Mikroobifusioloogia (0)

4Mikroobifüsioloogia LOMR.03.022
Riho Teras

Sisukord

1. Bakterite kasv ja toitumine 4
1.1. Bakterite kasvatamine laboritingimustes 4
1.2. Elutegevuseks vajalikud elemendid 7
1.3. Söötmed bakterite kasvatamiseks laboris 9
1.4. Füüsikalis-keemilised tegurid, mis mõjutavad bakterite kasvu 10
2. Bakterite ehitus ja rakustruktuuride funktisoonid 15
2.1. Tsütoplasma komponendid 16
2.1.1. Nukleoid 16
2.1.2. Tsütoplasma ja inklusioonkehad 19
2.2. Rakuümbrise komponendid 20
2.2.1. Periplasma 20
2.2.2. Peptidoglükaan 21
2.2.3. S-kiht 22
2.2.4. Kapsel 22
2.2.5. Välismembraani vesiikulid 23
3. Bakterite membraanid 25
3.1. Tsütoplasmamembraan 25
3.2. G(-) bakterite välismembraan 28
4. pH homöostaas 33
4.1. Mehhanismid , mille abil hoiavad bakterid tsütoplasma pH-d stabiilsena 34
4.1.1. Tsütoplasma pH reguleerimine prootonite transportimise abil. 36
4.1.2. Prootonite tarvitamine või genereerimine metaboolsete ensüümide abil. 37
4.1.3. Passiivsed mehhanismid, mis toetavad pH homöostaasi 38
4.2. Ekstremofiilide kohanemine pH-ga 39
5. Bakterite koordineeritud metabolism 41
5.1. Metabolismi regulatsioonietapid 42
5.2. Süsiniku transpordi ja katabolismi regulatsioon 44
5.3. Energia metabolism 47
5.4. Lämmastiku transport ja metabolism 48
6. Energia tootmine 50
6.1. Substraatne fosforüülimine 51
6.2. Oksüdatiivne fosforüülimine 53
6.2.1. Escherichia coli hingamisahel kui mudel 54
6.2.2. Alternatiivsed komponendid 57
6.2.2. Bakterite ebatavalised hingamisahelad 60
8. Transkriptsiooni reguleerimine 68
7.1. RNA polümeraasi ehitus 70
8.2. Sigma faktorid ja promootorite konsensused 70
8.3. Transkriptsiooni reguleerimine 73
8.4. Geenide organiseeritus 76
9. Globaalne transkriptsiooni regulatsioon 77
9.1. Geenide asukoht kromosoomis – globaalse regulatsiooni 1. aste 77
9.2. DNA superspiralisatsioon – globaalse regulatsiooni 2. aste 79
9.3. Alarmoonid – globaalse regulatsiooni 3. aste 82
11. Bakterite programmeeritud surm 92
11.1. Toksiin -antitoksiin süsteemid 93
11.1.1. MazEF-süsteem 94
11.2. Rakukesta lagundamisega seotud lüüs 94
11.2.1. Faagide põhjustatud lüüs 94
11.2.2. Bakterite peptidoglükaani hüdrolaasidega vahendatud suitsiid 95
11.3. Hingamisahela blokeerimine ja ROS 97
12. Konjugatsioon 99
12.1. Konjugatsiooni etapid 100
12.1.1. Plasmiidide klassifikatsioon konjugatsiooni seisukohast 102
10.1.2. Tüüp IV sekretsioonisüsteem 104
12.1.3. Relaksosoom 107
13. Bakterite transformatsioon 108
13.1. Transformatsiooni esimene etapp – DNA kinnitumine rakule, sisenemine rakku 109
13.2. Transformatsiooni teine etapp – võõr-DNA integreerimine genoomi 110
13.3. Transformatsiooni tähtsus bakteritele 111
13.4. Bakterite kunstlik transformatsioon 111
13.5. Teised metoodikad bakterite kunstlikuks transformatsiooniks 114
14. Biofilm 114
12.1. Biofilmi uurimise ajalugu 115
12.2. Biofilmi tähtsus bakterile 116
14.3. Biofilmi struktuur ja moodustumine 116
14.4. Biofilmi moodustumiseks vajalikud polümeerid 118
14.5. Biofilmi kesksed signaalrajad 123
14.6. Biofilmi maatriks 125
14.7. Biofilmi resistentsus 126
14.8. Biofilmi tähtsus inimesele 126
15. Bakterite hulgatunnetus 128
15.1. Hulgatunnetuse signaalmolekulid ja sensorsüsteemid 129
15.2. AHL ja AI-2 biosüntees 132
15.3. Hulgatunnetus ja bakterite biofilm 134
15.4. Hulgatunnetuse tähtus bakterite patogeneesis 135
15.5. Liikide ja domeenidevaheline hulgatunnetus 138
16. Taim- bakter interaktsioonid – endofüüdid 139
16.1. Mõiste „endofüüt“ 140
16.2. Endofüüdid 140
16.3. Endosfääri koloniseerimine 141
16.4. Endofüütide toime taimele 142
16.5. Endofüütide genoom võrreldes teiste bakteritega 145
16.6. Inimese patogeenid ja kommensandid endofüütidena 146
Füsioloogia on bioloogia teadusharu , mis uurib elutegevuseks vajalikke protsesse ja funktsioone, mis võimaldavad organismil kasvada ja paljuneda. Mikroobifüsioloogia on füsioloogia haru, mille uurimisobjektiks on mikroorganism . Käesolev loengusari keskendub eubakteritele.

1. Bakterite kasv ja toitumine

Raku kasv on bakteriraku kõigi füsioloogiliste protsesside koosmõju, see on keerukas protsess, mis hõlmab:
1. toitainete sisenemist rakku;
2. toitainete muutmist energiaks ja elava raku koostisosadeks;
3. raku massi ja mahu suurenemine;
4. kromosoomi replikatsioon ;
5. bakteriraku jagunemine kaheks tütarrakuks, mis mõlemad sisaldavad genoomi koopiat ja raku osiseid.
Kasv on raku koostisosade kvantitatiivne suurenemine. See sõltub bakteri võimest üles ehitada keskkonnas olevate toitainete abil raku koostisosi. Enamikel bakteritel hõlmab kasv raku-massi suurenemist ja ribosoomide sünteesi, mis päädib kromosoomi duplitseerumisega, uue raku-seina ja tsütoplasmamembraani sünteesiga ning tütarrakkude vahel kromosoomi ja raku koostis-osade jagunemisega. Lõpptulemusega toimub raku jagunemine. Ajaintervalli, mis jääb kahe jagune- mise vahele, nimetatakse generatsiooniajaks. Generatsiooniaeg võib olla väga erinev. Näiteks Escherichia coli generatsiooniaeg glükoosi minimaalsöötmel võib olla 15 minutit. Samas mõnel patogeenil võib generatsiooniaeg ulatuda päevadeni.

1.1. Bakterite kasvatamine laboritingimustes

Laboris on enim levinud bakterite kasvatamine suletud süsteemides, mis tähendab, et bakterite söötmesse ei lisata täiendavaid toitaineid kasvatamise käigus. Suletud süsteemis bakterite kasvatamise korral inokuleeritakse steriilne sööde teatud arvu bakterirakkudega ning jälgitakse bakterite arvukuse muutu teatud aja perioodil. Saadakse bakterite kasvukõver.
Bakterite arvukust võib mõõta mitmel moel, kuid kõigil meetoditel on iseloomulikud puudused, mistõttu bakterite kasvukõver on tinglik .
Meetod
Kasutusala
Kommentaarid
Mikroskoopimine
Bakterite loetlemine toiduainetes ja vaktsiinides
Ei erista elusaid ja surnuid rakke
Elusrakkude loetlemine (kolooniate kaudu)
Bakterite loetlemine mitmesugustest proovidest (toiduained, keskkonnaproovid, laborikultuurid jne)
Tundlik söötmekomponentidele ja kasvatamistingimustele (1 rakk ei võrdu alati 1 kolooniaga)
Valguse neeldumise mõõtmine
Bakterite arvukuse määramine mitmesugustest vedelikest sh söötmetest
Kiire ja mugav meetod, kuid ei suuda mõõta 12. Kui neutro- ja atsidofiilidel on tsütoplasma pH kõrgem ümbritseva keskkonna pH-st, siis alkalofiilidel on tsütoplasma pH keskkonna pH-st madalam.
Organism
Alumine pH
Optimaalne pH
Ülemine pH
Thiobacillus thiooxidans
0.5
2.0-2.8
4.0-6.0
Sulfolobus acidocaldarius
1.0
2.0-3.0
5.0
Bacillus acidocaldarius
2.0
4.0
6.0
Zymomonas lindneri
3.5
5.5-6.0
7.5
Lactobacillus acidophilus
4.0-4.6
5.8-6.6
6.8
Staphylococcus aureus
4.2
7.0-7.5
9.3
Escherichia coli
4.4
6.0-7.0
9.0
Clostridium sporogenes
5.0-5.8
6.0-7.6
8.5-9.0
Erwinia caratovora
5.6
7.1
9.3
Pseudomonas aeruginosa
5.6
6.6-7.0
8.0
Thiobacillus novellus
5.7
7.0
9.0
Streptococcus pneumoniae
6.5
7.8
8.3
Nitrobacter sp
6.6
7.6-8.6
10.0
Kohanemine keskkonna temperatuuriga
Mikroorganismid on võimelised kasvama sisuliselt kõikjal, kus leidub vett vedelal kujul, sõltumata temperatuurist. Seega bakterid võivad kasvada keskkonnas, mille temperatuur kõigub -20 kuni 120 C. Vastavalt temperatuurioptimumile jaotatakse bakterid kolme peamisesse rühma: psührofiilid, mesofiilid ning termofiilid. Mesofiilideks nimetatakse baktereid, mille kasvuoptimum on eukarüootide kehatemperatuuri sarnane, umbes 37 C. Baktereid, mille kasvuoptimum on 50 – 60 C, nimetatakse termofiilideks. Hüpertermofiilidel on kasvuoptimum 85 C juures ning nad taluvad kuni 120 C. Psührofiilideks nimetatakse baktereid, mis on võimelised kasvama 0 C juures, kuigi kasvuoptimum on 5 – 10 C. Psührotroofideks nimetatakse baktereid, mis on võimelised madalal temperatuuril kasvama, kuid kasvuoptimum on sarnane mesofiilsetele bakteritele.
Psührofiilid on kohastunud madalal temperatuuril kasvama, muutes membraani koostist voolavamaks. Psührofiilide membraan koosneb peamiselt küllastumata rasvhapetest, mis langetab membraani tardumistemperatuuri. Mõnel psührofiilil, eriti iseloomulik Antarktika liikidele, on membraanis polüküllastumata rasvhapped , mis pole prokarüootidele iseloomulikud rasvhapped. Küllastumata rasvhapete küllastumisel membraani tardumistemperatuur tõuseb ning membraan on voolav kõrgemal temperatuuril nagu mesofiilidel. (Taimeõlid on rikkad küllastumata rasvhapete poolest, või küllastunud rasvhapetest. Sellest johtuvalt on õli toatemperatuuril vedelas olekus, või tahkes.) Psührofiilidele on iseloomulikud ensüümide madal temperatuurioptimum. Nende ensüümid on aktiivsed ka 0 C ümber, samas kui toatemperatuuril need ensüümid pole aktiivsed.
Termofiilid on kohanenud elama kõrgemal temperatuuril kui 60 C. Nende membraan on küllastunud rasvhapete rikas. Ekstremofiilide membraan ei koosne tavapärastest esterlipiididest vaid eetersideme abil ühendatud fütanüülist ja alkoholist. Fütanüülradikaal koosneb küllastunud isopreenide kordustest, kus iga 4. süsiniku küljes on metüüljääk, mis takistab fütanüülradikaali liikuvust ning seega muudab lipiidkihi kõrgel temperatuuril stabiilsemaks. Termofiilsetel arhedel on membraan kahekihiline sarnaselt eubakteritele. Ekstremofiilsetel arhedel on membraan ühekihiline, koosnedes C40 isoprenoid atsüüljääkidest, mis on mõlemalt poolt seotud alkoholiga eetersidemete abil. Arhed ei suuda nii kergesti reageerida temperatuurimuutustele kui eubakterid. Samas on leitud, et Thermoplasma’l ja Sulfolobus solfataricus’el suureneb tetraeetrilises lipiidis tsükleerumine vastusena temperatuuri tõusmisele. Näiteks 40 C juures kasvades on rakumembraanis tsükleerimata : monotsüklilisi : bitsüklilisi tetraeetrilisi lipiide vahekorras 62 : 37 : 1, kuid 60 C juures tõuseb tsükleerunud tetraeetriliste lipiidide osakaal 25 : 50 : 24. Lipiidide tsükleerumine suurendab membraani termostabiilsust.
Vee kättesaadavus
Vesi on solvent , milles on lahustunud eluks vajalikud toitained . Seetõttu on vesi oluline faktor, mis mõjutab bakterite kasvu. Vee kättesaadavus rakkude jaoks sõltub õhuniiskusest või olemasolust lahustes. Vee kättesaadavus bakterite jaoks sõltub vee aktiivsusest (AW) ehk sellest kui palju on vees lahustunud aineid ( soolad , suhkrud jne). Vee aktiivsus on suhtarv, mis leitakse, jagades vesilahuse kohal oleva veeauru osarõhu destilleeritud veeauru rõhuga, mis on mõõdetud samal temperatuuril. Destilleeritud vee AW = 1 ja veemolekule mittesisaldava aine AW = 0. Seega, mida rohkem lahustunud aineid vesi sisaldab, seda vähem saavad bakterid vett kätte. Mikroorganismid suudavad elada keskkonnas, mille AW jääb vahemikku 0,7 – 1,0. Inimese vere AW = 0,99; merevee AW = 0,98; vahtrasiirupi AW = 0,90; põllumajandusmaadel on pinnase AW = 0,9 – 1.
Kuna nende keskkondade, kus bakterid elavad, vesilahuste ainsaks ühiseks soolaks on NaCl, siis väljendatakse bakterite taluvust kättesaadavale veele NaCl vesilahuste kaudu. Bakterid, mis vajavad kasvuks NaCl nimetatakse halofiilideks. Nõrgalt halofiilid vajavad kasvuks 1 – 6% NaCl lahust, keskmised halofiilid 6 – 15% NaCl lahust ning ekstreemsed halofiilid 15 – 30% NaCl lahust. Bakterid, mis suudavad kasvada nõrgas soolalahuses, kuid kõige kiiremini kasvavad soolavabas keskkonnas, nimetatakse halotolerantideks. Kserofiilideks nimetatakse organisme, mis elavad ja kasvavad kuivas keskkonnas ( kuivus on tekkinud vee puudumisest, mitte AW väikesest näitajast).

2. Bakterite ehitus ja rakustruktuuride funktisoonid

Prokarüootide rakk jagatakse tavaliselt kolmeks funktsionaalseks osaks:
1. tsütoplasma, mis koosneb nukleoidist, ribosoomidest ja inklusioonkehadest
2. rakuümbris, mis koosneb tsütoplasmamembraanist, rakukestast ning kapslist
3. jätked, mis on viburid ja mitmesugused piilid
KomponKomponent
Funktsioon
Peamine koostisosa
Tsütoplasma
Tsütoplasmamebraan
Selektiivne barjäär, ainete transport, energia tootmine.
Fosfolipiidid ja valgud
Ribosoomid
Translatsioon
RNA ja valgud
Inklusioonkehad
Sageli toitainete talletamiseks
Varieeruv , süsivesikud, lipiidid , valgud, anorgaanilised ained
Nukleoid
Geneetilise info kandja 
DNA
Plasmiidid
Kromosoomiväline geneetilise info kandja
DNA
Rakuümbris
Periplasma
G(-) bakteritel, metabolism, vahendada substraatide transporti, kemotaksist, sekretsiooni
Annab bakterile plastislisuse
Peptidoglükaan, mitmesugused valgud, substraadid jne
Peptidoglükaan
G(+) võib olla ainuke tsütoplasmast väljaspool olev raku osa.
Kaitse osmoose rõhu vastu, raku terviklikkuse hoidmine.
Peptidoglükaan
Välismembraan
Selektiivne barjäär, kaitse, transport
Fosfolipiidid ja lipopolüsahhariidid, valgud
Vesiikulid
Patogenees , rünnak, kaitse antibiootikumide vastu
Välismembraan + periplasma osised
S-kiht
Kaitse pH šoki vastu, virulentsus , kaitse fagotsütoosi vastu, adhesioon
Peamiselt valgud ja glükoproteiinid
Kapsel
Pinnale kinnitumine; kaitse fagotsütoosi vastu,
Patogenees,
Toitainete varu,
Kaitse kuivamise eest
Tavaliselt polüsahhariidne,
vahel valguline
Jätked
Vibur
Ujumine , voogamine
valgud
Sugupiili
Vajalik DNA ülekandeks konjugatsiooni ajal
valgud
Fimbriad
Pinnale kinnitumine, biolfilmi moodustumine, piili-tõmbumine
Valgud

2.1. Tsütoplasma komponendid

2.1.1. Nukleoid

Prokarüootidel puudub tuum, siiski prokarüootidel on kromosoomne DNA mingil määral pakitud ning seda nimetatakse nukleoidiks. Enamike bakterite kromosoom on tsirkulaarne. Tsirkulaarsele DNA-le on iseloomulik superspiraliseeritud olek, mis lihtsustatult tähendab tsirkulaarsele DNA-le vintide pealekeeramist. Tavaliselt on bakteri DNA negatiivselt superspirali-seeritud, positiivne superspiralisatsioon on iseloomulik ainult spooride DNA-le või lokaalselt vaigistatud DNA-le. DNA superspiralisatsiooni tulemusena pakitakse DNA lingudena 1000 – 10 000 korda kokku. Bakteritel osalevad nn histoonilaadsed valgud ehk nukleoidi moodustavad valgud DNA pakkimisel, et muuta rakus olev kromosoom kompaktsemaks. Arvatakse, et lisaks histoonilaadsetele valkudele aitavad nukleoidi pakkida veel aminorühmadega molekulid (NH2) nagu spermidiin. Nii histoonilaadsed valgud kui spermidiin on positiivselt laetud ning vähendavad DNA negatiivset laengut. Valkude abil pakitakse kromosoom kokku u 1000 linguks. Nukleoidi hulka kuulub veel RNA. Bakteri kromosoom on valkude vahendusel kinnitunud tsütoplasmamebraanile. Kinnitumine abistab kromosoomi segregeerumist tütarrakkudesse.
Kromosoom on bakteritel erineva pikkusega. On täheldatud, et parasiitsetel ja sümbiontsetel bakteritel on väiksem kromosoom kui vabalt elavatel bakteritel. Näiteks
Pseudomonas putida mullabakter 6 181 863 bp 5516 geeni
Escherichia coli soolestiku kommensant 4 639 211 bp 4279 geeni
Helicobacter pylori imetajate mao patogeen 1 667 867 bp 1576 geeni
Mycoplasma genitalium imetajate patogeen 580 074 bp 480 geeni
Kromosoomi struktuur ja pakitus sõltub bakteri kasvukiirusest. Kui E. coli kasvab kiiresti ning rakk sisaldab 4 – 8 kromosoomi, on kromosoomne DNA tugevasti pakitud ning DNA lokaalne super-spiraliseeritus varieerub tugevasti. Samas aeglaselt kasvavates rakkudes, kui bakteris on 1 – 2 kromo-soomi, pole kromosoom tugevalt pakitud ning on suhteliselt struktuuritult üle kogu tsütoplasma.
Kromosoomi tihedus pole rakus ühtlane, vaid väheneb pooluste suunas. Kromosoom on tihedaim keskelt ning hõredaim otstest . DNA kondenseeritus muutub ka rakutsükli jooksul, ühe jagunemise ajal võib toimuda mitu kromosoomi kondenseerumist ja dekondenseerumist. Arvatakse, et replikatsiooni initsieerimisel on E. coli’l kromosoomi origin ja ter-piirkond raku keskel, replikatsioo-ni käigus liiguvad originid bakteri terminustesse ning keskele jäävad ter järjestused, millele järgneb raku jagunemine. Osa baktereid reorganiseerib origini asukoha kahe replikatsiooni vahel, osa mitte. Näiteks E. coli origin liigub kahe replikatsiooni vahel raku keskossa, samas Caulobacter crescentus’el on origin alati ühe pooluse pool.
Lisaks kromosoomsele DNA-le on bakteril veel DNA-sid, mis on keskkonnaga kohanemise seisukohalt olulised – plasmiidid. Üldiselt peetakse plasmiide eluks mittehädavajalikeks. Plasmiidid aitavad koha-neda teatud keskkonnatingimustega ning üldiselt plasmiidid ei sisalda elutegevuseks hädavajalikke geene nagu näiteks ribosoomide geene. Plasmiidi ja kromosoomi mõiste võib olla hägune, sest üle 400 kb suurused plasmiidid sisaldavad ka ribosoomide geene ning pole konjugeeritavad.
Nukleoidi moodustumisel mängivad histoonilaadsed valgud olulist rolli. Need valgud seonduvad DNA-ga kolmel erineval moel: DNA-d painutades, mähkides DNA enda ümber või seondudes korraga kahe-le DNA järjestusele sildu moodustades. Kuna histoonilaadsed valgud seonduvad DNA-ga, siis neil on bakteri jaoks kahetine roll – pakkida DNA-d ning reguleerida geenide transkriptsiooni. Üldiselt on his-toonilaadsed valgud globaalsed transkriptsiooniregulaatorid, kuna nende seondumiskohti on bakteri genoomis palju. Histoonilaadsete valkude hulk pole E. coli’s konstantne , nende ekspressioon sõltub rakkude kasvukiirusest ning sellest johtuvalt on DNA struktuur ka erinev. Eksponentsiaalses kasvufaasis on E. coli’s peamiselt Fis, HU, StpA ja H-NS, statsionaarses kasvufaasis aga: Dps, IHF, HU ja StpA.
Valk
DNA mähkimine
DNA sildade loomine
DNA painu-tamine
Seondumis-järjestus
Molekulmass
Protomeer
HU
+
-
+
AT-rikas
9 kDa
Homo- või hetero -dimeer (HU-HU)
Lrp
AT-rikas
18 kDa
Homodimeer
MukB
Pole teada
175 kDa
Homodiemeer
Fis
+
+
+
AT-rikas
11 kDa
homodimeer
H-NS
-
+
-
AT-rikas
15 kDa
Homodimeer või heterodimeer StpA-ga
IHF
-
-
+
AT-rikas
11 kDa
Heterodimeer (IHF-IHF)
Dps
Pole teada
19 kDa
Monomeer või dodekameer
StpA
AT-rikas
15 kDa
Homodimeer või heterodimeer H-NS-ga
CbpA
Paindunud DNA
33 kDa
Homodimeer või heterodimeer CbpM-ga
CbpB
Paindunud DNA
33 kDa
monomeer
H-NS (inglise keeles histone-like nucleoid-structuring) on mittespetsiifiline transkriptsiooni repressor . H-NS-i homoloogid (sarnase funktsiooniga, järjestus pole sarnane) ja ortoloogid (järjestu-selt sarnased, sama funktsioon) on väga levinud bakterite hulgas. Tõenäoliselt ongi konserveerunud funktsioon siduda DNA-d valguliste sildade abil, mitte aminohappeline järjestus. H-NS seondub superspiraliseeritud DNA-le, tal pole väga tugevalt konserveerunud DNA järjestust, millega valk seonduks. Eelistab AT-rikast järjestust. Aminohappelise sarnasuse tõttu võib moodustada StpA-ga või teiste sarnaste valkudega (plasmiidilt kodeeritud Sfh) heterodimeere. StpA-l on H-NS-le sarnane funktsioon rakus. Arvatakse, et H-NS-i homodimeer ja heterodimeer reguleerivad geene erinevalt.
HU (inglise keeles heat unstable protein ) on heterodimeer, mis koosneb HU ja HU subühikust, mis on omavahel 70% ulatuses identsed. E. coli’s võib HU olla nii homo- kui ka heterodimeerina, mis sõltub raku kasvukiirusest. HU võib multimeriseeruda ning nii mähkida DNA enda ümber kui ka painutada DNA-d. Pseudomonas putida’l on kolm HU subühikut, mis võivad sama moodi moodustada hetero- või homodimeere. P. putida kõigi kolme HU geeni deleteerimine on rakule letaalne , samas kui kasvõi ühe, mistahes geeni, olemasolu tagab bakteri eluvõime. HU seondub DNA-ga mittespetsiifiliselt, kuigi eelistab väändunud DNA-d. DNA-ga seondumisel painutab HU DNA-d ning just DNA painutamise abil võib osaleda geenide transkriptsiooni reguleerimisel. HU painutamise tagajärjel DNA jäikus väheneb ning RNAP saab initsieerida transkriptsiooni (vastupidiselt H-NS-le, mis jäigastab DNA-d). HU on väga oluline histoonilaadne valk, mis osaleb DNA topoloogia kujunemisel.
IHF (inglise keeles integration host factor ) kirjeldati esmakordselt kui faag  järjestus-spetsiifiline rekombinatsiooniks hädavajalik bakteri valk. IHF on HU-le sarnane valk, kuid erinevalt HU-st IHF ei mähi DNA-d enda ümber ning IHF-l on üks tugevamini konserveerunud DNA järjestus, millele IHF seondub. IHF painutab DNA-d kuni 180 kraadi. Koosneb kahest subühikust, millest -subühik on DNA-ga seondumiseks olulisem. Võib esineda homodimeerina, kuid sel juhul on DNA-ga seondumine vähenenud 10 () ja 100 () korda. IHF-i kontsentratsioon tõuseb järsult E. coli kasvu aeglustumise faasis ning püsib kõrgena statsionaarses faasis.
Fis (inglise keeles factor for inversioon stimulation) kirjeldati esmalt kui Salmonella valk, mis inverteerib fim geenide ees promootorala. Fis- tunneb DNA-l suhteliselt hästi konserveerunud järjestust, mis on oma loomult AT-rikas. Fis ekspressioon sõltub E. coli’s väga tugevalt kasvukiirusest. Kui rakud ümber külvata värskele söötmele, siis Fis-i hulk rakus tõuseb järsult väga kõrgele, kuni 100 000 molekuli raku kohta. Eksponentsiaalse kasvufaasi keskel Fis-i hulk rakus väheneb drastiliselt 100 molekulini. Tänu DNA-ga seondumisele osaleb Fis väga paljudes raku funktsioonides, nagu nukleoidi moodustumine kiiresti kasvavates rakkudes, replikatsiooni initsieerimisel oriC -lt, rekombinatsiooni reguleerimisel ning transkriptsiooni reguleerimisel. Fis on E. coli nn kiire kasvu päästik, kuna aktiveerib ribosoomigeenide ekspressiooni. Fis põhjustab kuni 90 kraadise DNA painde ning negatiivse superspiralisatsiooni suurenemist nii lokaalselt kui ka globaalses mastaabis.

2.1.2. Tsütoplasma ja inklusioonkehad

Tsütoplasma on vesikeskkond, kus on bakteritel lahustunud peamiselt kolme tüüpi molekule: makromolekulid nagu ensüümid, mRNA ja tRNA; väikesed molekulid, mis on energia saamiseks või prekursoriteks makromolekulide sünteesimiseks; erinevad anorgaanilised ioonid ja kofaktorid. Tsütoplasmast on leitud peamiselt kolm komponenti: nukleoid, ribosoomid ja inklusioonkehad. Prokarüootide tsütoplasma on rohkem geeljas kui eukarüootidel ning tsütoplasma voolamist bakteritel ei toimu nagu on iseloomulik eukarüootidele.
E. coli tsütoplasma koostis balansseeritud kasvu korral.
Molekul
Protsent kuivmassist
Valgud
RNA
DNA
Fosfolipiidid
Lipopolüsahhariidid
Mureiin
Glükogeen
Väikesed molekulid: metaboliidid, vitamiinid , prekursorid jne
Anorgaanilised ioonid
Kuivmass kokku
55
20,5
3,1
9,1
3,4
2,5
2,5
2,9
1,0
100,0
Inklusioonkehad on tihti bakterite tsütoplasma koostises. Inklusioonkehad on eristatavad graanulid , mis võivad enda alla võtta märgatava osa raku tsütoplasmast. Tavaliselt on inklusioonkehad spetsiifiliste ainete säilitamiseks, nagu glükogeen (glükoosi polümeer), polü-3-hüdroksubuturaat (teatud rasv ). Polüfosfaatide inklusioonkehad sisaldavad PO4. Fototroofilised ja mõned litotroofid sisaldavad väävli inklusioonkehasid.

2.2. Rakuümbrise komponendid

Tavaliselt nimetatakse tsütoplasmamembraanist väljapoole jäävaid rakustruktuure rakukestaks. G(+) on rakukestaks peptidoglükaankiht ja S-kiht. G(-) on rakukest mitmekesisem, siia kuuluvad: periplasma koos peptidoglükaankihiga, välismembraan ja S-kiht. Tavaliselt kapslit ei peeta rakukestaks, vaid on eraldiseisev rakustruktuur. Kuid kõiki rakustruktuure, mis jäävad tsütoplasmamembraanist väljapoole, nimetatakse rakuümbriseks.

2.2.1. Periplasma

G(-) bakteritel on tsütoplasmamembraani ja välismembraani vahel periplasma, mis moodustab umbes 10% raku ruumalast. See on bakteri jaoks äärmiselt aktiivne rakuosa , kus toimub palju ensümaatilisi reaktsioone ja kus asub G(-) bakteritel peptidoglükaankiht. Peptidoglükaan on hüdreeritud olekus ning moodustab geelja massi, mis täidab kahe membraani vahelist ala. Seega periplasma pole tühi ruum, vaid raku oluline komponent , kus saavad valgud vabalt liikuda . Periplasmas asuvad valgud, mis vahendavad substraatide transporti nagu sahhariidid , aminohapped , vitamiinid, ioonid, vahendavad kemotaksist, sekretsiooni või viivad läbi ensümaatilisi reaktsioone, nagu membraanide ja peptidoglükaani biogenees, detoksifikatsioon (-laktamaas, penitsilliini lagundaja ) ja metabolism (DNA lagundamine, lisaks veel proteaase, fosfataase jmt). Spiroheetidel asub vibur periplasmas ning selle endoviburi abil bakter liigub.

2.2.2. Peptidoglükaan

Bakterid jaotatakse kaheks (kolmeks) suureks grupiks vastavalt sellele, kuidas rakud värvuvad Grami väljatöötatud metoodika järgi. Rakke värvitakse kristallvioletiga, rakke pestakse ning värvitakse uuesti safraniiniga. Kristallviolett on violetne värvaine ning raku värvumine sõltub peptidoglükaankihi paksusest. Gram -postiivsetel on peptidoglükaankiht nii paks, et kristallvioletile järgneva pesemisega värvainet välja ei pese. Gram-negatiivsed on õhukese peptidoglükaankihiga ning pesemisel tuleb kristallviolett rakust välja ning bakterid värvuvad safraniiniga värvides roosaks. On olemas ka kolmas rühm baktereid – Gram-varieeruvad, need on bakterid, mida ei saa kindlalt paigutada ühte või teise rühma nagu näiteks arhed.
Peptidoglükaan on eubakteritele omane rakuosa. G(+) võib peptidoglükaan olla raku kõige välimine osa, G(-) bakteritel on peptidoglükaani kiht õhem ning on periplasma osa (kahe membraani vahel). Arhedel on pseudomureiinkiht tsütoplasmamembraanist väljaspool, mis on peptidoglükaankihiga sarnase ülesandega – kaitsta rakku lüüsumast tugeva osmootse rõhu pärast.
Peptidoglükaan on lineaarne polümeer, kus korduvad -1,4-N-atsetüülglükoosamiini (NAG) ja N-atsetüülmuraamhappe (NAM) jäägid. NAM ja NAG on omavahel seotud -1,4-glükosiidsidemega. Muraamhappe karboksüülrühma kaudu on sahhariidne kiht seotud peptidoglükaani peptiidse kihiga , moodustades tugeva ja elastse võrgustiku, mis katab bakterit . Peptidoglükaani koostis on bakteriti erinev, kuid põhiolemuselt on ehitus sarnane. G(+) on peptidoglükaankiht väga paks (15 – 80 nm), koosnedes mitmest peptidoglükaankihist. G(-) on peptidoglükaan tunduvalt õhem (10 nm), tavaliselt ainult üks peptidoglükaankiht. Samas G(-) bakterite rakuümbrisesse kuulub veel välismembraan, mis annab bakteritele lisakaitse. Joonisel on toodud G(+) Staphylococcus aureus’e peptidoglükaan.
Peptidoglükaan sünteesitakse kokku periplasmas ning sellest võtavad osa mitmed ensüümid nagu transglükolüsaasid, transpeptidaasid, karboksüpeptidaasid. Penitisilliin ja teised -laktaamid pärsivad transpeptidaasi ja karboksüpeptidaasi tööd ning blokeerivad peptidoglükaani sünteesi. Seega toime on passiivne. Lüsotsüüm on ensüüm, mis lõikab NAG ja NAM-i vahelisi -1,4-glükosiidsidemeid ning lagundab aktiivselt peptidoglükaani. Lüsotsüümi sisaldavad loomsed seerumid, sekreedid (nt pisarad ), fagotsütootilised lüsosoomid. Sellega kaitsevad hulkraksed organismid ennast patogeensete bakterite eest. Lüsotsüümile on eriti tundlikud G(+) bakterid, G(-) on vähem tundlikud, sest neil kaitseb peptidoglükaankihti välismembraan.
G(+) bakteritel on peptidoglükaankihiga seotud teihhuuhapped. Teihhuuhapped on lineaarsed glütserooli või ribitooli polümeerid, mis on fosfaatrühmade abil polümeriseeritud (fosfodiestersideme abil) ning millel võivad olla aminohappe- või sahhariidrühmad. Teihhuuhapped on kovalentselt seotud peptidoglükaaniga ning nad ulatuvad peptidoglükaankihist läbi. Lipoteihhuuhapped on rashvappelise radikaaliga ja ankurdatud tsütoplasmamembraani.
Teihhuuhapete funktsiooni pole teada. Arvatakse, et teihhuuhapped on vajalikud nn ioonkanalite loomiseks. Teihhuuhapped loovad positiivse ioonkanali, mis aitab anioonidel läbida peptidoglükaankihti. Teise hüpoteesi kohaselt on teihhuuhapped struktuurüksusteks, mis aitab stabiliseerida muraamhappeid ning sünteesida peptidoglükaani. Looduslikes tingimustes on teihhuuhapped G(+) bakteritele hädavajalikud.

