus (fototaksis), temperatuurimuutused (termotaksis), mehhaanilised stiimulid (tigmotaksis), elektrivool (galvanotaksis) või magnetväli (magnetotaksis). Bakterirakud liiguvad kas viburite abil (enamus graampositiivseid ja graamnegatiivseid baktereid) või libisevad tahkel pinnal (müksobakterid, fototroofsed tsüanobakterid).
    Viburite abil liikumisel pöörlevad viburid kas päripäeva (CW, clockwise) või vastupäeva (CCW, counter clockwise). Stiimulite puudumisel on bakteriraku liikumine kaootiline . Viburite pöörlemissuund vahetub perioodiliselt. E. coli puhul on täheldatud näiteks 1-sekundilist perioodi, kus viburid pöörlevad vastupäeva. Sel juhul liigub rakk ühes suunas 30 m edasi (see on ligikaudu 10 rakupikkust), millele järgneb viburite pöörlemine päripäeva (0,1 sekundit), kus rakk tõmbleb ühe koha peal (ingl. k. “tumbling”), kuna iga vibur lükkab rakku erinevas suunas. Tõmblemise tulemusena muutub raku ujumissuund ligikaudu 60. Seega on raku liikumise trajektoor sik-sakiline. Kui rakkude kasvukeskkonda satub näiteks keemiline ühend, mis toimib kemoatraktandina, ujuvad bakterirakud selle kontsentratsioonigradiendi suunas. Ühesuunalise liikumise teeb võimalikuks CCW perioodide pikenemine viburite CW suunas pöörlemise blokeerimise arvelt.

