Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21. Võtsin 21 kaliibritud katseklaasi Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi
või katalüüsi käigus tekkivaid negatiivseid laenguid. Metalli ioonide teiseks rolliks on genereerida võimsaid nukleofiile neutraalse pH juuures. Ensüüme mis seovad metalli tugevalt ja vajavad neid stabiilse natiivse komformatsiooni säilitamiseks nimetatakse metalloensüümideks. Ensüüme mis seovad metalle nõrgalt ning ainult katalüütilise tsükli käigus nimetatakse metall- aktiveeritud ensüümideks. 4. Näiteid erinevate ensüümide katalüüsimehhanismidest: aspartaat-proteaasid, lüsotsüüm. Aspartaat-proteaasid · Sisaldavad kahte Asp jääki aktiivtsentris · Aktiivsed happelises keskkonnas · Lõikavad peptiidsidet eelistatult kahe hüdrofoobse jäägi vahelt · Kaks Asp jäätik töötavad koos üldiste hape-alus katalüsaatoritena · Ühel Asp jägil on madal pKa, teisel kõrge pKa · Deprotoneeritud Asp toimib nagu üldine alus, võttes vastu HOH prootoni ning
NB! Õhk ei tohi tungida geelikihti! 4. Kasutan kalibreeritud mõõtpipetti ja viin 1 ml uuritavat proovi kolonni. 5. Lasen proovil tilkuda geeli pinnale nii, et see jaotuks seal võimalikult ühtlaselt. NB! Samal ajal on väljavooluava suletud! Praktikumis uuritavas ainete segus on kõik ained värvilised ja segu komponentide lahutamine on visuaalselt jälgitav. Uuritava segu sisaldus: dekstraansinine + müoglobiin + DNP-aspartaat KOLONNI VOOLUTAMINE: 1. Avan väljavoolu kolonnist 2. Hakkan koguma eeljooksu (puhas vooluti), enne kui kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent (dekstraansinine). 3. Kui proov on täidisesse sisenenud, viin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikese koguse (0,5-1 ml) eluenti 4. Lasen eluendil täidisesse imbuda. 5. Kordan seda protsessi väikeste kogustega seni, kuni kogu uuritav proov on kolonni sisenenud 6
Kolonni sisediameeter 2,1 cm ( r= 1,05 cm) Vajalikud arvutused tööks Kogumaht Vt= Sp * L Sp= r2 Vt= 3,14 * (1,05)2 * 29,5 = 102 cm3 Geelimaatriksi maht Vg= k* Vt Vg= 0,1* 102 = 10,2 cm³ Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg Vxmax= 102-10,2= 91,8 cm3 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/ 2 n= 91,8/246 katseklaasi Elueerimispuhver: 0,15 M NaCl; 20 mM Tris/HCl; pH= 7,5 Lahutatava segu koostis: dekstraansinine 3 mg/ml, müoglobiin 6 mg/ml, DNP- aspartaat 0,3 mg/ml Segu komponentide lahutamine kolonnis 1. Avasin alumise kraani ja lasin voolutil kolonnist tilkuda väiksesse keeduklaasi kuni vooluti oli mõne mm kõrgusel geeli nivoost, jälgides, et kolonn kuivaks ei jookseks. 2. Sulgesin kolonni väljavooluava ning doseerisin pipetiga geeli pinnale 1 ml uuritavat proovi. 3. Järgmiseks lisasin tilkhaaval voolutit, et proov imenduks geeli, kuid ei lahustuks voolutis. 4
maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi
Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
liigestevalu ja palju muud. Järgnevad kroonilised haigused ägenesid aspartaami manustamisega: ajukasvajad, multiskleroos, kroonilise väsimuse sündroom, Parkinsoni ja Alzheimeri tõbi, lümfoom, sünnidefektid, suhkruhaigus ja mõned teised. Aspartaam koosneb kolmest kemikaalist: aspartaadist, fenüülalaniinist ja metanoolist. Seega saab aspartaami liigitada vaid keemiliste mürkainete hulka. Vaatleme lähedalt aspartaami koostisaineid: Aspartaat (aspartaat hape) 40% koostisest samuti sisaldub aspartaadis glütamaat hape. Mõlemad ained põhjustavad tõsiseid neuroloogilisi häireid ja tervet müriaadi muid sümptoome. Liiga palju glütamaati või aspartaati tapab teatud aju neuronid ja laseb ajurakkudesse üleliia kaltsiumit. Taoline sissetung käivitab ajurakke tapvate vabade radikaalide tekkimise. Aspartaat on aminohape. Kui seda tarvitada ilma seoseta teiste valkudega,
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiga koguda iga fraktsioon umbes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin automaatpipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiks koguda iga fraktsioon ubmes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
Nüüd oli kolonn valmis proovi sisestamiseks. Proovi sisestamine Võtsin pipetiga 1 mL uuritavat proovi ja viisin selle kolonni. Selleks juhtisin pipeti otsa vastu kolonni seina ja lasin proovil voolata geeli pinnale nii, et geel saaks võimalikult ühtlaselt kaetud. Uuritav segu Uuritav segu koosnes kolmest erineva molekulmassiga komponendist. Uuritava segu koostisosad: 1) Dekstraansinine, 3 mg/mL 2) Müoglobiin, 6 mg/mL 3) DNP-aspartaat, 0,3 mg/mL Kolonni voolutamine Kui olin proovi viinud geeli pinnale, siis avasin väljavoolutoru ja hakkasin eluaati koguma alguses ühendatud fraktsioonina kuiva kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. Kordasin sama asja väikese eluendi kogusega veel teinegi kord ja siis viisin juba geeli pinnale nii palju eluenti, et moodustus u 5 cm kõrgune kiht.