2.2.3. S-kiht

S-kiht (inglise keeles surface layer) rakkude välimine kiht, mis on kapsliga võrreldes suhteliselt õhuke. S-kihti on võimelised sünteesima enamik baktereid ning see koosneb valkude või glükoproteiinide subühikutest, mis moodustavad kristallilise struktuuri. S-kiht asub G(+) bakteritel peptidoglükaankihist väljaspool ning valgud on sukeldunud peptiidoglükaani. G(-) bakteritel on S-kihi valgud seotud välismembraani lipopolüsahhariididega. S-kiht võib olla nii G(-), G(+) kui ka arhedel.
S-kiht koosneb tavaliselt ühe valgu monomeeridest, kuid mõnikord on S-kiht varieeruvam. Näiteks Clostridium dificile ja Bacillus anthracis ’e S-kiht koosneb kahest erinevast valgust. S-kihi valgud koosnevad tihti happelistest ja hüdrofoobsetest aminohapetest. Lüsiin on positiivse laenguga aminohapetest sagedaseim. S-kihi valkudes on vähe S-S sildu moodustavaid aminohappeid nagu metioniin ja tsüsteiin.
S- kihil arvatakse olevat mitu funktsiooni: kaitseb rakku keskkonnategurite järsu muutuste vastu, nt pH-šoki vastu ja fagotsütoosi vastu. Näiteks E. coli kaitseb ennast S-kihiga nn bakterkiskja eest. S-kihiga on seotud bakterite virulentsus. S-kiht annab rakule veel ühe kaitsekihi ning hüdrofoobsuse tõttu on tihti kasutatav adhesiooniks. Näiteks inimese patogeen Campylobacter fetus’e (G(-) bakter) S-kiht koosneb SapA valgust ning katab bakteri välismembraani lipopolüsahhariidide kihi, mis on väga antigeenne. Kui inimese immuunsüsteem tunneb SapA ära, vahetab bakter S-kihti toodetavat SapA-d teise variandi vastu, mida immuunsüsteem ei tunne.

2.2.4. Kapsel

Enamikul prokarüootidest on rakukestast väljaspool veel polüsahhariididest või polüpeptiididest kiht, mida on võimalik mikroskoobiga eristada. Kapslite funktsioonid: adhesiooni vahendamine ning biofilmi moodustamine, kaitse fagotsütoosi vastu ja antimikroobsete ainete vastu, kaitseb kuivamise eest; kui baktereid kasvatada sahhariididerikkas söötmes, siis bakterid võivad sahhariide talletada kapslis polümeeridena.
Bakter
Kapsli koostis
Subühik
G(+)
Bacillus anthracis
Polüpeptiid
D-glutamiinhape
Bacillus megaterium
Polüpeptiid ja polüsahhariid
D-glutamiinhape, aminosahhariidid ja sahhariidid
Streptococcus mutans
Polüsahhariid
Glükoos (dektraan)
Streptococcus pneumoniae
Polüsahharidi
Sahhariidid, aminosahhariiddi, uroonhapped
G(-)
Acetobacter xylinum
Polüsahhariid
Glükoos ( tselluloos )
Escherichia coli
Polüsahhariid
Glükoos, galaktoos , fukoos
Pseudomonas aeruginosa
Polüsahhariid
Manuroonhape
Azotobacter vinelandii
Polüsahhariid
Glukuroonhape
Agrobacterium tumefaciens
Polüsahhariid
Glükoos
Biofilmi moodustamiseks on kapsel hädavajalik. Kapsli abil bakter kinnitub pinnale ning moodustab enda ümber kaitsva limakihi, mis on suhteliselt kemoresistentne, hoiab vett ning kaitseb vaenlaste eest. Streptococcus pneumoniae’l kaitseb kapsel bakterit makrofaagide fagotsütoosi eest. Bacillus anthracis’el (katkutekitaja) kaitseb kapsel bakterit lüsosoomis lüsotsüümide eest.

2.2.5. Välismembraani vesiikulid

G(-) bakteritel on kaks membraani, lisaks tsütoplasmamembraanile ümbritseb peptidoglükaankihti veel välismembraan, mis võib olla rakkudel kõige välimiseks rakuosaks, mis lahutab bakterit keskkonnast. Kuna välismembraan on liikuv rakuosa, siis võib välismembraan välja sopistuda ning moodustuda vesiikuleid. Vesiikulid on 50 – 250 nm läbimõõduga sfäärilised kaksikkihilise membraaniga struktuurid , mis võivad sisaldada mitmesuguseid osiseid periplasmast.
Välismembraani vesiikuleid on võimelised moodustama kõik G(-) bakterid ning kasutama seda kui alternatiivset sekretsioonimehhanismi. Vesiikuleid on kasutatud meditsiinis sisestamaks vajalikke aineid bakteritesse või eukarüootide rakkudesse.
G(-) bakterid on võimelised eritama vesiikuleid nii planktilises eluvormis kui biofilmis elades , nii vedelsöötmes või tahkel söötmel kasvades, nii tehistingimustes kasvatades kui ka looduslikes tingimustes elades. Membraanivesiikulid on bakteritele olulised eukarüoodi ründamisel, nõrkade bakterite tapmiseks, saamaks kätte toitaineid ning lähedalolevate bakterite abistamiseks . Patogeensus. Pseudomonas aeruginosa, bakter, mis on oluline tsüstilise fibroosi haigete kopsupatogeen, membraanivesiikulid võivad sisaldada proteaase, fosfolipaas C-d, aluselist fosfataasi ja autolüsiine, samuti proelastaasi ( elastaas , oluline ekstratsellulaarne proteaas , mis põhjustab kahjustusi kudedes, lõikab immuunoglobuliine, tsütokiine jt olulisi immuunvastuse valke), mis on patogeneesis olulised. Proelastaani sisaldamine membraanivesiikulites oli tõestuseks, et vesiikulid haaravad kaasa periplasmast komponente, sest proelastaan lõigatakse alles välismembraanis elastaaniks, mis on küps valk. P. aeruginosa’le lisaks on välismembraani vesiikulid olulised Proteus mirabilis (neerukahjustused), Serratia marcescens (haavandite patogeen), Vibrio spp, Borrelia spp ( borrelioos ) ja enterotoksilised E. coli vormid kasutavad sama moodi välismembraani vesiikuleid patogeneesiks vajalike valkude transpordiks peremehe rakku. Sekreteerides valke rakust välja suudab peremeesorganism kiiresti need kahjutuks teha, kuid membraan kaitseb bakteri patogeneesiks vajalikke valke antibiootikumide ja proteaaside eest.
Toitainete kättesaamine
G(-) bakterite periplasmas on alati autolüsiine ja penitsilliiniga seonduvat valku, mis on olulised peptidoglükaani reorganiseerimiseks, kui bakter kasvab. P. aeruginosa’l on periplasmas 11 erinevat autolüsiini, millest olulisim on 26 kDa raskune peptidoglükaani hüdrolaas PGase. Bakteril endal pole PGase peptidoglükaani reorganiseerimisel eriti oluline, sest valk pakitakse vesiikulitesse. Selle valgu abil lüüsib P. aeruginosa teisi baktereid, mis kasvavad aeglaselt või on stressis . Vesiikulid atakeerivad nii G(+) kui ka G(-) baktereid, kuid ründemehhanism on pisut erinev. Rünnatava bakteri vastupidavus P. aeruginosa vesiikulites olevale PGasele sõltub peptidoglükaani tüübist, mida sarnasem see on P. aeruginosa’le seda paremini PGase seda lagundab.
G(+) bakterite puhul vesiikul plahvatab peptidoglükaankihi peal ning vabanenud hüdrolaas hakkab kohe peptidoglükaankihti lagundama. PGase suudab G(+) bakteri peptidoglükaankihti lagundada ka siis, kui bakteril on peptidoglükaankihi peal veel S-kiht. Hüdrolaas tungib S- kihist läbi ning jõuab peptidoglükaankihini.
G(-) bakterite korral sulandub membraanivesiikul bakteri välismembraani ning vabastab vesii-kuli sisu sihtmärkbakteri periplasmasse. PGase vabaneb otse bakteri peptidoglükaanikihi juurde ning on võimeline preiplasmas vabalt difundeeruma. Selle tõttu võib hüdrolaas lagundada peptidoglükaa-ni mitmest kohast ning fragmenteerunud peptidoglükaani tõttu bakter võib lõhkeda. Kui sihtmärk-bakter on kiiresti kasvav ja jagunev, see tähendab bakteri metaboolne aktiivsus on kõrge, siis vesiikulitest pärit PGase ei suuda rakku lüüsida, kuna sihtmärktrakk parandab tekkinud kahjustused kiiresti. Rakkude jagunedes PGase hulk tütarrakkude periplasmas väheneb jagunemise tõttu ning lõpuks on PGase hulk bakteri järglasrakkude periplasmas tühine. Stressis bakterid või näljas, millel on metabolism aeglane, ennast kaitsta ei suuda, ning vesiikulitest pärit hüdrolaas tapab bakteri.
Naaberbakteri abistamine
P. aeruginosa ekspresserib kromosomaalselt geenilt -laktamaasi, mis teeb selle bakteri suhteliselt tundetuks penitsilliini tüüpi antibiootikumidele . Bakter on võimeline pakkima -laktamaasi vesiikulitesse. Naaberbakter, millel pole -laktamaasi, saab selle P. aeruginosa’lt vesiikulite abil ning omandab epigeneetiliselt -laktaam-tüüpi antibiootikumidele resistentsuse . Neisseria gonorrhoeae (gonorröa tekitaja ) on võimeline üle kandma plasmiide, mis kannavad antibiootikumiresistentsus-geene välismembraani vesiikulite abil. Seega vesiikulid võivad vahendada horisontaalset geeni-ülekannet. Vesiikulid võivad olla olulised ka antibiootikumide kontsentratsiooni alandamisel. Kuna välismembraan sisaldab väga palju poriine, mis lasevad antibiootikume periplasmasse, siis vesiikulid, mille membraanis on samad poriinid , tõmbavad osa antibiootikumist endasse, hajutades ja vähenda-des antibiootikumide mõju rakkudele. Kui vesiikulid sisaldavad veel -laktamaase, siis vesiikuli sees lagundatakse antibiootikum ning antibiootikumi kontsentratsioon bakteri ümber langeb kiiremini.
Gentamütsiiniga kokkupuutumisel suurendab P. aeruginosa vesiikulite tootmist kolm korda, püüdes antibiootikumi vesiikulitesse lõksu. Kuigi antibiootikumi kontsentratsioon keskkonnas langeb tunduvalt, võivad need vesiikulid (mis endas kannavad gentamütsiini) olla bakterile ohtlikud, sest vesiikul võib sulanduda bakteri membraani tagasi. Seda on kasutatud meditsiinis. Näiteks endopato-geenide korral on bakter eukarüoodi rakus sees. Sellisel juhul on antibiootikumide jõudmine bakterini raskendatud, kuna eukarüoodi membraan erineb G(-) bakteri välismembraanist ning antibiootikumi sisenemine rakku on halvenenud. Vesiikulite abil on võimalik viia bakterite kasvu pärssivaid aineid otse eukarüooti.

3. Bakterite membraanid

3.1. Tsütoplasmamembraan

Tsütoplasmamembraan ehk plasmamembraan on bakteritel kõige liikuvam rakustruktuur, mille peamiseks funktsiooniks on olla selektiivseks barjääriks tsütoplasma ja keskkonna vahel. Tsütoplasmamembraani abil reguleerib rakk ainete liikumist rakku ja rakust välja. Bakterite tsütoplasmamembraan laseb difusiooni abil läbi laenguta aineid, mis kaaluvad kuni 100 Da. Vesi ja molekulaarne hapnik difundeeruvad samuti läbi membraani. Tsütoplasmamembraan ei lase läbi laenguga ioone või aineid, mis on raskemad kui 100 Da. Näiteks H+, OH-, K+ ja Na+ ioonide difundeerumine läbi tsütoplasmamembraani on takistatud.
Bakteri membraan koosneb tavaliselt 40% ulatuses fosfolipiididest ja 60% ulatuses valkudest. Fosfolipiidid on amfoteersed molekulid (vastavalt tingimustele, käituvad kas happena või alusena ), millel on polaarne hüdrofiilne „pea“ ning estersidemetega seotud kaks mittepolaarset ehk hüdrofoobset rasvhappejääki. Tsütoplasmamembraan on veekeskkonnas kahekihilisena nii, et polaarsed pead jäävad membraani väliskülgedele ning hüdrofoobsed rasvhapped membraani keskele. Valgud võivad olla erineval moel membraani sukeldunud või ainult seotud membraani pinnaga sõltuvalt valgust. Lipoproteiinidel on lipiidne saba, mille abil valk kinnitub membraanile, ise membraani sukeldumata.
Tsütoplasmamembraan on voolav ning sellest johtuvalt saavad valgud membraanis ringi liikuda. Mõõtes membraanide viskoossust, on leitud, et membraanid on sama voolavad kui õlid toatemperatuuril. Membraani viskoossus on oluline membraani funktsioneerimiseks ning bakterid kasutavad viskoossuse reguleerimiseks mitmeid mehhanisme , millest üks on küllastumata rasvhapete isomerisatsioon. Erinevalt eukarüootidest ei sisalda eubakterite tsütoplasmamembraanid steroole (kolesterooli) ning koosneb küllastunud või monoküllastumata rasvhapetest. Kuna eukarüoodid on suuremad rakud kui prokarüoodid ning eukarüootidel puudub rakukest, siis peavad eukarüoodid muutma tsütoplasmamembraani steroolide abil jäigemaks.
Bakteritel pole rakusiseseid organelle, sellest johtuvalt on tsütoplasmamembraanil mitu elutegevuseks tähtsat funktsiooni:
1. barjäär (osmoregulatsioon, prootonite liikumapanev jõud, ainete difundeerumise regulatsioon)
2. energia genereerimine (elektronide transpordiahel, ATP süntees ning fotosünteetilised kromofoorid on sukeldunud tsütoplasma membraani)
3. transport (nii valkude kui mitmesuguste anorgaaniliste ja orgaaniliste ainete transport)
4. keskkonnast signaalide vastuvõtt (mitmed sensorid on tsütoplasmamembraanis, mis tunnetavad rakuväliste signaalmolekulide kontsentratsiooni)
5. metabolism (mitmed ensüümid, mida kasutatakse metabolismiks , on tsütoplasmamembraanis- rakukesta süntees, membraani süntees, DNA replikatsioon, CO2 fikseerimine, glükolüüsi transport ja fosforüülimine jne)
6. DNA replikatsiooni koordineerimine (ja rakujagunemise kontroll septumi moodustumise teel)
7. kemotaksis (nii ainete tunnetamine kui liikumine)
Membraan barjäärina
Membraani kõige olulisem funktsioon on kontrollida ainete liikumist rakku. Laenguga ained ning 100 Da raskemad ained transporditakse rakku. On kolm transpordi tüüpi: uniport – ained liiguvad ainult ühes suunas, sümport – kaks ainet transporditakse samaaegselt ühes suunas, antiport – kaks ainet transporditakse samal ajal vastassuunaliselt.
Bakteritel on mitmeid transportsüsteemide tüüpe, mille abil ained rakku või rakust välja transporditakse. Bakteril on neli transportsüsteemi, mis on valkude ehk transporterite abil vahendatud. Transportsüsteem võib koosneda ainult ühest või mitmest valgust, mis transpordivad aineid membraani ühelt poolt teisele poole. Transportsüsteeme iseloomustab substraadispetsiifilisus. Mõni transporter võib transportida struktuurselt sarnaseid aineid, kuigi peamisele ainele on suurem spetsiifilisus. Enamik bakteri transportsüsteeme transpordivad suhkruid, aminohappeid, katioone või anioone , mis on bakterile olulised toitained.
Soodustatud difusiooni süsteeme esineb bakteritel transportsüsteemidest kõige vähem. Need süsteemid soodustavad ainete difusiooni ega kasuta energiat. Moodustavad membraani kanali, mis spetsiifiliselt transpordib substraati aine madalama kontsentratsiooni poole nii kaua kuni saabub kontsentratsioonide tasakaal. Tuntuim on E. coli glütserooli uniporter GlpF. On ka teistsuguseid soodustatud difusiooni transportereid, mis sulgevad nn kanali. Näiteks vee transporti vahendav AqpZ laseb veel difundeeruda nii rakku kui rakust välja järsu osmootse rõhu korral. AqpZ laseb difundeeruda ainult veel ning selektiivselt välistab H+ ja teised katioonid, kuna poori sisekülg on positiivselt laetud. AqpZ on homotetrameerne valk, mis on osmoosiga suletav. Kui raku siserõhk läheb liiga suureks või vastupidi liiga väikeseks, siis tsütoplasmamembraani lipiidkihi paksuse muutumise tulemusena muutub AqpZ konformatsioon hüdrofoobsete jõudude abil.
Tavaliselt on bakteritel oluliseks probleemiks, kuidas aineid transportida vastu kontsentratsioonigradienti. Selleks kasutatakse aktiivtransporti.
Ioontransporterid kasutavad ainete rakku transportimiseks energiat ning tavaliselt saadakse vajalik energia prootongradiendist. See tähendab, aine transportimiseks viiakse koos substraadiga rakku ka H+. Prootongradient taastatakse hingamisahelaga. Näiteks E. coli laktoosi transporter LacY kasutab prootonit laktoosi transportimiseks rakku.
ABC-tüüpi (inglise keeles on kasutusel kaks varianti ATP-binging cassette või antigen-binding cassette) transporterid koosnevad mitmest valgust. Näiteks E. coli’s on maltoosi jaoks ABC-tüüpi transporter, mis kulutab maltoosi transpordiks ATP energiat. ABC-transporterid koosnevad kolmest osast: periplasmas on substraati siduv valk ( MalE ), mis annab substraadi edasi membraanivalkudele, mis tegelikult transpordivad substraati (MalFG), ning kolmanda osana on membraani tsütoplasma-poolses osas ATPaasid ( MalK ), mis genereerivad transpordiks vajaliku energia ATP hüdrolüüsiga. ABC-transportereid iseloomustab väga kõrge substraadispetsiifilisus. Substraadiga seonduvad ABC-transportsüsteemi valgud võivad periplasmas ringi liikuda ning seonduda substraadiga isegi siis, kui substraadi kontsentratsioon on 1 M (1 x 10-6 M). G(+) bakteritel on sarnane transportsüsteem samuti olemas, kuid erinevalt G(-) bakteritest pole neil periplasmat ning substraati siduv valk on lipoproteiin ning ankurdunud membraani. Prokarüootidest on leitud üle 200 erineva ABC-transporteri.
Modifitseerivad transporterid on transporterid, mis substraadi transportimise ajal modifit-seerivad substraati. Näiteks E. coli glükoosi transportersüsteem PTS (inglise keeles phosphotrans-ferase system), mis fosforüülib glükoosi rakku transportimisel. Modifitseerivad transporterid koosnevad mitmest valgust. Näiteks PTS koosneb 5 valgust, millest 2 (EI, HPr) on mittespetsiifilised ja ülejäänud 3 (EIIA, EIIB, EIIC) spetsiifilised glükoosi transportimiseks. PTS on bakterites palju, ning nende abil transpordivad bakterid rakku peale glükoosi veel mannoosi, fruktoosi ja tsellubioosi. Kõigil neil PTS tüüpi transportsüsteemidel on oluline fosforüülimine ning fosfor saadakse PEP-lt (fosfoenoolpüruvaat) ning valgud fosforüülivad üksteist jadamisi kuni fosfor jõuab membraanivalguni (EIIC), mis substraadi transportimise käigus fosforüülib substraadi. Ensüüm EI on esimene, mis võtab PEP-lt fosforjäägi ning fosforüülib HPr (inglise keeles heat-stable protein). Need kaks ensüümi võivad fosforüülida mitmeid PTS tüüpi transportsüsteeme. HPr fosforüülib EIIA (inglise keeles enzyme IIA), mis on muuhulgas väga oluline regulaatorvalk koordineeritud metabolismi regulaatorina. EIIA fosforüülib EIIB, mis omakorda EIIC. EIIC on glükoosi tegelik transporter E. coli’s.
Omadus
PD
VD
IT
ABCT
MT
Valkudega vahendatud 
Kontsentratsiooni vastu transport
NA
Substraadi septsiifilisus
energia päritolu
PMF 
ATP
PEP
Substraadi modifitseerimine
PD – passiivne difusioon
VD – vahendatud difusioon
IT – ioontransporterid
ABCT – ABC- transporterid
MT – modifitseerivad transporterid

3.2. G(-) bakterite välismembraan

G(-) bakteritel on tsütoplasmamembraanile lisaks veel välismembraan, mis koosneb peale fosfolipiidide veel lipopolüsahhariididest, st lipiididele on liidetud polüsahhariidid. See on teine lipiidne kaksikkiht raku ümber. Kuna selles membraanis on palju lipopolüsahhariide, siis kutsutakse tihti seda membraani ka LPS-kihiks. LPS-d on alati välismembraani välisküljel. Välismembraani siseküljel on sukeldunud lipoproteiinid , mis ankurdavad välismembraani peptidoglükaankihi külge. Sarnaselt sisemembraanile on ka välismembraani sukeldunud palju valke. Välismembraani sisekülg koosneb ainult fosfolipiididest ning sarnaselt tsütoplasmamembraanile on selle koostis järgmine: 80% fosfatidüületanoolamiine, 15% fosfatidüülglütseroole ja 5% kardiolipiine.
LPS on äärmiselt tugev antigeen imetajate immuunsüsteemile ning seetõttu nimetatakse LPS-e ka endotoksiinideks. LPS-ga seonduvad immuunrakkude retseptorid ning põhjustavad ägedat immuun -vastust. Üheks imetajate rakkude vastuseks on superoksiidide purse, mis põhjustab eukarüootide enda rakkude surma. LPS on ka eksogeenne pürogeen ehk palavikutekitaja ning põhjustab vaheühen-dite teket, mis põhjustavad septilist šokki inimesel. Inimene on LPS-dele teistest imetajatest tundli-kum, näiteks 1 g LPS-i 1 kg kehamassi kohta põhjustab inimesel šoki, samas kui hiired suudavad taluda isegi doosi 1 mg/1kg kohta. LPS-i O-antigeenne osa on kõige varieeruvam ja ka kõige antigeensem. G(-) bakter Neisseria gonorrhoeae on võimeline patogeneesi ajal oma O-antigeenset koostist muutma ning „kõrvale hiilima“ immuunvastusest. Bakter teeb seda faasivariatsiooni abil, mille käigus bakter muudab O-antigeenide sünteesi eest vastutavaid geene sarnaselt süsteemiga, mida inimene kasutab antikehade varieeruvuse tekitamiseks.
Lipopolüsahhariidide sahhariidse osa võib jagada põhimõtteliselt kaheks: polüsahhariidne südamik ( core -polüsahhariid) ja O-antigeen. Salmonella polüsahhariidse südamiku osa koosneb ketodeoksüoktonaatidest (KDO), heptoosidest, heksoosidest (glükoos, galaktoos) ja N-atsetüül-glükoosamiinist. Tuum-polüsahhariididid on kovalentselt seotud O-antigeeniga, mis koosneb tavaliselt galaktoosist, glükoosist, ramnoosist ja mannoosist (heptoosidest) ja ühest või mitmest dideoksüsahhariidist. O-antigeen koosneb 4 – 5 sahhariidsest kordusest, mis on tihti harunenud. O-antigeenne osa on väga varieeruv, näiteks E. coli’l on teada üle 160 erineva O-antigeeni.
Lipopolüsahhariidi lipiidset osa nimetatakse lipiid A-ks, mis pole glütseroolne lipiid vaid estersidemete abil seotud N-atsetüülglükoosamiin fosfaadiga. LPS-l on molekuli kohta rohkem rasvhappeid kui fosfolipiididel ning sellest johtuvalt on välismembraani rasvhapete vahel rohkem hüdrofoobseid sidemeid naabermolekuliga, mis teeb välismembraani tihkemaks ning suurendab membraanis hüdrofoobset keskkonda. Enterobakteritel on LPS väline kiht stabiliseeritud Mg2+ ja Ca2+-ioonidega, mis neutraliseerivad lipiid-A fosfaatide negatiivseid laenguid ning stabiliseerivad polüsahhariidide jääke. Lisaks koosneb enterobakterite lipiid-A küllastunud rasvhapetest, mis muudab membraani veel jäigemaks.
EDTA abil on võimalik muuta bakterite välismembraani ning seeläbi muuta G(-) bakterid tundlikumaks mitmesugustele ainetele , mis enne EDTA-ga töötlemist poleks välismembraani läbinud. EDTA seob LPS-e stabiliseerivad kahevalentsed katioonid ning LPS-molekulid vabanevad keskkonda. Bakter kompenseerib kaotsi läinud LPS-d fosfolipiididega ning tekkinud fosfolipiidne kaksikkiht on viskoossem ning toksiinidele lihtsamini läbitav. Kui bakterid toodavad lühemat LPS-i, millel puudub O-antigeen (nn kare LPS), siis bakterid moodustavad karedad kolooniad , mis on tundlikumad hüdrofoobsetele toksiinidele kui tervikliku LPS-ga bakterid, mis moodustavad sileda koloonia.
LPS-kihi tähtsus
LPS-kiht moodustab rakule polümeerse hüdrofiilse kihi, mille abil G(-) bakterid kaitsevad ennast mitmesuguste hüdrofoobsete detergentide ja antibiootikumide eest. See on tõenäoliselt üks põhjus, miks G(-) bakterid on mõne aine suhtes resistentsemad kui G(+) bakterid. Välismembraanil on sisemembraanile sarnane selektiivse barjääri tähtsus. Hüdrofiilsed kuni 600 Da raskused ained difundeeruvad väga lihtsalt läbi välismembraani, kasutades mittespetsiifilisi valgulisi kanaleid , mida kutsutakse poorideks. Vitamiinid ja Fe-kelaadid läbivad välismembraani mööda spetsiifilisi kanaleid. Kuna lipopolüsahhariidid on väga tugevad antigeenid imetajate immuunsüsteemile, siis bakterid varieerivad LPS-kihti. Patogeenid, nagu Neisseria meningitidis ja Gonococcus spp muudavad oma LPS välimise kihi koostist nii, et need sarnanevad erütrotsüütide ABH glükolipiididele ning pääsevad sedasi inimese immuunvastusest.
Lipopolüsahhariidide biosüntees E. coli’s
LPS sünteesitakse tsütoplasmamembraanis ning translokeeritakse välismembraani. See on ühesuunaline transport. LPS-i kõik komponendid (polüsahhariidide südamik, O-antigeen ning lipiid-A) sünteesitakse tsütoplasmamembraani rakupoolses kihis, kus lipiid-A ja polüsahhariidi südamik ka ligeeritakse, tekib nn kare LPS. Kare LPS ja O-antigeen transporditakse eraldi tsütoplasmamembraanist tsütoplasmaatiliselt küljelt periplasmaatilisele küljele ning seejärel liidetakse kokku terviklikuks LPS-ks. Karedat LPS-i transpordib ABC-transporter MsbA ning O-antigeeni Wzx (Wza) flipaas. Laborites laialt kasutatavad E. coli tüved, mis on põlvenud tüvest K-12 ei suuda O-antigeeni transportida, sest neil on flipaas defektne . Periplasmapoolsel tsütoplasmamembraani küljel liidab LPS-i kaks osa kokku ligaas WaaL. Seejärel LPS transporditakse ABC-tüüpi Lpt (inglise keeles LPS transport) transporteriga välismembraani.
Lpt koosneb kolmest osast: tsütoplasmamembraanis olev ABC-transportsüsteem, mis koosneb LptB, LptF, LptG ja LptC valkudest; periplasmas olevast LptA-st ja välismembraaniga seotud valkudest LptE ja LptD-st.
LptD on hädavajalik, et LPS-d jõuaks välismembraanile, kui bakteril puudub LptD, siis LPS-d akumuleeruvad periplasmasse. LptA ja LptB on vajalikud periplasmas LPS-ide transpordiks. Nende puudumisel LPS-d akumuleeruvad tsütoplasmamembraani. Kuna LptB on tsütoplasmaatiline nukleotiide siduv valk, siis arvatakse, et LptB hüdrolüüsib ATP-d ning genereerib energiat LPT-de transportimiseks välismembraanile. LptA transpordib LPT välismembraanile, kuid pole teada, kas LptA liigub periplasmas tsütoplasma- ja välismembraani vahel edasi tagasi või polümeriseerub periplasmas nii, et Lpt moodustab periplasmat läbiva kompleksi. LptFG ja C on tsütoplasmasse sukeldunud valgud, mis on vajalikud LPT-de transpordiks, ilma nende valkudeta ABC-transporter ei tööta.
Siiski pole täpseid tõendeid peale transporterite asukoha, kuidas Lpt-süsteem on kokku pandud. Kindlasti MsbA pole ülejäänud Lpt-ga seotud. Ükskõik millise Lpt valgu geeni deleteerimine päädib LPS-de akumuleerumisega tsütoplasmamembraani välisküljele. Ainult MsbA geeni deleteerimise korral akumuleeruvad LPS-d tsütoplasmamembraani siseküljele.
Välismembraani valgud
Välismembraan sisaldab väga palju erinevaid valke, neist mõnda on väga suures hulgas. Näiteks mureiin lipoproteiini Lpp, OmpA-d ja üldiseid diffusioonipoore on raku kohta 105 molekuli. Lpp on lipoproteiin, mis lipiididse osaga on välismembraaniseoseline, samas kui umbes 1/3 Lpp valkudest on kovalentselt seotud peptidoglükaanikihiga. Lpp vastutab raku terviklikkuse eest, Lpp puudumisel moodustuvad välismembraani vesiikulid ning periplasmaatilised valgud lekivad keskkonda. OmpA on samuti oluline välismembraani valk, mis hoiab bakteri kuju. Lisaks sellele on OmpA poore moodustav valk, kuigi nende pooride läbilaskvus on väga halb. OmpA-l on kaks vormi, tavaliselt on OmpA monomeerina välismembraanis ning nn suletud vormina. Samas oligomeerne OmpA vorm, mida on välismembraanil vähem, moodustab suuri poore, mis lasevad ainetel läbida välismembraani difusiooni abil.
Poriinid. G(-) bakterite välismembraanist on leitud palju erinevaid poriine. Poriinid on valgud, mille keskel on moodustunud kanal , mille kaudu liiguvad keskkonnast hüdrofiilsed ained tsütoplasmasse. Poriinide kanalid on suletavad, seega ainete difusioon on reguleeritav. Kuigi palju poriine laseb suhteliselt mitteselektiivselt vees lahustunud ained periplasmasse, siis on olemas spetsiifilisi poriine, mis vahendavad vitamiini B12, raua või maltoosi liikumist periplasmasse. Poriinid võivad aineid läbi lasta ka suuruse järgi. Näiteks OmpF ja OmpC lasevad difundeeruda katioonidel, mis on kergemad kui 600 Da. Poriinide funktsionaalsus ning ekspressioon sõltub kasvutingimustest.
Välismembraan ei lase hüdrofoobsetel ainetel ega suure molekulmassiga ainetel vabalt difundeeruda periplasmasse. Vajalike ainete transportimiseks on bakteritel spetsiifilised transportsüsteemid või poriinid välismembraanis.
Laenguta väikese molekulmassiga ained, nagu O2, CO2, NH3, H2O difundeeruvad takistusteta läbi välis- ja tsütoplasmamembraani. Siiski mõnikord on vaja vee transporti reguleerida.
Välismembraani valk
Funktsioon
OmpA
Välismembraani stabiliseerimine , oluline konjugatsioonil
Lpp
Välismembraanis kõige enam esindatud valk, kinnitab välismembraani peptidoglükaanile, stabiliseerib raku
LamB
Maltoosispetsiifiline poriin, - faagi kinnitumine
OmpF, OmpC
Väikese massiga katioonide difusioon
PhoE
Anioonide difusioon, aktiveeritakse P-limitatsioonil
TonB
Siderofooridega vahendatud Fe-transport
E. coli tüüpilised välismembraani valgud on OmpF, PhoE ja OmpC, mis moodustavad -tünne ning on trimeersed poriinid, seest hüdrofiilsed. Nende valkude poriinis on spetsiifiline L3 silmus, mis on oluline nii ainete difundeerumisel kui ka selektiivsusel. OmpF laseb läbi kuni 600 Da raskuseid molekule, seega ioonid, aminohapped, monosahhariidid kasutavad difusioonipoore periplasmasse jõudmiseks. Disahhariidid , polüsahhariidid ja teised molekulid vajavad spetsiifilisi välismembraani transportereid läbimaks membraani. OmpF on pH-st sõltuv katioone läbilaskev poriin, mis pH aminohape – 113. positsioonis asuv asparagiinhape. Kui see vahetada laenguta aminohappe vastu, kaob OmpF-i katioonide selektiivsus. OmpC ja PhoE-l on vastavalt nõrk katioonide ja anioonide selektiivsus.
Poriinide avatus sõltub peale membraanipotentsiaali veel pH-st ja polüamiinidest. Peale selle, et pH mõjutab poriinide selektiivsust ning läbilaskvust võib happeline pH (pH E. coli OmpF-i sulgeb ka kadaveriin, polüamiin, mida bakter hakkab tootma eriti madalal pH-l. Kadaveriin seondub OmpF-i luumenis oleva L3 silmusega ning initsieerib poori sulgumise. Arvatakse, et sedasi muudab bakter välismembraani vähem läbilaskvaks, et kaitsta ennast madala pH eest.
Välismembraani läbilaskvus ja antibiootikumiresistentsus
LPS omadustest tulenevalt moodustub G(-) bakterite välisküljele tugev hüdrofiilne barjäär (O-antigeen ja polüsahhariidide südamik), samas lipiid-A suurem hulk küllastunud rasvhappeid moodustavad tugeva hüdrofoobse barjääri keskkonnas olevatele ainetele. Väikesed hüdrofiilsed antibiootikumid nagu -laktaamid kasutavad rakku sisenemiseks poriine, samas kui makroliidid (nt erütromütsiin, takistab valgusünteesi), gentamütsiin, kanamütsiin, novibiotsiin ja katioonsed valgud kasutavad rakku pääsemiseks lipiidkihist läbi difundeerumist. Tetratsükliin ja kinoloonid kasutavad rakku jõudmiseks nii lipiidkihist läbi difundeerumist kui ka poriine. Bakterite resistentsus antibiootikumidele võib tekkida välismembraani lipiidse või valgulise koostise muutumise tulemusel.
Hüdrofoobsete antibiootikumide difundeerumisel välismembraani on kõige suuremaks barjääriks polüsahhariidne südamik. Samas rakkude töötlemine Tris/EDTA lahusega vähendab polüsahhariidse südamiku stabiilsust ning rakud muutuvad hüdrofoobsetele antibiootikumidele tundlikumaks. Polümüksiin B on antibiootikum, mis konkureerib LPS-i polüsahhariidse südamikuga katioonidele. LPS destabiliseerub ning polümüksiin B siseneb periplasmasse. Sellega antibiootikum indutseerib iseenda „ülekorjamise“ keskkonnast. Polümüksiin B märklauaks on tsütoplasmamembraan, millesse antibiootikum poeb oma hüdrofoobse sabaga ning destabiliseerib fosfolipiidset kaksikkihti. Salmonella typhimurium’il ja E. coli’l on teada polümüksiin B resistentsed tüved, mis taluvad kuni 100 korda kõrgemat polümüksiin B kontsentratsiooni võrreldes metsiktüvega. Leiti, et resistentsete tüvede LPS-des on toimunud muutused, mis vähendavad LPS vajadust katioonide stabiliseeriva toime järele ning seega on tundetumad EDTA-le ning polümüksiin B-le. Nende bakterite LPS-d sisaldasid 4 – 6 korda rohkem 4-aminoarabinoosi ja fosfoetanoolamiine lipiid-A fosfaatide esterfikatsiooni tulemusena, mis vähendasid LPS negatiivset laengut ning naabermolekuli tõukumist. Selle tulemusena muutus välismembraan tihedamaks, mis omakorda vähendas antibiootikumi difundeerumist lipiidkihti.
Antibiootikumide läbiliikumine poriinidest sõltub antibiootikumi omadustest ja pH-st. Sellised -laktaamid, millel on nii katioonsed kui anioonsed omadused, sõltuvalt pH-st läbivad E. coli OmpF-i kõige paremini pH väärtuse juures, kus antibiootikumil on mõlemad laengud . Nt ampitsilliin läbib OmpF-i poori väga hästi pH 5 juures, samas kui karbenitsilliin, mis on anioon läbib OmpF-i tunduvalt halvemini.
Bakterid lasevad -laktaamidel erinevalt difundeeruda. Näiteks Pseudomonas aeruginosa on tundetu enamikele -laktaamidele ja karbapeneemidele, mille suhtes enterobakterid on väga tundlikud. P. aeruginosa välismembraan laseb neid antibiootikume halvemini läbi ning P. aeruginosa’l on väga tõhus ainete väljapumpamissüsteem. Siiski, P. aeruginosa on väga tundlik karbapeneemidest imipeneemile. P. aeruginosa kasutab poriini OprD struktuuriliselt imipeneemile sarnaste aminohapete ja peptiidide difundeerimiseks periplasmasse (trüptofaan), sama poriini kaudu siseneb periplasmasse ka imipeneem.
Tetratsükliin võib läbida G(-) bakteri välismembraani nii poore kasutades kui ka imendudes läbi membraani, sõltuvalt milline on antibiootikumi laeng. Tetratsükliin on positiivse laenguga kui pH on madalam kui 7,8 ning kasutab peamiselt OmpF-i läbimaks välismembraani. Kui tetratsükliin pole laetud, siis imendub antibiootikum välismembraani ning jõuab periplasmasse difusiooni abil.
Antibiootikumiresistentsuse tekkimiseks välismembraani modifitseerimise abil on kaks võimalust:
1. välismembraani koostise muutmine, mis hõlmab endas nii teatud poriinide vähenemist või puudumist välismembraanis ja/või peamiste poriinide asendamine teiste poriinidega.
2. Spetsiifilise poriini funktsiooni muutmine või läbilaskvuse muutmine mutatsioonide abil
Näiteks Klebsiella pneumoniae’l on kolm OmpK poriini varianti: OmpK35, OmpK36 ja OmpK37, millest esimesed kaks on laia poori avaga, kuid viimane on kitsa pooriga suhkrute transpordiks. Haiglates on OmpK35 ja OmpK36 ekspressioon maha surutud ning kitsa pooriga OmpK37 laseb halvemini tsefotaksiimil ja tsefoksitiinil (3. põlvkonna -laktaamid) periplasmasse difundeeruda.
Antibiootikumide läbitavus pooridest võib muutuda halvemaks, kui poriini luumenis (pooris) toimuvad oluliste aminohapete asendumised. Näiteks OmpF aas L3 on olulise tähtsusega poriini selektiivsusel. Kui aasa L3 199. positsioonis glütsiin asendada asparagiinhappega, siis tsefalosporiinide (-laktaamide perekond) läbitavus vähenes 3 korda.