    Signaalse transduktsiooni rajad, mis kontrollivad bakterite kemotaksist


    Enterobakteritel on kirjeldatud 3 üksteisest sõltumatut signaalse transduktsiooni rada ja spetsiifilist kemosensorit:
  • metüülirühma aktsepteerivad (methyl-accepting) kemotaksise valgud e. MCP valgud;
  • fosfotransferaasi süsteemi (PTS) valgud Ensüüm I ja Hpr ning Ensüümid II;
  • hingamisahela ja elektron-aktseptorahela komponendid (tsütokroomid, tsütokroomi oksüdaasid).
    Kemotaksise suhtes defektseid mutante on võimalik isoleerida spetsiaalsetel söötmetel, kus Petri tassi valatud tardsöötme agari kontsentratsioon on madal (0,25%). Sööde sisaldab väga väikeses koguses (mikromolaarsetes kogustes ) C-allikana kasutatavat kemoatraktanti. Kui viia ühte punkti söötme pinnale väike kogus (ligikaudu 107) rakke, kasutavad need lokaalse C-allika ära ning liiguvad seejärel edasi atraktandi kõrgema kontsentratsiooni suunas. Seal rakud paljunevad, kasutavad ära C-allika ning liiguvad jälle edasi. Nii moodustuvad rakkudest söötmele kontsentrilised ringid . Mutandid, mis ei ole võimelised kas liikuma või detekteerima kemoatraktanti, jäävad söötmel algsesse inokuleerimise kohta, moodustades seal väikese, teravalt piiritletud koloonia.
    MCP valkude kaudu kontrollitud kemotaksis enterobakteritel
    Mutante, mille viburid pöörlevad ainult ühes suunas ja ei ole mõjutatavad kemotaksise stiimulite kaudu, on hakatud tähistama Che- mutantidena (non-chemotactic mutants). Selle rühma mutandid on enamasti defektsed Che valkude CheA, CheW , CheY või CheZ suhtes. MCP-sõltuva kemotaksise response-regulaatoriks on fosforüleeritud CheY, mis seondub viburi mootorile, pannes selle pöörlema päripäeva. Selle tulemusena tõmblevad rakud ühe koha peal. Ülejäänud Che valgud osalevad kas otseselt või kaudselt signaalse transduktsiooni rajas, mis moduleerib CheY fosforüleerimist. Viburi mootor on suur makromolekulaarne kompleks, mis koosneb Mot valkude poolt ümbritsetud basaalsest struktuurist, kuhu kinnituvad flagelliini filamendid. Selle struktuuriga on perifeerselt assotsieerunud Fli valgud, mille kaudu toimub pöörlemise lülitamine CW suunalt CCW suunale ja vastupidi. Fosforüleeritud CheY interakteerub FliM-ga ning vibur hakkab pöörlema CW suunas.
    Rakkude ärritus
    MCP retseptorvalgu C-terminaalne tsütoplasmaatiline domeen interakteerub adaptervalguga CheW, mis omakorda moduleerib histidiini proteiini kinaasi CheA. CheA fosforüleerib nii CheY kui ka CheB. CheY-l on autofosfataasi aktiivsus, mistõttu ta jääb fosforüleerituks ainult lühiajaliselt. CheY defosforüleerimist kiirendab CheZ. Kemoatraktandi seondumisel retseptorvalguga ei interakteeru retseptorvalk adaptervalguga CheW ning signaali ülekannet CheY fosforüleerimiseks ei toimu. Seega, kui kemoatraktandi kontsentratsioon tõuseb, viib see alla CheY fosforüleerimise taseme ning viburid pöörlevad vastupäeva (CCW suunas), võimaldades rakkude suunatud liikumist. Juhul, kui rakk puutub aga kokku negatiivse stiimuliga või kui positiivne kemoatraktant dissotseerub, käivitub signaalse trasduktsiooni rada, mille tulemusena CheY fosforüleeritakse ning viburite pöörlemine lülitub päripäeva suunale (CW suunale).
    Rakkude adapteerumine
    Transmembraansed retseptorvalgud (MCP valgud) on pöörduvalt metüleeritavad. Nende tsütoplasmaatiline domeen on metüleeritav metüültransferaasi CheR poolt ja demetüleeritav fosforüleeritud metüülesteraasi CheB poolt. Metüleeritakse 4 glutamaadi jääki, mis asuvad polüpeptiidi periplasmaatilist retseptor -domeeni (input domeen) tsütoplasmaatilise transmitter-domeeniga (output domeen) ühendava linkerala läheduses. CheR kannab metüülgrupi S-adenosüülmetioniinilt (SAM) glutamaadile. Fosforüleeritud CheB, mis käitub metüülesteraasina, hüdrolüüsib metüülrühmad. CheR ja CheB suhteline aktiivsus määrab MCP valkude metüleerituse taseme. Kuna CheR-i aktiivsus püsib rakus muutumatuna, siis mõjutab MCP valkude metülatsiooni taset põhiliselt CheB aktiivsuse fluktueerumine. Stiimuli puudumisel on ainult pooled saitidest metüleeritud. Positiivsed stiimulid inhibeerivad CheA ning sellest tulenevalt ei aktiveerita ka CheB-d, mis fosforüleeritult demetüleeriks retseptorvalgu. Samas toimub valgu pidev metüleerimine CheR-i poolt. Seega metüleeritakse positiivse stimulatsiooni korral enamus saite. Negatiivse stimulatsiooni puhul on aga ainult vähesed saidid metüleeritud, kuna sel juhul on CheB aktiveeritud.
    MCP valkude metüleerimisega kaasneb rakkude adapteerumine. Kui MCP retseptorvalk on metüleeritud, väheneb selle afiinsus atraktandile. MCP valkude metüleerimine kutsub esile vastupidise efekti kemoatraktandi seondumisele – see soodustab CheA autofosforüleerumist ning viburite pöörlemine lülitub CCW suunalt CW suunale. Selleks, et laguneks retseptori kompleks CheW ja CheA-ga, nii et viburid hakkaksid uuesti pöörlema CCW suunas, on vaja kõrgemat atraktandi kontsentratsiooni. Seega võimaldab adapteerumine rakkudel otsustada, kas liikuda suunatult edasi või püsida paigal. Kui atraktandi kontsentratsioon keskkonnas langeb, toimub retseptorvalgu demetülatsioon fosforüleeritud CheB abil ning retseptor muutub tundlikumaks madalama atraktandi kontsentratsiooni suhtes. See omakorda võimaldab jällegi destabiliseerida retseptori kompleksi CheW ja CheA-ga, CheY-t ei fosforüleerita ning viburid pöörlevad jälle CCW suunas, võimaldades rakul edasi liikuda.
    PTS kaudu kontrollitud kemotaksis
    PTS substraadid (näiteks glükoos) transporditakse rakku ja fosforüleeritakse Ensüüm II (EII) poolt. Selle tulemusena defosforüleeritakse Ensüüm I (EI). Defosforüleeritud EI akumuleerumine inhibeerib kinaasi CheA autofosforüleerimise, langeb fosforüleeritud CheY tase ning rakul tekib positiivne kemotaksise vastus.
    ETA-sõltuv taksis
    Elektrontransport ahela ETA-sõltuva taksise näitena võib tuua aerotaksise hapniku suhtes. Taksis elektronaktseptorite suhtes vajab lisaks spetsiifilistele MCP valkudele ja tsentraalsetele CheA, CheW ja CheY valkudele sensorina ka hingamisahela komponente. Kui E. coli rakud kasvavad anaeroobsetes tingimustes, kasutades elektronaktseptorina nitraati , liiguvad rakud suunas, kus on nitraati ja madalas kontsentratsioonis hapnikku. Rakkude aeroobse kasvu korral kaotavad nad aga huvi nitraadi suhtes, küll aga säilub neil aerotaksis hapniku suhtes. Paljud obligatoorsed anaeroobid väldivad hapnikku-sisaldavat keskkonda. Hapniku kõrge kontsentratsioon võib eemale tõugata ka paljusid fakultatiivseid anaeroobe ja rangeid anaeroobe. Seega hoiab ETA-sõltuv taksis bakterirakke keskkonnas, mis on neile energia tootmise seisukohalt optimaalne.
    Kemotaksise mehhanismid erinevatel bakteriliikidel