a) Deshifreerige viimane ühend ja kirjutage selle struktuur 5-fosforibosüülpürofosfaat O O P O CH2 O OH O O O O P O P O OH OH O O b) Kirjutage AMP sünteesi põhimõtteline skeem. Fumaraat Aspartaat + GTP GDP + P IMP Adenüülsuktsinaat AMP Adenüülsuktsinaadi süntetaas Adenüülsuktsinaadi lüaas c) Kuidas on nende ensüümide üldnimetus, mis katalüüsivad fosforibosüüli ülekannet N-alusele? Fosforibosüültransferaasid 6
Pundumistegur k 0,1 Täidise kõrgus L 31,5 cm Kolonni sisediameeter d 1,8 Täidise kogumaht ( ) Geelmaatriksi maht Maksimaalne elueerimismaht Fraktsioonide üldarv Dekstraansinine Uuritav segu Müoglobiin DNP-aspartaat pH 7,5 Elueerimislashus 0,05 M Tris/HCl 0,1 M NaCl Laine- Fraktsiooni Eluaadi Optiline pikkus järjekorra maht V tihedus (nm) nr (ml) Ühendfrakt. 23,5 0 670 1 25,5 0,025
Tulemuste põhjal koostati kromatogramm. Tulemused ja nende analüüs Täidise mark: SEPHADEX G-75 Pundumistegur k = 0,1 Täidise kõrgus L = 32,5 cm Kolonni diameeter d = 2,1 cm r =1,05 Täidise kogumaht: Vt= ·r2·L = 3,14 · 1.052 · 32,5 = 112,5 cm3 Geelmaatriksi maht: Vg= 0,1 · 112,5 = 11,25 cm3 Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 112,5 11,25 = 101,26 cm3 Fraktsioonide üldarv: n=101,26 : 2 = 50, 63 51 Uuritav segu: Dekstraansinine 3mg/ml Müoglobiin: 5mg/mol DNP-aspartaat: 0,3 mg/mol Elueerimislahus: pH= 7,4 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl Fraktsiooni nr Lainepikkus, nm Elueerimismaht V, Optiline tihedus, ml A Ühendatud fraktsioon - 23 0 1 670 25 0 2 670 27 0,032 3 670 29 0,163
R f = max V x - V xmin Fraktsioonide arvutamine: r = 2,2/2=1,1 cm h = 31,5 cm Geeli maht: Vt = Sp*h = r2*h = *(1,1)2*31,5 =119,68 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*119,68 = 11,9 cm3 Vxmax = Vt Vg = 119,68 11,9 = 107,7 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =107,7/2 = 53 Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu: Vv = 34 ml Uuritav segu koosneb kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin ja DNA- aspartaat, elueerimispuhvriks oli pH=7,5 0,05M Tris/HCl. Kolonn sisaldab: Sefadex G-50 Lainepikkus Fraktsiooni Eluaadi Optiline (nm) nr maht (ml) tihedus 1 36 0,037 2 38 0,169 670 3 40 0,248 4 42 0,189 5 44 0,095 6 46 0,039 6 46 0,692
3) Seejärel arvutatakse kolonni kogumaht Vt= r2h= 3,14*(2,4/2)*22,6=85,15 cm3 4) k=0,1 5) Seejärel arvutatakse geelmaatrikis maht Vg=k*Vt = 85,15*0,1=8,51cm3 6) Vg lähtuvalt arvutatakse max elueerimismaht Vx max=Vt-Vg=85,15-8,51=76,64 cm3 7) Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml, seega n= Vx max /2= 76 /2=38 Esimese elueerimismaht oli 15 ml Optilise tiheduse table Dekstraansinine Müoglobiin DNP-aspartaat 670nm 410 nm 360nm 0,011 0,129 0,166 0,335 0,612 0,542 0,484 1,683 1,555 0,329 1,999 2,636 0,154 1,171 3,179
