Molekulaarbioloogia (0)

Molekulaarbioloogia
Molekulaarbioloogia – tegeleb päriliku info kodeerimise, säilitamise ja ülekande mehhanismi uurimisega, samuti päriliku info realiseerumise molekulaarsete mehhanismidega (kuidas info geenides määrab elusorganismi ehituse ja tema funktsioneerimise . Uurib füüsikalis-keemiliste struktuuride ja biokeemilis-füsioloogiliste funktsioonide vastavust. Teadussuund hakkas arenema pärast makromolekulide ruumilise struktuuri kindlakstegemist (DNA 3-ruumiline struktuur).
Molekulaarbioloogia dimensioon – 1 A – 300 A (üle 500 – rakubioloogia, alla 1 - biofüüsika)
1 A (ongström) = 10 -10 m
1nm = 10 A
2-ahelalise DNA läbimõõt – 20 A
kovalentne side – 1,5 A
globulaarse valgu d – 50 A
dsDNA ( double stranded) d – 50 A
ribosoomide, valgumolekulide d – 200-300 A
DNA aluspaaride vahe – 3,4 A
vesiniksideme pikkus – 3 A
nukleosoom – 60x110x110 A
bakteri ribosoom – 200x200x230 A
tuumapoorid – 120x120x75 A
bakteriaalne RNA polümeraas – 90x90x60 A
Molekulaarbioloogia põhidogma
DNA↔ RNA →valk
DNA sünteesitakse nii DNA kui RNA alusel!
RNA-sõltuv DNA polümeraas – pöördtranskriptaas – revertaas – katalüüsib DNA sünteesi RNA matriitsilt, leiti algselt retroviirustelt.
Dogma evolutsiooniline aspekt: looduslik valik toimub organismide mitte geenide tasemel. Valik toimub geeniproduktide tasemel. Ühte „head“ geeni võib ümbritseda „halvad“ geenid ja teda ei valita. Mutatsioonid toimuvad juhuslikult. Epigeneetiline pärilikkus - on seotud genoomi ekspressiooni mustrite kordumisega uues põlvkonnas (DNA metüleerimine), ei ole seotud muutustega genoomis .
Geneetilise info 3 põhilist ülekandeprotsessi:
1. Replikatsioon – kahekordistumine
geneetiline info on säilitatud DNA kaksikheeliksi kujul
viib läbi DNA-sõltuv DNA polümeraas (substraat: desoksünukleosiid-5’-trifosfaat)
DNA replikatsioon – eukarüootidel
RNA replikatsioon – viirustel
DNA sünteesitakse – DNA alusel, RNA alusel; rekombinatsiooni, reparatsiooni alusel
Kitsas mõiste – DNA süntees
Laiem mõiste – RNA praimeri süntees, DNA ja kromosoomi struktuuri muutused, replikatsiooni regulatsioon
2. Transkriptsioon – mahakirjutamine
RNA süntees DNA matriitsi alusel. RNA sünteesi regulatsioon on geeni aktiivsuse regulaatori põhiline tase!
viib läbi DNA-sõltuv RNA polümeraas (substraat: ribonukleosiid-5’-trifosfaat)
Sünteesitud RNA ahel vastab 1:1-le temaga antiparalleelsele DNA matriitsahelale (komplementaarsusprintsiip).
kodeeriv ahel –DNA ahel, mis on RNA-ga identse järjestusega.
RNA sünteesi käigus toimub DNA ahelate lahtiharutamine, struktuur taastub pärast sünteesi.
3. Translatsioon – valgu biosüntees , tõlkimine
RNA nukleotiidne järjestus tõlgitakse valgu AH järjestuseks.
mRNA – kannab valgu sünteesiks vajalikku geneetilist informatsiooni.
ribosoom – RNA ja valkudest koosnev organell . Valgu AH järjestus ei määra 1:1 RNA järjestust (Goethe – Lost In Translation). Toimetab valkude sünteesi.
Koosneb kahest erinevast subühikust: väike ja suur. Auk keskel ( valgud RNA vahelistes aukudes), millest käivad läbi ribosoomi substraadid. Ribosoomid stabiliseerivad RNA-valgu struktuuri. Subühikuid iseloomustatakse raskusväljas liikumise kiiruse järgi (sadenemise järgi) – Svedberg. Bakteri ribosoomid 30S ja 50S – kokku 70S. Eukarüootidel 40S ja 60S – kokku 80S. Sõltub osakeste massist ja tema tihedusest – Svedberg. Sõltub osakeste massist ja tema tihedusest. Subühikud on omavahel koos subühikutevaheliste sildadega, põhiliselt RNA-RNA interaktsioon . Väike subühik – 1500 nukleotiidiline, 1 heeliks ja valgud. Suur subühik on natukene teistmoodi orienteeritud. Suur subühik – 6 sekundaarstruktuuri, lisaks 5S RNA. Subühikute vahele seostub tRNA 3 erinevasse saiti (A, P, E). Subühikud võivad olla erinevad, aga neid on alati kaks. 23S + 15 S RNA (suur subühik). Ribosoomi massist prokarüootidel 2/3 RNA. Eukarüootidel on suhteliselt rohkem valke (umbes pooleks), aga ka RNA on suurem. Põhjus, miks ta koosneb kahest subühikust on see, et mRNA käib kahe subühiku vahelt läbi.
valgu biosünteesi etapid (lühidalt):
osalevad valgulised faktorid , ATP, GTP. vajame ribosoome, AH seotakse spetsiifilise tRNA molekuliga ensüümide - aminoatsüül-tRNA süntetaasi (ARS) või aminoatsüül-tRNA ligaasi (ARL) – vahendusel.
1. preribosomaalne etapp:
aminoatsüül-tRNA süntees (aa-tRNA)
2. ribosomaalne etapp: (ribosoomides)
mRNAs pakinev koodon seatakse vastavusse tRNA sisalduva antikoodoniga
koodon – koosneb kolmest järjestikusest nukleotiidist
ribosoom sünteesib AH vahele peptiidsideme (tRNA küljes AH-d). Kasvav peptiidahel on sünteesi käigus kovalentselt seotud tRNA-ga.
Geen

• pärilikkuse ühik, DNA lõik (nukleotiidsed järjestused, järjekord määrab info), mis kodeerib eralduvat produkti (RNA või valk)
  
• DNA kodeerib iseend, aga pole eralduv produkt – jääb matriitsahelaga seotuks (poolkonservatiivne replikatsioon)
  
• Geenid on kodeeritud ühe ahela poolt, vastasahel kodeerimisel ei osale. NB! Pikema DNA lõigu ulatuses võivad mõlema ahela poolt kodeeritud olla – osa geene paikneb ühel, osa teisel ahelal .
  
• geenid võivad kattuda nii ühel kui ka eri ahelatel.
  
• ühe geeni sees võib asuda teine geen
  
• ei võrdu DNA
  
• võib koosneda ka RNA-st
  
• produktiks on RNA või valk
  
• muutused koodis toimuvad RNA tasemel – RNA protsessing
  

Inimese DNA-s on üle 90%, kus üldse geene ei ole
Geenide osad:
regulaatorpiirkond – geeni alguses, geeni sees, osaliselt väljaspool geeni, geenist endast kaugel. Sh ka terminaatorjärjestused – määravad sünteesi lõppu.
kodeeriv osa – sünteesitakse RNA
struktuurne osa – vastab produktis sisalduvale pärilikule infole. Peale sünteesi läbib RNA protsessingu – osa järjestusi eemaldatakse – ei satu kogu DNA kodeeriv osa produkti.
Prokarüootide – eeltuumsete geenid
Eukarüootsete – päristuumsete geenid
Pidevad;
Struktuurne osa on pidev järjestus ja
kopeeritakse produkti;
Organiseeritud operonidesse – mitu produkti
kodeerivad järjestused ühise regulaatori
kontrolli all.
Katkendlikud, sisaldavad introneid ja eksoneid
Geeni primaarprodukt mRNA läbib splassingu – osa RNA järjestusest eemaldatakse ( intronid ). Eksonid jäävad alles ja ühendatakse – nii tekib küps mRNA.
Küpses mRNAs on ka mittekodeerivad piirkonnad – liider (alguses, 5’ osas), treiler (lõpus, 3’ osas). Ka ühe geeni intronid võivad kodeerida produkte – mitmed väikesed RNA molekulid ( snoRNA )
alternatiivne splassing – ühel geenid mitu võimalikku produkti. eksonite ühendamine, mõned intronid jäetakse välja.
Funktsionaalselt jaotatakse geene:
struktuursed – kodeerivad valke ja RNA molekule
regulaator – poolt kodeeritud produktid , võib ka RNA ja valk olla, aga reguleerivad teiste geenide avaldumist
koduhoidja geenid (housekeeping) – hulkraksetes avalduvad igas rakus, ainuraksetes avalduvad konstitutiivselt (pidevalt). Neil pakineb 5’ osas oligopürimidiin järjestus ( TOPP geenid). TOPP geenide intronites on sageli teisi kodeerivaid järjestusi – samuti koduhoidja geenid. Omapärane geenide kattumine, füüsiliselt ei kattu info, aga mõlema geeni produktid reguleeritud ühise kontrolljärjestuse poolt.
Geenide kattumine esineb prokarüootides (mRNA tasemel ja DNA tasemel) – erinevate mRNA molekulide süntees. Eriti oluline viirustel.
Geenide aktiivsuse regulatsiooni tasemed:
1) transkriptsioon – kõige olulisem (!), RNA sünteesi reguleerivad valgud ja neid mõjutavad faktorid
2) RNA protsessimine ja transport. Aktiivne protsess ja väga täpselt kontrollitud
3) mRNA lagundamine - mRNA eluiga on oluline. Kui seda ei lagundata, siis saab tema arvelt sünteesida palju komponente. Valk titiin (kõikidel selgroogsetel olemas) – vajatakse varajases embrüonaalses arengus, esimest korda vajatakse blastulas. Sünkroonjagunemine toimub kiiremini (valk valgus sünteesitakse), mRNA jõutakse valmis sünteesida ja rakku transportida, aga ei jõuta lõpuni transleerida. Titiini molekul ise on väga pikk (mitukümmend AH pikk) - jääb titiin poolikuks, sest mRNA lagundatakse enne mitoosi käigus. Kui rakutsükkel pikeneb, saavad titiini molekulid valmis.
4) translatsioon – mRNA struktuur ja regulaatorvalgud ja RNA-d
5) valgu modifitseerimine ja lokalisatsioon – erinevatel modifitseerivatel valkudel eri roll
6) valgu eluiga (N- terminaalne reegel) – valke sünteesitakse tohutult palju, aga kui ta eluiga on mõni minut, siis pole ta roll nii tähtis midagi.
Valgu eluaea määrab ära N-terminaalne AH – N-terminaalne reegel.
Kui üks nendest destabiliseerivatest AH on eksponeeritud, siis suunatakse proteasoomi. Proteasoomis on keskmine kamber, mis toimetab lagundamist.
DNA ja valgu vaheline spetsiifiline äratundmine on geeni regulatsiooni alus. Valgud tunnevad DNA-l ära kindlaid järjestusi. Esineb negatiivne transkriptsiooni regulatsioon – DNA on vaikimisi aktiivne. Geenide regulatsioon seisneb geenide vaigistamises (maha surumises). nt. kui regulaatorvalk seostub promootorpiirkonna sellisesse kohta, mis sisaldab ka operaatorit. See viib geenide väljalülitamisele. Kui regulaatorit pole, on operon aktiivne. Teine geeni regulatsiooni põhiline viis on positiivne transkriptsiooni regulatsioon. Regulaator paneb geenid tööle, kui regulaatorit pole, on geen välja lüliatud.
RNA-d:

• stabiilsed. preRNA → translatsioon → valk
  pretRNA → translatsioon → valk
  

presnRNA → protsessimine → mRNA → translatsioon → valk

• labiilsed. premRNA → protsessimine → mRNA → translatsioon → valk
  

Labiilne RNA tuleb alati uuesti sünteesida. Stabiilne funktsioneerib mitmes rakupõlvkonnas.
snRNA – palju erinevad RNA klasse, mõjutavad info ülekannet, väikese tuuma RNA, premRNA protsessing
Labiilne RNA: mRNA ja mõned teised, miRNA (microRNA, seotud geenide vaigistamisega), siRNA (small interferingRNA)
RNA sünteesitakse eelastena (preRNA).
premRNA protsessingul muutub info oluliselt. Nt. ADAR – inimese KNS ensüüm , mis muudab A nukleotiide I-ks (Inosiin on deamineeritud A – NH2 reageerib H2O-ga). I paardub nagu G. Toimub RNA editing – primaarstruktuuri tasemel tehakse valgustruktuuris muutusi.
DNA järjestuse võrdlemine:
võrreldakse neljast nukleotiidist koosnevaid järjestusi. Järjestuse homoloogia alusel jagatakse perekondadesse ja superperekondadesse.
Geenid jagatakse järjestuse ja funktsiooni alusel:
homoloogilised – sarnane järjestus ja funktsioon
paralood – sarnane järjestus, erinev funktsioon nt pseudogeenid
ortoloog – geenid kahest eri liigist, mis pärinevad ühest geenist nende liikide viimases ühises eellases.
Geenide võrdlemisel on oluline leida lõigud, mis on suure homoloogiaga (mitte üldpilt). Eriti oluline valgu geenide võrdlemisel. Valkudes on järjestuse motiivid, perekondade piires konserveerunud järjestuse elemendid, mis koosnevad lühikestest lõikudest, aga need lõigud peavad olema kindlas järjestuses .
Pööratud geneetika – järjestuse võrdlemise alusel on võimalik tundmatu funktsiooniga geenile ennustada tema produkti võimalikku funktsiooni. Otsib funktsiooni muutust järjestuse muutmise tulemusel ja funktsioone olemasolevatele järjestustele
Tavaline geneetika – otsib mutatsioone funktsiooni muutuste kaudu.
DNA järjestuste võrdlemine on aluseks molekulaarsele evolutsiooniteooriale – eksonid ei varieeru (loodusliku valiku tõttu) ja intronid varieeruvad suuresti.
Makromolekulide struktuur
Geneetiliselt kodeeritud makromolekulid – nukleiinhapped ja valgud – on polümeerid, mis koosnevad väikesest arvust monomeeridest. Monomeerid sisaldavad identset osa, nad on omavahel ühendatud ja moodustavad polümeeri selgroo . Selgroo küljest hargnevad monomeeride külgahelad.
Geneetiliselt on kodeeritud primaarstruktuur – biopolümeeride monomeeride järjestus.
Molekulaarne mitmekesisus
- üks molekul sarnaneb teisega
- kaks molekuli seonduvad ensüümkompleksi sama piirkonnaga
- mitmed valgud on ruumiliselt tRNA-ga ühesuurused (RFF ja EF-G on sarnased EF-Tu-aatRNA kompleksile)
Valkude struktuur
Valgud koosnevad 20+1 kodeeritud AH-st. +1 on selenotsüsteiin – Sec – esineb vähestes valkudes ja on kodeeritus UGA koodoniga (tavaliselt on stoppkoodon ), bakterites ja eukarüootides, vaja ainult anaeroobsetes oludes.
Lisaks kodeeritud AH-dele esinevad ka teised, mis lisatakse pärast valgusünteesi ribosoomides – post-translatsioonilsed modifikatsioonid. Modifitseeritud AH-d: hüdroksüproliin, atsetüleeritud AH-d.
Valkudega on ühendatud suhkrujäägid (glükosüleerimine) või fosforhappe jäägid (valkude fosforüleerimine ). AH on omavahel ühendatud peptiidsidemega.
Peptiidside – amiidsideme vorm, mis moodustub α-aminohapete vahel. α-aminohapetel on amino (-NH2) ja karboksüülrühm (-COOH) ühendatud sama süsiniku aatomi külge (α süsinik).
Valguahel moodustub α süsinike ja peptiidsidemete abil; αsüsinike küljest hargnevad aminohapete külgahelad. Valguahela otsad on erinevad – algus on N-terminus (-NH2) ja lõpp C-terminus (-COOH).
AH erinevad keemilised omadused tulenevad erinevatest külgahelatest.
Valgud ühenduvad omavahel ka vesiniksidemete abil – moodustub valgu ruumiline struktuur. Peptiidsidemes on nii H-sideme doonor kui akseptor , mis osalevad valgu sekundaarstruktuuri moodustumisel. Väga olulised ruumilise struktuuri tekkel on ka tsüsteiinijääkidel, mis moodustavad disulfiidsidemeid – need hoiavad ruumilise struktuuri stabiilsena.
Laengu alusel jaotatakse AH-d:
laetud aminohapped ehk hüdrofiilsed
jagunevad omakorda happelisteks ja aluselisteks (vastavalt külgahela laengule). Osalevad valgu seondumisel teiste molekulidega ja on struktuurist väljaspool.
Apolaarsed ehk hüdrofoobsed
laetud rühmadeta. Esinevad ruumilise struktuuri sisemuses ja on üksteise läheduses
Valkude sünteesijärgne modifikatsioon :
valmis valkudele lisatakse mitmesuguseid rühmi, mille tulemusena tekivad modifitseeritud ehk mittekodeeritud aminohapped.
Fosforüleerimine – fosforhappe jäägi lisamine
Atsetüleerimine – äädikhappe jäägi lisamine amiidsideme abil NH2-le
Metüleerimine – APPI
Glükosüleerimine – suhkrujääkide lisamine OH ja NH2 rühmadele
lisaks ka nt proliini hüdroksüleerimine – tekib hüdroksüproliin (esineb kollageenis)
Modifitseeritud AH paiknevad valkude pinnal või lahustuvad rakkudevahelises ruumis – teistele molekulidele kättesaadavad.
Modifikatsiooni eesmärgid: kaitsevad valke lagundamise eest, osalevad rakusiseste signaalide ülekandel, moodustavad raku pinnamarkereid ja olulised valkude aktiivsuse regulatsioonil.
Valkude ruumiline struktuur
sõltub ümbritsevast keskkonnast. Nt vee keskkonna struktuur (H-sidemete moodustamise võime) suunab valkude struktuuri teket ja püsimist. Valgu sekundaarstruktuur moodustub samuti vesiniksidemete varal. H-sidemed tekivad peptiidsidemete amino- ja karboksüülrühmade vahel. Põhilised elemendid α heeliks ja β leht (lamepoogen).
Valkude tertsiaalstruktuur – aminohapete külgahelate omavahelise seondumise tulemusena. igale valgule spetsiifiline. Suur ruumiliste struktuuride mitmekesisus (valgud koosnevad erinevatest AH-dest). Ruumiline struktuur on valkude bioloogilise funktsioneerimise alus.
struktuuri motiivid – eraldiseisvad ruumilise struktuuri elemendid. Sisaldavad sageli sarnaseid AH järjestusi – primaarstruktuuri motiive. Sarnased ruumilise struktuuri motiivid = ühesugune bioloogiline funktsioonide läbiviimine. Osa domäänist.
valgu struktuurne domään – iseseisva struktuuri ja funktsiooniga üksus, mis moodustub pidevast järjestusest. Kannavad kindlaid funktsioone. Struktuurne motiiv ja domään üldjuhul ei kattu. Motiiv on domään osa. Nt kaheahelalise nukleiinhappega seondumise motiivid: heeliks- ling -heeliks, heeliks-pööre-heeliks, positiivselt laetud α heeliks, Zn sõrm – ei moodusta iseseisvaid domääne.
Biokeemilisi funktsioone viivad läbi mitmest polüpeptiidist koosnevad valgu kompleksid. Enamus ensüüme koosnevad: a) mitmest subühikust b) esinevad multiensüüm kompleksidena
Funktsionaalsed kompleksid tekivad valkude omavahelise seondumise tulemusena – kvaternaarne struktuur. Valkude omavaheline seondumine põhineb AH külgahelate interaktsioonidel (nagu valgu domäänide omavaheline seondumine).
Valgu ruumilise struktuuri teke – valkude voltumine
Ruumiline struktuur on määratud valgu järjestuse poolt. Ei ole 1:1 funktsionaalne sõltuvus. Üks valgujärjestus võib eksisteerida mitmes erinevas konformatsioonis. Haigused on põhjustatud valkude struktuuri muutustest. Valgu struktuuri muutust võib põhjustada nt mutatsiooni valgu geenis. Muutunud ruumilise struktuuriga valgud on halvasti lahustuvad ja agregeeruvad – agregeerumine põhjustab haigusi. Jaotatakse kaheks, olenevalt kuhu lahustumatud agregaadid kogunevad: 1) ladestuvad valkude agregaadid rakkude sees – Parkinsoni tõbi, Huntingtoni tõbi 2) süsteemsed amüloidoosid – valkude agregaadid rakkude vahelises ruumis.
Valgusünteesijärgne protsess. Protsessis osalevad molekulaarsed lapsehoidjad chapronid, mida on mitut erinevat tüüpi. Kontrollivad valgu sobivust. Valkude kvaliteetkontrolli mehhanism .
Chaperone võib olla 1 või mitu. Kui chaperon ei suuda anda sellist konformatsiooni, nagu vaja, siis läheb valk proteasoomi. Paljud avastati selle järgi, kui avastati kuumaehmatusvalgud. Ülimalt konserveerunud valgud. Nii inimestel kui bakteritel on nad ühesugused. Hsp60 perekonna valgud tegelevad posttranslatsioonilise voltumisega. Tünnikesed, sees auk, kuhu valk sisse võetakse, kaas pannakse peale (60 teine pool Hsp15). Hüdrolüüsitakse ATP, hoitakse ja tegeletakse temaga seal nii kaua, kuni struktuur muutub. Toimub ATP vahendusel. 2. perekond on Hsp70 ja Hsp 40 valgud, Seotud sageli ko-translatsioonilise transpordiga. Kuna valgud on seotud ka replikatsiooni protsessiga, siis algselt olid teise nimega. Algul identifitseeritud kui replikatsioonil vajalikud - suunavad replikatsiooni struktuuride muutusi. Töötavad sageli riboosoomsõltuvalt. Haaravad ribosoomi, kui valku alles sünteesitakse. Ka ATP hüdrolüüsi toimel vabaneb korrektse struktuuriga valk. Valkudel on väga erinev eluiga, aga see on täpselt kontrollitud. Seda kontrollib terve suur süsteem, mis koosneb samuti valkudest, Olemas ka ubikvitiin – nagu märgid, neid on palju, tavaliselt pannakse valgule otsa, et tähistada mingit funktsiooni, tüüpiline märk, et kui ubikvitiin küljes, siis läheb lagundamisele. Ubikvitiin pannakse algul E1 külge, see seostub E2 ja E3 kompleksiga, kõigepealt kantakse E1-lt E2-le. E3 on valk, mis on spetsiifilisuse faktor. E2-ga seotud ubkivitiin pannakse kandjavalgule. Pannakse veel ubikvitiine otsa. Polüubikvitineeritud kompleks , mis läheb proteosoomi. E1 on lihtalt kandja, vahendaja. Nii valkude lagundamine kui modifitseerimine on lõpule viidav. Ei jää rakku poolenisti lagunenud valke. Valkude eluiga on määratud N-terminaaliga. On küll alguses Met, kuid pärast sünteesi protsessitakse, N-terminus lõigatakse peaaegu alati maha. AH võib olla destabiliseeriv või stabiliseeriv. Tuntakse N-terminaalse reegli järgi.
Paljud chaperonid on kuumaehmatuse valgud – sünteesitakse siis, kui on kõrge temperatuur. Hsp 70 suunatud voltumine. Hsp 40 kofaktoriga. Suunavad mingi konformatsiooni muutust, on DNA replikatsiooniga seotud valgud . Suunavad vajalikke struktuuri muutusi. Kui on mutatsioon , siis DNA sünteesiks vajalikud valgud ei moodusta õigeid struktuure. Töötavad sageli ribosoomsõltuvalt. Haaravad sünteesitud valgu kaissu juba siis, kui sünteesiti. Osalevad ruumilise struktuuri katkes. Vabaneb korrektse struktuuriga valk. Proteasoom – koosneb 20S ja kahest 19S otsast, palju monomeere, torujas struktuur. Kui valk ubikvitiiniga läheb toru sisse, ei pääse välja muud kui AH-d ja väikesed polüamiinid. Esinevad destabiliseerivad AH-d.
Protsessiivsus – nähtus, kus üht valku sünteesitakse ja kui palju seda tehakse (85% initsiatsioonidest jõuavad terminatsioonin). Vahepeal võib RNA katki minna või modifitseeruda.
Valgud sünteesitakse mRNA-delt ribosoomides.
Enamusel tekib funktsionaalne struktuur sünteesi käigus ja see toimub kiiresti. Oluline, millises keskkonnas süntees aset leiab:
1) membraanseoseliste ribosoomide poolt – valk satub peale sünteesi kohe membraani, järjestuse voltumine (ruumiline struktuur) tekib membraanis. Membraanis on hüdrofoobne keskkond
2) vabade ribosoomide poolt – satuvad peale sünteesi tsütoplasma keskkonda (vesi), tekib teistsugune ruumiline struktuur.
Ruumilise struktuuri teket suunab ja mõjutab chaperoni valgud. Suunavad valkude voltumist sünteesi käigus – aitavad sünteesile kaasa või katkestavad lõpliku ruumilise struktuuri teket enne kui valk on oma sihtkohta viidud. Väiksemate valkude ruumiline struktuur tekib iseenesest sünteesi käigus ja ei vaja lisafaktoreid (ruumilise struktuuri tekkeks vajalik info valgu primaarstruktuuris).
Ribunukleaas A (RNaas A) – denatureerida (kuumutamise, keemiliste ainetega), jääb primaarstruktuur muutumatuks, lagunevad vaid nõrgad sidemed, mis ruumilist struktuuri kinni hoidsid. Renatureerub kui on sobivad kofaktorid – valgu ligandid, mis stabiliseerivad tema struktuuri. Nt metalli ioonid (moodustavad valgu struktuuris koordinatiivseid sidemeid). Renatureerimist kiirendavad ensüümid – valgu disulfiidi isomeraas, peptidüül-prolüül isomeraasid – kiirendavad disulfiidsidemete vahetust või proliini konformatsiooni muutust. Kiirendavad ka chaperonid.
Chaperonid erinevad funktsioonid – toimivad valgusünteesi käigus, osalevad valgu transpordil ja hoiavad ära lõpliku konformatsiooni teket, osalevad valkude renaturatsioonil kiirendajana.
Hsp 60 – chaperon, kiirendab renaturatsiooni (bakterites GroE). Moodustab toru, millesse siseneb denatureerunud valk. ATP hüdrolüüs harutab ta lahti ja aktiivne struktuur taastatakse.
Kuumaehmatuse valgud – vajalikud rakkude temperatuuritaluvuse tagamiseks, temperatuuri tõus muudab valkude ruumilist struktuuri.
Valk saab oma struktuuri:
1) kotranslatsiooniliselt – sünteesi käigus
2) lokalisatsioonist sõltuvalt – peale transporti raku kompartementi
3) ümbervoltumine – chaperonide poolt suunatud
4) iseeneselik
Valgud:
1) lahustuvad valgud – ujuvad tsütoplasmas ringi
2) poollahustuvad – tsütoskeletis (tubuliin, aktiin)
3) tuumavalgud – histoonid , Ri, TR faktorid
4) tsütoplasma organellide (mitokonder, kloroplast) valgud
5) tsütoplasma membraani struktuuri valgud (Golgi, ER)
6) sekreteeritavad valgud – translokatsiooni signaalid
unitaarne valk – toimib tervikuna
modulaarne valk - valgu üks osa = üks domään, millel on oma iseseisev funktsioon.
Nukleiinhapete struktuur
Nukleiinhapped on polümeerid, mis koosnevad nukleotiididest. Nukleotiid koosneb – suhkur + lämmastikalus + fosfaatjääk, aga nukleosiid – suhkrujääk + lämmastikalus. DNA ja RNA erinevad üksteisest suhkrujäägi poolest. Selgroog (suhkru- ja fosfaatjääk) on ühesuguste lülide kordus ja lisanduvad külgahelad (lämmastikalused). Suhkrujäägid fosfaatidega on ühendatud fosfodiestersideme abil. Nukleiinhappe monomeer on nukleotiid.
DNA ahelad on antiparalleelsed ja üksteise ümber käändunud. Esineb suur ja väike vagu – väikeses vaos suurem osa aluspaare. Lämmastikalustepaarid on keskel.
Lämmastikalus
nukleosiid
nukleotiid
adeniin
adenosiin
adenüülhape
guaniin
guanosiin
guanüülhape
tsütosiin
tsütidiin
tsütosüülhape
tümidiin
tümidiin
tümidüülhape
uratsiil
uridiin
uridüülhape
Lämmastikalused:
puriinid – A ja G
pürimidiinid – C, T ja U
riboos ja desoksüriboos – pentoosid
suhkru aatomeid tähistatakse ’ (prim)ga. Lämmastikaluse aatomeid lihtsalt numbriga.
Fosfaatjäägiga on seotud 3’ ja 5’ C aatomid. Trifosfaatides on fosfaadid seotud C5’ga. Suhkruaatomite järgi nimetatakse nukleiinhapete otsi 5’ ja 3’ otsteks.
Nukleiinhapete sünteesi suund: 5’→3’. Järgmine nukleotiid lisatakse 3’ otsa.
Vabale 3’OH-le lisatakse nukleotiid nii, et suhkru OH ühineb fosfaadi vesiniku aatomiga, vee molekul vabaneb ning 3’C ja järgmise nukleotiidi fosfaadi vahel tekib fosfoester side. Polükondensatsioonreaktsioon – nukleiinhapete süntees.
Lämmastikalused on aromaatsed ühendid ja moodustavad vesiniksidemeid, mille abil teineteisega seonduvad – aluste paardumine .
DNA struktuur
Wilkins ja Franklin kasutades kristallograafia meetodeid, leidsid, et DNA-l esinevad fibrillid.
J. Watson ja F. Crick esitasid 1953. a DNA ruumilise struktuuri mudeli. Koosneb 2 nukleiinhappe ahelast , mis moodustab kaksikspiraali läbimõõduga 20A. Suhkur- fosfaat selgroog on väljaspool ja lämmastikalused on heeliksi sees. Lämmastikalused paarduvad omavahel vesiniksidemetega. Paari moodustavad puriinide ja pürimidiinide vahel.
A-T (2 vesiniksidet) ja G-C (3 vesiniksidet) – komplementaarsed paarid. Need on isosteerilised paarid (täidavad sama ruumiosa).
Regulaarne ja ühtlase jämedusega kaksikspiraal.
DNA kaksikheeliks teeb ühe täispöörde 34 A kohta. Aluspaaride vahe on 3,4 A. Ühe täispöörde kohta on 10 aluspaari .
DNA ahelad kaksikheeliksis on antiparalleelsed – suhkru ja fosfaadi vahelised fosfoestersidemed on vastasahelates vastassuunalised. Antiparalleelsus tähendab, 5’ ja 3’ otsa kohakuti asetsemist.
Ahelate otsad on samuti erinevad, ühes heeliksi otsas on desoksüriboosi 5’C ja teise ahela 3’C (sellega seotud OH). Heeliksi teises otsas on desoksüriboosi 5’ C ja esimese ahela 3’C (sellega seotud OH).
DNA kaksikheeliks moodustab parempoolse vindi. Kui mingis piirkonnas on parempoolseid vinte liiga palju, saab seda kompenseerida vasakpoolse vindiga (Z-DNA)
Iga kaksikheeliksi täispöörde kohta toimub üks kord ahelate teineteisest üleminek ehk seostumine. Ahelate lahutamiseks on vajalik, et kaksikheeliks teeks ümber oma telje sama arv pöördeid kui temas on vinte. DNA ahelad on omavahel seotud nõrkade – arvukate – vesiniksidemetega lämmastikaluste vahel – seetõttu on DNA ahelad lahutatavad (nt temperatuuri tõstmine). See on pöörduv.
DNA ahelate paardumisel tekivad paljud struktuurid , kus ahelad on osaliselt iseendaga paardunud (takistab kaksikahela teket). Võivad tekkida struktuurid, kus eri ahelad on paardunud, aga juhusliku komplementaarsuse alusel. Korrektse struktuuri tekkeks peavad kõik valed struktuurid lahti sulama ja tekib korrektne kaksikahel. Et saada terves ulatuses paardunud DNA kaksikheeliks, on vaja ahelate paardumine pika aja jooksul temperatuuril, kus ahelad on osaliselt paardunud ja valed struktuurid ei püsi. DNA sulamine – ahelate lahutamine temperatuuri toimel. Tm – temperatuur, mille juures ½ nukleiinhape ahelates on lahti sulanud. Need piirkonnad, mis sisaldavad G-C paare on stabiilsemad ja sulavad kõrgematel temperatuuridel (3 vesiniksidet).
DNA-l esinevad struktuurivormid: A, B ja Z.
Rakkudes on DNA B-vormis (aluspaaride väike kalle heeliksi telje suhtes, aluspaarid asuvad heeliksi keskel (teljel), fosfaatrühmad väljaspool, järgmises ringis riboosid; suur/väike vagu esineb. B-vormis on kõige painduvam (elastsem), võib moodustada rõnga 200 bp pikkuse lõigu kohta – see omadus võimaldab DNA pakkimist kromosoomidesse ja nukleosoomide moodustumist. Vesiniksidemed stabiliseerivad DNA struktuuri. B-vormis pöörub paremale. 2’ C juures ei ole O
RNA on A-vormis. Suur ja väikest vagu pole näha, suur = sügav vagu. väike = hästi madal. aluspaaride asukoht selles vaos. Väljas on fosfaadid; riboosid ja lämmastikalused on enamvähem kohakuti ja keskel on auk. RNA-l on veel lisa vesinikside, mida DNA-l pole. Kaheahelaline RNA on stabiilsem kui dsDNA. Aluspaaride roll stabiliseerimisel on väiksem. 2’ C juures on O
RNA-s:
- 2’ O suunab kiiremale lagundamisele
- esinevad kaheahelalised struktuurid molekuli paardumisel iseendaga
- kaksikheeliks jäik ja ebaregulaarne
- aluste stäkkumine (järjestikuste nukleotiidide vahel, van der Waalsi jõudude abil – nõrgad elektromagneetilised jõud)
- struktuur globulaarne
- A-vormis
DNA-s:
- koosneb kahest eraldi ahelast
- kaksikahel on paindlik ja regulaarne
- kaksikheeliksit stabiliseerib lämmastikaluste paardumine - määrab samas ka struktuuri
- struktuur fibrillaarne (kiud)
- B-vormis
Puriin paardub pürimidiiniga:
A – T, 2H sidet, tasapinnaliselt
G – C, 3H sidet, stabiilsemad, tasapinnaliselt
P-vorm – Paulingi DNA mudel (enne Watson Cricki oma). Eripära: fosfaadid ja riboosid on keskel, lämmastikalused väljaspool.
Nukleosoom (DNA kompleksis histoonidega, topoloogilise pinge all)
140-160 bp 2- ahelaline DNA + histoonide oktameer. 1,67 pööret on moodustatud 147 DNA aluspaarist.
Kui sünteesitakse uus DNA, tuleb osaliselt DNA histoonidest lahti harutada. DNA süntees on väga kiire – iga sekundiga tekitatakse 3 nukleosoomi jagu DNA-d.
Histoonid on väikesed (102-135 AH) valgud. Oktameeri moodustavad H2A, H2B, H3, H4 (2 kordselt) – kokku 8 polüpeptiidi. H3 ja H4 moodustavad tetrameeri; üks H2A dimeer, teine H2B dimeer – oluline nukleosoomi lahtiharutamiseks.
H3 ja H4 – tetrameerid on kogu aeg koos ja need jäävad seotuks ühe ahelaga pärast replitseerimist. Teisele ahelale peab uued panema. Histoonid peavad juba valmis olema. H2A ja H2B dissotseeruvad.
Histooni chaperonid – juhivad uued histoonid tütarDNA juurde. Kontrollib, et moodustaks tetrameer sellega, kellega peakski. Aitavad nukleosoomi moodustada. Erinevatel chaperonidel on erinevad rollid
kokkupakkimisel.
Nukleosoomis on histoonide ja DNA vahel 142 vesiniksidet. Nukleosoomide vahel on DNAga seotud H1 (histoon). H1 on oluline kromatiini struktuuri kohaselt.
Histoonidel on üheahelalised DNA sabad, mis ulatuvad nukleosoomist välja. Olulised sündmused on mõjutatud sabadest. H3 koht – sealt läheb DNA välja. H2A ja H2B ei ole otstega seotud, vaid ainult selle järjestusega.
H3 ja H4 N-terminaalsete otste modifitseerimine on oluline geenide ekspresseerimisel.
Histoonide laengust sõltub, kui kõvasti on DNA küljes kinni.
Histoonid tagavad DNA-l topoloogilise pinge, DNA on „ülekäänatud“.
PCNA – kahest identsest subühikust moodustunud rõngas, mis keerub ümber DNA. See aitab DNA-l nukleosoomi struktuuri moodustada.
Fiiber – kromatiinis nukleosoom DNA-ga pakitud. Läbimõõt 300 A. Nukleosoomid paiknevad DNA fiibris zig-zag mudeli kohaselt.
Kokkupakkimiseks on vesiniksidemed head, kuna on suhteliselt nõrgad – ahelate katkestamine on raske, ahelate lahutamine aga kerge.
30 nm DNA fibrill – sisaldav kolmeastmelist vinti. DNA kokkupakkimisel on oluline teada, et seal on väga palju erineva astme vinte. Need on omakorda seotud järgmise astme struktuuridesse ja nii moodustubki kromosoom
Kui uus DNA on sünteesitud, siis oluline protsess – lipukeste külgepanek DNA-le ja histoonidele. Histoonid, eriti H3 ja H4, mis jäävad DNA-ga seotuks, nende N-terminaalsetel sabadel on postmodifikatsioonilisi jääke. Histoone tuleb ka modifitseerida, atsetüleerimine on kõige tähtsam, eriti olulised on H3 jaH4 puhul. Histoonid koosnevad kindlatest struktuurielementidest. Kõigil on teatud sarnane struktuur. Palju hiiresabasid, igal histoonil on 2 saba.
Soleid = heeliks, mudelil keskel auk. Aitab stabiliseerida DNA molekuli.
zig- zag mudel – iga järgmine histoon on eelmise histooniga risti. Siin keskel auku ei ole. Võimaldab DNA-d tihedamini kokku pakkida.
DNA kõrgemat järku struktuurid ja ensüümid:
Topoisomeraas 1 – tekitab DNA-s üheahelalisi katkeid. Ei vaja ATP-d. DNA topoloogiliste pingete lõdvendaja st laseb vinte välja. Pärast ühendab tagasi ja laseb vintidel juurde tekkida. Seondub kaheahelalise DNA-ga. Muudab L (ahelate seotust ja täispöörete arvu). Oluline replikatsioonil.
Topoisomeraas 2 – tekitab DNA-s kaheahelalisi katkeid (fosfodiestersidemed lagundatakse). Vajab ATP-d. Mõjutab supervintide arvu (T) ja tekitab supervinte juurde. Tekitab DNA kõrgemat järku struktuure ja on vajalik DNA tihedaks pakkimiseks kromatiini. Seda inhibeerivad antibiootikumid või madalmolekulaarsed ained. Osa geenide avaldumiseks vajalikud.
DNA riststruktuur tekib juhul, kui sellest on linge välja keeratud. DNA topoloogia säilitamiseks oluline struktuur – 5’ ja 3’ otsad on sarnased:
TCGTT ACCGA
AGCCA TGGCT
juuksenõelastruktuur – kui on peegelpilt, sees kolmeahelaline struktuur.
Neljaahelaline struktuur on oluline kromosoomi otste ärapeitmiseks ( oligo G järjestused)
DNA järjestuse sümmeetria:

• kordusjärjestused: pööratud, peegel - ja otsesed kordusjärjestused
  
• peegelkordusjärjestused on tähtsaimad , sest DNA saab moodustada riststruktuure.
  
• supervint – kõrgemat järku vint
  
• Rõngasmolekulide (DNA, mille otsad on fikseeritud, plasmiidid ja tsirkulaarsed viirused ) valem:
  

L = T + W
L – linking – mitu korda üks ahel teisest üle läheb
T – täispöörete arv
W – kõrgemat järku spiraalid

• topoisomeraasid – DNA struktuursete üleminekute kontroll
  

Info DNA-s peab olema ühtlasi säiliv ja kättesaadav: inimeses on:
igas rakus 6 miljardit aluspaari (bp), mille kogupikkus on 2m. 1014 rakku, rakutuuma läbimõõt on paar mikromeetrit.
Valgu biosüntees ehk geneetiline translatsioon
jaotub kahte etappi :
1) preribosoomne – väljaspool ribosoome, AH aktiveerimine ATP-ga ja AH ühendamine spetsiifilise tRNA-ga. Sünteesitakse aminoatsüül-tRNA (aa-tRNA).
2) ribosoomne – ribosoomides, substraadina aa-tRNA, mRNA programmi järgi, aa-tRNAs seotakse AH vastava nukleiinhappe järjestusega (antikoodoniga). Ühendatakse AH omavahel.
Nukleiinhappe järjestusest üleminek AH järjestuseks toimub geneetilise koodi alusel.

Translatsioon – valgusüntees RNA alusel

Valkude struktuur ja funnktsioon on määratud tema primaarjärjestusega. DNA kaheahelaliselt saadakse üheahelaline mRNA ja selle alusel sünteesitakse valk. RNA süntees on lihtsam – süntees toimub komplementaarsuse alusel, igale nukleotiidile vastab teine nukleotiid, osaleb RNA polümeraas ja vajalikud nukleotiidid . Translatsioon on keerulisem – paljud molekulid, AH-d, ATP, GTP, kofaktorid, hulk valke. tRNA-sid osaleb translatsioonil ca 40 erinevat. tRNA otsas on AH – aminoatsüül-tRNA (3’ otsas on AH). Translatsioonifaktorid aitavad läbi viia translatsiooni. Esinevad initsiatsioonifaktorid (3), elongatsioonifaktorid (EF-Tu, EF-Ts ja EF-G, eukarüootides on need EF1A, EF1B ja EF2) ja terminatsioonifaktorid (RF-1, RF-2, RF-3, RRF, korraga toimub ainult kas RF-1 või RF-3 – aitavad valgusünteesi lõpetada ja suunavad produkti vabanemist). RRF – aitab ribosoomi vabastada, vajalik selleks, kui ribosoom on ühe valgu sünteesinud, siis saab teist hakata sünteesima.
mRNA 5’ → 3’ suunas hakatakse lugema. Ribosoom loeb mRNA-d samas suunas, kui teda sünteesitakse. Protsessid mõlemas suunas. Valkude puhul aminoterminusest karboksüterminuse poole. mRNA-s loetakse koodonid üksteise järel. Esmalt toimub initsiatsioon – valk mRNA järkestuse alusel, elongatsioon , kuni jõutakse stoppkoodonini ehk terminatsioonikoodonini. Ribosoomi substraat on tRNA. Ribosoomis on tRNA sidumiseks 3 piirkonda (A-, P- ja E- sait ). P-sait on keskel, A-sait 3’ suunas. P –sait – peptidüültRNA jaoks. A-sait – aminoatsüültRNA sidumiseks, pidama jääb selline valk, mille koodon- antikoodon seostumine sobib. tRNA on alguses A-saidis, hiljem P-s. P-l on kasvav peptiid . mRNA on seotud ribosoomi väiksema subühikuga. Selleks on mRNA-l väike kanal olemas. E-sait on koht, kuhu tRNA seostub enne vabanemist, Elongatsiooni käigus on ribosoomiga seotud kaks tRNA-d korraga. Suures subühikus on auk, kust kasvav peptiid läbi läheb.
E- exit- sait - terminatsioon
Geneetiline kood
sõnastik, mille abil tõlgitakse nukleiinhapete järjestuses sisalduv geneetiline info valkude AH järjestuseks.
Kolme nukleotiidiline järjestus – koodon – vastab ühele AH-le.
valgusünteesi info kandja – RNA – 4 nukleotiidi – 43 – 64 kombinatsiooni. Kood on universaalne (elu monofüleetilisus), sünonüümne (sama tähendus ja kodeerivad samu AH), mitmetähenduslikkus (ühele AH vastab mitu koodonit ).
Bakteritele on letaalne, kui neil tekib 1-2 mutatsiooni põlvkonda.
Koodi kõdunemine – ühele AH vastab mitu koodonit, info kõdunemine geneetilise informatsiooni käigus st et osa infot läheb tõlkimisel kaduma.

• Kolm stoppkoodonit – UAA, UAG, UGA - (terminaatorid, nonsens koodonid) – ei vasta sellele ühtegi AH, kasutatakse valgusünteesi lõpetamiseks.
  
• startkoodon AUG, prokarüootidel GUG
  

Terminaatoreid tunnevad ära terminatsioonifaktorid, mis osalevad valgusünteesi lõpetamisel.
Aminohapped on organiseeritud koodis – ühele AH-le vastavad koodonid paiknevad tabelis lähestikku, sünonüümsed koodonid erinevad keskmise tähe poolest.

• Sünonüümsed koodonid – teevad evolutsioonis sünonüümseid asendusi. Mutatsioonid 3-tähelised, vastavat AH ei muuda. Kui mutatsioon siiski muudab, siis 30 % tõenäosus, et asendub AH sarnaste omadustega AH-le.
  

Ser ja Arg vastavad 6 eri koodonit. Neist 4 koodonit asuvad koos, koodonite 1. ja 2. täht on sama. Ülejäänud 2 asuvad eraldi. Ile vastab 3 koodonit. 16S RNA moodustab vesiniksidemeid nii mRNA kui tRNA vahel.
Koodoni perekond – koodonite rühm, mille tähendus on määratud 1. ja 2. tähe abil st olenemata koodoni 3. positsioonist ja mis kõik vastavad ühele AH-le.