    Eespool toodud detailne ülevaade MCP valkudest sõltuvast kemotaksisest põhineb mehhanismidel, mida on kirjeldatud E. coli puhul. Kuigi CheA ja CheY ekvivalendid on leitud ka graampositiivsetel bakteritel, näiteks B. subtilis’el, toimib süsteem vastupidiselt E. coli’s kirjeldatule. B. subtilis’e puhul positiivsed signaalid mitte ei inhibeeri vaid aktiveerivad CheA. Selle tulemusena lülitab fosforüleeritud CheY viburi mootori pöörlema CCW suunas. Rakkude adapteerumisel positiivsele stiimulile kantakse metüülrühm MCP valkudelt üle hüpoteetilisele regulaatorvalgule ning võimalik, et ka viburi mootori valkudele.
    Bakteril Rhodobacter sphaeroides on ainult üks vibur, mis võimaldab rakul kas liikuda või paigal püsida. Kui limiteeriva kasvusubstraadi kontsentratsioon tõuseb, kiireneb viburi pöörlemine ja selle tulemusena ujub rakk kiiremini. Ligimeelitavana toimivad kõik metaboliseeritavad ühendid. Stiimulile reageerivad valgud on analoogilised E. coli MCP ja Che valkudele.
    Myxococcus xanthos’e rakud liiguvad tahketel pindadel libisedes. Kui toitaineid on rikkalikult, liiguvad üksikud rakud eraldi või väikestes gruppides. Sel juhul on neil aktiveeritud liikumist kontrolliv süsteem A (tuleneb inglisekeelsest sõnast “adventurous”). Kui toitained kasvukeskkonnast ammenduvad , moodustub rakkudest viljakeha ning rakkude liikumine lülitub ümber süsteemile S (sõnast “social”). Rakud libisevad aeglaselt, 2-4 m minutis) ja pöörduvad vastassuunalisele liikumisele iga 7-8 minuti tagant. Ka müksobakteritel on leitud MCP ja Che valkude analooge.
    3
    • .DOC Laadi alla originaalfail 91 lk · .doc · 85 allalaadimist
    Vasakule Paremale
    Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #1 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #2 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #3 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #4 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #5 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #6 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #7 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #8 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #9 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #10 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #11 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #12 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #13 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #14 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #15 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #16 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #17 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #18 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #19 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #20 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #21 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #22 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #23 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #24 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #25 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #26 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #27 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #28 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #29 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #30 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #31 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #32 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #33 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #34 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #35 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #36 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #37 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #38 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #39 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #40 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #41 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #42 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #43 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #44 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #45 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #46 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #47 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #48 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #49 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #50 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #51 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #52 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #53 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #54 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #55 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #56 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #57 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #58 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #59 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #60 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #61 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #62 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #63 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #64 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #65 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #66 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #67 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #68 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #69 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #70 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #71 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #72 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #73 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #74 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #75 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #76 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #77 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #78 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #79 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #80 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #81 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #82 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #83 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #84 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #85 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #86 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #87 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #88 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #89 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #90 Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid #91
    Punktid 50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.
    Leheküljed ~ 91 lehte Lehekülgede arv dokumendis
    Aeg2009-02-14 Kuupäev, millal dokument üles laeti
    Allalaadimisi 85 laadimist Kokku alla laetud
    Kommentaarid 0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid
    Autor mary-liz Õppematerjali autor
    Kontrollitud
    PDF TXT
    Põhjalik
    mikrobiolooga