Fraktsioonide arvutamine: r = 2,3/2=1,15 cm h = 29,5 cm Geeli maht: Vt = Sp*h = r2*h = *(1,15)2*29,5 =122,56 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*122,56 = 12,256 cm3 Vxmax = Vt Vg = 122,56 12,256 = 110,30 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =110,3/2 = 55,15 Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu: Vv = 27 ml Uuritav segu koosneb kolmest komponendist: dekstraansinine 3mg/ml, müoglobiin 6mg/ml ja DNA-aspartaat 0,3mg/ml, elueerimispuhvriks oli pH=7,4 20mM Tris 0,15M NaCl Kolonn sisaldab: Sephadex G-75 Lainepikku Fraktsiooni Eluaadi Optiline s (nm) nr maht tihedus (ml) 1 36 0,007 2 38 0,067 670 3 40 0,160 4 42 0,248 5 0,180 44
Maksimaalne elueerimismaht selline elueerimismaht, mille juures kolonnist väljuvad ka need molekuli, mille molekulid täielikult diffundeeruvad geeli pooridesse (=). Aineid, mille molekuli suudavad täielikult diffundeerida geeli pooridesse ja mille antud kolonnis on teada, iseloomustatakse liikuvusteguriga : Selle värtusedjäävad vahemiku 0...1 Töö käik 1. Proovi andmed: =0.5 ml. Koostis: Dekstraansinine (6 mg/ml), Müoglobiin (6 mg/ml), DNP-aspartaat (0.3mg/ml), proovi lahusti ja eluent NaCl lahus. 2. Märgin ära kolonni andmed: geel on Sephadex G-75, koeffitsient k=0.1, geelisambla kõrgus L=27.4 cm, diameeter d=1.9 cm. 3. Arvutan vajalikud mahud: ; ; 4.Arvutan fraktsioonide üldarv: n= (tegelikult 29-s fraktsioonis oli nii vähe elueerivat ainet, et sellega ma lõpetasin fraktsioonide kogumist). 5. Asetan katseklaase statiivi ja nummerdan neid. 6
Apolaarsed (hüdrofoobsed) aminohapped Leutsiin (Leu,L) Proliin (Pro, P) Alaniin (Ala, A) Valiin (Val, V) Kaks ülemist happelised Aspartaat (Asp, D) Glutamaat, Glu, E) Neli alumist Metioniin, Met, M) Trüptofaan (Trp, W) apolaarsed Fenüülalaniin (Phe, F) Isoleutsiin (Ile, I) Kolm Treoniin (Thr, T) Tsüsteiin (Cys, C) esimest polaarsed, neutr. (laenguta) Türosiin, Tyr, Y) Histidiin (His, H) Kolm viimast aluselised Lüsiin Arginiin
Eluaadi kogumise lõpetasin, kui see oli muutunud värvusetuks. Fraktsioonide analüüsimine Ainete kontsentratsiooni antud töös väljendatakse igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritava ainesegu koostisest: dekstraansinine- 670 nm, aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (türosiin Tyr, fenüülalaniin Phe, trüptofaan Trp) - 280 nm ja DNP-aspartaat- 360 nm. Katseandmete tabel Fraktsiooni nr Elueerumismaht ml Optiline tihedus, A Ühendatud fraktsioon 16,75 0 1 18,75 0,0961 2 20,75 0,1959 670 nm 3 22,75 0,3551 4 24,75 0,6745 5 26,75 0
Kromatogramm. Kõige esimesena väljus kolonnist dekstraansinine , selle osakesed olid väga suured ja ei mahtunud geeli pooridesse. Dektraansinine on nendest kolmest ainest kõige väiksema molekulmassiga. Dekstraansinise kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige väiksem. Teisena väljus kolonnist müoglobiin , mille osakesed difundeerusid geeli pooridesse osaliselt. Müoglobiini kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige suurem. Viimasena väljus kolonnist DNP-aspartaat , sest tema osakesed difundeerusid täielikult geeli pooridesse, mistõttu tema osakesed liikusid kolonnis kõige aeglasemalt. DNP-aspartaat on nendest kolmest ainest kõige suurema molekulmassiga. Arvutuslikult tuli kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima kontsentratsioonida fraktsiooni eluaadi maht , mis on veidi suurem, kui katseliselt saadud tulemus