• Kõige olulisem positsioon on koodoni 2. täht (keskmine, erand: Ser (keskmine täht C või G), Arg, Leu – vanemad koodi esindajad), siis tuleb 1. täht.
  U - keskel → hüdrofoobne AH
  C-keskel → neutraalsed, hüdrofiilsed AH
  A-keskel → laenguga, (va Tyr)
  
• 1. täht on 5’ otsas ja 3. täht on 3’ otsas.
  

UGK (universaalne geneetiline kood) – 8 koodoniperekonda (8 AH puhul pole 3. täht oluline).
7 AH puhul on koodoni tähendus määratud 3. tähega (puriin (A, G) /pürimidiin (U, C).

• Ainult Metioniini (AUG) ja Trüptofaani (UGG) puhul on 3. täht ühetähenduslik (3. on G). Vastab vaid üks koodon.
  

Koodoni kolmanda tähe mitmetähenduslikkus – kõdunemine – võimaldab sama AH järjestust kodeerida erinevate nukleiinhappe järjestuste abil.
Sünonüümsed asendused – 3. tähe asendused, mis ei muuda valgu AH järjestust.
AH keskmine sagedus 5 % ühe konkreetset aminohappe kohta.
Koodon antikoodon interaktsioon toimub ribosoomis, kus mRNA koodonile seatakse vastavusse tRNA antikoodon.
RNA esineb A-vormis. G saab paarduda nii U kui C-ga. G-U paardumiseks vajalik struktuurne vabadus on olemas koodon-antikoodon paardumisel 3. positsioonis (vastab antikoodoni 1. tähele).
Wobble reegel – koodoni kolmanda positsiooni suurem vabadus paardumisel. Võib esineda GU ja UG paarid). Võimaldab tRNA-d kokku hoida (va Metioniin ja Trüptofaan) st tRNA-d kulub vähem ja valgusüntees toimub kiiremini. 61 AH koodoni kodeerimiseks ja alla 40 tRNA!
tRNA-sid on rohkem kui AH-sid, aga vähem kui koodoneid. Neid pole lihtsalt nii palju vaja.
tRNA suudab dekodeerida (ribosoomide abil transleerida) kahte koodonit juhul, kui tema antikoodoni 1. kohal on G või U.
Kui tRNA 1. kohal on G, siis kodeerib koodonit, mille 2 tähte on samad ja 3. pürimidiin (C või U)
Kui tRNA 1. kohal on U, siis kodeerib koodonit, mille 3. on puriin (A või G).
valelugemine – koodonit transleeritakse valesti.
Sarnased AH paiknevad kooditabelis lähestikku. Juhuslikud vead ei muuda sünteesitava valgu omadusi eriti suures ulatuses, kuna AH asendub lähedaste omadustega AH-ga.
UGK on vigade summutamise suhtes optimaalne, kood on „külmunud õnnetus“ – tekkis kood ja enam ei saanud muutuda. Mõned asendused on UGKs aset leidnud väikeste genoomide puhul.
Mida sagedamini esineb AH, seda rohkem vastab talle koodoneid. UGK on pikk evolutsiooniline ajalugu.
Kõige väiksemad genoom on mitokondritel, kus esinevad erinevused UGK-st.
Luca – ühine universaalne konserveerunud eellane, põhineb GK-il.
CAI – koodoni adaptsiooni indeks – igale koodonile antakse arvuline väärtus vastavalt tema esinemissagedusele võrreldes kõige sagedamini esinevaga (võetakse eeskujuks, millega võrreldakse). Selle põhjal saab ennustada valgu ekspressiooni taset. Kõrgelt ekspresseeruvatel on indeks kõrgem.
Mitokondri GK jagunevad:
taimsed - universaalne kood
mittetaimsed – erinevad universaalsest koodist
Genoomi suuruse ja koodi stabiilsuse vaheline seos tuleneb koodi külmunud olemisest. Kui GK ühe koodi tähendus muutub (tRNA hakkab uut ära tundma), toob kaasa mutatsiooni kõigis geenides, kus vastav koodon esineb. Muutused geneetilises koodis on letaalsed.
Väga väikeste genoomide puhul esineb üks kindel koodon ühes või kahes geenis ja üksikud AH asendused valkudes ei pruugi omada suurt mõju organismi eluvõimele. Juhuslikud muutused saavad evolutsioneerida – tekib alternatiivne geneetiline kood.

• Koodilugemisvea sagedus – 10-4. 1 viga 10000 õigesti loetud koodoni kohta.
  
• Lugemisraam oleneb sellest, mitmendast nukleotiidist lugema hakatakse, üht järjestust saab hakata lugema mitmest kohast → eri valgud
  
• geneetilise info kadumine – sünteesitakse valk, millelt osa infot kaob.
  
• sagedased ja haruldased koodonid on selleks, et hoida kokku tRNA-d (haruldasi kasutatakse vähe ja seda tRNA-d on rakus vähe)
  

Mitokondriaalne GK
UGK
Lihtsam kui UGK
Kõik koodonipaarid kodeerivad samu AH-eid
AUA vastab metioniin
UGA vastab trüptofaanile
Arginiinil 4 koodonit
4 stoppkoodonit (UAA, UAG, AGA, AGG)
Valku saab sünteesida vähemate tRNAdega
tRNAdel antikoodoni 1. kohal U
ei ole ühekoodonilisi AH vastavusi
kood on lihtsustunud ja saab läbi vähemate
tRNA-dega.
AUA vastab isoleutsiinile
UGA on stoppkoodon
Arginiinil 6 koodonit
3 stoppkoodonit (UAA, UAG, UGA)
Teistes organismides on sage UGK stoppkoodoni asendus UGA Trp koodoniga. Neil organismidel on 2 stoppkoodonit.
Pärmseentel (Candida perekond) – leutsiini CUG transleerimine seriinina. CUG koodonit transleerib seriini tRNA antikoodoniga CAG. CAG lülitab peptiidahelasse nii seriini kui leutsiini (leutsiini väikse sagedusega) – erakordne.
Taimemitokondris on UGK (erinev inimesest):
Stop → UAA, UAG, AGA, AGG
Met → AUA, UAU
Ile → AUC, GAU, AUU
DNA – tRNA – mRNA – valk
A T T C T A C G A A G A T G T C G A T C G A T C T A T T C DNA
U A A G A U G C U U C U A C A G C U A G C U A G A U AA G mRNA (siit loed vastavaid AHsid)
A UU C U A C G AA G A U G U C G A U C G A U C U A UU G tRNA
tRNAde standardiseerimine – sünteesitakse väiksel arvul tRNAsid ja nii säästetakse energiat. Ohtralt avalduvad geenid kasutavad väikest arvu koodoneid. Rakk saab vähema energiavaruga hakkama.
Koodonite järgnevus pole juhuslik ja 3. täht sõltub järgmisest koodonist.
Ribosoomis tunneb tRNA antikoodon ära koodoni. rRNA nukleotiid kompab väikeses vaos aluspaari geomeetriat.
2. tähe äratundmine – tekib võrgustik, palju vesiniksidemeid
3. tähe äratundmine – „wobble“ lubatud, aluspaari geomeetriat ei kontrollita , vesiniksidemed pole tähtsad.
Antikoodon

• tRNA ühes lingus
  
• koosneb 3-st nukleotiidist
  
• antikoodon tRNA-s paardub ribosoomi koodoniga.
  
• AU ja GU paar on võrdse stabiilsusega. Nt RNA: GUG või GUA 5’ →3’ → Val
  

RNA antikoodon tRNA → CAU 3’→5’.

• 3. G-le kui 3. A-le vastab tRNA-s U → tRNA-d hoitakse nii kokku ja tehakse vähem vigu
  
• 1 tRNA suudab kodeerida mitut erinevat DNA koodonit.
  

Transport (tRNA) RNA struktuur
tRNA-st üldiselt:
molekul, kus realiseerub geneetiline kood. Väga stabiilne molekul, omab väga jäika struktuuri. Sekundaarstruktuur – 4 kaheahelalist osa, 3 lingu , 4 viimast nukleotiidi 3’ otsas on üksikahelas. Viimane nukleotiid 3’ otsas on A – alati 76. positsioonis. Alguses sünteesitakse tRNA nii nagu tavaliselt. Pärast transkriptsiooni lisatakse tRNA-le modifitseeritud nukleotiide – posttranskriptsiooniline modifikatsioon. Need on kindlates kohtades. tRNA tertsiaalstruktuur – L-tähe kujuline. Ruumiline struktuur tekib nii, et õlad liituvad üheks ühiseks heeliksiks. Liituvad akseptorõlg ja T- õlg ning antikoodon- ja D-õlg. Tänu heeliksite liitumisele satuvad D- ja T- ling üksteisele lähedale ja nende vahel toimub aluspaardumine. Üks kõige stabiilseima struktuuriga bioloogiline molekul. α- vormis heeliks, keskel on auk. Vabas tRNA-s on antikoodoni nukleotiidid juba peaaegu heeliksis, oleksid juba nagu paardunud. Nukleotiidid paarduvad äärmiselt kergesti. Vabad on ainult 3 nukleotiidi. Üks nukleotiid antikoodonist 3’ suunas ja alati hüperpolariseeritud – ei saa moodustada vesiniksidemeid, kuna on radikaali küljes. Modifikatsiooni mõte, et kui mRNA paardub tRNA-ga, siis paardumine piirduks, ei leviks. Muidu tekiks kaheahelaline molekul, millega pole midagi peale hakata. 5’ suunas konserveerunud U – sellel on oma struktuur – U hoopis teisel pool. mRNA ei saa paarduda teisele poole, ei ulatu, kuna molekulis tekib järsk pööre. Ühelt poolt takistab hüpermodifikatsiooni, teiselt poolt tekib järsk pööre. tRNA struktuur ilus näide, kuidas ruumiline strukuur tagab tema funktsioneerimise

• molekuli pikkus 74-92 aluspaari.
  
• esimene nukleotiid on 5’ otsas, antikoodoni moodustavad nukleotiidid 34, 35, 36. Hakatakse nummerdama 5’ otsast. 36. vastab mRNA 1. nukleotiidile.
  
• enne antikoodonit on N 33
  
• antikoodon (kolmenukleotiidiline), seostub mRNA-ga.
  
• 18. nukleotiid võib olla paljude lisadega
  
• 3’ otsa järjestus CCA – konserveerunud (74, 75, 76 – alati, ükskõik kui palju on nukleotiide tRNA-s) – 4 heeliksit, 3 lingu ja üheahelaline järjestus
  
• sekundaarstruktuur on samuti konserveerunud (ristikheina lehe kuju):
  
• 4 kaheahelalist osa (õlg) ja 4 üksikahelalist piirkonda ( 3 lingu e. aasa ja 4 paardumata nukleotiidi 3’ otsas).
  

Üksikahelalised piirkonnad paiknevad õlgade otstes .
tRNA molekulide otsad asuvad lähestikku. Kui nad paarduvad, tekib kaheahelaline osa e. õlg – akseptoorne õlg. 3’ otsas on üheahelaline piirkond, kuhu liidetakse aminohape estersidemega (karbonüülradikaali kaudu).
Akseptorõlg – akseptorheeliks – 3’ terminaalse A külge kinnitub aminohape. D-õlg, mille otsas on D-ling. Esineb alati (D) dihüdroolidiin. D-lingu vastas on D-õlg.
Akseptorõlg on 7 aluspaari (ei pea tingimata omavahel paarduma)
Antikoodonõlg – antikoodonheeliks - T-õlg: (modifitseeritud lämmastikaluste pärast nimi). Lämmastikalused paiknevad T-aasas. Järjestus TU*C on tRNA T-aasas konserveerunud. Need alused on ribosüültümidiin – T ja pseudouridiin – U*. 5 aluspaariline.
T-ling ja vastavalt T-õlg – rohkem konserveerunud, T – tümidiin (5- metüül -ribotümidiin).
tRNA-s esinevad modifitseeritud nukleosiidid:
- aluspaari ei saa moodustada.
Antikoodonlingus esineb sageli valesti modifitseeritud nukleosiid, et saaks kerge vaevaga paarduda mitme lämmastikalusega. Antikoodonlingus kaks nukleotiidi modifitseerimata.
Ala spetsiifiline tRNA – pannakse otsa alaniin .
hüpermodifitseeritud – keemiliselt muundatud, tugevdab stäkkumist
Pseudouridiin – isomeriseeritud uridiin – esinevad kõikides RNA stabiilsetes molekulides.
D-ling - aa
Posttranskriptsiooniline modifikatsioon – tRNA sünteesi käigus on sellel kohal harilik (ribosüültümidiin – T) U nukleotiid, mis muudetakse tümidiiniks juba tRNA koosseisus . Mõlemad eelpool nimetatud alused tekivad nii.
T-õlg on 5 aluspaariline, 5-ribosüültümidiin (5. positsioonist metüleeritud). T-aasas on 7-9 nukleotiidi.
Antikoodonõlg on alati 5 aluspaari pikk ja antikoodon ling sisaldab kolme (nukleotiidist) antikoodonit, mis määrab tRNA koodoni spetsiifika.
Antikoodoni lingus on alati 7 nukleotiidi ja sisaldab modifitseeritud nukleotiide.
D-õlg: koosneb 4st aluspaarist ja kannab D-lingu (dihüdrouridiinjääkidest nimi). D lingu pikkus on varieeruv.
Lisaks:
sisaldavad paljud tRNA molekulid lisaõlga/lisalingu, pikkus jällegi varieerub .
preribosomaalsed protsessid:

• kõik muudetud nukleotiidid sünteesitakse pärast transkriptsiooni – posttranskriptsiooniliselt. Antikoodonlingus on 37. ja 38. positsioonis modifitseeritud nukleotiidid
  
• antikoodonõlg ja D-õlg liituvad üheks heeliksiks. Akseptorõlg ja T-õlg liituvad teiseks heeliksiks.
  
• RNA koosneb kahest heeliksist, mis on omavahel risti – D- ja T -õlgade lämmastikaluste paardumine stabiliseerib seda
  

tRNA ruumiline struktuur
tekib heeliksite liitumisel. L-kujuline struktuur. Ühes otsas on antikoodon aas, teises otsas (3’) on aminohape kinnitunud.

• kõigile on omane 74 A – 34. nukleotiidi (2’OH) ja 3’ otsa vaheline kaugus. Põhjus: kõik seonduvad sama ribosoomi piirkonnaga.
  
• 37. ja 38. nukleotiid on modifitseeritud, ei moodusta aluspaare.
  

Akseptoorne õlg (heeliks) ja T-õlg (heeliks) - liitumisel moodustavad (ühise) heeliksi.
D-õlg (heeliks) ja ja antikoodon-õlg (heeliks) – liitumisel moodustavad teise (ühise) heeliksi.
Ruumilises struktuuris seega satuvad D- ja T- aas lähestikku ja on omavahel lämmastikaluste vaheliste vesiniksidemete abil ühendatud (tertsiaalsed H-sidemed) – stabiliseerib tRNA molekuli struktuuri.
Erinevate tRNA-de struktuur peab olema sarnane, sest kõik seonduvad ribosoomil samasse piirkonda.
Kõigil tRNA-del peab olema sama aminohappe ja antikoodoni vaheline kaugus – 70 A.
Antikoodon (nukleotiidid 34, 35, 36) paarduvad mRNA kolme nukleotiidiga (koodoniga), mis on geneetilise translatsiooni aluseks.
Antikoodon aasas on alati 7 nukleotiidi, milles antikoodoni moodustavad 3 keskmist nukleotiidi. Antikoodoni ees paikneb konserveerunud U33 nukleotiid, mille järel teeb nukleiinhape järsu pöörde.
Antikoodoni kolm nukleotiidi paiknevad RNA ahela ühel küljel sarnases konformatsioonis nagu esineb RNA kaheahelalises A-vormis. Antikoodoni aasa struktuur on oluline lugemisraami hoidmisel, kuna U33 on antikoodoni teljest järsult ära pööratud – see nukleotiid ei saa osaleda mRNA-ga paardumisel pideva heeliksina.
Nukleotiid 34 (antikoodoni 1.) peab paarduma koodoni 3. nukleotiidiga ja on oluline et koodon-antikoodon interaktsioon lõppeks just 34. nukleotiidiga ega jätkuks U33-ga. U33 juures toimuv järsk pööre määrab ära koodon-antikoodon seose pikkuse (3bp). Antikoodoni järel paiknevad hüpermodifitseeritud nukleotiidid (ei ole võimelised aluspaardumisel osalema). Antikoodoni 3’ küljel on need – vajalikud translatsiooni täpsuse tagamiseks.
Bakteri mutantides, kui mõni tRNA-d modifitseeriv ensüüm puudub, tehakse rohkem vigu.
tRNA 3’ ots asub antikoodonist 70 A kaugusel. tRNA 3 viimast nukleotiidi – CCA seondub ribosoomis (peptiidsideme moodustumist) katalüüsiva tsentriga.
Aminoatsüül-tRNA (aa-tRNA) süntees

• kõik tRNA molekulid seonduvad ribosoomides samasse piirkonda. Kõik aa-tRNA molekulid peavad seonduma elongatsioonifaktor T-ga, mis transpordib ribosoomidesse.
  
• Igal tRNA liigil peavad olema mingid struktuursed determinandid , mille järgi neid ära tuntakse ja nii määravad AH spetsiifika.
  
• Põhilised ensüümid, mis peavad tRNA molekuli tuvastama on aminoatsüül-tRNA süntetaasid e. ligaasid – ARL või ARS või lihtsalt RS (neid on 20)
  
• 1 aa-tRNA süntetaas tunneb ära ühe AH, aga mitu erinevat tRNA-d
  
• ARS e. süntetaasid seavad vastavusse tRNA molekuli ja vastava aminohappe. Süntetaas tunneb ära nii AH kui tRNA molekuli ja liidab nad estersidemega.
  
• ARS on ATP seoselised ensüümid
  
• tRNA identsuselemendid – tRNA struktuuri elemendid, mis määravad ära millise AH-ga tRNA aminoatsüleeritakse. Need on tRNA nukleotiidid kindlates positsioonides. AlaRS – alanüülaminoatsüül tRNA süntetaas → tRNA alaniini spetsiifiline. Nukleotiid 71. on universaalne identsuselement – esineb kõigil tRNA-del. Kui AH on Leu, siis N₇₁ = A
  
• Ala-ga seostumise määrab G₃ - N₇₁ ja N₇₁ (A₇₁) - ühelgi teisel peale Ala-le vastaval tRNA-l pole
  
• ARS-l on tRNA-ga seostumisdomääni aktiivtsenter ja ATP sidumise domään
  

Üht AH kodeerib 1-6 koodonit ja seega erinevat tRNA-d (isoakseptoorne tRNA). Need tRNA molekulid erinevad üksteisest antikoodoni järjestuse poolest. Iga AH jaoks on ainult üks süntetaas – st 20 AH 20 süntetaasi.
Sama AH spetsiifilistel tRNA liikidel on samad identsuse elemendid. Identsuse elemendid on antikoodonis osaliselt ja vaid nukleotiidide osas. Kõik süntetaasid tunnevad ära 4. nukleotiidi 3’ otsas st nukleotiidi 73, mis on isoakseptoorsetel tRNAdel identsed. 4. nukleotiid 3’ otsas nimetatakse diskriminaator-aluseks. Suurem osa tRNA identsuse elemente paiknevad kas akseptoorses õlas või antikoodon lingus.
Akseptoorne õlg ja antikoodon ling on süntetaasiga tihedas kompleksis. Ülejäänud tRNA molekul moodustab süntetaasiga vaid üksikuid kontakte.
Süntetaasid jaotuvad (järjestuse homoloogia alusel):

• Klass 1 – ühepolüpeptiidilised, aga võivad moodustada dimeere. N- terminaalne katalüütiline domään – seob aminohapet ja nukleotiidi. N-domään sisaldab kaheosalist osaliselt konserveerunud järjestust, mis on kõigil klassi süntetaasidel sarnane – allkirja järjestus. Nukleotiidi siduv domääni tertsiaalstruktuur on sarnane kõigil nukleotiide siduvatel valkudel. Koosneb: 4-6 antiparalleelset β- ahelat , 2-4 α-heeliksit, mis on β-kihiga risti. Primaar - ja sekundaarstruktuur varieerub. Aktiivtsenter N-domäänis. ATP sidumisdomään. Panevad AH 3’ O külge.
  
• Klass 2 – vähemalt kahe polüpeptiidahelalised, võivad moodustada tetrameere. domäänis on homoloogiline osa, aga varieerub rohkem kui Klass 1-l. Nukleotiidi siduv domääni ruumiline struktuur on mõlemal klassil sarnane, aga järjestuse homoloogia puudub. tRNA-dega seondumine erineb. Mõlemad klassid on tekkinud sõltumatult, kuna homoloogiat nende vahel pole, aga ilmselt oli ühine eellasmolekul. Aktiivtsenter C-domäänis. Panevad AH 2’O külge.
  

• tRNA-ga võivad seostuda mõlema klassi ensüümid
  
• ATP sidumisdomääni on võimalik ära tunda
  
• 10 AH pannakse ARS 1-ga tRNA külge
  
• mõned ARS-id on vahetanud evolutsiooni käigus klassi
  
• Erandid Gln ja Asn – neile pole eraldi ARSi – tRNA-le liidetakse Asp ja Glu, mis muudetakse Gln ja Asn-iks
  
• kui süntetaasidest lõigatakse jupp maha, siis muutub tsükliiniks – reguleerib raku kasvu ja jagunemist – väga spetsiifilised
  
• ühel ARSil mitu funktsiooni – valgu süntees, transport ja mõjutamine ja osalemine tRNA sünteesil
  

Kõigil Ala tRNA-del on 3G-U70 aluspaar („wobble“)
antideterminandid – takistavad ensüümi ja tRNA interaktsioone.
antideterminandid ja determinandid aitavad ära tunda ja õigesti aminoatsüleerida.
AARS klassid
20 ensüümi. Iga AH jaoks on oma ensüüm. Mõnes organismis on mõne AH jaoks 2 ensüümi. Alguses pannakse kahele tRNA-le sama ensüüm, pärast modifitseeritakse. Glutamiin ja glutamiinhape ja asparagiin ja asparagiinhape puhul on see nii. Algul aminoleeritakse glutamiinhappele ja asparagiini puhul ka, asparagiinhappest lähtuvalt. 20 AH jaotuvad 2 klassi. Need kaks klassi erinevad primaar- ja ruumilise struktuuri poolest. Ei ole mingit seost AH struktuuride vahel. Klassideks jaotatakse ensüümide struktuuri järgi. Tegemist on süntetaasidega, seovad ATP-d ja neil on ATP-d siduv domään. ATP-d siduvad domäänid paiknevad erinevas piirkonnas. Klass I puhul N-terminaalis, klass II puhul keskel. tRNA erinev äratundmine klass I ja klass II AARS ensüümidel. Äratundmine erinevates kohtades, ensüümide erinev seondumine. Antikoodonstruktuuri tunnevad ära mõlema klassi struktuurid. Neid nukleotiide, mida süntetaas ära tunneb – tRNA identsuselemendid. Ühele AH-le võib vastata kuni 6 koodonit. Selle 6 koodoni transleerimiseks kasutatakse 3-4 erinevat tRNA-d, millel erinev antikoodon. Kõikidele erinevatel molekulidele tuleb otsa panna üks ja sama AH. Kõik tRNA-d, millele käib otsa üks ja sama AH, nimetatakse nii. tRNA peab ühelt poolt olema piisavalt erinev, et süntetaas ta ära tunneb ja tunneks ära ikka õige süntetaasi, mitte vale. Ala tunneks ära ikka Ala tRNA. Ensüüm peab välja valima õige. Nad peavad olema sarnased, aga samas erinevad. Võib ühelt tRNA-lt võtta ja teiselt võtta. Kui tRNA-d muuta, siis determinandid (identsuseleme ndid), siis ensüüm hakkab otsa panema teist AH-t. Saab konstrueerida. Kõik tRNA-d peavad seonduma õigesse kohta ribosoomides. tRNA-de struktuur on väga konserveerunud. Mõned parameetrid , mis on ühesugused.
On seotud nukleotiid G3 U70-ga. Kui on muud moodi, hakkab seda tRNA-d mingi muu ensüüm ära tundma ja pannakse muu AH sinna külge. Et siis ensüüm paneb kokku tRNA ja AH. Kõik tRNA-d peavad samasse kohta seonduma ja peavad sama tee läbima, sarnased parameetrid. tRNA-de ruumiline struktuur on hästi konserveerunud. Mõningad parameetrid, mis on hästi ühesugused. Näiteks mõõdaks ära, kui kaugel on antikoodon 3’ otsast. See on hapnike 3’ otsast, on 3’ O ja nendevaheline kaugus on 80 A. Antikoodoni ja 3’ otsa siis.
Aminohappe liitmine tRNA molekulile (aminoatsüleerimine) e. kaheastmeline reaktsioon
Toimub enne kui valk ribosoomi otsa jõuab.
1. aa + ATP + AARS ↔ aaRS ~AMP + PPi – vabaneb anorgaaniline fosfaat, tekib kompleks, kus AH on seotud aminoatsüüladenolaadiga, energeetiliselt vabalt mõlemas suunas käiv, kuid tavaliselt ühesuunaline. Tekkiv pürofosfaat lagundatakse.
2. aaRS~aa~AMP + tRNA → aatRNA + AMP (tRNA-l on vaba 3’ ots – seal ei ole midagi, ensüüm paneb sinna aminohappe, tekib aminoatsüül-tRNA – suur energeetiline efekt 7kcal/mol, mis muudab reaktsiooni pöördumatuks, aitab produktide vabanemisele kaasa.
1. Süntetaasiga seonduvad AH ja ATP ja moodustavad ensüümi pinnal aminoatsüüladenülaadi (AH COOH rühma O2 reageerib ATPα-fosfaadiga). Aktiivne vaid veevabas keskkonnas. AH aktiveeritud COOH rühma kaudu.
2. Estersideme süntees – AH COOH rühma ja tRNA 3’-terminaalse riboosi 2’ või 3’ süsiniku vahel. Vabaneb AMP. AH jääb seotuks tRNA 3’terminaalse riboosiga estersideme abil. Aminoatsüüladenülaadist viiakse AH üle tRNA-le.
Kui 1. ja 2. etapp on pöörduvad, süntetaas võib aminoatsüül-tRNAst ja AMPst pürofosfaadi abil sünteesida ATP-d, vabaneb AH ja tRNA.
tRNA aminoatsüleerimisreaktsiooni võrrandid:
1. E + aa + ATP – E ATPaa – E AMP-aa + PP
2. E AMP-aa + tRNA – E AMP-aatRNA – EaatRNA + AMP – E + aa-tRNA
aminoatsüül-tRNA süntees on väga täpne – vigade sagedus 10-5 .
tRNA valik süntetaasi poolt toimub kahes etapis:
1) seondub süntetaas stabiilselt vaid „sobiva“ tRNA molekuliga
2) toimub vaid „õigele“ tRNA –le AH liitumine kiiresti – vale tRNA võib küll süntetaasiga seonduda, aga teda ei aminoatsüleerita.
õige tRNA molekul indutseerib süntetaasil konformatsioonilise muutuse, mis kiirendab aminoatsüleerimise reaktsiooni.
vale tRNA molekul süntetaasi konformatsioonilist muutust esile ei kutsu, jõuab enne ensüümi pinnalt lahkuda, kui keemilise sideme süntees aset leiab.
kineetiline veerulugemine – valiku mehhanism, mis põhineb reaktsioonide kiiruste erinevusel.
AH valik toimub neil süntetaasidel, mille substraadil on keemiliselt lähedasi „valesid“ aminohappeid, ka mitmeastmeliselt. (Ile, millel on lähedased Val ja Leu).
Kui vale AH ühendatakse tRNA-ga, siis hüdrolüüsib süntetaas tekkinud estersideme. Valesti sünteesitud produkt laguneb ja aminohape ning tRNA vabanevad.
Viib läbi süntetaasi hüdrolüütiline tsenter , mis on osa ensüümi aktiivstentrist. Õige produkti hüdrolüüs on aeglane, vale kiire – kineetiline veerulugemine. Mitmeastmelised valikumehhanismid on omased paljudele ensüümidele.
Ribosoom

• viivad läbi programmeeritud valgusünteesi ja kasutavad substraadiks aminoatsüül-tRNA-d (aa-tRNA).
  
• süntees toimub vastavalt mRNA programmile
  
• koosnevad kahest subühikust: suur ja väike
  prokarüoodid – 30 S + 50 S:
  30 S – 21 erinevat valku ( igat 1 + 16S rRNA)
  50 S – 34 erinevat valku (33 on igat 1; ühte on 4 + 23S rRNA + 5S rRNA). Aktiivtsenter koosneb vaid rRNA-st. Kompaktne, 1 domään, millest ulatuvad välja struktuurid (3 sarve ühel küljel), keskmine sarv = 5S rRNA ja kaks äärmist on valgud. Läbi 50S läheb tunnel, millest väljub ribosoomis kasvanud peptiidahel. Võrreldav tulbi kroonlehega. 50 S on 6 domääni, mis ei moodusta eraldi struktuure – üksteisest läbipõimunud.
  eukarüoodid – 40 S + 60 S
  
• subühikud koosnevad RNA-st ja valkudest – mõlemad osalevad substraadi sidumisel ja keemilise reaktsiooni läbiviimisel
  
• aktiivtsentri moodustab just ribosoomi-RNA (rRNA).
  
• RNA on katalüütilise funktsiooni kandja („RNA“ maailma hüpotees – tekkis elu algselt RNA baasilt)
  
• valgu sabad ei ulatu välja (nagu histoonidel), vaid lähevad rRNA struktuuri sisse või läbi – valk on siis ühel pool, saba teisel pool struktuuri.
  
• et ribosoom saaks mRNA-ga seostuda, peab ta 5’ otsa seostuma nii, et subühikud oleks dissotseerunud ehk eraldi,
  
• üks ribosoom sünteesib palju valku ja osaleb mitmes rakujagunemises
  
• kui ribosoomi satub poolik mRNA, siis tuleb appi 10SaRNA (ssrA geeni produkt, mitusada nukleotiidi pikk, on aminoatsüleeritav). Sisaldab tRNA sarnast struktuuri. tRNA-l on T₃N₇₀ ja A nukleotiid terminaatori otsas. Aminoatsüleeritakse alaniiniga (esinevad Ala identsuselemendid). Moodustab nagu tRNA-gi: EF-Tu-ga komplekse ja seostub ribosoomi A-saiti, kui mRNA-d pole (A-saidis pole koodonit).
  
• „Ribosoomi rämps“ translokeeritakse A-saidist P-saiti, millele järgneb pööre → muu teeb tRNA-st mRNA.
  

ssrA geeni produkt on tmRNA (transport messenger). tmRNA-s on palju Ala koodoneid. C-terminusse pannakse 11 AH-d. Sellised valgud, millel on see järjestus, lagundatakse. Poolik mRNA vabaneb tmRNA-ga liitudes ribosoomist. TmRNA-l on UAA stoppkoodon ja translatsioon lõppeb. Ribosoom dissotseerub , vigane valk lagundatakse.
Valku ei sünteesi ribosoom üksi, teda abistavad: tRNA, mRNA, translatsioonifaktorid (valgulised): initsiatsioon – määrab õige lugemisraami, elongatsioon – ahela pikendamine, terminatsioon – valmis peptiidahela vabastamine.
Bakteriaalne ribosoom – 2/3 tRNA ja 1/3 valku
Eukarüootide ribosoom – ½ tRNA ja ½ valku.
Organellidel (mitokondrid, kloroplastid) – 2/3 valku ja 1/3 tRNA-d
Makromolekulide ja nende suuruse iseloomustamiseks kasutatakse ühikud S (Svedberg). Mida suurem partikkel, seda suurem S.
S – raskusväljas liikumise kiirus, mis sõltub molekulmassist kui mõõtmetest (tihedusest) – mittelineaarne sõltuvus.

• Valk on 3x tihedam kui vesi, tRNA 2x tihedam kui vesi. Mida suurem massi tihedus, seda kiiremini liigub raskusväljas
  

Bakteri ribosoom: 2,5 x 10 6 D – väike 30 S, suur 50 S, rRNA moodustab 66% ribosoomide massist, kuivmassist 20-40%
Inimese ribosoom: 4,2 x 10 6 D – väike 40 S, suur 60 S , rRNA moodustab 60% ribosoomide massist, kuivmassist veel väiksem %
rRNA ensüüm – ribosüüm , neid on palju
16S rRNA – 1500 nukleotiidi; koosneb väiksest (fn kõige olulisem, „pea“, 3’ otsas) ja suurest domäänist („keha“, 5’otsas) – neid ühendab platvorm - keskdomään. Moodustab koos valkudega 30 S. Globulaarse struktuuri tekitavad valgud koos 16 S rRNA aukudega, mille nad täidavad.
rRNA ja valgud on organiseeritud ribosoomi struktuurseteks domäänideks, mis moodustavad mRNA, tRNA, valguliste transkriptsioonifaktorite sidumiskohad. rRNA-d ribosoomis kõige rohkem.
r-valgud seonduvad rRNA kindlatesse kohtadesse ja stabiliseerivad rRNA ruumilist struktuuri ja ühendab erinevaid rRNA domääne omavahel, tekivad interaktsioonid:
valk-valk, valk-RNA.
Ribosoomi suures subühikus on kanal, mille kaudu väljub kasvav peptiidahel.
EPA – tRNA seostumiskohad, mis ei vaja abivahendeid.
Subühikud on omavahel seotud kahest kohast. Subühikute vahele jääb põhiline aktiivtsenter, mis moodustab tRNA-de sidumiskohad. Ribosoomis on 3 tRNA sidumispiirkonda –tRNA sidumissaidid. Kolmest saidist on alati täidetud kaks ja tühi üks.
Polüsoom – ühe mRNA-ga on korraga ühendatud palju ribosoome, translatsioon käib mitmest kohast. 5’ ― ribosoom ― ribosoom ― ribosoom ― 3’. Tõenäoliselt on ribosoomid omavahel kompleksis (spiraalstruktuur)
A sait:

• seondub aminoatsüül-tRNA (aa-tRNA, sisaldab vaba aminogruppi) + peptidüül-tRNA. mRNA koodoni alusel valitakse aa-tRNA-sid. aa-tRNA reageerib peptidüül-tRNA-ga – tekib peptiidside ja värskelt sünteesitud peptidüül-tRNA.
  
• nii väiksel kui suurel subühikul
  
• tRNA antikoodoni paardumine mRNA-ga
  

P sait:

• sinna seondub peptidüül-tRNA (sisaldab kasvavat peptidüülahelat). Peale peptiidsideme sünteesimist, kui peptiidside kantakse peptidüül-tRNA-lt aa-tRNA-le, jääb P-saiti alles deatsüleeritud tRNA (3’ otsas vaba OH rühm).
  
• mõlemal subühikul
  
• tRNA antikoodoni paardumine mRNA-ga
  
• initsiaator tRNA seostub otse siia, sest tal pole vaja vaba aminogruppi (on formüleeritud)
  
• Siin pole vabu aminorühmi
  

E sait:

• seondub deatsüleeritud-tRNA. tRNA-d liiguvad koos mRNA-ga ühe koodoni võrra edasi ja deatsüül -tRNA satub E-saiti.
  
• siit väljub deatsüül-tRNA, et minna uuele ringile
  
• ei seo aa-tRNA-d ega peptidüül-tRNA-d.
  
• asub suuremal subühikul
  

Kui uus mingisugune tRNA satub A-saiti, siis lahkub E-saidist tRNA.
kui tRNA liigub E-saiti jääb koodon-antikoodon seos ajutiselt alles ja katkeb enne kui tRNA lahkub ribosoomilt.
Ribosoom sisaldab 3 saiti tRNA sidumiseks. Kogu aeg samaaegselt 2 tRNA-d ribosoomiga seotud. Väiksemal subühikul asub mRNA kanal. Koodon-antikoodon paardumine toimub väiksemas subühikus.
tRNA aktiivtsentrid:
Ribosoomi dekodeeriv tsenter – asub väiksemal subühikul. Toimub koodon-antikoodon äratundmine. Moodustavad 16S rRNA ja väiksema subühiku valgud.
mRNA sidumispiirkond – dekodeeriva tsentri läheduses, väiksemal subühikul. Toimib valgusünteesi initsiatsioonil. Koosneb rRNA-st ja moodustub 16S rRNA 3’ otsas, mis paardub mRNA seondumispiirkonnaga.
peptidüültransferaasne tsenter – peptiidsideme moodustumist katalüüsiv tsenter – asub ribosoomi suuremal subühikul. Piirkond, kuhu seonduvad aa-tRNA ja peptidüül-tRNA 3’ otsad koos vastava AH ja kasvava peptiidahelaga.
valgusünteesi faktoreid siduv tsenter – 1) AH siduv tsenter koosneb 23 S rRNA-st
2) selle tsentri moodustumisel osalevad ka L-valgud.
Ribosomaalse valgusünteesi etapid:
1) initsiatsioon
2) elongatsioon
3) terminatsioon
Initsiatsioon:

• ribosoomi subühikute assosteerumine
  
• valgu kodeeriva ala algusel leidmine mRNA-l
  
• õige lugemisraami fikseerimine
  
• esimese peptiidsideme süntees
  

Elongatsioon:

• valguahela pikenemine kuni stoppkoodonini
  

Terminatsioon:

• stoppkoodoni äratundmine terminatsioonifaktori poolt
  
• sünteesitud valgu, mRNA, tRNA vabanemine
  
• ribosoomi subühikute eraldumine – taastub ribosoomi algolek (subühikud eraldi ja ribosoomid on läbinud valgusünteesi ribosoomi tsükli.
  

Valku hakatakse sünteesima N-terminaalsest otsast C-poole.
Initsiatsioon
Peab olema koodon, millelt valgusüntees algab. (Transkriptsioonis oli promootor ).
osalevad lisaks ribosoomidele ka valgulised initsiatsioonifaktorid, initsiaator-tRNA ja GTP. Järgnevalt prokarüootide initsiatsioon. Ribosoom peab seostuma mRNA-ga, leidma üles startkoodoni ja initsiaator-tRNA (peavad ka seostuma ribosoomile). Initsiatsioon ei lõppe enne kui on esimene peptiid sünteesitud. Esinevad initsiatsioonifaktorid, kui tähtsaim on IF-2 – suur valk, mis moodustab kompleksi fMet -tRNA (initsiaator-tRNA) ja GTP-ga → see kompleks seostub ribosoomi väiksemale subühikule. IF-3 takistab mittetranskribeeruvatel ribosoomidel kokku minna, seostub väiksema subühikuga ja ei lase neil kokkuseonduda kui translatsioon pole alanud. Takistab 50S subühiku seondumist. IF-3 peab olema enne seotud 30S-ga, kui toimivad järgmise translatsioonifaktorid. IF-1 kiirendab IF-3 ja IF-2 seostumist ja pärast nende lahkumist. IF-3 peab olema enne, siis IF-2 koos GTP ja fMet tRNA-ga seotuakse mRNA-ga (väikesesse subühikusse).
Prokarüootidel on mRNA transkriptsioon seotud translatsiooniga (!)
Prokarüootidel kattuvad initsiaatorkoodon ja terminaatorkoodon UAAUGA → UAA/AUG/UGA
Esimese mRNA tsistroni transleerimiseks on vaja subühikute dissotsiatsiooni, hiljem enam mitte.
mRNA seostub 30S-ga (30 S pinnal on koodon-antikoodon äratundmine). RNA ühel poolel on seotud 30S subühik, teisel pool suurem 50S subühik.
EPA – tRNA seostumiskohad, ei vaja abivahendeid.
Prokarüootide mRNA:
Eukarüootidel on: üks mRNA kodeerib ühe valgu ja toimub cap-struktuuri seondumine (identifisteerib mRNA). Prokarüootides: ühelt mRNA-lt kodeeritakse mitut valku ja peab startkoodoni mRNA keskelt üles leidma. AUG koodonit võib esineda väga sageli – 300 koodoni kohta 1 õige AUG (300 on umbes ühe valgu pikkune ). mRNA-s on veel lisaks lisajärjestussignaal. Iga AUG koodoni ees (5-8 nukleotiidi eespool ) asub järjestus – AAGG – ribosoomi äratundmissignaal – Shine - Dalgarno järjestus – ribosoomi reageerimissait. Tunneb 16S RNA kaudu ära (väikese subühiku RNA). 16S 3’ otsas asub järjestus, mis on komplementaarne Shine-Dalgarno järjestusega (U-rikas). Toimub seejärel kaksikahela moodustamine. Trikk startkoodoni ülesleidmiseks. mRNA kodeerivas järjestuses on Shine-Dalgarno väga haruldane. Kõik komponendid võivad seostuda enne mRNA seostumist. Kui translatsioonifaktorid on seondunud, siis peab fMet-tRNA ka olemas olema ja seostub väiksema subühikuga. Toimub koodon-antikoodon interaktsioon. Moodustub kaheahelaline RNA, mis saab 50S subühikuga seonduda. fMet-tRNA läheb otse P-saiti, kõik teised lähevad läbi A-saidi. Kui kompleks on korrektselt moodustunud, siis kõik faktorid vabanevad ja tekib 70S initsiatsioonikompleks, kus initsiaatorkoodon paigas.
Bakteritel on kaks konserveerunud initsiatsioonifaktorit (IF), mõnel on kolm IF-i.
IF-2 on suur valk, IF-1 ja IF-3 väikesed.
IF-2 ja IF-3 esinevad kõigil bakteritel
IF-1 kiirendab IF-de seostumist 50S-ga. Aitab tRNA-l P-saiti ja blokeerib A-saidi.
IF-2: (GTP-fMet-tRNA)
- seob GTP juuresolekul initsiaator-tRNA-d (bakterites on fMet-tRNA fmet). Juhendab initsiaator-tRNA P-saiti.
- seondub ribosoomi väikse subühikuga ja moodustub stabiilne kompleks.
- GTP-d siduv valk ja on teistele GTP-d siduvatele valkudele omane valgudomään – GTP domään. Omab GTP-d hüdrolüüsivat tsentrit, mis aktiveerub initsiatsiooni käigus ja sõltub ribosoomi suuremast subühikust.
IF-3 on ribosoomide dissotsiatsionifaktor, takistab ribosoomide subühikutel assotseerumast, aitab lahus hoida ribosoomi subühikuid – vajalik translatsiooni alustamiseks. Võimaldab vabade 30S subühikute olemasolu – vajalikud mRNA ja IF-2 GTP fMet-tRNA fMet kompleksi sidumiseks.
Initsiaator-tRNA erineb tavalisest tRNA-st:
esimene nukleotiid tRNA-s pole paardunud, tRNA-s on 1. nukleotiid paardunud 72.-ga. Antikoodonõla struktuur on erinev. Erinevused on vajalikud transforumülaasile äratundmiseks – lisab Met-tRNAfMet-le formüülgrupi ja seob Met-tRNA fMet otse ribosoomi P-saiti (A-saiti läbimata).
üldist:
GTP-d siduv domään on universaalne, aga ATP-d siduv domään on eri valkudel erinev.
kõigil mRNA-del on ribosoomi sidumispiirkond
Bakteriaalne mRNA on polütsistroone – üks mRNA kodeerib mitut valku.
Avatud lugemisraam – ORF
- valku kodeeriv järjestus nii mRNA-l kui DNA-l.
- 99% järjestusi algab AUG. Prokarüootides on 10% GUG
- nukleiinhappe järjestus, mis algab initsiaatorkoodoniga ja lõpeb stoppkoodoniga.
- mRNA-d sisaldavad ORFi ja splaisserjärjestust.
- 0 raam, + 1 raam, - 1 raam (= +2 raam – loogilisem)
Enne ORFi (5’ otsa poolset) asub liiderjärjestus ja peale viimast ORFi on treilerjärjestus. Erinevate lugemisraamide vahel asuvad inter-tsistroonsed speisserid.
Initsiatsiooniprotsessi käigus otsib ribosoom üles ORF alguskoha (initsiaatorkoodoni, enamasti AUG).
Bakteriaalsetel mRNA-del eelneb initsiaatorkoodonile ribosoomi sidumispiirkond RBS. RBS paikneb 5-7 nukleotiidi AUG koodonist eespool. RBS – Shine Dalgarno järjestus. Esinevad ka RBS-ta mRNA-d, aga on madala ekspressiooniga (kuna ei osale efektiivselt valgusünteesi initsiatsioonil).
Bakteriaalne mRNA on võimeline seonduma ribosoomi väiksema subühikuga ilma lisafaktorite abita moodustades kaheahelalise kompleksi mRNA RBS järjestuse ja 16S rRNA 3’ otsa vahel.
Ribosoomi väiksem subühik on komplekseerunud IF-3-ga – ei oma see faktor mõju mRNA seostumisele.
mRNA 30S kompleks seondub IF-2 GTP fMet-tRNA fMet kompleksiga ja selle käigus tekib esimene koodon-antikoodon paardumine – määrab ära lugemisraami alguse.
initsiaator-tRNA seondub 30S ribosoomi P-saiti.
10% bakteriaalsest mRNA-dest on initsiaatorkoodoniks GUG ja väga harva mingi lähedane koodon.
Vahet pole, milline on initsiaatorkoodon, sellega seondub ikka fMet-tRNA fMet.
Tekkiv kompleks on 30S mRNA IF-2 GTP fMet-tRNA fMet IF-3 ja toimub ribosoomi suurema subühiku seondumine. Tekib 70 S ribosoom ja nüüd hüdrolüüsitakse IF-2-ga seotud GTP. Pärast hüdrolüüsi vabanevad IF-2, IF-3 ja GDP. Järgmine aa-tRNA seondub ribosoomidega juba kompleksis EF-Tu ja GTP-ga. Peale esimese peptiidsideme sünteesi on valgusünteesi initsatsioon lõppenud ja sujuvalt üle elongatsiooniks läinud.
[Kui IF-3 lahkub, seostub 30 S 50S-ga, toimub GTP hüdrolüüs, vabaneb IF-2. Tekib kompleks 30S-50S-MettRNA. ]
AUG koodonist edasi on järjestus, mis paardub 16S rRNA 3’otsaga (pürimidiinide rikas, mRNA-l puriinide)
kui ribosoomis on ainult 1 tRNA, siis on sellelt võimalik valepaardumine. Initsiatsioonil on valepaardumine tõenäolisem, kui elongatsioonil.
Eukarüootide mRNA
Prokarüootides toimub RNA-RNA interaktsiooni abil initsiaatorsaidi leidmine . Eukarüootides toimub skaneerimisprotsessi kaudu, osaleb palju rohkem translatsiooni initsiatsiooni faktoreid. eIF2 – seob initsiaatori ja GTP, aga tal on ka väike abifaktor eIF5b, mis aitab ribosoomi subühikute assotsiatsioonil (IF-3 homoloog on eIF3 – mõlemas sama funktsioon - takistab mittetranskribeeruvatel ribosoomidel kokku minna. Eukarüootides ei ole formüülgruppi metioniini küljes – prokarüootidel on. Moodustub 43S pre-initsiatsioonikompleks. eIF4F kompleks seostub 5’ cap-ga. eIF4 – seostub mRNA-ga, aga eIF-1, eIF-3, eIF-5 → seostuvad ribosoomidega.
Koos mRNA-ga moodustub kokku 47S initsiatsioonikompleks (mRNA + valgud). RNA kaksikahelalised struktuurid lagundab lahti helikaas (ATP-st sõltuv). Suunab kompleksi liikumist mööda RNA-d, 5’ ots on suure kompleksi küljes kinni. Initsiaatorkoodon on AUG, selles kompleksis on initsiaator-tRNA-l antikoodon. Kogu aeg hüdrolüüsitakse ATP-d. Kui see initsiaatorkoodon üles leiti, initsiaatortRNA paardub, tekib kodoon-antikoodon interaktsioon, skaneerimine lõpe , tekib 80S kompleks. Iga AUG koodon peab olema õiges kontekstis – nt. enne AUG-d ja pärast AUG-d (positsioonid -1 ja +4) peavad olema puriinid, esimene A ja viimane G.
Valgusünteesi elongatsioon

• toimub ribosoomis peptiidahela pikendamine vastavalt mRNA programmile kuni ribosoomi dekodeerivasse tsentrisse jõuab üks kolmest stoppkoodonist
  
• kasvav polüpeptiid on seotud ribosoomiga, nii et ta on tRNA otsas kogu aeg kovalentselt kinni. Prokarüootidel osalevad EF-Tu, EF-Ts ja EF-G.
  