    Sarnased õppematerjalid

    Eksam molekulaarbioloogia
    37
    doc

    Eksam molekulaarbioloogia

    aitavad kõrvaldada mRNA 3' otsast juuksenõelastruktuure. RNaas E on üks põhilisi mRNA degradatsioonil osalevaid endoribonukleaase. See ttunneb ära spetsiifilisi sekundaarstruktuure, kuid lõikab nende kõrvalt üksikahelalist RNA-d, mille puhul on erinevate mRNA-de degradatsiooni uurides pakutud välja erinevaid konsensusjärjestusi. RNA I 5' otsas olev juuksenõelastruktuur stabiliseerib RNA-d, kuid 5 mittepaardunud, nt enne seda sruktuuri, on destabiliseeriva toimega, võimaldades RNaas E-l mRNA 5' otsale seonduda ja RNA-d lõigata. Olulised on nii mRNA primaarjärjestus kui ka sekundaarstruktuurid. mRNA stabiilsust mõjutavad järjestused Sekundaarstruktuuride mRNA-d protekteeriv toime ei ole universaalne, vaid sõltub iga konkreetse mRNA atakeeritavate saitide kontekstist ja sellest, millised nukleaasid seda mRNA-d veel atakeerivad. UTR järjestused

    Molekulaarbioloogia
    Mikroobifusioloogia
    147
    docx

    Mikroobifusioloogia

    4Mikroobifüsioloogia LOMR.03.022 Riho Teras Sisukord 1. Bakterite kasv ja toitumine................................................................................ 4 1.1. Bakterite kasvatamine laboritingimustes.....................................................4 1.2. Elutegevuseks vajalikud elemendid.............................................................7 1.3. Söötmed bakterite kasvatamiseks laboris....................................................9 1.4. Füüsikalis-keemilised tegurid, mis mõjutavad bakterite kasvu...................10 2