V x max = 79,86 - 7,986 = 71,874 71,874 n= = 35,957 36 2 Sain siis, et fraktsioonide üldarvuks tuleb 36. Seejärel eemaldasin kolonni ülaosast üleliigse vedeliku lastes sel voolata mööda kolonni väiksesse keeduklaasi. Kui vedeliku nivoo oli geelisambaga peaaegu samal kõrgusel ( umbes 2mm kõrgemal) siis sulgesin kraani ja doseerisin pipetiga geelisamba pinnale 0,5ml uuritavat proovi. Proov koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin ja DNA-aspartaat. Seejärel keerasin kraani vaikselt tilkuma ja panin sinna alla kolvi. Kui uuritav proov oli geeli imendunud, lisasin natuke juurde puhvrit, seejärel uuesti väikese koguse ja lõpuks lisasin rohkem, et puhvri maht ulatuse kolonni ääreni. Lasin eluaadil kolbi tilkuda seni, kuni esimene värviline riba ( sinine) jõudis kolonni põhjani ja eemaldasin siis kolbi ja kogusin edasi vedelikku fraktsioonidena nummerdatud ja kaliibritud(2ml) katseklaasidesse. Fraktsioone kogusin seni, kuni eluaadi
tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A) Ühendatud fraktsioon 25 0 1 27 0,042 2 29 0,2026 3 31 0,1868
kogumise lõpetada. Tulemused ja nende interpreteerimine A. Täidise mark ja materjal=> Sephadex, 675 Täidist iseloomustav pundumistegur=> 0,1 Täidise kõrgus=> 12,5 cm Täidise sisediameeter=> 2,7 cm Täidise kogumaht=> 71.53 cm3 Maksimaalne elueerimismaht=> 64,38 cm3 Fraktsioonide üldarv=> 32,19 B. Kromatogramm A- Müoglobiin B- D-aspartaat C- dekstraansinine V A B C 15,45 0 0 0 17,45 -0,0251 -0,0313 -0,0139 19,45 -0,0271 -0,033 -0,0164 21,45 -0,0168 -0,0225 -0,0055 23,45 0,0718 0,061 0,0783 25,45 0,03087 0,2615 0,2761 27,45 0,03448 0,2845 0,299 29,45 0,1667 0,1349 0,1509 31,45 0,0651 0,0401 0,0522 33,45 0,0773 0,021 0,0143
difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja: Vt = r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3 Vg= k*Vt = 0,1 * 51,27 = 5,127 ml Vx max = Vt Vg = 51,27 5,127 = 46,143 ml N= Vx max /2 = 46,143 /2 = 23,1 tk Pärast ettevalmistuste tegemist avada ettevaatlikult kolonni voolutusava ning kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, siis taas sulgeda kolonni väljavooluava. Kolonn on valmis proovi sisestamiseks.
raud(II)laktaat, raud(II)sulfaat, raud(III)difosfaat (raud(III)pürofosfaat), raud(III)sahharaat, raud elemendina (karbonüülselt, elektrolüütiliselt või vesinikuga taandatud), raud(II)diglütsinaat, raud(II)-L-pidolaat, raud(II)fosfaat, raud(II)tauraat; 4) vask – vaskkarbonaat, vasktsitraat, vaskglükonaat, vasksulfaat, vask-L-aspartaat, vaskdiglütsinaat, vase-lüsiini kompleks, vask(II)oksiid; 5) jood – naatriumjodiid, naatriumjodaat, kaaliumjodiid, kaaliumjodaat; 6) tsink – tsinkatsetaat, tsink-L-askorbaat, tsink-L-aspartaat, tsinkdiglütsinaat, tsinkkloriid, tsinktsitraat, tsinkglükonaat, tsinklaktaat, tsink-L-lüsinaat, tsinkmalaat, tsinkmono-L-metioniinsulfaat, tsinkoksiid, tsinkkarbonaat,