• tsükliline protsess
  
• ainult antikoodon seostub ribosoomiga ja seal testitakse selle sobivust. Otsitakse geomeetria järgi õige. Kui tRNA paardub mRNA-ga, moodustub 3-st järjestikusest nukleotiidist kaksikheeliks. Nii tRNA kui ma mRNA annavad vesiniksidemeid 16S RNA nukleotiididega. 2 A nukleotiidi teevad vesiniksidemeid mRNA ja tRNA vahelise komplektiga siis, kui geomeetria on õige. Koodon-antikoodon geomeetria kontroll toimub kahe nukleotiidiga, toimub GTP ja Tu hüdrolüüs, mis vabanevad. tRNA 3’ otsa ei kaitse miski ja saab reageerida peptidüül RNA-ga. Toimub peptiidsideme süntees, mida katalüüsib ribosoomi suurem subühik. Ribosoom on üks suur ribosüüm. Ribosoomi valgud on küll olemas, kuid otseselt reaktsioonis ei osale. AH on seotud korrektselt A-saiti. Kantakse P-saidilt peptidüültransferaasreaktsiooniga. Peptiid kantakse üle. Nüüd on A-saidis peptidüül RNA, P-saidis paljas RNA. Ribosoomi A-sait tuleb vabastada, seda viib läbi EF-G. tRNA ja mRNA kompleksi liikumine ühe koodoni võrra. Kompleks liigub nii, et paljas RNA liigub E-saiti. mRNA hoitakse ribosoomis kinni tRNA-de kaudu. Tu ja G on kompleksis GDP-ga. Sellised valgud, mis seovad GTP-d ja GDP-d nimetatakse G-valkudeks. Olulised valgud eriti membraanseoselistes ja signaalseoselistes protsessides. Nende konformatsioon sõltub selles, kas seotud on GDP või GTP-ga. Kui tRNA hakkab E-saidist liiga vara lahkuma, siis ribosoom ei hoia lugemisraami nii hästi.
  
• lisaks ribosoomidele, mRNA, aa-tRNA; elongatsioonifaktorid: EF-Tu (G-valk), EF-Ts, EF-G ja kofaktor GTP.
  

EF-Tu – kompleksi moodustav valk, seob GTP-d.
EF-Tu ja EF-Ts moodustavad kompleksi – EF-T – transpordi funktsiooniga
u – ebastabiilne, unstable
s – stabiilne, stable
EF – elongatsiooni faktor
EF-G – võime hüdrolüüsida ribosoomide juuresolekul GTP-d.
EF-Tu ja EF-Ts osalevad aa-tRNA transpordil ribosoomi A- saiti. EF-Tu ja aa-tRNA ja GTP moodustavad kompleksi – kolmik -kompleks. Kolmik-kompleks (EF-Tu GTP aa-tRNA) seondub ribosoomi A-saiti.
Kui aa-tRNA antikoodon on komplementaarne (ribosoomi dekodeerivas tsentris) koodoniga, toimub GTP hüdrolüüs, EF-Tu GDP ning fosfaatjääk lahkuvad ribosoomist. Kui ei ole komplementaarne, siis kolmikkompleks ribosoomiga ei seondu. EF-Tu seondub GDP-ga stabiilsemalt kui GTP-ga. See on omane paljudele G-nukleotiidi siduvatele valkudele (G-valgud).
GDP dissotsiatsioon EF-Tu-lt on aeglane.
Nukleotiidi vahetust EF-Tu-l katalüüsib EF-Ts ja tekib EF-Tu GTP kompleks, mis on võimeline seonduma järgmise aa-tRNA-ga. (EF-Tu GDP kompleks ei seo aa-tRNA-d). Sarnased nukleotiidi vahetust katalüüsivad faktorid on paljudel G-valkudel. Rakkudes on GTP kontsentratsioon kõrgem kui GDP oma.
Teine G-valk on EF-G, mis katalüüsib ribosoomidel mRNA tRNA kompleksi translokatsiooni.
Elongatsioonitsükkel
I reaktsioon

• EF-Tu sõltuv aa-tRNA sidumine ribosoomi A-saiti. aa-tRNA-de valik vastavalt mRNA programmile. EF-Tu GTPaa-tRNA kompleksid seonduvad ribosoomi A saidiga juhuslikult ja ainult nende kompleksidega, millel tekib koodo-antikoodon äratundmine (tRNA antikoodon on komplementaarne mRNA koodoniga). Tekib stabiilne seondumine – indutseerib GTP hüdrolüüsi EF-Tu-l.
  
• EF-Tu seondub aa-tRNA akseptoorse õla ja 3’ otsaga – nii on aminohape kolmik-kompleksis kaitstud – ei ole ribosoomile kättesaadav
  

Seni kuni ribosoomis on EF-Tu, ei saa aa-tRNA osaleda peptiidsideme moodustamisel kuna aa-tRNA 3’ots ja AH on seotud EF-Tu-ga. (Hoiab ära peptiidsideme moodustumise vale AH-ga). Pärast EF-Tu sõltuvat GTP hüdrolüüsi ja EF-Tu GDP kompleksi lahkumist ribosoomidelt saab toimuda peptiidsideme süntees. EF-Tu lahkub ribosoomis GDP vormis ja enne järgmise aa-tRNA sidumist peab toimuma nukleotiidi vahetus GDP vahetub GTP-ga. Seda viib läbi EF-Ts.
II reaktsioon

• peptiidsideme süntees – moodustub aa-tRNA α aminogrupi
  
• AH, mis on tRNA 3’otsas reageerib aminorühma kaudu peptidüül-tRNA karboksüülrühmaga ehk peptiidjääk kantakse peptidüül-tRNA-lt üle aminoatsüül-tRNA-le.
  
• peptidüültransferaasne reaktsioon – peptiidsideme sünteesi käigus kantakse peptiidjääk üle. Kõige tähtsam ribosoomi poolt katalüüsitav reaktsioon, kuna teised on mittekovalentsete komplekside moodustamised, mis seejärel lagunevad. Selle reaktsiooni produkt on ühe AH võrra pikem peptidüül-tRNA ja vaba tRNA (deatsüül-tRNA). Peptiid läheb P-saidist A-saidis olevale tRNA-le. Peptiid liigub väikeses ulatuses, kuna on ribosoomi tunnelis. Et saaks uut peptiidi liita on vaja A-saidist peptiid P-saiti viia st on vaja mRNA-d liigutada, seda teeb ribosoomi translokatsiooniga EF-G-GTP. A-saidi vabanedes saab siduda järgmise aa-tRNA (valitakse õige tRNA).
  

5’ ― E-P-A ― 3’ → EF-G-GTP → 5’ ― E-P-A ― 3’ » A-sait on taas vaba. EF-G-GTP hüdrolüüs, E-saidist vabaneb tRNA.

• suurema subühiku integraalne reaktsioon, mis ei vaja ribosoomiväliseid lisafaktoreid.
  

Peptidüültransferaasne tsenter – ribosoomide peptiidsideme moodustumist katalüüsiv tsenter – koosneb: rRNA-st (23S rRNA) – ribosoomi suurema subühiku valkudest, 2 tRNA 3’ otsa sidumiskohta (üks aa-tRNA ja teine peptidüül-tRNA CCA järjestuse jaoks).
Peptidüül-tRNA 3’ otsa CCA järjestus on osaliselt paardunud 23S rRNA-ga. tRNA nukleotiidi C73 ja 23S rRNA nukleotiidi G2252.
Peale peptiidsideme sünteesi või selle käigus paiknevad tRNA-de 3’ otsad ribosoomis ümber. Äsja sünteesitud peptidüül-tRNA 3’ ots asetub endise peptidüül-tRNA kohale ja vana peptidüül-tRNA (peptiidjäägi kaotanud ja muutunud deatsüül-tRNA-ks) liigub deatsüül-tRNA spetsiifilisse E-saiti.
Kus paikneb peptidüül-tRNA ribosoomis? Seda näitab puromütsiin , mis sellega reageerib. On antibiootikum , Tyr-tRNA 3’ otsa analoog (seega ka aminoatsüül-tRNA 3’ analoog), mis võib peptidüül-tRNA 3’ otsa asendada . Kasvav peptiidahela võib puromütsiinile üle kanda, aga siis katkeb mRNA suunatud peptiidahela pikenemine, kuna puromütsiin koos peptiidahelaga lahkuvad ribosoomilt. Püromütsiiniga reageerib vaid peptidüül-tRNA (P-saidis!). Vahetult pärast peptiidsideme sünteesi, kui peptidüül-tRNA on A-saidis, ei reageeri puromütsiiniga. Nii eukarüootides kui prokarüootides.
III reaktsioon

• translokatsioon
  
• mRNA kompleks (koosneb mRNA-st, 2 tRNA-d) nihkub ribosoomis ühe koodoni võrra edasi. Pärast translokatsiooni asetub peptidüül-tRNA ribosoomi P-saiti ja deatsüül-tRNA ribosoomi E-saiti.
  
• Katalüüsib elongatsioonifaktor G – EF-G koos GTP-ga.
  
• Pärast translokatsiooni või selle käigus toimub EF-G-lt GTP hüdrolüüs ja EF-G koos GDP-ga lahkub ribosoomist.
  
• EF-G seostub G nukleotiididega nõrgalt ja ei vaja nukleotiidi vahetuseks lisafaktorit (nagu EF-Tu).
  
• EF-tu ja EF-G seonduvad ribosoomi sama piirkonnaga (faktorite sidumistsentriga).
  
• EF-G ruumiline struktuur on sarnane EF-Tu GTP aa-tRNA kompleksi struktuuriga, kusjuures üks EF-G struktuurne domään sarnaneb tRNA antikoodon ling-õlg omaga st valguline EF-G osa meenutab RNA struktuuri.
  
• Struktuurne sarnasus eri molekulide vahel – molekulaarne mimikri.
  
• Translokatsiooni käigus asendab EF-G GTP ribosoomi A saidis EF-Tu GTP aa-tRNA kompleksi, mis on tõenäoliselt üheks translokatsiooni molekulaarseks aluseks.
  
• Ka teised GTP-d hüdrolüüsivad translatsioonifaktorid (IF-2, RF-3) sisaldavad elongatsioonifaktoritega sarnast domääni, mis tõenäoliselt seondub ribosoomis sama piirkonnaga kui EF-Tu ja EF-G.
  
• Ribosoomi faktorite sidumistsenter koosneb nii valkudest (suurema subühiku valgud L7/12) kui kahest eri piirkonnast 23S rRNAs.
  

Peptiidahela terminatsioon
Pikem jutt: Valgu ahela sünteesi lõpetamiseks on eraldi signaalid – cis-järjestused, mis järjestavad 3-st nukleotiidist signaalid nii nagu vaja. Terminatsioonikoodonid: UAG, UGA ja UAA – nonsense -koodonid. Lisaks stoppkoodonitele osalevad terminatsioonifaktorid. Jaotatakse kahte klassi. Klass 1-s prokarüootides 3 erinevat ja eukarüootides 1. Terminatsioonikoodoni seostumine on ribosoomist sõltuv. RF-1 ja RF-2 spetsiifika on erinev. Eukarüootide RF-1 tunneb ära kõik 3 stoppkoodonit. A-saiti seostub kas RF-1 või RF-2. Translatsioonikoodon tunneb vastava koodoni ära ja suunab selle polüpeptiidahela vabanemist ribosoomidelt. Seda tehakse koos RF-3-ga. Klass II faktoreid on vaja, et suunata valguahela vabanemist ahelast. Aitab protsessi lõpuni viia. RF-3 seostub ribosoomiga GDP vormis. RF-3 vahetab ribosoomis olles nukleotiidi, GTP vahetatakse GDP vastu ja siis hüdrolüüsitakse. GTP on alati aktiivne vorm. RF-3 puhul on asi veidi teistsugune – GDP on aktiivne. Tõenäoliselt on järgmises staadiumis seotud ainult 1 tRNA. Ribosoom on inaktiivne, tema P-sait on kinni, kompleksis mRNA-ga ja A-saidis on stoppkoodon. Osalevad valgud RFF (ribosome recycling factor ) – valk, mis suunab ribosoomi tagasi valgusünteesi tsüklisse. IF-3 osaleb subühikute lagundamises. EGF-G katalüüsib RFF translokatsiooni, tõrjub P-saidist välja seal oleva tRNA. IF-3 saab seostuda väiksema subühikuga, ribosoomid lähevad lahku ja nüüd on võimelised alustama järgmist osa.

• terminatsioonifaktorid RF-1, RF-2, RF-3, RRF
  

RRF – ribosome release factor, vabastab mRNA ribosoomi küljest.

• RF-1 ja RF-2 – mõlemad tunnevad ära kaks terminaatorkoodonit. RF-1 seondub UAA ja UAG stoppkoodoniga, RF-2 UAA ja UGA. Mõlemad suunavad peptiidi vabanemist st elongatsioon on lõppenud. RF-1 katalüüsib viimase sideme hüdrolüüsi (peptiid reageerib veega – ribosoom katalüüsib, abistab GGQ – glütsiin-glütsiin-glutamiin). Kui peptiid on lahkunud, RF-1 vabaneb, RF-3-ga toimub GTP hüdrolüüs.
  
• RF-1 ja RF-2 käituvad ribosoomis nagu tRNA molekulid seondudes ribosoomil samasse piirkonda (A-saiti) inakteerudes 30S ja 50S subühikutega – molekulaarne mimikri
  
• RF-1 ja RF-2 vajavad seondumiseks ribosoomi A-saidis olevat stoppkoodonit ja P-saidis polüpeptidüül-tRNA-d. Ribosoomis peab olema piisavalt pikk polüpeptidüül-tRNA, et RF seondumine ribosoomidega oleks stabiilne
  
• RF-3 seondub ribosoomiga siis kui on RF-1 ja RF-2 olemas. et RF-2 lahti saada, on vaja RF-3. EF-G ja RF-3 vabastavad ribosoomist viimase tRNA – nüüd võib ribosoom liikuda vabalt mRNA-l ringi, dissotseerub siis, kui seondub IF-3. IF-3 muudab reaktsiooni pöördumatuks.
  IF-3 seondub, kui seostub RRF, IF-3 seostub 30S-ga st subühikud dissotseeruvad.
  
• RF-3 stimuleerib RF-1 ja RF-2 suunatud reaktsiooni (peptidüül-tRNA hüdrolüüsi, mille tulemusena vabaneb ribosoomis polüpeptiidahel).
  
• RRF on vajalik mRNA vabanemiseks
  
• 50S ja 30S eralduvad – ribosoomi subühikud
  
• iga terminatsiooniga ei toimu ribosoomi eraldumist mRNA-st.
  

TF kontsentratsioon rakus on suhteliselt madal ja stoppkoodonile lähedast koodonit transleerivad tRNA-d võivad osaleda stoppkoodoni transleerimisel. UGA-le lähedane koodon on UGG (vastab trüptofaanile). Trp lülitatakse madala sagedusega UGA koodoni kohale. Vigane translatsioon põhjustab normaalsest pikemate valkude sünteesile. Stoppkoodonite transleerimine – ülelugemine. Rakkudes vajalik protsess. Mõnede valkude pikemad vormid omavad kindlat regulatoorset tähtsust. UAA on kõige tugevam stoppkoodon ja selle koodoni kohale AH ei lülitata.
prokarüoodid
eukarüoodid
RF-1 – UAG
eRF-1 tunneb kõik ära
RF-2 – UGA
klass I
RF-1 ja 2 – UAA
klass II
RF-3
eRF-3
Terminatsioonifaktor seostub samasse kohta kui tRNA, on ribosoomisõltuv.
Kogu translatsiooniprotsessi käigus on seondunud alati 2 tRNA-d korraga. Kui A-saiti jõuab üks kolmest stoppkoodonist, seostub RF-1 või 2 olenevalt koodonist.
RF-3 seostub GDP-ga RF-1-le, koos GGQ-ga (RF-1-ga seotud) vabastab valguahela. Ehk siis klass II faktorit vaja, et lahti lasta. RF-3 tuleb ja laseb lahti. Klass I tunneb ära, klass II aitab lõpuni viia. RF-3 seondub ribosoomiga GDP vormis – erandlik. RF-3 seondumine ribosoomiga on kompleksis GDP-ga. RF-3 ribosoomis olles RF-1-ga kompleksis → peptiidahel on vabanenud, siis RF-3-l toimub nukleotiidi vahetus. Ribosoomis olles vahetab nukleotiidi: GDP → GTP (vahetus, G-valgud muudavad konformatsiooni GTP-GDP-ga ja aktiivne on GTP). RF-3 vastupidi – toimub GTP hüdrolüüs ja aktiivne on GDP, mis stimuleerib ribosoomi. GTP ja GDP siduvad valgud on suht sarnased: sarnane 1 domään, struktuuriühik, kus toimub GTP eraldamine. Nende reaktsioonide tulemusena kasvab polüpeptiid ja ribosoom vabaneb. Kui protsess lõpeb, on tekkiv ribosoom inaktiivne. P-sait on kinni, ei saa midagi seonduda. A- saidis on stoppkoodon.
Ribosoomi vabanemine:
tRNA-d tuleb vabastada, et saaks vähemalt libiseda mööda RNA-d, kui mitte lahkuda. Vabastamisel osalevad RRF (RF-4 – terminatsioonifaktor – ribosome release factor), valk, mis suunab ribosoomi tagasi valgusünteesi tsküklisse ja G osaleb selles protsessis. Katalüüsib translokatsiooni. IF-3 osaleb subühikute vabanemises. Nad lähevad A-sse, RRF seondub ja katalüüsib RRFi katalüüsi. P-saidist tõrjub RRF välja seal oleva tRNA. Kui on välja tõrjutud, seondub IF-3 vaba ribosoomiga ja selle käigus ribosomi subühikud dissotseeruvad ja võivad alustada järgmist tsüklit.
Sec – selenotsüsteiin – kodeerib UGA stoppkoodonit. Esineb E. Coli kahes valgus. Sec lülitumiseks on vaja 3 geeni produkti (tRNA, Sec süntetaas, spetsiifiline EF-Tu). Geenid indutseeritakse anaeroobsetes tingimustes. Sec – 21. aminohape. Inimene vajab seda valku vähe.
Vajatakse lisaks juuksenõela struktuuri (mRNA-s, UGA järel), tekitab ribosoomi peatamise. mRNA-l. UGA ja juuksenõela struktuuri vahel on 50 nukleotiidi. Lõlitatakse sisse üks Gly kahe UGA peale – pseudosplassing st RNA osa jääb vahele, aga ei lõigata välja. Osa on seotud kindlate RNA-dega (nt mõni surpressor tRNA). UGA koodoni kohal toimub konkureerimine (Sec-tRNA ja RF-2 vahel).
Selenotsüsteiini lülitumiseks valkudesse on vaja 3 geeni:
1) kodeerib erilist tRNA-d
2) kodeerib ensüümi, mis selenotsüsteiini sünteesib
3) EF-Tu selenotsüsteiini spetsiifiline
Sec lülitumine valku UGA koodonile (normaalsel juhul stoppkoodon, mõnikord kodeeritakse kui trüptofaani), sõltub bakterites 3-st geenist:
tRNASec, SecS, EF-TuSec ja spetsiifilisest mRNA sekundaarstruktuurist (juuksenõelastruktuur). Eukarüootides on see selenotsüsteiini lülitumine keeruline, osaleb rohkem produkte, vajatakse lisafaktoreid. Päristuumsetel on lisaks veel mRNA-l SECIS järjestuse element, mis paikneb 3’UTR-s (mRNA 3’ mittetransleeritav piirkond) Peab osalema spetsiifiline valk. Nendes geenides, kus ta esineb, on teda mitmes korduses. Kõigepealt aminoatsüleeritakse tRNA seriiniga, SecS ensüüm tunneb tRNA ära ja modifitseerib seal seriini tRNA otsas tsüsteiiniks.
RNA:
kiire metabolismiga organismis on palju RNA-d lagundavaid ensüüme – RNA lõigatakse juppideks → valgusüntees jääb pooleli , ribosoom kinni mRNA-s, sest terminatsioonikoodonit pole → ei dissotseeru. Kui dissotseerub, võib valk lahti pääseda, mis on normaalsest lühem (ja kahjulik).
Supressor tRNA ja translatsiooni täpsus
Valgu geenides toimuvad mutatsioonid võivad tekitada lugemisraamis stoppkoodoneid, mis põhjustavad valgu lühenemist ja funktsiooni kadu. Neid kahjulikke mutatsioone kõrvaldab surpressor tRNA.
Surpressorid jagatakse:
nonsens surpressorid – transleerivad stoppkoodoneid
misens surpressorid – kui AH kodeerivaid koodoneid teise AH-na
read-through translation – väga madal valgu ekspressioon
raaminihke surpressorid – muuta valgusünteesi lugemisraami
supressor tRNA-d – võimelised ära tundma stoppkoodoneid, suunavad stoppkoodonist sõltuvalt peptiidahelasse AH lülitumist. Eriti sagedased on mikroorganismides. Surub maha mutatsiooni.
kuidas saab alguse surpressor tRNA? leiavad aset mutatsioonid tRNA antikoodonis, võib viia stoppkoodonile komplementaarse antikoodoni tekke – „viga parandab vea“
- geenis tekib viga, selle vea parandab tRNA-s toimuv supressor tRNA
- võib juhtuda: ülelugemismutatsioon – kui esineb liiga palju supressor tRNA-d, siis valgusüntees ei peatu. Esinevad ka raamnihke surpressorid (+1, -1 (+2))
Surpressor tRNA-d:
- transleerivad mutantseid geene
- natukene viletsamad kui elongeerivad tRNA-d
- UAA (20% efektiivsus) on kõige tugevam surpressor, tema tunnevad ära nii RF-1 kui RF-2
- kõige nõrgem stoppkoodon on UGA – töötab 10% efektiivsusega
- väga paljudel valkudel on stoppkoodoneid järjest
- töötab 10 % efektiivsusega. Kui surpressor tRNA on kompleksis EF-Tu-ga, siis ei jää sinna pidama. Kui läbib EF-Tu tsükli, jääb püsima.
- terminatsioonifaktor on palju aeglasem , kui elongatsioon st rakus toimub samaaegselt supressioon ja terminatsioon.
- on kontekstist sõltuvad: milline nukleotiid on temast ees/taga
- ei suuda AH lülitada ahelasse/peptiidi
- lülitab peptiidahelasse AH sellele kohale, kus peaks olema stoppkoodon – ülelugemistranslatsioon. See pole halb, sest stoppkoodoneid on enamasti korduses st samas raamis on neid mitu. Stoppkoodoneid saab korrata ka siis, kui geenid on kattuvad (operonides on palju kattuvaid geene)
Surpressor tRNA-d:

• koodonid 5’→3’ suunas, antikoodonid 3’→5’ suunas
  
• ühe punktmutatsiooni tagajärjel
  

SupC ja SupG transleerivad kahte stoppkoodonit UAA ja UAG.
SupU transleerib stoppkoodonit UGA ja trüptofaani koodonit UGG.
Surpressor tRNA-d on võimalik selekteerida kasutades bakterite nonsense mutatsiooniga geeni, mis on mikroobide kasvuks vajalik – selektsiooniskeem – „viga parandab vea“ printsiip
SupE transleerivad ühte stoppkoodonit UAG.
SupD transleerib üht stoppkoodonit UAG. ( alleel suure tähega märgitud – „D“)
SupF transleerib üht stoppkoodonit UAG.
Sup – tRNA geeni lookus

• Surpressor tRNA võib transleerida lõppkoodoni; parandada raaminihke mutatsioone st sünteesib 4-tähelistest koodonitest aminohappe ahela.
  

Valgusüntees – dünaamiline protsess, mille kiiruse määravad ära substraatide kontsentratsioon ja ensüüm – substraatkomplekside tekke kiirus ja tasakaal. Eriti aa-tRNA valiku juures.
Valgusünteesi täpsuse määrab põhiliselt ribosoomi A saidis toimuv aa-tRNA selektsioon vastavalt eksponeeritud mRNA koodonile. aa-tRNA selektsioon: 1) kolmikkomplekside seondumise tasemel (EF-Tu GTP aa-tRNA) 2) peale EF-Tu suunatud GTP hüdrolüüsi aga enne peptiidsideme sünteesi
Kolmikkomplekside valik toimub juhuslikult: iga aa-tRNA põrkub juhuslikult ribosoomi A-saidiga.
Kolmikkompleksid, mille aa-tRNA antikoodon paardub vähemalt kahe koodoni järjestikuse nukleotiidiga, seonduvad ribosoomiga ja indutseerivad EF-Tu-l GTP hüdrolüüsi – dissotseeruvad ribosoomilt EF-Tu GDP kompleks. Võib toimuda ka aa-tRNA dissotsiatsioon, juhul kui koodon-antikoodon kompleks ei ole kõigi kolme nukleotiidipaari ulatuses paardunud.
aa-tRNA dissotsiatsioon ribosoomilt peale EF-Tu GTP hüdrolüüsi on tRNA selektsiooni teine etapp – „kineetiline veerulugemine“.
Kui antikoodon seondub koodoniga stabiilselt, siis püsib kompleks kaua ja ribosoom katalüüsib peptiidsideme moodustumist (muudab reaktsiooni pöördumatuks)
Kui koodon-antikoodon seondumine pole piisavalt stabiilne, siis ei jõua peptiidside moodustuda ja aa-tRNA lahkub ribosoomist.
Ribosoomi mutandid (valgus S12, rRNA-s): õige aa-tRNA peab läbima rohkem kui ühe valikutsükli enne kui AH lülitub kasvavasse peptiidahelasse. Need mutatsioonid viivad ülitäpsele valgusünteesile ja neis bakteritüvedes toimub nonsens supressioon väga väikese efektiivsusega. Ribosoomidel toimuvat kaheastmelist aa-tRNA valikut iseloomustab järgmine skeem:
RS A – vaba A-saidiga ribosoom
RS E – peale peptiidsideme moodustumist ribosoom
Pi – anorgaaniline fosfat (tekib GTP hüdrolüüsil)
1. aa-tRNA valiku esmane etapp, pöörduv. mittepöörduv (stabiilne) kompleks (ribosoomi ja kolmikkompleksi vahel) tekib siis, kui vähemalt kaks järjestikust antikoodoni nukleotiidi paarduvad mRNA koodoniga.
2. GTP hüdrolüüs EF-Tu-l, indutseerib koodon-antikoodon paardumine
3. peptiidsideme süntees, tekib üha AH võrra pikem peptidüül-tRNA. Peptiidahel pikeneb nii
4. peale GTP hüdrolüüsi mitteproduktiivne dissotsiatsioon – proofreading ehk veeruparandus.
Surppressor tRNA-d

• vähemvõimekad – ei lülita mitte iga valikutsükli käigus AH peptiidi.
  
• nende poolt moodustatud kolmikkompleksid (seonduvad ribosoomidega) on vähempüsivad ja suurem tõenäosus dissotseeruda pärast GTP hüdrolüüsi EF-Tu-l. Seepärast suunavad surppressor t-RNA-d stoppkoodoni transleerimist ainult väikese efektiivsusega (enamikel juhtudel toimub siiski stoppkoodoni kohal terminatsioon)
  
• TF-l on alati ülekaal surppressor t-RNA ja TF omavahelises konkureerimises.
  
• Suppressor tRNA juuresolekul toimub vastav stoppkoodoni transleerimine sense koodonina alla 50% (piisav muteerunud valgugeeni translatsiooniks ja samas viib suppressor tRNA ka normaalsete valkude pikendamisele, seda aga alla 50% juhtudest).
  
• Rakk saab vajaliku valgu ja peptiidahela terminatsioon saab toimuda piisava sagedusega. Enamikul valgugeenidel on stoppkoodonid väikese vahega korratud, kui ei toimu terminatsiooni esimesel stoppkoodonil, siis järgmisel toimub see suure tõenäosusega.
  
• Normaalsed stoppkoodonid on sobivas järjestuses – suurendab terminatsiooni tõenäosust ja vähendab suppressiooni efektiivsust.
  

Raainihke ja misense suppressorid on veelgi väiksema „võimekusega“ kui nonsense suppressorid.
Valgusünteesi protsesiivsus – näitab, kui suur osa alustatud valkudest lõpuni sünteesitakse. See on äärmiselt kõrge.
Prokarüootides sõltub valgusünteesi protsesiivsus ka RNA sünteesi protsesiivsusest – tingitud translatsiooni ja transkriptsiooni seotusest – polaarne efekt. Põhiline põhjus, mis vähendab valgusünteesi protsessiivsust on pep-tRA lahkumine (dissotsiatsioon) transleerivatel ribosoomidelt. Raku elutegevuseks on väga oluline, et alustatud valgud ka lõpuni sünteesitakse, poolikud valgud võivad põhjustada protsesside häirimist rakus ja osutuda raku jaoks mürgiseiks.
Kui valgusüntees lõpeb enneaegselt mRNA katkemise tõttu, siis on selliste poolikute valkude lagundamiseks eraldi süsteem. Lisatakse C-otsa eriline AH järjestus, mis on valgu degradatsiooni signaaliks ja sellist järjestust kandev peptiid lõhutakse proteaaside poolt AH- deks .
Kui ribosoomi A-saiti satub katkenud mRNA, ei oma normaalset 3-nukleotiidist koodonit, siis seondub ribosoomiga eriline RNA - 10Sa RNA. Täidab nii tRNA kui mRNA funktsioone – tmRNA – teine nimi 10Sa RNA. TmRNA sarnaneb osaga tRNA-st (akseptoorse ja T-õlaga moodustavad liitunud heeliksi RNA-s. TmRNA sisaldab aminohappe Ala liitumiseks vajalikke nukleotiide (RNA determinante) ja on substraadiks alanüül-tRNA süntetaasile. TmRNA ja mRNA ühisosa on mRNA järjestus ja üleminekujärjestus. Kui TmRNA on aminoatsüleetritud alaniiniga, siis tekitab ta kompleksi EF-Tu ja GTP-ga – kolmikkompleks, mis sarnaneb aa-tRNA poolt moodustatava kompleksiga, seondub ribosoomi A-saiti, juhul, kui seal ei ole korrektset tripletset koodonit. Peale Ala-tmRNA seondumist ribosoomiga, toimub EF-Tu-l GTP hüdrolüüs – EF-Tu GDP vabaneb ja kasvav peptiidahel kantakse üle alaniinile. Peale EF-G ja GTP suunatud translokatsiooni satub peptidüül-tmRNA ribosoomi P-saiti ja katkenud mRNA ja deatsüül-tRNa lahkuvad ribosoomist. Nüüd satub ribosoomi dekodeerivasse tsentrisse tmRNA osa, mis asendab mRNA-d ja dekodeerib spetsiifilist järjestust, mis suunab valgu lagundamisele.
TmRNA täidab funktsioone: 1) tRNA oma 2) tRNA kui mRNA oma 3) ainult mRNA oma 4) lugemisraam (kodeeriv järjestus), mis lõpeb stoppkoodoniga ja suunab valguahela lõpetamisele. Peale tmRNA poolt „märgitud“ valgu vabanemist ribosoomidelt see lagundatakse. Nii ei saa osaliselt sünteesitud valgud eksitada raku normaalset elutegevust.
Eukarüootse translatsiooni eripära
Eukarüootide ribosoomid on suuremad ja sisaldavad rohkem valku.
tRNA molekulide suurused on mõlemas samad.
Mõlemas on initsiatoorne tRNA eriline metionüül-tRNA, aga eukarüootides ei formüleerita. Tähistus: Met tRNA i Met
Eukarüoodid
Prokarüoodid
Ribosoomid suuremad ja sisaldavad rohkem
valku
Ribosoomid väiksemad ja valku vähem
tRNA molekuli suurus sama
tRNA molekuli suurus sama
Initsiatoorne tRNA – metionüül-tRNA, ei
formüleerita
Metionüül-tRNA, formüleeritakse
mRNA on monotsistoorne ja kodeerib vaid
ühte valku, üks ORF
mRNA on polütsistoorne ja kodeerib mitut
erinevat valku (mitu ORFi – lugemisraami)
mRNA 5’otsa lisatakse m7G cap struktuur
(m7GpppNpNpN). m7G cap on mRNA-ga
Ühendatud 5’-5’ sidemega. Seega on mRNA-l
Kaks 3’ otsa, algne 5’ ots on cap struktuuriga
Peidetud. 5’UTR ei transleerita
Ei esine cap struktuuri
mRNA 3’ otsas on kuni 200 nukleotiidi pikkune
polü (A) järjestus, mis lisatakse mRNA 3’
(mittetransleerivas osas) paiknevale polü (A)
Signaaljärjestusele AAUAAA
mRNA initsiaator- AUG on raamistatud
spetsiifilise kontekstjärjestusega A/GNNAUGG
- Kozak’i konsensus – soodustab translatsiooni
initsiatsiooni
Kozak’i konsensusele sarnane Shine Dalgarno
järjestus
mRNA süntees tuumas, translatsioon
tsütoplasmas – transkriptsioon ja translatsioon
ruumiliselt lahutatud
Ühe mRNA transkriptsioon ja translatsioon
on seotud
mRNA läbib enne tsütoplasmasse minekut
protsessingu (splassing)
tuumapooridega läheb tsütoplasmasse
Splassimine ja modifitseerimine on seotud
transkriptsiooniga
Elongatsioon, terminatsioon sarnane,
2 valgulist elongatsioonifaktorit
mRNA transport on kaudselt seotud transkrip-
tsiooniga-.
Protsessing – transkriptist eraldatakse intronid ja lisatakse 5’ otsa cap struktuur ning 3’ otsa lisatakse polü (A) järjestus.
Eukarüoodis ei ole stoppkoodonit, tuleb 3’UTR osa, mis on olulisim mRNA regulatsiooni koht (ligikaudu 200 nukleotiidi). Polü A saba (30-200 nukleotiidi). See pole DNA-s kodeeritud, selle lisab Polü A polümeraas.
3’UTR juurde seonduvad mitmed valgulised faktorid. Määravad ära, mitu koopiat valku tehakse. Toimib ka modifitseeriva järjestusena.
cap ―AUG ―UGA ― juuksenõel ― STOP.
UGA kodeerib sec’i teket (selenotsüsteiin, sealt tekivad juuksenõelad).
Enne on vaja pausi. Lisaks on veel 3’UTR-s spetsiaalne järjestus – SECIS – määrab ka sec’i lülitumise. SECIS toimib ainult üks kord. dihüdrofolaadi reduktaas. cis-elemendita seonduvad ka rasvhapped.
cap ja polü (A) on vajalikud: 1) mRNA stabiilsus 2) mRNA transport 3) mRNA seondumiseks initsiatsioonifaktoritega ja soodustavad väga tugevalt translatsiooni initsiatsiooni.
PAP – poly A binding protein . Initsiatsioonifaktor. Poly A-sait on cis-element ja PAP on trans-faktor. PAP seostub eIFG4-ga ja toob mRNA 3’ otsa 5’ otsa lähedale. eIF4 A ja B viivad läbi ribosoomi liikumist; A hüdrolüüsib ATP-d ja destabiliseerib mRNA-d. Suur kompleks hakkab koos liikuma mööda mRNA-d 5’ → 3’ suunas kui tunnet ära AUG – mRNA skaneerimine – tähtsus 40S ja Met-tRNA.
Initsiaatorkoodon AUG asub 5’ otsa läheduses (40-100 nukleotiidi cap’ist). Paljudel eukarüootsetel mRNA-del on AUG koodon cap’ist kaugel (kuni 1000 nukleotiidi). Initsiaator-AUG on raamistatud spetsiifilise kontekst järjestusega A/GNNAUGG – Kozak’i konsensus. Translatsiooni efektiivsus on maksimaalne, kui AUG-st 3 positsioonis on A/G ja +4 on G. Ainult 35% eukarüootsetel mRNA-del on -3 ja +4 positsioonid mõlemad optimaalsed. 65% on seega alareguleeritud.
mRNA struktuur on mõlemal erinev ja üks ei tööta võõra (teise) valgusünteesis.
Initsiatsioon võib toimuda ka ilma initsiatsioonifaktorita ja Shine-Dalgarno järjestuseta (erand).
Eukarüootse organismi translatsiooni initsiatsioon on keerukam, sest organismil on suurem vajadus geeniekspressiooni kontrollitavuse üle ka translatsiooni tasemel.
Bakteril on 3 initsiatsioonifaktorit, eukarüoodil on 12 erinevat valku või mitmest valgust koosnevat kompleksi.
Erinevate mRNA-de translatsiooni kontrollitakse: initsiatsioonifaktorite (eIF), mRNA struktuuride, mRNA-ga seonduvate valkude, mRNA polü-adenüleerimise, mRNA valgulise lokalisatsiooni kaudu
Prokarüootides toimub enamasti sisemine initsiatsioon – mRNA sisaldab mitut ORFi ja valgusüntees toimub kõigil initsiaatorkoodoni ja Shine-Dalgarno järjestusega varustatud lugemisraamidel. Eukarüootidel on 95% mRNA-dest initsiatsioon mRNA 5’ otsale kõige lähemal asuvalt initsiaatorkoodonilt. AUG koodonite või tugevate RNA sekundaarstruktuuride tekitamine 5’ capi’i ja valku kodeeriva lugemisraami vahele inhibeerib sellelt translatsiooni või kaotab selle sootuks.
Siit tuleneb klassikaline skaneeriv translatsiooni initsiatsiooni mudel, mille kohaselt seostub ribosoom mRNA-le 5’ cap-ist sõltuvalt ning koos initsiaator-tRNA-ga skaneerib mRNA-d 5’-3’ suunas kuni esimese õiges kontekstis initsiaatorkoodonini, kus toimub valgusünteesi initsiatsioon.
Initsiatsioonikompleksi moodustumine:
1. eIF1A ja eIF3 seonduvad ribosoomi 40S alaühikuga, tekib 43S kompleks.
eIF takistab 60S alaühiku seondumist 40S-ga.
2. 43S kompleks seob Met-tRNAi Met-eIF2-GTP kompleksi
3. eIF4E , eIF4G ja eIF4A – eIF4F – seonduvad mRNA 5’- otsaga. eIF4E on mRNA cap’i siduv valk, eIF4A on RNA helikaas, mis harutab lahti RNA sekundaarstruktuuri. eIF4G on selles cap’i siduvas kompleksis adaptorvalk.
eIF4G seob teisi initsiatsioonifaktoreid (eIF3, eIF4E, eIF4A, ja Pab1p valku), moodustades koos 43S ribosoomi kompleksiga, uue 48S kompleksi.
Pab1p – valk, ms seondub mRNA 3’ polü (A) struktuuriga. Seega tuuakse translatsiooni initsiatsioonil mRNA mõlemad otsad lähestikku.
3. 48S kompleks skaneerib 5’-3’ suunas kuni esimese sobivas kontekstis initsiaatorkoodonini.
Skaneerimiseks on sünergistlikult vajalikud eIF1 ja eIF1A valgud.
4. nüüd seondub 60S alaühik kompleksis eIF5-ga. eIF5 katalüüsib GTP hüdrolüüsi eIF2-l.
5. Ribosoomi alaühikute antiassotsatsioonifaktorid (eiF-3, eIF-5) ja eIF-2 -GDP vabanevad, valgusünteesi elongatsioon võib nüüd alata.
Eukarüootsed translatsioonifaktorid
initsatsioonifaktorid:
eIF1 – skaneerib 43 S’i mRNA-l koos eIF1-A
eIF2 – koosneb 3st valgust: α (35kDa) , β (38kDa) , γ (52kDa)
α fosforüülimine inhibeerib translatsiooni initsiatsiooni, peatab eIF2-GTP kompleksi tekke. Kutsutakse esile viirusinfektsiooni korral, et pidurdada viiruse elutsüklit rakus. β ja γ – osalevad Met-tRNA i ja GTP sidumisel. Seega on eIF2 bakteri IF2 analoog
eIF2B – 5 alaühikut. Katalüüsib G nukleotiidi vahetust eIF2-l
eIF3 – 8-10 alaühikut, seob ribosoomi 40S alaühikut, ei lase seonduda 60S-ga. Seob ka eIF4G-d.
eIF3 A, B – antiassotsiatsioonifaktor.
eIF4A – RNA helikaas, nõrgendab mRNA sekundaarstruktuuri ATP hüdrolüüsist sõltuvalt. Harutavad lahti kaheahelalist RNA-d. ATP-d siduvad valgud. Sisaldavad järjestuse motiive – DEAD-box, mis asuvad kindla koha peal. DEAD-box valgud osalevad paljudes mRNA-ga seotud protsessides.
eIF4B – stimuleerib eIF4A helikaasset aktiivsust, seostub mRNA-ga.
eIF4E – seob mRNA 5’ cap struktuuri. translatsioon initsiatsiooni limiteeriv faktor. Üle selle toimub translatsiooni aktiveerimine vastusena insuliinile või kasvufaktoritele, viirusinfektsioonil võib üle eIF4E toimuda ka cap-sõltuva valgusünteesi inhibitsioon .
eIF4G – molekulaarne adaptor, seob eIF4E, eIF4A, eIF3, Pab1p.
eIF5 – ribosoomist sõltuv GTPaas, soodustab ribosoomi alaühikute ühinemist (assotsiatsiooni).
eIF6 – seob 60S alaühikut, põhiline antiassotsiatsioonifaktor.
elongatsioonifaktorid:
eEF1 – 3 alaühikut (51, 48, 35 kDa), seob GTP sõltuvalt aa-tRNA-d, omab ka GDP-GTP vahetusaktiivsust, EF-Tu ja EF-Ts analoog
eEF2 – bakteri EF-G analoog, translokatsiooni faktor
eEF3 – pärmis, katalüüsib tRNA dissotsiatsiooni ribosoomi E-saidist. Ribosoomist sõltuv GTPaas ja ATPaas.
eIF2 A, B, C – homoloogne prokarüoodi IF-2-ga. Koosneb mitmest subühikust. Olulisim A subühik – GTP sait, põhiline regulatsiooni märklaud, fosforüleeritav. B ja C osalevad nukleotiidi vahetusel.
Ribosoom seob eIF2A, eIF1, eIF3. Eukarüootides initsiatsiooni tRNA: met-tRNA, mis seostub 40S subühikuga. 60S seostub peale AUG-i.
mRNA skaneerimine – põhiline initsiatsioon. Paljude initsiaatorvalkude mRNA-l on initsiaatorpiirkond kaugel 5’ otsast. Siin ei toimu skaneerimine vaid sisemine initsatsioon. Oluline on mRNA ruumiline struktuur, mis määrab ära 40 subühiku seondumise saidi.
üks universaalne terminatsioonifaktor:
eRF – põhjustab terminatsioonikoodonist sõltuvat valgusünteesi terminatsiooni.
Paljudel eukarüootsetel mRNA-del on AUG koodon cap’ist kaugel (kuni 1000 nukleotiidi). Need mRNA-d sisaldavad 5’ mittekodeerivas osas tugevaid RNA sekundaarstruktuure ja kümneid AUG koodoneid. Selliste mRNA-de translatsiooni initsiatsioon ei saa toimuda skaneerimise teel. Nad juhivad kuidagi 40S alaühiku õige initsiaatorkoodoni juurde.
Sisemist translatsiooni initsiatsiooni suunav struktuur mRNA-s – IRES – internal ribosome entry site. Cap-sõltumatu translatsiooni kasutavad mitmed rakulised mRNA-d (TBP, FGF2, IGF2, antennapedia, ultrabithorax, eIF4G, BiP jt) ja viiruste mRNA-d. IRES on sisemine ribosoomi seondumiskoht. Need on enamasti mRNA sekundaarsed struktuurid. Pole vaja skaneerimiseks ja cap-iga seondumiseks vajalikke valke. Seda kasutavad ära mitmed RNA-viirused 5’ ― IRES ― 3’.
Ühel viirusel on kaasas proteaas, mis tõmbab IF4 pooleks. Raku valgusüntees peatub ja viiruse valgusüntees IRES-i abil saab toimuda.
Sisemist initsiatsiooni kasutavad rakulised mRNA-d kodeerivad enamasti proto-onkogeene või arengugeene, mille ekspressiooni on oluline reguleerida. Paljud viirused kasutavad cap-st sõltumatut translatsiooni initsiatsiooni, et selektiivselt inhibeerida peremeesraku cap-st sõltuvat translatsiooni ja suunata peremehe valgusünteesi aparaat eelistatult viiruse valke tootma .
Osad viirused – C hepatiit – suudavad oma sisemist initsiatsiooni kasutataval mRNA-l initsiaatorkoodonit ära tunda kasutades vaid ribosoomi 40S alaühikut, Met-tRNAi Met, eIF2 ja GTP-d. See komplekt faktoreid vastab täpselt prokarüootseks initsiatsiooniks vajaliku faktorite komplektiga. Eukarüootne translatsioon on ehitatud konserveerunud prokarüootset päritolu initsiatsioonimehhanismile. Lihtsalt on täiendatud prokarüootset translatsiooni, et tagada protsessi paremat kontrollitavust.
Raku viirusvastus – valgusünteesi globulaalne inhibeerimine . Nt: üle inteferooni toimuv regulatsioon.
Interferentsi nähtus – kui üks viirus on põetav, siis teine viirus ei saa siduda end. Kaheahelaline RNA indutseerib kindla viirusvastuse. Nt 2’ – 5’ A2-4
2’ – 5’ A (2-5) indutseerib:
1) RNAaas L - kaheahelalise RNA spetsiifiline RNAaas (RNAaas III perekond). Normaalselt kahehahelalist RNA-d temale kättesaadav pole. Viiruse RNA on. Takistab viirust
2) eIF2 A fosforüülimine - takistatakse nii raku- kui viirusvalkude sünteesi. Kui need kaks eelnevat asja ei mõju, suunatakse rakk apoptoosi.
Globaalset translatsiooni inhibeerivad asjad:
IF2 või IF 4 fosforüleerimine
IF2 A kinaas – PKR (protein kinase R)
IF4 – mõjutas skaneerimist
ühe mRNA translatsiooni aktiivsuse regulatsioon käib üle 3’ UTR-i, kus on cis-järjestused, millega seonduvad TRANS-faktorid. Toimub spetsiifiline mRNA aktivatsioon või repressioon
More Antisense RNA
- mRNA-ga komplementaarne RNA. Nt. inimese neerupealise rakkudes. Kaks mRNA-d ekspresseeruvad samades rakkudes, kus nad seonduvad ja valku ei tule.
- Kaheahelalised (20-25 nukleotiidi)
1) siRNA – small interfering RNA – pärineb pikkadest kaheahelalistest RNA-dest või on tegemist viirusega. Seondub translatsiooni reguleerijana. Seondub ja RNA lagundatakse ära.
2) micRNA – microRNA – väikesed genoomis kodeeritud RNA-d. Suudavad modifitseerida DNA-d ja vaigistab geeni. PTGS – post-translational gene-silence
Translatsiooni tasemel regulatsioon prokarüootides