4. pH homöostaas

Erinevalt eukarüootidest elavad bakterid muutlikus keskkonnas ning peavad hakkama saama suurte pH kõikumistega või on kohanenud elama väga äärmuslikes pH väärtuste juures. Näiteks, E. coli on neutrofiil, kuid suudab kasvada keskkonnas, mille pH kõigub 5,5-st 8-ni. See on 1000-kordne H+-ioonide kõikumine keskkonnas. Veelgi enam, E. coli talub pH kõikumist 2 – 9, mis on 10 miljoni kordne vesinikioonide kontsentratsiooni kõikumine keskkonnas. Samas, bakteri jaoks on oluline hoida tsütoplasma pH stabiilsena, sest enamik valke ja ensüüme on funktsionaalsed pigem kitsas pH-vahemikus. Kui väliskeskkonna pH on vahemikus 5,5 – 8, siis E. coli sise-pH (pHi – inglise keeles internal pH) kõigub kõigest 7,2 – 7,7. Äärmuslikes pH-ga keskkondades kõigub raku pHi rohkem, kuid siiski mitte oluliselt. Näiteks väliskeskkonna pH 4 – 9 korral muutub raku pHi 10 korda.
Mitu faktorit võib mõjutada raku pHi: raku puhverdusvõime, oksüdatiivse fosforüülimisega ja ATP hüdrolüüsiga seotud H+ transport, prootonite ja metallide (peamiselt K+ ja Na+) antiport ning aminohapete dekarboksüleerimine. Prootoni transport on rakkudel peamine pH homöostaasi hoidja, kuid kui keskkonnas pH läheb liiga äärmuslikuks, lülitatakse tööle teised mehhanismid, mis hoiavad raku sisemist pH-d stabiilsena. Keskkonna hapestumisel lülitatakse tööle K+/H+ antiport, mis transpordib kaaliumi rakku ning prootoni rakust välja. Sellega rakk vähendab tsütoplasmas olevat prootoni kontsentratsiooni ning tõstab pHi. Selle antipordi abil hoitakse pHi 7,5 lähedal ning suurendatakse pH-d (pH-de erinevus tsütoplasmas ja keskkonnas). Kui keskkonnas muutub pH aluselisemaks, siis E. coli hakkab raku tsütoplasmat hapestama Na+/H+ antiporteri abil. Na+ iooni väljatransportimisega tuuakse rakku H+- ioon , mis langetab pHi.
Peale tsütoplasma hapestamise ja aluselisemaks muutmise H+ transportimise abil on rakkudes olemas spetsiifilised kaitsemehhanismid , mis lülituvad tööle ekstreemsete pH väärtuste korral. Näiteks E. coli ja Salmonella kaitsevad rakku ühe mehhanismiga pH langemisel väärtuseni 3, kuid pH langemisel 2-ni lülitab E. coli tööle teise mehhanismi. Seega E. coli’l on mitu mehhanismi, mis aktiveeritakse erinevate pH väärtuste korral.
Ekstreemsetel atsidofiilidel on tsütoplasma membraan tihkem ning seetõttu on vähenenud membraani prootonite läbitavus. Eriti oluline on see ekstreemsetel termofiilsetel atsidofiilidel, mis elavad happelises keskkonnas ning mille kasvuoptimum on üle 80 C. Näiteks Thermoplasma acidophilum’i membraan koosneb hoopiski tetraeetrilistest lipiididest vähendamaks prootonite läbimist.

4.1. Mehhanismid, mille abil hoiavad bakterid tsütoplasma pH-d stabiilsena

Bakterid peavad tagama membraanil prootonite liikumapaneva jõu e PMF-i (inglise keeles proton motive force ) olemasolu, et toota energiat, transportida aineid ning liikuda. Kui bakter satub ekstreemsesse pH keskkonda, siis esmalt püüab bakter reguleerida pH homöostaasi PMF-i kahe komponendi tagurpidi pööramisega. See tähendab, bakter võib reguleerida tsütoplasma pH-d või membraani potentsiaali. Esmalt, mis on prootonite liikumapanev jõud, millest see koosneb ning kuidas tekib.
PMF on elektrokeemiline gradient , mis on loodud bakteri membraanile. PMF koosneb kahest komponendist : transmembraansest H+-gradiendist ehk pH-gradiendist (pH) ja transmembraansest elektrilisest potentsiaalist (). Transmembraanne elektriline potentsiaal tekib siis, kui katioon liigub anioonse partnerita membraanist läbi ning põhjustab katioonide kuhjumist membraani välisküljel, mis tekitab sinna positiivse laengu. Samal ajal kui tsütoplasmasse kuhjuvad anioonid ning annavad negatiivse laengu. Elektriline gradient tekib ainult vahetult membraani lähedal, membraanist kaugemal ioonid difundeeruvad keskkonda. Tavaliselt tekitavad bakterid PMF-i prootonite transportimisega tsütoplasmast välja. Kuna prootonid on positiivse laenguga, siis tekib kaks gradienti korraga – keemiline gradient (ainet on ühel pool membraani rohkem kui teisel pool) ning elektriline gradient (membraani välisküljel on positiivne laeng, tsütoplasmapoolsel küljel negatiivne laeng). Selle tulemusena on soodustatud prootonite tagasi liikumine tsütoplasmasse, ehk ATP-süntaas kasutab ära prootonite passiivset liikumist mööda elektrilist ja keemilist gradienti.
PMF-ga on tihedalt seotud kemiosmoos. Kemiosmoosi põhimõte on sarnane osmoosile, kus kahel pool membraani olev vesi liigub membraani sellele poolele, kus on vähem vett. Kemiosmoosi korral liiguvad katioonid. Tavaliselt on selleks katiooniks metallid, millest omakorda levinuim on kaalium . Bakteris on kaalium kõige suurema kontsentratsiooniga metall , ulatudes rakus 0,1 – 0,6 M, samas kui keskkonnas on tavaliselt kaaliumi väga vähe 0,1 – 10 mM. Kasutades spetsiifilisi poore, mis lasevad läbi ainult K+, liigub kaalium difusiooni teel membraani välisküljele, tekitades membraani siseküljel anioonide ioonide ülehulga. Laeng kontsentreerub lipiidkihtidele väliskülgedele, tekitades membraanipotentsiaali, mis on positiivne välisküljel ja negatiivne siseküljel. Rakus sees on kaaliumi kontsentratsioon kõrge ning Na+ ja Cl- kontsentratsioon madal. Keskkonnas vastupidi.
Mõlemad gradiendid, nii keemiline gradient kui ka elektriline gradient, sõltuvad kui hästi või halvasti laseb membraan läbi ioone ehk difusioonist. Bioloogiliste membraanide lipiidne kaksikkiht on ioonidele barjääriks, mistõttu ioonide läbimine membraanist on takistatud. See võimaldab membraanil hoida erineva laenguga osakesi kahel pool membraani ning tekitada elektrokeemilist gradienti. Ainult teatud tüüpi ioonkanalid võimaldavad ioonidel liikuda läbi membraani. Kemiosmootse teooria kohaselt spontaanselt liikuvate H+ ioonide liikumise abil tsütoplasmasse sünteesib ATP-süntaas energiat ATP tootmise näol. Seega PMF on peamine jõud, mille abil elektrokeemiline energia muundatakse ATP energiaks.
 – transmembraanne elektriline potentsiaal, mis arvutatakse sisemine  - välimine , mööndusega, et  on negatiivse väärtusega, kui rakumembraani sisekülg on negatiivse väärtusega)
R – universaalne gaasikonstant (on katseliselt määratud füüsikaline konstant, mis väljendab ühe mooli ideaalse gaasi tehtavat paisumistööd tema temperatuuri tõstmisel ühe kelvini võrra muutumatu rõhu juures, R = 8,3 J · K-1 · mol-1)
T – absoluutne temperatuur
F – Faraday konstant (füüsikas ja keemias kasutatav konstantne arv, mis näitab ühe mooli elektronide elektrilaengu absoluutväärtust, 96 485,3 C/mol)
Standardtingimustes on PMF-i arvutamiseks kasutatav valem lihtsam:
Kuna bakterid on võimelised elama väga erineva pH-ga keskkondades, siis on neil ka PMF erinev. Ekstreemsetel atsidofiilidel nagu Acidithiobacillus ferrooxidans on pH erinevus rakus sees ja keskkonnas väga suur, mis loob väga suure pH (keemilise ehk H+) gradiendi . Seda tasakaalustab vastupidine elektriline potentsiaal. Atsidofiilidel on väga madala pH juures rakus positiivne laeng ja keskkonnas negatiivne laeng. Alkalofiilidel nagu näiteks Bacillus pseudofirmus on pH-gradient tagurpidi. Keskkonnas on H+ kontsentratsioon väga madal ning PMF-i loomiseks alkalofiilid kompenseerivad vastupidist pH-gradienti väga tugeva elektrilise potentsiaaliga. Neutrofiilil (E. coli) on pH-gradient väike ning PMF-i loomiseks kasutatakse elektrilist potentsiaali. Üldistatult võib öelda, et kui võrrelda erinevaid bakterirühmi, siis PMF suureneb pH alanemisel ning tsütoplasma pH langeb keskkonna pH langedes.

4.1.1. Tsütoplasma pH reguleerimine prootonite transportimise abil.

Bakteri tsütoplasma pH võib muutuda prootonite aktiivse transpordi tagajärjel. Oksüdatiivse hingamise tagajärjel transporditakse H+ ioone hingamisahelas rakust välja ning F1F0-ATP-süntaas transpordib H+ ioone tsütoplasmasse tagasi. Lisaks kasutab bakter katioon- prooton antiportereid loomaks transmembraanset potentsiaali. Oksüdatiivse hingamise korral loob bakter PMF-i hingamisahela abil. Kui neutrofiil satub happelisse keskkonda, siis suurendab bakter hingamisahela geenide ekspressiooni, suurendamaks H+ ioonide väljapumpamist tsütoplasmast. Samas kui F1F0-ATP-süntaasi ekspressiooni vähendatakse, et vähendada H+ ioonide transportimist rakku. Streptococcus mutans’l, peamisel kaariese tekitajal, on ainult osaline hingamisahel ning ta ei suuda läbi viia oksüdatiivset fosforüülimist, siis selline neutrofiil kasutab F1F0-ATP-süntaasi võimet tagurpidi töötada ning hüdrolüüsida ATP-d. Sellega bakter pumpab prootoneid tsütoplasmast välja. Aluselises keskkonnas on bakteril oluline transportida prootoneid rakku, et hapestada tsütoplasmat. See saavutatakse peamiselt katioon-prooton antiporterite tööle lülitamisega. E. coli tõstab tsütokroomi bd ekspressiooni, mis ei pumpa prootoneid tsütoplasmast välja hingamisahela käigus ning vähendab nende hingamsiahela komponentide ekspressiooni, mis transpordivad prootoneid rakust välja. Lisaks suurendatakse F1F0- ATP-süntaasi ekspressiooni. Sellega vähendatakse prootonite kadu PMF loomise ajal ning suurendatakse võimalikku transporti rakku tagasi.
Grampositiivsetes (G(+)) bakterites (Enterococcus hirae) töötab F1F0-ATP-süntaas kogu aeg ATP hüdrolüüsival režiimil ning pumpab H+ rakust välja. Leeliselistes tingimustes E. hirae ei ekspresseeri peaaegu üldse seda süntaasi. Samal ajal indutseeritakse Na+-sõltuv V1V0-ATPaas, mis on aluselistes tingimustes G(+) bakteritel peamine transmembraanse potentsiaali tekitajaks .
Leeliselistes tingimustes on transmembraanse potentsiaali genereerimine äärmisel oluline, toetamaks katioon-prooton antiporterite tööd nii hingamisahelaga bakteritel, kui ka bakteritel, mil täielik hingamisahel puudub. Na+ või K+ antiporterid on aluselistes tingimustes äärmiselt olulised valgud, mille abil bakter hoiab oma tsütoplasma happelisemana kui väliskeskkond. Tavaliselt pole katioon-prooton antiporterid võrdsed. Ühe Na+ välja transportimisega tuuakse sisse rohkem kui üks H+. Näiteks E. coli NhaA abil tuuakse rakku 2 H+ ja viiakse rakust välja 1 Na+. Prootonite sissetoomine toimub väga suure transmembraanse potentsiaali () abil, sest raku sisemus on negatiivselt laetud. Kui rakud on keskkonnas, kus on Na+ väga vähe või vastupidi, väliskeskkonna Na+ ioonide kontsentratsioon on väga kõrge, siis on K+ antiporteritel suurem tähtsus. Bakterid transpordivad prootoneid sisse kaalium-prooton antiporterite abil. G(+) bakter E. hirae inaktiveerib ja represseerib V1V0-ATPaasi väga aluselises keskkonnas. Samuti on väga kõrge pH väärtuse juures aktiivne kaalium-prooton antiporter ning naatrium -prooton antiporter NapA on aktiivne pigem vähem aluselises keskkonnas.
NhaA on E. coli’l hädavajalik valk, kohanemaks leeliseliste tingimustega kui keskkonnas on piisavas hulgas naatriumi. NhaA on väga kiire transportvalk, ühe minuti jooksul NhaA katalüüsib 105 Na+/2H+ vahetust. NhaA on tugevasti pH-sõltuv valk. Selle valgu aktiivsus tõuseb kolm suurusjärku kui väline pH tõuseb 6,5-lt 8,5-le. Bakter ei suuda toime tulla aluselises keskkonnas kui nhaA geenis on toimunud mutatsioonid , mis muudavad valgu kiirust, pH-sõltuvust või Na+/2H+ transporti.

4.1.2. Prootonite tarvitamine või genereerimine metaboolsete ensüümide abil.

Teise võimalusena hoida tsütoplasma pH stabiilsena on metabolismi reguleerimine. Happelistes tingimustes on soodustatud sellised metaboolsed protsessid, mis tarbivad tsütoplasmas H+, siia alla kuuluvad hüdrogenaasid ja aminohapete dekarboksülaasid. Anaeroobsetes tingimustes kui keskkonna pH on väga madal pH 2,0 – 2,5, aktiveerib E. coli hüdrogenaas 3, mis katalüüsib H+ muutmist H2. Neutrofiilides, mis satuvad äkki happelisse keskkonda, on olulised aminohapete dekarboksülaasid, näiteks glutamaadi dekarbüksolaas (E. coli’s GadB), mis lagundab glutamaadi -aminovõihappeks ehk GABA -ks (inglise keeles -amonibutyric acid), arginiini dekarbüksolaas ja lüsiini dekarboksülaas. GadB partner GadC abil transporditakse tsütoplasmast GABA välja. GABA transportimisega välja transporditakse glutamiinhape rakku.
Vastupidiselt happelisele keskkonnale, aktiveeritakse aluselises keskkonnas aminohapete deaminaasid näiteks trüptofaani deaminaas TnaA või metabolismirajad, mis toodavad orgaanilisi happeid .
hüdrogenaas:
glutamaadi dekarboksülaas:
trüptofaani deaminaas ehk trüptonaas:
Transkriptsiooni reguleerimine. E. coli hakkab väga happelises keskkonnas (maohape) ekspresseerima sigma-faktoreid, mis lülitavad sisse geenid , mis on vajalikud happelise keskkonnaga toime tulemiseks. Lisaks arvatakse, et Crp- cAMP seondub sigma-faktoriga, mille tulemusena tekib kompleks , mis talub madalat pH-d.

4.1.3. Passiivsed mehhanismid, mis toetavad pH homöostaasi

Üldiselt pole leitud tugevat seost bakteri tsütoplasma puhverdusvõime ja pH-homöostaasi vahel, arvatakse, et passiivsetel mehhanismidel on pH homöostaasil siiski oluline roll. Näiteks membraani koostisest ning raku pinna laetusest sõltub kui hästi laseb membraan prootoneid läbi. Membraanid ei tohi prootoneid läbi lasta, vältimaks prootongradiendi ja elektrilise gradiendi kadu. Näiteks ekstreemsetel termofiilidel koosneb membraan tetraeetrilistest lipiididest, mis vähendab prootonite läbilaskvust märgatavalt võrreldes eubakterite estersidemega kahekihilise membraaniga.
Kõrge temperatuur muudab bakterite ja arhede membraani vedelamaks ja seega ka prootonitele paremini läbitavaks. Kui membraan laseb liiga palju prootoneid või Na+-ioone läbi, ei suuda rakk hoida PMF-i ning elutegevus lõpeb. Selle tõttu on membraani koostis ka peamine faktor, mis määrab ära maksimaalse temperatuuri, mille juures bakter on võimeline kasvama. Bakterid ja arhed hoiavad membraani prootonite läbilaskvust väga väikeses vahemikus, mis võimaldab bakteritel kiiresti kasvada (joonisel lilla triibuna). Mõned termofiilsed bakterid pole oma temperatuuri kasvuoptimumil võimelised vähendama membraani läbilaskvust prootonitele, näiteks Bacillus stearothermophilus ja Thermotoga maritima. Nende membraanid lasevad väga suures hulgas prootoneid läbi. Mõned termofiilsed bakterid (nt Clostridium fervidus) kompenseerivad prootonite sissetungi tugeva hingamisahela valkude ekspresseerimisega ning töötamisega. Enamik termofiilseid baktereid kasutavad energia tootmiseks ning elutegevuseks H+-gradiendi asemel Na+-gradienti. Kuna naatrium on vesiniku aatomist tunduvalt suurem, siis membraanid lasevad naatriumi-ioone tunduvalt halvemini läbi. Samas membraanide Na+-ioonide läbilaskvus pole lineaarses sõltuvuses temperatuurist, pigem eksponentsiaalses sõltuvuses. Siiski, see on piisav, et luua vajalik Na+-ioonide gradient. Clostridium fervidus kasvuoptimum on 70 C, mis on kõrgem kui Bacillus stearothermophilus’el (65 C). Kuid kuna membraan on väga läbitav prootonitele, siis Clostridium pole võimeline tsütoplasma pH-d stabiilsena hoidma ning suudab kasvada ainult väga kitsa pH-ga (peaaegu neutraalne ) keskkonnas, et hakkama saada prootonite sissetungiga.
Raku pinna laeng on teine passiivne mehhanism , mille abil bakter püüab tsütoplasma pH-d stabiilsena hoida. Atsidofiilsete bakterite pinnavalkude pI (valgu isoelektriline täpp ehk pH väärtus, mille juures valgu laeng on 0) on palju kõrgem kui neutrofiilidel. Näiteks Acidithiobacillus ferrooxidans’i pinnavalgu OmpA pI on 9,4, samas kui E. coli OmpA pI on 6,2. Seega happelises keskkonnas atsidofiilide pinnavalkude positiivne laeng tõukab prootoneid eemale. Vastupidiselt atsidofiilidele, on alkalofiilide pinnavalkude pI madalam kui neutrofiilidel. Näiteks tsütokroom C oksüdaasi subühik 2 on eksponeeritud rakuväliselt ning Bacillus pseudofirmus’l on see pI 4,4, samas kui neutrofiilil Bacillus subtilis’l on see 8,6. Madala pI väärtusega valgud tõmbavad tõenäoliselt prootoneid ligi ning bakteril on hõlpsam hoida tsütoplasma pH-d stabiilsena.
G(+) alkalofiilide sekundaarne rakukest koosneb happelistest polümeeridest nagu teihhuuhapetest või happelistest valkudest nagu S-kihi valk SlpA. Need polümeerid ja valgud tõenäoliselt aitavad siduda prootoneid ning teevad rakule prootonid seeläbi kergemini kättesaadavaks. Kui B. pseudofirmus’l lüüa välja slpA geen, siis need mutandid ei suuda toime tulla järsu pH muutusega 7,5-lt 11-le. Metsik tüvi kasvab pH 7,5 juures kiiremini kui slpA knock-out-mutant tõenäoliselt selle pärast, et SlpA ekspressioon on energiakulukas, kuid ei talu keskkonna muutumist järsku aluseliseks.

4.2. Ekstremofiilide kohanemine pH-ga

Erinevalt teistest gram-negatiivsetest ehk G(-) bakteritest sh E. coli’st hoiab Helicobacter pylori (patogeen inimese maos) pH stabiilsena periplasmas, mitte tsütoplasmas. H. pylori periplasma pH on stabiilselt 6,1 vaatamata keskkonna pH 2-le. Helicobacter’i periplasma pH homöostaas saavutatakse ureaasi ja -karbonaat dehüdrataasi abil. Esimene lagundab inimese mao rakkude eritatud uurea ammoniaagiks (NH3) ja karboksüülhappeks (H2CO3) ning teine ensüüm lagundab karboksüülhappe H2O-ks ja CO2, mis liigub periplasmasse ning -karbonaat dehüdrataasi abil HCO3 - ja H+. Ammoniaak liigub sama moodi periplasmasse ning muudetakse ammooniumiooniks (NH4+). Uureat transpordib pH-tundlik transporter UreI periplasmast tsütoplasmasse. Ammoniaak ja CO2 difundeeruvad tsütoplasmast periplasmasse.
Atsidofiilidel aitab taluda madalat pH-d ka prootonite vesiikulite teke tsütoplasmas. Lisaks aitab atsidofiilidel prootonite transporti vastupidine membraanipotentsiaal, mis saavutatakse K+-ioonide transportimisega tsütoplasmasse ning orgaaniliste hapete lagundamine CO2 ja H2.
Alkalofiilidel on pH-gradient vastupidine kui neutrofiilidel ning PMF on tekitatud peamiselt transmembraanse potentsiaali abil. Alkalofiilidel on eriti olulised Na+/H+ antiporterid. Näiteks alkalofiilsetel Bacilluste’l on Mrp antiporter, mis koosneb 7 hüdrofoobsest subühikust. Kui mrp geenid deleteerida, siis bakterid pole võimelised elama leeliselises keskkonnas. Alkalofiilid kasutavad ka F1F0-ATP-süntaasi nii pH homöostaasi kui ka ATP sünteesiks. ATP süntaasi abil tuuakse rakku prootoneid. Alkalofiilidel on F1F0-ATP-süntaasi pH optimum kõrgem ning ATP-hüdrolüütiline aktiivsus pärsitud.
Neutrofiilide kaitsemehhanismid eriti happelise keskkonna korral. E. coli on neutrofiil ning elab peamiselt imetajate soolestikus . Kuid soolestiku koloniseerimiseks peab E. coli läbima imetaja mao happelise keskkonna, kus pH  2,0. E. coli’l pole välja arenenud mehhanisme, mille abil saaks bakter elada nii madalal pH-l, kuid tal on kolm erinevat mehhanismi, mille abil bakter suudab paar tundi happerünnakule vastu pidada. See on piisav aeg läbimaks magu .
Esimene mehhanism AR1 (inglise keeles acid resistance system 1) on kõige ebaselgem ning vähem aru saadud. Pandi tähele, et LB-l (aminohapeterikas sööde) kasvanud rakud jäävad pH 2,5-le ümber külvates ellu, samas kui minimaalsöötmes kasvanud rakud, kus C-allikaks on glükoos, ei suuda ekstreemselt madalal pH-l ellu jääda. Leiti, et pH 2,5 talumiseks on bakteritel vaja sigmaS ning CRP-cAMP-d. Kuid, mis geene need regulaatorid aktiveerivad, pole veel täpselt teada, kuid glutamaadi dekarboksülaasi geenid on sigmaS-ga aktiveeritavad. AR1 alla arvatakse ka F1F0-ATP-süntaasi tagurpidi töötamine ning sellega prootonite väljapumpamine rakust. AR1-ga pole seotud aminohapete dekarboksüleerimine.
AR2 ja AR3 on kaks happeresistentsuse mehhanismi, mõlemad seotud aminohapete dekarboksüleerimisega. AR2-ga glutamaadi dekarboksülaas GadB ja transporter GadA. AR3 on arginiini dekarboksüleerimine, mida viib läbi AdiA.
E. coli sattumisel pH 2,5 juurde hapestub bakteri tsütoplasma rohkem, kui seni arvati. Tsütoplasma pH langeb umbes 4,5-ni. AR2 hoiab pH-d 4,2 juures ning AR3 pH 4,7 juures, nende pH väärtuste juures on ka mõlema dekarboksülaasi pH-optimumid, GadB-l pH 4 ja AdiA pH 5. Kui bakteri tsütoplasma tõuseb üle dekarboksülaaside optimaalse pH, siis ensüümid aeglustuvad kuni pH on jälle ensüümide optimaalsel tasemel. Teised aminohapete dekarboksülaasid, nagu lüsiini ja ornitiini dekarboksülaasid, ei oma keskkonna nii madalal pH väärtusel erilist tähtust bakteri tsütoplasma pH homöostaasi tagamisel, sest nende pH optimum on tunduvalt kõrgem.
Aminohapete dekarboksüleerimise käigus vähendatakse tsütoplasmas H+ kontsentratsiooni. Kui dekarboksüleerimise lõpp- produktid GABA (Glu) ja agmatiin (Arg) rakust välja viiakse, siis väheneb tsütoplasmas prootonite kontsentratsioon ning pH tõuseb (stabiliseerub dekarboksülaasi optimumi lähedale). Prootonite sissetungi vähendab ka vastupidine transmembraanne potentsiaal. E. coli-il (nagu ka atsidofiilidel) toimub transmembraanse potentsiaali vastasmärgiliseks muutumine, membraani sisekülg on positiivselt laetud ning väliskülg negatiivselt laetud. Arvatakse, et tsütoplasma membraani sisekülje positiivne laeng tuleneb kas prootonite ülehulgast endast või mängivad rolli siin agmatiini kontsentratsiooni tõus tsütoplasmas. Membraani sisekülje positiivse laenguga takistatakse prootonite tungimist tsütoplasmasse positiivse laenguga.
E. coli tsütoplasma pH homöostaasi hoidmisel on oluline roll ClC kanalil, mis reguleerib Cl- ioonide liikumist väliskeskkonna ja tsütoplasma vahel. Välja on pakutud kaks hüpoteesi. Esimese kohaselt siseneb bakterisse HCl, mis mao madala pH tõttu on maos laenguta, kuid bakteri tsütoplasmas laguneb H+ ja Cl- ioonideks. Prooton kasutatakse ära aminohapete dekarboksüleerimise käigus, kuid ClC transporter viib Cl- iooni tsütoplasmast välja vältimaks membraani hüperpolariseerumist (siseküljele antav negatiivne laeng suurendab prootonite sissetungi). Teise hüpoteesi kohaselt Cl- ioone tuuakse rakku H+/Cl- antiporteri abil, et ära hoida membraani sisekülje liiga kõrget positiivset laengut ning soodustamaks neutraalsel pH-l esialgse transmembraanse potentsiaali tekkimist (membraani sisekülg negatiivse laenguga).