NB. Mingil juhul ei tohi kolonni kuivaks lasta. 3. Proovi sisestamine. Kolonni lisatakse uuritava proovi (0,5-1,0 ml) 4. Reeglin koosnevad segud 3-4 erineva molekulmassiga komponentidest, mis on lahustunud sobivas lahuses(näitek destileeritud vesi või NaCl lahus). Meie töös ained on värvilisred ja me võime visuualselt jälgida nende lahutamist. Meie lahuse koostises: Dekstraansinine Müoglobii DNP-Aspartaat 5. Kolonni voolutamine. Kuni kollonni allaosa jõuab kõige kiiremini liikub komponent (meie juhul dekstraansinine) kogume eluaadi ühendatud fraktsiooniga ühe kolbi. Pärast esimese komponentide kolonni alla jõudmisel kogume 2 ml kaupa. 6. Fraktsioonide analüüsimine. Meie töös väljendame aine kontsentratsiooni igasfraktsioois lahuse optilise tiheduse järgi. Iga aine absorbeerib erinevatel lainepikkusel. Kasutame spektrofotomeetri meetodi. 7
Vxmax fraktsiooni väljumiseni. Vxmin Dekstraansinise elueerumismaht on võrdne kolonni vaba mahuga, kuna tema molekulmass on 200 kDa ning ta ei mahu geeli pooridesse ja liigub pooridevahelisel alal, kuivõrd antud geeli lahutuspiirkond on .... 3000-80000 Da. Dekstraansinine väljus esimesena, kuna tema molekulaarmass on suurim ja ta ei mahtunud geeli pooridesse. DNP-aspartaat on väikseima molekulaarmassiga ning ta difundeerus täielikult pooridesse ja läbis seetõttu kolonni kõige aeglasemalt. Kuna geelkromatograafia põhimõtte on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi, siis järeldan ka, et ma ei tegelenud praktikumis mustkunstiga ning sain ootuspärased tulemused, kus kõige suurema molekulmassiga aine väljus esimesena ning kõige väiksema molekulmassiga väljus viimasena
L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. · Voolutuslahus:Dekstraansinine,Müoglobiin,DNP-Aspartaat.Kasutasin automaatpipetti mahuga 0,5 ml. · Kolonni pinnal olev eluent kogun seisukolbi. Segu komponentide lahutamine: Avan kolonni väljavooluava. Täidise lahus hakkab keeduklaasi tilkuma. Reguleerin kolonni voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava . Uuritav segu: 1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane). Proovi sisestamine:
mõõta. · Saadud tulemustest koostatakse katseandmete tabel ja selle alusel kromatogramm. Kolonni iseloomustavad parameetrid · Geel: Sephadex G 75 , fraktsioneermispiirkond 3000 80000 Daltonit · Geeli pundumistegur: k = 0,1 · Täidise kõrgus L = 31.5 cm · Kolonni sisediameeter: d = 2,1 cm Proovi komponendid · Dekstraalsinine (6mg/ml) · Müoglobiin (6mg/ml) · DNP aspartaat (0,6 mg/ml) Mõõtmis- ja arvutamistulemused 1. Kolonni täidise maht Vt 2. Geelmaatriksi maht Vg 3. Kolonni maksimaalne elueerimismaht Vx,max 4. Fraktsioonide üldarv n. 5. Mõõtmistulemuste tabel Optiline Fraktsiooni Elueerimisma tihedus number ht V, ml ,A
25 69,5 0,484 360 26 71,5 0,186 360 27 73,5 0,056 360 28 75,5 0,033 360 C. Kromatogrammilt: Komponentide elueerumisprofiilid: Dekstraansinine (: A = 0,400; eluaadi maht V = 25,5 ml Müoglobiin (: A = 3,0; eluaadi maht V = 33,5 ml DNP-aspartaat (: A = 1,364; eluaadi maht V = 65,5 ml Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, mis tõestab, et sellel on kõige suurem molekulmass. Tänu sellele ei difundeerunud ta geeli pooridesse, vaid väljus kolonnist graanulite vahelt minimaalse elueerimismahuga, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vxmin = 25,5 ml.
MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA | YTM0011 I KONTROLLTÖÖ KORDAMISKÜSIMUSED | 20/09/10 I VALKUDE STRUKTUUR 1. Aminohapped, aluselised ja happelised, hüdrofiilsed ja hüdrofoobsed, polaarsed vs. mittepolaarsed, kõrvalahelate tüübid. Aluselised: Lüsiin, Arginiin, Histidiin. Happelised: Aspartaat, Glutamaat. Hüdrofoobsed: Alaniin, Valiin, Leutsiin, Metioniin, Isoleoutsiin, Fenüülalaniin, Trüptofaan, Tyrosiin. Hüdrofiilsed: Arginiin, Lüsiin, Aspargiin, Glutamaat, Proliin, Aspartaat. Polaarsed: Türosiin, Histidiin, Lüsiin, Arginiin, Aspartaat, Glutamaat, Treoniin, Seriin, Aspargiin, Glutamiin. Mittepolaarsed: Alaniin, Valiin, Leutsiin, Isoleutsiin, Fenüülalaniin, Metioniin, Proliin, Trüptofaan. 2
c) Ribuloos-5-fosfaat+ glütseraldehüüd-3-fosfaat Sedoheptuloos-7-fosfaat. d) Sedoheptuloos-7-fosfaat+ glütseraldehüüd-3-fosfaat Fruktoos-6- fosfaat+erütroos-4-fosfaat. e) Ribuloos-5-fosfaat Ksüluloos-5-fosfaat. 7. Selgitage 2-4-lausega mille poolest erineb maksas ja lihastes leiduva glükogeeni kasutamine meie organismis. 8. Millised loetletud ühenditest on inimese organismis glükoheogeneetilised substraadid. a) Alaniin. b) Aspartaat. c) Histidiin. d) Leutsiin. e) Etanool. f) Glütserool. h) Palmitat. 9. Millised ühendid tekivad ribonukleotiidi reduktaasi reaktsiooni tulemusel. a) IMP ja OMP. b)PRPP. c) Desoksüribonukleotidid. d) Ribonukleotiidid. e) Fosforibosuulamiin. 10. Kirjutage skemaatiliselt kataboolne rada, mille abil on võimalik glütamaadi (5C) koosseisu kuuluv süsinik täielikult oksüdeerida. Nimetage olulisemad etapid, kus tekib/kulutatakse ATP või tekib redutseeritud koensüüme
valmis proovi sisetamiseks. 1.4 Proovi sisestamine Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin pipetti. Viisin 0,5 ml uuritavat proovi kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina. Proovil lasksin voolata geeli pinnale nii, et see jaotuks võimalikult ühtlaselt. 1.5 Uuritavad segud Uuritav segu koosnes järgnevatest ainetest: Dekstraansinine ( 6 mg/ml ) Müoglobiin ( 6 mg/ml ) DNP aspartaat ( 0,6 mg/ml ) 2.4 Kolonni voolutamine Kui proov on täidisesse sisenenud, viin pipetiga geeli pinnale väikse koguse voolutuslahust ja lasen täidisesse imbuda. Kordan seda nii kaua, kuni kogu uuritava proov on kolonni sisenenud ja siis võib geeli pinnale kanda suurema hulga voolutit. Kui esimene värviline riba ( dekstraansinine ) läheneb kolonni põhjale, siis eemaldab kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja hakkan koguma eluaati 2ml kaupa katseklaasidesse.
peptiidsidemeid produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele sidemetele eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Lisaks eristatakse proteaase veel optimaalse keskkonna pH järgi, kas hapudeks-, neutraalseteks- või leelisproteaasideks. Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsenti ehitus ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Proteaasid jagunevad seriin-, tiool-, aspartaat-, ja metalloproteaasideks. Kuna hüdrolüüsinud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav siis avaldatakse proteaaside aktiivsus valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide hulga kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgnevad trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Töö käik
24 66 0,036 25 68 0,013 Tabeli alusel koostatud kromatogramm: C. Kromatogrammi info: Ainetest kõige esimesena väljus dekstraansinine, sest tema molekulmass on kõige suurem (2 000 000 daltonit), ainetest järgmisena väljus Müoglobiin kuna tema molekulmass on suuruselt järgmine ( 16 800 daltonit) ja ainetest viimasena väljus DNP aspartaat, sest tema molekulmass on kõige väiksem (299,5 daltonit). Mida suurem on aine molekulmass, seda vähem difundeerub ta geeli pooridesse ja seda kiiremini ta kolonnist väljub. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vxmin = Vv = 22 ml. Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vx = 30 ml. Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi DNP-aspartaadi kõrgeima
peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud on endopeptidaasid. Ensüümi toimimise optimaalse keskkonna järgi eristatakse hapusid (pH ~2,5), neutraalseid (pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0). Aktiivtsentri ehituse järgi jaotatakse proteaasid põhiliselt seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasideks. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide
peptiidsidemeid produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele sidemetele eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Lisaks eristatakse proteaase veel optimaalse keskkonna pH järgi, kas hapudeks-, neutraalseteks- või leelisproteaasideks. Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsenti ehitus ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Proteaasid jagunevad seriin-, tiool-, aspartaat-, ja metalloproteaasideks. Kuna hüdrolüüsinud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav siis avaldatakse proteaaside aktiivsus valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide hulga kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgnevad trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Töö käik
2,6,8-puriintrioon KREATINIIN 1,5-2,5 g/ööp UUREA e. KARBAMIIDI TSÜKKEL (tuntud ka kui ORNITIINI tsükkel) · Toimub ammoniaagi konverteerimine uureaks. · On iseloomulik enamusele maismaaloomadest. · Tsükli reaktsioonid toimuvad valdavalt maksarakkude tsütoplasmas. · Tsüklis osalevad mitteproteogeensed aminohapped ornitiin ja tsitrulliin ning proteogeensed aspartaat (Asp) ja arginiin (Arg). Uurea liikumine: MAKSARAKUD VERI NEERUD URIIN välja KARBAMOÜÜLFOSFAADI SÜNTEES - uurea tsükli 1. reaktsioon; temalt pärineb uurea üks N aatom. NB! Reaktsioon maksarakkude mitokondrite maatriksis.