• ribosoomi valkude sünteesi regulatsoon
  
• spc operon
  
• kõik valgud on ühe mRNA peal. Üks operoni valkudest kontrollib translatsioon aktiivsust (operon = ribosoomi valk). S4 seostub iseenda mRNA-ga ja võib seda 16S rRNA-ga teha, kui seda on piisavalt. Kui toimubki seostumine mRNA-ga → pidurdab translatsioon
  
• kui esimese tsistroni translatsioon blokeerida, pidurdub ülejäänud süsteem
  
• α-operon sisaldab: RNA polümeraas + α-subühiku geenid
  
• AB – valgusünteesi inhibiitorid
  
• 
  

Valgusünteesi inhibeerivad antiboiootikumid ja ribosomaalse RNA funktsioonid
Antibiootikumid – madalmolekulaarsed ained, mis pidurdavad mikroobide elutegevust ja paljud neist on kasutusel ravimitena.
Varasemalt olid antibiootikumid pärit mikro - või ka hulkraksetest organismidest (looduslikud antibiootikumid).
Inimese organism toodab mitmeid antimikroobseid aineid nn defensiine, mis on oma keemiliselt loomuselt lühikesed peptiid ja nad on geneetiliselt kodeeritud st igale defensiivile vastab oma geen.
Sünteetilised antibiootikumid – looduslike ravimite derivaadid või täiesti uued keemilised ühendid.
Suur osa antimikroobsetest ainetest, mida kasutatakse inimese ja loomade ravimisel, toimivad valgusünteesi aparaadile. Mõned toimivad otse ribosoomile või on seotud elongatsioonifaktorite poolt suunatud protsesside inhibeerimisega. Antibiootikumidel on spetsiifilise seondumise piirkond mõne ribosoomi aktiivtsentri läheduses ja nad inhibeerivad reeglina põhiliselt üht ribosoomi osareaktsiooni. Puromütsiin – on olnud oluliseks abimeeteks valgusünteesi molekulaarsete mehhanismide väljaselgitamisel ja neid kasutatakse valgusünteesi uurimisel ka praegu.
tRNA sidumist ja koodoni äratundmist (koodon-antikoodon interaktsiooni) mõjutavad rohud:
aminoglükosiidid – streptomütsiin, neomütsiin, kanamütsiin, gentamütsiin, kasugamütsiin), inhibeerivad aa-tRNA seondumist ribosoomi A saiti ja koodon-antikoodon äratundmist.
Streptomütsiin – on tuntud omaduste poolest indutseerida koodilugemise vigu st valede AH lülitumist valkudesse. Tema juuresolekul võib vigade sagedus kasvada 50 korda (normaalselt teevad bakteri ribosoomid ühe vea 10 000 õigesti lülitatud AH kohta). Valesti sünteesitud valgud ei suuda rakus täita vajalikke funktsioone ja kutsuvad esile proteaaside aktiviseerimise. Selle tulemusena peatub valgusüntees ja raku kasv ning lõpuks järgneb raku surm. Peale valelugemise vigade indutseerib streptomütsiin ja ka teised aminoglükosiidid translatsiooni raaminihke teket, mis on veel kahjulikum kui valelugemine. Enamus aminoglükosiidsed antibiootikume toimivad ainult prokarüootidele. Spetsiifika tuleneb prokarüootsete ja eukarüootsete ribosoomide ehituse erinevusest. Aktiveerib apoptoosi (raku kontrollitud enesetapumehhanism).
Aminoglükosiidid on tugeva positiivse laenguga ained ja seonduvad ribosoomides põhiliselt 16S rRNA-ga. Seondumine ribosoomidega on väga spetsiifiline ja sageli ka väga stabiilne. Prokarüootsetes ribosoomides takistavad aminoglükosiidsed koodoni seondumist antikoodoniga või põhjustavad selle protsessi selektiivsuse vähenemist. Eukarüootsed ribosoomid aga ei seo enamusi aminoglükosiidseid antibiootikume. Aminoglükosiide seovad mitokondrite ribosoomid. Aminoglükosiidide seondumine põhiliselt rRNA-ga on olnud oluliseks argumendiks, millel põhineb veendumus, et ribosoomide katalüütilised tsentrid on ehitatud peamiselt RNA-st.
Bakterite resistentsuse aminoglükosiidsete ravimite suhtes tagavad mutatsioonid nii 16S rRNA-s kui ribosoomi valkudes. Streptomütsiini resistentsust põhjustavad mutatsioonid vähemalt neljas erinevas 16S rRNA piirkonnas (primaarstruktuuril). Ribosoomi ruumilises struktuuris paiknevad kõik lähestikku. 16S rRNA mutandid, mis tagavad streptomütsiini resistentsuse, nõrgendavad oluliselt selle ravimi seondumist ribosoomidele. Ka ribosoomi valgu S12 mutatsioonid võivad tagada retsessiivsuse.
S12 mutandid, streptomütsiini resistentsed ribosoomid, transleerivad mRNA-d suurema täpsusega kui metsiktüübi ribosoomid. Seejuures ei mõjuta nad väga oluliselt streptomütsiini seondumist ribosoomidega. Viimase seondumisel väheneb küll translatsiooni täpsus, aga jääb raku taluvuse piiridesse.
S12 mutatsioonid mõjutavad nonsens supressori aktiivsust. aa-tRNA selektsioon on võimendunud ja suppressor tRNA-d ei suuda oma funktsiooni täita. Mutatsioonid suurendavad ribosoomide poolt tehtavate translatsiooni vigade sagedust – ribosoomi võimekuse mutatsioonid – ribosome ambiguiti mutations – ram.
Tetratsükliin inhibeerib samuti aa-tRNA seondumist ribosoomi A-saiti. Seondub nii pro-kui eukarüootsete ribosoomidega. Eukarüoodid ei ole tundlikud, rohi ei jõua rakkudesse. Tetratsükliini resistentsuse mehhanism – pumpab TetO valk ribosoomidest GTP hüdrolüüsi abil seondunud tetratsükliini välja.
4 tsüklit. Ei lähe organismist välja, ladestuvad, püsiv DNA kahjustus.
Peptiidsideme sünteesi ja –ahela pikenemist inhibeerivad antibiootikumid – kloroamfenikool, sparsomütsiin, erütromütsiin, linkomütsiin, klindamütsiin, nukleotiidsed antibiootkimud.
Kloroamfenikool ja sparsomütsiin on tüüpilisemad ensüümi inhibiitorid – seonduvad ribosoomi peptidüül-transferaasse tsentri akseptor saiti (ribosoomi A-saidi osa, kuhu seondub tRNA 3’ ots –CCA-aa), takistades aminoatsüül-tRNA (akseptorsubstraadi) seondumist ribosoomi aktiivtsentrisse. Kloroamfenikool ja sparsomütsiin takistavad peptiidsideme moodustumist konkurentse inhibitsiooni kaudu.
Ribosoomide resistentsuse kloroamfenikooli ja sparsomütsiini suhtes tagavad mutatsioonid 23 rRNA-s (domäänis V, peptidüültransferaasses regioonis). Erütromütsiin kuulub makroliidsete antibiootikumide rühma.
Makroliidid inhibeerivad peptiidahela pikenemist, mitte peptiidsideme moodustumist. Blokeerib peptiidahela kasvu ribosoomis ainult sünteesi algusfaasis. Kui ahel on pikem kui 6-7 nukleotiidi, siis ei mõjuta. Seostub ribosoomides kasvava peptiidi tunneli algusesse, peptiid ei saa tunnelisse st peptiidahel ei pikene ja toimub ainult lühikeste valkude süntees. Erütromütsiini resistentsuse tagavad mutatsioonid ribosoomi valgus L4, L22 ja 23S rRNA-s. Erütromütsiin seondub suurema subühiku valkudega ribosoomis ja 23S rRNA-ga. Antibiootikumide resistentsus bakterites saavutatakse mutatsioonidega ribosoomi komponentides (nt permeaablust – ravimite transport bakteritesse – mõjutavad mutatsioonid.
Ribosomaalset translokatsiooni inhibeerivad tiostreptoon, viomütsiin ja spektinomütsiin. Tiosreptooni seondumiskoha moodustavad ribosoomi valk L11 ja 23S rRNA.
Translokatsioon – mRNA ja 2 tRNA molekuli kompleksi liikumine ribosoomis ühe koodoni võrra.
Tiostreptoon ja viomütsiin blokeerivad ribosoomi struktuurse muutuse – translokatsiooni toimumise.
Tiostreptooni resistentsuse tagavad:
1) 23S rRNA modifitseerimine või muteerumine
2) valgu L11 puudumine ribosoomidest
Viomütsiini resistentsuse tagavad:
1) 23S ja 16S rRNA mutatsioonid
Spektinomütsiin – takistab EF-G seondumist ribosoomidega
Spektinomütsiini resistentsuse annavad:
1) mutatsioonid valgus S5, 16S rRNA-s (ribosoomi väiksem subühik)
Elongatsioonifaktoritega seonduvad antibiootikumid on kirromütsiin ja fusiidhape. Kirromütsiini resistentsuse annavad mutatsioonid EF-Tu-s. Fusiidhape takistab elongatsioonitsükli toimumist.
On veel inhibiitoreid, mis seostuvad EF-Tu-hTB või EF-Tu-hDB-ga. Need antibiootikumid blokeerivad EF-Tu konformatsioonilisi üleminekuid. EF-Tu ei saa enam ribosoomist lahkuda, elongatsioon ei saa edasi kulgeda.
Eukarüootidel ja prokarüootidel on ka sisemised „asjad“ valgusünteesi inhibeerimiseks. Mõnikord on vaja valgusüntees välja lülitada (kui puudub mõni AH). Kui pole aminohapet, siis ribosoom jääb mRNA-le seisma, otsivad uue mRNA koha, kust edasi sünteesida (nihke inhibeerimine on vajalik). Mittespetsiifilise valgusünteesi väljalülitamiseks modifitseeritakse translatsioonifaktoreid (IF-1, Tu või G) – tavaliselt fosforüleeritakse.
Antibiootikumid ja valgusüntees. Ribosoomiga seonduvad antibakteriaalsed ained
Kui tassi kasvab hallitus, siis selle ümber bakterid ei kasva.
antibiootikum
toimekoht
aminoglükosiidid (kanamütsiin, gentamütsiin,
neomütsiin, erütromütsiin, spektinomütsiin,
kloroamfenikool)
valkude süntees. Seonduvad ribosoomi väiksema sub-
ühiku 16S rRNA-ga, põhjustavad translatsioonivigade
sageduse tõusu. Ribosoomid hakkavad tegema vigu,
lülitavad valesid AH-eid. Sagedus tõuseb umbes 100x.
Rakk sisuliselt tapab iseennast ära. Valed valgud
jäävad raku masinavärgis ringi hulpima, ei muuda
õigeid struktuure. See käis aminoglükosiidide kohta
pentisiliin, vankomütsiin
rakukesta süntees
rifampitsiin
RNA süntees
norflokatsioon
DNA topoisomerisatsioon, inhibeeritakse replikatsiooni
sulfonüülamiidid
floiinhappe sünteesi inhibeerimine
Kõik antibiootikumid on algselt mikroobse, biogeense päritoluga. Sulfoüülamiidid on inimese toodetud. Tänapäeval on peaaegu kõik antibiootikumid sünteetilised, isegi siis, kui nad on algselt olnud biogeenset päritolu. Häda on selles, et nende vastu tekib kiiresti resistentsus. Praegu pole teada ühtegi, mille vastu pole resistentsust. Kõige tähtsam mükobakterivastane antibiootikum on rifampitsiin (tuberkoloositekitaja). Tetrasükliin oli kunagi väga populaarne, laia toimespektriga, struktuuris aromaatsed konjugeeritud benseenituumad, helendab UV valguses, Lisaks sellele, et on antimikroobne aine, jääb pidama ja akumuleerub luukoes. Kui tetratsükliiniga ravida, siis lagunevad hambad ära, hõrendab luukudet. Takistab ribosoomi seondumist A-saiti. GTP hüdrolüüsitakse. Kui ribosoom on kompleksis tetratsükliiniga, siis see tRNA ei seostu stabiilselt ribosoomi saiti. Antibitootikumidel on kõrvaltoimed. Streptomütsiin tekitab kurtust. Puromütsiin on aminoatsüül tRNA 3’ otsa analoog. Struktuur on sarnane adenosiiniga, mis paikneb tRNA 3’ otsas. Makroliidsed antibiootikumid - erütromütsiin ja tema derivaadid - seonduvad sellele kohale, kus on kasvav koht ribosoomis, kitsas koht. Blokeerib kasvava peptiidi minekut kahe subühiku vahelisse tunnelisse, ei lase kasvada pikemaks kui 8 AH-t. Erütromütsiini ja teiste makroliinide struktuur on suhteliselt keeruline. Rühmade ümberasetamisega on saadud väga palju derivaate.
Kuidas saavutatakse resistentsus:
märklaua modifitseerimine – modifitseeritakse kohta, kuhu ta seondub, nt tuleb modifitseerida ainult ühte A nukleotiidi, et resistentsus tagada
antibiootikumide modifitseerimine – nt kloramfenikooli puhul (inhibeerib peptiidsideme süntees, seonduvad 3’ otsa). Nendel on α-aminogrupp, seondub sinna, kuhu peaks siduma aminoatsüül-tRNA aminorühm . Peab ainult atsetüleerima
antibiootikumi rakust välja pumpamine – lihtsalt aetakse rakust välja. nt tetramütsiini puhul
epigeneetilised fenomenid:
- PTGS - posttranskriptsiooniline geeni vaigistamine. Käib üle 2-ahelalise RNA. Võib rakkudesse sattuda nii, et rakku nakatatakse 2-ahelalise või üheahelalise viirusega – viirusliku päritoluga. 2-ahelalisest tehakse 22 nukleotiidilisi 2-ahelalisi ja siis 1-ahelalisi RNA-sid
- Pärilik DNA modifitseerimise muster
- päritav histoonide koht-spetsiifline modifitseerimine
- prioni nähtus (valguline pärilikkus)
- Hsp 90 osa vaikivate mutatsioonide kogunemisel – heatshock proteins, tekitab fenotüübilise vaigistamise. Mutantne geen avaldub, aga mutantne fenotüüp mitte.
Muul ja hinni täiesti vastandid. Hinnis on kokku saanud halvad omadused. Muul: isaseesel ja emashobune. Hinni on vastupidine.
mRNA vaigitamine C. elegans rakkudes
- 2-ahelaline RNA suunab RNA lagundamist
- DICR I toodab väiksemad jupikesed sellest 2-ahelalisest RNA-st lagundatakse → üheahelalised RNA-d. Märklaud RNA-sse tehakse auk sisse, ei saa midagi edasi toimuda
RNAi
- dicer valk (Rnaas III ortoloog) seondub 2-ahelalise RNA-ga
- dicer lagundab RNA 20-24 bp tükkideks (siRNA)
- siRNA suunatakse RISC kompleksi (RNA induced silencing complex )
- RISC kompleks leiab siRNA järjestuse alusel märklaud mRNA (komplementaarsuse alusel leitakse üles)
- mRNA lagundatakse või muudetakse translatsioonikõlbmatuks
miRNA – eriti olulised arenguliselt (microRNA)
- genoomis kodeeritakse väikesed RNA-d
- moodustavad „juuksenõela“ struktuure – 2-ahekalised osad lõigatakse välja
- funktsioneerivad geenide vaigistamisel sarnaselt siRNA-le
piRNA – nagu miRNA, aga päritolult teistsugused, 1-ahelalised RNA-d
- genoomis kodeeritud väikesed RNA-d
- ei moodusta juuksenõela struktuure
- seonduvad PIWI valguga
- funktsioneerivad transposoonide vaigistamisel
Histoonide deatsetüleerimine vaigistab geenide telomeeri piirkonnas. Mõnes kohas ei avaldu geenid kunagi – heterokromatiin. Nt. kromosoomide otstes asuvad telomeeri piirkonnad. Valgud Sir 2, Sir 3 ja Sir 4 on seotud, suunavad deatsetüleerimist
DNA metüleerimine ja histoonide deatsetüleerimine viib geenide vaigistamisele. Metüleeritud osad ei seostu transkriptsioonifaktoritega.
DNA vermimine isa- ja emasliinis – geneetiline imprinting. Metüleeritakse geenide regulatoorsed elemendid. Võimendi olemasolu, aktiveerib ühte geeni olenevalt isolaatori asukohast.
Prion valgu struktuurid – valk (membraaniga seotud), mis eksisteerib kahes erinevas struktuurses vormis. Neil vormidel on erinev funktsioon. Tekitavad üksteist, üleminek on tagatud. Algne vorm koosneb α-heeliksitest ja – lingudest, lahustuv vorm. Kui läheb üle β-vormiks, siis hakkab moodustaba amüloide, mis on lahustumatu vorm. Mittemendelik päritavus – ei allu Mendeli seadustele. Prionihaigused.
Geneetiline mitmekesisus looduslikes populatsioonides on maskeeritud metsiktüüpi fenotüübi kaudu. C. H. Waddington (1950). Geneetilist mitmekesisust maskeerib Hsp 90. S. Rutherford, S. Lindquist (1998).
Hsp 90 roll rakus on kontrollida valkude struktuuri. Üks chaperonide liike. Suunab valesti struktureeritud valgud lagundamisele. Surub maha väga paljude mutantsete geenide avaldumise.
Valkude kotranslatsiooniline transport
- levinud bakterites, arhedes ja eukarüootides
- süntees membraani küljes
- valk liigub kohe läbi membraani
- esimesed 10-20 sünteesitavat AH-d on signaaliks transpordile
- ribosoomides tekib translatsiooniline arest kui signaalosa tuleb nähtavale
- ribosoomid seostuvad membraanida ja valk sünteesitakse luumenisse
- signaaljärjestus lõigatakse ära luumenis
- Sec 61 võimaldab valgul liikuda ka „külje-ukse“ kaudu, millega valk läbib membraani. Põhiline osaline kotranslatsioonilises transpordis.
Ko-translatsiooniline transport
Mis saab valguga, kui ta on valmis sünteesitud. Valku transporditakse lõplikku kohta kompleksis chaperonidega. Ko-translatsioonilise transpordil suunatakse endoplasmaatilise retiikulumi luumenisse. Läheb translatsiooni ajal läbi membraani. Valgu N- terminaalses osas signaaljärjestus, mis suunab sünteesitava valgu ER-i luumenisse. Läheb kohe sünteesi ajal luumenisse, niimoodi on organiseeritud. Tekib auk, see pannakse kinni. Protsessid kindlas järjestuses. Lisaks signaalpeptiidile osaleb SRP-kompleks (signaali äratundev osake, 5 valku ja 1 RNA). Kui ribosoomist ulatub välja selline signaalpeptiid, mille SRP ära tunneb, siis SRP indutseerib traditsioonilise aresti. Valgusüntees jääb seisma, kuni SRP seal küljes on. See kompleks seondub membraanis oleva signaaliretseptoriga. Kui kompleks tekib, siis ribosoom, SRP-kompleks lateraalse difusiooni abil liigub Z61 poorini. Ribosoom on paigutatud poorile kohale nii, et saab läbi membraani minna. Läbiminekut kutsutakse ko-translatsiooniliseks.
Teine võimalus valgutranspordiks on, kui ta on juba valmis. Peale membraani läbimist valgu struktuur muutub. Bakterites toimub valgu ruumilise struktuuri muutmine enne kui ta membraani läbib. Osaleb Sec A.
G-valk -7x läbi membraani minev valk.
Ribosoomi suuremast subühikust väljub signaaljärjestusega peptiid ja sellega seostub SRP (signal recognising particle, 7SRNA + 5 polüpeptiidi). SRP indutseeribki translatsioonilise aresti. Membraanis on SRP retseptor (rER – rough endoplasmatic reticulum). 7S RNA peatab valgusünteesi SRP-s.
Signaalpeptidaas – lõikab signaaljärjestuse ära, siis satub valk edasiste valgusünteesi faktorite meelevalda.
Organellidesse transpordil tekib lõplik valgu struktuur organellidesse sisenemisel. Sekreteeritavate valkude struktuur rekib alles väliskeskkonnas. Valk sünteesitakse eellasmolekulidena - preprovalk. Pre ja pro osa lõigatakse funktsionaalses valgu ära – pre-pro ensüüm. Palju valke voltub valesti kokku.
chaperon - saatajavalk, aitab valkudes õiget ruumilist struktuuri saavutada. Valkudel on vahevormid, enne kui lõplik strukuur kujuneb. Siin osalevad chapreonid, mis jagunevad perekondadeks (Hsp e heat -schock-proteins, aitasid pärast „kuumarünnakut“ valgu natiivset konformatsiooni taastada. Hsp 10; 40; 60; 70; 90 – lagundavad vale struktuuriga valke
Hsp 110, Hsp 15
Hsp 60 e. Gro EL – moodustab 7 monomeerist ringi ja see seob järgmise seitsmest monomeerist ringi. Sellesse silindrisse seonduvad valgud (põhjaga tünn ), millel on hüdrofoobsed valgud väljaspool (tavaliselt ei ole nii). Silinder hakkab kuju muutma siis, kui valk on sees. Silindri peale seostub Hsp 15 valk Gro ES ja hakkab suletud silindri ATP-d hüdrolüüsima ning valk saavutab seal õige struktuuri.
Hsp 70 e Dna K – kontrollivad DNA replikatsioonivalkude struktuuri.
Hsp 40 – Dna J; Gep E. on üks Hsp 70, millega võib seostuda mitu Hsp 40-t. Hsp 40 määravad ära spetsiifilisuse kindlatele valkudele. N: Bip on Hsp 70 perekonna chaperon.
Organellidesse transporditavad valgud liiguvad kompleksis oma chaperonidega.
Valgu elu lõpp
Pool sünteesitavates valkudest lagundatakse peaaegu enne, kui nad funktsioneerima hakkavad (eukarüootides). Prokarüootides pole nii hull.
Valgulagundamine on väga hästi kontrollitud. Põhiliselt toimub ubikvitiini abil. Ubikvitiin – 7G ahelast koosnev COOH saba. Signaal , et valk tuleb viia proteasoomi lagundamiseks.
Lagundavate valkude aminorühmale lisatakse kovalentselt ubikvitiin. Ubikvitiin aktiveeritakse kompleksis E1 valkudega. Vaja läheb ka ATP-d. E1-ubikvitiin +E2-E3 → ubikvitiin-E2-E3, mis on valmis degradeeruma. E3 tunneb ära lagundatava valgu. Tavaliselt pannakse ubikvitiin-E2-E3 Lys aminorühma külge. Nüüd algab polüubikvitinüleerimine. Siis suunatakse proteasoomi. Ubikvitiin läheb pärast uuesti kasutusse.
Proteasoom
destabiliseerivad aminohapped: Arg, Lys, His, Phe, Leu, Trp, Ile, Asp, Glu, Asn, Gln
Valgu eluaea määrab ära N-terminaalne AH – N-terminaalne reegel.
Kui üks nendest destabiliseerivatest AH on eksponeeritud, siis suunatakse proteasoomi. Proteasoomis on keskmine kamber, mis toimetab lagundamist. Suure molekulmassiga (20S +2x19Scap).
Amüloidsed struktuurid
Amüloidide ladestumisel on tulemuseks patolooga nt Huntingtoni tõbi ja BSE. Amüloidide teke on seotud valgu struktuuri muutustega. Tihti α ja β struktuuri vahetumine. β vorm moodustab tihti agregaate ja proteaasid ei saa neid lagundada – tekivad amüloidid.

Geneetiline transkriptsioon – RNA süntees

• DNA alusel, mis on geenide avaldumise peamine regulatsiooni tase. Selle käigus RNA vabaneb, DNA sünteesil jäävad aga matriits ja produkt omavahel seotuks.
  
• krabisõra kompleks – molekul organiseeritud selleks
  
• DNA sõltuvad RNA polümeraasid – ensüümid, mis vastutavad RNA sünteesi eest. Võtmeensüüm geenide aktiivsuse regulatsioonil. Selle ensüümi vahendusel määratakse rakkudes millised geenid avalduvad, millal ja millises ulatuses. Prokarüootidel on 1, eukarüootidel 3, neil on erinevad markergeenid. Esineb ka ühepolüpeptiidilisi polümeraase.
  
• kasutab substraadina ribonukleosiid trifosfaate.
  
• aktiivtsentris toimub uue fosfodiestersideme süntees. Kui on kaheahelaline DNA, siis ainult ühelt ahelalt toimub transkriptsioon. See ahel, millelt sünteesitakse, on matriitsahel.
  
• Polükondensatsioon reaktsioon – sünteesitakse fosfodiestersidemed polünukleotiidahelasse ja reaktsiooni käigus vabanevad pürofosfaadi jäägid.
  
• 3’ O aktiveerib sideme, toimub ümberesterfitseerimise reaktsioon. PPi vabaneb. Osaleb 2 Mg iooni, üks koordineerib β- ja gammafosfaate.
  
• 5’→3’ suunas süntees
  
• RNA polümeraasid koosnevad paljudest subühikutest. Mitterakulised (viiruslikud) RNA polümeraasid ei vaja keerukat regulatsiooni, koosnevad ühest polüpeptiidist.
  
• jagatakse kolmeks: (aktivatsioon enne, siis) initsiatsioon, elongatsioon, terminatsioon – kõike katalüüsib 1 ensüüm.
  
• algab DNA ahela kindlast kohast – start saidist
  
• enne sünteesi peab RNA polümeraas seonduma DNA kindla piirkonnaga – geeni promootor – kindla järjestusega DNA lõigus. DNA järjestuse elemendid, mis osalevad sama DNA molekulil transkriptsiooni initsiatsioonil, kutsutakse cis järjestusteks või cis elementideks. RNAP – RNA polümeraas. Sigmafaktorid osalevad promootorjärjestuse äratundmisel prokarüootidel. Neid on palju ja tagavad promootori spetsiifika. Sigmafaktor koos RNA polümeraasiga seostub järjestusspetsiifiliselt DNA-ga – tekib suletud kompleks. Järgneb konformatsiooniline muutus, tekib avatud kompleks ja transkriptsioonisild. Kui sünteesitakse vähem kui 10 nukleotiidiline RNA (lühikesi RNA juppe), kaasneb väga suur konformatsiooniline muutus RNA polümeraasis.
  
• promootori puhastamine – kui initsiatsioon läheb üle elongatsiooniks.
  
• RNA polümeraas seondub DNA promootorpiirkonnaga koos lisafaktoritega, mis ahela pikendamisel ei osale. trans faktorid. Need on transkriptsiooni aktiveerivad faktorid – TAF (eukarüootsetes) organismides).
  
• Lisafaktorid osalevad promootori äratundmises ja aitavad RNAP seonduda „õige“ DNA piirkonnaga.
  
• RNA sünteesi lõpetamine toimub prokarüootides terminatsioonifaktorite abil – rho-sõltuv (pööratud kordusjärjestused, 20 järjestust, milles 8 AT paari, GC paarid on tugevamad) terminatsioon või ilma nendeta.
  
• Eukarüootsete transkriptsioon toimub terminatsioonifaktorite vahendusel
  

Kui rho faktor tunneb ära sünteesitud RNA järjestuse, seondub ta RNA-ga. RNA ahel vabastatakse transkriptsioonikompleksist. Kui promootor vabaneb sealt, saab sinna seostuda uus RNA polümeraas ja alustada uut RNA sünteesi. Ühelt geenilt võib toimuda paljude RNA molekulide süntees.
Bakterites esineb valk Cre faktor, mis suurendab pürofosforülüütilist toimetamist. Sarnaneb hüdrolüütilisele toimetamisele. Vale nukleotiidi ahelasse ei lülitata (toimub pärast fosfodiestersideme sünteesi). Seotud promootori puhastamisega.
α-heeliksil kaks domääni, mis asuvad teineteisest suhteliselt kaugel. β’-subühikud on kohad, kuhu ühinevad 2 Mg iooni ja sünteesitakse fosfodiesterside.
RNAPI – rRNA süntees, RNAP II – mRNA süntees, RNAP III – dRNA süntees. Mõned subühikud kattuvad.
Eeltuumsete promootor ja pärisbakterite promootor
Koht, kust süntees algab. 10 aluspaarist koosnev DNA järjestus. Esinevad vabadusastmed. „-„ mitu nukleotiidi eespool alguspunktist. Esimene on -10 heksameer. Teise vabadusaste on -35 heksameer. Nende kahe vahele jääb 17 aluspaari. -10 ja – 35-ga seonduvad sigmafaktorid. Startsait ei ole juhuslik ja algab alati puriiniga. Milliselt DNA osa pealt RNA sünteesitakse, on määratud DNA kindlate järjestustega. Kõdunud järjestused (heksameerid) on üksteisest kindlal kaugusel (määrab ära, millised DNA osad on olulised, kuidas ära tuntakse, mis osadel RNA sünteesitakse, mis osa muutub geeniks). UP-element -55 boksiga pole kõigil, vaid neil, kes on väga stabiilsed. Tugevdavad sagedust, millega promootor töötab. „Laiendatud-10 boks “. -50/-55 piirkonnas samuti järjestuselement, mida tunneb ära RNA polümeraasi α subühiku N lisadomään.
Transkriptsiooni initsiatsiooni eeltuumsetes määrab sigmafaktor ära ahela spetsiifika. Kahte ahelat nimetatakse erinevat moodi. Ahel, mis on identse nukleotiidilise järjestusega mRNAle, nim + ahel – kodeeriv ahel. Teine on mRNA-le komplementaarne ahel 3’→ 5’ suunas. RNA-d sünteesitakse ju 3’ →5’ suunas. Sigmafaktor tagab seondumisel ühelt poolt seondumisjärjestuse spetsiifika ja kompleksi avatuse, teiselt poolt RNA polümeraasi vaheldumise. Koos sigmafaktoriga toimub promootori äratundmine, see on kiire protsess, toimub millisekunditega. Kui elongatsioon on alanud, siis toimub kiiresti. Promootorpiirkond vabaneb 1-2 sekundi jooksul.
Sigmafaktor tunneb ära kindla heksameeri ja määrab ära, mille pealt süntees toimub. Kahte ahelat nimetatakse + ja -. See ahel, mis on identse nukleotiidilise järjestusega kui sünteesitav mRNA on + ahel – kodeeriv ahel. – ahel on komplementaarne ahel, mille järgi sünteesitakse. See transkrptsiooni initsiatsiooniprotsess on prokarüootides küllaltki oluline.
RNA polümeraasid
Prokarüootidel on 1 aktiivne RNA polümeraas, eukarüootidel on neid 3.
Prokarüootne RNA polümeraas. E. Coli RNAP holoensüüm – täisensüüm – koosneb 4-st erinevast polüpeptiidist (valgust), millest üks on kahe koopiana.
subühikud on α – geen rpoA; β subühik, geen rpoB, β’, rpoC; sigma , rpoD.
Holoensüümis on kaks α subühikut, üks β, üks β’ ja üks sigma. Molekulmass 428-486 kDA. Transkriptsiooni elongatsiooni viib läbi põhi- e. tuumikensüüm – core enzyme, milles puudub sigma subühik, seega olemas α, β, β’. sigma subühik osaleb ainult translatsiooni initsiatsioonil suunates põhiensüümi seondumist promootoriga. Kuna on mitut tüüpi promootoreid, siis on vastavalt ka mitu sigmafaktorit. Põhiline on sigma 32 – valk, mis suunab suure enamuse bakteri geenide avaldumist.
Polümeraasis toimub struktuurne muutus töö käigus. Ühest faasist teise üleminekul on see väga oluline, Bakteri RNA polümeraas koosneb mitmest polüpeptiidist (α, 2β ja γ). Algul on avatud, hiljem suletud.
RNA polümeraasi kiirus: 40-80 nukleotiidi sekundis, DNA polümeraasi kiirus: 1000 nukleotiidi sekundis
RNA polümeraas teeb 1 vea 10000 kohta, DNA polümeraas 1 vea miljoni kohta
RNA polümeraas ei vaja praimerit, DNA polümeraas vajab praimerit
Krabi sõra struktuur – RNA polümeraas koosneb mitmetest subühikutest. Struktuur on seotud ensüümi protsessiivsuse tagamisega – arv monomeere, mis lisatakse ühe initsiatsioonisündmuse kohta. Aktiivtsenter asub sõrgade vahel. Seal toimub uue fosfodiestersideme süntees (ühelt DNA ahelalt). RNA ahelale lisatakse nukleotiide juurde. Järjestuse alusel valitakse välja komplementaarsed nukleosiidid, ribonukleosiidfosfaadid ja fosfodiesterside süntees – 3’ O atakteerib fosfodiestersidet α fosfaadi juures – ümberesterifitseerimisreaktsipoon. Vabaneb PPi. Osaleb kaks Mg iooni (üks deprotoneerib 3’O ja teine kodeerib fosfaadi O-sid).
Bakteriaalne DNA sõltuv RNA polümeraas
sigma subühik on seostunud ainult initsiatsiooni ajal.
Transkribeeritav vorm koosneb α2 β β’
vastavad geenid:
1) α-rpoA – karboksülterminaalne domään tunneb ära DNA.
2) β-rpoB – kõige suuremad, katalüütilised
3) β’-rpoC- katalüütilised
4) sigma -rpoD – oluline vaid initsiatsioonil
Bakterite geenid on enamasti operonides:
promootor ― A ― B ― C ― jne
promootorregioon kontrollib kõiki neid geene korraga.
promootor koosneb 8 heksameerist: -35 ja -10 (miinus tähendab, et need on startsaidi ees) nt ― -35 ― - 10
Transkribeeritakse ainult ühte ahelat. See, mida transkribeeritakse, on matriitsahel (DNA) ja see, mida mitte, on kodeeriv ahel
Matriitsahel: 3’ ←5’, sinna peale tehakse 5’ ― 3’ RNA
operaator – geeni aktiivsust reguleeriv järjestus, millele saabub regulatsioonifaktor.
cis-järjestus – (promootor, operaator, enhancer )
UAS – (upstream activating sequence) promootorist eespool asuv järjestus, mis aktiveerib spetsiifiliselt geene. Paljudel geenidel, mille ekspressioonitase väga palju muutub. Muutub 1000 x või enam.
silencer – järjestus, mis surub geenide aktiivsust maha
trans-faktorid – enamasti valgud, mõnel juhul RNA. repressor , aktivaator , terminaator . ensümaatiline terminaator – sigma-sõltuv terminaator (tagasihoidlik juuksenõel + sigmafaktor).
Transkriptsioon võib väga tihti jääda pooleli (erinevalt translatsioonist). Tavaliselt juhtub seda kahe faasi vahel: initsiatsioon-elongatsioon.
Transkriptsiooni alustamine:
1) RNA polümeraas (järjestusspetsiifiline) seondub DNA-ga
2) seondumisele järgneb konformatsiooni muutus – suletud kompleks läheb üle avatule.
3) DNA ahelad sulavad lahti → tekib transkriptsiooni silm
- sünteesitakse väike osa RNA-d. Otsa jääb trifosfaat.
4) RNA süntees, produkt vabaneb, DNA ahelad seonduvad taas kokku
5) promootori puhastamine
täisensüüm – holoensüüm - α2 β β’ sigma
põhiensüüm - α2 β β’
kui RNA polümeraas seondub sigmafaktoriga, siis hakatakse otsima promootorjärjestust. Kui leiti, siis polümeraas ei dissotseeru, aga sigmafaktor teeb seda. Erinevad sigmafaktorid tunnevad ära erinevaid DNA järjestusi (tagab promootori ja ahela spetsiifika, nõrgendab RNA polümeraasi seondumist). Kiire protsess. RNA polümeraasi põhiensüüm võib ka ilma sigmafaktorita kompleksi moodustada (aga väga väikeses osas). Põhiline on sigma 70.
rpoD ⁞ 70 kD ⁞ üldine ⁞ TTGACA (-35) ⁞ 16-18 bp ⁞ TATAAT (-10)
rpoH ⁞ 32 kDa ⁞ heat shock ⁞ COCTTGAA ⁞ 13 – 15 bp ⁞ COCGATNT
rpoN ⁞ 54 kDa ⁞ lämmastik ⁞ CTGGNA ⁞ 6 bp ⁞ TTGCA
Initsiatsioon
RNA polümeraas + sigma subühik → kiire protsess
DNA otste lahtisulamine → avatud kompleksi moodustamine, tunduvalt aeglasem, kui esimene protsess (miljard x)
esimese 10 nukleotiidi süntees → suhteliselt kiire
üleminek initsiatsioonilt elongatsioonile → kõige aeglasem + edasiste nukleotiidide süntees. Promootori puhastamine. Pooltel juhtudel jääb süntees pooleli. Sõltub ATP (GTP) kontsentratsioonist. Esineb ka analoogseid ensüüme, mis pärsivad edasiminekut. Elongatsioon, kui on lahti läinud, toimub kiiresti. F
Initsiaatoris võib mitu RNA polümeraasi seonduda ja kui promootor on vabastatud, siis võib mitu korda ühelt geenilt.
RNA polümeraas – DNA sõltuv nukleotidüültransferaas, sünteesib fosfodiestersidet.
RNA sünteesi keemia – RNA 3’ otsa seostub ATP või ekvivalent oma 5’ otsaga ning vabaneb pürofosfaat (pöördumatu reaktsioon, kuna pürofosfaadi lõhkumine kulutab energiat).
Oluline on tekkiva kaksikahela geomeetria, kui see on vale, eemaldatakse vana nukleotiid ja uus pannakse asemele.
Ensümaatiline terminatsioon
terminaator – struktuurelement DNA-s.
Bakterites on kas rho sõltuv või sõltumatu. Rho sõltuv – pööratud kordusjärjestused ja nendele 10 nukleotiidilistele pööratud kordusjärjestusele järgneb 8 AT paari (ühel ahelal ainult A, teisel T). RNA-sse lülitatav nukleotiid on U rikas. Võib moodustada juuksenõela struktuuri ja kui on piisavalt stabiilne, tekib kaheahelaline RNA aktiivtsentris - sellega RNA polümeraas ei seondu. Sünteesi käigus hoiab RNA polümeraas enda käes 8-nukleotiidilist heterodupleksi (RNA ja DNA hübriid ). Juuksenõelastruktuur peab olema piisavalt pikk, et dissotseeruda RNA polümeraasi kompleks DNA-lt. Kaksikahel (RNA-RNA – juuksenõela moodustumisel) on stabiilsem kui RNA-DNA heterodupleks. Sellise järjestuse puhul kus on AT paar, selle koha pealt võib RNA kergelt dissotseeruda ja produkt vabaneb. Siis ka süntees katkeb.
Rho sõltuv faktor moodustab heksameere ja seondub RNA-ga. Liigub mööda ahelat kuni RNA polümeraasini, kui selles on sünteesitud kindel järjestus (mis on rho-le ATP hüdrolüüsi signaaliks), tunneb järjestuse ära. Moodustab heksameerse kompleksi ja äratundmisjärjestusega suunab RNA ahela lõikamise. RNA ahel vabastatase transkriptsioonikompleksist. Toimub sigmafaktori vahendusel, mis moodustab heksameere. Seondub sünteesitava RNA 5’ otsaga ja hakkab liikuma 5’ → 3’ suunas, jälitab polümeraasi. Kui ribosoomid tulevad vahepeal juba kohale, siis sigmafaktor jääb sinna kinni. Kui ribosoomid dissotseeruvad, siis saab sigmafaktor jõuda polümeraasini ja annab edasi lõpetussignaali.
mRNA 5’ ―valk―valk―valk―→3’
Enneaegne stoppkoodon (nt mutatsioon esimeses tsistronis) põhjustab polaarse efekti. Ülejäänud geenid sealt operonist ei avaldu (seotud sigmafaktori ja ribosoomide kaudu). Kui translatsiooni ei toimu, lõpetab asja sigmafaktor.
DNA kaksikahel, millelt toimub RNA transkriptsioon, on seotud RNAP β ja β subühikute vahele ning on seotud mõlemalt poolt ensüümi, seega teeb DNA kaksikahel poolkaare ümber RNAP ensüümi. RNAP maksimaalne läbimõõt on 150 A, aga RNA sünteesi initsiatsiooni käigus katab RNAP 70-90 aluspaari DNA ahelast, seega 235-305 A, mida seletab RNAP-DNA kompleksi kolmemõõtmeline struktuur, kus DNA pöördub ümber RNAP ensüümi. DNA on transkriptsiooni käigus tihedalt seotud RNAP subühikute vahele, mis seletab transkriptsiooni kõrge protsessiivsuse.
Eukarüootne transkriptsioon

• imetajatel 40 000 geeni, prokarüootidel 10x vähem
  
• eukarüootide pärilik info on pakitud kromatiini, mis muudab DNA kättesaamatuks trans faktoritele ja transkriptsioonifaktoritele. Selles ongi erinevus eukarüootide ja prokarüootide geenide aktiivsuse regulatsioonis transkriptsiooni tasemel.
  
• prokarüootidel on negatiivne transkriptsiooni regulatsioon, eukarüootidel positiivne transkriptsiooni regulatsioon
  
• DNA avamine kromatiinis (kromatiini remodelleerimine) on eukarüootidele omane geeni aktiivsuse regulatsiooni põhisündmus. Selle protsessi käigus modifitseeritakse histoonid. Histoonide spetsiifilised modifikatsioonid muudavad DNA ja histoonide vahelised kontaktid dünaamiliseks, nii et nukleosoom saab mööda DNA ahelat „libiseda“ ja oma asukohta muuta. Nii muudab histoonide modifitseerimine mõne spetsiifilise DNA lõigu DNA-ga seonduvatele valkudele kättesaadavaks. Palju DNA cis elemente ja trans faktoreid. Erinevalt reguleeritud geeniperekonnad.
  
• 5’ TOP – housekeeping geenid.
  