5. Bakterite koordineeritud metabolism

Erinevalt taimedest ja loomadest elavad enamik baktereid keskkonnas, mille füüsikalis-keemilised omadused pidevalt muutuvad. Bakterid reageerivad keskkonna muutustele väga kiiresti ja täpselt, muutes struktuurivalkude, transportvalkude, toksiinide, ensüümide jms ekspressioonimustrit keskkonnatingimustele vastavaks. Näiteks E. coli ei sünteesi kolonisatsiooniks olulisi piilisid, kui bakter elab planktiliselt. Vibrio cholerae sünteesib kooleratoksiini (põhjustab kõhulahtisust) ainult siis, kui elab inimese soolestikus. Bacillus subtilis ekspresseerib trüptofaani biosünteesi geene ainult siis, kui keskkonnas on liiga vähe trüptofaani. Kui E. coli panna kasvama söötmele, mis sisaldab nii glükoosi kui laktoosi, siis bakter tarvitab esmalt glükoosi, kui energiarikkamat süsinikuallikat ja alles seejärel laktoosi.
Metabolism on mikroorganismide elu keskpunkt, sest metabolismi abil suudavad mikroorganismid tagada endale raku koostisosad ning energia koostisosade ehitamiseks. Vaatamata sellele, et mikroorganismid elavad väga erinevates keskkondades, on ülesanded, mis peab metabolismiga lahendama äärmiselt sarnased. Näiteks, kõik organismid peavad hankima toitaineid ning seejärel koordineerima tsentraalset metabolismi, monomeeride sünteesi ja seejärel makromolekulide polümerisatsiooni suurendamaks biomassi, mis päädib paljunemisega . Metabolism ja raku teised protsessid peavad olema koordineeritud, et tagada rakule vajalik hulk toitaineid ning energiat. Kuna raku metabolism on ulatuslik ning tihedalt seotud võrgustik, mis koosneb erinevatest keemilistest reaktsioonidest, siis metabolismi üldist regulatsiooni on väga keeruline hoomata, kuna „võrrandis on liiga palju muutujaid“. Siiski, tänapäeval on võimalik juba teha üldistusi raku metabolismi moodulite koordineeritud regulatsioonist.
Üldiselt bakterid ei ekspresseeri katabolismiks vajalikke ensüüme, kui keskkonnas pole substraati, mida lagundada. Vastupidine olukord on energiat raiskav ning bakterite kohasust vähendav. Sarnaselt katabolismiradadele on bakteritel välja kujunenud regulatsioonimehhanismid, mis kontrollivad anabolismi ning ekspresseerivad vajalikke ensüüme ainult siis, kui ainest tekib rakus puudus. Näiteks kui bakter leiab keskkonnast piisavalt aminohappeid, siis aminohapete biosüntees on represseeritud. Sellega hoiab bakter energiat kokku. Siiski, regulatsioonimehhanismid peavad olema paindlikud ja bakteri füsioloogia peab väga kiiresti reageerima keskkonnamuutustele. Sest toitainete kättesaadavus võib väga kiiresti muutuda.
Regulatoorne võrgustik, mis kontrollib raku metabolismi koosneb: metaboliitide interaktsioonidest, ensüümidest ja regulaatoritest. Kuigi metabolismi keerukus on hämmastav, on siiski võimalik metabolismi võrgustikku vaadelda moodulitena, mis moodustavad peamised aine- ja energiavood. Mooduli regulatsiooni uurimiseks on vaja väga hästi mõista sisendit , regulatsioonis osalevaid faktoreid ning nende abil kontrollida püstitatud hüpoteesi. Mõõtes substraadi tarbimist, (vahe) produkti kuhjumist ja transkriptsiooni on võimalik analüüsida metabolismi mooduleid. Näiteks kaheetapiline katabolism sõltub substraadi hulgast, mis mõjutab reaktsiooni kiirust ning regulatsiooni. Katabolismi regulatsioon võib toimuda vaheprodukti kuhjumisega, mis reguleerib ensüümide aktiivsust või aktiveerib regulaatorite sünteesi, mis vastavalt kiirendab aeglast etappi või represseerib vaheprodukti kuhjumist.
Toitainete transport, tsentraalne süsinikallika metabolism, energia genereerimine, aminohapetega varustatus ning valgusüntees on metabolismi peamised moodulid, mida on palju uuritud. Vaatamata sellele, et bakterid on väga erinevad, on metabolismi ülesanne universaalne ning regulatsiooni vooluringi sisend ning väljund tihti sarnased. Enamikul bakteritest on kolm metaboliiti, mis on metabolismi koordineeritud regulatsioonis tsentraalse tähtsusega, nendeks on: fruktoos -1,6-bifosfaat (FBP, inglise keeles fructose-1,6-bisphosphate), glutamiin (Gln) ja ATP. Kuigi metaboliidid on ühised, võib regulatsiooni sisend ja väljund erineda, mistõttu bakterite metabolismi regulatsioon on erinev. Metabolismi mudelorganismideks on E. coli ja Bacillus subtilis.

5.1. Metabolismi regulatsioonietapid

Metabolismi võib reguleerida põhimõtteliselt kolmel viisil:
1. Substraadi kättesaadavusega
1.1. substraadi kontsentratsioon ning transport, induktori välistamine
2. Ensümaatiliselt
2.1. Ensüümide kovalentsete sidemetega modifitseerimisega (fosforüleerimine,
atsetüleerimine)
2.2. Ensüümide mittekovalentsete sidemetega modifitseerimisega
2.2.1. allosteeriline regulatsioon
2.2.2. kofaktoritega
2.2.3. pH-ga reguleerimine
3. Valkude ekspressiooniga
3.1. Transkriptsiooniliselt
3.1.1. transkriptsioon initsiatsiooni reguleerimine
3.1.1.1. esimese nukleotiidi kättesaadavusega (ATP ja GTP hulk rakus)
3.1.1.2. promootori ehitusega (DNA superspiralisatsioon, kasvukiirus, sigma
faktori tüübist sõltuvus, diskiminaatori olemasolu)
3.1.1.3. regulaatorvalkudega
3.1.1.4. promootori asukohaga genoomis
3.1.1.5. vaba RNAP olemasoluga
3.1.2. transkriptsiooni attenuatsioon
3.2. Post-transkriptsiooniliselt
3.2.1. RNA elueaga
3.3. Translatsiooniga
3.3.1. translatsiooni initsiatsiooniga
3.3.2. translatsiooni elongatsiooniga
3.4. Post-translatsiooniliselt
3.4.1. valkude lagundamisega
Allosteeriline regulatsioon. Allosteerilisel ensüümil on aktiivtsenter, mis viib reaktsiooni läbi, ning allosteerilisesse taskusse seondub efektor , mis pole substraat ega vii reaktsiooni läbi. Efektor on vajalik ensüümi aktiivtsentri konformatsiooni muutumiseks. Efektor võib olla nii positiivse kui negatiivse mõjuga ensüümi aktiivsusele. Allosteerilise aktivatsiooni korral on ensüümi aktiivsuseks vaja efektori seondumine allosteerilisse taskusse, allosteerilise inhibitsiooni korral efektori seondumine muudab ensüümi inaktiivseks või pärsib ensüümi tööd. Allosteeriline regulatsioon on olemas ka transkriptsiooni regulaatoritel. Sellisel juhul on regulaatori aktiivtsentriks DNA-d siduv domeen ning allosteeriliseks taskusse seonduvaks efektoriks võib olla substraat, produkt või mõni muu regulatoorne molekul . Kui regulaatori DNA-d siduv domeen on aktiivne, siis see valk seondub DNA-ga, ning kui on inaktiivne siis regulaatorvalk ei seondu DNA-ga. Efektor mõjutab regulaatori seondumist DNA-ga.
Tagasisidestusega regulatsioon on allosteerilise regulatsiooni üks liik. Metabolismiraja lõpp-produkt inhibeerib oma biosünteesiraja esimesi etappe – negatiivne tagasisidestus. Iseloomulik aminohapete biosünteesiradadele. Biosünteesiraja esimene ensüüm on allosteeriline ensüüm, millega seondub produkt ning inaktiveerib ensüümi. Samas, kui metabolismiraja teised ensüümid jäävad aktiivseks. Näiteks trüptofaani biosünteesi pärsib trüptofaan ise läbi sünteesiraja esimese ensüümaatilise etapi inhibeerimise. Trüptofaan seondub anthranilaadi süntaasiga (TrpE+TrpD). Kui trüptofaani kontsentratsioon rakus langeb, aktiveerub biosünteesiraja esimene ensüüm ning rakk hakkab uuesti trüptofaani biosünteesima.
Positiivse tagasisidestuse korral sünteesiraja (vahe)produkt võib aktiveerida metabolismi. Nt fruktoos-1,6-bisfosfaat aktiveerib glükolüüsiraja alumisi ensüüme, mis lagundavad PEP-i püruvaadiks. Või CysB, mis tunnetab tsüsteiini biosünteesi vaheprodukte ning aktiveerib tsüsteiini biosünteesi raja geenide transkriptsiooni. O-atsetüülseriin aktiveerib CysB ning aktiveerib ka SO42- transporteri CysA. Samas tsüsteiin inhibeerib allosteeriliselt CysA ja CysE, mis katalüüsib L-seriinist O-atsetüülseriini.

5.2. Süsiniku transpordi ja katabolismi regulatsioon

Substraadi transport. Heterotroofsed bakterid nagu E. coli, kasutavad energia tootmiseks erinevaid süsinikallikaid. Sellised bakterid ei kasuta kõiki süsinikallikaid korraga, vaid transpordivad rakku süsinik- ja energiaallikaid hierarhilises järjekorras, kasutamaks esmalt energiarikkamaid toitaineid. Kõigi olemasolevate transportsüsteemide pidev ekspressioon on energeetiliselt kulukas . Lisaks ei mahu kõik süsteemid bakteri membraani ning väheneb bakterite kohasus , sest metabolism on koormatud vähemenergeetiliste toitainete lagundamisega. Rakusiseste ja –väliste signaalide abil reguleeritakse ebavajalikud transportsüsteemid alla ning vajalikud üles.
Rakuväliseid signaale tunnetab bakter peamiselt kahekomponentsete signaalsüsteemide abil. Millest üks on sukeldunud membraani ning seondub signaalmolekuliga. Sellele järgneb tsütoplasmas oleva regulaatorvalgu aktiveerimine, mis reguleerib geenide ekspressiooni. Umbes 60 kahekomponentset signaalsüsteemi on teada E. coli rakus, mis tunnetavad sealhulgas rakuvälist fosforit , nitraati ja süsinikallikat. Lisaks kahekomponentsetele signaalsüsteemidele on paljudel heterotroofsetel bakteritel nagu E. coli olemas rakusisesed süsinikallika sensorid, mis tunnetavad rakus süsinikallika kontsentratsiooni ning vastavalt signaalile reguleerivad geenide transkriptsiooni. Sellised ühekomponentsed sensorid on vahelüliks, mis tunnetavad metabolismiraja vaheprodukte ning aktiveerivad transportsüsteemi ning metabolismiks vajalike geenide ekspressiooni. Klassikaliseks näiteks on lac-operon, mille puhul rakusisene metabolismiprodukt allolaktoos seondub transkriptsiooni repressoriga LacI ning vabastab laktoosi transpordi ning katabolismigeenide transkriptsiooni repressioonist. E. coli’s reguleeritakse sarnaselt ühekomponentse regulaatori abil peale laktoosi veel glükoosamiini, trehaloosi, fukoosi ja maltoosi transporti. Arvatakse, et selline positiivse tagasisidestusega regulatsioon on erinevate substraatide transpordis bakterite seas valdav, kuna see on piisavalt tundlik tunnetamaks substraadi saadavust keskkonnast.
Kataboliitne repressioon. Positiivse tagasisidestusega regulatsioon võimaldab reguleerida substraadi omastamist tekke järgi keskkonda, kuid ei võimalda eristada substraate efektiivsuse järgi. Bakterid kasutavad esmalt energiarikkaid substraate, et suurendada kasvukiirust ning seeläbi kohasust. Energiaallikate hierarhilisest kasutamisest annab aimu diauksia, mis näitab tarbitava süsiniku- ja energiaallika vahetumist. Kataboliitne repressioon on nähtus, mille abil kasutatakse C- ja energiaallikaid hierarhiliselt, mis tunnetab eelistatud C-allika olemasolu ning represseerib teiste C-allikate transporti ja katabolismi. Kataboliitne repressioon toimub mitme tasandi abil: reguleeritakse mitte-eelistatud substraatide transporti, nende geenide ekspressiooni ja ensümaatilisel tasandil katalüüsi.
Induktori välistamissüsteem toimub transporterite tasemel. E. coli eelistatuim C-allikas on glükoos ning glükoosi esinemisel keskkonnas pärsitakse teiste, alternatiivsete C-allikate omastamine . E. coli transpordib glükoosi rakku fosfotransferaas-süsteemi abil (PTS, inglise keelest phosphotransferase system). Kui glükoos transporditakse PTS süsteemi abil rakku, siis süsteemi komponent EIIA on defosforüleeritud ning takistab otseselt mitte-eelistatud C-allikate transporti rakku nende transporterite kaudu.
Transkriptsiooni kaudu reguleerimine. Kuigi induktori välistamissüsteem võib olla efektiivne, on E. coli’l lisaks regulatsioonisüsteem, mis reguleerib mitte-eelistatud substraatide katabolismigeenide ekspressiooni. Regulatsiooni keskmeks on regulaator Crp (ingl k Catabolite repressioon protein), mille sünonüümne nimi on CAP (ingl k Catabolite activator protein). Crp on cAMP- seoseline transkriptsiooni aktivaator , mis efektori (cAMP) puudumisel ei aktiveeri sekundaarsete C-allikate transpordi- ja katabolismigeene. Tsüklilist AMP sünteesitakse adenülaattsüklaasi (AC) abil, mida aktiveerib fosforüleeritud EIIA. Kuna fosforüleeritud EIIA esineb peamiselt siis, kui keskkonnas glükoosi pole, siis glükoosi olemasolu pärsib efektori sünteesi ja Crp kaudu alternatiivsete C-allikate kasutuselevõttu. Adenülaattsüklaasi ekspresseeritakse E. coli’s pidevalt ning tema aktiivsuse regulatsioon toimub allosteeriliselt, kas keskkonnas on piisavalt glükoosi või mitte.
Glükoosi olemasolu korral keskkonnas, cAMP-d ei sünteesita ning Crp aktiveerib glükoosi transpordiks kasutatavast transportsüsteemist (PTS) ühe geeni (ptsG), püruvaadi dehüdrogenaasi (aceE), kaudselt tRNA ja ribosoomi valkude, ja RNAP geenid. Sellega suurendab Crp glükoosi juuresolekul püruvaadi sisenemist tsitraaditsüklisse ning glükoosi katabolismist saadud energia kasutamist valgusünteesiks. Glükoosi olemasolul on paljude geenide transkriptsioon pärsitud Crp vahendusel. Pärsitud on tsitraaditsükli geenide ekspressioon, mis kataboliseerib -ketoglutaraati (2-oksoglutaraat) edasi üle suktsinaadi, fumaraadi oksaalatsedaatiks. Samuti on pärsitud oksaalatsetaadi kineerimine PEP-ks (geenid sucAB, sucCD, sdhAD, fumA, mdh, pckA). Crp pärsib ka glüoksülaadirada tsitraaditsüklis (aceA, aceB). Pärsitud on sekundaarsete C-allikate katabolismi ja transpordigeenid ning mõningate aminohapete süntees: aspartaadi , trüprofaani ja seriini süntees. Pärsitakse ka proteaaside geenide süntees.
Metaboliitide kaudu regulatsioon. PTS süsteemi komponent EIIA fosforüleeritus ei sõltu ainult glükoosi transpordist vaid ka C-allika katabolismist. Näiteks glükolüüsi rajas tekkiv PEP-i (fosfoenoolpüruvaat) ja püruvaadi hulgast sõltub EIIA fosforüleeritus. PEP-s olevat fosforit kasutatakse EIIA fosforüleerimiseks. Kui keskkonnas on glükoosi, siis fosforüleeritud EIIA abil transporditakse glükoos rakku ning EIIA defosforüleeritakse. Kui keskkonnas glükoosi pole, siis EIIA jääb fosforüleerituks ning aktiveerib AC.
Lisaks PEP-le reguleerivad veel teised metaboliidid C-allika kasutamist. Ketohappeid, nagu -ketoglutaraati, püruvaati ja oksaalatsetaati kasutatakse aminohapete sünteesiks kui substraati. Kui rakus ketohapped kuhjuvad, siis pärsitakse glükoosi transport rakku ning AC. Sellisel moel reguleeritakse C:N vahekorda rakus ning metabolismi kaks poolt - C-allika katabolism ja aminohapete anabolism - on seotud.
Transkriptsiooni kaudu metabolismiradade reguleeritus ei iseloomusta kuigi hästi bakterite metabolismi regulatsiooni, sest metabolismirajad on tugevasti reguleeritud allosteerilise regulatsiooniga. E. coli võib uue substraadiga keskkonnas kohaneda sekundite jooksul just allosteerilise regulatsiooni, kas metaboliidi seondumise või post-translatsiooniliste modifikatsioonide abil. Selliseid universaalseid signaalmolekule, mis annaks bakterile aimu raku energeetilisest seisundist ning C-allika kasutamisest, pole palju: FBP, cAMP, L-glutamiin, -ketoglutaraat, ketohapped nagu püruvaat, oksaalatsetaat; lisaks L- leutsiin , ppGpp, ATP, kinoloonid.
FBP on suhteliselt hästi kirjeldatud signalisatsiooni näide, mis kasutab nii allosteerilist regulatsiooni kui ka transkriptsiooni tasandil regulatsiooni. Transkriptsioonifaktor Cra (FruR) on glükolüütiliste ensüümide ekspressiooni repressor ning aktiveerib glükoneogeneesis osalevate geenide transkriptsiooni. Aktiivse glükolüüsi ajal on Cra inaktiveeritud FBP-ga seondumise tõttu. Kuigi FBP on tsentraalne metaboliit mitmete metabolismiradade jaoks, siis jääb arusaamatuks, miks glükolüüsi ajal peaks FBP kuhjuma. Võti seisneb glükolüüsi raja alumiste ensüümide allosteerilises aktiveerimises, mis ei saa toimuda enne, kui on piisavalt kuhjunud FBP-d ning tasakaalustab glükolüüsi ülemise ja alumise raja alles piisava FBP kontsentratsiooni korral. FBP on allosteeriline aktivaator püruvaadi kinaasile ja PEP karboksülaasile.
FBP allosteeriline püruvaadi kinaasi aktiveerimine on väga tugevalt konserveerunud, isegi eukarüootidel sh inimesel aktiveerib FBP püruvaadi kinaasi. Kuna mõlemad ensüümid, mille suhtes on FBP aktivaator, vähendavad PEP-i hulka rakus, siis FBP ja PEP allosteerilised aktivatsioonid on vastandlikud. PEP-i kasutatakse Pst süsteemi fosforüleerimiseks, mis on vajalik glükoosi transportimiseks rakku, FBP vähendab rakus PEP-i hulka. PEP-i hoitakse rakus siiski teatud kontsentratsioonil just FBP kontsentratsiooni vähenemisega. PEP-i lagundavad ensüümide aktiveerimiseks on vajalik FBP kuhjumine , mistõttu teatud kontsentratsioonist PEP-i enam ei kataboliseerita. Arvatavasti on PEP-i teatud kontsentratsioon vajalik glükoosi transportsüsteemi reaktiveerimiseks, kui glükoos tekib uuesti keskkonda ning FBP kontsentratsiooni languse kaudu, mis annab märku glükoosi hulga vähenemisest, hoitakse rakus piisaval koguses PEP-i.

Metabolismiradade seotus glükolüüsiga tuleneb sellest, et osa glükolüüsi raja vaheprodukte on allosteerilised regulaatorid teiste metabolismiradade ensüümidele või nendest hargnevad paljud teised metabolismirajad. Sellisteks metaboliitideks on PEP, püruvaat, glüoksülaat, oksaalatsetaat. Nt püruvaadist algab arginiini biosüntees, püruvaat on allosteeriliseks aktivaatoriks 6 ensüümile ning allosteeriline inhibiitor 12 ensüümile, lisaks efektor kahele transkriptsiooni regulaatorile PdhR ja IclR. Seetõttu on peale püruvaadi dehüdrogenaasi aktiveerimise seotud püruvaat veel raku jagunemisega ja peptidoglükaani sünteesiga.
Tänapäeval takistab sünteetilisel bioloogial kõiki seoseid modelleerimast biokeemiliste andmete puudus üksikute reaktsioonide jaoks. Paljud regulatsioonietapid on veel kirjeldamata. Tõenäoliselt lähiajal ei suudeta keskkonnast tulnud signaale ja tsentraalsest metabolismist lähtuvat informatsiooni veel modelleerida ning bakteri käitumist ette ennustada.

5.3. Energia metabolism

ATP keskne roll. Rakud säilitavad biokeemilist energiat ATP-na. Kahe mehhanismi abil on bakterid võimelised ATP-d tootma – substraatne fosforüülimine ja oksüdatiivne fosforüülimine (membraanne fosforüülimine, hingamine ). Elektronid kantakse substraadi redoksreaktsioonides üle hapnikule või teistele oksüdeeritud ühenditele, nagu nitraat , nitrit , või sulfaat. Elektronide aktseptor redutseeritakse hingamisahelas, mis elektronide ülekande ajal transpordib H+ väliskeskkonda. Sellega tekitatakse membraani eri pooltel prootongradient, mida kasutatakse ATP sünteesiks ATP-süntaasi abil. Oksüdatiivne fosforüleerimine on suurema ATP saagisega ühe substraadi molekuli kohta kui substraatne fosforüleerimine, kuid protsessist peavad osa võtma rohkem valke (tsitraaditsükli ensüümid, elektronide transport, prootoni transport, ATP süntetaas, reaktiivsete hapnikuradikaalide kahjutukstegemine jne). Bakteril on kaks võimalust ATP sünteesi suurendamiseks , kas kataboliseerida rohkem substraati või suunata energiatootmine üle oksüdatiivse fosforüleerimise.
C-allika katabolismi reguleerib peale Crp-cAMP veel otseselt ATP/ADP+AMP suhe. Kui Crp tunnetab ketohapete kaudu C:N vahekorda ning ketohapete vähesus signaliseerib C-defitsiiti, siis ATP hulk rakus otseselt võib reguleerida energiadefitsiiti ja mõjutada glükolüüsi. ATPaaside kunstlikul üleekspressioonil vähenes ATP kontsentratsioon rakus, mille järel suurenes glükolüüs. ATP ja tema analoogid ADP ja AMP võivad reguleerida paljude ensüümide aktiivsusi, kuid fruktoos-6- fosfaadi ja fruktoos-1,6-fosfaadi suhte reguleerimisel on ATP eriti oluline. ATP inhibeerib fosforüleerimist ja AMP inhibeerib defosforüleerimist. Suure hulga AMP korral suurendatakse glükolüüsi, et korvata energia puudust.
Tsitraaditsükli geenide transkriptsiooni kontroll. Tsitraaditsükli tööd reguleeritakse nii geenide transkriptsiooni tasandil kui ka metaboliitide tasandil. Peamine on geenide transkriptsiooni kontroll, mis iseenesest on kulukas. Kiiresti kasvavad rakud sünteesivad peamiselt ribosoomivalke ning E. coli’s kontrollib peamiselt kaks transkriptsiooni regulaatorit tsitraaditsükli geenide transkriptsiooni eest: Fnr ja ArcA .
Fnr tunnetab otseselt rakusisese molekulaarse hapniku kontsentratsiooni. Hapniku puudumisel Fnr represseerib aeroobse hingamisega seotud geenide transkriptsiooni ning aktiveerib anaeroobse metabolismiga seotud geenide transkriptsiooni. Fnr on Fe-S klastriga valk, mis homodimeriseerub hapniku puudumisel ning sellises vormis reguleerib transkriptsiooni. Hapniku juuresolekul Fnr monomeriseerub väga kiiresti ning kaotab Fe-S klastri , valk inaktiveerub.
ArcA on kahekomponentse signaalsüsteemi ArcAB transkriptsiooniregulaator. ArcB on membraaniseoseline sensor , mis tunnetab hingamisahela redokskandjaid, ning redutseeritud substraate nagu NADH, laktaat , atsetaat ja püruvaat. Sensori fosforüleerimist soodustavad redutseeritud substraadid ning pärsivad membraani kuhjunud oksüdeeritud kinoonid . ArcB fosforüleerib ArcA ning viimane represseerib oksüdatiivses fosforüleerimises osalevate geenide transkriptsiooni sealhulgas tsitraaditsükli geenid ning aktiveerib kääritamises (substraatne fosforüleerimine) osalevate geenide transkriptsiooni.
Siiski, molekulaarne hapnik pole ainuke regulatoorne faktor. Crp reguleerib samuti tsitraaditsükli ensüümide geenide transkriptsiooni, mis näitab, et ka substraat keskkonnas reguleerib energia sünteesi. Tsitraaditsükli toimimist reguleerib metaboliitide tasemel -ketoglutaraat. See ketohape reguleerib allosteeriliselt tsitraadi süntaasi (citE, oksaalatsetaat + Atsetüül-CoA -> tsitraat + CoA), mis on tsitraaditsükli esimene etapp. See omakorda näitab, et energia tootmine sõltub C-allika saadavusest.

5.4. Lämmastiku transport ja metabolism

Lämmastiku omastamine ning substraadi valik kajastub paljuski C-allika metabolismis. E. coli eelistatud N-allikas on NH4+ kujul, kuid bakter kasutab ka palju teisi orgaanilisi N- allikaid . Sarnaselt C-allika omastamisele ja metabolismile, tunnetab bakter N-allikaid omastamise järel ning vastavalt sellele aktiveerib vajalikud transpordirajad ning metabolismirajad. E. coli’l on ainult mõni näide induktori välistamise kaudu N-allika omastamise regulatsioonist. Sarnaselt Crp-cAMP süsteemile võib E. coli’s leida N-allika keskseid reguleerijaid – GlnB (tuntud ka kui PII), mis inhibeerib transkriptsiooni regulaatorit NtrC (tuntud ka kui NRI) läbi fosforüleerimiskaskaadi. GlnB takistab NtrC fosforüülimist, mis on vajalik GlnA (glutamiini süntetaas) geeni transkriptsiooniks. Lisaks, NtrC aktiveerib mitmesuguste N-allikate transpordiga ja metabolismiga seotud geenide transkriptsiooni ning peaks olema aktiveeritud ainult N-nälja korral.
Lämmastikallikat tunnetatakse glutamiini (Gln) kontsentratsiooni järgi rakus, mis on peamine ammooniumi assimilatsiooni saadus ning on substraadiks paljude N-allikate anabolismil. Madal glutamiini kontsentratsioon rakus on N-nälja signaaliks ning vastupidi. Glutamiin hoiab ära GlnB inaktiveerivad modifikatsioonid ning seeläbi inhibeerib NtrC. Kui rakus on vähe glutamiini, siis GlnB inaktiveerub ning NtrC aktiveerib vajalike geenide ekspressiooni. Madala glutamiini kontsentratsiooni korral -ketoglutaraat inhibeerib GlnB. A-ketoglutaraadi ülehulk rakus signailiseerib bakterile, et C-allikat on piisavalt, tootmaks aminohappeid (glükolüüs on efektiivne, kuid aminohapete biosüntees ebaefektiivne). See kontrollsüsteem aktiveerib N-katabolismi, kui glutamiini kontsentratsioon on liiga madal ja kui -ketoglutaraadi kontsentratsioon on rakus liiga kõrge. GlnB-l arvatakse olevat veel teine regulatsiooniline tähtsus. GlnB seondudes -ketoglutaraadiga GlnB muutub inaktiivseks ning soodustab ammooniumi assimilatsiooni. Ammooniumi assimilatsioon on seotud ka glutamiini süntetaasi aktiivuse regulatsiooni kaudu. Paljud metaboliidid, nagu glutamiin ise ja mõned teised aminohapped, lisaks mõned nukleotiidid , pärsivad glutamiini süntetaasi aktiivsust. Kui rakus on palju glutamiini ja ATP-d, siis GlnB inhibeerib glutamiini süntetaasi GlnE kaudu. Kui -ketoglutaraadi/glutamiini vahekord läheb liiga suureks, siis GlnB-le pannakse külge UMP ning glutamiini süntetaas aktiveeritakse GlnE kaudu. Peale GlnB seondub -ketoglutaraat GlnK-ga, mis on GlnB homoloog , ja aktiveerib ammooniumi transportsüsteemi AmtB. AmtB kaudu ammooniumi transport on energiat kulutav ning kõrge afiinsusega ammooniumi transportsüsteem. GlnK kaudu AmtB aktiveerimisega reguleeritakse rakus väga täpselt N-allika olemasolu.
Nendest seostest tulenevalt võib -ketoglutaraati pidada E. coli ’s keskseks metaboliidiks, mis reguleerib C:N tasakaalu, aktiveerides N-assimilatsiooni ning pärssides C-allika lagundamist läbi Crp-cAMP signaali ning peale selle -ketoglutaraat otseselt inhibeerib PTS-i kaudu glükoosi transporti rakku.
Aminohapete transport ja metabolism
Aminohapete biosüntees ja katabolism on kiirelt reguleeritud peamiselt metaboliitide tasandil. Kõik 20 aminohapet on E. coli’s reguleeritud kas biosünteesi esimese etapi allosteerilise regulatsiooni kaudu või üheetapiliste radade korral produkti negatiivse tagasisidestuse kaudu. Kuna inhibitsioon mõjutab ainult teatud metabolismiradu, siis globaalset ega ka teiste aminohapete biosünteesile efekti pole.
Transkriptsiooniga on E. coli’s reguleeritud vähemalt 10 aminohappe biosünteesi, kas transkriptsiooni regulaatorite kaudu või siis transkriptsiooni attenuatsiooni abil. Mõni transkriptsiooni regulaator inhibeerib biosünteesi raja vahetappi, sel juhul kui allosteeriline regulatsioon on ebapiisav. Transkriptsiooni regulaatorid võivad kooperatiivselt reguleerida aminohapete biosünteesi. Näiteks ArgR, mis represseerib arginiini biosünteesi raja geene, kui arginiini on rakus palju. Samas ArgR aktiveerib arginiini katabolismiga seotud geene. Globaalne regulaator NtrC aktiveerib nii arginiini transpordi kui ka arginiini lagundamise, kui rakus on N-nälg.
Mitte kõik aminohapped ei reguleeri ainult enda biosünteesi ja katabolismi. Mõni aminohape võib reguleerida mitut biosünteesirada . Üks aminohape on erandlik – leutsiin. Leutsiin seondub transkriptsioonifaktoriga Lrp, mis reguleerib sadade geenide transkriptsiooni, kusjuures mitte kõik geenid pole seotud aminohapete metabolismiga. Lrp abil reguleeritakse ka rakkude sisenemist statsionaarsesse kasvufaasi. Siiani pole ühtegi konkreetset hüpoteesi, miks bakterid peaks leutsiini hulga kaudu tunnetama rakkude üldist nälga.
Valkude süntees ja kasv
Üks metabolismi lõppsaadus on aminohapetest valkude assambleerimine. Eksponentsiaalses kasvufaasis, kui bakterid kasvavad kiiresti, on umbes 75% rakkude transkriptsioonist suunatud ribosoomide ekspressiooniks. Selleks, et sünteesida valke, tunnetab bakter rakus olevat energiataset ning aminohapete kättesaadavust. ATP ja GTP kontsentratsioon mõjutavad otseselt rRNA geenide transkriptsiooni. Mõlemad nukleotiidid on transkriptsiooni initsiatsiooni esimesed nukleotiidid, mis RNA ahelasse lülitatakse. Initsieeriva nukleotiidi defitsiit langetab ka rRNA geenide transkriptsiooni ning rakkude kasvukiirust.
ATP hulga kaudu reguleeritakse rakkude kasvu ka kaudselt. ATP kontsentratsiooni langedes reorganiseeritakse bakteri transkiptsiooniaparaat ümber rRNA geenide transkriptsioonilt stressi vastuse geenide transkriptsioonile. ATP kontsentratsiooni langedes inhibeeritakse RpoS-i lagundamine, mis on stressi sigmafaktor.
Aminohapete kättesaadavust tunnetatakse alarmooni (p)ppGpp (guanosiintetrafosfaadi ja guanosiinpentafosfaadi) kaudu. Selle alarmooni süntees aktiveeritakse aminohapet mittekandva tRNA abil läbi allosteerilise RelA aktivatsiooni. Väike molekul (p)ppGpp toimib rRNA ekspressioonile kaheti, otseselt represseerides rRNA transkriptsiooni või üle regulaatori DksA. Peale rRNA geenide transkriptsiooni pärssimise, aktiveerib (p)ppGpp veel teatud aminohapete biosünteesi, mis leevendab aminohapete puudust.
Aktiivse kasvu ajal E. coli suunab ressursi ribosoomide sünteesile ning ensüümide sünteesile ning eelistab energiat pigem saada glükolüüsist kui oksüdatiivsest hingamisest, sest sellisel moel saab rakk kiiremini energiat kätte.