    Mikroobifüsioloogia
    Nimetu
    23
    docx

    Nimetu

    Kordamisküsimused MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA EKSAM 2011 KEEMILINE SIDE 1. Keemilise sideme tüübid (kovalentne, mitte-kovalentne ­ vesinik-, ioon-, van der Waalsi ja hüdrofoobne side). Keemilise sideme omadused. Sideme energia, pikkus, küllastatavus, suund. 2. Miks vesi on hea lahusti (solvent)? Sest moodustuvad vesiniksidemed. 3. Termodünaamika II seadus. Isoleeritud süsteemis kulgevad kõik protsessid entroopia kasvu suunas. 4. Mis on kiraalsus ja kuidas seda kasutab loodus? Üks asümmeetriline aatom on kovalentselt seotud nelja erineva aatomi või rühmaga; enamik suhkruid on D isomeerid, aminohapped L isomeerid, ka ensüümid on kiraalsed. ravimitööstus? Sünteesitakse ravimühendte enantiomeere, mida ensüümid seoksid ning millel oleks vajalik toime. Tihti omab bioloogilist aktiivsust vaid üks isomeer ning ravimitööstuses kasutatakse seda bioloogiliselt aktiivsemate ainete saamiseks, looduses mitmekesisuse tõstmiseks. Valkude D-

    Kategoriseerimata
    Molekulaarbioloogia
    194
    docx

    Molekulaarbioloogia

    aga mõlema geeni produktid reguleeritud ühise kontrolljärjestuse poolt. Geenide kattumine esineb prokarüootides (mRNA tasemel ja DNA tasemel) – erinevate mRNA molekulide süntees. Eriti oluline viirustel. Geenide aktiivsuse regulatsiooni tasemed: 1) transkriptsioon – kõige olulisem (!), RNA sünteesi reguleerivad valgud ja neid mõjutavad faktorid 2) RNA protsessimine ja transport. Aktiivne protsess ja väga täpselt kontrollitud 3) mRNA lagundamine - mRNA eluiga on oluline. Kui seda ei lagundata, siis saab tema arvelt sünteesida palju komponente. Valk titiin (kõikidel selgroogsetel olemas) – vajatakse varajases embrüonaalses arengus, esimest korda vajatakse blastulas. Sünkroonjagunemine toimub kiiremini (valk valgus sünteesitakse), mRNA jõutakse valmis sünteesida ja rakku transportida, aga ei jõuta lõpuni transleerida. Titiini molekul ise on väga pikk (mitukümmend AH pikk) - jääb titiin poolikuks, sest mRNA 3

    Bioloogia
    Rakubioloogia II
    94
    docx

    Rakubioloogia II

    seotakse ligaasi poolt. DNA liider- ja viivisahela sünteesi alustamine. Prereplikatiivses kompleksis asuvate alguspunkti äratundva kompleksi ja helikaaside fosforüülimine kui replikatsiooni algatamise eeltingimus eukarüootides. Raku G1 faasis tekib prereplikatiivne kompleks replikatsiooni origin punkti.See tagab selle, et igat replikatsiooni alguspunkti aktiveeritakse ainult üks kord rakutsükli jooksul. Uut kompleksi ei saa enne tekkida, kui rakk on uusti G1 faasis ja origin recognition complex (ORC) on defosforüleeritud S faasis toimub replikatsioon. DNA topoisomeraas I osa DNA kaksikheeliksi keerdumise ärahoidmises replikatsiooni protsessis Topoisomeraas I katksetab eukarüootide DNA ühe ajelaajutiselt,selleks, et vältida ahelakeerdumist. Topoisomeraasi aktiivsaidison türosiin.Kovalentselt seodub DNA fosfaadiga lõhkudes fosfodiestersideme. DNA ahel on nüüd võimeline ennas pöörama keerust lahti.