12. Mille järgi klassifitseeritakse aminohappeid glükogeenseteks ja ketogeenseteks? Nimetage mõni esindaja kummastki rühmast. Glükogeensed aminohapped, millest tekivad glükoosi sünteesi eelühendid. N: alaniin. Ketogeensed aminohapped, mis degradeeritakse atsetüül CoA või atsetoatsetaadiks. N: leutsiin. Millised on glükoketogeensed aminohapped? Need aminohapped, mis kuuluvad mõlemasse rühma. N: isoleutsiin, Phe, Thr, Trp. 13. Aminohapete desamiinimise tulemusel tekivad aspartaat ja alfa-ketoglutaraat (inimesel). Aminohapete dekarboksüülimise tulemusel tekivad biogeensed amiinid. Milliseid vastavate ainegruppide esindajaid teate? Histamiin, türamiin. 14. Millised toodud ühenditest on lämmastiku ainevahetuse lõpp-produktideks erinevates organismides. Kirjutage nende ühendite struktuurivalemid. a. Uratsiil d. Uridiin b. Uurea CH N O4 2 e. Kusihape (uric acid) C5H4N4O3 c. NH 4 +
peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud on endopeptidaasid. Ensüümi toimimise optimaalse keskkonna järgi eristatakse hapusid (pH ~2,5), neutraalseid (pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0). Aktiivtsentri ehituse järgi jaotatakse proteaasid põhiliselt seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasideks. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsentri ehitus (millised aminohapped sellesse kuuluvad) ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Siinkohal piirdume vaid nelja peamise rühma nimetamisega, süüvimata nende toimemehhanismide erinevustesse: seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasid. Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 kat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 mooli aminohapete vabanemise1 s vältel 30°C juures. Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis ongi üldlevinud, et proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide, st aminohapete ja peptiidide hulga kaudu. Töö käik:
kolmetähelised koodid. Milliseid ebaharilikke aminohappeid teate? Aminorühm mis on seotud valgus on tetraeedrilise kujuga. Proteogeenseid aminohappeid on 20, mida peame teadma. Grupeerumine: Apolaarsed ehk hüdrofoobsed: Leutsiin(Leu,L), Proliin(Pro,P), Alaniin(Ala,A), Valiin(Val,V), Polaarsed ehk neutraalsed: Glütsiin(Gly,G), Seriin(Ser,S), Aspargiin(Asn,N), Glutamiin(Gln,Q), alaliigitus: happelised ja H+ loovutajas on Aspartaat(Asp,D), Glutamaat(Glu,E), Jälle apolaarsed: Metioniin(Met,M), Trüptofaan(Trp,W), Fenüülalaniin(Phe,F), Isoleutsiin(Ile,I), jälle polaarsed ehk laenguta: Treoniin(Thr,T), Tsüsteiin(Cys,C), Türosiin(Tyr,Y), ja aluselised ja h sidujad: Histidiin(His,H), Lüsiin(Lys,K), Arginiin(Arg,R). Veel saab grupeerida, nagu biokeemia praktikumiraamatus oli: alifaatsed punasega, väävlit sisaldav: oranz , aromaatsed: sinised.