6. Energia tootmine

Selleks, et bakterid ellu jääks, peavad nad olema võimelised käituma vastupidiselt termodünaamika 2. seadusele, mis ütleb, et spontaanselt toimuvad süsteemid kaotavad korrastatust ning entroopia suureneb. Bakterid peavad suurendama korda, et ehitada üles rakk ning panna see funktsioneerima. Selleks rakud esmalt päästavad energia valla keskkonnast leitud molekulidest ehk substraatidest ning seejärel talletavad valla päästetud energia universaalsetesse molekulidesse. Talletatud energiat kasutatakse korra loomiseks makromolekulide biosünteesi näol.
Kui rääkida energiast, siis tuleb alustada entroopia definitsioonist . Entroopia (S) on lihtsustatult öeldes korratuse mõõde, mida suurem on S-i väärtus, seda suurem on korratus . Keemiliste reaktsioonide, mis suurendavad entroopia väärtust (S > 0; S = SP – SS; produkti entroopia on suurem kui substraadi entroopia), toimumine on soodustatud ning need toimuvad spontaanselt. Sellistel reaktsioonidel vabaneb energia. Keemilised reaktsioonid, mis vähendavad entroopiat (S Gibbsi energia (G = GP – GS; produkti energia – substraadi energia). Kui reaktsiooni Gibbsi energia on negatiivne, toimub reaktsioon saaduste suunas. Positiivse G korral on pöörduvad reaktsioonid suunatud lähteainete poole või produkt ei teki spontaanselt ning vajab tekkimiseks lisaenergiat. Kui Gibbsi energia on 0, siis reaktsioon on jõudnud tasakaaluolekusse ning reageerimine lõppeb. Eelistatud on need reaktsioonid, kus vabaneb palju vaba energiat ehk siis negatiivne G on väga suur ehk entroopia suurenemise suunas. Seega Gibbsi energia väljendab seda energiat, mis vabaneb või on vaja teha produkti saamiseks. (Seos entroopiaga: G = H – TS; H on entalpia , süsteemis sisalduv energia, T on temperatuur Kevinites, S on entroopia muutus).
Rakkude eesmärk on kinni püüda substraadis paiknev energia ning talletada see molekulidesse, mille energiat saab hiljem kasutada makromolekulide biosünteesiks ehk korra loomiseks. Teisisõnu talletada glükoosi lagundamisest CO2 ja H2O-ks vabanev energia (-G) ATP-na ning kasutada seda energiat reaktsioonide läbiviimiseks mille G on positiivne. Anaboolsete reaktsioonide peamine energiallikas on ATP ning sellest johtuvalt on bakteri jaoks äärmiselt oluline toota võimalikult palju ATP-d, et rakk suudaks kasvada. ATP-d toodetakse kahel moel: substraatsel fosforüülimisel ja oksüdatiivsel fosforüülimisel (nimetatakse ka membraanseks fosforüülimiseks ja hingamiseks).
Suure -G väärtusega ATP energiat kasutatakse reaktsioonideks, millel on suur +G väärtus. Ühe mooli ATP lagundamisel ADP-ks ja Pi vabaneb 32 kJ energiat. Seda energiat kasutatakse biosünteesil. Energia ülekanne ATP-lt mingi reaktsiooni toimumiseks on tavaliselt üle vaheühendite tekke. Olgu hüpoteetiline ensüüm, mis viib läbi kahe substraadi liitmisreaktsiooni A-H + B-OH = A-B + H2O. Esmalt kantakse ATP energia üle B-OH konverteerimiseks B-O-PO4 vaheühendiks. See vaheühend on väga lühikese elueaga ning B-O-PO4 vaheühendi lagunemisest vabanenud energiat kasutab ensüüm A-B loomiseks.

6.1. Substraatne fosforüülimine

Substraatsel fosforüülimisel moodustub ATP fosforüülrühma ülekandumisel ADP-le katabolismi makroergiliselt vaheproduktilt. ATP-d kasutatakse vahemolekuliks, mis vahendab energia liikumist nn kõrge energiasisaldusega süsteemidelt süsteemidele, mis vajavad energiat. Antud juhul kantakse energia üle substraadi fosfaatrühma makroergilise sideme näol ADP-le ja seejärel reaktsioonile, mis vajab energiat. Kuigi ATP-s on P-O side ning selle katkemisel vabaneb energia, on täpsem rääkida ikkagi fosforüülpotentsiaali ülekandest. Oksüdatiivsel fosforüülimisel kantakse edasi elektronide ja prootonite potentsiaali, mis tekib redoksreaktsioonides.
Kolm peamist reaktsiooni, mille abil luuakse makroergiline side substraadile, mis kantakse üle ADP-le: dehüdrogeniseerimine (H2-äravõtmise abil), dehüdratatsioon (H2O-äravõtmise abil) ning transatsetülatsioon (atsetüülrühma CH3CO - ülekandmisel ühelt ühendilt teisele).
GAP-i oksüdeerimine. EMP rajas (Embden-Meyerhof-Parnas rada) oksüdeerib glütseeraldehüüd-3-fosfaadi dehüdrogenaas (G3P hüdrolaas) GAP-i (glütseeraldehüüd-3- fosfaat ), mille tulemusel liidetakse molekulile Pi ning moodustub 1,3-bisfosfoglütseraat, millel on üks fosfaatrühm makroergilise sidemega. Makroergilise sidemega P kantakse ADP-le, moodustub ATP. Tegelikult koosneb makroergilise sideme loomine GAP-le kolmest järjestikusest reaktsioonist: tioolrühma lisamisest, vesiniku ülekandmisest NAD-le ning fosforüleerimisest, mis päädib ADP-le makroergilise sideme ülekandega. Reaktsioon algab tioolrühma ülekandega GAP-le ensüümi katalüütilise aktiivtsentri tsüsteiinilt. Kuna tioolestrite dehürdogeenimisel vabaneb tunduvalt rohkem energiat kui tavalistelt hapnikuestritelt, siis vabaneva energia abil liidetakse hapnikule fosfaatrühm. Selle fosfaatrühma kannab ADP-le üle fosfoglütseraadi kinaas ning moodustub ATP.
Makroergiline side võib tekkida ka substraadilt vee äravõtmisega ehk 2-fosfoglütseraadi dehüdratatsiooniga. Reaktsiooni viib läbi enolaas ning tekib PEP (fosfoenoolpüruvaat). 2-fosfoglütseraadi 3C-lt –OH rühma ning 2C –H liitmine tekitab süsinike vahel kaksiksideme, mis muudab PEP ebastabiilseks, kuid n-ö energiseerib fosfaatrühma. Püruvaadi kinaas kannab makroergilise sideme üle ADP-le.
Fosfaat-atsetüültransferaas vahetab atsetüül-CoA-s CoA energeetilise tioolesterisideme fosfaadi vastu, mis on samuti makroergiline side. Atsetaadi kinaas kannab makroergilise sidemega fosfaadi ADP-le.
(NB! järgnev skeem on illustratiivne, seda ei pea peast teadma)
Süsivesikute lagundamisest saadav ATP-saagis sõltub metabolismiradadest, mida bakter katabolismiks kasutab. EMP rajas lagundatakse heksoos kaheks trioosfosfaadiks fruktoos-bisfosfaadi aldolaasi abil ning laktaadi lagundamisel saadakse saagiseks 2 ATP-d. See on kõige tavalisim glükoosi katabolismirada. Kuid näiteks Acetobacterium xylinum, Lactobacillum (heterofermentatiivsed liigid) ja Leuconostoc spp. lagundavad glükoosi pentoosfosfaadi rajas, kus glükoos muudetakse ksüloosiks, mille fosfoketolaas lagundab atsetüülfosfaadiks ja G3P-ks. G3P konverteeritakse EMP rajas püruvaadiks, mis edasi lagundatakse laktaadiks. Katabolismi saagiseks on 1 ATP-d, laktaat ja etanool .
pentoos + 1Pi +1ADP -> laktaat + etanool + 1ATP + 2H2O
(NB! järgnev skeem on illustratiivne, seda ei pea peast teadma)

6.2. Oksüdatiivne fosforüülimine

Süsivesikute oksüdeerimisega genereeritakse hingamisahelas elektronide edasiandmine läbi mitmete vaheühenditele lõppakseptorini nagu O2, nitraat või fumaraat. Süsivesikutest vabastatakse energia mitme redoksreaktsiooniga, mida kasutatakse prootonite rakust välja pumpamiseks . Kuna membraan laseb laetud osakesi difusiooni teel väga halvasti läbi, siis tekib prootongradient, mis koos elektrilise potentsiaaliga moodustavad prootoni liikumapaneva jõu (PMF-i).
Elektronide transportsüsteem (ETS ehk hingamisahel) võtab elektronid doonormolekulilt, mis on madala redokspotentsiaaliga molekul, ning kannab need positiivsema redokspotentsiaaliga ühendile ehk elektronide aktseptorile. Hingamisaehlas saadav energia (G) sõltub transportahela redokspotentsiaalide erinevusest (E). Neid reaktsioone katalüüsivad tsütoplasmamembraani seoselised kompleksid, mis kasutavad elektronide doonori ja aktseptori energiaerinevusi prootongradiendi tekitamiseks kahele poole membraani. Prootongradient koos elektrilise potentsiaaliga moodustavad prootonite liikumapaneva jõu (PMF-i), mida kasutatakse ATP sünteesiks ATP-süntaasi abil. Hingamisahela esimeseks komponendiks on dehüdrogenaas, mis võtab substraadilt (NADH, suktsinaat , laktaat jne) elektronid ning kannab need üle vaheühendile kinoonile. Hingamisahela viimane komponent on oksüdaas, mis kannab elektroni lõppakseptorile, mis redutseerib molekulaarse hapniku või mõne muu elektronide aktseptori. ETS koosneb heemi sisaldavatest komponentidest (tsütokroomid), raud-väävel klastriga ensüümidest, flavoproteiinidest (sisaldab FMN-i) ja kinoonidest.
Sõltuvalt kasvutingimustest, elektronide akseptorite olemasolust ning energiaallika olemasolust võib bakterite hingamisahel koosneda erinevatest faktoritest. Muutuda võib nii hingamisahela esimene komponent kui ka viimane komponent, mis kannab elektronid üle elektronide lõppakseptorile. Elektronide transportsüsteem võib saada elektrone ja prootoneid mitmest reaktsioonist, mida viivad läbi erinevad dehüdrogenaasid, nagu NADH- , laktaasi-, suktsinaadi-, formaadi- või glütserool-3-fosfaadi dehüdrogenaas. Bakteritel võib olla mitu hingamisahelat korraga membraanis, sõltuvalt sellest, milliseid elektronide doonoreid või aktseptoreid on keskkonnast võimalik kätte saada.
Membraanis olevad kinoonid on seevastu universaalsed elektronide transporterid, mis võtavad elektrone vastu erinevatelt komponentidelt ning annavad need edasi vastavale elektronide transportsüsteemi komponendile olenevalt millist elektronide lõppakseptorit kasutatakse. Kinoonid on membraanis liikuvad molekulid, mis „pendeldavad“ dehüdrogenaaside ja oksüdaaskomplekside vahel. Peamine kinoon bakterite hingamisahelas on ubikinoon-8, mis on oluline just aeroobsel hingamisel. Anaeroobsel hingamisel on oluline menakinoon-8.

6.2.1. Escherichia coli hingamisahel kui mudel

E. coli hingamisahel on väga põhjalikult uuritud ning seda kasutatakse tihti bakterite mudeliks. E. coli’l on hingamisahel väga varieeruv ning sõltuvalt keskkonnatingimustest võib bakter kasutada erinevaid komplekse, elektronide doonoreid ja aktseptoreid. Teada on vähemalt 15 erinevat dehüdrogenaasi, mis võimaldab elektrone saada väga erinevatelt doonoritelt, ja 10 terminaalset reduktaasi (oksüdaasi), mis redutseerivad elektronide aktseptoreid.
Sõltuvalt sellest, millist hingamisrada kasutatakse, võib periplasmasse üle kanda 0 – 4 H+/e-. E. coli kasutab erinevaid kinoone elektronide edasikandmiseks, millel on ka erinev standartne redokspotentsiaal ubikinoon/ubikinoolil E0’ = +110 mV, menakinoon/metakinoolil E0’ = -80 mV. Aeroobsetes tingimustes kantakse elektronid kinoonidest sõltuvate oksüdaaside abil molekulaarsele hapnikule, mis redutseeritakse veeks (E0’ = +820 mV). O2 puudumisel võib elektronide aktseptoriks olla nitraat E0’ = +420 mV ( nitraadi reduktaas), nitrit E0’ = +360 mV (nitriti reduktaas), DMSO E0’ = +160 mV (DMSO redutkaas), TMAO E0’ = +130 mV (TMAO reduktaas) või fumaraat E0’ = +30 mV (fumaraadi reduktaas). Kusjuures hapnikule kantakse enim energiat üle ja fumaraadile kõige vähem. Sellest sõltub omakorda kui palju suudetakse metabolismist energiat talletada.

Hingamisaehlae 1. komponent – NADH-dehüdrogenaas I

NADH-dehüdrogenaas I (nuoA-N) on hingamisahela esimene komponent ja sisaldab FMN-i ( flaviin -mononukleotiidi) ja Fe-S klastreid. NADH-dehüdrogenaas I (NDH-I) katalüüsib elektronide ülekande NADH-lt kinoonidele, mis on tsütoplasma membraanis ja on võimeline looma prootongradienti. NDH-I on oluline nii aeroobsel kui ka anaeroobsel hingamisel, kui hingamisahela esimene komponent. NDH-I on tsütoplasmamembraanis ning koosneb 14 subühikust, mis oksüdeerib NADH, redutseerib kinoone ning transpordib kuni 4 H+ tsütoplasmast periplasmasse. NADH oksüdeerimisega liigub tsütoplasmast 2 prootonit redokspotentsiaali abil periplasmasse ning lisaks 1-2 prootonit konformatsiooniliste muutuste tulemusena.
NDH-I koosneb kolmes struktuursest osast: hüdrofiilne fragment (NuoEFG), mis katalüüsib NADH oksüdeerumise ja elektronide liikumise ensüümi sisemusse ; amfipaatne fragment (NuoBCDI; amfipaatne – molekulil on nii hüdrofiilne kui ka hüdrofoobne osa), mis ühendab hüdrofiilset ja hüdrofoobset fragmenti, ning hüdrofoobne fragment, mis on sukeldunud membraani (NuoAHJKLMN). Hüdrofiilne fragment sisaldab FMN kofaktorit. NADH kaks elektroni liiguvad FMN-le, mis redutseerub FMNH2-ks. Elektronide üleaknne Fe-S-klastrile põhjustab prootonite pumpamise periplasmasse ja PMF-i genereerimise . Elektronid liiguvad Fe-S-klastrilt kinoonile. Ensüüm on Ca-seoseline, ilma Ca2+ on ensüüm inaktiivne. Lisaks Zn2+-liig pärsib ensüümi tööd, takistades prootonite liikumist mööda ensüümi, kas sisenemist või väljumist.
NDH-I on oluline ka anaeroobsel hingamisel, kui elektronide lõppakseptoriks on fumaraat või DMSO. Sellisel juhul kantakse elektronid üle menakinoonile. Aeroobsetes tingimustes kantakse elektronid üle ubikinoonile. NDH-I-s olev FMN põhjustab ROS-ide teket, peamiselt H2O2 näol. Ükskõik millise nuo-geeni deleteerimisel on rakkude kasv rikkal söötmel aeroobsetes tingimustes häiritud. NDH-I kompleksita rakud ei suuda statsionaarses faasis konkureerida metsiktüvega.
NDH-I nuo-operonilt on transkriptsioon aktiveeritud hapniku, nitraadi ja fumaraadiga. Fis aktiveerib, IHF, Fnr ja ArcAB represseerivad transkriptsiooni.

Hingamisahela 2. komponent – kinoonid

Kinoonid on rasvlahustuvad polaarsed ained, mis liiguvad membraanis vabalt ringi. Kinoonid erinevad isoprenoidide arvu poolest, mis moodustab hüdrofoobse saba ning on sukeldunud membraani. Kasutatakse redoksreaktsioonides elektronide transporterina. Redutseeritud kinoonide oksüdeerumisel liigub periplasmasse 2H+.
Ubikinoon (oksüdeeritud vorm, ülemine) ja ubikinool (redutseeritud vorm, alumine)
Ubikinoonid võivad saada elektronid mitme erineva dehüdrogenaasi käest. Prootonid võetakse tsütoplasmast. Näiteks:
NADH-dehüdrogenaas,
laktaasi dehüdrogenaas Dld (laktaat + ubikinoon -> püruvaat + ubikinool),
püruvaadi oksüdaasilt PoxB (püruvaat + H2O + ubikinoon -> CO2 + atsetaat + ubikinoon),
tsitraaditsüklis tekkiva malaadi oksüdeerimisel, malaadi oksidoreduktaas Mqo ( malaat +
ubikinoon -> oksaalatsetaat + ubikinool)
suktsinaadi oksidoreduktaas SdhABCD (suktsinaat + ubikinoon -> ubikinool + fumaraat)
Menakinoonid on sarnased ubikinoonidele, kuid sisaldavad naftaleeni tuuma. Menakinooni redutseeritud vormi nimetatakse menakinooliks. Menakinoone kasutab E. coli anaeroobsetes tingimustes, kus elektronide lõpp-aktseptoriks on mingi muu molekul, mis pole O2.
Menakinoon 8

Hingamisahela 3. komponent – oksüdaas

E. coli’l on kolm terminaalset oksüdaasi, mis on võimelised hapnikku redutseerima: tsütokroom bo (CyoABCD), tsütokroom bd-I (CydABX) ja tsütokroom bd-II (AppCD). Kõik kolm redutseerivad aeroobsetes tingimustes molekulaarse hapniku O2 veeks. Tsütokroom bo on ekspresseeritud siis, kui hapniku kontsentratsioon keskkonnas on kõrge, tsütokroom bd-I siis kui tegemist on mikroaeroobsete tingimustega. Mõlemad tsütokroomid on vajalikud PMF-i tekkimiseks, kuid tsütokroom bo transpordib veel lisaks tsütoplasmast prootoneid periplasmasse, bd-I aga mitte. Tsütokroom bd-II seos PMF-i tekitamisega on veel ebaselge . Mõni autor annab, et bd-II ei osale PMF-i tekkimises, mõne autori järgi bd-II osaleb PMF-i tekkimisel.
E. coli tsütokroom bo (sünonüümina tsütokroom o) koosneb neljast subühikust CytD (IV subühik, cyoD), CytA (II subühik, cyoA), CytB (I subühik, cyoB) ja CyoC (III subühik, cyoC). Tsütokroomi operonis on veel viies geen cytE, mis on vajalik heemi sünteesimiseks. Sarnane tsütokroom c oksüdaaside aa3-tüüpi perekonnaga. Tsütokroom bo oksüdeerib kinooli (2e-), ning redutseerib molekulaarse hapniku veeks. Lisaks transpordib tsütokroom bo periplasmasse 2H+. Tsütokroom bo-l on kaks kinooni seondumiskohta, madala afiinsusega QI ubikinooli oksüdeerimiseks ning kõrge afiinsusega QH, mis vahendab elektronide ülekannet heemile. Tsütokroom bo cyo-operoni ekspressioon sõltub hapniku ja energiaallika olemasolust. Anaeroobsetes tingimustes või ka mikroaeroobsetes tingimustes on operon negatiivselt reguleeritud Fnr-ga ning ArcAB kahekomponentse süsteemiga. Mittefermenteeritavate energiallikate korral on cyo-operoni ekspressioon kõrge ning glükoosi olemasolul keskkonnas on ekspressioon madal.

6.2.2. Alternatiivsed komponendid

Alternatiivsed dehüdrogenaasid

NADH-dehüdrogenaas II (ndh) on membraaniseoseline valkude kompleks, mis sarnaselt NDH-I-ga kannab elektronid NADH-lt ubikinoonile. Erinevalt NDH-I-st ei osale NDH-II prootongradiendi loomisel. NDH-II on neli domeeni, millest üks on seotud NADH dehüdrogeenimisega, üks on FAD-i sisaldav, kolmas sisaldab Cu ja neljas on membraani ankurdav domeen.
Aeroobses keskkonnas, kus on glükoosi limitatsioon, kasutab E. coli mõlemat NADH-dehüdrogenaasi (nii NDH-I kui NDH-II) elektronide transpordiks hapnikule. Samas, NDH-I geenide deleteerimisel ei ole elektronide transport hapnikule häiritud, samas kui NDH-II geeni deleteerimisel elektronide ülekanne väheneb hapnikule tugevalt. NDH-II on oluline nitraatsel ja aeroobsel hingamisel. NDH-II võib sarnaselt NDH-I-ga genereerida H2O2, kui NDH-II on üleekspresseeritud või membraanis on ubikinoonide limitatsioon, siis FAD-i autooksüdeerumisel tekib ROS. Siiski balansseeritud kasvu korral pole NDH-II peamine ROS-i allikas rakkudes. NDH-II on tundlik Cu-toksilisusele.
NDH-II ekspressioon on tugevalt sõltuv kasvufaasist. Selleks on geeni transkriptsioon reguleeritud globaalsete regulaatoritega Fis ja IHF, Fis aktiveerib ja IHF represseerib geeni transkriptsiooni. Lisaks sõltub NDH-II ekspressioon veel hapniku olemasolust, anaeroobsetes tingimustes Fnr represseerib geeni transkriptsiooni.
Suktsinaadi dehüdrogenaas (sdhCDAB sünonüümina suktsinaat-kinoon oksidoreduktaas) on tetraheteromeer ning otseselt seotud tsitraaditsükliga, sest katalüüsib suktsinaadi oksüdeerumist fumaraadiks ning kannab elektronid üle ubikinoonile. Suktsinaadi dehüdrogenaas ei osale prootongradiendi loomisel. SdhA ja SdhB on hüdrofiilsed ning paigutuvad tsütoplasmasse. Tsütoplasmas asuvad SdhC ja D subühikud. SdhA sisaldab heemi ning suktsinaadi seondumiskohta. Funktsionaalselt sarnane fumaraadi reduktaasiga, mis viib läbi pöördreaktsiooni. Subühikud on asendatavad teineteisega, näiteks fumaraadi reduktaasi geene kandev plasmiid komplementeerib sdh geenide knock-out-mutante. SdhA redoksreaktsiooni läbi viiv aktiivtsenter paigutub valgus nii, et ensüüm ei tekita reaktiivseid hapnikuradikaale (ROS-e). Samas kui fumaraadi reduktaas saades menakinoolilt elektronid tekitab väga palju ROS-e. Sellest johtuvalt on aeroobses keskkonnas soodustatud Sdh ekspressioon.
Anaeroobsest keskkonnast üleminek aeroobsesse võimendab sdh-operoni ekspressiooni, konstantselt aeroobsetes tingimustes on ekspressioon mõõdukas. Anaeroobses keskkonnas represseerib ArcAB kahekomponentne süsteem oksüdatiivses fosforüleerimises osalevate geenide transkriptsiooni.

Terminaalsed oksüdaasid

E. coli tsütokroom bd-I (cydABC ja cydX) katalüüsib nii kinooli oksüdeerumist ja kahe prootoni transporti periplasmasse kui ka molekulaarse hapniku redutseerimist veeks, milleks 2 elektroni tuleb hüdrokinoonilt ning 4 prootonit tsütoplasmast. Tsütokroom bd-I koosneb CydA ja CydB subühikutest ning sisaldab heemi. Tõenäoliselt on tsütokroomi kompleksis veel kolmas subühik CydX, mis puhastub koos tsütokroom bd-I-ga välja. Tsütokroom bd-I toimib ka kui katalaas , mis oksüdeerib H2O2 veeks. Selle tulemusena vähendab tsütokroom ROS-i stressi.
Tsütokroom bd-I ekspressiooni reguleerib negatiivselt Fnr ja aeroobsetes tingimustes negatiivselt H-NS, anaeroobsetes tingimustes positiivselt ArcAB kahekomponendiline süsteem. Sellise regulatsiooni korral on tsütokroom bd-I ekspresseeritud just mikroaeroobsetes tingimustes. Transkritpsioon on cydABX-lt aktiveeritud kui keskkonnas on NO ja on NO-stressile tundetu.
E. coli tsütokroom bd-II (appCB) on vähem uuritud ning täpne roll pole selge. Tõenäoliselt tsütokroom bd-II ei osale prootongradiendi tekitamises. Seda tsütokroomi ekspresseeritakse statsionaarses faasis, samuti C- ja P-nälja korral. ArcAB kahekomponentne süsteem aktiveerib geenide transkriptsiooni.

Elektronide aktseptorid

Nitraatne hingamine. E. coli’l on 3 nitraadi reduktaasi, mis on võimelised elektrone kandma kinoolilt elektronide lõpp-aktseptorile, antud juhul nitraadile. Nendest kaks, nitraadi reduktaas A (NRA) ja nitraadi reduktaas Z (NRZ) on membraaniseoselised, mis viivad läbi tsütoplasmaatilist redutseerimist, ja on biokeemiliselt sarnased. Nii NRA kui NRZ on aktiveeritud aeroobses keskkonnas, samas kui kolmas, Nap, on ekspresseeritud anaeroobses keskkonnas. Kõik kolm nitraadi reduktaasi sisaldavad Fe-S klastrit ning on Mo-seoselised ensüümid.
NRA kodeerib narGHJI operon. NRA on terminaalne reduktaas, mis kannab elektronid üle lõpp-aktseptorile, tsütoplasmaatilisele nitraadile. Kasutab elektronide doonoriks nii ubikonooli kui menakinooli. NRA ekspresseeritakse siis kui bakterid on aeroobses keskkonnas, kus on palju nitraati. Nitraadi redutseerimiseks transporditakse nitraat tsütoplasmasse. Huvitav on märkida, et NRA vastutab E. coli telluriidiresistentsuse eest. Mutandid, millelt oli deleteeritud narGHJI operon on väga tundlik telluriidile (Te+, mis on poolmetalli ioon, sarnaselt elavhõbedale toksiline rakkudele). Anaeroobsetes tingimustes, kui nar operon on kunstlikult üleekspresseeritud, siis on bakter võimeline redutseerima telluriiti (Te+) telluuriks (Te0).
NRZ on sarnane NRA-ga, koosneb neljast subühikust narZYWV. Nõrga nitraadi reduktaasi aktiivsusega, ekspresseeritud siis, kui rakud on aeroobses keskkonnas, mis sisaldavad nitraati. Fnr represseerib transkriptsiooni, nõrgalt nitraadiga indutseeritud. NRZ on oluline siis, kui rakud lähevad aeroobsest keskkonnast anaeroobsesse. NRZ on hingamisahela üleminekuvariant. Statsionaarses kasvufaasis on NRZ ekspresseeritud, RpoS- sõltuv transkriptsioon.
Kolmas nitraadi reduktaas Nap on ka tsütoplasmamembraanis, kuid redutseerib nitraati periplasmas. Nap-i ekspressioon on aktiveeritud anaeroobses keskkonnas nitraadi vähesuse korral. Nap ei pumpa prootoneid periplasmasse, ta on terminaalne elektronide aktseptor, mis redutseerib nitraati. Olukorras, kus nitraati on vähe, ei transpordita elektronide aktseptorit tsütoplasmasse, et hoida kokku energiat. Lisaks on Nap kõrgema afiinsusega nitraadile kui NRA ning seetõttu saab Nap kasutada madala nitraadi kontsentratsiooni korral. Fnr on napBCGHA operoni geenide transkriptsiooni aktivaator. Nitraadi vähesust signaliseerib NarP.
Fumaraatne hingamine. Anaeroobses tingimustes on fumaraadi reduktaas (QFR, frdABCD) üks membraaniseoselistest flavoproteiinidest, mida kasutatakse elektronide ülekandeks lõpp-akseptorile. Antud juhul on akseptoriks fumaraat. Fumaraadi reduktaas on väga sarnane suktsinaadi dehüdrogenaasile, kuid viib läbi vastupidist reaktsiooni, redutseerib fumaraadi suktsinaadiks. Anaeroobses keskkonnas E. coli kasutab eelistatult esmaseks dehüdrogenaasiks NDH-I ning terminaalseks reduktaasiks fumaraadi reduktaasi ning elektronide ülekandjaks menakinoon 8.
Fumaraadi reduktaas koosneb neljast subühikust, on flavoproteiin ning sisaldab Fe-S-klastrit, hädavajalik anaeroobseks hingamiseks kui energia- ja C-allikaks on glütserool või fumaraat. Operonilt on transkriptsioon represseeritud kui keskkonnas on eelistatud aktseptor, O2 või NO3-, aktiveeritud kui keskkonnas on fumaraat. QFR on oluline viburi pakkimiseks , kui QFR-i pole siis bakter ei ole võimeline korrektselt viburit assambleerima.