• üheaegselt avalduvatel geenidel sarnased faktorid (osaliselt kattuvad) ja ka homoloogsed DNA cis järjestused, millega faktorid seonduvad. sarnaselt reguleeritavatel geenide homoloogsed DNA regulaatorjärjestused, mis on samade või sarnaste transkriptsioonifaktorite seondumiskohtadeks. Eukarüootides on kolm erinevat RNA polümeraasi, millest igaühel on oma kindlad märklaudgeenid
  
• eukarüootide 3 erinevat RNA polümeraasi:
  

RNAP I – vastutab ribosomaalsete RNA geenioperonide transkriptsiooni eest (18S-5, 8S-28S rRNA), transkribeerib ühte geeni, mida on paljusid koopiaid (rRNA). rDNA – geenid, mis kodeerivad ribosoomi RNA-d. Ühte operoni organiseeritud – erand eukarüootides, tavaliselt seda neil ei esine.
RNAP II – sünteesib valke kodeerivaid mRNA molekule – transkribeerib enamikke geene, olulisim (!)
RNAP III – transkribeerib 5S rRNA, tRNA ja mitmeid U-RNA molekule, sno RNA (ja ka tuumas!)
epigeneetilised fenomenid:
1. Prion
2. Chaperonid (Hsp 90) mutatsioonide varjestajatena
3. RNA interferents
4. DNA metüleerimine ja geenide päritav represseerimine
Geenide vaigistamine ja RNA interferents
RNA vahendatud geeni vaigistamine – homoloogsete RNA-de või RNA-DNA interaktsioon viib geeni aktiivsuse kadumisele ja DNA metüleerimisele. Nähtus on levinud paljudes päristuumsete rühmades nagu taimed, pärmid , ussid, putukad ja imetajad. Eri taksonid kasutavad erinevaid geeni vaigistamise mehhanisme. See toimub nii tuumas (taimedes) kui tsütoplasmas.
RNAi – RNA interferents – posttranskriptsiooniline geeni vaigistamine, mille käigus 2-ahelaline RNA suunab homoloogse mRNA lagundamist tsütoplasmas.
PTGS – post transkriptsiooniline geeni vaigistamine (silencing). Taimede puhul. Kasutatakse lühendit PTGS/RNAi
quelling – sama tähendusega termin Neurospora puhul (maha suruma)
dsRNA – kaheahelaline RNA – double stranded – RNAi oluline vahendaja
RdRP – RNA sõltuv RNA polümeraas suunab RNA sünteesi RNA matriitsi alusel, mulle tulemuseks on dsRNA. Pole RNAi toimumiseks vajalik kui rakus on suur kogus dsRNA-d
RNaas III – dsRNA spetsiifiline endoribonukleaas, mis hüdrolüüsib rohkem kui 10 aluspaarilise dsRNA fosfodiestersidemeid. RNAi puhul toimub pikkade dsRNA-de lagundamine väiksemateks fragmentideks (21-25 aluspaari), mida viivad läbi RNaas III homoloogid, nt Dorsophilas valk nimega Dicer.
siRNA – vaigistamist indutseeriv RNA on RNaas III sarnaste ensüümide hüdrolüüsi produkt; 21-25 nukleotiidi pikk, mis on kas „sense“ või „antisense“ järjestusorientatsiooniga.
antisense RNA –

• mRNA-ga komplementaarne, mis mRNA-ga seondudes moodustab kaheahelalise RNA, mida ei saa transleerida.
  
• Kaheahelalisele RNA-le on spetsiifiline RNAaas (RNAaas III) – lõikab katki mõlemad RNA ahelad (kaheahelalised katked).
  
• Kui geeni pole vaja, sünteesitakse antisense RNA ja geen lülitatakse välja
  
• Hok ja Sok geenid – Hok – ( host killing) peremehe tapja ja Sok – (supressor of killing) tapmise takistaja. Hok produktiks on valk. Sok’ilt sünteesitakse antisense RNA. Kui Sok’i pole, on võimalik Hok-ilt valgusüntees.
  
• bakteri periplasmas on palju RNAaase ja DNAaase, mis kaitsevad viiruste sissetungi eest.
  

RISC – RNA indutseeritud vaigistuskompleks (RNA induced silencing complex). See on RNAi põhiline efektorkompleks, mis lagundab siRNA-ga homoloogse mRNA. Seega siRNA kuulub koos mitmete valkudega RISC kompleksi.
Helikaasid – dsRNA-d või dsDNA-d lahtiharutavad ensüümid. Neurosposa puhul on leitud, et DNA helikaas osaleb RNAi toimumisel. Teistes organismides on leitud, et RNAi jaoks on vajalikud RNA helikaasid.
Transkriptsiooni regulatsioon prokarüootidel
- Ribosoomide süntees – pooldutakse kiiresti ja on vaja pidevalt ribosoome sünteesida. Aeglaselt kasvavad või nälgivad bakterid on ribosoomide vaeguses.
- Tasemed (transkriptsioon, translatsioon, mRNA stabiilsus/protsessimine, translatsioon, valgu modifitseerimine ja eluiga, ribosoomide süntees).
- Nukleiinhapete ja regulaatorvalkude äratundmine. DNA järjestusspetsiifiline äratundmine valgu poolt (sigmafaktor, millel on 2 domääni heksameeri äratundmiseks). Nt Trp operoni repressorvalk. Kui seob Trp, siis repressor seondub DNA-le. DNA suures vaos toimub enamus järjestusspetsiifilistest interaktsioonist.
- Aktiveerimiseks võib olla Trp, mis muudab valgu konformatsiooni selliseks , et ta seondub DNA-le (Trp geeni repressor operonile).
- Kui geeni ei reguleerita, on ta aktiivne
- prokarüootsed geenid on operonides.
- operoni promootorile seondub RNA polümeraas, seal toimub põhiline regulatsioon. Ilma regulatsioonita on operon aktiivne ja sünteesitakse.
- Esineb positiivne ja negatiivne transkriptsiooni. Negatiivne on prokarüootidele omane.
- Kui midagi pole, on aktiivne negatiivne regulatsioon. Kui DNA pole valkudega peidetud, siis töötab. Negatiivse puhul repressor seondub operonpiirkonnaga ja vaigistab operoni aktiivsuse ehk mõjutab negatiivselt. Regulaatorvalk seostub promootorpiirkonna sellisesse kohta, mis sisaldab ka operaatorit → viib geenide väljalülitamisele. Kui regulaatorit pole, on operon aktiivne.
- Eukarüootidel on positiivne kontroll – DNA on tavaliselt valkudega seondunud ja tuleb eemaldada valke, et midagi toimuks . Positiivse regulatsiooni puhul on eukarüootidel palju reguleerivaid piirkondi, kuhu saavad seostuda erinevad transkriptsioonifaktorid. Kui transkriptsioonifaktorit pole, siis asi ei tööta – faktor mõjub positiivselt. Regulaator paneb geenid tööle. Kui regulaatorit pole, siis geen on väljalülitatud. DNA on pakitud kromatiini – DNA tuleb kättesaadavaks teha sünteesiks ja selleks vajatakse regulaatorit. Ilma regulaatorita on geen välja lülitatud.
Lac-operon, kolm geeni
1) LacZ – ensüüm β-galaktosidaasi kodeeriv geen, lagundab laktoosi; vajalik pentoosfosfaadi tsüklis . Koosneb neljast valgust.
2) LacY – membraanivalk, permeaasi (transportvalku) kodeeriv geen; võimaldab laktoosil rakku vast võtta. Pääseb väga aeglaselt. Permeaasita on laktoosi kontsentratsioon väiksem raku sees kui ümbritsevas keskkonnas.
3) LacA – transatsülaas, ensüümide aktiveerimiseks; laktoosi esmane lagundaja
4) LacI – regulaatorvalk, seondub promootoriga osaliselt kattuvasse piirkonda- operaatorisse; negatiivne kontroll. Kodeerib repressorvalku, mis ei lase Lac-operoni transkribeerida. Tema regulaator paikneb operoni piirkonnas, on oma promootor. LacI geeniprodukti kasutatakse indutseeriva valgusünteesi juures bakterites.
Laktoos – piimasuhkur, mida bakterid söövad. Kui inimesel pole laktaasi, hakkavad bakterid paljunema, küht läheb lahti.
Kui Lac-repressor on seondunud operaatoriga, siis ei saa RNA polümeraas seonduda promootoriga. Operaatorgeen on repressorvalgu sidumiskoht promootorpiirkonnas. Kui Lac repressor on seal, siis polümeraas ei saa seonduda. mRNA ja valgu eluiga on erinevad. Valgud, mis mRNA-lt sünteesitakse, on stabiilsed. mRNA tase langeb, kui induktor (laktoos) keskkonnast ära viia. Operoni seisukohalt on väga oluline, et valk permeaas jääb ka alles. Permeaas korjab aktiivselt laktoosi keskkonnast. Repressori seondumine ja tetrameeri seondumine DNA-ga (tetrameer seondub DNA-ga ja represseerib operoni), siis operon on vait. Kui laktoosi keskkonnas ei ole, on operon vaikne. Kui rakku satub laktoos, siis seondub repressoriga. Kui kõik repressori neli valku seonduvad laktoosiga, siis toimub konformatsiooniline muutus nii, et ta enam DNA-ga ei seostu. Toimub operoni derepressioon ja algab valgusüntees.
Mutatsioonid operaatoris muudavad operoni konstitutiivselt aktiivseks. Mutantoperaator on selline, millele repressorit ei seostu. Tegelikult on pidevalt aktiivne, seda ei saa represseerida. Selle eest operaatori mutatsioonid on dominantsed. Mutatsioonid LacI geenis (repressoris) muudavad operoni konstitutiivselt aktiivseks ja on retsessiivsed.
Induktor – madalmolekulaarne aine, mis aktiveerib operoni
Lac-operaator – siia seondub repressorvalk. Operaator asub tavaliselt osaliselt promootoriga kattuvalt (mõjutab otseselt promootorpiirkonnad).
Laktoosi peab olema piisavas kontsentratsioonis, et ta satuks mittespetsiifiliselt rakku ja seonduks repressoriga.
Induktor põhjustab mRNA koguse ja eluea, kui ta ära võtta, siis kaob mRNA, aga sünteesitub valgud jäävad alles. Selliselt saadakse kätte ka viimased laktoosi jäänukid. Need valgud lahjenevad pikapeale.
Induktor seondub repressoriga - konformatsioon muutub ja DNA saab avatuks sigmafaktoritele.
Operoni on hea kasutatada mutatsioonide uurimisel. Nt kui promootorjärjestus muutub, siis repressor ei saa enam seonduda ja asi töötab kogu aeg. Sama on ka repressori mutatsioonidega, aga see on retsessiivne. CAP valgu sidumiskoht on erinevatel operonidel erinev.
„võlutäpikese“ süntees viib transkriptsiooni seiskumisele. Guanosiintetrafosfaat ehk magic spot. Nimi tuleb meetodist, kuidas avastati. G-nukleotiid, millel nii 5’ kui ka 3’ otsas on fosfaadid ( (p)ppGpp). Toimib signaalmolekulina, osaleb transkriptsiooni regulatsioonis. Madalmolekulaarsed ühendid, mis osalevad transkriptsiooni globaalses regulatsioonis – mõjuva alameerivalt.
Täpike tekib nälgivates molekulides. Sünteesitakse ribosoomides kui valgusüntees on jäänud poolikuks (ei ole AH). Võib olla ka energeetiline nälgimine, kui GTP või ATP-d pole piisavalt. ATP ja GTP jääke kasutatakse võlutäpikese sünteesiks. Võlutäpike seondub RNA polümeraasiga ja lülitab RNA sünteesi välja.
Trp operoni kontrollitakse attenuaatori abil. Kinnine DNA struktuur (ei seondu valk) kodeerib lühikest peptiidi. AH-de biosünteesi operonides on oma attenuaator . Need on tundlikud endapoolt sünteesitud ühendite suhtes. Kui ribosoomid sünteesivad vajalikud valgud, siis valgus on palju Trp-d. Kui keskkonnas pole Trp-d, siis attenuaator lubab Trp sünteesivate geenide avaldumist. Valgult sünteesitud mRNA võib olla mitmes erinevas konformatsioonis. mRNA konformatsioon määrab terminaatori tekkimise. See, milline sekundaarstruktuur tekib, sõltub, kus kohas ribosoom pausi peab ja kas ta üldse peab. Attenuaatorile on iseloomulik see, et ta sünteesib lühikest peptiidi (millel valguna pole funktsiooni). Kui sünteesitakse, tekib RNA-s konformatsiooniline muutus, mis viib transkriptsiooni lõpetamisele. Süntees mõõdab Trp taset rakus. 1. liiderpeptiid on Trp rikas, liiderpeptiidi saab sünteesida, kui rakus on palju Trp-d. Saab sünteesida terminaatorit ja toimub attenuatsioon. Kaks meetodit, kuidas transkriptsioon välja lülitada – üks repressoriga, teine attenuatsiooniga.
Tihti kontrollitakse veel CAP-ga (kataboliitne aktivatsoonivalk). See toimib näiteks: juhul, kui keskkonnas on glükoosi, siis teisi suhkruid ei sööda. On ka kataboliitne repressor.
Alarmoonid – madalmolekulaarsed ained raku mingi stressi tingimusel. Nt nälgimisel. Kui mingi valgu sünteesiks on olemas kõik AH va üks, siis ribosoom sünteesib pooliku jupi valku.
Nälgimisfaktor – see sünteesib „võlutäpikese“ nukleotiidi. 2D õhukese kihi kromatograafias liigub see guanosiinfosfaat vägagi teistest erinevalt. Guanosiinpentafosfaat petab ära RNA polümeraasi. Ta lülitatakse RNA koosseisu, aga sinna otsa enam ei saa midagi panna. RNA süntees jääb seisma. Lülitatakse transkriptsioon üldiselt välja.
Erinevad viisid transkriptsiooni aktiveerimisel:
Aktivaatorvalgud seonduvad promootori lähedusse – sigmafaktor seondub nõrgalt, ei hoia piisavalt kinni avatud struktuuri tekkimiseks. α subühiku seondumist saab stabiliseerida – sellega saab kogu promootorit stabiliseerida. Sel juhul aktivaatorvalgud interakteeruvad nii α kui β subühikuga. Aktivaatorvalk peab igal juhul ära tundma mingi järjestuse sel kohal.
Aminohapete sünteesiraja regulatsioon
Trp operon
Transkriptsiooni ja translatsiooni seostatus. See on Trp sünteesi operon. Kui Trp-d pole, siis toimub mRNA süntees operonilt. Kui söötmes on Trp, siis sünteesitakse operonilt vaid lühikesed mRNA jupid. See saavutatakse mRNA konfiguratsiooni kaudu. Saab tekkida erinevaid mRNA struktuure. Võib tekkida terminatiivne mRNA või mitteterminatiivne struktuur.
Kui Trp-d pole, siis ribosoom jääb seisma attenaatori 1. piirkonda hetkeks ja regioonid 2. ja 3. paarduvad omavahel. Niiviisi terminatiivstruktuuri ei teki. Kui 3. ja 4. omavahel paarduvad, tekib terminatiivstruktuur (Trp olemas).
Nt. – P ― 1. – UGG (Trp)n ―2. ―. Kui Trp on, siis ribosoom saab liikuda 2.-ni ja jääb seal seisma. Kui Trp-d pole, siis ei saa ta üle 1. liikuda – jääb sinna seisma.
RNA polümeraasi α-osa suudab ära tunda järjestusspetsiifiliselt (β ja β’ ei suutnud). α N-terminaalne osa on ühenduses βja β’ subühikuga. Aktivaatorvalk võib seonduda DNA-ga ja suunata mingi piirkonna promootori avaldumise. Kui aktivaatorvalgu sidumiskohti on mitu, siis nad muudavad DNA topoloogiat. Toovad lähedusse primaarjärjestuse suht kauged piirkonnad. Painutavad DNA nagu hobuseraua, et need piirkonnad lähestikku tuua.
Translatsiooni repressioon valgu ja katalüütilise RNA poolt
Nt. Trp süntees mRNA kaudu
Ribosüüm – katalüütiliselt aktiivne ribosoom. Lõikavad RNA kindla koha pealt katki. Selle aktiivsus sõltub RNA struktuurist. mRNA sisaldab ribosüümi 5’ otsas. Muutub aktiivseks, kui produkti on palju keskkonnas ja hakkab iseennast katki lõikama. Katalüüsivad tähtsamaid reaktsioone (peptiidsideme moodustumine, AH ühendamine polüpeptiidahelaks). Kui ribosüüm osaleb geeni regulatsioonis, siis kutsutakse seda regulatsiooni – ribolülitiks – riboswitch.
Trp repressor seob Trp ja seondub Trp operaatoriga. Seondumine DNA-ga sõltub sellest, kas ta on kompleksis Trp-ga. Seondumine võib toimuda ka Trp vahenduseta, kuid selle eest ribosoomi vahendusel. GlcN6P (aminoglükoos-6-fosfaat) on efektormolekul, mis seostub selle sama enda mRNA-ga. Kui on seondunud, siis ribosüüm lõikab iseennast katki. Katkisest RNA-st pole translatsioonil abi. Ribosüüm kompleksis metaboliitidega, mille sünteesi reguleerib, viib mRNA lagundamisele ja ensüümi sünteesi väljalülitamisele. Suunab mRNA lagundamist tema enda ribosüümi poolt. Sünteesi regulatsioon ribolüliti abil.
r-valkude sünteesi regulatsioon tagasiside abil
Ribosoom – kompleksne struktuur – 54 eri valku. 53 valku 1-s koopias. Ühte valku on 4 koopiat. Ribosoomi sünteesiks on vaja omakorda sünteesida rRNA ja ribosoomivalgud. Üks komplekssemaid organelle. Kõik koostisosad moodustavad stabiilse üksuse. Ribosoomide geenid on organiseeritud operonidesse. Operonide regulatsioon – S8 reguleerib spektinomütsiini operoni. S-valgud – väiksema subühiku valgud. R- valgud suurema subühiku valgud. Valgu S8 seondumine 16S rRNA ja mRNA-ga. Kaks RNA-d konkureerivad valgusidumise pärast. Valgusüntees ei toimu, kui valk S8 on ülehulgas ja seondub mRNA-ga – mRNA ei saa enam ribosoomiga seonduda. Polaarne efekt – suurtel operonidel on selline nähtus, et kui tekib stoppkoodon L23 sisse, siis valku S23 ei saa sünteesida ja lõpetab ka nende valkude sünteesi, mis talle järgnevad. Transkriptsioon ja translatsioon on prokarüootides omavahel seotud – toimuvad ühtse protsessina. Kui sünteesitakse mRNA, siis seda transleeritakse samal ajal. Nii kui ta välja ulatub, saab temaga seostuda ribosoom ja saab toimuda translatsioon. Kui süntees jääb seisma ja valku ei saa sünteesida, siis jääb ka RNA süntees katki – polaarne efekt (st omavahel seotud). Kui ribosoom transleerib mRNA-d, siis kaitseb ta sünteesitavat produkti rho faktori eest. Kui pole ribosoome, võib toimuda rho sõltuv terminatsioon. Rho faktorist tingitud. Rho faktori sõltuvaid kohti esineb operonides küllalt sageli.
Bakterite sporulatsioon
Toimub sigmafaktori ümberlülitumine – kaskaad . Seda rada poole pealt tagasi pöörata ei saa. Üks sigmafaktor määrab ära järgmise sigmafaktori. Selline kaskaadne süntees on eukarüootides tavaline, prokarüootides eriline.
RNA, mida ei transkribeerita kunagi
Nt. rRNA, mille geenid on ühes operonis. rRNA elementidel on antiterminatsiooniboksid, mis blokeerivad rho sõltuva terminatsiooni
-UAS ―P1-P2 – (box A) ― 16S ― tRNA – (boxA-boxB) ― 23S ― 5S-T1-T2―
Kaks promootorit ja neid reguleeritakse erinevalt.
P1 – konstitutiivselt aktiivne; P2 - lülitatakse sisse, kui on väga head kasvutingimused.
Kaks terminaatorit – toimivad sigmasõltumatult. Kõige tugevamad prokarüootide terminaatorid. Termineerivad ka võõrpolümeraase. Kahte terminaatorit on vaja, et terminatsiooniresistentset polümeraasi ikkagi peatada. Valgu geene siin operonis pole.
Kuidas kaitsta sigmasõltuvat terminatsiooni eest. Selleks antiterminatsiooni cis-elemendid ja faktorid.
cis-elemendid on nut - saidid. cis-elemendid toimivad antiterminatsioonifaktorite abil.
antiterminatsiooniboksid:
box A – primaarstruktuuride element.
box B – RNA sekundaarstruktuuri element. Antiterminatsiooni cis-elemendid – nut – sait.
Antiterminatsiooni järjestuselemendid töötavad RNA tasemel. RNA polümeraas alustab ja mingi hetk terminatsiooni saidid vabastavad antiterminatsioonifaktorid.
Antiterminatsioonifaktorid: NusA, NusB, NusC, NusD, NusE. Seostuvad kindla RNA kindlate järjestustega. Need faktorid seonduvad box A ja box B-ga. RNA polümeraas on jõudnud boxidest üle, faktorid on seondunud RNA-ga ja seonduvad ka RNA polümeraasiga. Ülejäänud RNA pungub välja RNA-st. 5’ otsa hoitakse kinni ja toimub väljapungumine (otsad hoitakse lähestikku). Aitavad ruumilist struktuuri tekitada.
Lõpuks on kaks väga tugeva operoni lõpus rho sõltumatu terminatsioon. Rho sõltumatu, sest 5’ ots on kinni – rho faktor seostub RNA 5’ otsaga ja peab liikuma mööda RNA-d. Ribosoomi RNA süntesitakse ühe pika eellasena. Geenid on ühes operonis – ühest kohast reguleeritakse. Lõigatakse välja 16S ja 23S RNA. Rnaas III on oluline – arhe tüüpi Rnaas – tal on 16S ja 23S RNA ümbritsevas piirkonnas äratundmise kohad ja vabaneb RNA produkt, lõikab. Peale ribosoomi RNA väljalõikamist seondub ribosoomi valkudega ja moodustab struktuuri.
Antiterminatsioonifaktorid moodustavad suure valkude kobara, seostuvad RNA elementidega ja RNA polümeraasiga. RNA sünteesitakse suure linguna, mille otsad on lähestikku.
Ribosoomi valgud pärsivad iseenda sünteesi ja soodustavad rRNA sünteesi. Antiterminatsioonifaktorid seostuvad RNA cis-elementidega ja teisalt RNA polümeraasiga. Sigmafaktor peaks hakkama kinni 5’ otsast ja polümeraasile järgi jooksma, aga siin pole see võimalik. Ees on valkkompleks. RNA polümeraas on siin nn modifitseeritud. Antiterminatsioonifaktorid ei saa seostuda.
Antiterminatsiooni elemendid – boxid – on kahes korduses, et tagada 23S rRNA transkriptsiooni regulatsioon. 16S rRNA geen on pikk ja kui seal midagi juhtub, tagab järgmine box ka järgmise geeni regulatsiooni.
UAS – upsteream activating sequence – toimib valgu Fis sidumise kaudu. See järjestus toimib ka ilma Fis valguta, siis DNA kõverdub ja aitab eksponeerida promootoreid. Fis valgu seondumisel aga tagatakse kindalt avaldumine. Kokku toimib siis transkriptsioon – 100 x rohkem.
RNA protsessimine
Ribosoomi RNA sünteesitakse ühe pika eellasena (-5500 nukleotiidi). ―― 300S
Selle eellasRNA moodustab iseloomuliku sekundaarstruktuuri. Järjestused, mis on 16s rRNA, 23 S rRNA ja tRNA „otstes“ on järjestused, mis paarduvad homoloogiliselt. Tekkivad kaksikahelad on äratuntavad Rnaas III-le. St eellasRNA sisaldab eelpool mainitud RNA-de lõike endas ja need kleepuvad kokku, moodustades lingusid, mida lõikavad kleepumiskohast lahti Rnaas III-ed ja moodustavad subühikuid → vabanevad 16S rRNA ja 23S rRNA eellased.
Peale Rnaas II rakenduvad järgmised Rnaasid, mis on tundlikumad ribosoomi valkude seondumisele. Kui on ribosoomi valgud, siis ei lõika . Lõikab sealt, kust ribosoomi valke pole seondunud.
Rnaas P – spetsiifiliselt lõikab tRNA 5’otsa. Koosneb kahest subühikust: RNA ja valk. Lõikamise määrab katalüütiliselt aktiivne RNA. Valk kiirendab produkti vabanemist.
Rnaas E – suur molekul. Seotud degradosoom. Osaleb 5’ S rRNA protsessimises. Degradosoom lagundab RNA-d.
Ribosoomi RNA-st on 1% modifitseeritud nukleotiide. Modifikatsioonid lisatakse pärast transkriptsiooni. On nn pseudouridiini modifikatsioon. Siin töötab S-ensüüm. U nukleotiide keeratakse ringi. Iga modifikatsioon tehakse eraldi. Kolm pseudouridiini on tähtsad bakterite elus, teised pole. Pseudouridiini ensüüm on ka samaaegselt ribosoomi chaperoniks. Ta pakib ribosoomi õigesti kokku. Ilma selleta on ribosoomi efektiivsus tohutult väiksem.
30S rRNA sünteesil tekivad juuksenõelastruktuurid väga täpselt ja kontrollitult. Lõpp-struktuur tekib nende vahevormide kaudu. Ruumiline lõplik struktuur vajab eelnevaid vaheolekuid.
Geneetilise info ülekandmise täpsus
Kontrollmehhanismid:
1) Odav vigadeparandus sünteesi ajal – RNA polümeraasil kineetiline veerulugemine (proofreading). Kui vaja, hüdrolüüsitakse üks nukleotiid otsast ära ning pannakse uuesti, kus peab olema
2) Kallis mehhanism (editing) e. toimetamine. Produkt lagundatakse täielikult, kui midagi on valesti. Kontrollitakse RNA dupleksi õigsust, Lagundab degradosoom.
DNA polümeraasidele on omane oma vigade sagedus. DNA sünteesi täpsused:
1) DNA sõltuv DNA süntees – E-5-E-6
2) DNA sõltuv RNA süntees – E-5
3) RNA sõltuv DNA süntees –E-3-E-4
Valgusüntees on kõige vähem täpsem. Vigade sagedus sõltub substraadi kontsentratsioonist ja reaktsioonide kiirustest
Transkriptsioon eukarüootidel

• tRNA transportida tuumast tsütoplasmasse
  
• kromatiin asub tuumas
  
• DNA nukleosoomides (histoonide oktameeri komplektina)
  
• geenide intron - ekson struktuurid, operone pole
  
• kolm erinevat DNA sõltuvat RNA polümeraasi (prokarüootides 1) ja neil on osaliselt kattuvad subühikud prokarüoodi polümeraasiga.
  
• iga geen üks transkriptsiooni ühik
  
• inimese ≈ 20 000 geenilt saab ≈ 40 000 produkti
  
• inimesel näiteks rakku E+14 – paljurakulised organismid
  
• erinevates rakkudes avalduvad erinevad geenid
  

Kolm erinevat DNA sõltuvat RNA polümeraasi:
1) Pol I – transkribeerib ühte geeni, mida on palju koopiaid (rRNA)
2) Pol II – transkribeerib enamikke geene ja toodab mRNA-d. Peamine regulatsioon.
3) Pol III – transkribeerib 5S rRNA geene, tRNA geene ja sno geene (väikesed tuumageenide osad)
RNA polümeraas II
Olulised järjestused:

• - 2 … + 4 → heksameerne startsait CCAxxxTCC ⁞ komplementaarne TTAxxxATT
  
• - 31 … - 26 → TATA BOX → TBP valk (TATA binding protein). TATATATA…
  
• - 37 … - 32 →BRE → TFIIB valk, enne TATA BOX-i
  
• +28 … + 32 → DPE (ja Inr) → TFIID valk, on transkriptsiooniühiku ees, et polümeraas saaks transkriptsiooni alustada
  
• Need elemendid ei pea kõik korraga olemas olema, need olid vastavate piirkondade transkriptsioonifaktorid. TF – transkriptsiooni faktor; II → käib kokku RNA polümeraas II-ga.
  B- RNA polümeraas II B.
  
• prokarüootidel on ≈ 400 promootorit, eukarüootidel ≈ 20 000
  

TF (transkriptsioonifaktorid, mis on igal polümeraasil):
- üldised – mõjuvad kõigile promootoritele, mis selle polümeraasiga töötavad. Koosnevad paljudest valkudest.
- erilised – spetsialiseerunud, toimivad vaid kindlatele geenidele. Tavaliselt ühepolüpeptiidsed.
TF – üldised transkriptsioonifaktorid. Osaleb kõikide promootorite puhul.
TF II – RNA polümeraas II spetsiifiline
TF II A, B, C – erinevad transkriptsioonifaktorid
Transkriptsiooni initsiatsioon
TBP –(TATA binding protein). Seondumine muudab DNA kuju (160 kraadine pööre). Sunnib DNA-d kokku keerama. On näide, kuidas transkriptsiooni initsiatsiooni puhul konformatsioon muutub. ülimalt oluline. Eukarüootidel on DNA e kromatiini struktuuri muutusel vältimatu eeltingimus. DNA peab muutuma. Üks neist, kes kuju muudavad kindla koha peal on TBP. NB! DNA topoloogia muutub ka peale initsiatsiooni ka elongatsiooni puhul. Tekib keerde sisse (supervindid + ja – pidi) – topoisomeraasid.
TATA box - TATAXAX ( X = A/T) äratundmispiirkond – kui sellest mööda saab, siis transkriptsioon võib pihta hakata.
TFIID – koosneb paljudest valkudest. Võib ära tunda erinevaid piirkondi promootoril, sest on palju subühikuid.
Oluline on eukarüootsete promootorite puhul start sadi ümbruses. Kui 1. nukleotiid lülitatakse 5’ otsa mRNA-l. Oma konsensusjärjestus, mis bakteriaalsetel promootoritel pole. Need esinevad ka kodeeriva järjestuse sees.
Põhi polümeraas II promootor koosneb 4-st järjestuselemendist – TF II B, TBP, TF IID, TF II A
Polümeraasi kokkupanek: 1) on geen, promootor ja TATA box 2) pärast TATA-t seondub TF II A
3) esimesena seostub faktor TF IID ja TBP (data binding protein). Üle selle tunneb ära TATA box-i
4) siis seonduvad veel 2 TF IIB ja TF IID. 5) siis saab seonduda RNA polümeraas II – seondub DNA valkkompleksile, mitte ühele DNA-le, Kui on TF II A, B, D kompleks, siis võib seonduda. 6) Polümeraas II ise on ka teiste valkudega kompleksis. 7) kogub järjest subühikuid, kuni saab valmis 8) kui kõik on olemas tekib transkriptsioonisild – kogu kompleks on sinna seondunud. DNA on lahti harutatud, aga transkriptsioon ei hakka tööle. RNA polümeraas II karboksüterminaalne fosfrüülimine. CTD – saba taga, mida fosforüülitakse. Ühe kindla polüpeptiidi (subühiku) saba on nõrgalt struktureeritud ja koosneb paljudest lühikestest Ser/Thr rikastest kordusjärjestusest. Inimesel on 54 kordust, Pärmil paarkümmend. Ser/ Thr fosforüleeritakse külgahelaid. Ilma fosforüülimata seondub CTD mitme TF-ga. Algab transkriptsioon – signaaliks CTD fosforüülimine.
1) Preinitsiatsiooni kompleksi moodustumine, TBP seondub TATA box-ga.
―TBP ― TFIID ―
Süntees hakkab TFIIB-st.
TF IIB – oma äratundmiskoht. Esiteks seonduvad DNA-ga.
TFIID = TBP + TAF (ka TFIID ise sisaldab juba TBP). TAF on transkriptsiooni aktivatsiooni faktor. Kõik valgud seonduvad DNA-le korraga → kompleksis. Eelnevalt tehti DNA histoonidest vabaks.
2) Seondub lisaks TFIIA ja TFIIB. TFIIF seondub koos RNA polümeraas II-ga ja see kompleks hakkab ruumiliselt ümberkorralduma.
3) Seondub veel TFIIH – tekitab transkriptsiooni mulli. TFIIH ja TFIIE seondumise järel hakkab transkriptsioon. TFIIH fosforüleerib Ser (OH jääki), seejärel algab transkriptsioon. Tal on ka helikaasne aktiivsus. TFIIH-l on proteiinkinaasne aktiivsus (fosforüleerib CTD e karboksüterminaalse domääni, koosneb korduvatest järjestustes; 7 AH, millest 3 on Ser).
TBP seondumine muudab DNA kuju. Transkriptsioon muudab DNA topoloogiat - DNA on nii pikk, ei saa ümber telje pöörelda. Kui teha transkriptsiooni mull, siis see soodustab vindi teket. Lk=Tw+Wr-. Mulli ees positiivsed ja taga negatiivses supervindid. Neid eemaldavad ja reguleerivad topoisomeraasid.
Mediaatori vahendused toimuv transkriptsiooni initsiatsioon
Inimese geenide transkriptsioon algab peaaegu alati mediaatorkompleksi vahendusel. Seonduvad üldised transkriptsioonifaktorid. Lisaks seonduvad aktivaatorvalgud – spetsiifilised ja on igal geenil erinev kombinatsioom
Mediaatorkompleks – suur kompleks, mis seondub transkriptsiooni aktivaatoritega ja on 2-domäänilised valgud. Üks domään seondub DNA-ga, teine mediaatoriga. Teisel üks DNA-ga, teine aga kromatiini ümbermodelleerimise kompleksiga. Keeruline valgukompleks. Lisaks on spetsiaalne TF, mis koosneb kahest moodulist . Üks domään tunneb ära DNA järjestuse ja teine seondub mediaatorkompleksiga. TF terminatsioonid määravad geeni avaldumise. Valkkompleks, mis remodelleerib kromatiini. Histoone atsetüleeritakse. TATA kõverdumine aitab üksteisest kaugel olevaid osi üksteisele lähedale tuua. Aktivaatorpiirkond peab olema promootorile piisavalt lähedal. Mediaatorkompleks vahendab interaktsiooni.
HAT – histooni atsüültransferaas (histooni Lys aminorühm tavaliselt). DNA on tavaliselt topoloogilise pinge all. HAT lõdvendab DNA struktuuri histoonidega.
Faktorid, mis stimuleerivad transkriptsiooni elongatsiooni
RNA polümeraas II puhul on transkriptsiooni stimulaatorid – valgud, mis on seotud RNA-ga. Üks ensüüm on cap. Seonduvad järgmised komponendid: capping ensüüm, mis modifitseerib mRNA 5’ otsa (lisab esimesele G nukleotiidile).
GpppGpN – ahela pikenemine.
Ahelat alustatakse ka 5’ fosfaadiga.
Inimesel umbes 57 lisafaktorit. RNA polümeraasiga seonduvad valgud elongatsiooni ajal:
capping enzyme – paneb 5’ cap-i otsa. Paneb 7st positsioonist metüleeritud G nukleotiidi m7 G produktiks. sellega märgitakse ära kõik RNA produktid. Kui esineb m7 geen – see struktuur asub 5’ otsas, siis saab aru, et tegu on mRNA-ga. Vaja eristada splaissimise ja transpordi jaoks. Tuleb eristada kõigest. mRNA-d sünteesitakse palju ja erinevates piirkondades. Ribosoomi RNA-d sünteesitakse ainult tuumakestes. Valmiva RNA karboksüterminaaalse otsaga seonduvad mRNA splaissimisel osalevad valgud ja neid on palju. 5’ otsa modifitseerimisel mRNA suunatakse splaissimise masinavärki, mis hakkab kontrollima, kas tal esinevad intronite alguse ja lõpu signaalid. See on polümeraas II sõltuv. seondub RNA polümeraasi karboksüterminaalse domääniga. Kordus on (Ser, Pro, Tre, Ser, Pro, Ser) xN.
cap struktuur näitab, et tegemist on mRNA-ga. Kui mRNA sisaldab introne, siis seondub kohe kompleks, mis splassivad introneid välja. Ainult polümeraas II-l on CTD ja ainult tema produktile pannakse cap struktuur.
RNA eksportiinid seonduvad ka CTD-ga. Transkriptsiooni ja splassingu ajal toimub RNA transport tuumast tsütoplasmasse. On umbes 10 erinevat eksportiini.
Transkriptsiooni terminatsiooni määravad valgud:

• RNA eksportiinid (seonduvad ka polümeraasiga)
  
• terminatsioon erineb oluliselt prokarüootidest
  
• on seotud polü-A lisamisega. Polü A lisamise signaal AATAAA. Üksi sellest ei piisa.
  
• CPSF faktor – cleivage and polyandenolytiv spetsific factor – tunneb ära AATAAA järjestuse RNA tasmel. Kui ta selle ära tunneb, lahkub ta polümeraasi küljest. muutub polümeraasi konformatsioon ja eraldub DNA-st. See sama CPSF lõikab DNA ja RNA heterodupleksi lahti. Valk, mis seondub sabaga. Tunneb ära PolA lisamise järjestuse. Kui geenil esineb see järjestus, siis läheb polyA otsa. Faktor tunneb järjestuse ära ja lõikab katki. Vabanenud otsa pannakse PolyA polümeraasi poolt otsa palju A-sid. Ta on karboksüterminaalse domääni juures. (mRNA-s cap struktuur). Polümeraas sünteesib edasi mRNA-d, kuid on faktoritest ilma jäänud. Selline polümeraas, kellel pole midagi saba küljes, on halb toimetaja. Transkriptsioon toimub veidi edasi, kuid sumbub vaikselt.
  
• AAATAAA – selle pealt RNA sünteesides seonduvad RNA-ga need faktorid, mis enne olid C-domääniga. Sealt küljest polyA polümeraas jt hüppavad üle. Lahkuvad C- domääni küljest ja seonduvad RNA lõpuga. Suunavad RNA lõikamist, lõikavad ja ei hooli polümeraasist. RNA vabaneb ja Poly A polümeraas sünteesib sinna otsa PolyA saba.
  
• PAP tuleb CTD-st lahti ja hakkab 3’ RNA otsa sünteesima polü-A järjestust (≈200). Sünteesitava polü-A sabaga seondub polü-A-siduv valk PABP r.eIF-4E. Seega juba transkriptsiooni käigus soenduvad translatsiooniks vajalikud valgud.
  