Hiljem, kui siniselt värvunud molekulid olid geelist läbi tulnud, võis kiirust lisada. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 0,5ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Lisasin puhverlahust, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused: Geelisamba kõrgus: 31cm
Sinised fraktsioonid mõõdetakse lainepikkusel 670nm, pruunid lainepikkusel 410nm ja kollased lainepikkusel 360nm. Koostatakse katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine (molekulmass 2 000 000 Da), mis ei läbinud geeli poore ja väljus minimaalse elueerimismahuga. Teisena väljus müoglobiin (molekulmass 17 800 Da), mis osaliselt difundeerus geeli. Viimasena väljus DNP-aspartaat (molekulmass 299 Da), millel on võrreldes teistega väga väike molekulmass ning seetõttu difundeerus täielikult geeli pooridesse. Eluaadi maht kuni deksrtaansinise kõrgeima konstentratsiooniga kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli Vxmin = 20,75 ml Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli Vx = 28,75 ml Eluaadi maht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli Vxmax = 57,75
Kromatogramm · Teades, et komponentideks olid: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml, Mr = 2 · 106 2. Müoglobiinist 6mg/ml, Mr = 1,7 · 104 3. DNP aspartaadist 0,3mg/ml Kuna sinine desktraansinine voolas läbi kolonni kõige kiiremini võib järeldada, et tema molekulmass on suurim. Kahjuks ma DNP aspartaadi molekulmassi ei tea, mistõttu on keeruline oletada, kumb väljus kolonnist enne, kes müoglobiin või DNP aspartaat. · Eluaadi maht dekstraansinise kõrgema kontsentratsiooni hetkel Vxmin = Vv = 31,5ml · Kuna ma OPN aspartaadi molekulmassi ei tea siis oletan, et ONP aspartaadi molekulmass on väiksem. Vx = 26ml · Kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima konsentratsiooniga fraksioon Vx1max = 57,5ml · Vx1max = 57,5ml Vxmax = 65,357 tõenäoliselt on see viga tekkinud, kas kolonni mõõtmisel või fraktsiooni ei ole täpselt kogutud
bakteriaalsed proteaasid nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt. Proteaase jagatakse ka selle alusel, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele – endo-ja eksopeptidaasid. Ensüümi toimimise järgi jaotuvad need hapudeks (pH=2,5), neutraalseteks (pH=7,2) ja leelisproteaasideks (pH=9,0). Aktiivtsentri ehitusest tuleneb ensüümi toimemehhanism. Neli peamist rühma on seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasid. Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 µkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 µmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 µmooli aminohapete vabanemise 1 s vältel 30°C juures. Aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate aminohapete ja peptiidide hulga kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina kaseiini, mis on piima põhivalk ja kus ta asub mitsellidena. Vees see ei lahustu, küll aga lahustub selle
piiratud proteolüüs, nt trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin). Eristatakse ka endo- ja eksopeptidaase, vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele. Optimaalse pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase. Oluline klassifikatsiooni aspekt on ka aktiivtsentri ehitus ja sellest tulenev toimemehhanism, 4 peamist rühma on: seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasid. Proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ning trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel, milleks kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. TKÄ toimel sadestuvad lahusest tervikvalgud ning kõrgmolekulaarsed peptiidid, sademe
Elueeritud segus oli: 1. Dekstraansinine - absorbeerib lainepikkusel 670 nm. Sinise värvusega aine, mis väljub esimesena, sest dekstraansinine on kõrgmolekulaarne (suured molekulid), mille tulemusena molekulid ei mahu geeligranulite pooridesse ja liikuvad kiiresti nende vahel. Kromatogrammi järgi elueerimismaht on Vx min = 24 ml 2. Teisena väljus Lysozyme, mis absorbeerib lainepikkusel 280 nm Vx = 48 ml 3. DNP - Aspartaat - absorbeerib lainepikkusel 360 nm. Kollase värvusega aine väljub viimasena, kuna temal on kõige väiksem molekulaarmass ja molekulid hästi mahuvad pooridesse, mis pidurdavad nende liikumist. Vxmax = 72 ml Liikuvusteguri Rf väärtus: V x -V min x 48-24 Rf = max min = =0,5 V x -V x 72-24 Järeldus Liikuvusteguri Rf väärtuseks sain 0,5 , mis vastab vahemikule 0 < Rf < 1
Iga transporditud ATP kohta tuleb üks H+ sisse. Ühe ATP sünteesile kulub kolm H+. Seega, ATP süntees ja eksport kokku võrdub 4H+ ühe ATP kohta. 12. Kas toodud väited vastavad tõele? Vale väide formuleerige ümber tõeseks. a) Mitokondrite sisemembraan pole küll NADH-le läbitav, kuid tsütosoolse NADH transport mitokondri maatriksisse on lahendatud süstiksüsteemide abil. b) Tsütosoolse NADH reoksüdeerimisel osalevad süstiksüsteemid (N: malaat-aspartaat süsteem). c) Kogu tsütosoolis tekkinud NADH reoksüdeeritakse sealsamas. mitokondri maatriksis 13. Oksüdatiivse fosforüleerimise reguleerimine toimub järgmiste faktorite abil a) glükoosi kontsentratsioon rakus b) ADP ja Pi kontsentratsioon maatriksis c) NADH ja CoQH2 kättesaadavus d) rasvhapete sisaldus rakus e) H+ gradiendi suurus
annaabi.ee 