6.2.2. Bakterite ebatavalised hingamisahelad

Metallihingamine Bakterid on võimelised vahetama elektrone tahke pinnasega ja/või kasutama selleks lahustuvaid vaheühendeid. Metallihingamiseks kasutatakse elektronide lõpp-aktseptoriks Fe3+ või Mn4+. Või vastupidi, redutseeritud metallid (Fe2+) võivad olla elektronide doonoriteks, millega initsieeritakse hingamisahelas elektronide transportahel . Transportimisel elektrone madalamalt redokspotentsiaaliga ühendilt kõrgema redokspotentsiaaliga ühendile luuakse prootongradient ning sünteesitakse ATP-d. Kuigi metallihingamine on teada ammu , pole siiani täpselt välja selgitatud kogu protsessi. Peamiseks erinevuseks E. coli tüüpi hingamisahelatest on elektronidoonorite või aktseptorite lahustumatus. Mudelhingamisahelas difundeerub lõpp-aktseptoriks kasutatav gaas lihtsasti tsütoplasmasse, või on bakteril suhteliselt lihtne transportida lõpp-aktseptoreid. Metallihingamise korral on hingamisahel jagunenud kahe membraani vahel (tsütoplasma- ja välismembraan), mille vahel kasutatakse periplasmaatilisi elektronide ülekandjaid.
Metallihingamise mudelorganismiks on Geobacter sulfurreducens, mille genoom on sekveneeritud ning sealt on leitud 110 geeni, mis on c-tüüpi tsütokroomidega sarnased.G. sulfurreducens on G(-) anaeroobne bakter. NADH-dehüdrogenaasiga luuakse prootongradient ning elektronid jõuavad tsütoplasmamembraanis oleva MacA-ni, mis annab elektronid edasi periplasmaatilisele PpcA-le. PpcA on elektronide periplasmaatiline ülekandevalk, mis redutseerib välismembraanse tsütokroomi, mis omakorda Fe3+ redutseerib Fe2+-ks. Välismembraanis on Geobacter’il palju erinevaid tsütokroome, millest olulisemad on OmcB ja OmcS.
7 Rakkude energia hulk ja selle muutumine
Energia on rakkude eluspüsimiseks hädavajalik. Kõik elusrakud vajavad suures hulgas energiat, hoidmaks entroopiat madalana süsteemides, mis on vajalikud ensümaatiliste protsesside läbiviimiseks ja biosüsteemide funktsionaalsuse hoidmiseks. On leitud, et bakteriraku kasvamisel kulub rakul kuni 75% energiast valgusünteesiks ja DNA replikatsiooniks kulub 2% koguenergiast.
Rakkudes energia talletamiseks ning metabolismiradade vahel liikumiseks kasutatakse peamiselt kolme molekuli: adenosiinfosfaadid (ATP/ADP/AMP), nikotiin - amiid - adeniin -dinukleotiid (NAD/NADH) ja nikotiin-amiid-adeniin-dinukleotiid-fosfaat (NADP/ NADPH ). ATP toob energiat substraatselt fosforüülimiselt ja membraanselt fosforüülimiselt anabolismiradadele, NADH toob redutseerivat „jõudu“ katabolismirajalt hingamisahelale või fermenteerimise substraatidele, NADPH toob redutseerivat „jõudu“ katabolismirajalt pentoosfosfaadirajale, NADP-sõltuvalt isotsitraadidehüdrogenaasilt või energiat nõudvalt transhüdrogenaasilt anabolismile. NAD-i ja NADP puhul on rakkudes pigem oluline nende ühendite laeng kui absoluutne kontsentratsioon, ensüümid on väga tundlikud laengu muutustele.
Kataboolne redutseeriv jõud: 𝑵𝑨𝑫𝑯/( 𝑵𝑨𝑫𝑯+𝑵𝑨𝑫+)
Anaboolne redutseeriv jõud: 𝑵𝑨𝑫𝑷𝑯/( 𝑵𝑨𝑫𝑷𝑯+𝑵𝑨𝑫𝑷+)
Adenülaadi energialaeng AEC (ingl k adenylate energy charge):
𝐴𝐸𝐶 =( [𝐴𝑇𝑃]+0,5 [𝐴𝐷𝑃])/( [𝐴𝑇𝑃]+[𝐴𝐷𝑃]+[𝐴𝑀𝑃])
kus nurksulgudes on toodud vastava metaboliidi kontsentratsioon. AEC kõigub 0 ja 1 vahel, olles väärtusega 1, siis kui kõik adenosiinid on 3 fosfaatjäägiga (ATP-na) ning 0 siis, kui kõik raku adenosiinid on 1 fosfaatjäägiga (AMP-na). Kui rakus on ainult ADP, siis AEC väärtuseks on 0,5.
Kuigi energia võib olla talletatuna trifosfaatidena mitmesugustesse molekulidesse nagu GTP, CTP, TTP ja UTP, kasutavad elusorganismid ATP-s olevat trifosfaatset energiat energia talletamiseks ja bioloogiliste protsesside läbiviimiseks. Kõik elusorganismid, lihtsaimast bakterist inimeseni, kasutavad ATP energiat metaboolsete protsessid läbiviimiseks ja ATP, ADP, AMP hulk rakus peegeldab raku energeetilist seisundit .
ATP-d saadakse tavaliselt mitmesugustest metaboolsetest reaktsioonidest, peamiselt substraatsest fosforüülimisest, fotofosforülatsioonist, kääritamisest ja hingamisest. ATP-d kasutavad ensüümid ja struktuursed valgud kõigiks rakulisteks protsessideks: biosünteesiks, liikumiseks, rakkude kasvuks ja jagunemiseks ning bioloogiliste protsesside regulatsiooniks. Elusas rakus on bioenergeetilised protsessid seotud omavahel adenosiinsete nukleotiidide vahendusel (ATP, ADP ja AMP). Adenosiinide abil salvestatakse substraadi energia ning kasutatakse uute biomolekulide sünteesiks, mis on vajalik rakkude kasvuks ja arenguks. Tasub meeles pidada, et rakk ei kasuta adenosiine mitte ainult energia ülekandeks katabolismilt anabolismile, vaid adenosiinseid nukleotiide kasutatakse ka allosteeriliseks regulatsiooniks. ATP, ADP ja AMP kontsentratsiooni muutumine reguleerib mitmeid multiensümaatilisi radu rakus.
ATP, ADP ja AMP kontsentratsioon rakus muutub kiiresti ja pidevalt. Bioloogiliste protsesside käigus sünteesitakse ja lagundatakse ATP-d väga kiiresti, mille tõttu muutub adenosiinide kontsentratsioon rakkudes väga kiiresti, mis viib ostsillatsioonini. Paljudel juhtudel pole ostsillatsioon perioodiline ning ADP ja AMP kontsentratsioonid alluvad sama moodi ostsillatsioonile. Paljude metaboliitide kontsentratsioonile on iseloomulik ostsillatsiooniline kõikumine. Nii eukarüootidel kui ka prokarüootidel kõiguvad NAD(P)H ja vabade rasvhapete kontsentratsioon, fosfolipiidide biosüntees, cAMP kontsentratsioon, mRNA hulk ( geeniekspressioon ), rakusisene vabade aminohapete hulk, membraanipotentsiaal, rakusisene pH, hingamise metabolism, glükolüüs, rakusisene Ca2+ kontsentratsioon, proteolüüs, mRNA metabolism, tRNA, uurea tsükkel, Krebsi tsükkel, aminohapete transport, peroksüdaasi-oksüdaasi reaktsioonid, fosforüleeritus jne. On leitud, et kogu genoomi replikatsioon ja geenide ekspressioon ostsilleerib väikese amplituudiga. Rakud on avatud dünaamilised süsteemid, kus metaboolse stressi korral võib adenosiinide kontsentratsioon väga tugevalt varieeruda. Näiteks hulkraksete eukarüootidel võib skeletilihastes ATP kontsentratsioon muutuda rohkem kui 100 korda väga lühikese aja jooksul.
Vaatamata sellele, et adenosiinide (ATP, ADP ja AMP) kontsentratsioon rakkudes kõigub väga tugevasti, jääb enamikes elusrakkudes AEC (0,7) 0,8 ja 0,95 vahele, stabiliseerudes paljudel juhtudel 0,9 lähedale. Kui AEC ≈ 0,9, siis on rakkude katabolism ja anabolism stabiliseerunud ning ATP-d toodetakse sama palju juurde kui kulutatakse. Organismid, nii eukarüoodid kui ka prokarüoodid, hoiavad raku AEC-d väga kitsas vahemikus. Seda on näidatud nii taimedel, loomadel kui ka prokarüootidel. Rakkude AEC ja kasv on omavahel väga tugevas seoses, mida kõrgem on rakkudes AEC, seda kiiremini rakud kasvavad. Kui AEC väärtus jääb 0,5 ja 0,8 vahele, siis bakterirakud on küll elus, kuid ei jagune. Siiski on kõik sellised rakud võimelised täissöötmele külvatuna moodustama kolooniaid . See tähendab, et kui AEC on 0,5 ja 0,8 vahel, siis rakud on võimelised taastama kasvu. Väga ebasoodsates tingimustes võib AEC väärtus järsult langeda alla 0,5, sellisel juhul rakud surevad. Bakterite spooride AEC on väga madal.
Bakter kasvutingimused AEC
Escherichia coli aeroobne , ekspoentiaalne kasv, 0,85 – 0,95
(G(-), fakultatiivne anaeroob ) erinevad söötmed
Klebsiella aerogenes mikroaerofiilne keskkond 0,81 – 0,84
(G(-), fakultatiivne anaeroob) anaeroobne keskkond 0,65
Bacillus subtilis vegetatiivne rakk > 0,79
(G(+), obligaatne aeroob ) spoor 0,08
Rakkude energia on reguleeritud mitme protsessiga:
1. ATP süntees ADP-st (ATP süntaas) – membraanne ja substraatne fosforüülimine
2. ATP hüdrolüüs ADP-ks (kinaas ja ATPaassed reaktsioonid) ja AMP-ks ( ligaasid )
3. AMP kineerimine ADP-ks
4. AMP de novo süntees ja lagundamine
Süsteem vajab pidevalt energia sissevoolu toitainetest ja metaboolsete lõpp-produktide väljaviimist.
Sarnaselt kõikide organismidega on ka Escherichia colil AEC väärtus äärmisel oluline allosteerilise regulatsiooni korral. E. coli ATP-d tootvad ensüümid on aktiivsed siis, kui AEC väärtus on madal ning nende aktiivsus langeb järsult kui AEC väärtus on kõrgem kui 0,75. Ja vastupidi, biosünteesis osalevate ensüümide aktiivsus on väga madal, kui AEC Saccharomyces cerevisiae) mutandil OP1 on defektne mitokondriaalne ADP/ATP translokaas, mis transpordib mitokondris sünteesitud ATP-d tsütoplasmasse ning tüstoplasmast ADP-d mitokondrisse. Kuna tsütoplasmas ATP kontsentratsiooni langusega langeb ka AEC väärtus, siis rakud sünteesivad valke väga halvasti (pärmil on alternatiivseid translokaase, mis töötavad) ning pärmirakud kasvavad halvasti ja jäävad väikeseks.
Järsud keskkonnatingmuste muutused mõjutavad AEC-d, sest rakud peavad kohanema uute tingimustega. Selleks võib olla kas energiaallika ammendumine või hapniku hulga ( membraanse fosforüülimise, mis on kõige efektiivsem energia tootmise protsess) vähenemine.
E. coli ekponentsiaalse kasvu korral on AEC ≈ 0,9. Kui söötmes energiallikas hakkab ammenduma, siis langeb ka AEC väärtus ning rakud ei kasva enam nii kiiresti. Bakteri kasvu uuriti minimaalsöötmes, milles glükoos oli ainukeseks energia- ja C-allikaks. Glükoosi ammendumisel langes AEC väärtus 0,6 ja 0,7 vahele ning rakkude kasv peatus. Kui sellisele söötmele lisati täiendavalt glükoosi, siis 45 minuti järel AEC väärtus tõusis paralleelselt rakkude kasvama hakkamisega. Arvati, et lühiajaline AEC ja adenosiinide kontsentratsiooni langus, mis järgnes glükoosi ammendumisele ja kasvu peatumisele, võib tuleneda jätkuvast RNA sünteesist, mis jätkas ATP tarbimist. E. coli on võimeline kasvama üsna pikka aega minimaalsöötmel energiaallika (glükoosi) ammendumise järel. Sügavas statsionaarses kasvufaasis rakud hakkavad keskkonda eritama adenosiine, seda peamiselt AMP kujul ning rakusisene adenosiinide üldkontsentratsioon langeb. Samas on näidatud, et keskkonda eritatud AMP kasutatakse väga kiiresti ära, toiduks. Rakkudes hakkab AEC aeglaselt langema kuni 0,5-ni, millele järgneb suhteliselt kiire AEC väärtuse langus, mis päädib rakkude surmaga. Kui sügavast statsionaarsest kasvufaasist rakkudega inokuleerida värsket söödet, mille AEC ≈ 0,5, siis esmalt tõuseb rakkudes AEC ≈ 0,8 (lag-faas) ning alles seejärel hakkavad rakud kasvama. Üldiselt võib öelda, et rakkude suremine ning AEC langus on omavahel korrelatsioonis. Üldiselt on lineaarne seos AEC languse alla 0,5 ja rakkude suremise vahel. Siiski, ka rakud, mille AEC Rakkude ümberlülitumine uuele C-allikale log-faasis võib põhjustada diauksiat. Ekponentsiaalses kasvufaasis C- ja energiaallika vahetumine võib põhjustada lühiajalist kasvupeetust, mis väljendub kasvukõveral väikese platoona eksponentsiaalses kasvufaasis ning erinevates kasvukiirustes. Näiteks glükoosi minimaalsöötmel glükoosi transporti takistava ⍺-metüülglükosiidi lisamisel tekkis kasvukõverasse diauksia, samal ajal langes järsult AEC, anaboolne ja kataboolne redutseeriv jõud. Kui rakud kohanesid vähenenud glükoosi transpordiga, siis kõik väärtused taastusid. Samas kui jälgiti glükoosilt ümberlülitumist mannoosile, siis AEC ja redutseerivate jõudude langust ei täheldatud. Samas on teada, et mannoosi katabolismi korral kasutatakse tunduvalt vähem hapnikku.
Sarnaselt AEC-le langeb rakkudes anaboolne redutseeriv jõud (NADPH/NADP+NADPH) ning taastub , kui söötmesse lisada täiendavat C-allikat. Süsinikallikad mõjutavad anaboolse redutseeriva jõu kõikumisi erinevalt, glükoosi puhul tõuseb anaboolne redutseeriv jõud aeglaselt algsele tasemele , samas kui suktsinaadi korral väärtuse tõusu ei täheldatud. Glükoosi puhul võib anaboolse redutseeriva jõu suurenemine olla seotud sekundaarse metaboliidi, atsetaadi, omastamisega. Glükoosil lühiajaline nälgimine ei pruugi väljendada täielikku nälgimist, sest glükoosi lagundamisega eritab E. coli keskkonda atsetaati, mida rakud suudavad hiljem kasutada energia- ja C-allikaks. Hapnikuvaegusel ja liial on anaboolsele redutseerivale jõule suur mõju. Antibiootikumide lisamine kasvavale kultuurile mõjub rakkudele vastupidiselt. Kohe lisamise järel anaboolne redutseeriva jõu väärtus tõuseb ning mõnekümne minuti järel hakkab langema.
Kui anaboolse redutseeriva jõu väärtuste muutusi on võimalik rakus detekteerida, siis kataboolsel redutseerival jõul suuri muutusi pole või toimub see väikese amplituudiga. Näiteks suktsinaadi lisamisel nälgivatele rakkudele toimus kataboolse reutseeriva jõu lühiajaline järsk tõus, mis kiiresti langes platoole. Rifampitsiini lisamisel rakkudele toimus kataboolse redutseeriva jõu langus, samas kui klooramfenikooli lisamine väärtust ei muutnud.
Rakkude ümberkülvamisel minimaalsöötmesse, milles puudub energia- ja C-allikas, E. coli’s tõuseb AEC kiiresti 0,6-lt 0,8-le, mille järel toimub jälle kiire AEC langus. See viitab sisemiste energiavarude kiirele ärakasutamisele, mis päädib üsna pikka aega (20 tundi) AEC väärtuse hoidmisega 0,6 juures. Sellisel väärtusel rakud ei sure , kuid ka ei kasva. Seega, isegi toitainete puudumisel suudab bakter ennast elus hoida ning oodata nn paremaid aegu. Kui minimaalsöötmele oli lisatud glükoos, siis rakkude AEC tõusis 0,8-ni ning püsis nii kõrgena toitainete ammendumiseni. Erinevalt toitaineteta söötmest oli glükoosiga söötmel toitainete ammendumise järel AEC ≈ 0,6 kaks korda kauem, enne kui AEC langes alla 0,5 ning rakud surid.
Rakkude suremisel ja ka energia- ning C-allikata söötme inokuleerimisel võib rakkudes tõusta adenosiinide üldkontsentratsioon. Arvatakse, et see toimub RNA lagundamise arvel, kust vabaneb palju adenosiinfosfaate. Glükoosiga söötme inokuleerimisel tõuseb adenosiinide kontsentratsioon viivitusega. Tõenäoliselt tänu glükoosi lagundamisest vabanevale energiale, mida kasutatakse ATP sünteesiks substraatsel fosforüülimisel.
Aeroobselt kasvavate rakkude viimine anaeroobsesse keskkonda langetas kiiresti AEC väärtust ning kasv pidurdus. Mõne aja pärast AEC tõusis 0,8 lähedale ning kasv kiirenes. Samas, anaeroobselt kasvavatele rakkudele lühiajalise hapniku andmine ei mõjuta AEC-väärtust ning adenosiinide kontsentratsioon näis vähe mõjutatud olevat.
7.1 E. coli metabolismi muutused järsule toitaineküllusele ja –vaegusele Bakterite vastus toitaineküllusele võib olla esmapilgul ootamatu . Näiteks, järsk glükoosi üleküllus võib aktiveerida rakkudes metabolismirajad, mis vähendavad ATP sünteesi. Külvates E. coli’t ümber toitainevaeselt söötmelt glükoosirikkale söötmele, võib aktiveerida metüülglüoksaali raja, mis on glükolüüsi harurada (algab DHAP-st ning lõppeb püruvaadiga). Selle abil vähendab bakter järsku fosforüleeritud suhkrute hulka rakus. Jälgiti E. coli rakke glükoos-minimaalsöötmel pidevkultuuris. Pidevkultuuris muudeti söötme läbivoolukiirust, kas suuremaks ( paranes glükoosi kättesaadavus) või väiksemaks (glükoosi kättesaadavus vähenes). Ootamatu glükoosi juurdevool suurendas rakkude hingamist ning impulsina suurenes ka ATP kontsentratsioon. Sellele järgnes hingamise vähenemine ning ATP kontsentratsiooni langus, mida võib seletada vähemefektiivsete metabolismiradade aktiveerimisega. Samal ajal suurenes ADP kontsentratsioon, mis näitab anaboolsete metabolismiradade aktiveerumist, mille tulemusena langes AEC. Glükoosi kättesaadavuse halvenemisel (läbivoolukultuuris aeglustati söötme läbivoolu) väheneb järsult hingamine ning ATP kontsentratsioon rakus, kuna anaboolsed rajad kulutavad rohkem energiat kui kataboolsed rajad jõuavad juurde toota. Selle tõttu langeb väga kiiresti, 2 minuti jooksul, ka AEC. Lühikeseks ajaks hingamine küll taastub, koos sellega tõuseb ka AEC, kuid lõpuks hingamine ikkagi väheneb ning ATP kontsentratsioon ja AEC stabiliseeruvad uuel väärtusel. Tsükliline-AMP (cAMP) on üks regulatsioonimolekulidest, millel on E. coli rakkudes glükoosi kataboliitne kontroll. Glükoosi piisava hulga korral on adenülaattsüklaas inaktiivne, kuid glükoosi hulga vähenemisel toimub AC allosteeriline aktivatsioon ning tulemusena tekib rakku cAMP-d, mis aktiveerib sekundaarsed metabolismirajad. Üllatuslikul kombel tõuseb cAMP kontsentratsioon nii kättesaadava glükoosi hulga vähendamisel söötmes kui ka suurendamisel. Esimese 2 minuti jooksul tõuseb cAMP kontsentratsioon läbivoolukultuuri rakkudes umbes 1 µmol-ni 1 g kuiva rakumassi kohta, kui rakud on glükoosikülluses. Glükoosi limiteerimise korral cAMP kontsentratsioon tõuseb 4 µmol-ni 1 g kuiva rakumassi kohta. Mõne tunni jooksul langeb cAMP kontsentratsioon jälle rakkudes väga madalale, 0 lähedale. Sarnane kontsentratsioonimuutus nii glükoosi hulga vähenemisel kui ka ootamatul suurenemisel näitab, et rakud peavad kiiresti kohanema C-allika muutustega . Olgu selleks siis C-allika vähesus või üleküllus. Toitainete kättesaadavuse järsu muutusega tekib rakkudes sekundaarseid metaboliite, mis transporditakse keskkonda. Sekundaarsete metaboliitide teke näitab, et metabolism pole tasakaalus. Kui E. coli rakkudel vähenes läbivoolukultuuri toitainete kättesaadavus, siis sekundaarseid metaboliite söötmest ei suudetud detekteerida. See on mõistetav, sest toitainevaeguse korral peavad rakud kasutama maksimaalselt olemasolevaid C- ja energiallikaid ära. Samas kui läbivoolukultuuris kiirendati söötme läbivoolu (glükoosi hulk suurenes), siis rakud eritasid keskkonda palju sekundaarseid metaboliite, nagu atsetaati (450 mg/l, söötmes on glükoosi 10 g/l), laktaati (100 mg/l D-laktaati ja L-laktaati), püruvaati ja sipelghapet ( metaanhape ). Lisaks tekib väga kiiresti metüülglüoksaali (14 minuti järel 0,6 mg/l, maksimumkontsetratsioon u 4 tunnil 0,9 mg/l).
Metüülglüoksaali rada (MG-rada) on glükolüüsi kõrvalharu, mis aktiveeritakse siis, kui rakkudes on glükoosiliig ning rakk püüab vabaneda fosforüülitud suhkrutest. MG-rada algab DHAP-st ning raja esimene ensüüm MG-süntaas on allosteeriliselt reguleeritud, DHAP aktiveerib ensüümi ning reaktsiooni lõpp-produkt, fosfaat, inaktiveerib ensüümi. Samas GAP-i dehüdrogenaas on fosfaadi kontsentratsioonist sõltuv ning madal fosfaadi kontsentratsioon pärsib GAP-i lagundamist ja DHAP-i akumuleerumist. GAP ja DHAP tekib fruktoosbisfosfaadi (FDP) lagundamisel aldolaasiga võrdsel hulgal. Kui GAP-i dehüdrogenaas on aktiivne, siis glükolüüs on suunatud PEP-i kaudu glükoosi lagundamisele. Glükoosi hulga järsul suurenemisel söötmes, kuhjus rakkudesse FBP ja DHAP, samal ajal kui GAP-i lagundati väga intensiivselt. Vaatamata GAP-i intensiivsele lagundamisele ei suudeta DHAP-i piisavalt kiiresti ümber konverteerida GAP-ks ning kuhjunud DHAP aktiveerib allosteeriliselt MG süntaasi.
7.2 AEC on seotud nn vaikivate rakkude tekkega
Näiteks risosfäärne G(-) bakter Rhodospirillium centenum muutub metaboolselt inaktiivseks ja moodustab tsüsti, kui keskkonnas väheneb tugevalt toitainete hulk. Tsüsti moodustumine on reguleeritud klassikalise kemotaksise signaalraja modifitseeritud kaskaadiga Che3. See koosneb sensorist CheS 3 ja vastuseregulaatorist CheY 3. Lisaks on oluline veel teine sensorvalk CheA 3, mis modifitseerib signaali ülekannet CheS3-lt CheY3-le. Tegelikult on sensorvalk CheA3 valgukompleks, mille koosseisus on: metüül-kemoretseptorvalk MCP3, metüültransferaasid CheR3 ja CheB3, linkervalgud CheW3a ja CheW3b ja histidiinkinaas CheA3. Kui rakkudes deleteeriti cheS3 või cheY3 geen, siis moodustas R. centenum alati tsüste. Samas, kui rakud on CheA3-defektsed, siis R. centenum oli alati vegetatiivse rakuna . See näitab, et CheA3 reguleerib signaali ülekandumist CheS3-lt CheY3-le.
Kui rakkude AEC on kõrge, siis on CheS3 histidiinkinaasne domeen (HWE) fosforüleeritud ning toimub vastuseregulaatorile CheY3 fosfaatjäägi ülekanne. Sellises olukorras võtab CheA3 REC (vastuvõtu domeen) fosfaatjäägi enda histidiinkinaassest domeenist ning takistab fosfaatjäägi ülekannet CheS3 REC domeeni. CheA3 võib fosforüleerida CheS3 REC-domeeni, kui rakkudes väheneb ATP kontsentratsioon, ning suureneb ADP kontsentratsioon (AEC väheneb). CheA3 aktiveerimiseks on vajalik, et see sensorvalk võtaks keskkonnast vastu seniteadmata signaali. Sellisel juhul CheS3-l on fosforüleeritud REC-domeen ning takistatud HWE-domeeni fosforüleerimine ning signaali ülekanne CheY3-le ning rakud moodustavad tsüsti.
7.3 Persistorid ja multitolerantsus
Multitolerantsus (fenotüübiline tolerantsus, ka persistentsus) on mikroorganismi võime ellu jääda keskkonnas, mis sisaldab bakteriotsiidseid aineid, mis tavarakkudele on toksilised. Multitolerantsuse korral on biotsiidile tolerantsed rakud (persistorid) ja samale biotsiidile tundlikud rakud geneetiliselt samad. Vrdl multiresistentsus, mis tekib vastavate geneetiliste ümberkorralduste või geenide inserteerumisele genoomi. Tavaliselt on persistorite metaboolne aktiivsus, vaatamata toitainerikkusele, väga madal. Näiteks bakteritel Mycobacterium , Staphylococcus ja Pseudomonas on osa rakke populatsioonist persistoritena, mis soodustab juhuslike ja ootamatute ebasoodsate tingimuste üleelamist ning populatsiooni taasasustamist. Kuna bakterid on metaboolselt väheaktiivsed, siis enamik biotsiidseid aineid neile ei mõju ning nad on võimelised aluse panema uuele populatsioonile kui ebasoodsate tingimuste tõttu on enamik metaboolselt aktiivseid baktereid surnud.
Persistorite tekke täpset molekulaarset põhjust ei ole teada, välja on pakutud mitmeid teooriaid , sageli on tehtud järeldusi fenotüübiliste ja molekulaarbioloogiliste muutuste jälgimisel ning püütud leida teoreetilisi seoseid persistorite tekkega.
Välja pakutud mitu mudelit persistorite tekkeks:
1. Juhuslik teke. Antibiootikumitolerantsed bakterid tekivad juhuslikult populatsioonis.
2. Juhuslik kaasnev nähtus, nt näljaga kaasnev sekundaarne teke. Rakud tekivad statsionaarses faasis, kui toitained on otsakorral või keskkonnas pole toitaineid. Osa rakkude metaboolne aktiivsus langeb ning rakkude kasv peatub. Sellised rakud on iseenesest tundetud antibiootikumide suhtes, mille märklauaks on just kasvavad rakud.
3. Toitainete vahetus. See on pigem tähelepanek, et toitainete kättesaadavuse järsu muutusega või kui tekib diauksia, kaasneb antibiootikumidele tundetute rakkude teke.
Pikka aega on arvatud, et persistorid on metaboolselt inaktiivsed või väheaktiivsed, samas hiljuti avaldatud töös leiti (Radzikowski jt 2016 ), et mitte kõigi persistorite tüüpide puhul pole rakud metaboolselt inaktiivsed. Võrreldes kolme rakutüüpi pärast C-allika ja energiaallika muutmist (rakud külvati glükoosilt fumaraadile) leiti, et fumaraadil lasvavate rakkude AEC = 0,89, toitainete vahetusest tingitud persistorite AEC = 0,74, ning nälgimise tulemusena tekkinud persistorite puhul langes AEC kuni 0,24ni.
Võrreldes kasvavate rakkudega on persistorites vähenenud valkude kontsentratsioon, mis on seotud DNA replikatsiooniga ja DNA rekombinatsiooniga. Samas persistorites on suurenenud valkude kontsentratsioon, mis on seotud üldise stressivastusega (sh näljavastusega), RNA katabolismiga, DNA parandamisega ja valkude pakkimisega. On arvatud, persistorite tekke peamiseks põhjuseks on toksiinigeenide kõrgem ekspressioon rakkudes, mis tuleneb omakorda ppGpp (toitainete puuduse alarmoon) kontsentratsiooni juhuslikust kõikumisest rakuti. Nii toitainevahetusest tingitud persistoritel kui ka näljast tingitud persistoritel on geeniekspressioon üldiselt sama mustriga, vaatamata sellele, et eritüübiliste persistorite metaboolne aktiivsus on erinev. See näitab, et persistorite tekke taga on sarnane üldine stressivastus, peamiselt ppGpp juhuslik kuhjumine rakus ning RpoS-i regulon. Samas, tüvedel, mis on rpoS-deletandid, ei ekspresseeri ppGpp-d või on toksiin/antitoksiini süsteemide suhtes mitmikmutandid, tekib ikkagi persistoreid. Seetõttu arvatakse, et persistoreid tekib mitme mehhanismi abil.
Tähelepanuväärne on, et võrreldes kasvavate rakkudega on persistorites 1-2 suurusjärku vähem glükolüüsi vaheprodukte, nagu glükoos-6-fosfaati, fruktoos-6-fosfaati, DHAP jne, välja arvatud PEP. See näitab, et persistoritesse on vähenenud toitainete voog ning rakud on läinud stressi.
Persistoritele on iseloomulik, et suurenenud on RNA lagundamine (post-transkriptsiooniline regulatsioon) ning vähenenud translatsioon. Persistoritest leiti rohekm RNaase (I, R, E) ja ribosoomi modulatsiooni faktorit (RMF), mis takistab 70S ribosoomi moodustumist.
Samas metaboolselt aktiivsete ja inaktiivsete persistorite vahel on ka erinevusi. Metaboolselt aktiivsetes persistorites on kõrgem DNA replikatsiooniga seotud valkude kontsentratsioon ning rohkem globaalset regulaatorit IHF-i. On välja pakutud, et IHF-i on rohkem selle pärast, et teda on vaja replikatsiooni alustamiseks.
Toksiin/antitoksiin-süsteemide kõrvale pakutakse üha enam persistorite tekkepõhjuseks metabolismi häiritust. Näiteks juhuslike persistorite teke on soodustatud olukorras, kus glükoosi transport on inhibeeritud ( inhibiitorid ). See näitab, et persistorite tekke põhjuseks võib olla laias laastus metabolismi funktsioneerimise häiritus, mis viib toitainetevoo langusele rakku. Eriti ilmekalt tuleb see välja kättesaadavate toitainete järsul muutusel. Rakkude metabolism on häiritud ning uut C-allikat ei suudeta kasutusele võtta. Metabolismi häiritusega kiireneb valkude lagundamine võrreldes biosünteesiga ning rakk pole võimeline anabolismiradu enam aktiveerima . See omakorda aktiveerib stressivastusegeenide ekspressiooni ning toksiin-antitoksiinsüsteemid. Võimalik on ka toitainerikkas keskkonnas juhuslik stressivastuse aktivatsioon, mis viib metabolismi häiritusele ning persistori tekkeni.

8. Transkriptsiooni reguleerimine

Bakterite elukeskkond võib väga kiiresti muutuda ning sellest johtuvalt peab bakter kiiresti reageerima keskkonna muutustele. Kõige kiiremini reageerib bakter keskkonna muutustele metabolismis osalevate ensüümiaktiivsuste muutustega, mida viib läbi allosteeriline regulatsioon. Aeglasem vastus keskkonnast tulnud signaalile on geenide ekspresseeritavuse muutmine, mis sisaldab endas mitut kontrollpunkti. Geenide avaldumist saab reguleerida transkriptsiooni initsiatsiooni ja transkriptsiooni enneaegse terminatsiooniga ehk attenuatsiooniga ning post-transkriptsiooniliselt RNaaside abil reguleerides RNA eluiga. Samuti on oluline kontrollpunkt translatsioon ning post-translatsiooniline valkude pakkimine ning degradeerimine.
Keskkonnast vastuvõetud signaalile võib bakter reageerida erinevalt, muutes ainult ühe geeni avaldumist või reguleerides mitme või isegi sadade geenide avaldumist korraga. Selleks, et toimuks geenide avaldumine, on esmalt vaja geene transkribeerida RNA-ks. Transkriptsioon jaguneb initsiatsiooniks, elongatsiooniks ning terminatsiooniks.
Transkriptsioon algab RNA-polümeraasi (RNAP) seondumisega spetsiifilise DNA järjestusega, mida nimetatakse promootoriks, ning suletud kompleksi moodustumisega. Suletud kompleksiks nimetatakse RNAP-DNA kompleksi, kui polümeraas on seondunud DNA-ga, kuid pole veel transkriptsiooni initsieerinud. Selleks, et alustada RNA sünteesi on vajalik DNA ahelate lahtisulamine ehk avatud kompleksi moodustumine. Kui RNAP paneb paika RNA 10 esimest nukleotiidi, siis vabaneb RNAP küljest sigma faktor ning RNAP liigub edasi transkriptsiooni elongatsioonifaasi. Siiski enne elongatsioonifaasi üleminekut on transkriptsiooni initsiatsiooni reguleerimisel veel üks võimalik etapp, see on promootori vabastamine. Mõnikord reguleeritakse transkriptsiooni nii, et RNAP ei lasta üle minna elongatsiooni faasi, kuigi polümeraas on paika pannud esimesed nukleotiidid. Seda nimetatakse ka abortiivseks transkriptsiooniks. Transkriptsiooni on võimalik reguleerida ka libiseva sünteesiga, kui initsiatisiooninukleotiidi järel on mitu T-nukleotiidi nagu nt ATTTTTTG, siis RNAP võib transkribeerida kuni 15 nukleotiidi pikkusi RNA järjestusi, mis koosneb ainult U-dest.
Transkriptsiooni elongatsioonifaasis moodustub väga stabiilne DNA-RNAP-RNA kompleks, mida nimetatakse ka kolmikkompleksiks. Sigma faktori vabanemise järel võtab RNAP konformatsiooni, mis stabiliseerib transkriptsiooni. RNAP transkribeerib väga efektiivselt RNA-d, sünteesides 1000 nukleotiidi sekundis. RNA sünteesi ajal on DNA 17 nukleotiidi ulatuses alati lahti harutatud üheahelaliseks DNA-ks. Sellest johtuvalt on RNAP ees positiivne superspiralisatsioon, mida güraas leevendab. RNAP taga on negatiivne superspiralisatsioon, mida TopA leevendab.
Transkriptsiooni terminatsioon saab toimuda kahel viisil: Rho-sõltuv ja -sõltumatu terminatsioon. Rho faktorist sõltumatu terminatsioon toimub juuksenõela struktuuri abil. GC-rikkad kordusjärjestused tekitavad RNA-l stabiilseid juuksenõelastruktuure, mis seonduvad RNAP-ga ning destabiliseerivad kolmikkompleksi. Termineerumist soodustab GC-korduste järel olev T-rikas piirkond, mis vastab RNA-l U-rikkale järjestusele, mis soodustab kolmikkompleksi lagunemist.
Rho-sõltuv terminatsioon toimub tavaliselt RNA-l, mida ei transleerita. Rho seondub RNA-l rut (inglise keeles rho utilization site) järjestusele, mis on C-rikas, ning kasutades ATP-d liigub mööda RNA-d polümeraasile järele, seondub RNAP-ga ning põhjustab kolmikkompleksi lagunemise (DNA-RNA kompleksi). RNAP jääb tavaliselt u 100 bp pärast rut järjestust toppama spetsiifilisel terminatsioonijärjestusel ning „ootab“ Rho-faktorit järele. Mõnikord ei saa polütsistroonselt RNA-lt operoni esimest geeni transleerida ning Rho faktor seondub mitte-transleeritava RNA-ga ning termineerib transkriptsiooni. Selle tulemusena ei avaldu mitte ükski geen operonist, kuigi tagumistel geenidel võib translatsiooniks vajalik ribosoomide seondumisjärjestus olemas olla. Sellist efekti, kui esimene geen takistab operoni tagumiste geenide avaldumist nimetatakse polaarseks efektiks.