RNA polümeraas I
Initsiatsioon – TBP seondub mitte otse DNA-ga, vaid TF kompleksiga. See valgukompleks peab moodustuma RNA geenide transkriptsiooniks.
promootor – üks promootor ühte tüüpi. Polümeraas on kogu aeg promootori küljes kinni.
aktivatsioon – sõltub järjestusest, mis on ≈ 100 ülesvoolu, startsaidist: -150 … + 100 → UCE.
UCE-le vastab ka TBP ja lisaks UCB. rRNA-l pole oluline, milline RNA polümeraas teda sünteesib. Tuumakeste moodustumine sõltub RNA polümeraas I-st.
RNA polümeraas III
Initsiatsioon tRNA geenidel.
tRNA geenid: seal on transkriptsiooni alguskoht ja vajalikud järjestused transkriptsiooni ühik sees. Seepärast erinebki. Teistel on promootor põhiliselt geeni ees. Polümeraas II puhul põhiliselt geeni sees. TBP esineb seal, kuigi tal pole TATA boxi. Seal esinevad tähtsad faktorid: TF II C, TF II B ja TF II A. Vajalikud nii transkriptsiooni initsiatsiooniks kui ka sünteesi puhuks. Sünteesitud RNA seondub TF II C-ga ja viimane osaleb RNA transpordil tuumast välja. TF III A suunab 5S RNA tuumakesse. Geene ei viida tuumakesse, geenid on tuumas. Kui 5S RNA saab valmis sünteesitud, siis satub kompleksi TF II A-ga ja viiakse tuumaksesse, kus toimub ribosoomide assambleerimine.
- kahte tüüpi promootoreid. promootorid on sisemised:
―→ START→―box A ― box B ―
- mängus TBP, TFIIB, TFIIC (kui toimub tRNA transkriptsioon. TFIIC seondub ka sünteesitava RNA-ga ja on ka transpordifaktoriks.
5S rRNA puhul on TFIIA spetsiifiliseks faktoriks. See on Zn valk. Seondub 5S rRNA-ga transkriptsiooni ajal ja ta viiakse selliselt tsütoplasmasse. 5S rRNA lisatakse tsütoplasmas, et ribosoom tuumas tööle ei hakkaks.
Eukarüoodi geeniekspressiooni regulatsioon
Põhiline ikka valgu ja nukleiinhappe spetsiifiline äratundmine, glükokortikoidid.
Tüüpiline tee:
1) aktivaator seondub DNA-ga (järjestusspetsiifiliselt) + CRC (chromatic remodelling complex) →
2) kromatiini struktuuri muutus + histooni modifikatsiooni ensüümid →
3) histoonid kovalentne modifitseerumine + muud aktivaatorid →
4) aktiveerunud geeni kompleks + GTF (üldised transkriptsiooni faktorid) →
5) transkriptsiooni pre-initsiatsiooni kompleks + teised aktivaatorid →
6) RNA polümeraasi fosforüleerimine ja transkriptsioon
Punkt 1) toimub tavaliselt replikatsiooni ajal. Kõik DNA järjestused avanevad siis.
CRC – muudab kromatiini struktuuri. Punkt 3) H3 ja H4 atsetüleerimine, mille N-sabad ulatusid nukleosoomist välja. Muidu ei saa DNA-d kätte. Et saaks mööda DNA-d libiseda, tuleb histoonid H3 ja H4 modifitseerida nii, et nad laseksid DNA-st lahti – histoonide kovalentne modifitseerimine.
Punkt 5) Geeni promootorpiirkond on eksponeeritud, on tekkinud transkriptsiooniling.
Transkriptsioonlingu tekkeks vajatakse SATB1 valke immuunsüsteemi rakkudes.
Aktivaatorid – transkriptsioonifaktorid. . Koosnevad 2-st moodulist või domäänist ja sageli moodustavad dimeere. Valgul 2 domääni – aktivaatorvalgud. Üks seostub DNA-ga, teine aktivatsioonidomään on kromatiini remodelleerimiskompleksi või mõne muu aktivaatorvaluga seondumiseks (või mediaatoriga).
Transkriptsioonifaktorid koosnevad kahest moodulist ehk domäänist. Üks osa tunneb ära DNA järjestuse ja teine – aktivatsioonidomään – omab signaali, et järgmised faktorid saaksid tulla. Nt pagaripärmi GAL1 geeni promootor ja aktivaatorala koos Gal4 sidumiskohtadega.
Moodulite vahetamine aktivaatoris viib promootori spetsiifika muutumisele. DNA sidumisdomään määrab aktivaatori töötamise.
Transkriptsiooni aktivatsioon võimendi abil – enhancer.
Toimib DNA-le mõlemis suunas. Võib asuda promootorist väga kaugel. Üks enhancer võib reguleerida mitut geeni, sellega seonduvad oma kindlad geeni aktivatsiooni elemendid (ST1). Enhancer on DNA järjestus, mis koosneb paljudest kordustes, on mõlemat pidi sümeetriline. RNA polümeraas II seob mediaatorkompleksi, need omakorda enhancer piirkonnaga.
Kromatiini remodeleerimine toob enhancer promootori lähedusse.
Need histoonid, mis jäävad aktivaatori seondumissaidist allapoole, atsetüleeritakse. Histooni atsetülaas atsetüleerib N-terminaalsed otsad. Nii muutub DNA kergesti kättesaadavaks.
Histoonidel on erinevaid modifitseerimise võimalusi, Kõige rohkem on neid H3-l. Kui siin N-terminaalset modifikatsiooni pole, siis sealolevad geenid on vaikses olekus. Histoone modifitseeritakse ka replikatsiooni ajal.
Lys – atsetüleeritakse. Ser – fosforüleeritakse. H3- kõige pikem N-terminaalne saba, tal kõige rohkem modifikatsiooni võimalusi. H4 – ka mitu erinevat võimalust. H3 – kovalentsed modifikatsioonid omavad erinevat tähendust. Kui pole modifikatsiooni → lähedal on geenid vaikivas olekus või geene pole. 14. positsioonis on Lys atsetüleeritud → geen on inaktiivne. 9. positsioonis on Lys atsetüleeritud → histooni eraldumine, metüleerimine.
Võimendi mõju tühistamine insulaatori (tühisti) abil
promootor võib olla ka kaugel, aga peavad olema samad molekulid, et võimendi talle mõjuks. Enhancer
mõjub nii kaua, kui tuleb selle mõju tühistav DNA järjestus (insulaator). Enhancer mõjutab vaid teiselpool olevaid geene. Insulaator blokeerib võimendi mõju.
―enhancer ―→ insulaator ―
Eukarüootide transkriptsiooni regulatsioon
- millised geenid ja millal aktiveeritakse
- kui palju geeni produkti sünteesitakse
- regulatsioon toimub põhiliselt transkriptsiooni initsiatsiooni reguleerimise kaudu (preinitsiatsiooni kompleksi moodustumine), kuid ka transkriptsiooni elongatsiooni tasemel
Prokarüootides on sarnased geenid ühise promootori kontrolli all. Eukarüootidel on iga geen eraldi iga transkriptsioonielemendi kontrolli all, iga üksiku promootori kontrolli all. Operonid puuduvad (va rRNA puhul). Eukarüootidel on rohkem geene ja mittekodeerivaid alasid. Eukarüootide kromatiid on palju rohkem keerdunud, geenid on kõvemini ära peidetud. Bakterites on DNA suhteliselt vaba. Hulkraksetel eukarüootidel erinevates kudedes peavad avalduma erinevad geenid ja teatud eluetappidel peavad avalduma mõned geenid, mis muidu on vaikimisi.
DNA on keerdunud ümber histoonide kompleksis. Geen on kuskil kohas. Pole lihtne üles leida.
1. aktivaator seondub DNA-ga (järjestusspetsiifiliselt). Paljudel juhtudel toimub see 1. protsessi replikatsiooni ajal. Geenide avaldumist valmistatakse ette juba replikatsiooni ajal.
2. Kromatiini struktuuri muutus. Histooni modifikatsiooni ensüümid. Histoonide kovalentne modifitseerimine. DNA peab muutuma histoonide suhtes liikuvaks. Histoonid hoiavad DNA muidu kõvasti kinni. H3 ja H4 tuleb atsetüleerida, et nad laseksid natukene lahti ja ei hoiaks DNA-d nii kõvasti kinni. 4. Muud aktivaatorivalgud. Aktiveeritud geeni kompleks. Kogu aktiveerimise käigus on geeni promootorpiirkond eksponeeritud. On moodustunud transkriptsiooniling. GTF – general transcription factor. 5. Transkriptsiooni pre-initsiatsiooni kompleks. Teised aktivaatorid. 6. RNA polümeraasi fosforüleerimine ja transkriptsioon. Transkriptsiooniling kromatiinis: valk STAB I indutseerib lingude teket immuunsüsteemi rakkudes. Gammageeni aktivatsioon, millega muutub kromatiidi struktuur. Transkriptsioonilingudes hakkavad toimuma kõik vajalikud protsessid. Transkriptsioonifaktorid (aktivaatorid) koosnevad kahest domäänist (moodulist). Üks domään seostub järjestusspetsiifilise DNA-ga, teine on selleks, et seostada kromatiidi kompleksiga või mõne muu aktivaatorvalguga (seotud struktuurimuutustega).
Pagaripärmi GAL1 geeni promootor ja aktivaatorala koos Gal sidumiskohaga. GAL1 geen võimaldab kasutada galaktoosi energiaallikana. Transkriptsioonifaktori (TF) aktivaatori sidumiskohti on palju. TF moodulid toimivad iseseisvalt. Gal IV on samuti üks galaktoosi sünteesi aktivaatorvalk. Test-geen on LacZ geen, millel on palju substraate. Geeni avaldumiseks on vaja TF seondumist. Transkriptsiooni võimendavad DNA elemendid, kui asuvad samal DNA molekulil. Võimendi võib asuda väga kaugel ja võimendavad transkriptsiooni kõigil neil geenidel, mis selles piirkonnas on ja sisaldavad vastavaid regulatsiooni elemente. Esineb järjestusspetsiifiline sidumiskoht. Vahendab võimendi ja RNA polümeraasi vahelist reaktsiooni. Hakkab sünteesima siis, kui mediaator seondub võimendiga (seotud aktivaatorvalkudega). Esineb LexA sidumiskoht, sidumisdomään ja Gal1 aktivatsioonidomään, mis seondub mediaatoriga. Esinevad veel kromatiini struktuuri muutust katalüüsivad ensüümid. Aktivaatorvalk on seotud DNA-ga järjestusspetsiifiliselt. DNA võib parasjagu nukleosoomis olla. Transkriptsiooni aktivaatorvalk on histoonide atsetüleerimise alguse signaaliks. Aktivaatorvalgu vaba aktivatsioonidomääniga seondub histooni atsetülaas. Histooni atsetülaas hakkab modifitseerima nukleosoomides asuvaid histoone (H3 ja H4). Histoonide atsetüleerimine muudab kromatiini struktuuri selliseks, et DNA võib liikuda histoonide suhtes. Kromatiini struktuurimuutuse kutsub esile kromatiini remodelleerimise kompleks, selleks on vaja histoone atsetüleerida, et kompleks seonduks.
Transkriptsioonifaktori moodulid toimuvad suhteliselt iseseisvalt, võivad vahetuda. Moodulite vahetamine aktivaatoris viib promootori spetsiifika muutusele. Domääne vahetades saab teha hübriidseid rakke. DNA transkriptsioonielemendid, mis võimendavad protsessi, asuvad samal DNA molekulil. Võimendavad geene, mis peavad avalduma. Võimendavad kõiki neid geene, mis selles regioonis on. Võimendi on aktivaatorvalkude sidumiskoht. RNA polümeraas hakkab sünteesima siis, kui mediaator seostub aktivaatoriga. Mediaator vahendab aktivaatori ja võimendi seostumist.
Kromatiini struktuuri muutus (remodelleerimine).
Osalevad katalüütilised ensüümid. Aktivaatorvalk on seotud DNA-ga järjestusspetsiifiliselt. Aktivaatori üks domään on DNA küljes ja teine on vaba, millega seostub histoonatsetülaas. Modifitseerib nukleosoomis asuvaid modifikatsioone. Aktivaatorvalk on modifikatsiooni alguspunkt selles piirkonnas. Histooni atsetüleerimine muudab kromatiini struktuuri selliseks, et DNA võib histoonide suhtes liikuda. Kui histoonid on atsetüleerimata, siis kromatiini remodelleerimiskompleks ei liigu. Kõigil on N- ja C-terminaalsed sabad. Kõige tähtsamad modifikatsioonid toimuvad H3 ja H4-ga. Erinevatel modifitseerimistel on erinev tähendus - saab atsetüleerida või metüleerida.
Histooni H3 kovalentsed modifikatsioonid omavad erinevat tähendust, Kui geene pole üldse modifitseeritud, siis tähendab see seda, et nad on välja lülitatud. Võimendi mõju tühistamine toimub insulaatori (tühisti) abil. Kui promootori ja võimendi vahel on insulaator, siis võimendit ei aktiveerita.
Histooni kood
Histooni modifikatsioonide tähendus. Kui on atsetüleeritud või modifitseeritud erinevad lüsiinid. Sellel on erinev tulemus. Toimub transkriptsiooni aktivatsioon/ kromatiini muutumine / replikatsioon / geenide väljalülitamine. Fosforüülimised toimuvad mitoosis ja meioosis. Võimendi toimib DNA peal nii kaua, kuni pole ühtegi insulaatorit, mis katkestab võimendi mõju. Võimendi aktiveerib promootoreid. Kui promootori ja võimendi vahel on insulaator, siis võimendi ei aktiveeri seda promooterit.
LCR või GCR – reguleerivad geeniklastreid
Hulk geene, mis asuvad lähedastes lookustes. Täiskasvanutel on globuliinid . Embrüo saab hapniku läbi platsenta (ema verest difundeerub).
globiini geenid. Nt lootel on oma globuliin , et O2 emalt paremini kätte saada. Muutuvad β-ahelad. LCR kontrollib selle geeniklastri avaldumist. Eriline tähtsus sigma globiinil.
― LCR ― epsilon ― gamma ―gamma ―sigma―β― lõpus insulaator.
LCR on piirkond, mis kontrollib kogu hemoglobiini geene (lookuse kontrollregioon). LCR on iseloomult võimendi.
Individuaalse arengu käigus on vaja sisse lülitada teistsugune hemoglobiini geen. Võimendi osatähtsus. embrüonaalne geen lülitatakse välja, mis toimub DNA modifikatsiooni läbi. Kui geeni enam ei vajata, siis tema promootor metüleeritakse – epigeneetiline kontrollmehhanism
DNA modifitseerimine
DNA järjestusspetsiifiline metüleerimine. Selle geeni promootor muutub aktiivseks. DNA modifitseerimine ei kipu ära lõppema mitoosi ajaks. Modifikatsioon antakse edasi – geeni IMPRINTING – pärilik modifikatsiooni muster. Ensüümid, mis seda teostavad, on emal/isal erinevad → toimub erinev modifitseerimine.
Hox – geenid reguleerivad embrüo lõigustumist
Konservatiivne koht-spetsiifiline rekombinatsioon . Kui aktivaator on DNA-ga seondunud, toimub histoonide atsetüleerimine (histooni atsetülaasi abil). Järgnevalt tekib kromatiini remodelleerimise kompleks. DNA-s vabaneb SPFi sidumispiirkond. SPF (TF) seondub promootori lähedusse ja aktiveerib otseselt transkriptsiooni – RNA polümeraas saab seonduda. Mediaatori vahendusel suunab transkriptsiooni aktivatsiooni.
Hox geen avaldub emas. SPF ei avaldu, kui esineb mutatsioon. ~ Kui nukleosoomi ei teki, ei vajata TF-eid.
Aktivaatorite kooperatiivne toime
Kõik geenid on mitme aktivaatori kontrolli all. Eukarüoodi transkriptsiooni regulatsioon seisneb peamiselt erinevate transkriptsioonifaktorite kombinatoorikas. Transkriptsioonifaktoreid (aktivaatorid/inhibiitorid) on palju. Faktori seostumisjärjestused ei pea olema lähedal ega järjest → peavad olema ühel DNA-l
Võimendi võib kombineeruda spetsiaalsete regulaatoritega (β-interferooni geen võimendiga). Võimendis võivad olla lisaelemendid – spetsiifiliste geenide aktiveerimiseks. Mida rohkem on transkriptsioonifaktoreid, seda rohkem geene. Erinevate elementidega seonduvad erinevad aktiivsusfaktorid. Võimendi ümbruses aktivaatorid on ≈ komplementaarsed promootorile seonduvate aktivaatoritega. Kui aktivaatorid sobivad omavahel, siis produktiivne transkriptsiooni kompleks. Kui aktivaatorid ei sobi, siis mitte produktiivne transkriptsiooni kompleks ja sünteesitakse ainult paar esimest nukleotiidi (poolik).
Hulkraksete eukarüootide geenide kombinatoorne regulatsioon
Iga geeni avaldumiseks on vaja mitut hulka erinevaid transkriptsioonifaktoreid. Neil peavad ka omad geenid olema. Vajalik transkriptsioonifaktorite õige kombinatsioon. Transkriptsioonifaktoritel peab olema kooperatiivne toime – kõik peavad samal ajal õiges kohas olema. Kasutatakse aktivatsioonikompleksi. Igale aktivaatorile kindel DNA järjestus. Aktivaatori kombinatoorika kaudu on väheste aktivaatoritega võimalik reguleerida rohkem geene
Eukarüootide repressorid
Repressorid töötavad erinevatel viisidel ja reguleerivad geene erineval moel. Ühed konkureerivad sama seostumiskohaga. Teine võimalus on inhibitsioon – mõlemad seostuvad, kuid repressor seostub aktivaatoriga (aktivatsioonidomääniga) nii, et mediaator ei saa enam seostuda. Prokarüoodis repressor asetus enne promootorpiirkonda. Eukarüoodis repressor seondub RNA polümeraasi seondumis- või aktivatsioonipiirkonnaga. Repressor seondub ka otseselt aktivaatori domääniga. Repressor seob otseselt mediaatorkompleksiga – blokeerib aktiveeriva toime. Repressor seondub ka histoonidele, kui ise toimetab, on histoonide deatsetülaas - histoonid seiskuvad – võetakse atsetüülrühmad ära.
Splassimine
Splassiosoom – eemaldab peamiselt introneid. Mõned intronid eemalduvad ise (auto-splicing). Splassiosoom koosneb ≈ 150 erinevast valgust, 5 erinevast RNA-st. Intron tavaliselt pärast eraldumist lagundatakse.
snRNPs - väikese tuuma ribonukleaarsed valgud
― 5’ ekson ― 5’ splice site (U1) ― A (U2) ― polüPy (U2AF) 3’ splice site ― 3’ ekson
IGS – intron guide sequence
Eukarüootide premRNA splaissimine
- osalevad U RNA (U rikas, 100-300 nukleotiidi pikad), paljud valgud (mitmed on SR valgud). SR valgud – seriini ja arginiini rikkad.
- splaissimine – intronite (geenid sisaldavad introneid – mittekodeerivad osad) eemaldamine RNA tasemel
- kõigis organismides on intronitel sarnased otsad
- toimub kõikides rakkudes
- intronil on 3 tähtsat osa: 2 otsa ja hargemiskoht.
- intronid on sagedasemad hulkraksetes eukarüootides
- harvem on intronid prokarüootidel ja viirustel. Pagaripärmi genoomis ≈ 200 intronit, millest 101 on valgusünteesi geenides
- hulkraksete intronid on reeglina palju pikemad (1500) kui eksonid (500)
- ühes geenis võib olla üle 50 introni
- intronid lõigatakse välja nukleotiidilise täpsusega, vastasel juhul läheb lugemisraam paigast ära.
- intronid on liikide vahel konserveerunud
- on üks pikk eellasRNA ja selle RNA tasemel lõigatakse isa välja
- kogu info introni väljalõikamise (splaissimise) kohta paikeb intronis endas. On oluline, kuidas intron levib.
- mõnel juhul vastavad intronid funktsionaalsetele domäänidele (Ig geenid)
- Ig-s on introni asukoht mittekorreleeruv valgu funktsionaalse rühmaga.
- geenis on kõik intronid ja eksonid olemas, nendega ei juhtu midagi.
Valkude funktsioonid seoses RNA-ga: RNA järjestuse äratundmine, RNA struktuursete ümberkorralduste katalüüs ; RNA helikaas (DEAD box valgud). Ei moodusta ringi ümber RNA ahela, liiguvad mööda RNA ahelat.
ATAC intronid – minoorsed intronid
T-d tavaliselt RNA-s pole, aga see on DNA järjestuse alusel. Erinevad GU…AG-st otsmiste nukleotiidide poolest. U1 asemel on U11. U6 RNA-ga on paardunud eriline U4 (atakk intronite spetsiifiline). ATAC-s on veel U12. 5% geenidest sisaldavad introneid. Need geenid on kõik sellised, mis osalevad regulatsioonis. Nende geenide produkte sünteesitakse vähe ja paljud on valgusünteesi aparaadi koostises. Osalevad DNA ja RNA, valkude metabolismis.
Intron - ekson struktuur
5’ ex 1 ― int 1 ― ex 2 ― int 2 ― ex 3 3’
- iga premRNA transkriptsoon algab ja lõpeb eksoniga, intronid on vahepeal.
- splassingu komponendid seotud Polümeraas II karboksüterminaalse domääniga
Erinevad RNA splaissimistüübid
- splaissosoomi (RNA + valk, katalüüsib intronite eemaldamist) suunatud splaissimine
- esimene reaktsioon toimub splassingukompleksiga. 5’ splaissingu saiti tekib cycl. Vaheühend, vabaneb 5’ eksoni 3’ ots, mis atakeerib 3’ splaissi, vabaneb intron, mis on seotud splassingu kompleksiga ja ekson.
- isesplaissuvaid introneid (ei vaja lisakomponente, kui siis Mg ja ühevalentseid katioone, ribosüümid) on 2 tüüpi:
1) Tüüp II – sarnane premRNA splaissimisele, kuid ei kasuta välispidiseid faktoreid
2) Tüüp I – erinevad teistest, kuna kasutavad G-nukleotiidi kofaktoreid. G-nukleotiidi 3’OH atakeerib 5’ splassingu saiti, G-nukleotiid seotud 5’ otsaga, tsüklilist vaheühendit ei teki.
- seda viivad läbi valgud, RNA ise ei osale
- pärmide tRNA geenides esineb splaissimine, RNA on seal substraadiks
Tüüp I ja II isesplaissuvad intronid lõikavad ennast välja preRNA-st, erinevalt mRNA intronitest ei pea nad olema tingimata mRNA-s. Pole oluline, mis polümeraas neid sünteesib – võib muu olla peale RNA polümeraas II. Lisaks on veel üks intronite liik – pärmi tRNA intronid. Erinevalt kõigist teistest pärmi tRNA geeni väljalõikamisel osalevad valgud.
Grupp 1 isesplaissuvad intronid:
- ühendab eksoneid
- avastati esmalt algloomadelt (Tetrahymeno termophila – ainuraksed siliaadid)
- sekundaarstruktuur on konserveernud
- moodustab ruumilise struktuuri
- kaksikahelad ühenduvad spetsiifiliselt
- IGS – sisemine guide järjestus, paardub introni 5’ otsaga
- võib seonduda suvaline G nukleotiid (guanosiin, GMP, GDP, GTP)
- G nukleotiid peab olema RNA 3’ otsas
- 3’ O on G nukleotiidi kofaktor, mis reageerib introni 1. nukleotiidi fosfaadiga ja samal ajal vabaneb eksoni 3’ ots (eksoni viimane nukleotiid). 3’ otsa ekson muutub reaktiivseks ja reageerib introni 3’ otsaga – tekib tsirkulaarne RNA
- introni 5’ otsas G nukleotiid, mis seondub G nukleotiidi sidumistaskusse.
- intron katalüüsib edasi iseenda vabanemist ja lühikese RNA sünteesi
GU…AG intronid
- U1 RNA tunneb introni 5’ otsa ära.
- U2 RNA tunneb ära hargnemiskoha järjestused
- U5 RNA tunneb introni 3’ otsa ära.
- kõige sagedasemad intronid, bakterites neid pole.
- kaks esimest nukleotiidi on GU ja viimast AG.
- 5’ → 3’ ots. Hargnemiskoht A.
- A nukleotiidi 2’O atakeerib introni 5’ otsa → lasso (tsükliline struktuur). 5’ eksoni otsa tekib vaba 3’ O. Intron vabaneb ja eksonid ühendatakse.
- 5’ splassingu saidis algab GU, mis lõpeb nukleotiidiga AG, ka ekson lõpeb AG-ga
- G on on seega nii alguses kui lõpus.
- eukarüootides on 2 sorti introneid: GU…AG ja atakk-intronid.
- väljalõikamise skeem sama. 5’ introni ots algab GU-ga, siis tuleb kindel järjestus. Selle tagumises osas on A nukleotiid, mille 2’O on tähtis reaktsioonrühm. Intronis edasi minnes tuleb hargnemiskoht, millele järgnev järjestus lõpeb AG-ga. Seal on olulised järjestuselemendid, mis on vajalikud introni väljalõikamiseks. Eksoni 3’ ots 5’ otsa juurde, ligeerimine, intron eraldub.
- splaissimisel osalevad RNA-d U1, U2, U4, U5, U6. Need on GU…AG intronitega seotud RNA-d
- splaissosoomi moodustavad U2, U4, U5, U6
- splaissingu reaktsiooni alguses U1 RNA seondub 5’ splassingu saidiga ning seonduvad introni 3’ piirkonda (U2AF, BBP). Asuvad hargnemiskoha ja 3’ splaiss-saidi vahel.
- valgud: 1. U2AF – U2 aktakeeriv faktor 2. BBP – splaissimise koha määraja, E;
- kui nad on seondunud, siis moodustub E1 kompleks, seal on U RNA-d
- U2 RNA on seal valkkompleksina, U2 RNA seondub hargnemiskohaga, paardub sellega. Hargnemiskohta äratundev valk lahkub. Siis seonduvad U4, U6, mis viivad E2 kompleksi tekkimiseni
- U1 ja U2 RNA on kompleksis ülejäänud splaissimises olevate RNA-dega.
- 5’ eksoni 3’ ots tuuakse hargnemiskoha lähedusse. Selle tulemusel U1 RNA lahkub. Hüdrolüüsitakse ATP, kui U4, U5 ja U6 seonduvad introniga, siis U4 paardub U2-ga. Kaheahelaline DNA, toimub konformatsiooniline muutus. U4-U2 paardumine seondub U6-U2 paardumisega. RNA konformatsioonilsed muutused.
- geenil on ≈ 1200 eksonit, osa neist on paljudes kordustes.
- U3 ei ole snRNA vaid snoRNA.
Splaissimisreaktsiooni keemiline aspekt
Hargnemiskoha A ja tema 2’O. Introni G 5’ ots (fosfaat) + A 2’ O ots→ ümberesterifitseerimine – tsüklilise introni struktuur, tekib uus fosfodiesterside. Kuigi on 3’ → 5’ fosfodiesterside, siis nüüd on 2’→5’ . Selleks, et reaktsioon saaks toimuda, peavad need kohad sattuma üksteisele lähedale. Hiljem peavad 5’ ja 3’ splaisserid kokku sattuma. Kui kuskil jääb nukleotiid lisaks, läheb lugemisraam paigast ära. Splaissosoom koosneb rohkem kui 150-st valgust ja RNA-st. RNA-d on vähe, aga olemasolu tähtis. Kõik väikesed snRNA-d komplekseeruvad valkudeta, moodustavad U-d. 5’ splaissimissaidi järjestus on kindel – koosneb ca 6-st nukleotiidist. Hargnemiskohas on oma konsensusjärjestus.
Poly Py (polüpürimidiin-track)– U-C rikas järjestus, see on hargnemiskoha ja 3’ splaissimiskoha vahel. Koosneb paljudest pürimidiinidest. ehk järjestuselemendid, mis tuleb ära tunda. U1 RNA (tunneb ära) paardub 5’ splaisssaidiga. Poly Py järjestusega seostub valk U2AF (U2 aktiveeriv valk). Hargnemiskoha järjestusega seostub valk BBP – branch binding protein. Valgu ja RNA äratundmine – valgud tunnevad ära kindlaid struktuurielemente. Varane kompleks ehk e-kompleks. U2 RNA paardub hargnemiskoha konsensusjärjestusega - üheselt määratud 6-nukleotiidiline + A, mid jääb üle ja ei paardu - kõikidel intronitel sama. Nii tekib A-kompleks– seal toimub ATP hüdrolüüs. Oluline A ei paardu ja on völja lükatud (veidi kõrgendatud) ja 2’O on lükatud välja aktiivtsentrisse. Kui U2 ja A on seotud (+ nendega seotud valgud), siis hakkab toimuma intronis ruumiline ümberkorraldus, mida katalüüsib U4, U5, U6 RNA-st ja nendega seotud valkudest. Seda kutsutakse splaissosoomiks ja moodustavad ümmargusi struktuure. Splaissosoom katalüüsib preRNA-s muutusi. 5’ ja hargnemiskoht satuvad lähedale. Introni 5’ otsaga paardub hoopis U6 RNA, kui U1 RNA on lahkunud. Seejärel kogu introni ruumiline struktuur reageerib 5’ splaisssaidiga. Tekib A-kompleks, kus toimub ATP hüdrolüüs. Nad on kokku kägardunud, sellele järgneb eksonite ühinemine.
RNA-RNA äratundmine splaissimise käigus
U1 RNA e-kompleksi tekkimise käigus paardub introni 5’ otsaga. [Kui U6 RNA paardub introni 5’ otsaga, tekib P-kompleks ]. U1 RNA vabaneb. Hargnemiskoha RNA-ga paardub U2 RNA. U2 RNA moodustab kompleksi U6 RNA-ga. sellega kaasneb 2’ O ja 5’ otsa (splaissingu reaktsioon) kokkusaamine. Osalevad ka valgud. U6 on paardunud U4-ga, aga kuna toimub muutus DNA-s → ümberesterifitseerimine.
Grupp I intronid
- iseennast splaissivad intronid. Autokatalüütilised, aga töötavad vaid ühe korra.
- kindel ensümaatiline struktuur, palju konserveerunud järjestusi
- IGS paardub 5’ splaissingu saidiga (eksoni osa)
- G nukleotiidi seondumine IGS.ga
- nukleotiidi (G) 3’ OH muutub aktiivseks ja seondub 5’ splassingu saidiga, intron eraldub
- splassingut katalüüsib RNA ise
Splaissimine võib toimuda ka valgu tasemel
Nt esineb liblikõieliste taimede lektiinides üks valkude rühm. Seal asuvad tsirkulaarsed peenstruktuurid. Algul sünteesitud valk moodustab tsüklilise peptiidi ja viskab välja teatud osa.
Permutatisoonid – valgud on mingis osas homoloogsed. Homoloogsetel valkudel võib algus ja lõpp eri kohtades olla, kui nad lähevad rõngasse, siis kattuvad. Valk, kui tekib alguses, siis esineb tsükliline peptiid, hiljem viskab teatud osa välja.
Enamik splassingut toimub siiski RNA tasemel
RNA toimetamine ehk RNA editing
RNA toimetamine – RNA järjestuse muutumine pärast transkriptsiooni. Geneetiline info muutub (posttransduktsiooniline toimetamine. Võetakse ära üksikud nukleotiidid, lisatakse juurde või asendatakse. RNA on laialt levinud parasiitidel. Esineb ka taime mitokondrites ja inimestel põhiliselt närvisüsteemis avalduvatel geenidel. Üks on järjestus, aga valku jõuab hoopis teistsugune järjestus. RNA toimetamine mõjutab valgu järjestust (mRNA translatsiooni), premRNA splaissimist, RNA eluiga, RNA struktuuri, viiruste puhul ka replikatsiooni. DNA ja RNA muutuvad erinevaks. Nukleotiid asendatakse teiste nukleotiididega. Avastati taimede mitokondrites ja trüpanosoomides (haigustekitajad). See on omane ka imetajatele (esineb palju). mRNa post-transriptsiooni modifikatsioonid – RNA toimetamine
Levinum toimetamine: A → I (adeniin deamineeritakse inosiiniks) ja C→ U. I-s on 3 vesiniksidet. I hakkab C-ga paarduma, nukleotiidi tähendus on muutunud. See on oluline premRNA splaissimisel, RNA replikatsioonil, RNA degradatsiooni seisukohast.
gRNA (guide RNA) esineb kohas, kus kindlas kohas splaissitakse. Selle alusel muudetakse sihtmärk RNA järjestust.
RNA toimetamine ja viirusvastuse seos! RNA järjestust muutvad ensüümid seonduvad viiruse RNA-ga. Viirus võtab RNA järjest enam muutva ensüümi ja see tekitab viiruses mutatsiooni. Pärast 3-4 replitseerumist ei suuda viirus toota ühtegi funktsionaalset valku. Viiruste vastu võitlemine. HIV-il on mehhanism, mis kaitseb selle mehhanismi eest.
Imetajates on 3 tüüpi toimetamist:
1) U nukleotiidi lisamine (gRNA vahendusel) RNA transkriptil. U nukleotiidid pannakse sinna toimetamise käigus (muidu neid ei ole RNA koosseisus). Toimetamine esineb väga vähestes geenides. Igasugune RNA toimetamne toimub väikeste RNA-de vahendusel, mida nimetatakse gRNA-ks. G – guide. Kodeeritud need nukleotiidid, mis sinna tuleb lisada või need, mis tuleb asendada. gRNaas on mRNA-ga komplementaarne järjestus, kus on kodeeritud puuduvad nukleotiidid. Kodeeritud on need nukleotiidid, mis tuleb asendada. gRNA-l on oma ankurboks – UGGA järjestus - selline järjestus, mille koha pealt toimetamine lõpeb (toimetamise lõpusignaal). Ankru ees asub toimetamise piirkond. Märklaud RNA lõigatakse katki, sinna vahele pannakse gRNA järjestuses määratud nukleotiidid.
Ankurboks – selline järjestus, mille koha peal tometamine lõpeb ehk lõppsigaal. Selle ankru ees toimub toimetamine. Ahel tehakse katki, sinna vahele pannakse nukleotiid gRNA abil. Nii saab toimetatud RNA valmis.
Adenosiini deaminaas (ADAR) – Toimub U-de lisamine ja C-de muutmine. Osaleb RNA vaigistamisel. Kui eukarüooti jõuab RNA viirus, siis ADAR paljudel juhtudel muudab viiruse RNA-s A → I-ks. Rakus esinevad sellised ensüümid, mis lagundavad RNA-d, kui sisaldab I-d. Viiruste RNA-d ei ole õiged ja sellepärast antakse signaal nende RNA-de lagundamiseks. ADAR konkureerib teiste RNA ensüümidega.
2) teatud nukleotiidi eemaldamine
3) nukleotiidi asendus
RNA editing: võib muuta – splassimist, RNA lagundamist, RNA replikatsiooni.
Oluline – kaitse RNA viiruste eest! ( imetaja ensüümid tunnevad ära)
Adenosiini deaminaas (ADAR)
Peale mRNA järjestuse muutmist, muudetakse ka muud. ADAR katalüüsib A → I (aminorühma asemel tuleb OH-rühm). Tehakse RNA koosseisus, mitte vaba nukleotiidi tasemel. ADAR takistab korduvate elementide (junk-DNA) avaldumist. ADAR konkureerib teiste RNA ensüümidega. ADAR-i deamineerimine konkureerib teiste rakuliste protsessidega. Oleneb, kumb jõuab enne, kas ADAR või splassingu masinavärk.
mRNA (cargo) transport eksportiini abil
RNA sünteesitakse rakutuumas, tsütoplasmas või tuumakeses. Vaja läheb neid enamasti tsütoplasmas, aga selleks peavad nad jõudma tuumast tsütoplasmasse. See protsess on kontrollitud ja reguleeritud. Tuum ei taha lasta läbi tugevasti laetud suuri molekule nagu RNA. Tuumapoorid lasevad läbi väga väikeseid molekule, RNA ei pääse läbi. Sünteesi käigus RNA märgitakse ära – mRNA 5’ otsa sünteesitakse m7G cap (7ndas positsioonis metüleeritud G cap ja 3’ otsa sünteesitakse PolyA saba). Need signaalid on mRNA äramärkivaks signaaliks. Teatud märgistatud RNA tuleb suunata tsütoplasmasse. RNA sünteesi käigus seonduvad RNA polümeraas II-ga sellised valgud, mis kuuluvad eksportiinide hulka. RNA domääniga seostuvad valgud, mis kuuluvad eksportiini hulka. Eksportiine on palju erinevaid. mRNA moodustab eksportiinidega kompleksi, mis seostub tuumapoorile. ATPaasist sõltuvalt läheb kompleks läbi tuumapoori. Sellest läbimineku käigus tsütoplasma poolel osa valkudest vabaneb. Koos RNA-ga on eksportiinidel eksponeeritud ekspordisignaalid. Kui lähevad tsütoplasmasse ja vabanevad, siis vabanevad importiinisignaalid. Eksportiinid muutuvad importiinideks. Impordivad tuuma valke, millel pole NLS signaali. Nii satuvad valgud tuuma tagasi. Igal RNA tüübil omad eksportiinid ja oma eksporttee. Tuumapoorid on erinevad. Kõik valgud ei vabane. mRNA 3’ ots polüA-ga seotud PAB-ga (initsiatsioonifaktor, polyA binding protein). 5’ otsas on cap.
Ran GTPaas – asub tuuma poorides, sellega seonduvad poori läbivad lihtsalt valgud või valk (+ transporditav kompleks).
tuumast välja – tuuma eksport eksportiinidega (neid on palju, nt eksportiin 5 vastutab enamiku RNA transpordi eest).
cargo – ülekantav üksus. Tsütoplasmas läheb (m)RNA kasutusse. Valgud, millega koos RNA läbi poori tuli (= eksportiinid), vabanevad ja nad lähevad tuuma tagasi (selleks vastav impordi järjestus). Tuum poorist läbi, BGTP hüdrolüüsi abil.
Nonsense Medicated Decay (NMD)
geneetiline mehhanism, mis viib vigaste RNA-de lagundamisele. RNA kvaliteedi kontrolli mehhanism. Tuleb välja uurida, kas polümeer on hea või halb, läheb vaja või mitte. Paljudes rakkudes on see koht-spetsiifiline protsess. Uued geenid tekivad tihti pimesi nt. Ig kokkupanek. Ig variaalsed osad on N-otsas. Mutatsioonid toimuvad valgu alguses. Lähevad valesse raami/ stoppkoodon. Iga B- lümfotsüüt sünteesib ainult ühte – üks on aktiivne. Rakk on kasutu, kui sünteesib valet. Kasulik mehhanism, mis aitab vale RNA ära tunda. Lõpetab RNA sünteesi enne, kui saab rakule saatuslikuks – B-lümfotsüütide kloonid, mis ei tooda Ig-d, elimineeritakse. See on lümfotsüütide seisukohast elupäästmise mehhanism. Vaja lõpetada vale mRNA süntees enne, kui see saab rakule saatuslikuks. Kui rakutuumas RNA polümeraas 2 transkribeerib geeni ja kõik muu, millega peab siduma, suunatakse splaissimist ja transportimist. Kui ribosoom transkribeerib, jõutakse valguni. Kui jõutakse stoppkoodonini, lõigatakse need valgud mRNA küljest maha, mis veel jäid. Valgud lükatakse maha, mis veel jäid. 1 osa neist on UPF-valgud, mis aitavad läbi viia mRNA kvaliteedi kontrolli. UPF valgud seostuvad ekson-intron ühendustesse. Kui stoppkoodon on enne viimast ekson-intron ühendust, siis jäävad mõned UPF-valkudest mRNA-ga seotuks. Kui jääb seotuks, siis valk suunab RNA degradatsiooni – RNA lagundatakse. 1. asi on 5’ otsa lagundamine, võetakse ära cap-modifikatsioon (m7G nukleotiid) ja sellega kaotab oma identiteedi, keegi ei tunne teda enam ära. mRNA, milles on stoppkoodon enne kui viimases eksonis (st viimase eksoni ees), see lagundatakse, st stop ei tohi olla enne viimast eksonit. Stop peab olema vähemalt 50 nukleotiidi eelviimasest eksonist, siis lagundatakse. Kui sünteesitud valk ei moodusta õiget ruumilist struktuuri, siis mRNA lagundatakse.
Geneetiline kontroll eksisteerib igal pool: replikatsioonil, transkriptsioonil, translatsioonil. RNA-sid ja valke kontrollitakse. Kui valgud ei võta ruumilist struktuuri, siis võib see olla signaaliks, et toimuks NMD. Antakse signaale edasi, kuni jõuavad tuuma, nii et lõpuks lülitatakse see geen välja.
Kuidas selekteerida funktsionaalseid molekule in vitro?
RNA, SELEX, kaheahelaline, transkriptsioon, selektsioon. Uuesti DNA süntees, dsDNA kloneerida ja järjestada, rikastada RNA-s. Protsessi korrigeerides saab ka ensüüme teha, ensümaatilisi RNA-sid.
Ubf – upstream binding factor – on splassingu faktorid, ei lahku splassitud valgu küljest (SRP valgud lahkuvad). Sidumispiirkond on splassingu saidist 50 nukleotiidi ülesvoolu.
Kui premRNA transport läbi tuumamembraani, siis translatsiooni käigus Ubf valgud eemaldatakse. Kui normaalne translatsioon, siis eemaldatakse kõik Ubf valgud, mRNA puhastatakse. Kui stoppkoodon on enne viimast splassingu saiti, siis osa Ubf jääb mRNA- ga seotuks. RNA-l võetakse 5’ cap maha, algab RNA lagundamine. 5’ kaitseb lagundamise eest, lagundamine algab 5’ otsast.
Enneaegne stoppkoodon – mRNA lagundamine, splaissimise inhibeerimine st vastavat RNA-d enam ei teki. Kui Ubf valke lahti ei võeta, siis jäävad need tsütoplasmasse ja ei osale uutes splassingutes.
Kui mRNA-l stoppkoodon puudub, siis see mRNA lagundatakse. Arvatakse, et tuumades puudub translatsioon.
RNA protsessimine
nt splassimine, lõikamine
rRNA protsessimine
- prokarüootides rRNA iga modifikatsioonide jaoks on oma ensüüm
- eukarüootides on rRNAd-es palju modifikatsioone. 2’OH metüleerimine (DNA-s pole 2’OH RNA-s on). Sage pseudouridüleerimine (uridiinist teakse pseudouridiin). Ühe ribosoomi peale ≈ säärast modifkatisooni.
- modifikatsioonid stabiliseerivad RNA struktuuri ja metüleerimine muudab Rnaaside resistentseks.
- gRNA ei osale siin toimetamises, vaid snoRNA-dena (väikese tuumakese RNA). Nt U3 RNA (see puudub splaissosoomis). U3 suunab RNA lühemakslõikamist. Lõigatakse välja 18S, 5,8 S jupid RNA-st.
- modifikatsioonid viiakse sisse tuumakeses
- rRNA-sid sünteesib RNA polümeraas I, sünteesi toimumisel tekib selle ümber tuumake (seal hDNA randeemsed kordused). Enne rRNA eraldumist toimub palju modifikatsioone.
- snoRNA-sid on kahte tüüpi: box C, D RNA ja box H RNA – need on kindlad RNA-s olevad järjestuselemendid. Box D = CUGA.
- Box C – box D vahel on rRNA-ga komplementaarne piirkond (12-20 nukleotiidi pikk).
- Box D kohe vahetult pärast komplementaarset piirkonda → määrab metüleerimiskohad
- Pseudouridineerimist ei saa teha kaheahelalises. Lämmastikalus keeratakse metüleerimiseks ahelast välja.
- Kahe komplementaarse piirkonna vahel on Cl, mis piiratakse teatud ensüümi abil ringi.
- snoRNA-d on kodeeritud intronites. Metüleerimist ja pseudouridineerimist tagavad RNA-d on premRNA intronites (mitte igasugustes geeni intronites)
- on TOP geenide intronites (terminal oligopyrimidin track). Need geenid avalduvad kõigis jagunevates rakkudes (ribosoomide, transport jne geenid, põhiainevahetuse geenid). Need geenid on paljudes rakkudes avaldunud, hea intronitesse snoRNA geene panna. St kui rakk jaguneb saadakse rRNA intronites protsessimise teel. Kui rakk ei jagune, siis neid pole, ribosoome ei lähe peaaegu vaja.
- tuumakeses on elektronmikroskoobiga nähtavad täpid – cayal kehakesed. Neisse kogunevad snoRNA-d, seal toimub RNA modifitseerimine.
Post-transkriptsiooniline geeniregulatsioon eukarüootides:
alternatiivne splaissimine – isemoodi juurdelõikus. Sellega saavutatakse suur geeniproduktide hulk (suurem kui geenide hulk). Eriti närvirakkudes on palju erinevaid splaissimise variante. algul 3 eksonit, 2 intronit, 1 premRNA – sellelt 5 erinevat spliced mRNA-d. 5 erinevat varianti ühendamiseks. Intronid on võrdlemisi pikad ja splaissimise äratundmiskohad üsna lühikesed, seetõttu selliseid järjestusi, mis sobivad, on olemas küll. Mõni intron võib osutuda natukene pikemaks mõnes kohas, sest lõigatud on erinevas kohas. Posttranslatsiooniline geeniregulatsioon eukarüootides – alternatiivne splaissimine
valgugeenide arv ei ole otseses sõltuvuses organismi keerukusest
sireussil (C. elegans) on 20 060 geeni
inimesel (H. sapiens) on 21 888 geeni
Alternatiivne splaissimine äädikakärbse soomääramise geenidel.
Sugu on määratud mitte ainult sugukromosoomidega, vaid autosoomsete kromosoomidega. Sugukromosoomide suhe autosoomidesse. Sugu määratakse geenidoosiga. Isase äädikakärbse puhul (X ja A suhe) 0,5 ja emase puhul 1. Isaste puhul splaissimist ei reguleerita. RNA-ga seostuv valk, mis reguleerib teiste geenide splaissimist. Splaissitakse välja intron 1 ja 2, eksonid 1, 2 ja 3 ühendatakse ning tulemuseks on mittefunktsionaalne valk, sest eksonis 2. on stoppkoodon. Emastel esinevad säärased regulaatorid , isastel mitte. Ühendatakse eksonid 1 ja 3 ja sünteesitakse selline RNA seostuv valk, mis seostub järgmise geeni premRNA-ga ja hakkab seal splaissimist reguleerima. Kodeerib krüptilist splaisssaiti nii, et emastel lõigatakse välja suurem intron kui isastel. Tulemuseks on mittefunktsionaalne valk isastel ja emased saavad juba järgmis Tra-valgu. Tra-valk seostub teistmoodi kui sex lethal. Seostub ja blokeerib introni väljalõikamise kohapealt, lõigatakse rohkem välja. Tra valk – valk, mis aktiveerib splaissimist. Suurendab ühe splaisssaidi kasutamist sellega, et sinna seondub. Seondub ekson 2-ga ja tekib 5’ esimene ekson. Sama on nii emastel kui isastel äädikakärbestel. Erinevus: erinevad eksonid seotakse erinevatega. Eksoniga seonduv valk suunab splaisssaidi kasutamise sagedust. Kutsutakse ekson enchancer, mis on eksoni võimendi. Seostub eksoniga ja stimuleerib 3’ splaisssaidi kasutamist. Kui seda ei ole, siis splaissimist ei toimu. Võimendi suunab mingi kindla splaissimise kasutamist. Teistel juhtudel toimub splaiss-saidi blokeerimine, teisel juhul aktiveerimine. Selle tulemusena tekib double-sex valgul isastel 400 AH hulk ja 150 isasspetsiifilist AH ja emastel 30 spetsiifilist AH. Tulemuseks saadakse transkriptsiooni repressor. Valk represseerib emasspetsiifiliste geenide avaldumisr. Põhimõtteliselt sama valk, aga ühesuguste geenide avaldumise või teistsuguste geenide avaldumine, Transkriptsiooni repressor, mis seostub isaspetsiifiliste või emasspetsiifiliste geenidega. Alternatiivse splaissimise negatiivne ja positiivne kontroll – repressor seostub ja reguleerib. Eksoniga seotud splaissimise võimendi. Kui võimendi puudub, siis splaissimist ei toimu.
Ühe geeni erinevad geeniproduktid:
primaarse transkripti splaissimine:
1) kanooniline splaissimine – 2 intronit (kõik) eemaldatud , eksonid ühendatud
2) 2 intronit eemaldatud, ekson 2. eemaldatud, 1. ja 3. ekson ühendatud
3) krüptilised splaisssaidid – pole ideaalsed splaisssaidid, tekib mõnevõrra pikem ekson, (ühes intronis mitu 5’ splaisssaiti, 3’ splaisssaiti).
4) intron jäi väljasplaissimata
5) 1. ja 2. ekson ühendatud ja 1. ja 3. ekson ühendatud
Kui kanooniline splaisssait on blokeeritud (varjestatud), siis läheb krüptiline splaisssait käiku.
cis järjestused – samal molekulil, mida reguleeritakse
trans faktorid – valgud
Putukatel saab järglaste sugu reguleerida.
geen sex-lethal – avaldub geenivariant, mis jätab ühest soost embrüod alles.
Kui splaissimine on reguleerimata – tavaline mRNA.
Emastele seondub repressor – eksonid 1 + 3 ja 1. introni 3’ otsaga ühendatakse. Sünteesitakse erinev valk. Eelmise produkt (mRNA-lt valk) blokeerib järgmise splaissimise.
Kui 1. + 2. + 3. ekson ühendatakse – tekib valk, mis pole funktsionaalne.
Splaissimise valgulised regulaatorid:
takistavad splaisssaiti – intronitega - negatiivne
võimendavad splaisssaiti – eksonitega – positiivne
fibronektiin – toodavad fibroplastid. Kui tekib haav, veri hüübib (fibronektiin soodustab klompide teket). Oluline kaitsevalk. Avaldub maksarakkudes ja fibroplastides – geen mõlemas sama, aga valk erinev.
Fibroplastides on palju eksoneid ja AH järjestusi, maksarakkudes vähem.
Fibronektiini geen – valk, mis ekspresseerub vererakkudes ja maksarakkudes. Erinev funktsioon. Oluline põletuste ja traumade korral. Kaitsevalk, kaitseb vigastatud rakke ja kudesid. Selle geen koosneb tohutu paljudest eksonitest, kuid kõiki neid eksoneid ei kasutata. Osa eksoneid ühendatakse omavahel, saadakse fibroblastidest välja, toodetakse mRNA, millel on kindlad eksonid alles. Maksarakkudes on need eksonid juba eemaldatud. Nii saadakse sama geeni pealt 2 erinevat produkti.
Puuviljakärbse geeni DSCAM splaissimine – valgetest kõik käiku, 1 punane, 1 roheline ja 1 sinine. Valikuliselt jäetakse midagi alles ja millestki loobutakse. Sedasi saadakse ühelt geenilt väga palju valke.
Alternatiivne splaissimine sisekõrva harjasrakkude slo mRNA puhul –
Saame korraga kuulda erinevaid signaale (ühest geenist saab erinevaid valke)
Teos on harjasrakud, mis apikaalses osas on pika ahelaga ja basaalses osas lühikese ahelaga. Harjakesed hakkavad võnkuma, kui õhuvõnge jõuab kõrva. Erineva pikkusega hari eri võnke puhul läheb resonantsi, annab edasi signaali. Iga rakuke annab ainult 1 positiivse signaali. Neid rakke on palju ja nad katavad resonantsi 50 – 500000 Hz. Kuna iga sageduse registreerib erinev rakk, siis on kuulmisaparaat eriti tundlik ja suure lahutusvõimega. Kõikidel harjasrakkudel on samad geenid. Slo-geenil on väga palju alternatiivse splaissimise variante.