    Rakubioloogia
    Molekulaarbioloogia teise KT vastused
    8
    doc

    Molekulaarbioloogia teise KT vastused

    valgu süntees. (RNA alusel valgu süntees tsütoplasmas paiknevatel ribosoomidel.) Translatsiooniprotsess loob geneetilise koodi ehk vastavuse mRNAde nukleotiidahelate ja valkude polüpeptiidahelate vahel. 2. Initsiatsioon prokarüootidel: transkriptsioon algab sellega, et protsessi läbiviiv ensüüm RNA polümeraas kinnitub struktuurgeenide ees asuvas promootoris sisalduvatele transkriptsiooni algussignaalidele. RNA polümeraas ei vaja transkriptsiooni initsiatsiooniks praimerjärjestust nagu seda vajas DNA polümeraas. Promootori piirkonnas, 10np transkriptsiooni alguspunktist eespool, on kindel järjestus ­ TATAAT -, mis on tuntud Pribnow box'i nime all. Sellel järjestusel kinnitub RNA polümeraas DNA-le ja oletatakse, et selles kohas avatakse DNA kaksikahel nii, et DNA matriitsahelal oleks võimalik seostuda RNA nukleotiidiga. Kuna pribnow box'i ala on A : T paaride rikas, on seal kergem ahelaid denatureerida

    Molekulaar - ja rakubioloogia loengud
    Rakubioloogia II kordamisküsimused
    49
    docx

    Rakubioloogia II kordamisküsimused

    struktuur Külgmised struktuurid – ulatuvad tsütosooli või nukleoplasmasse Korv – sisemine ja välimine membraan moodustavad transmembraanse rõngasja struktuuri, mis on seotud südamikkarkassiga, milles on sisemise ja välimise ringi elemendid Tsütoplasma poolsed filamendid – sisemise ja välimise ringi struktuurid ehk FG tuumaporiinid ja kiud Nukleoporiinid: 1) välimise transmembraanse rõnga nukleoporiinid (tuumapoori seestpoolt ringina ümbritsevad ja seda läbivad nukleoporiinid); 2) südamiku tellingnukleoporiinid (sisemise ja välimise rõnga nukleoporiinid) 3) FG-nukleoporiinid (kesksed ning tsütoplasma- ja tuumaplasmapoolsed tuumaporiinid), mille pikad väljaulatuvad osad sisaldavad hüdrofiilseid aminohappejärjestusi ja hüdrofoobseid fenüülalaniini (F) ja glütsiini (G) FG-kordusi 4. Tuuma ja tsütoplasma vaheline ainete transport: passiivne, aktiivne

    Rakubioloogia
    Geneetika eksam
    69
    pdf

    Geneetika eksam

    Geneetika 2 kordamisküsimused Lisaks tekstile ja õpikule vaadake kindlasti ka materjali slaididelt. 1. Võrrelge lüütilq aaise ja mõõduka bakteriofaagi paljunemistsüklit VIRULENTSED FAAGID – põhjustavad peremeesraku surma MÕÕDUKAD FAAGID – võivad püsida rakus ilma seda hävitamata o Lüütiline ja lüsogeenne fvgvb89htsükkel. Lüsogeenne tsükkel võib keskkonnatingimuste muutudes üle minna lüütiliseks tsükliks Lüütiline​: kinnitub peremeesrakule antiretseptori vahendusel; genoom sisestatakse rakku, tehakse palju DNA/RNA koopiaid, viiruspartiklid pannakse kokku, rakk lüüsitakse Lüsogeenne​: kinnitub peremeesrakule antiretseptori vahendusel; genoom sisestatakse

    Kategoriseerimata


    Rohkem sarnaseid



    Kommentaarid (0)

    Kommentaarid sellele materjalile puuduvad. Ole esimene ja kommenteeri



    Kõik kommentaarid



    Info
    K & V
    Mäng
    Eraõpetajad
    Meist
    Kuidas saada punkte?
    KKK
    Reklaam
    Uudistevoog
    Sitemap
    Kontakt
    Saada kiri
    kiri@annaabi.ee
    Telefon: +372-569-80010
    Aadress: Tiskrevälja 33, Tallinn
    OÜ LOLSOL. Registrikood: 11450433
    Kasutustingimused
    Privaatsustingimused
    Sõnastikud
    Inglise Soome Saksa Vene Hispaania Prantsuse Rootsi Itaalia Ladina Taani Esperanto
    Püsiühendus(es)
    Facebook Instagram Twitter Reddit
    Sellel veebilehel kasutatakse küpsiseid. Kasutamist jätkates nõustute küpsiste ja veebilehe üldtingimustega Nõustun