7.1. RNA polümeraasi ehitus

Transkriptsiooni läbi viiv E. coli RNA polümeraasi (RNAP) apoensüüm koosneb viiest subühikust: 2, , ’ ja . Seondudes kuuenda subühikuga, -subühikuga, moodustub RNAP holoensüüm, mis on võimeline initsieerima transkriptsiooni. RNAP ’ subühik (rpoC) sisaldab osa aktiivtsentrist, mis sünteesib RNA-d, see subühik vastutab ka DNA-ga ja äsjasünteesitud RNA-ga mittespetsiifilise seondumise eest. RNAP  subühik (rpoB) sisaldab ülejäänud aktiivtsentrit, mis on RNA sünteesiks vajalik ning osaleb samuti DNA ja RNA-ga mittespetsiifilises seondumises. RNAP  subühik (rpoA) on RNAP kahe koopiana, N-terminus vastutab RNAP assambleerumise eest ning C-terminus on oluline UP-elementidega seondumiseks ning regulaatorvalkudega seondumiseks. RNAP väikseim -subühik (rpoZ) on oluline RNAP assambleerumisel,  aitab ’-subühikul seonduda 2 subühikutega ning stabiliseerib RNAP-d. Lisaks assambleerimisele, osaleb -subühik ppGpp vahendatud transkriptsiooni regulatsioonis. RNAP, millel puudub -subühik, on ppGpp suhtes tundetud ega vahenda globaalse alarmooni regulatsiooni. Alarmoon ppGpp seondub  ja ’ subühiku vahele ning -subühiku N-terminus on vastutav ppGpp regulatsiooni vahendamise eest. Samas on pakutud, et -subühik ei oma in vivo nii suurt tähtsust ppGpp tundlikkuse vahendamises kui RNAP stabiliseerimises olukorras, kus DNA on tugevalt negatiivses superspiralisatsioonis (vt transkriptsiooni globaalne regulatsioon). RNAP kuues subühik -subühik ehk -faktor on vajalik ainult promootori äratundmiseks ning avatud kompleksi moodustumiseks. Esimeste RNA nukleotiidide sünteesimiste järel -faktor vabaneb ning RNAP apoensüüm jätkab transkriptsiooni elongatsiooni ning lõpetab RNA sünteesi.
E. coli’l on 7 põhilist -faktorit, mida kasutatakse geenide ekspressiooni reguleerimiseks, kuna -subühikud tunnevad ära erinevaid DNA järjestusi ehk promootoreid. Erinevalt eukarüootidest on eubakteritel promootor alati geeni ees.
Bakteritel on üheks globaalseks regulatsiooni võimaluseks reguleerida geenide avaldumist erinevate sigma faktoritega. Tavaliselt on bakteritel mitmeid sigma faktoreid, mis tunnevad ära erinevaid promootoreid ning reguleerides sigma faktorite ekspressiooni rakus on võimalik reguleerida stimulone sigma faktoritega.

8.2. Sigma faktorid ja promootorite konsensused

Tavaliselt on bakteritel üks peamine sigma faktor ning palju alternatiivseid sigma faktoreid, mille ekspressioon on aktiveeritud spetsiifilistes tingimustes. E. coli kõige olulisem -faktor on D (70), mis on vajalik elutähtsate geenide avaldumiseks ning see sigma faktor on bakteris alati olemas. Sigma70 abil ekspresseeritakse E. coli’s enamikke geene. Teised, nn alternatiivsed sigma faktorid, on ekspresseeritud spetsiifilise stressi korral. Kõige üldisem alternatiivne sigma faktor on S (38), mis vastutab üldise stressivastuse geenide transkriptsiooni aktivatsiooni eest. SigmaS ekspresseerub rakkudes kasvu aeglustumise faasis. Lämmastiku limitatsiooni vastuse geenide avaldumise eest vastutab N (54), raua limitatsiooni vastuse geenide avaldumise eest vastutab I. Kuumašoki ning pH šoki vastuse geenide avaldumise eest vastutab H (32) ning liikumise (viburi) geenide avaldumise eest vastutab F (28).
Sigma faktorid jagunevad tavaliselt kahte suurde perekonda. Suurem ja üldisem on sigmaD perekond, millest on evolutsiooni käigus tekkinud palju alternatiivseid sigma faktoreid, nagu S, H , F. Nendel sigma faktoritel on peale aminohappelise järjestuse suhteliselt sarnane ka DNA järjestus, mida nad ära tunnevad. Tavaliselt on bakterites 1 või 2 sigma faktorit, mis on sigma70 perekonnast erinevad. E. coli’s on selleks N, mis on vajalik N-metabolismi geenide ekspressiooniks. Erinevalt sigmaD-tüüpi sigma faktoritest vajab sigmaN transkriptsiooni initsieerimiseks alati aktivaatoreid, mis võivad seonduda DNA-ga promootorist ebatüüpiliselt kaugel.
Eraldi alternatiivsete sigma faktorite rühma moodustavad sigmaD superperekonda kuuluvad ekstratsütoplasmaatilise funktsiooniga sigma faktorite alamperekond ECF (inglise keeles extracytoplasmic function ). Need alternatiivsed sigma faktorid reguleerivad raku ümbrisega seotud funktsioone, nagu sekretsioon , ekstratsellulaarsete faktorite süntees, toitainete omastamine ja transport. Pseudomona areuginosa’s on leitud 19 ECF sigma faktorit, Bacillus subtilises 7 ECF sigma faktorit. Need alternatiivsed sigma faktorid on enamik ajast seotud membraaniseoseliste antisigmafaktoritega ning inaktiveeritud. Õige keskkonna signaali korral need alternatiivsed sigma faktorid vabanevad antisigma faktorist ning muutuvad aktiivseks. See süsteem on sarnane kahekomponendilisele süsteemile, mis samuti aktiveerib keskkonnast tulnud signaali tulemusel vajalikud geenid. Erinevus on selles, et kahekomponendilises süsteemis on tegemist regulaatorvalguga, sigma-antisigma süsteemis RNAP subühikuga.
Sigma faktor on tavaliselt antisigmafaktoriga samas operonis. Antisigmafaktor on tavaliselt membraaniseoseline ning seondub sigma faktoriga. Seondunud sigma faktor on inaktiivne. Teatud signaali korral sigma faktor vabaneb antisigmafaktori küljest ning initsieerib spetsiifilise stressivastuse. Tuntuim E. coli E-RseA sigma-antisigmafaktori süsteem, mis tunnetab madala ja kõrge temperatuuri šokki, etanooli, lipopolüsahhariidide defekte ning biofilmi moodustumise represseeritust. Teisisõnu tunnetab E-RseA süsteem ekstratsütoplasmaatilist stressi, mis päädib antisigmafaktori lagundamisega nii periplasmast kui ka tsütoplasmast. Proteolüütilise vabastamise järel sigmaE aktiveerib stressivastusgeenid, millest paljud on periplasmaatilised šaperonid, lipiidA biosünteesigeenid jne. Nt Pseudomonas aeruginosas aktiveerib E alginaadi sünteesi.
E. coli konserveerunud DNA järjestused, mida tunnevad ära erinevad sigma faktorid.
SigmaD (-35 element, vaheala, -10 element) TTGACA N17(1) TATAAT N5-7 G/A
SigmaD-l on väga spetsiifilised järjestused, kusjuures kahe elemendi vahelise ala pikkusega reguleeritakse geeni transkriptsiooni kasvufaasist sõltuvalt. Geenide promootorite -10 ja -35 järjestused võivad konsensusest erineda. Kuigi tugevalt on konserveerunud 12 nukleotiidi, siis isegi ainult 7 nukleotiidi kattumine on piisav, et RNAP suudaks transkriptsiooni initsieerida. RNAP subühikute asetusest ning suurusest tulenevalt asub transkriptsiooni esimene nukleotiid tavaliselt 6 – 8 nukleotiidi kaugusel -10 elemendist.
SigmaS (-35 element, vaheala, -10 element) TTGACA N15(2) KCTAYACT (K = G või T; Y = C või T)
E. coli sigmaS-l ei ole -35 element nii tugevalt konserveerunud kui sigmaD-l. -35 element ei pruugi sugugi sarnaneda TTGACA järjestusele, ometigi mutatsioonid selles piirkonnas muudavad sigmaS-ga transkriptsiooni regulatsiooni isegi siis, kui järjestus ei sarnane TTGACA-ga. -10 element on suhteliselt sarnane sigmaD -10 elemendiga. -10 elemendist ülesvoolu on konserveerunud lisanukleotiidid, mida sigmaD -10 elemendil pole. SigmaS-i promootorite vaheala pikkus varieerub rohkem kui sigmaD vaheala pikkus.
SigmaN (-24 element, vaheala, -12 element) TGGCAC N6 TGC
E. coli sigmaN-i konsensus DNA-l erineb sigmaD konsensusest tugevasti ning põhimõtteliselt seisneb -12 positsioonis konserveerunud GC-s ja -24 positsioonis konserveernud GG-st.
SigmaH (-35 element, vaheala, -10 element) CCTTGAA N14(1) CCCATTTA
SigmaF (-35 element, vaheala, -10 element) TAAAGTTT N11 GCCGATAA
RNAP on väga suur valk, u 450 kDa raske, ning sellest johtuvalt katab RNAP DNA promootoralas kuni 110 nukleotiidi (-90 … +20 nukleotiidi geeni esimesest nukleotiidist). Sellest johtuvalt muutused selles piirkonnas mõjutavad transkriptsiooni initsiatsiooni ja seega ka geenide avaldumist. Sellest johtuvalt jaotatakse DNA piirkonnad kolmeks: -90 … -40 promootorist ülesvoolu jääv piirkond, -40 … -1 promootori piirkond ning +1 … +20 promootorist allavoolu jääv piirkond (NB! 0 nukleotiidi pole, on -1 ja +1 nukleotiid, vastavalt üks nukleotiid enne geeni ja geeni esimene nukleotiid, mis tavaliselt on A või G).
Promootorist ülesvoolu jääval regioonil on transkriptsiooni initsiatsioonikompleksi moodustamist reguleeriv funktsioon. Siia seonduvad tavaliselt transkriptsiooni aktivaatorid , mis soodustavad RNAP seondumist promootorile, avatud kompleksi teket või promootori vabanemist. DNA-l endal võib ka olla regulatoorne tähtsus. DNAs olevad lühikesed AAAA või TTTT järjestused soodustavad DNA paindumist, mis tõenäoliselt soodustab DNA mähkumist RNAP ümber ning transkriptsiooni initsiatsiooni. Spetsiifilisi AT-rikkaid järjestusi nimetatakse UP- elemendiks , mis asub tavaliselt positsioonis -40 … -60 geeni algusest. UP-element seondub RNAP -subühiku C-terminusega ning põhjustab konformatsioonilisi muutusi RNAP-s, mis indutseerib kordades transkriptsiooni initsiatsiooni (nt E. coli ribosomaalsete geenide operon rrnB).

8.3. Transkriptsiooni reguleerimine

Bakteris jagatakse transkriptsiooni reguleerimine kaheks: positiivse kontrolli korral regulaatorvalgud aktiveerivad transkriptsiooni ning negatiivse kontrolli korral represseerivad transkriptsiooni. Kuna regulaatorvalgud võivad olla allosteerilised, nende aktiivsus (antud juhul DNA-le seondumine) võib olla reguleeritud efektormolekulide abil. Efektormolekuliks võib olla väga erinev väike molekul nagu näiteks metabolismiraja substraat, produkt, vaheprodukt, alarmoon, ioon jne. Regulaatorvalgu ning efektormolekulide iseloomust tulenevalt saab transkriptsiooni regulatsiooni jagada neljaks alatüübiks:
1. Regulaatorvalk on efektormolekulita inaktiivne, ei seondu DNA-ga
1.1. Positiivne kontroll. Regulaatori ja efektormolekuli seondudes regulaator aktiveerib transkriptsiooni. Efektormolekulita regulaatorvalk ei aktiveeri transkriptsiooni, transkriptsiooni ei toimu. Regulaatorvalku nimetatakse apoinduktoriks ning efektormolekuli koaktivaatoriks.
1.2. Negatiivne kontroll. Regulaatori ja efektormolekuli seondudes regulaator represseerib transkriptsiooni. Efektormolekulita regulaatorvalk ei represseeri transkriptsiooni, transkriptsioon toimub. Sellisel juhul regulaatrovalku nimetatakse aporepressoriks ning efektormolekuli korepressoriks. Näiteks trüptofaani biosüntees regulaator TrpR seondub trüptofaaniga ning seejärel seondub trp operoni promootoralaga ning pärsib transkriptsiooni.
2. Regulaatorvalk on efektormolekulita aktiivne, seondub DNA-ga
2.1. Positiivne kontroll. Regulaator aktiveerib transkriptsiooni efektormolekulita. Efektormolekuliga seondudes transkriptsiooni ei toimu. Regulaatorvalku nimetatakse aktivaatoriks, efektormolekuli inhibiitoriks.
2.2. Negatiivne kontroll. Regulaatorvalk represseerib transkriptsiooni kui pole seondunud efektormolekuliga. Efektormolekuliga seondudes regulaatrovalk ei represseeri enam transkriptsiooni. Regulaatrovalku nimetatakse repressoriks ning efektormolekuli induktoriks. Näiteks LacI seondumine lacZYA operonile pärsib RNAP seondumise promootoralale. LacI seondumine allolaktoosiga muudab LacI konformatsiooni sedasi, et LacI vabastab promootorala ning RNAP alustab transkriptsiooni.
DNA piirkonda, millele seonduvad transkriptsiooni negatiivselt reguleerivad regulaatorvalgud, nimetatakse operaatoralaks ehk operaatoriks. DNA piirkonda, millele seonduvad transkriptsiooni positiivselt reguleerivad regulaatorid, nimetatakse aktivaatori seondumisalaks.
Transkriptsiooni reguleerimine transkriptsiooniregulaatoritega.
Repressioon. Kõige lihtsam viis transkriptsiooni reguleerimiseks on repressioon. Transkriptsiooni uurimise alguspäevil oli repressiooniga reguleerimine nii domineeriv, et esimesed teated transkriptsiooni aktiveerimisest leidsid ägedat vastuseisu. Repressioon võib toimuda kõigil etappidel, mida on vajalik transkriptsiooni initsiatsiooniks:
1. RNAP seondumise takistamine
2. avatud kompleksi moodustumise takistamine
3. promootori vabastamise takistamine
RNAP seondumise parimaks näiteks on LacI seondumine lacZ geeni ees olevale operaatoralale, mille tulemusena lacZ geeni transkriptsiooni ei saa RNAP alustada. Operaator asub promootori ja geeni alguspunkti vahel ning takistab füüsiliselt RNAP seondumist promootoralaga.
Transkriptsiooni regulaatorite seondumiskohast sõltuvalt võib aimata, kas regulaator aktiveerib või represseerib transkriptsiooni. Tavaliselt seonduvad transkriptsiooni repressorid promootorile või promootori ja geeni alguse vahele, takistades füüsiliselt RNAP seondumist promootorile. Aktivaatorid seevastu seonduvad promootoralast ülesvoolu ning on vajalikud RNAP -subühikuga seondumiseks või DNA painutamiseks, et RNAP seonduks DNA-ga või ülesvoolu asuva aktivaatoriga.
Avatud kompleksi moodustumist saab takistada DNA ahelate lahtisulamise takistamisega. See saavutatakse tavaliselt regulaatorite seondumisel promootoralale nii, et muutub DNA lokaalne superspiralisatsioon, mis takistab ahelate lahtisulamist. (Aktivatsiooni korral soodustab lahtisulamist). Avatud kompleksi ülemineku heaks näiteks on E. coli gal operon, mille promootorist üles ja allavoolu seondub repressor GalR operaatoritele. Repressiooniks on vaja histoonilaadse valgu HU seondumist, selle tulemusena DNA paindub , ning GalR dimeerid seonduvad omavahel ning moodustub stabiilne DNA luup , mille keskel olevale promootorile RNAP seonduda ei saa. Kuid isegi siis, kui HU ei seondu DNA-ga ega moodustu stabiilset DNA luupi (isegi siis kui geenipoolne GalR operaator muteerida nii, et sellele ei seondu enam GalR) gal-operoni ei transkribeerita. Piisab ühest GalR operaatorile repressori seondumisest, et represseerida transkriptsioon. Arvatakse, et see toimub avatud kompleksi moodustumise takistamisega.
Transkriptsiooni saab represseerida ka RNAP liikumise takistamisega elongatsioonifaasi ehk promootori vabastamisega. Bacillus subtilis’e faagi 29 promootorite modifitseerimisega laboris, konstrueeriti promootor, mille järjestused kattusid täpselt sigmaD konsensusjärjestustega TTGACA N17 TATAAT. Ootamatult ilmnes , et sellelt promootorilt ei transkribeeritud sugugi kõige intensiivsemalt geene, vaid hoopis promootorilt, mis oli keskmiselt sarnane sigmaD konsensustega. Antud juhul seondus RNAP promootoriga nii tugevasti, et RNAP suutis sünteesida ainult paari nukleotiidipikkusi RNAsid ning seejärel transkriptsioon peatus. Seega optimaalne promootori järjestus ei pruugi anda tugevaimat transkriptsiooni.
Aktivatsioon. Aktivatsiooni korral suureneb geenide transkribeeritavus regulaatorite toimel. Tavaliselt on geenid transkribeeritud madalal tasemel, mida nimetatakse ka basaalseks tasemeks. Kui promootoralale seonduvad regulaatorid, siis transkriptsioon võimendub mitmeid või mitmeid sadu kordi. Vastandina repressioonile, kus regulaatorvalk blokeeris transkriptsiooni teatud etapi, toimub aktivatsiooni korral kõige aeglasema etapi inhibitsiooni leevendamine. Aktivaatorid võivad soodustada RNAP seondumist promootoralale, avatud kompleksi moodustumist või promootorala vabastamist.
Tavaliselt seonduvad aktivaator ja RNAP DNA-le samaaegselt. Sellest johtuvalt seonduvad aktivaatorid tavaliselt promootorist ülesvoolu ega takista RNAP seondumist promootorile. Kui aktivaator seondub promootori -35 elemendi lähedale, siis tavalisel toimub aktivaatori ja RNAP -subühiku C-terminuse vahel interaktsioon , mis soodustab RNAP seondumist või avatud kompleksi moodustumist. Transkriptsiooni akitveerimine võib toimuda ka aktivaatori ja RNAP mõne teise interaktsiooni tulemusel kui -subühiku C-terminusega. Näiteks interaktsioon -subühiku N-terminusega, - või ’-subühikuga või isegi -subühikuga.
Aktivaatori seondumise kaugus promootorist, mille abil toimub transkriptsiooni aktiveerimine, on erinev. Sellest tulenevalt on mehhanism, mille abil transkriptsiooni aktiveeritakse, pisut erinev. Crp (tuntud ka kui CAP – inglise keeles catabolite activator protein) võib aktiveerida transkriptsiooni seondudes geeni algusest -63 või -45 piirkonda. Klass I promootori korral seondub Crp kohe -35 elemendist eemale ning transkriptsioon toimub RNAP -subühiku C-terminusega interakteerudes. Sellisel juhul toimub RNAP promootorile seondumise soodustamine. Teisel juhul, klass II promootori korral, seondub aktivaatorina käituv Crp -35 elemendile väga lähedale ning aktivaator seondub -subühiku N-terminusega ning paindliku hingeregiooni abil seondub -subühiku C-terminus ülesvoolu asuva DNA regulaatoralaga. Klass II promootorite puhul soodustatakse avatud kompleksi teket.
DNA piirkonnad, kuhu seonduvad regulaatorid, võivad asuda hoopiski väga kummalises kohas. Üldjuhul seonduvad repressorid otse promootorile, kuid mõnikord võib asuda promootori vahealas ka aktivaatori seondumiskoht. Näiteks transposooni Tn501 elavhõbeda resistentsusoperoni mer aktiveerimiseks on regulaatori MerR seondumine operoni promootori vahealasse, mis jääb -35 ja -10 elemendi vahele. Selle promootori vaheala on tavatult pikk 19 – 20 nukleotiidi ning transkript-siooni initsiatsiooniks on vajalik vaheala väändumine regulaatorvalgu abil. Sellisel juhul -35 ja -10 elemendi vaheala lüheneb ning elemendid positsioneeruvad täpselt RNAP seondumisjärjestustele vajalikule kaugusele. Regulaatori toime sõltub sellest, kas MerR on seondunud elavhõbeda iooniga või mitte. Kui MerR pole Hg2+ seondunud, siis regulaatorvalk ei painuta DNA-d ning aktivatsiooni ei toimu. Kui MerR on Hg2+-ga seondunud, siis toimub DNA väänamine ning transkriptsiooni aktiveerimine.
Aktivatsioon võib toimuda veel keerulisemalt. Näiteks arabinoosi operoni geenide transkriptsiooni aktiveerimine promootorilt PBAD sõltub arabinoosi olemasolust. Promootoralaga seonduvad AraC, mille allosteeriliseks efektoriks on arabinoos, ning Crp-cAMP, mis tekib siis kui keskkonnas pole enam glükoosi ning rakud peavad kasutama sekundaarseid C-allikaid. AraC seondub kolmele alale promootori ees: operaatorala O2, mis asub promootorist kaugemal, ning O1, mis asub promootorile lähemal. Promootorile kõige lähemal asub aktivatsiooni järjestus I1. Crp-cAMP seondub promootoralas I1 ja O1 vahele. Kui arabinoosi keskkonnas pole, siis regulaatrovalk AraC seondub promootori lähedal olevale alale aktivatsiooni järjestusele I1 ja operaatorile O2. Moodustub DNA luup, mis takistab RNAP seondumist promootoralaga. Kui arabinoos on saadaval, siis arabinoosi seondudes regulaatorvalgule AraC toimuvad konformatsioonilised muutused ning seejärel muutuvad ka seondumiseelistused. Arabinoosiga seondunud AraC seondub I1 ning Crp-cAMP saab seonduda DNA-ga ning arabinoosi katabolismigeenid aktiveeritakse.

8.4. Geenide organiseeritus

Bakterites pole kõigil geenidel oma promootorit, millelt RNAP saaks initsieerida transkriptsiooni. Geenid, mis asuvad sama promootori järel ning mida RNAP transkribeerib korraga, nimetatakse operoniks ning sellist RNA-d, mis sisaldab mitme geeni RNA-d, nimetatakse polütsistroonseks RNA-ks. Tavaliselt on ühes operonis sellised geenid, mis on seotud sama funktsiooni või mehhanismiga. Näiteks tihti on sekundaarsete C-allikate katabolismi geenid ühes operonis. Geene, mis vastutavad sama C-allika metabolismi eest on efektiivne transkribeerida korraga ühe promootori alt, sest sellisel juhul aktiveeritakse kogu metabolismirada korraga ning aktivatsiooniks on vaja geenide transkriptsiooni reguleerida ainult ühe promootori kaudu, mis on energeetiliselt efektiivne.
Reguloniks nimetatakse neid operone ja geene, mida reguleerib üks regulaatorvalk, näiteks arginiini regulon. Moduloniks nimetatakse regulone, operone ja geene, mida reguleerib globaalne regulaatorvalk nagu näiteks Crp. Erinevus regulonidest on signaali ulatus. Moduloni korral on muudetavate geenide avaldumise arv suurem ning vastus üldisem kui regulonide puhul. Moduloni korral kasutatakse signaaliks alarmoone, mis on väikesed efektormolekulid, mis kogunevad rakus stressi korral. Näiteks Crp moduloni alarmooniks on cAMP. Stimuloni alla kuuluvad geenid, operonid, regulonid ja modulonid, mis on aktiveeritud ühe üldise keskkonnasignaali korral. Stimuloni korral on reguleeritud geenide avaldumine, mille produktid on väga erinevate funktsioonidega, ega ole omavahel seotud otseselt nagu näiteks DNA replikatsioon ja glükolüüs. Osa teadlasi ei erista moduloni ja stimuloni ning võrdustavad need stimuloniks. Regulonid võivad kuuluda erinevatesse stimulonidesse, mis näitab veelkord geenide transkriptsiooni regulatsiooni keerukust.
Bakterid on võimelised kasvama ning hakkama saama mitmesuguse keskkonnast tingitud stressiga, nagu näiteks toitainete hulga järsu muutumisega, C-allika asendumisega, aminohapete limitatsiooniga, O2 hulga muutumisega keskkonnas, kuumašokiga, pH järsu muutusega ja mitmesuguste toitainete limitatsiooniga (fosfor, lämmastik, süsinik). Kõigil nendel juhtudel peab bakter muutma oma füsioloogiat nii, et bakter oleks võimeline kohanema uute tingimustega ning tegema seda võimalikult efektiivselt. Keskkonnatingimuste muutumisele vastab bakter globaalse regulatsiooniga, mis seisneb DNA replikatsiooni, kasvukiiruse, rakujagunemise ning metabolismi muutmisega. Globaalse regulatsiooni korral reguleeritakse korraga väga paljude geenide avaldumist.

9. Globaalne transkriptsiooni regulatsioon

Enamasti on DNA bakterites tsirkulaarsel kujul. See tähendab, et DNA otsad ei saa vabalt pöörelda ning DNA superspiraliseerub. DNA superspiralisatsioonil on kaks tähtsust: pakkida DNA-d ning reguleerida replikatsiooni ning transkriptsiooni. Kõrvutades E. coli raku pikkust kromosoomi pikkusega on ilmselge, et bakter on tunduvalt lühem kui tema sees olev DNA. Logaritmilises faasis kasvab bakter kiiresti ning E. coli pikkus ulatub kuni 2 m-ni, samas näiteks E. coli lac-operon koosneb kolmest geenist lacZ, lacY ja lacA ( kodeerivad vastavalt -galaktosidaasi, laktoosi permeaasi ja galaktosiid O-atsetüültransferaasi) ning on umbes 1,7 m pikkune kui arvestada nukleotiidse järjestuse pikkust. Kui arvesse võtta 4639 valku kodeerivat geeni, ulatub E. coli tsirkulaarne DNA 1,5 mm-ni. Need võrdlused näitavad ilmekalt, et bakter peab DNA-d väga efektiivselt pakkima ning lisaks veel operatiivselt võimaldama DNA-d replitseerida ning transkribeerida. Mis tähendab, et bakter peab DNA lahti harutama ning uuesti pakkima.

9.1. Geenide asukoht kromosoomis – globaalse regulatsiooni 1. aste

Geenid ei paikne bakterite kromosoomis suvalises järjekorras, vaid kindla korra alusel. Arvatakse, et geenide paiknemisel kromosoomis on evolutsiooniline tähtsus, neid ei saa suvaliselt ümber paigutada, kui siis ainult teatud piirkonnas. E. coli kromosoom jaotatakse 6 erinevaks piirkonnaks , kuhu kuuluvad 4 makrodomeeni: Ori-domeen, vasak domeen, parem domeen ja Ter-domeen, ning kaks mittestruktureeritud regiooni: NS-vasak ja NS-parem regioon (NS inglise keeles non-structured). Makrodomeen on bakteri kromosoomi väga pikk piirkond, milles toimuvad rekombinatsioonid domeeni siseselt, kuid domeenidevahelised rekombinatsioonid on pärsitud, sest liiga suurte DNA ümberkorralduste tulemusena bakteri kohasus väheneb. Kaks bakterit Escherichia coli ja Salmonella enterica on väga sarnased enterobakterid, mis evolutsiooniliselt on lahknenud umbes 100 miljonit aastat tagasi (u 120 miljonit aastat tagasi tekkisid õistaimed). Samas on mõlemal bakteriliigil geenid konserveerunud makrodomeenidesse väga sarnaselt, mis näitab, et geenide asukoht bakteri kromosoomis muutub väga aeglaselt, mis näitab regulatsiooni säilimisele läbi miljonite aastate.
Ori-piirkonna makrodomeen koosneb oriC­-ga (oriC-lt algab kromosoomi repliaktsioon) piirnevatest aladest, selle vastas asub Ter-piirkonna makrodomeen, mis koosneb replikatsiooni termineeriva piirkonnaga ter külgnevatest aladest. Ter-piirkonna makrodomeen sisaldab ka dif –järjestust, mis on tütarkromosoomide lahutamiseks määrava tähtsusega. Sellele järjestusele seonduvad rekombinaasid XerC ja XerD. Ülejäänud piirkonnad moodustavad vasaku ja parema replikatsioonikahvli piirkonnad, mis moodustuvad DNA-polümeraasi liikumisel mööda kromosoomi. Kromosoomi paremaks osaks nimetatakse seda bakteri kromosoomi osa, kus DNA-polümeraas liigub päripäeva, ning kromosoomi vaskuks osaks nimetatakse seda kromosoomi poolt, kus DNA-polümeraas liigub vastupäeva.
Kromosoom on pakitud kokku umbes 117 kbp pikkuste lingudena, mis võivad olla nii solenoidselt (kujuta ette vedru) kui ka plektoneemselt (lamedate plaatidena). Edasi pakitakse DNA mikrodomeenidesse, mis on umbes 10 – 12 kbp pikkused lingud. Mikrodomeeniks nimetatakse kromosoomi topoloogiliselt sõltumatut piirkonda. E. coli’l on umbes 400 mikrodomeeni. Mikrodomeene hoiavad koos histoonilaadsed valgud (ehk nukleoidi moodustavad valgud), nagu Fis, IHF, HU, H-NS ja Dps. Eriti oluline roll on H-NS-l ja Fis-l, mis lahutavad mikrodomeene üksteisest. Arvatakse, et H-NS-i DNA sildu moodustav omadus on määrav, mille tõttu üle kromosoomi laiali pillutud H-NS-i seondumisjärjestustele seondudes kromosoom pakkub kokku keerukaks struktuuriks. Valkude abil pakitakse bakteri DNA lilleõit meenutavaks struktuuriks. DNA topoloogia on dünaamiline, see tähendab, et DNA lingude ehitus muutub ning sõltub bakteri füsioloogilisest seisundist.
Geeni transkriptsioon sõltub asukohast kromosoomis. Bakterite geenid paiknevad genoomis teatud korra järgi. Uuritud 300 - ja -proteobakterite genoomis paiknevad geenid, mille produkte on vaja kiiresti kasvavates rakkudes, nagu stabiilsete RNA-de geenid, asuvad origini lähedal. Tavaliselt on sellised geenid ka mitmes korduses. Samas geenid, mida pole sageli vaja, nagu näiteks anaeroobse stressi korral, asuvad replikatsiooni terminaatorite lähedal. Peale selle, et geenid asuvad teatud korra järgi, on nende ekspressioon seotud geenide asukohaga. Näiteks güraas seondub pigem origini lähedusse ning origini lähedal paiknevad ka need geenid, mis vajavad aktivatsiooniks suuremat negatiivset superspiralisatsiooni. Samas statsionaarse sigma faktori kontrolli all olevad geenid paiknevad pigem replikatsiooni terminaatorjärjestuste lähedal.
Geenide ekspressioon sõltub: DNA tertsiaarstruktuurist ja regulaatori difundeerumisest bakteris. Bakterite geeniuuringute alguses oli tavapärane arusaam, et regulaatorgeen asub struktuurgeeni lähedal. Nii saab regulaator aktiveerida struktuurgeeni üsna lihtsalt. Kuid uurides regulaatoreid, mis aktiveerivad väga palju geene, mõisteti, et geenide regulatsioon on ruumiliselt keerulisem. DNA molekulis võivad geenid asuda üksteisest kaugel, kuid DNA tertsiaarstruktuur toob geenid üksteisele lähedale. Kui vaadata bakterite genoomi kaarte, siis lineaarsel kaardil võivad teineteisest sõltuvad geenid asuda väga kaugel.
Rohkem kui 100 bakteri genoomi uuriti bioinformaatiliselt ning leiti, et teatud geenipaaridel on konserveerunud kaugus, need geenid eksisteerivad bakteri kromosoomis teineteisest teatud kaugusel. E. coli’s on selliseks sammuks 117 kbp, mis on täpselt ühe solenoidi või plektoneemi samm. Veelgi enam, enamik sellistest geenidest oli lokaliseerunud genoomi piirkonda, mida aktiivselt transkribeeriti. Lisaks 117 kbp sammule võivad geenid olla paigutunud veel umbes 16 kbp ja 600 – 800 kbp tagant, mis vastab umbes mikrodomeeni ja makrodomeeni pikkusele.
Bakteris on DNA alati tertsiaarstruktuuris, mis tähendab, et DNA solenoidse või plektoneemse tertsiaarstruktuuri korral võivad geenid asuda kõrvuti. Selline orienteeritus lihtsustab geenide regulatsiooni. Samas kui toimuksid DNA-s ümberkorraldused, siis ainuüksi geenide asukoha muutmine võib struktuurgeenide regulatsiooni muuta, ainult sellega, et DNA tertsiaarstuktuuri moodustumisel asub regulaatorgeen struktuurgeenide aktivatsiooniks füüsiliselt liiga kaugel. Geeni asukoha muutumisel genoomis võib struktuurgeenide aktivatsioon tunduvalt muutuda, ilma et DNA järjestus ise muutuks. Arvestades asjaolu, et bakteri nukleoidi tertsiaarstruktuur muutub kasvu kiirusest sõltuvalt (vt peatükki Bakterite ehitus ja rakustruktuuride funktsioonid), siis geenide regulatsioon võib muutuda ainult kromosoomi erinevast pakkimisest kasvufaasiti.
Teine võimalus, regulaator difundeerub märklaudjärjestuseni. Jälgiti Caulobacter crescentus’e groESL operoni geenide (ATP-st sõltuvad šaperonid, mis aitavad struktuurvalkudel õigesti pakkuda) ja E. coli’s geeni lacZ (-galaktosidaas) mRNA-de liikumist rakus fluorestsents-märkega hübridiseerimise abil in situ (ladina keeles, tähendab „koha peal“). Esmalt saadi tulemus, et mRNA-lt toimub translatsioon DNA lähedal, mis näitab valkude ruumilist eraldatust bakteris. Valku sünteesitakse geeni lähedal. Sellisel juhul tekib küsimus, kuidas regulaatorid saavad aktiveerida ruumiliselt kaugel asuvaid geene. Kuumašoki korral võimendub groESL operoni geenidelt valkude ekspressioon, kuna rakul on vaja tagada valkude õige pakkimine. Leiti, et kõrge ekspressiooniga geenide korral võib mRNA difundeeruda rakus geenist kaugemale ning vajalikke valke ekspresseeritakse geenist kaugemal. Siinjuures on hea märkida, et regulaatorgeenide transkriptsiooni tase ja reguleeritavate geenide hulk on omavahel lineaarses seoses. Mida rohkem on geene, mida regulaator reguleerib, seda rohkem ekspresseeritakse regulaatorit. Seega regulaatorite puhul, mis reguleerivad väga väheseid geene, on oluline struktuurgeeni ja regulaatorgeeni lähestikku paiknemine . See võib olla saavutatud kas geenide kõrvuti asumisega või siis geenide asumisel kromosoomi piirkonnas, mis nukleoidi pakkimisel satuvad lähestikku.