DNA replikatsioon

1953. Watson ja Crick – DNA struktuur
- substraat – desoksüribonukleosiidtrifosfaadid (dNTP), vanem DNA.
- süntees toimub ainult praimer i ja matriitsi olemasolul. Vaja on ka lisaks vaba 3’ otsa, sinna lisatakse juurde (RNA sünteesi puhul polnud vaja!)
- sünteesitakse alati juba olemasoleva DNA külge (st praimeri). Matriitsahel – selle järgi toimub kirjutamine. - süntees toimub 5’→3’ suuunas (nukleotiidid lisatakse 3’ otsa). Kõigi nukleiinhapete sünteesi suund.
- reaktsioon võib toimuda mõlemas suunas
- sünteesi käigus lahkub pürofosfaat (PPi). Hüdrolüüsitakse kohe, PPi tase rakkudes on madal – muudab reaktsiooni pöördumatuks.
- uue nukleotiidi otsimine toimub nagu RNA ja valgusünteesi puhul. Kõik võimalikud nukleotiidid põrkuvad ensüümidega, see tunneb ära nukleotiidi, mis on maatritsiga komplementaarne. On rohkem nukleotiide, kui 4, mida DNA ahelasse lülitada, aga on oluline, et tekkiva aluspaari geomeetria oleks õige.
- H-sidemed on matriitsi ja uue ahela vahel.
Watson-Crick paari sümmeetria:
- alati ühesugune.
- H-sidemete teke vajalik
- Metalliioone vajatakse
- Esimene metalliioon on seotud vesiniku eemaldamisega. Teine metalliioon koordineerib kahe hapniku sideme moodustamist.
Lys ja Arg – positiivselt laetud aminohapped.
DNA polümeraas
- sõrmede piirkond seondub üheahelalise DNA matriitsahelaga, millele sünteesitakse vastasahel.
- korraga seondub aktiivtsentrisse ainult üks nukleotiid.
- DNA-sse ei tohi sattuda ribonukleotiid. RNA-sse võib mõni desoksüribonukleotiid sattuda.
- dNTP (desokspnukleosiidtrifosfaat) – palju erinevaid konformatsioone. rNTP – jäigem konformatsioon, tugev mõju naabernukleotiidile. DNA-sse ei tohi sattuda.
- kahevalentsed metallid regleerivad Pi-rühma hapnikuga (Mg2+), kui seondub, siis hapnik kaotab laengu ja stabiliseerib.
- kui aluspaar on moodustunud, siis sulgub ensüümi aktiivtsenter.
- aktiveeritakse 3’O, tekib oksoaniooni (O-), see on Mg2+-ga koordinatiivse sidemega seotud (st ei reageeri omavahel). β ja gamma Pi tunnevad ära Lys ja Arg (elektrostaatiline interaktsioon).
- türosiin aitab lämmastikalust õiges kohas hoida. Tyr sulgeb ensüümi aktiivtsentri. Pi on uue nukleotiidi α-Pi, see reageerib eelmise nukleotiidi oksoaniooniga: R-O- + Pi-R. Lahkuv rühm on PPi, see ei lahku kohe, vaid siis, kui toimub ensüümi translokatsioon st aktiivstsenter moodustab järgmise nukleotiidi 3’OH ümber, et uus nukleotiid saaks liituda. Liikumine DNA valmival ahelal. Oluline! Translokatsiooni energiat uuritakse alles.
- On 1-4 ahelalist DNA-d, peamine on kaheahelaline DNA. DNA-d saab mitmel viisil replitseerida. PCR – polümeraasi ahelreaktsioon. Seda saad replitseerida, et üks uus ahel + üks vana ahel – poolkonservatiivne. Üks uus ahel + üks uus ahel või vana + vana – konservatiivne. Uue ja vana ahela mosaiik – dispersne.
Vigade parandused:
- kompab ja kontrollib DNA sümmeetriat. Kui tekib vale paardumine, siis DNA väikeses vaos toimub geomeetria muutus. Võetakse ära viimane või isegi rohkem nukleotiide – kuni tekib väikse geomeetriaga vagu.
Geneetiline veerulugemine.
- Toimub poolkonservatiivne. DNA replikatsioon on rakule elulise tähtsusega. Täpselt reguleeritud ja kontrollitud. On replikatsiooniühikud nagu transkriptsiooniühikud (geen, osa geeni). Replikatsiooni ühik – algab ja lõpeb kindlas DNA punktis. Plasmiididel on replikatsiooni alguspunkt ehk koht, kus algab replikatsioon.
- Replikatsioon on ühe- või kahesuunaline. Enamik replikatsioone on kahesuunalised. Et replikatsioon toimub kahesuunaliselt, tõestati radioaktiivset dNTP-d kasutades. Replikatsiooni kiirus on 500 – 1000 nukleotiidi sekundis (max kiirus, sellega toimuks replikatsioon ca 40 minutiga, aga tavaliselt läheb umbes tund). Kui ühes DNA piirkonnas on radioaktiivne nukleotiid, siis ühesuunaline replikatsioon. Kui kahes DNA piirkonnas on radioktiivne nukleotiid, siis kahesuunaline.
Tähtsamad valgud:
1. DNA helikaas – heksameerne, 6-st valgust ensüüm (ring). DNA ahelate lahutamine, et DNA polümeraasil oleks üheahelaline DNA. Kasutab ATP energiat ja seondub ühe ahela ümber, ATP hüdrolüüs lahutab ahelad. Aktiveerib DNA primaasi.
2) SSBs – üheahelalise DNA-ga seostuvad valgud, kaitsevad lahtist DNA-d, et muu sinna ei seostuks ja et seda ära ei Dnaasitaks. Seondub kohe üheahelalise DNA-ga ja ei lase ahelatel kokku minna.
3) Topoisomeraasid – kompenseerivad DNA topoloogilisi pingeid, „vedru“ pingest vabaks. Eemaldab supervindid.
4) DNA primaas – ensüüm, mis sünteesib DNA replikatsiooni praimereid, DNA sünteesil on selleks RNA (esineb RNA praimer). DNA primaas toodab RNA praimerei DNA jaoks. Ajab SSBs-id ära ja sünteesib RNA praimeri replikatsiooni alguspunkti. Liitub üheahelalisele DNA-le. Sinna peab pärast DNA polümeraas II holoensüüm seonduma. Tekib nii peaaegu valmis kompleks, mis on valmis DNA-d sünteesima. Peavad veel lisanduma sliding DNA clamp (libisev klamber ), mis võtab DNA ringi sisse ja moodustab DNA ringi.
5) DNA polümeraasid – DNA sünteesi läbiviiv ensüüm. Sünteesib 5’→ 3’ suunas uue DNA st polümeraas liigub vanal ahelal 5’ →3’ suunas (nukleiinhapete süntees). Uus ahel (süntees matriitsilt) valmib siis 3’ →5’ suunas, sest uus komplementaarne ahel on alati vastassuunaline.
6) sliding DNA clamp – (libisev klamber) - DNA polümeraasi osa, et sünteesida DNA lõpuni, et ei tekiks poolikuid DNA juppe. Asub DNA polümeraasi taga, on 2 subühikut, ring ümber vastsünteesitud DNA kaksikheeliksi. Paneb β-subühikud peale.
7) Rnaas – replikatsiooni komponent , see lagundab RNA praimeri, et selle asmele ka DNA sünteesida. Lõhub RNA-DNA hübriidid. Augud täidab teine DNA polümeraas
8) DNA ligaas – ensüüm, mis liidab DNA tükid. (okazaki fragmendid) omavahel. Tekitab DNA juppide lahiste otste vahel fosfodiestersidemed.
leading strand – pidevalt sünteesitav ahel st juhtiv ahel. Pidev ahel ei käi ajaliselt kogu aeg, vaid ei tehta ahela juppe. Juhtival ahelal asub rohkem kõrgelt avalduvaid geene.
lagging strand – mahajääv ahel, sünteesitakse fragmentidega, okazaki fragmentidena. Seal läheb vaja palju DNA praimereid.
DNA polümeraasid (2tk) on tihti ühendatud holoensüümideks – multi-valk kompleks nagu šveitsi taskunuga.
Juhtiva ahela süntees peab ootama, et teine ahel ka täis sünteesitakse. Üks Me+2 (kahevalentne metallioon) koordineerib β ja gamma Pi-d, teine α Pi-d ja oksüaniooni.
9) replikatsiooni alguspunkt – replikatsiooni ORI (origin of replication) – koosneb bakteri puhul kahte tüüpi kordusjärjestustest. Replikatsioon algab korraga kahest otsast.
Kui E. colil on 1 ORI, siis S. cerevisiae-l on sadu. ORI-l on kindlad kordusjärjestused, mis on märklauaks valkudele. Valgud tunnevad ära ja seonduvad sellega.
10) intronid – kordusjärjestused
11) DNA replikatsiooni silm – selle tekitab initsiaatorvalk.
12) DNA helikaas – lagundavad ahelaid, kasutavad ATP-d ahelate lahutamiseks.
13) DnaA-ATP – indutseerib DNA struktuuri muutust, seondub 9-aluspaariliste kordustega.
14) DnaB ja DnaC – valgukompleksid, mis seonduvad üksikahelaliste piirkondadega. Moodustavad ringstruktuure ja ring sulgub ümber DNA, liiguvad 3’ → 5’ suunas.
15) BCDA kompleks – asetab β-subühiku rõngad kaksikheeliksile peale (pea-saba kombinatsioon).
Klamber hoiab DNA polümeraasi vabrikut DNA küljes kinni – tagatakse protsessiivsus.
16) RNA praimer – vajatakse DNA sünteesiks. Lühike RNA jupp, mille sünteesib DNA primaas.
DNA polümeraas sünteesib ühele poole ühe ahela ja teisele poole teise ahela.
Lk = Tw + wr
Lk – ahelate omavaheline seondus, Tw – täispöörete arv, wr – teise astme vindid.
Replikatsiooni kiirus
kuni 1000 nukleotiidi sekundis. E. coli kr APPI replitseerimiseks kulub ca. 1h. Bakterid jagunevad kiiremini kui 1 h. Mitmekorruseline replikatsioon tagab selle, et DNA süntees jõuab jagunemisele järele. DNA süntees sõltub de novo valgu sünteesist.
Eukarüootide replikatsiooni initsiatsioonil osalevad valgud. Kui DNA polümeraas kohale jõuab, hakatakse DNA-d sünteesima. Cdk on oluline regulaator – stimuleerib ja pidurdab replikatsiooni algust. Kui esineb Cdk aktiivsus, siis pre-RC kompleksi ei aktiveerita.
Eukarüootide replikatsiooni käigus ORI-d inaktiveeritakse. Esineb palju alguspunkte (ORI-sid). ORI-d on seotud DNA järjestusega, iseseisvalt ei toimi. DNA replikatsioon toimub vaid ühe korra, vajatakse ainult ühte koopiat. DNA alguspunktide inaktiveerimiseks peab valk olema seondunud ja see eemaldab alguspunktid.
Pre-RC – pre-replikatsiooni kompleks, mis koosneb ORC-dest. Moodustab selle 6 eri polüpeptiidist.
Eukarüootide replikatsiooni lõpetamine on seotud terminatsioonisaidiga – järjestus on polaarne. Mõlema ahela jaoks on oma terminatsiooni koht. Kui saadakse omavahel seondunud ahel, siis üleliigne DNA lagundatakse.
Juhtiv ahel sünteesib lõpuni välja komplementaarse ahela. Teise ahela puhul vajatakse RNA praimerit, mis jääb sinna külge. See on omakorda vaja eemaldada Rnaasi poolt – jääb üheahelaline replitseerimata DNA. See koht kromosoomi lõpus tuleb siiski replitseerida. Looduse üks lahendus on telomeraas, mis toimib vaid eukarüootides. Telomeerid sisaldavad paljusid kordusi ja erinevatel rakkudel on eri arv kordusi. Üheahelalise otsaga seondub RNA, polümeeri otsa lisatakse 3 nukleotiidi, pikendatakse teist ahelat. Toimub telomeraasi translokatsioon. Liigub edasi, kuni tema abil sünteesitakse kordusjärjestused – 6-nukleotiidilised kordused. Edasi läheb tavaliselt – sünteesitakse RNA praimer, sünteesitakse kromosoomi ots täis. Tüvirakkudel on telomeerid pikemad, diferentseerunud rakkudel lühemad. Telomeraas (koosneb valgust ja RNA-st) sünteesib telomeere. Inimese telomeraasil on UAACCCUAA kordus, mis on RNA matriits, mille alusel DNA sünteesitakse. Ta liitub juhtiva ahela lõppu nii, et üks ots jääb veel üle ja tema abil sünteesitakse kuni otsani, siis libiseb jälle edasi ja jälle sünteesitakse. Nii moodustub palju kordusi. Seejärel sünteesitakse teisele ahelale RNA praimer ja DNA. RNA praimer eemaldatakse ja selle võrra on üks ahel lühem (okazaki fragmentide ahel). Telomeeri kordustele lisanduvad telomeeriga seonduvad valgud, mis tunnevad ära heksameerseid kordusi ja peidavad kromosoomi otsad ära, et need ei oleks kättesaadavad rekombinatsiooniensüümidele (ei saa rekombinatsioon toimuda).
Replikatsioon
Rakkudes on palju erinevaid DNA polümeraase, neist vaid mõned osalevad kromosoomide replikatsioonil.
E. Coli DNA polümeaasid (= prokarüootide polümeraasid):
1) Pol I – reparatsioon , RNA praimeri eemaldamine (1 polüpeptiid)
2) Pol II – reparatsioon (1 polüpeptiid)
3) Pol III – replikatsioon (3(9 (koos lisafaktoritega) polüpeptiidi)
4) Pol IV – reparatsioon, aukude täitmine (1 polüpeptiid)
5) Pol V – aukude täitmine (3 polüpeptiidi)
Polümeraasid on seotud ka nukleotiidide lagundamisega. Pol IV ja V on erilised.
Rnaas H – eemaldab koos Pol I-ga RNA praimeri, see on kaheetapiline protsess. Rnaas H lagundab. Jätab viimased RNA nukleotiidid alles, sest need on nii DNA lähedal. Mõlemad praimeri otsad jäävad alles. Otsad eemaldab DNA polümeraas I, sest tal on tugev eksonukleaasne aktiivsus, st lõikab nukleotiide ahela otsast.
Polümeraas III on peamine replikatsiooni polümeraas. Eksisteerib kahes vormis. Koensüüm – 3 peptiidi; polüensüüm – 9 peptiidi. Üksi paljudab bakteri DNA-d. Polümeraasid IV ja V on ebatäpsed (aga see-ees oskavad mõningaid raskeid kohti ületada). Kasutatakse DNA reparatsioonidel. Polümeraas V – stressiensüüm nt bakter on näljas.
Eukarüootide DNA polümeraasid:
1) Pol-α – 4 polüpeptiidi, primaas e. tegelikult RNA polümeraas (DNA praimeri süntees)
2) Pol-β - 1 polüpeptiid – BER reparatsioon (aluse eemaldamise reparatsioon, eemaldatakse ainult lämmastikalus, suhkur jääb)
3) Pol-X (hii) – 3 polüpeptiidi, mitokondri DNA replikatsioon
4) Pol-delta – 2-3 polüpeptiidi. DNA replikatsioon ja reparatsioon
5) Pol-epsilon – 4 polüpeptiidi. DNA replikatsioon ja reparatsioon
6) Pol-pii - 1 polüpeptiid. reparatsioon, hüpermutatusoon
Pol- α on tegelikult RNA polümeraas, võib ka DNA-d replitseerida.
Polümeraasid teevad vigu, see on spetsiifiliste mehhanismide poolt ette nähtud, et vead viiakse geeni. Vead ei pärandu järglastele, lähevad edasi vaid samas rakuliinis.
Polümeraasid teevad harva vigu (1 viga miljoni kohta).
Replikon – üks replikatsiooni ühik, peab sisaldama replikatsiooni alguse ja lõpu signaale. Algus on ORI sait, lõpp terminatsiooni sait. Võib olla üks molekul või molekuli osa.
Replikatsiooni kontroll
terminatsiooni saidid on ahelaspetsiifilised (ühe ahela terminatsiooni sait ei põhjusta teise ahela terminatsiooni. liigne sünteesitud DNA hiljem lagundatakse ja saadakse kaks uut replikoni).
ORI – koosneb kordusjärjestustest (A-T) rikas
OriC – E. coli ORI. E. coli-l on palju erinevaid oriC-sid. Pole omavahel seotud, ei mõjuta üksteist. On sobivad või välistavad teineteist.
SV 40 – imetajate viirus
Initsiaatori funktsioonid replikatsiooni alustamisel
- Aktiveerivad ORI, kui on ära aktiveerinud, siis initsiaator lagundatakse (st kui replikatsioon on alanud). Ta tekitab esimese ahelate lahutamise. Seostub ORI-ga järjestusspetsiifiliselt, harutab lahti ORI-kõrval oleva DNA, tekib replikatsiooni mull (silm).
- Initsiaator kutsub kohale teisi valke (helikaase), mis seonduvad lahti tehtud DNA piirkonnaga ja replikatsioon läheb edasi. E. colil ORI – 3x13 piirkond + 4x9 piirkond.
Dna – seondub 9-aluspaarilistele kordustele, tekib DNA topoloogia muutus, see kutsub esile ahelate lahtikeerdumise, et ahel ei katkeks, vajab topoisomeraasi.
DnaB – DNA helikaas
DnaC – DNA helikaasi laadija – suurendavad replikatsioonisilma
Pärast DnaB ja DnaC seostumist toimub praimeri süntees. seejärel seostub DNA polümeraas III holoensüüm, sünteesitakse veidi DNA-d, lisandub libisev klamber DNA polümeraas III-le → täielik replikatsiooni mehhanism nüüd koos.
See replikatsioon vajab ühe valgu sünteesi. DnaA lagundatakse. Järgmise replikatsiooni ringiks on vaja sünteesida uus DnaA valk (initsiaator), sest see on ühekordseks kasutamiseks.
Soodsad tingimused → g → 30 minutit bakteril → kromosoomi replikatsioon initsieeritakse rohkem kui üks kord tunni kohta. Mitu replikatsiooni toimub üheaegselt. Jagunemine toimub siis, kui ahel saab valmis. Sünteesi kiirust (kordused) määrab DnaA valgu hulk.
eukarüoodi replikatsiooni käigus ORI-d inaktiveeritakse. Eukarüootide ühel kromosoomil on palju ORI-sid. Bakteril ainult 1 ORI (origin of replication). Eukarüootide ORI-de aktivatsioon toimub samuti initsiaatorvalkude seondumise kaudu.
DNA muutus – kromatiini litsenseerimine kui replikatsioon on käivitunud, siis iga ORI inaktiveeritakse eraldi.
Pre-RC moodustumine (RC – replikatsiooni kompleks)
Eukarüootide replikatsiooni initsiatsioon on kontrollitud Pre replikatsioon kompleksi moodustamisega. Replikaatoriga ühineb OrC, seejärel seostuvad cdf ja cdk valgud (cdk – tsükliinsõltuv kinaas, cdf – tsükliinsõltuvad faktorid).
Need on rakutsükli sõltuvad ensüümid. Tsükliine sünteesitakse rakutsükli kindlas faasis ja mitoosis lagundatakse.
Cdf ja Cdk kutsuvad kohale Mom 2-7 (üks helikaas, mis seondub). On moodustunud Pre-RC (kui helikaas on kohal ja ahelad lahus).
Eukarüoodi replikatsiooni initsiatsioonil osaleb palju valke.
Cdk – stimuleerib ja pidurdab replikatsiooni algust (tsükliinsõltuv kinaas fosforüleerib; ATP-lt Pi ülekanne teisele valgule). Aktiveerivad ja samas pidurdavad repilkatsiooni initsiatsiooni. Madal cdk kontsentratsioon, toimub Pre-R moodustumine, kui aktiivsus on väga kõrgeks tõusunud, siis inhibeerib pre-RC moodustumist. Kõrge cdk aktiivsuse tasemel valke fosforüleeritakse (inhibeerib) ja olemasolevad replikatsiooni kompleksid saavad lõpuni sünteesida.
Pärast M-faasi – cdk-d pole. S-faasis on tase kõrge (DNA süntees). G1 faasis tekivad. G2 faasis cdk lagundatakse.
Replikatsioon lõpeb ter saidis. Ter saidis replikonid lahutab Topoisomeraas 2 (on tekkinud kaks plasmiidi, Topo 2 lahutab nad teineteisest). Rõngaskromosoom, tekivad konkatemeerid (DNA rõngasmolekulid, mis on omavahel ruumiliselt kovalentselt seotud).
Topoisomeraas 2 – tekitab DNA-s kaheahelalisi katkeid. Kontaktemeerid lahkuvad.
Mahajääva ahela lõpust RNA praimeri lagundamisel DNA polümeraas ei saa seostuda, sest pole DNA-d kuhu seostuda.
― 5’ siin oli praimer ― 3’
et DNA ahelad ei lüheneks on telomeerid ahelate otstes. See mure on lineaarse DNA puhul. Telomeraas lisab 3’ lõppu TTAGG korduseid ning neid korduseid pikendatakse iga kord, nii et väärtuslikku infot ei lähe otstest kaduma ning otsad ka ära ei kao.
Mõni bakter seob replikatsiooni ajal 5’ ja 3’ ahela otsad kokku ja otsa probleemi pole, sest kaotab otsad ära. Kui otsi ei seota, on telomeraasid. TTAGG-d sünteesib telomeraas (valk + RNA). Sealne RNA sisaldab 1,5 telomeeri korduselementi UAACCCAAU (telomeeril vastavalt TTAGGGTTA võrra pikem!).
Telomeraas seostub vaba 3’ otsaga ja pikendab seda DNA ahelat mitme kordusjärjestuse võrra, seejärel sünteesib RNA praimeri ja DNA polümeraas sünteesib lühemasse 5’ otsa nukleotiide juurde. Seejärel seonduvad telomeeriga seonduvad valgud ja 3’ ots on 5’ otsast ikkagi TTAGGGTTA võrra pikem!
Reparatsioon (mutatsioonidele)
Replikatiivsed DNA polümeraasid on looduses kõige täpsemad: üks viga E+5/ E+6 kohta. See vigadesagedus pole piisavalt hea. Lõplikuks täpsuseks on bakteritel E-8 – E-9-st üks viga E+9 nukleotiidi kohta. Eksponentsiaalselt jagunevatel bakteritel on üks viga 1000 jagunemise kohta. Vead on sagedasemad teatud piirkondades.
Transversioon ja transitsioon on asendusmutatsioonid ja punktmutatsioonid.
Transversioon – puriin asendatakse pürimidiiniga või vastupidi(C/T↔A/G)
Transitsioon - üks puriin asendatakse teise puriiniga (A↔G) või pürimidiin teise pürimidiiniga (C↔T)
On veel deletsioonid – üks või mitu nukleotiidi. Insertsioon – nukleotiidi lisamine. Need pole tavalised replikatsioonivead, vaid tekivad rekombinatsiooni tulemusel.
Piirkonnad, kus mutatsioone on rohkem, on kordusjärjestused lühikesed st mikrosatelliidid. Nende järgi saab uurida populatsiooni ajalugu. Imetajatel on mikrosatelliit näiteks CA kordused, nende korduste arv võib muutuda.
DNA mutatsioonid ja nende parandamine:
- punktmutatsioonid – transitsioonid ja transversioonid. Punktmutatsioonide puhul tehakse väga vähe vigu – mõni viga miljoni nukleotiidi kohta.. Umbes 6000 viga iga replikatsioonitsükli kohta.
- deletsioonid, insertsioonid – need on vead (ja üldse väikesed vead) mittekodeeritaves piirkondades mikrosatelliitides ja tsentromeerides. Tsentromeerides on väga palju kordusjärjestusi (sh homopolümeerseid). Neid vigu tehakse sagedamini – sünteesitav ahel ja matriitsahel võivad omavahel paarduda erinevat moodi – nt. replikatsioon jääb seisma ja paardub mõnes teises kohas. Sellised alternatiivsed paardumised tekitavad deletsioone ja insertsioone eriti sagedasti kordusjärjestuste piirkonnas. Regulatoorsete geenide kodeerivates piirkondades on mutatsioonid suhteliselt haruldased. Seal on tegu pigem asendusteega (transitsioon ja transversioon).
- mutatsioonid mikrosatelliitides ja tsentromeeri piirkonnas
Kordusjärjestused ajavad ensüümid segadusse, uus ja vana DNA liiguvad teineteise suhtes, see on lihtne, kui on lühikesed kordusjärjestused. Kromosoomi suurim muutlikkus on tsentromeerides. Tsentromeeride järjestust pole suudetud määrata. Kordused pole päris identsed.
Replikatsiooni vigade reparatsioon sõltub mutS valgust (valepaardumise äratundmine ja parandamine). see on mismatch reparatsioon.
MutS skaneerib värskelt sünteesitud DNA-d ja otsib vigu. Kontrollib DNA struktuuri ja geomeetriat (et oleks B-vormis). Kui MutS leiab vea, jääb seisma, hüdrolüüsib ATP → konformatsioonis toimub muutus, liituvad MutL ja MutH. MutH teeb DNA-sse katke ja terve lõik lagundatakse endonukleaaside poolt.
MutH – endonukleaas (3’→5’ või 5’→3’). MutL – määrab ahela spetsiifika. Hiljem DNA polümeraas II sünteesib tehtud augu täis. MutS väänab DNA-d ja kompab DNA struktuuri. Valepaardumise puhul jääb DNA konaruste tõttu kinni ja MutS jääb seisma. Sünteesil tekib hemimetüleeritud DNA, kus vanem ahel on metüleeritud (uus ahel alguses pole metüleeritud). Katkemine tekitatakse alati metüleerimata ahelasse (!).
Replikatsioon check pointid (kontrollpunktid rakutsüklis). DNA replikatsioon ei lõpe enne, kui ta on ära kontrollitud (enne kromosoom ei kondenseeru). Neid kontrollpunkte on palju ja neil on erinevad funktsioonid. Mitoos ei lähe edasi enne, kui mingisugused sündmused on toimunud. MutH – tunneb ära metüleerimata ahela ja lagundab selle. DNA ligaas – DNA taastav metüleerimine (nagu vanemal ahelal tehtud) – toimub palindroomsetes järjestustes (mõlemas ahelas on sama järjestus, pööratud kordus).
Replikatsioonil tekib hemimetüleeritud DNA. Värskelt sünteesitud DNA on metüleerimata. Dam - desoksüadenosiin metülatsioon. Dcm – desoksütsükliin metülatsioon.
Dam A nukleotiidi metülatsioon toimub kindlas järjestuses (GATC) – üks selline järjestus 250 nukleotiidi kohta.
MutL – tunneb ära metüleeritud ahela
MutH – lõikab katki metüleerimata ahela, eristab vana ja uut ahelat (vana on metüleeritud).
Metüleerimata ahel lagundatakse. Mutatsioon ja metüleerimispunkt ei pea väga ligidal üksteisele olema. Uus ahel lagundatakse 5’ → 3’ eksonukleotiidse aktiivsuse abil (ensüüm Exo VII). Kui lagundada 3’→ 5’ suunas, siis ensüüm Exo VI-ga. Iga ensüüm lagundab ainult ühes suunas (on ka erandeid). Kui reparatsioon on lõpuni, siis DNA polümeraas sünteesib augu täis. Ligaas liidab otsad.
Metülaas – tunneb ära kindla järjestuse. Bakter kasutab seda oma ja võõra DNA eristamisks (kaitse).
Parem seletus:
1) MutS leiab ahelast valestipaardunud nukleotiidi, võrdleb metüleeritud ja metüleerimata ahelat (vana vs uus, uus metüleeritakse hiljem). MutH valk seondub hemimetüleeritud DNA ahelas veale lähima 3’ poolsele metülatsiooni kohale (GATC – järestusele).
2) MutS valk liigub valestipaardunud kohast (5’ → 3’ suunas) edasi ja jätab enda järele maha uusi MutS valke – MutS valgud oligomeriseeruvad kuni DNA-ga seondunud MutH valguni. Valestipaardunud nukleotiidiga seondunud MutS valk seondub MutL valguga.
3) MutL valk interakteerub DNA-ga seondunud MutH valguga moodustades DNA lingu. MutH valk teeb DNA ahelasse üksikahelalise lõike.
4) Eksonukleaas lagundab valestipaardunud nukleotidiidist kuni MutH valguni (lähim GATC järestus)
5) DNA polümeraas III, kasutades vana ahelat matriitsina, sünteesib tekkinud tühiku täis. Ligaas seob katkeid.
(valke üks, kujutatud kaks, vahepeale ei saanud kirjutada)
― G ― GATC ―→ ―MutS ―MutH → ―MutS (+ MutL)-MutS-MutS-MutH
― A ― CTAG ―→ ― MutS ― MutH →―MutS (+ MutL)-MutS-MutS-MutH
― G ―GATC ―
ära lõigatud ahela jupp ― sünteesitakse uuesti
Restriktsioon - modifikatsiooni süsteem bakterites
Restriktsiooniensüümid tunnevad ära kindlaid järjestusi ja lõikavad DNA selle koha pealt lahti → tekivad kaheahelalised katked DNA-s. Vajalikud bakteriofaagide jaoks.
Bakterites sama DNA järjestuse tunnevad ära nii restriktaas kui metülaas. Restriktaas ei lõika metüleeritud DNA-d. Restriktaas lagundab metüleerimata DNA (võõra DNA) sptesiifilistest kohtadest. Restriktaas ja metülaasi äratundmiskohad kattuvad. GATC on restriktaasi (kindla) äratundmisjärjestused, mis on vanas DNA-s kõik metüleeritud, ei lõigata katki.
Kui rakku tuleb faagi DNA, siis see ei ole sellelt kohalt metüleeritud st lõigatakse katki. Erinevus metüleerimisel tuleneb erinevustest bakteri ja faagi DNA replikatsiooni mehhanismides.
Modifikatsioonide alusel eristatakse bakteri ja faagi DNA, metüleerimata DNA tunneb ära restriktaas – lagundatatakse.
Reparatsioon – parandamine pole ainult valepaardumiste ja replikatsioonivigade parandamine vaid ka muu parandusvorm. DNA saab sageli mitmesuguseid kahjustusi. Reageerimine mitmete kemikaalidega, kiirgused (nt ioniseeriv ). Väikese genoomiga organismid nt. rakusisesed parasiidid – neil on oma reparatsioonisüsteemid kolmandik oma genoomist.
Lisaks DNA reparatsioonile esineb ka RNA parandamise mehhanismid. nt. erütrotsüütides esineb hemoglobiin , seal esinevad ensüümid, mis suudavad parandada kõige sagedamini toimuvaid muudatusi – hapnik reageerib väga kergesti, tekitab oksüdatiivseid kahjustusi hemoglobiinile, sest uut RNA-d ei tule erütrotsüüti ja neid on vaja parandada.
DNA erinevad kahjustused:
1) deamiinimine – reageerimine H2O-ga. Reageerivad aminogruppidega ja deaminaasid deamineerivad. Toimub ka normaalselt (kahjustamata). Adenosiini deaminaas. C→ U-ks
2) depuriinimine G-rühm + H2O →G + rühm. Lämmastikalus eemaldatakse
- G nukleotiidi reageerimine veega – G on atakteeritav hapnikuradikaalide poolt. Tekivad DNA-d alküleerivad ühendid.
3) G oksüdeerimine – GO, alküleerimine või deamineerimine (iga asi kindlas kohas)
4) pürimidiini dimeerid (dT) – tekivad ühe ahela järjestikuse pürimidiini vahel (kovalentne side). Tsütosiini ja tümidiini dimeerid tekivad UV toimel.
Tümidiini-dimeeri teke võib tekkida väga kergesti UV toimel (nt. päevitades). Valguskvant tabab DNA-s piirkonda, kus on kaks järjestikust tümidiini ja nende vahele tekib tsüklobutaan. Need kaksiksidemed asenduvad kahe lämmastiku vaheliste sidemetega. Nad ühinevad ja see kahjustus on talumatu. Ei saa sünteesida DNA-d ja RNA-d. dT-d tekivad imetajatel ja taimedel.
5) Lämmastikaluste analoogid – interkalaatorid. Interkaleerimine – aluspaaride vaheline paardumine. Interkalaatorid: etiidium, propiidium, akridiinoranž, proflaviin – seostuvad lämmastikaluste vahele, DNA konformatsioon muutub, mutatsioonide sagedus kasvab. Lämmastikaluste analoogid petavad nukleotiide, sünteesivad ensüümid ära. DNA-sse läheb modifitseeritud lämmastikalus või mõni muu ühend.
Moodsa keemia areng – palju ühendeid, mida tarbitakse on lämmastikalused või nende derivaadid. Vahel satuvad DNA koostisesse. nt 5-bromouratsiil, mis võib teha aluspaari G-ga ja sellega tekitada valepaardumise DNA-s.
Tsüklilised aluselised ühendid tekitavad DNA-s ebaregulaarse struktuuri. Etiidiumbromiid on üks oluline kemikaal, mida kasutatakse DNA värvimiseks. Helendab DNA-d UV valguses – muudab oranžikaks. Ise kovalentselt ei reageeri, tekitavad ebaregulaarseid struktuure. DNA kõrgemat järku struktuuri modifitseerimine.
Reparatsiooni käigus toimub DNA lagundamine ja süntees. Osalevad paljud samad ensüümid mis replikatsiooniski
DNA reparatsioonisüsteemid:
Tüüp ⁞ viga ⁞ ensüümid:
1) valepaardumine ⁞ replikatsiooni viga ⁞ MutS, MutH, MutL
2) fotoreaktsioon (otsene parandamine) ⁞ Td alküleerimine ⁞ DNA fotolüaas
3) BER aluse eemaldamise repatatsioon ⁞ Lämmastikaluste modifikatsioon lõigatakse välja ⁞ DNA glükosülaas ja lämmastikalus lahkub
4) nukleotiidide väljalõikamine (tähtsaim) ⁞ (Py)2; aluse modifitseerimine ⁞ UvrA, B, C, D + XPO, XPA, XPD
5) kaheahelaliste katkestuste parandamine ⁞ kaheahelalised katked ⁞ RecA, RecB, C, D
6) rekombinatsiooni reparatsioon ⁞ massilised kahjustused, mõlemad ahelad lagundatakse ⁞ UmuC (DNA polümeraas IV ja V)
Fotoreaktsioon on omane taimedele, imetajatele mitte. Fotoreaktsioon – otsene parandamine. Pürimidiini-dimeeride eemaldamine rakus, teeb DNA fotolüaas (ensüüm AlkB).
BER – base edition reparatsioon – DNA glükosidaas lõikab glükosiidsideme, kahjustatud lämmastikalus lahkub, selle asemele hiljem uus alus.
nukleotiidide väljalõikamine – tähtsamaid reparatsioonitüüpe, lagundatakse DNA-d, lõigatakse kahjustatud välja
(Py)2 – pürimidiini dimeer. Aluste modifitseerimine, kui aluste küljes on suured võõrad rühmad, mida teised ensüümid ära ei tunne.
UvrA jne seotakse tavaliselt UV mõjul (bakteritel). Inimesel on bakterite geenidega homoloogilised XPC (kseroderma pidmentaasa – kuiv nahk, väga kiirgustundlik) - DNA reparatsiooni geene pole piisavalt.
Eraldi DNA kahustuste alaliik. Parandatakse nii, et kasutatakse teise DNA ahela infot. DNA fragmendid ühendatakse teise ahela abil. Siin osalevad spetssiaalsed DNA polümeraasid, mis kuuluvad Y-perekonda. Teevad palju vigu, aga suudavad DNA-d sünteesida ka siis, kui matriitsiks pole korrektne kaheahelaline DNA (võib olla väike jupp DNA-taolist ainet).
Teinococcus radiodurax
Bakter, kes elab tuumareaktorites, kosmoselaevade pinnal. Ioniseerivale kiirgusele vastupidev. Hästi arenenud DNA reparatsiooni süsteem. Translatsiooni süsteem on erakordset resistentne . Tal on genoom neljakordselt (kõike on 4 komplekt). Kui kolm on vigased, siis rekombinatsiooni reparatsioon saab need ühe genoomi abil parandada.
Fotoreaktivatsioon
UV → tümidiini olimeer→ pimedas seostub fotolüaas, tunneb ära vea → parandus toimub nähtavas valguses
Td (pürimidiin-dimeer) tekib valguse toimel, need ei paardu enam ja tekib DNA struktuuri muutus. DNA fotolüaas tunneb kahjustuse ära ja seondub. Kasutab nähtavat valgust kahjustuste parandamiseks. Lagundab tsüklobutüülradikaalid ja tekib tagasi algne DNA. Fotolüaas esineb vaid taimedel.
Otsene reparatsioon
DNA metüültransferaasid. Tunneb ära metüleeritud ebanormaalse nukleotiidi ja metüülradikaal ei paardu, on ruumilise struktuuri muutus ja metüültransferaas võtab metüülrühma ära. Reageerib DNA-ga nii, et viib ära teatud rühma. DNA saab terveks, aga metüleeritud valk lagundatakse. Üks valk DNA metüültransferaas lagundatakse peale ühe metüülrühma eemaldamist – väga kallis, 1200 ATP-d valgu ülesehitamise jaoks. Metüülrühma ei võeta endale, vaid antakse oksaalatsetaadile.
Teine metüleerimise reparatsioon – AlkB ensüüm, mis suudab RNA-d demetüleerida (võtta metüülradikaale ära). Esineb 3-metüültsütosiin, mis metüleerides ei saa enam vesiniksidemeid moodustada ega paarduda. Ensüüm AlkB – eukarüoodis on palju homolooge ja see on ensüüm, mis ei võta metüülrühma endale, vaid oksaalatsetaadina kantakse metüülrühm, mille tulemusena formaalaldehüüd tekib.
AlkA – parandab A nukleotiide. AlkB – parandab G ja C nukleotiide. Kasutab metüültransferaase (sellel on SH rühm). Vaja vitamiin C-d ja metalliioonidest kofaktoreid.
OxoG – G parandamine enne replikatsiooni või replikatsiooni käigus. G reageerimisel hapnikuga tekib OxoG, mis ei paardu C-ga ja see kahjustus eemaldatakse. Replikatsioon jääb sel kohal seisma ja tulevad kohale replikatsiooniensüümid. Indutseerib replikatsiooniensüümide seondumise ja DNA reparatsiooni. Sama toimub ka RNA sünteesimisel.
Nukleotiidi väljalõikamise reparatsioon - NVR reaktsioonid.
1) aluste väljalõikamine. Oxo-G = oksüdeerunud G-alus
2) replikatsiooni käigus, kui replikatsiooni süsteem jääb seisma, lämmastikalus, mis põhjustab seiskumise, lõigatakse välja.
UvrA skanneerivad DNA-d nagu Mut S. UvrA lahkumisel B sulatab DNA ahelad lahti (kui on tehtud viga). UvrD tekitab katked. See on replikatsioonist sõltumatu protsess, seotud transkriptsiooniga. DNA polümeraas I ja ligaas sünteesivad uue DNA. Üksikahelalised katked tehakse mõlemale poole viga, eemaldatakse fragment. Allesjäänud ahela (vana ahel) alusel sünteesitakse DNA.
Sagedamini kasutatavad geenid on suurema kontrolli all. Neid geene, mida transkribeeritakse, neid parandatakse ka sagedamini, sest neis leitakse vead paremini üles.
Reparatsioon on seotud transkriptsiooniga. Reparatsioon toimub eri kohtades eri sagedusega. See kromosoomi piirkond, kus reparatsioone on palju, toimub pidev DNA kvaliteedi kontroll. RNA polümeraas tunneb kahjustused ära, jääb seisma kui leiab vea. Kui seisab, seostub UvrA2B kompleks. RNA polümeraas tõrjutakse välja, tekib reparatsioonikompleks (tavaline nukleotiidi väljalõikamine).
Homoloogiline rekombinatsioon
- Genoomi stabiilsuse säilitamiseks, et see säiluks ühesugusena
- Homoloogilised kromosoomid vahetavad homoloogilisi DNA järjestusi. Ristsiire (crossingover) eukarüootides.
- Homeoloogiline rekombinatsioon prokarüootides (pole homoloogilisi kromosoome)
- Genoomi stabiliseerimine reparatsioonimehhanismide kaudu.
- transgeensete organismide konstrueerimine (reparatsiooniensüümide abiga)
- Jõud, mis hoiab genoomi stabiilsena. DNA on väga tihedalt kokkupakitud, on kogu aeg mehhaanilise surve all. Vaja tagada stabiilsus. Mitoosis ja meioosis on kontrollpunktid, mis hoiavad DNA stabiilsena.
- Esineb ka eri kromosoomide vahel, mitte ainult homoloogilistes kromosoomides (ribosoomi DNA, lühikesed ja pikad kordusjärjestused). Mikrosatelliidid – lühikesed; LINE-d ja SINE-d – pikad.
Homoloogilise kromosoomi tulemus võib olla krossingover – ristsiire. Prokarüootides pole homoloogilisi kromosoome, neil toimub homoloogiline rekombinatsioon kahe bakteri vahel. Kui nad liituvad, siis tekibki rekombinatsioon.
Homoloogiliste rekombinatsioonide reaktsioonid:
1) homoloogiliste DNA lõikude (alleelide) joondamine
2) kaheahelaliste katkete tekitamine
3) ahela vahetus ( inversioon ) ja Holliday ühenduse teke – homoloogia muutub nii nõrgaks, et pole võimalik ahelaid koos hoida.
4) ühenduste liikumine nii kaua kuni homoloogia nende järjestuste vahel kaob. Tekivad mittehomoloogilised piirkonnad. Kui mismatche tekib palju, siis sinna jääb Holliday ühendus pidama.
5) produktide lahutamine
Ühendus liigub nii kiiresti, kui kiiresti suudetakse DNA topoloogilisi probleeme lahendada. Ahelad üksteisest üle ei lähe. Holliday lahendamine – kas lõigatakse lahti suured või väikesed tähed. Vanem DNA-d lõigatakse lahti. Lõigatakse lahti need ahelad, mis ei läinud risti ja katkestusi ei tehtud. Lõigatakse lahti need, kus tekitati katkestused. Sellest sõltub aga tulemus, sest ühel juhul tekib rekombinantne tulemus, teisel juhul vana olukord tagasi. Need alleelid, mis enne olid erinevates molekulides, on nüüd samas molekulis.
’-dega ahelad vahetavad omavahel kohti.
Holliday mudel
See on mudel, mis ei peegelda tegelikkust, vaid iseloomustab toimuvat reaktsiooni. Ei põhine katsetel, vaid sellel, et rekombineerumise tulemusel tekivad rekombinantsed DNA molekulid.
Esinevad kaks kaheahelalist ahelat – komplementaarne ja teine alleel. Ahelad, mis tähistatud erinevalt, sisaldavad samu geene. Tehakse üheahelalised katked ja nad (sama alleel) vahetab ahelaid. Omavahel vahetavad nii, et tekiks komplementaarne DNA. Kui ahelad vahetatakse, tekib ühendus. Teine ahel ikka samamoodi koos. Ahela ühendus liigub ja liikumise käigus aluspaarid ühelt poolt sulavad, teiselt poolt tekivad tagasi. Energeetiline efekt on väike. Ühendust katalüüsitakse ja liigutatakse. ATP hüdrolüüs toimub. Ühendus liigub nii kiiresti, kui kiiresti suudetakse topoloogilisi probleeme lahendada. Vesiniksidemed katkevad pidevalt oma algDNA-s ja tekivad edasi liikudes uues. Ühendus liigub nii kaua, kuni tekivad mitmed homoloogilised piirkonnad. Ühinenud uued dupleksid – lühem ja parem ahel. Pole enam päris komplementaarsed. Ühelt üksikult mismatchilt liigutakse üle. Mismatche – mittekomplementaarseid aluspaare tekib mitu. Holliday ühendus jääb pidama. Seal toimub ahelate lahutamine. Tekib selline ristvorm. Selle juures toimub Holliday ühenduse lagundamine. Seda saab kahte moodi – kummaltki risti keskelt erinevates suundades. Lõigatakse üksteisega vastavast kohast ahelad lahti. Ühe lõikamise puhul tekib rekombinatsioon, teise lõikamise puhul tekib sama, mis oli enne. Kui need, mis enne kohti ei vahetanud – lõikamata ahelad – tekib rekombinatsioon. Lõikumata ahelat lõigates tekib rekombinantne molekul. Teistpidi ahelat – juba lõigatud ahelat lõigates.
ABC ja abc -2 DNA molekuli, millel sama geeni erinevad alleelid; väikesed erinevused, punktmutatsioonid – sisaldavad asendusi koodoni 3. positsioonis.
Holliday ühenduse järjekord:
1) vahetuvad üks ahel, lõigatakse ja kleebitakse vastaskromosoomiga.
2) liiguvad edasi, libisevad kuni kuskile kindlale maale
3) moodustub Holliday struktuur
4) lõigatakse ülejäänud ahelad ja kleebitakse
edasi liikuv koht jääb mitte klappima. Lõikamata ahelate lõikamisel tekib rekombinatsioon. Varem lõigatud ahelate uuesti lõikamisel ei teki rekombinatsioon.
1) Üheahelalised katked mõlemas kromosoomis (Holliday mudel), looduses on kaheahelalised katked.
2) Ahelate ristimine – ahelad üksteisest üle. NB! vahetuvad samasuunalised ahelad.
3) Tekkinud Holliday ühendus liigub mööda DNA-d. Ühes otsas aluspaar lahtisena, teises nende teke. Liikumine toimub nii kiiresti kui DNA topoloogia seda lubab. Mõlemal pool ristumispunkti tekib supervint – topoisomeraas kõrvaldab need.
4) Erinevuste kohal tekib valepaardumine, mis parandatakse replikatsiooni käigus.
5) Holliday ühendus lõpeb, kui on piisavalt palju erinevusi (tagasi ei moodustu sama palju aluspaare, kui lahti sulades)
2 erineva DNA tekkimiseks on 2 võimalust:
1) tulemus on geenide sisalduse poolest sama, kuid alleelide poolest erinev.
2) See ahel, kus esialgu rekombinatsiooni ei toimu, muutub pärast Holliday ühenduse kadumist, see oleneb, mis pidi Holliday ühendus katki lõigatakse.
Homoloogiline rekombinatsioon:
Erinevad osalevate valkude poolest. Ühes DNA-s on kaheahelaline katkestus , tekib korraga 2 Holliday ühendust. Ühenduse liikumist katalüüsitakse RuvA (ensüüm, mis on seotud DNA Holliday ühendusega) ja RuvB (helikaas) poolt. Seda mudelit kutsutakse RecBCD rekombinatsioon.
RuvA ja Ruv B helikaas – ensüümid, mis on seotud DNA Holliday ühendusega. Seda mudelit kutsutakse RecBCD rekombinatsioonimudeliks. See toimub päriselt. Holliday mudeli järgi tekivad katked mõlemas ahelas, katkete arv on aga sama. Holliday mudeli järgi tekivad katked mõlemas molekulis, RecBCD järgi aga ühes molekulis kaheahelaliselt.
DNA joondatakse ja lähendatakse, nüüd RecBCD tekitab kaheahelalise katke ja seejärel hakkab kompleks DNA-d lagundama. Alles jääb üks molekul (homoloogiline). Jääb alles ainult üks RecBCD kompleks, mis DNA-d lagundab ja liigub mööda DNA ahelat. Ei toimu suure kiirusega. Ahelaid lagundatakse samas suunas. Keemiliselt täiesti erinevad protsessid:
ühte 3’ → 5’ suunas
teist 5’ → 3’ suunas
… kuni jõutakse erilise DNA järjestuseni hii (chi) sait. Toimub RecBCD ümberkorraldamine. Hii-sait on signaaliks, et üks subühik – RecD- (mis vastutas 5’ → 3’ suuna eest) lahkub kompleksist. RecBCD hakkab liikuma oluliselt suurema kiirusega, lagundab nüüd ainult ühte ahelat. Enne lagundas kahte. Tulemuseks üheahelaline DNA, mille otsas on hii-järjestus. Üheahelalise DNA-ga seonduvad valgud, mida nimetatakse RecA-ks. RecA moodustab DNA-ga filamendi – spiraalse struktuuri, mis sarnaneb kaheahelalise DNA-ga struktuurilt ja geomeetrialt. Esineb primaarne (seob üksikahelalise) ja sekundaarne (seob teise) DNA sidumiskoht. RecA hüdrolüüsib ATP-d ja kontrollib kogu aeg komplementaarsust.
Üksikahelat liigutatakse mööda kahte ahelat, kontrollitakse terve pika lõigu komplementaarsust. Nii kaua kuni leitakse komplementaarne piirkond. Üksikahel tungib kaheahelalisse DNA-sse ja asendab seal selle ahela. Ühel rekombineeruval DNA-ld on tunduvalt rohkem geene kui teisel. On tekkinud 2 Holliday ühendust – teine kromosoom pole ikka veel lõigatud, ainult vesiniksidemed lõhutud ja selle asemele liikunud. Seejärel esimesena lõigatud kromosoomil lõigatakse juurde. Mõlema Holliday ühendusega liituvad 2 heksameerset kompleksi ja liiguvad edasi üksteisest kaugemale. Seejärel on kaks kohta, kus saab toimuda risti lõikamine. Võidakse kahte moodi Holliday ühendust lõigata – mõlemas kohas peab samamoodi lõikama, kuigi kromosoomid ei lahutu omavahel. Kas mõlemast juba vahetunud või veel vahetumata ahelad. Krossingover kas tekib või mitte. Lagundajaks on RuvC valk, valib, kumba lõigata. Kui lõikab vana ahelat, siis ei toimu midag. Kui juba vahetatud ahelat, siis toimub rekombinatsioon.
1. etapp:
- sünteesida puuduvad DNA osad.
- DNA süntees toimub nii rekombinatsioonil, reparatsioonil kui ka replikatsioonil
2. etapp:
- RuvAB kompleks seondub Holliday ühendusega.
- RuvB helikaas moodustab heksameerseid komplekse. RecBCD puhul sarnane olukord.
Kui E. coli rakku satub hii saitidega DNA, siis ei jää RecBCD kompleks sinna pidama ja see kompleks lagundab selle DNA lõpuni.
Teine funktsioon homoloogilisel rekombinatsioonil on replikatsioonikahvli katkemine. Tekib üheahelaline katkemine ja sealt ei saaks replikatsioon edasi toimuda. Kui on ühes ahelas lihtsalt tömp ots. siis on taastumiseks vaja homoloogilist rekombinatsiooni. On tekkinud juba kaheahelaline katkestus.
Toimumine:
- RuvBCD liitub tömbile otsale
- hakkab liikuma ja liigub, lagundab hii-nim sealt edasi lagundab üht ja tekib RecA filament .
- see katalüüsib kaksikahela komplementaarsust otsides, paardub ühe ahelaga
- siis ongi replikatsioonikahvel taastatud ja replikatsioon saab edasi minna
replikatsiooniensüümide fn: kataüüsida liikumist, ühendamist
Erinevused kahes mudelis:
- katked ühes kromosoomis või mõlemas
- lagundamine või lihtsalt ahela vahetus
- kaks või üks Holliday koht
- mõlemad liiguvad edasi
- katkestused – vastupidi, et kumba peab lõikama, et tekiks rekombinatsiooni produkt.
RecBCD aitab võõrast DNA-d lagundada, taastada replikatsioonikahvel ja korraldada rekombinatsiooni. RuvA kõigi nelja DNA ahelaga sidumiseks oma piirkonnad olemas. Need piirkonnad on omavahelises orientatsioonis nii, et ühendus saab vabalt liikuda.
Rekombinatsioon algab kaheahelalise katkega - Ruv A, Ruv B on b ensüümid.
- 3 ensüümi ReBCD moodustavad DNA-l kompleksi ja, lagundavad kaheahelalisel DNA-l ühe ahela ära.
- D;BC – üks on helikaas, ahel on katki, teine on nukleaas, mis lagundab.
- X- sait – lambda järjestus – sellel kohal on krossingover väga sage. See jääb tekkiva üheahelalise DNA 3’ otsa.
- seondub RecA – tekitab DNA-s RecA filamendi, katalüüsib ahela vahetust, algselt tekib kolmeahelaline DNA. RecA aitab üheahelalisele DNA-le homoloogilise koha, katalüüsib ahela vahetust (kulutab palju ATP-d).
- Holliday puhul liigub 1 ristumiskoht, tegelikult liigub 2 ristumiskohta.
- RuvA ja RuvB ühesuunalise liikumise tagabki ATP hüdrolüüs.
- Kaheahelalise katkemise tulemusel (tegelik), seal on rohkem sobivaid saite.
- RuvC valk lahendab katked.
- RuvC ristab kas A ja d või B ja C.
- Kaheahelalised katked tekivad peamiselt replikatsiooni käigus, kui „ kahvel “ ei saa enam edasi liikuda.
- Juhtiv ahel ei pikene kahjustustest edasi, tekib kaheahelaline katkemine, kahjustatud koht lagundatakse ja algab rekombinatsioon.
Rekombinatsiooni ensüümid:
reaktsioon
E. coli ensüüm
Eukarüoodi ensüüm
Ahela vahetus
RecA
Rad 51
2-ahelaline katkemine
Spo11 (meioos), nukleaas
1-ahelalise DNA teke
RecBCD helikaas, nukleaas
MRX valk
Ahelavahetuskompleks
RecBCDm RecFDR
Rad 52, Rad 53
Ühenduste liikumine
RuvAB
Ühenduste lahendamine
RuvC
Mus81
Bakterid saavad olla ka ilma RecA-ta, kuid ilma Rad 51-ta rakud jaguneda ei saa. Mitoosi kontrollpunktist ei lähe mitoos edasi.
RecBCD ha RecFDR katalüüsivad ainevahetust.
RacA filamendi tekke suund – 5’ → 3’ suunas liitub RecA kompleks kiiremini. RecA filament võib tekkida mõlemas suunas. Eukarüootide meioosil toimub rekombinatsioon, mis on suhteliselt sama mis RecBCD, aga sel ei toimu ulatuslikku lagundamist ja RecBCD homoloog, kus tekitatakse kaheahelaline katke Spo11 nukleaasi abil, sellest mõlemas suunas lagundatakse üks DNA ahel ära (vastasahel) ja tekib kaks RecA filamenti. Põhiline erinevus on geomeetrias.
RecA ahela vahetuse ensüümid
Tuleb leida homoloogiline koht, kuhu DNA vahele surgata kaheahelalisse DNA-sse. See ahel sulatatakse lahti, aluspaar topitakse vahele, vaadatakse, kas sobib.
Eukarüootide meioosis toimub homoloogiline rekombinatsioon →kaheahelaline kromosoomistik → liituvad Spo 11 (katked) ja MRX (tunneb ära kaheahelalise katke, lagundab ära 1 DNA ahela 5’ → 3’ suunas, tekivad üheahelalise DNA 3’ vabad otsad) → Spo 11 eemaldub → Dmc 1 ja Rad 51 liituvad.
RuvA – tetrameer seondub Holliday ühendusega ja katalüüsib selle liikumist. 3 domääni, mis kõik seonduvad NDA-ga.
Koht-spetsiifiline rekombinatsioon ja transpositsioon
1. Konservatiivne koht-spetsiifiline rekombinatsioon – fosfodiestersidemete vahetus. Tekib, kui lagunevad P-O-P sidemed. Genoomi struktuur muutub, DNA lõik lahkub kohalt või pöördub ringi.
Ühest kohast võetakse lahti ja viiakse teise kohta asemele. Ei vajata lisaenergiat, DNA lagundamist. Toimub sidemete asendamine.
1) insertsioon – üks DNA ahel läheb teise vahele
2) deletsioon – kustutamine
3) inversioon – DNA lõik pöördub ümber. DNA järjestuse ümberpaiknemine. Identsed elemendid, DNA seal vahel pööratakse ringi.
transposoonid – DNA ja RNA vahendatud. Transposoonid on liikuvad DNA elemendid – hüppavad geenid. Geneetiline element, mis võib ühest molekulist teise minna. Koht-spetsiifilise rekombinatsiooni üks vormidest. See on seotud DNA kindlate järjestuste elementidega, mis ei ole väga väikesed. Järjestuse element, mis osaleb, koosneb 3-st elemendist – 2 kordusi sisaldav ja nende vahel on nt. geen. Ebasümmeetriline, esineb kindel orientatsioon. On pööratud, otsesed kordused, peegelkordused. Seal on nii kordused kui ebasümmetrilised kordusjärjestused. Selle koht-spetsiifilise rekombinatsiooni tulemusena võib toimuda insertsioon. Selle suund, mis pidi see element sinna satub, on määratud selle DNA-ga (mispidi kordusjärjestused).
Märklaudmolekulil ja mobiilsel DNA-l ei pea olema omavahelist homoloogiat. Rekombinatsioon toimub siis, kui on ulatuslik homoloogia, aga antud juhul ei pea olema. Võivad toimuda deletsioon ja insertsioon. Sõltub koht-spetsiifilise rekombinatsiooni järjestusest.
koht-spetsiifiline rekombinatsioon – DNA lõik pöördub ümber.
transpositsioon – ühe kindla struktuuri DNA lõik läheb ühest DNA molekulist teise. Esimesse võib alles jääda või lahkuda.
Kui transposoonid paljunevad, toimub koht-spetsiifiline rekombinatsioon – DNA-d jääb sama palju.
DNA struktuurid, mis on vajalikud konservatiivseks kohtspetsiifiliseks rekombinatsiooniks
osalevad järjestused:
1) 2 pööratud kordusjärjestust
2) krossingoveri piirkond, see, mis jääb pöördepunktide vahele
Rekombinaas
1. Ser-rekombinaas – tekib vahehühend, kus valgu O on seotud DNA 5’ P-ga. 3’ ots on nüüd vaba OH rühmaga, sarnaselt teise ahelaga. (salmonella rekombinaas, Tn 3 rekombinaas, Hin rekombinaas).
1 rekombinatsioon = 4 rekombinaasi molekuli, vaja teha 4 katket.
2. Tyr-rekombinaas – tekin üheahelaline katke, korraga vaja 2 Tyr rekombinaasi molekuli. ( Faag P1 Cre, E. coli, faag lambda integraas).
Kahel pool krossingoveri piirkonda on rekombinaasi äratundmisjärjestused.
Cre rekombinaasi äratundmismehhanism
Faagi P1 rekombinaas (Tyr). Tekib 2 Holliday kompleksi. Pärast ühe ahela vahetust toimub teine
Lambda faagi integreerimine peremehe kromosoomi
Kui rakk on nakatunud, siis DNA integreerub peremeesraku genoomi. E. coli-s on 1 lambda faagi integreerumissait. Bakteri integreerumiskoht, kuhu lambda integreeruks, koosneb kahest kordusest ja nende vahel olevast unikaalsest kordusest. Integreerumine peremeesrakku ja sealt väljatulek on väga täpselt reguleeritud. Tekib profaag.
nt. rekombinaas, mis on lambda integraas, on koht-spetsiifilist integratsiooni läbiviiv ensüüm – türosiin rekombinaas. Koos lisafaktoritega nt. E. coli-l IHF valk (integration host factor) ja cis valk osalevad integreerumises ja on vajalikud lambda faagi integreerumiseks.
Integraasil on 2 DNA-ga seondumise piirkonda. Üks on lambda integreerumissait, mis tugevdab integreerumist. Teine on DNA piirkonnaga seondumissait (vajalik, et tööle hakkaks). Mõlema saidi töötamiseks peab DNA kõverduma – võtma sisse kindla kuju. Selle kõverdumise teeb IHF valk. Lambda kasutab seda IHF-i, mis on E. coli-s olemas.
Esineb integraas või rekombinaas. Tal on mingis tsentris kindel seriin, kus on protoneeritud hapnik. Reageerib fosfaadiga nii, et DNA aela 5’ fosfaat on kovalentselt rekombinaasiga seotud. Prooton liigub 3’ O külge. 5’ otsa kaudu on DNA-st üks ahel seotud rekombinaasiga.
Seriini rekombinaas. Ja seal on teise DNA molekuli puhul samuti rekombinaas seotud. Selleks on vaja kahte kordusjärjestust. Seal peavad seonduma 2 rekombinaasi molekuli. Need järjestused on identsed järjestused. Vahepeal esinevad unikaalsed järjestused. Mõlemad rekombinaasid tekitavad kovatse sideme 5’ fosfaadi ja seriini jäägi vahele. DNA ei saa kuskile minna, siis vahetavad ahelad kohad ja uued ahelad ühendatakse omavahel. Neis tehakse valkude seondumise kohas (nende vahel) kaheahelaline katke. seriinis samuti O 5’ fosfaadiga, vesinik kantakse üle 3’ otsale ja toimub samuti protoneerimine. Erinevus – türosiini rekombinatsioonide puhul tekivad ahelavahetused selles staadimis, kui on ainult üheahelalised katked. Toimub ahela vahetus ja siis tekib katkemine teises ahelas ja siis ahelad vahetavad kohad. Teise ahela vahetuse, kui esimesed on juba vahetunud, katalüüsivad kas lisafaktorid, türosiin-rekombinatsioon ise või lisanukleaasid. Kui otsesed kordused, nende vahel on mingi DNA, siis rekombinatsiooni tulemusena tekib deletsioon. DNA piirkond kaob ära, deleteeritakse. Kui jälle on pööratud kordusjärjestused, siis DNA pöörab ennast ringi nt tekib inversioon. Pööratud kordusjärjestused – inversioon.
Lambda faagi tsükkel → lüütiline või lüsogeenne, viimane tähendab faagi DNA integreerunud peremehe kromosoomi.
DNA on lineaarne, otsad on komplementaarsed, kuid pole kovalentselt seotud.
Kromosoomil on kaks õlga, kus on valgud peremehe kromosoomi liitumiseks.
Xis-geen on lambda faagi väljalõikamise geen .
nt. esineb geen, mis takistab vähkkasvajate teket. Kui geen on kromosoomis (nagu nõel heinakuhjas). takitsab vähkkasvaja teket. Seda uuritakse rekombinatsiooni abil ja cre rekombinaas on väga hea ensüüm selleks. Ta tunneb ära kindla järjestuse, kus on pööratud kordused ja sellega seonduvad kordusjärjestused. Kasutab geneetilisel rekombinatsiooni. Mõte, et tekkis hiir ilma selle geenita. Kontrollida, kas ta ikka takistas vähkkasvaja teket. Kui viia rakku cre rekombinaas sisse, mis rekombineerib selle geeni välja. Deletsiooni tekkeks tuleb järjestust pöörata. Kui järjestused on ühtepidi, tekib deletsioon. Kokku 4 järjestust – 2 alguses, mille vahel mingi ala, geen, veel 2, mille vahel mingi ala. Äkki paneks cre saite erinevasse kohta genoomis.
Lümfotsüütiline spetsiifiline cre rekombinaas, mis avaldub ainult lümfotsüütides. Kui geen on Loc saitide vahel, siis lümfotsüütides hakkab avalduma cre rekombinaas – konkreetne geen kaob. Hiir sureb vähki.
IHF kõverdab DNA-d
- ei põhjusta DNA katkeid
- lambda integraasil on vaja ka kahte äratundmispiirkonda – on teineteisest kaugel. Kui IHF DNA kõverdub, satuvad lähemale.
Transposoonid on nii pro- kui eukarüootides, kõikides organismides erineval määral. Bakterites, pärmis on neid vähe. Väga levinud geneetiline element.
Drosophilas pisut rohkem kui pärmis, rohkem ka mittekodeerivat genoomi.
Taimedes ja imetajates rohkem kui 50% mobiilsetest keemilistest elementides on vaigistatud.
Inimesel ≈ 2% kodeerib valke, üle 50% transposoonidest pärinevad järjestused.
Isekas DNA – organism ise ei saa valida, vaid teeb, mida geen ütleb. Kui geen tahab paljuneda, siis organism teeb seda. DNA-d ei huvita organism, vaid lihtsalt tahab, et teda saaks palju (so mittekodeeriv DNA).
DNA transposoonid
tüüp
struktuuri iseärasus
mehhanism
näited
1. bakteri replikatiivsed
transposoonid
otsmised pöördkordused.
Transposaas ja
resistentsuse marker.
kopeeritakse koos
insertsioonidega
Tn3 faag
2. bakteri „lõika- kleebi “
transposoonid
sama eelmisega. Nt. AB
resistentsus, transpoaas
vajalik transposooni
liikumiseks
enne kui uude kohta
läheb, lõigatakse vanast
välja
Tn5; Tn10; Tn7;
IS91
3. eukarüoodi transposoonid
pöördkordused raamis-
tavad intronitega geene
„lõika-kleebi“
P element;
mAT perekond
Transposoonid:
- laialt levinud, kordusjärjestused on küllalt pikad. Esinevad otsimised kordused otsas. Viiruse saransed retroposoonid on transposoonid, mis käivad üle RNA – sisaldavad pöördtranskripttaasi, integraasi, viirussarnaste valkude geeni.
Eukarüootidel pole erinevalt bakteritest iseka DNA väljalõikamise mehhanismi.
Kui faag Mu tungib bakteritesse, siis ühe bakteri tsükli jooksul paljuneb faagi genoom mitusada korda.
PolyA retroposoonid oleks nagu RNA sarnane peremees - sisaldavad pöördtransferaasi. 3’ otsas on alati mingi järjestus.
Teine transposoonide klass on replikatiivsed transposoonid. Ei esine „lõika-kleebi“ mehhanism. Replikatiivsete transposoomide puhul DNA-d paljundatakse, transposoon jääb alles ja tekub uus uude kohta. Mehhanism sarnane. Esmalt ühinevad transposoonid, teevad struktuuri, kus nad ükstesega kokku puutuvad. Seonduvad otsmistele kordusjärjestustele selleks. Tekitavad üheahelalise katke. Teine ahelakatkestus teiste ensüümide puhul. Transposoon integreerub märklaudDNA-sse ja replikatiivses transposoonis tekib kointegraal, kus jaguneb ahel pooleks vesiniksidemete kohast ja sünteesitakse kogu transposoonile teine ahel. Ahelad lähevad risti-rästi, tuleb likvideerida.
Plasmiid võib kromosoomi seostuda nii, et temast kahele poole jäävad transposoonid. Replikatiivsete transposoonidega saab teha transpoosoonalaüüse (viia teisi geene sisse).
RNA vahendatud transport
Eukarüootide DNA-s on neid palju, imetajatel moodustuvad enamuse DNA-st.
Sarnanevad retroviirustega, nende genoomis alati pöördtranskriptaas, integraas ja rakupinna antigeen on alati peremehe spetsiifiline.
tüüp
struktuuri iseärasus
mehhanism
näited
viiruste sarnased
retrotransposoonid
250-600 bp LTR (otsesed
kordused); Int, Gag
Transkriptsioon vasakult
LTR promootorilt;
pöördtranskriptsioon ja
insertsioon
Ty (pärm), Copia
elemendid (Dras)
Poly(A)
retrotransposoonid
3’ A/T järjestus, 5’ UTR,
RNA siduv valk ja RTase.
Transkriptsioon sisemiselt
promootorilt, märklaud
initsieerib pöördtranskrip-
tsiooni
(endonukleolüütiline)
F ja G elemendid,
(Dras); LINE, SINE
elemendid, Alu
järjestus
Kui transposoon läheb raku sisse, on geen rikutud.
Poly (A) retrotransposoonide 3’ on AT rikas ala ja 5’ otsas ala, mida ei transleerita, kodeerivad valke, RNA siduv valk ja pöördtranskriptaas.
Retrotransposoonide geenid ei sisalda introneid.
Ilma introniteta pseudogeenide teket seostatakse retrotransposoonidega.
Lõika ja kleebi
Transpositsiooni algus: transposoon lõigatakse DNA-st välja ja hakkab sihtmärk DNA-d otsima → ühendatakse transposooni DNA 3’ otsad märklaud DNA-ga → tekib 2-st kohast katkestatud DNA molekul → katked sünteesitakse täis ja ligeeritakse kokku reparatsiooni ensüümiga → transposoon uues kohas ja transpositsiooni käigus sünteesitakse uut DNA-d, sest vana DNA ahelale jäävad kleepuvad otsad, mis on vaja kaotada.
Kui transpositsioon liigub mujale, jätab ta vanale kohale lühikese märklaud-järjestuse, milles indutseeritakse kordus.
Näide „lõika-kleebi“ transposoonist. Tekitab DNA-s spetsiifilisi katkeid. Mõlemast ahelast lõigatakse välja tekkivad tömbid katked. Mõlemas otsas 3’ →5’. Märklaud DNA-l jääb kummalegi poole üheahelaline osa – otstesse tulevad lisakordusjärjestused transponeerumise käigus. Transposaasid peavad mõlema otsmise kordusjärjestusega sobima. Tekkiv transposoon - kahel pool kordusjärjestustel valgud seonduvad üksteisega ja tekib DNA väljaulatumine. Transposaasid seonduvad. Tekivad alguses vabad polümeeraasad. Teist ahelat lõikab transposaas kummastki otsast ainult ühe ahela katki. Transposoonil tekivad esialgu vabad 3’ ja 5’ otsad. Et esiahelad katki ei läheks, vajatakse lisafaktoreid. Need 3’ ja 5’ otsad ligeeritakse omavahel – transposoon läheb siis teise molekuli. Märklaud DNA 3’ otsad tuleb polümeraasiga pikendada nii, et sinna saaks midagi - DNA sünteesitakse veelkord seal. Identsed DNA-d. See koht, kus oli transposoon, jäävad jäljed järele – kordused, mida transposoon tekitab tänu transponeerumise mehhanismile. Algusahel pannakse kokku.
Retroviirused
Retroviirused ja retroviirusesarnaseid transposoone on organismis väga palju. Kui retroviirusesarnased transposoonid on liikunud teise kohta, põhjustavad geneetilisi haigusi. Retroviirus koosneb vähemalt 3-st geenist. Retroviirus vajab paljunemiseks genoomi integreerumist. Tekib kaheahelaline retroviiruse DNA. Tal on oma nukleaasid, lõikab järjestused ära. Üleulatuvad 5’ otsad. Nendega on võimalik peremehe DNA-sse integreeruda. Retroviirused ja nendesarnased transposoonid on evolutsiooniliselt väga sarnased.
Genoomist väljatulekuks peab toimuma transkriptsioon. Retroviiruse DNA otstest lõigatakse ära 2 nukleotiidi nukleaasidega. Väikeste üleulatuvate otstega DNA on võimeline integreeruma peremeesraku DNA-sse. Läheb rakust välja ja nakatab teise organismi. Tehakse DNA uuesti, toimub transkriptsioon. Sarnane replikatiivse transposooni mehhanismile, kus ka kopeeritakse vastavat lõiku. Mobiilsete DNA elementide omavaheline suurus on erinev. DNA element, kas sattunud organismi mööda vertikaalset või horisontaalset teed. Kui on suguluses eellastega või horisontaalselt, paljud on võimelised liikuma nii.
Tn4 perekond transpositsioonil kontrollitakse üle RNA
- ühes otsas on transposaasi geen (mis on promootor) ja teisel ahelal on väljapoole promootor. Sisemiselt promootorilt sünteesitakse transposaasi ja teise pealt lühike osa, mis on komplementaarne transposooni 5’ otsaga. Kokku saades moodustavad 2-ahelalise RNA. Tekib inaktiivne kaheahelaline RNA. Transposoonid koordineerivad selle avaldumist. Rohkem avaldudes sünteesitakse komplementaarset DNA-d, mis surub maha transposaasi avaldumise.
- kontrollitakse transpositsiooni sagedust ja transposooni sees olevate geenide avaldumist
- transposaasi geeni avaldumisel tekib DNA-s katke
- transposoone on kõigis organismides erineval määral
- transposoonis on alati transposaasi geen ja teisi geene nt resistentsuse geen
- „lõika-kleebi“ transposooni otsad ligeeritakse liikumise ajaks kinni, kuid erinevast kohast.
- „lõika-kleebi“ lõigatakse välja mõlemad DNA ahelad (transposooni piirkond)
- replikatiivne rekombinatsioon – alguses lõigatakse 1 ahel, seejärel teine, kuid erinevast kohast.
- „Lõika-kleebil“ vahepeal otsad koos.
- replikatiivne transpositsioon – tekib transposooni osas (2 DNA ahela hübriidi), need on seotud mõlemasse DNA molekuli, tekib uus kaheahelaline DNA transposoon (st see paljuneb)
- „lõika-kleebi“ transposoone juurde ei teki
Geeni vahetus homoloogilise rekombinatsiooniga:
Bakterist ühe geeni eemaldamine. Hea oleks saada mutant, kus geeni puudub – selleks kasutatakse homoloogilist rekombinatsiooni. Võõras sissetunginud DNA lagundatakse ära – bakter kaitseb ennast. Bakteris on homoloogilise rekombinatsiooni tase seetõttu madal, ensüümide tase madal. Et seda tõenäosust tõsta, viiakse sisse lisakoopia rekombinaasi geeni, mis on üks spetsiifiline rekombinaas, mis väga suure sagedusega homoloogilist rekombinatsiooni kordab. 1000x suurendab sagedust. Kui see kaheahelaline DNA viia sellistesse bakteritesse, toimub homoloogilise rekombinatsiooniga insertsioon. Siis bakter asendab selle geeni mingi vanaga. Vana eemaldatakse ja sellest saadakse lahti. Markergeeniks sobib antibiootikumi resistentsus. Bakter ise ei ole resistentne, aga geen on. Bakterisse viiakse sisse rekombinaasi geen – spetsiifiline, mis tõstab homoloogilise rekombinatsiooni sagedust. Bakter muutub resistentseks antibiootikumi suhtes, aga ühtlasi kaotas ära geeni, mis oli sellel kohal enne
Replikatsiooni mehhanismi kasutamine
- saab kasutada GMO-de tekitamiseks (uurimustöö, tootmine). Hiired tehakse cre kombinaasiga, katked tekivad kahe cre järjestuse vahele. Cre calgu koespetsiifiline integreerimine.
- manipuleerimiseks viiakse hiire ES rakku (embrüonaalne tüvirakk ) konstrukt. Uuritavad geenid Loc saitidega. Lineaarne DNA sünteesitakse rakutuuma. Seal rekombineerub väga suure sagedusega. ES rakud on muutunud resistentseks genetsiini suhtes. Transformeeritud ES rakud süstitakse tagasi blastulasse, kus nad segunevad teiste olemasolevate tüvirakkudega. Tekivad kimäärsed hiired – sisaldavad mõlemat tunnust.
Immunoglobuliinide geenid ja nende rekombinatsioon
- imetaja on võimeline tootma 106 erinevat antikeha , millest igal peab olema oma geen
- Ig1 geene on vaid mõni tuhat
- esineb rakuline ja humoraalne immuunvastus (bakterid ja viirused)
- NH2 on antigeeni sidumiskoht
- IgM – 10%, IgO – üle 1%, IgG – 75%, IgA – 15%, IgE – alla 1% (kui IgE on rohkem, tekib allergia).
- ahelaid ( 2 rasket ja 2 kerget) ühendavad ja seovad S-S sidemed ja valgud
- kerged ahelad on kõigil samad, rasked ahelad on erinevad.
- Ig-de erinevus tuleneb erinevast monomeeride arvust
- antigeeni sidumine toimub raske ja kerge ahela aminoterminaalses otsas. Aminoterminus geeni 5’ otsas.
- S. Tonegawa avastas immuunoglobuliinid.
IgG skemaatiline struktuur
- koosneb ühesugustest valgudomäänide kordustest – domäänidest. Mõned on varieeruvad, mõned konstantsed.
- ühe klassi piires on kõik ühesugused (raske ahela konstantsed osad).
- Ig1 domäänid koosnevad antiparalleelsetest β-lehtedest (stabiilseim valgu struktuur, tünnilaadne). Lingud, mis sealt β-lehtedest välja tulevad, on erinevad.
- raskel ahelal on muutlikud ja konstantsed domäänid. Nende erinevus – β-kihtide vahel olevad lingud on varieeruva järjestusega, moodustab geeni äratundmiskoha.
Immuunvastus toimub klonaalse selektsiooni teel. Tuhandest geenus on vaja kokku saada miljon erinevat varianti.
IgI geenid
- Iga Ig1 perekond koosneb V geenist ja sellega seotud geenist.
- geeniks nimetatakse üht struktuurset üksust kodeerivat järjestust, ei ole ühes piirkonnas
perekond
V geenid
C geenid
kerge ahel
inimene / hiir
inimene / hiir
lambda
˂ 300 / 2
˃ 6 / 4
kappa
˂ 300 / 1000
1 / 1
raske ahel (α, eeta)
300 / ˃ 100
9 / 8
- Hiirel ja inimesel tuleb toota 106 erinevat antikeha.
- V – variaabel geenid
- C – konstantsed geenid
- antikeha tekib, kui veres on antigeen. Antikeha tekkeks peab antigeen minema rakku, kus see lagundatakse, tükid viiakse raku pinnale MHC kompleksiga.
- MHC on koesobivuskompleks klass. Esineb kõikide somaatiliste rakkude pinnal. Paljunema hakkavad lümfotsüüdid, mis on parimaks immuunvastuseks.
- 1 lümfotsüüt = 1 tüüpi antikeha
- spetsiifilisus tekib somaatilise rekombinatsiooni tulemusena
- J segment on variaabeli kõige varieeruvam koht
Lambda perekond
Konstantne osa (suurem enamus sellest geenist) ja teise osa (embrüonaalne) vahel on J-osa (join). Variaabelgeene on väga palju. J-segment on introni abil ühendatud konstantse osaga. Somaatiline rekombinatsioon toimub erinevalt (konservatiivne koht-spetsiifiline protsess, sünteesitakse mRNA).
leader → intron → variaabel → J segment → intron → konstant
- iga geen kodeerib pikka ja konstantset valgu osa
- lümfotsüüdis tekib V-J ühendus, … selle pealt sünteesitakse mRNA, mis läbib splaissimise.
- erinevates rakkudes võetakse juhuslikult 1V segment (V1, V2 või V3)
― v1 ― v2 ― v3 ― v4 ― v5 ― v… ―― J – S – E – G – M – E – N – T ― konstantne osa.
J- segmenti jääb ontogeneesi käigus vähemaks.
Tegemist on lambda perekonnaga. Ontogeneesi käigus toimuvad muutused, vahepealt DNA lagundatakse nii, et J-segmendi ette satub 1V segmentidest. DNA ümberkorraldus, toimub kui DNA lagundatakse ja järjestus muutub. Tekib V-J ühendus. V-J ühendust ei kontrollita täpselt, et lugemisraamid oleksid kohakuti, nad võivad olla eri lugemisraamides – tulemuseks apoptoos .
Variaabelotsi 300 järjest. 6 JC segmenti (iga konstantsel osal on J-segment juba küljes).
Gamma perekond
- 2, 3, 4 J-segmendid eemaldatakse mRNA tasemel. 1 J-segment jääb alles. RNA protsessimise aste on geeniavaldumise tase, kus tekib funktsionaalne geen.
~ Raskel ahelal on lisaks V, J … segmendile olemas ka D-segment (displaced) - hüpervariaabel - umbes 10 tk, J-te 4 tk. D-J ühendus ja V-D ühendus tekib koht-spetsiifilise rekombinatsiooni tagajärel . Ig geenid embrüos – embrüonaalses olekus V- segmente 300. Variaabeli segmente on üle 300, J-segmente 5 ja üks C-segment. Piisav selleks, et tekiks immuunvastus.
Kappa perekond
- V segmente on palju, J segmente (5tk, lambda ainult 1 J segment)
- embrüonaalse arengu käigus tekib ka VJ-ühendus, millele järgneb veel J segmente. Hiljem eemaldatakse premRNA-st splaissimise teel (mRNA tasemel)
- VJ- ühendus ei määra, milline valk tekib
- splaissimisega määratakse, millist J segmenti kasutatakse antikeha tootmisel
geen → Js1 → intron → Js2 → intron → jne
- erinevused tagab somaatiline rekombinatsioon ja alternatiivne splaissimine (tagab kerge ahela geeni tekke).
Raske ahela geenid:
- D segmente on 10 tk ja J segmente 4 tk
- seejärel V-D ühendus
- inimeses ≈ 300 lambda perekonda V geeni ja ˃ 6 J-C geeni
- ≈ 300 lambda perekonda V segmenti 1-5 J segment ja 1C segment (erinevad kombinatsioonid)
- boosting – immuunvastuse tugevnemine (mutatsioonide sündmus)
T-DNA
eriline somaatiline rekombinatsioon, taime ja temaga koos oleva mikroobi vahel. Taim kasvab seal, kus ei peaks (nt pole substraati); mükoriisa puhul seened aitavad (taim seenelt vett ja mineraalaineid, seen taimelt orgaanilisi aineid).
Nt Agrobacterium – koloniseerib taime juuri. Saadab oma DNA taimerakku, kus DNA hakkab taime instrueerima uute ühendite sünteesiks, mida tavaliselt taim ei tee. Bakteri annab osa plasmiidist, mis läheb peremeesraku tuuma, siseneb tema kromosoom ja hakkab seal paljunema. Vasakpoole järjestus jääb bakteri plasmiidi, parempoolne kordusjärjestus läheb taimeraku tuuma. Taim hakkab tootma nopaliin ja oktapiin (ained, mis on bakterile söögiks).
Ti-plasmiid sisaldab teisigi geene: osa DNA ülekandeks, osa juurdekasvu, osa võrsekasvu indutseerimiseks.
Ti – epikromosomaalne geneetiline element.
Oluline transgeensete taimede tegemiseks. Kui bakteri DNA siseneb, siis toimub konservatiivne koht-spetsiifiline rekombinatsiooni kaudu. Ühesuunaline protsess – läheb taime ja sinna jääb. Ainult üks DNA ahel kantakse üle. Ti-plasmiidi jääb kogu geneetiline info alles.
Ti- plasmiid Agrobacteriumist läheb taime genoomi, tekivad kasvajataolised moodustised, mügarad. Ti plasmiide on erinevat tüüpi. Määravad apiindide sünteesi (need on Arg derivaadid).
Nopaliin –aine, mis sunnib taime diferentseeruma.
T-regioon ühineb taime genoomiga.
Ti-plasmiidide geenid:
1. vir – DNA ülekanne taimele 2. shi – võrse areng 3. rai – juure areng 4. nos – nopaliini süntees
5. noc - nopaliini katabolism 6. ocs 7. occ 8. tra – baktereid transportiv geen
vir, shi ja rai on kõigis Ti-plasmiidides.
T-DNA bakteris ja taimes
Ti-plasmiid on bakteris kahe korduse vahel, kui kandub üle taimele, siis kordustest jääb vähe kordusi järele. Taimes Ti enam välja ei saa, sest pole enam kordusjärjestuste vahel st on ühesuunaline liikumine.
Immuunsüsteemist veel
Kuidas tekivad antikehad, mis tunnevad antigeeni ära veel täpsemalt? See tekib somaatiliste mutatsioonide tulemusena ühe geeni väga täpses piirkonnas. Ainult diferentseerunud B-lümfotsüütides. Mutatsioonid esinevad piirkonnas. Siin toimib DNA polümeraas II, mis on väga mutatsioonirikas.
Somaatiliste mutatsioonide karakteristikud
- see tähendab, kuidas tekivad paremad, veelgi spetsiifilisemad antikehad
- spetsiifiline antikeha tekib mutatsiooni tulemusena
- mutatsioon toimub teatud geeni piirkonnas, ainult diferentseeruvates B-lümfotsüütides, diferentseerumine toimub sõltuvalt luuüdis
- mutatsiooni teke sarnane immuunvastuse tekkele, samad tingimused. Vaja T-rakke ja interleukiine → rakud hakkavad jagunema ja paljunema
- mutatsioon toimub kindlas piirkonnas – nt raske ahela VDJ ühenduse piirkonnas.
- mutatsioonid esinevad ainult V; J; D piirkonnas
- mutatsioon bakteris tekib DNA polümeeri IV ja V abil
- inimesel on DNA polümeeri epsilon – pii abil (teised ensüümid ebatäpsed)
- mutatsiooni tekke piirkonda sünteesib DNA polümeer pii → tekib sageli mutatsioone, sest aegluse tõttu tekib palju vigu
Geenid ja evolutsioon
- evolutsiooniliselt kaugematel genoomidel on siiski lähedane arv geene nt nematood – 20 000, äädikakärbes 14 000, meritupp 15 000
- hulkraksetel on DNA-d rohkem, kodeeriv osa väike, valkude sünteesi määrav osa veelgi väiksem (inimestel alla 2%).
- liiliatel ja salamandritel on DNA-d ühe raku kohta kõige rohkem. (≈ 100x rohkem kui inimesel).
- äädikakärbes väga kompleksne organism, geenide arv ja liigi diferentseerumise aste pole kooskõlas.
- mudel-liigid – morfolooline-arenguline evolutsiooni puu.
- looduslik valik valib geenikomplektide alusel, millised geenid lähevad ja millised geenid jäävad. Genoomide alusel on võimalik uurida geneetilist sugulust. Kuigi organismid võivad olla võrdlemisi erinevad oma kompleksuse astmel, on neil enam-vähem sama arv geene. Välimuse erinevus saavutatakse kuidagi teistmoodi erinevalt. Arusaam evolutsioonis: geenides tekivad juhuslikud mutatsioonid, loodusliku valiku käigus genotüüpide alusel organismid paljunevad valikuliselt. Looduslik valik geenikomplektide alusel, millised geenid lähevad edasi ja millised jäävad.
Genoomide suurus
- kõige väiksemad genoomid on endosümbiontsetel bakteritel. Carsonella rudii 160 kb (kõige suuremate viiruste genoomid on pea 10x suuremad kui sellel), Buchnera aphidicola 422 kb
- osa geene on „ümber kolinud“ peremehe kromosoomidesse
Mudelliigid: nematood, äädikakärbes/ puuviljakärbes, kerakala, hiir
Geenide homoloogia alusel saab teha geeni puid.
Globiini geenid on tekkinud on tekkinud duplikatsioonide tagajärel. On selgunud, et β-globiinid on tekkinud ühest ja samast eellasest. Et saaks uus geen tekkida, peab ta enne duplitseerima.
Morfoloogia mitmekesisuse tekitamiseks mustrit määravad geenid. Need võivad olla kas transkriptsioonifaktorid või – repressorid. Tavaliselt on seotud transkriptsiooniga ja selle reguleerimisega, kas positiivse või negatiivse reguleerimisega. Koertel geenid väga sarnased, erinevused just nendes transkriptsiooni regulatsiooni määravates geenudes. Neil ei ole kuigi olulist geneetilist erinevust. Kokku geeni duplitseerimise teel on tekkinud suur rida geene.
Äädikakärbse areng kärbsevastsest. Vastne paistab vähediferentseerunud, aga ikkagi lülideks avalduvad erinevad geenid. Mitmete kärbse organite eellasrakud on seal olemas. Et kust areneb silm, kust jalg. Kui ühte geeni, mis on oluline silma arenguks, sundida avalduma jala imaginaardiskil (lülis), siis on kärbestel silmad ka jalgadel. Kõik geenid on olemas, aga avalduvad erinevalt. Äädikakärbest on palju uuritud. Kärbse vastse uurimisel on leitud, et silma arengut määrab Pax6, oluline on tema avaldumise koht embrüos. Kui seda ühte geeni, mis on oluline silmaarengus (transkriptsioonifaktor), sundida avalduma, vahetades ära tema regulatoorse elemendi, siis on kärbsel silmad jalgadel.
Geneetilise võimendi (enhanceri – koosneb tavaliselt pööratud kordusjärjestustest) tähtis osa geeni avaldumise msutris. Üks geen võib avalduda täiesti erinevas kohas, selleks pole dramaatilisi muutusi vaja. Geeni võimendi on natukene muutunud. Selleks, et toimuks evolutsiooniliselt oluline muutus, ei toimu geenis endas, vaid tema regulatoorses osas. Muutus võib toimuda nii transkriptsioonifaktoris, aga ka selle märklaudgeenis.Olenevalt lacZ võimendist, asukohast, järjestustest on afiinsus ja sellest tingituna määratakse geeni avaldumise koht lokaalselt organismis. Mutatsioonid mõjutavad ja võivad tekkida ka repressori seondumiskohal. Geen on samasugune, aga võimendi on natukene muutunud. Geeni oluliseks muutuseks ei pea geen muutuma, vaid nt tema regulatoorne osa.
Hox geenide avaldumine kärbses ja hiirel. Lülid , milles avalduvad samasugused geenikomplektid. Molekulaarne alus võib olla seotud Hox geenide avaldumise mustris. Imetajal on 2x rohkem geene kui putukal, on nende Hox geenide järjestus genoomis väga sarnane ja nende avaldumise muster ka küllaltki sarnane. Imetajal kõht allapoole ja putukal kõht ülespoole. Siis morfoloogilised elemendid satuvad kohakuti. Ka imetajatel on lüliline struktuur, milles avalduvad samad geenikomplektid embrüo staadiumis. Selle sarnasuse molekulaarne alus võib olla seotud Hox geenide avaldumise mustris. Need geenid vaatamata sellele, et imetajal on palju rohkem geene, on nende Hox-geenide järjestus genoomis mõlemal väga sarnane ja nende avaldumise muster on ka väga sarnane, mis viib ühesuguse tulemuseni.
Geeni puu (FGF)
- organismide keerulisemaks muutudes geenid duplitseeruvad, neid saab rohkem
- FGF – fibroblast growth factor- fibroplastide kasvufaktor – geenid, mis määravad kehaplaani, toimivad võrdlemisi varajases arengus ja täiskasvanul avalduvad sama komplekt geene, pole geneetilist erinevust
- punane → meritupel olev FGF-d, tal on 6 FGF geeni.
- inimesel ja hiirel on 22 FGF geeni.
- näiteks on erinevad saba segmentide kaupa represseerumisel, kellel on repressor 8 lülis ja kellel mitte. Saba tekib 8-st lülist, on selle derivaat. Kui repressor represseerib, siis ei teki.
Globiini geenid on tekkinud duplikatsioonide tagajärjel
- loote veres on hapnikku vähem, kui sellel organismil, kes ise hingab st loote hemoglobiin peab hapnikku paremini siduma.
- epsilon globiin – loote hemoglobiin
- lambda hemoglobiin – üleminek, loote sünd
- β globiin – inimene
- võib muutuda ka regulaatorgeen, mis hakkab nüüd reguleerima teisi geene.
- alleelide regulatsiooni tase, nt isoensüümid
- odasaba – erinevates segmentides (lülides) avalduvad eri geenid eri tugevusega
- Pax61 geen – silmageen, avaldub rakkudes, millest tekib liitsilm. Kui pax61 geen panna jalgade arengut määrava geeni asemele, siis jala peal on silm st geeni ümbertõstmisel on tulemused dramaatilised organismi tasemel (äädikakärbes).
- võimendid on olulised geeni ekspressiooni mustri avaldumisel, ta võimaldab paremini kontrollida geeni mustri avaldumist.
- kui on kõrgema afiinsusega transkriptsiooni aktiveeritud sidumiskohad, siis on teatud rakkude hulk suurem.
- selleks, et saada keerulist ja komplekset organismi, ei pea olema palju geene. Loevad geeni regulaatorid, aktivaatorid, võimendid.
Box geenide avaldumine äädikakärbsel ja hiirel
- selgroogne justkui „tagurpidi“ putukas
- box geenid (homeaatilised) määravad ära, milline geenikomplekt avaldub vastavas kehasegmendis
Inimese kõnet määrav geen FOXP2
- leidub ainult see üks geen
- annab võime kõnelda ja teha muid häälitsusi
- FOXP2 geen on olemas erinevates organismi rühmades, on suure tõenäosusega transkriptsiooni aktivaator
- inimesel on 2 mutatsiooni ja see rikub ära aktivaatori, geenid avalduvad rakkudes, mis on osalised kõri ehituses.
- võrreldes ahviga, on inimese kõri rohkemate lihaste kontrolli all.
- FOXP2 geen määrab ära linnul laulu õppimisvõime – lisaks geenile on vaja ka magada – kuulamise ja õppimise vahel on vaja magada.
- lind õpib ainult teatud vanuses, hiljem mitte, sest laulu õppimise geenid ei avaldu enam
- inimese kõne on sarnane, kuid erinevus seisneb selles, et lind õpib jäljendama ka inimese häält (õpib kordama häält). Inimene õpib kordama samu liigutusi jmt. st püüab jäljendada teisi (miimika). Rääkima õpib hiljem.
- kui geen on mutantne, siis linnud ei suuda laulu tervenisti ära õppida või ei õpi üldse.
- kui FOXP2 järjestust võrrelda inimesel, šimpansil ja hiirel, siis järjestuste erinevused on väga väikesed.
„Inimlikkuse“ geen
- -genoomi piirkond, mis on imetajatel konserveerunud, kuid erineb oluliselt inimesel võrreldes inimahviga
- HAR1 regioon (human accelerated region) 18 mutatsiooni piirkonna kohta (norm 0-1)
- HAR1F kodeerib väikest RNA-d ja ekspresseerub arenevas neokorteksis, migreeruvates neuronites
- avaldub ka testistes ja ovaarimus (tavapärane neuronigeenide puhul).
- migreeruvad neuronid – moodustavad neurokorteksit – neuronid, mis migreeruvad aju pinnale, on kõrgema närvitalitlusega seotud. Väga spetsiifiline neuronites. Aju erineb nt šimpansi ajust oma pinna tõttu, suuraju pinna koor.
97