9.2. DNA superspiralisatsioon – globaalse regulatsiooni 2. aste

Tsirkulaarsed DNA-d superspiraliseeritakse. Superspiralisatsiooni saab kõige paremini ette kujutada, kui lõnga üks ots siduda ukse lingi külge ning teisest otsast hakata lõnga kiududest lahti tõmbama. Ukselingi ja lõnga hargnemiskoha vahel hakkab lõng keerduma pusaks. Umbes sellisena võib DNA superspiralisatsiooni ka ette kujutada. DNA superspiralisatsiooni tekitavad ja vähendavad DNA topoisomeraasid. Bakteri DNA on tavaliselt negatiivse superspiralisatsiooniga ning elutegevuse käigus muutub negatiivne superspiralisatsioon suuremaks või väiksemaks. Kui bakteri kromosoom kaotab negatiivse superspiralisatsiooni (tavaline tsirkulaarne vorm), siis bakter ei suuda initsieerida replikatsiooni ega transkriptsiooni. Positiivset superspiralisatsiooni esineb bakteritel harva, kas lokaalselt inaktiveeritud DNA-na või siis spooride DNA-na, kus DNA on samuti inaktiivne. Kromosoomi lingud on ankurdatud nukleoidi moodustavate valkudega. See on oluline selleks, et kui ühes lingus kaob superspiralisatsioon ning see ling muutub transkriptsiooniliselt inaktiivseks, siis superspiralisatsiooni kadu ei kanduks üle kõrvallingu. Plasmiidid on ka bakterites superspiraliseeritud, kuid erinevalt kromosoomidest piisab üheahelalise katke tegemisest, et plasmiidide superspiralisatsioon kaoks.
DNA topoloogiat kujundavad topoisomeraasid, mis jaotatakse kahte klassi. Topoisomeraaside esimesse klassi kuuluvad valgud, mis teevad DNAsse üheahelalise katke ning võimaldavad katkestatud ahelal keerelda ümber katketa ahela. Sellega muudavad nad DNA linking number’it 1 võrra. Sellest klassist on kõige olulisem topoisomeraas Topo I (TopA), mille ekspressioon E. coli’s võimendub statsionaarses faasis, siis kui bakterite kasvukiirus hakkab vähenema. Topo I vähendab DNA negatiivset superspiralisatsiooni.
Topoisomeraasid klassist II teevad DNAsse kaheahelalisi katkeid ning muudavada DNA linking number’it 2 võrra ning on ATP-st sõltuvad. Klassi topoisomeraas II kuulub güraas, mis on E. coli’s üks olulisemaid DNA negatiivse superspiralisatsiooni tekitajaid. Güraas tunnetab bakteri füsioloogilist seisundit ATP/ADP suhte järgi. Kui bakter on toitaineterikkas keskkonnas ning suudab toitaineid lagundada, siis ATP hulk rakus suureneb ja güraas aktiveerub. Güraas suurendab DNA negatiivset superspiralisatsiooni ning soodustab replikatsiooni ning kiire kasvu faasi geenide ekspressiooni. Bakterite kasvu aeglustumisel väheneb ATP hulk ning güraas pole enam nii aktiivne. Topo I, mis pole ATPst sõltuv vähendab negatiivset superspiralisatsiooni. Seega geenide ekspressioon sõltub bakteri metaboolsest aktiivsusest.
Superspiraliseeritud DNA on pingestatud. Negatiivselt superspiraliseeritud DNA-s on sisuliselt keeratud DNA heeliksile vastupidises suunas vinte peale. Mis tähendab DNA heeliksi lõtvumist, kuna DNA püüab ennast stabiliseerida ning saavutada heeliksis sama samm (vabalt moodustunud DNA heeliksis on 10,4 nukleotiidi ühe pöörde kohta, sammuga 34 Å), siis DNA superspiraliseerub ehk moodustab kaheahelalisi spiraale ümber DNA heeliksi. Superspiralisatsioon tekib DNA kaksikahela keerdumisel ümber iseenda, kui sedasi spiraliseerunud DNA lahti keerata, siis DNA kaksikahel sulab kergesti lahti. Seega valkude seondumisel DNA-le on soodustatud DNA ahelate lahtisulamine, kuna DNA on juba pinges. Positiivse superspiralisatsiooni korral on DNA-le keeratud heeliksiga samas suunas vinte peale ning DNA ahelad ei sula lahti.
Transkriptsiooni initsieerimiseks (samuti ka replikatsiooni) on vajalik DNA ahelate lahti sulamine ning RNAP üleminek avatud kompleksi. DNA lahtisulamisega saab sama moodi reguleerida transkriptsiooni efektiivsust . RNAP seondumisel promootorile muudab RNAP lokaalset DNA topoloogiat nii, et avab ühe superspiraali ning pingestab DNA, mis soodustab ahelate lahtihargnemist ehk avatud kompleksi teket! Seega, mida negatiivsemalt on DNA superspiraliseeritud, seda lihtsamini toimub DNA ahelate lahtisulamine, mis transkriptsiooni mõttes tähendab avatud kompleksi moodustumist. RNAP seondumisel DNA-le superspiralisatsiooni tõttu mähkub DNA RNAP ümber.
Välja on pakutud kaks hüpoteesi, kuidas DNA negatiivne superspiralisatsioon soodustab transkriptsiooni:
1. Promootorite topoloogia. RNAP vajab promootori äratundmiseks -35 ja -10 elemendi täpset positsioneerimist. Kui elementide vahel on liiga palju nukleotiide või liiga vähe, siis promootori elemendid pöörduvad DNA-l sigma faktorist mööda ning transkriptsiooni initseerimine on vähendatud. Negatiivse superspiralisatsiooni korral, kui DNA on lõdvem, on sigma faktoriga kohakuti need promootorid, mille elementide vaheala on lühem kui optimaalne (17 nukleotiidid). Selliste promootorite korral kaob DNA superspiralisatsioonist sõltuvus, kui vahealasse inserteerida nukleotiid juurde (nt tRNA tyrT promootor).
2. Avatud kompleksi moodustumine. Sellisel juhul sõltub -10 elemendi nukleotiidsest koostisest, kas avatud kompleks tekib kergemini või halvemini. -10 element on oma olemuselt AT-rikas DNA piirkond, mis sulab kergemini lahti kui GC-rikas piirkond. Kui -10 element pole optimaalse järjestusega, vaid on toimunud asendusmutatsioonid G või C-ga, siis avatud kompleksi moodustumine on raskendatud ning sellised promootorid on DNA superspiralisatsioonist sõltuvad.
DNA superspiralisatsiooni kaudu transkriptsiooni reguleerimiseks on veel promootori lähedal olevad järjestused, mis mõjutavad transkriptsiooni. SigmaD tüüpi promootoril on oluline -35 elemendist ülespoole jääv DNA järjestus, mis iseenesest võib soodustada transkriptsiooni (RNAP-le seondudes) või aktivatsioon võib olla vahendatud sellele DNA alale seonduvate regulaatorvalkudega.
Eristatakse globaalset DNA superspiralisatsiooni ning lokaalset DNA superspiralisatsiooni. Globaalne on DNA-l tervikuna ning on teada, et DNA globaalne superspiralisatsioon sõltub bakteri kasvufaasist. Kiiresti kasvavates bakterites ehk eksponentsiaalses kasvufaasis on DNA rohkem negatiivselt superspiraliseeritud ning aeglaselt kasvavates ehk statsionaarses kasvufaasis on DNA vähem negatiivselt superspiraliseeritud. (NB! elusates bakterites pole DNA globaalne superspiralisatsioon kunagi positiivses superspiralisatsioonis, välja arvatud sporuleerunud bakterite DNA). DNA lokaalne superspiralisatsioon sõltub DNA lingu superpiralisatsioonist ning histoonilaadsetest valkudest, mis DNA-ga on seondunud.
Histoonilaadsed valgud muudavad DNA lokaalset superspiralisatsiooni. Need valgud saab jagada kahte rühma. Transkriptsiooni soodustav valk on Fis. Fis võib aktiveerida transkriptsiooni RNAP -subühiku või -faktoriga otseselt seondudes või seondudes RNAP eemale ning reguleerida DNA superspiralisatsiooni distantsilt. Fis seondub DNA-le ning väänab negatiivse superspiraali lahti ning pingestab sama moodi DNA-d nagu avatud kompleksi moodustumisel. Seevastu HU ja H-NS tekitavad negatiivseid superspiraale ning sellega blokeerivad transkriptsiooni. HU ja H-NS toime on erinev. HU seondumine DNA-ga on lühiajaline, DNA supersipralisatsiooni hoidmine lühiajaline, seega DNA transkribeerimine sõltub HU hulgast. H-NS-i seondumine DNA-ga on stabiilsem ning transkriptsiooni represseerimine ulatuslikum .
Histoonilaadsed valgud mõjutavad DNA lokaalset superspiralisatsiooni kasvufaasist sõltuvalt, kuna valkude ekspressioon sõltub bakterite kasvukiirusest. Sellest johtuvalt sõltub geenide globaalne transkribeeritavus kasvufaasist. Kasvufaasist sõltuva transkriptsiooni taga ongi sisuliselt transkriptsiooni sõltuvus DNA superpiralisatsioonist.
Histoonilaadsed valgud mõjutavad DNA globaalset superspiralisatsiooni, kuna lisaks DNA topoloogia muutmisele osalevad histoonilaadsed valgud ka transkriptsiooni reguleerimisel otse. Kui bakterid satuvad ootamatult toitaineterikkasse söötmesse, siis esimesena suureneb rakkudes ATP/ADP suhe. See toimub tänu metaboolsete ensüümide allosteerilisele regulatsioonile, mille tulemusena hakatakse kohe lagundama energiallikaid. ATP kontsentratsioon rakus suureneb.
Järgmise etapina aktiveerub güraas, mis on ATP-st sõltuv topoisomeraas. DNA negatiivne superspiraliseeritus suureneb, mille tulemusena hakatakse transkribeerima geene, mille promootorid on reguleeritavad DNA superspiralisatsiooni abil. Kõige olulisemad on globaalsed transkriptsiooni regulaatorid, mis reguleerivad väga paljude geenide transkriptsiooni. Nendest on E. coli’s kõige olulisemad Crp ja Fis. Näiteks Fis reguleerib otseselt või kaudselt E. coli’s 5% geenide transkriptsiooni. Mõlema valgu enda geeni transkriptsioon sõltub negatiivsest superspiralisatsioonist positiivselt. Samas, Crp ja Fis represseerivad fis-i transkriptsiooni. Mõlemad valgud reguleerivad DNA topoisomeraaside ekspressiooni. Fis valmistab ette DNA globaalse superspiralisatsiooni vähenemist, Crp takistab seda. Fis represseerib güraasi geenide gyrA ja gyrB transkriptsiooni, samas Crp aktiveerib gyrA transkriptsiooni, samas Fis aktiveerib topoisomeraas I geeni topA transkriptsiooni. Lisaks reguleerivad Crp ja Fis histoonilaadsete valkude geenide transkriptsiooni. Näiteks, Fis aktiveerib IHF, H-NS ja HU geenide transkriptsiooni, mis on olulised just statsionaarses faasis nukleoidi moodustumiseks ning HU ja H-NS vähendavad ka lokaalset negatiivset superspiralisatsiooni.

9.3. Alarmoonid – globaalse regulatsiooni 3. aste

Alarmoonideks nimetatakse efektormolekule, mis signaliseerivad kasvukiiruse langemist. Tavaliselt on regulatsioon globaalne, mis tuleneb globaalse regulaatori allosteerilisest või mõnel muul moel mõjutamisest. Sageli nimetatakse alarmoonidega globaalset regulatsiooni kasvufaasist sõltuvaks regulatsiooniks.
On täheldatud, et kasvukiiruse aeglustumisel koguneb rakkudesse ppGpp (modifitseeritud GTP, guanosiintetrafosfaat) molekule, mis signaliseerib rakule energia ja C-allika puudust. Sellele järgneb ulatuslik geeniekspressiooni muutus. Rakud lülituvad ümber vähemenergiarikaste energiallikate ja sekundaarsete C-allikate kasutamisele, mis enamjaolt nõaub keerulisemaid ja mitmeastmelisi metabolismiradu. Alarmooni ülesandeks on bakter ette valmistada kasvuks, kui DNA globaalne negatiivne superspiralisatsioon on väike.
ppGpp ja GTP
Alarmooni (p)ppGpp kontsentratsioon rakus muutub. Eksponentsiaalse faasi alguses alarmooni kontsentratsioon tõuseb natuke ning jääb sellele kontsentratsioonile stabiilselt kuni kasvukiiruse aeglustumiseni. Ses faasis suureneb alarmooni kontsentratsioon järsult väga kõrgele ning langeb peagi madalale kontsentratsioonile tagasi. Alarmooni sünteesib ribosoomiseoseline valk RelA, mis aktiveerub siis kui ribosoomi A-taskusse siseneb aminohappeta tRNA, mis on otseseks signaaliks, et rakus ei jätku aminohappeid valkude sünteesiks. RelA sünteesib pppGpp (guanosiinpentafosfaati), mille katalüüsib ppGpp-ks guanosiinpentafosfaadi fosfohüdrolaas GppA. Selle geeni transkriptsioon on tugevalt represseeritud kui DNA globaalne negatiivne superspiralisatsioon väheneb. Seega, kui rakud sisenevad statsionaarsesse kasvufaasi, siis ppGpp süntees väheneb. Kui valkude süntees on stabiliseerunud (piisavalt aminohappeid ribosoomide kohta), siis SpoT lagundab (p)ppGpp.
Alarmoonist sõltuvatel promootoritel on iseloomulik diskriminaatorjärjestus, mis on -10 elemendi ja transkriptsiooni alguspunkti vahel olev GC-rikas järjestus. Diskriminaatori abil pärsitakse avatud kompleksi avanemist ning transkriptsiooni initsiatsiooni, sest GC-rikas ala takistab ahelate lahtisulamist, mis päädib RNAP dissotseerumisega DNA-lt. Ühe hüpoteesi kohaselt ppGpp seondub diskriminaatorjärjestuses olevate C-nukleotiididega ning takistab sedasi promootori vabastamist.
Promootorid, mida ppGpp pärsib, on diskriminaatorjärjestusega promootorid, mis on aktiveeritavad negatiivse superspiralisatsiooniga. Tavaliselt on selliste promootorite vaheala lühem N=16. Seevastu promootorid, millel on diskriminaatorpiirkonnas AT-rikas järjestus või on pikema vahealaga N=18 pole ppGpp-ga represseeritavad. Pikema vahealaga promootorid on negatiivse superspiralisatsiooni vähenemisel pigem aktiveeritud, tänu -10 ja -35 elementide nihkumisele õigesse positsiooni statsionaarses kasvufaasis.
Teise hüpoteesi kohaselt RNAP on statsionaarses kasvufaasis ebastabiilsem tänu sellele, et RNAP-ga on seondunud transkriptsiooni regulaatorvalk DksA, mis seondub polümeraasiga ning takistab avatud kompleksi moodustumist. Alarmoon võimendab DksA destabiliseerivat toimet.
10 Kahekomponentsed transkriptsiooni regulatsioonisüsteemid
Bakterites on tugevalt konserveerunud kahekomponentsed signaalsüsteemid, mis tunnetavad süsteemile spetsiifilist keskkonnasignaali, kannavad selle edasi tsütoplasmasse ning reguleerivad signaalile vastuseks vajalike geenide avaldumist. 2011. aastal oli teada 64 960 kahekomponentset süsteemi 1125 täielikult sekveneeritud genoomiga bakterite hulgas. Kusjuures keskmiselt on eubakteritel umbes 50 – 60 kahekomponentset süsteemi.
Klassikaline kahekomponentne signaalisüsteem koosneb kahe geeni kodeeritud valgust, üks on tavaliselt membraaniseoseline ning võtab keskkonnast signaali vastu, teine on tsütoplasmaatiline ning reguleerib vajalike geenide transkriptsiooni. Signaali vastuvõtvat valku nimetatakse sensoriks ja geenide transkriptsiooni reguleerivat valku signaali vastuvõtvaks regulaatoriks. Siiski väga paljud kahekomponentsed süsteemid koosnevad kolmest või enamast valgust, mis modifitseerivad signaali ülekannet või vastuvõttu.
Sensori N-terminuses on tavaliselt signaali vastuvõttev domeen ning C-terminuses signaali ülekande domeen või domeenid . C-terminuses on autokinaasne domeen, mis fosforüleerib sensorvalgu, kui see on seondunud ligandiga või muutnud konformatsiooni mõne füüsikalise teguri toimel. Fosforüleerimiseks kastutatakse fosfaatrühma, mis saadakse ATP-lt (kinaas!) ning fosforüleeritakse tugevalt konserveerunud histidiini jääki. Mille tõttu nimetatakse vahel sensoreid ka seonsor-kinaasideks või histidiinikinaasideks. Sensori C-terminuses olev kinaasne domeen koosneb kahest osast, mis vastutavad histidiini kineerimise eest: HisKa-domeen, mis sisaldab konserveerunud histidiini, ning HATPase-domeen, mis vastutab ATP seondumise, hüdrolüüsi ning HisKa domeenis histidiini fosforüleerimise eest. Hübriidsetel sensoritel võib olla HisKa-domeenile lisaks Hpt-domeen (inglise keeles phosphotransfer), mida fosforüleeritakse. Sensor kannab signaali üle regulaatorvalgu vastuvõtvale domeenile, fosforüleerides regulaatorvalgu asparagiinhappe jäägi.
Kahekomponentsed regulatsioonisüsteemid ei pea sugugi koosnema ainult kahest komponendist ning võivad koosneda fosforüleerimise signaalirajast, kus fosfaatjääk kantakse üle mitmele valgule, mis lõpuks jõuab vastust kujundava regulaatorvalguni. Sellisel juhul kasutatakse pigem mõistet fosforelee, millel fosfaatrühm liigub HisKa-lt vastuvõtjale, sellelt Hpt-domeeni kandvale valgule ja sellelt regulaatorvalgule. Fosfaatrühm liigub aminohapetejääkidelt His -> Asp -> His -> Asp. Näiteks Bacillus subtilis’e sporuleerumise histidiinkinaas (Kin) kannab fosfaatjäägi Spo0F -le, sealt liigub fosfaatrühm Spo0B-le ja viimaks jõuab transkriptsiooni regulaatorile Spo0A-le. Mitte ainult Kin ja Spo0B ei fosforüleeri signaaliraja valke Spo0F ja Spo0A, vaid need on fosforüleeritavad ka mitme fosfotransferaasiga, mis annab keeruka regulatsioonivõrgustiku ning bakterile muudetava signaalraja.
Kahekomponendilistel regulatsiooniradadel on üldiselt signaali ülekandumiseks partnerid konserveerunud. See tähendab, et enamikel juhtudel on sensoril kindel regulaator, mida ta fosforüleerib, kuigi on kirjeldatud ka ristfosforüleerimist (üks sensor fosforüleerib mitut regulaatorit). E. coli’l on kirjeldatud 62 kahekomponendilist regulatsioonirada, Bacillus subtilis’el 70. Varem arvati, et nii paljude signaaliradade ning fosforüleerimiseks konserveerunud aminohapete olemasolul võiks signaalirajad olla suhteliselt kergesti ristreguleeritavad. Seda kinnitasid ka in vitro eksperimendid , kus leiti, et sensor võib fosforüleerida pea igat regulaatorit. In vivo see nii pole ning on teada ainult mõni regulatsioonirada, kus signaal antakse edasi mitmele regulaatorile. Näiteks E. coli kemotaksise sensor CheA fosforüleerib nii CheY-t kui ka CheB -d. Bacillus subtilise Spo0F võib saada fosfaatjäägi mitmelt sensorilt KinA-lt ja KinB-lt. Lisaks, kahekomponentsete signaalradade komponentidest on varieeruvam regulaatorvalk. Kuigi signaalsüsteemis on enamjaolt konserveerunud sensor-regulaator paarid, pole geenid alati koos samas operonis. Umbes 40% kahekomponentsete süsteemide geenidest on genoomis üksikuna ning 5 – 7% geenidest on leitud operonidest, mis koosnevad rohkematest geenidest kui kahekomponentsete süsteemide geenid.
10.1 Kahekomponentsete signaalradade funktsioon
Kahekomponentsed signaalirajad on seotud bakterite vastuse reguleerimisega keskkonnatingimuste muutumisele, sellest johtuvalt on need regulatsioonirajad bakteri jaoks olulised keskkonna tunnetamiseks ning adekvaatseks reageerimiseks muutustele.
Kuna kahekomponentseid regulatsioonisüsteeme on bakteritel väga palju, siis võib kirjandusest leida väga lihtsalt kahekomponentseid süsteeme pea iga signaali jaoks. Enamik kahekomponentsetest süsteemidest reguleerivad bakteri kohanemist keskkonnategurite muutustele. Vastused võivad olla spetsiifilised ühele faktorile, mis muutub. Näiteks Pho kahekomponentne süsteem reguleerib bakteri füsioloogilist vastust fosfori kättesaadavusele, CusSR indutseerib vaseresistentsusgeenide ekspressiooni. Samas on leitud mitmeid süsteeme, mis reageerivad mitmele stiimulile ja reguleerivad mitut füsioloogilist vastust. Näiteks BaeSR reageerib rakuümbrise stressile ning raskemetallidele (Cu ja Zn), mis annab metalliresistentse fenotüübi ja üldise rakuümbrise stressivastuse. E. coli kemotaktilised kahekomponentsed süsteemid reguleerivad bakteri liikumissuunda vastavalt kemoatraktantide/kemorepellentide olemasolule, saades signaali sensorvalkudelt, mis on tuntud kui metüül-vastuvõtvad kemotaksise valgud (MCP). Bakteri fenotüübi kujunemisest võib osa võtta mitu eraldi toimivat kahekomponentset regulatsioonirada. Näiteks E. coli membraani omaduste muutmisest võtavad osa EncZ/OmpR, CpxAR ja RcsCDB kahekomponentsed süsteemid.
Kahekomponentsed regulatsioonirajad on seotud bakterite patogeneesiga. Näiteks Burkholderia pseudomallei IrlRS reguleerib bakteri tungimist eukarüoodi rakku. Mycobacterium tuberculosis’e eukarüoodis paljunemise varajane faas on seotud PrrAB süsteemiga. Yersinia pestis’e eluvõime inimese neutrofiilides on seotud PhoPQ kahekomponentse süsteemiga. Pseudomonas aeruginosa virulentsus on seotud mitme kahekomponentse süsteemiga: PhoPQ, GacAS signaaliradadega, mille signaali mõjutavad RetS , LadS ja AlgR. Kahekomponentseid süsteeme on kasutatud meditsiinis ravimite väljatöötamiseks, sest kahekomponentsed süsteemid on signaalispetsiifilised ning ravim ei pea tungima rakku.
10.2 Kahekomponentsete regulatsiooniradade seos genoomi suurusega Kahekomponentsete regulatsiooniradade arv bakteri genoomis sõltub genoomi suurusest, mis omakorda sõltub keskkonnast, kus bakter elab. Üldiselt võib välja tuua järgmise seose: iga järgmise 1 Mb genoomi kohta tuleb 22 regulatsioonirada. Mida keerulisemates keskkonnatingimustes bakter elab, mis sisuliselt tähendab keskkonnatingimuste kiiret muutumist, seda rohkem bakteril signaaliradu on.
Esimene bakter, mille genoom sekveneeriti, oli 1995. aastal Haemophilus influenzae. Bakteri genoom on 1,8 Mb pikkune ning bakteril on 9 kahekomponentset regulatsioonirada. Siiski, Haemophilus on pigem erandlik bakter ning enamikel juhtudel on bakterite genoomis rohkem kahekomponentsete süsteemide geene. Eubakteritel on genoomis tavaliselt 50 – 60 kahekomponentset süsteemi, arhedel umbes 15 ning eukarüooridel alla 5. Eukarüootide puhul on kahekomponentsete süsteemide arv genoomi kohta väga varieeruv ning enamikul eukarüootidel pole ühtegi kahekomponentset süsteemi (v-a taimed ja seened). Kõige rohkem on kahekomponentseid süsteeme delta -proteobakteritel, G(+) bakteritel (Firmicute) ja tsüaanobakteritel on neid üle 250 süsteemi genoomi kohta.
Kahekomponentsete regulatsiooniradade loendamisel ja otsimisel on tehtud palju valejäreldusi ning süsteemide hulka on kunagi arvatud palju valke, millel on süsteemidele sarnased domeenid, kuid mis tegelikult ei ole kahekomponentsete süsteemide osad, nagu näiteks DNA topoisomeraasid. Mõnikord võivad segadust tekitada hübriidkinaasid, mis koosnevad nii sensorist kui ka vastuseregulaatorist. Umbes 23% kõigist kahekomponentsetest süsteemidest on tegelikult hübriidkinaasid. Jääb ebaselgeks, miks signaali ülekandumine toimub kord hübriidkinaasi, kord fosforelee abil. Fosforelee korral on fosfori ülekandumises osalevad domeenid eraldi valkudena (geenidena).
Kahekomponentsed süsteemid on jaotatud nelja perekonda: Che, Ntr, Pho ja Nar perekonda. Rühmitamise aluseks on võetud signaali vastuvõtva domeeni, ülekande domeeni ning regulaatori domeeni sarnasus, HK-domeeni ja regulaatori domeeni olemus. Organismiti varieeruvad kahekomponentsete süsteemide perekonnad, näiteks Streptomyces coelicolor’il on peamiselt Nar ja Pho perekondade kahekomponentsed süsteemid ning mitte ühtegi Ntr perekonna süsteemi. Myxococcus xanthus’el on mõni Nar perekonna kahekomponentne süsteem ja palju Ntr perekonna süsteeme. Lisaks on leitud, et teatud kahekomponentsed süsteemid on üle võtnud teisest perekonnast partneri, esindades nii hübriidseid perekondi. Sellest johtuvalt arvatakse, et kahekomponentsed süsteemid ei ole alati lineaarse põlvnemisega vaid osa on päritud horisontaalse geenide ülekandega. Kui bakterid saavad sarnaseid kahekomponentseid geene horisontaalse geeni ülekandega, siis võib geenide vahel toimuda rekombinatsioon . Rekombineerumise tulemusena on tekkinud hübriidkinaasid.
10.3 Kahekomponentsete süsteemide struktuur ja funktsioneerimine Kahekomponentse süsteemi sensori ja vastuseregulaatori ehitus. Paljud sensored, mis on kahekomponentse süsteemi osad, on dimeersed ning selle tõttu moodustuvad sensori tsütoplasmaatilises osas olevad domeenid dimeersetena. Näiteks EnvZ keskel on HisKa domeen, mille kahte histidiini jääki võivad kineerida HATPaasi domeenid, mis seovad ATP-d ja kannavad ATP-lt fosfaadi jäägi üle HisKa domeenis olevale histidiini jäägile. HATPaasi domeen seob veel Mg2+-iooni, mis on vajalik kineerimise läbiviimiseks. HisKa domeen moodustub neljast ⍺-heeliksist, kaks heeliksit mõlemalt sensori monomeerilt. HisKa domeenis olevad histidiini jäägid on eksponeeritud väljapoole, mille tõttu on neid kerge atakeerida nii HATPaasi domeenidel kui ka regulaatori vastuvõtval domeenil.
Hpt-domeen E. coli CheA-l on monomeerne ning tal on ainult 1 histidiini jääk, mida kineerida. Siiski, CheA Hpt-domeen koosneb 4 ⍺-heeliksist, sarnaselt EnvZ HisKa domeenile.
Vastust kujundava regulaatorvalgu signaali vastuvõtudomeen koosneb tavaliselt vaheldumisi asuvast viiest β-lehest ja viiest ⍺-heeliksist. Regulaatori signaali vastuvõttev domeen sisaldab tavaliselt 3 tugevalt konserveerunud Asp-jääki, millest keskmine on vajalik fosforüleerimiseks. Aspartaadi jäägid moodustavad happelise tasku , mis seob Mg2+-iooni, mis on vajalik fosforüleerimise koordineerimiseks.
Signaali vastuvõtmine ja edasikandmine. Sensori signaali vastuvõttev domeen võib asuda nii tsütoplasmas, membraanis või membraanist väljaspool ehk ekstratsütosoolselt. Need sensorid, mis võtavad signaale vastu keskkonnast on ehituslikult väga erinevate sensordomeenidega. Siiski võib neil eristada 3 peamist tüüpi sensordomeene: segastruktuuriga domeenid, mis koosnevad nii ⍺-heelisksitest kui ka β-lehtedest, ainult ⍺-heeliksitest koosnevad domeenid ja ainult β-lehtedest koosnevad domeenid. Segadomeenidega sensordomeenid on kõige levinumad ning nad koosnevad 5 β-lehest ja 2 ⍺-heelisksist, näiteks PAS-domeen. Sensordomeen võib koosneda ka ainult ⍺-heeliksitest, näiteks TorS ja NarX, mis tunnetavad nitraadi kontsentratsiooni. Kuid näiteks RetS-i sensordomeen koosneb ainult β-lehtedest.
Segatüüpi domeen PAS-domeen tunnetab raku redokspotentsiaali, valgust, hapniku hulka ning raku üleüldist energeetilist taset. PAS-domeen asub ebaharilikult raku tsütoplasmas. PAS-domeen kontrollib raku redoksseisundit, mis kaudselt väljendab raku energia tootmise võimet läbi oksüdatiivse fosforüülimise. Samuti tunnetab bakter PAS-domeeni abil keskkonnafaktoreid, mis tungivad läbi tsütoplasmamembraani rakku ning on võimelised muutma raku metabolismi. Nii hapniku kontsentratsiooni kui ka redoksseisundi monitoorimine ja valguse tunnetamine annab bakterile mõista, millised on võimalused energia tootmiseks. Paljud mikroorganismid on kohanenud elama kindlal hapniku kontsentratsioonil ning vajavad selle tõttu hapniku kontsentratsiooni mõõtmist. Valguse tunnetamine annab bakterile aimu fototropismi võimalikkusest. PAS-domeeni abil on bakter võimeline tunnetama lähenevat energiakriisi, sest enne ATP hulga langust väheneb PMF. Seda tunnetab bakter redokspotentsiaali muutumisena. PAS-domeeniga valke on olemas kõigi kolme domeeni organismide hulgas: eukarüootidel, eubakteritel ja arhedel.
PAS-domeen on peamiselt levinud valkudel, mis on seotud signaali edasiandmisega: kahekomponentsete süsteemide sensorid, signaali edasikandjad ning transkriptsioonifaktorid. Kuid eubakteritel ja arhedel on PAS-domeen peaaegu alati kahekomponentsetel signaalsüsteemi sensoritel. Näiteks ArcB tunnetab raku redoksseisundit, Aer tunnetab kaudselt hapniku kontsentratsiooni redokspotentsiaali muutuse kaudu, mis sõltub hapniku olemasolust, PYP tunnetab sinist valgust, FixL tunnetab otseselt heemi abil hapniku olemasolu. FixL-i PAS-domeenis hapniku seondumine põhjustab konformatsioonilisi muutusi, mis ei lase HATPaassel domeenil histidiini kineerida. Hapniku puudumisel FixL autofosforüleerub ning annab signaali edasi FixJ-le, vastuseregulaatorile. Aer tunnetab muutusi elektronide transportsüsteemi (hingamisahela) redokspotentsiaalis ja inhibeerib HCD domeeni, mis on Aer-i C-terminuses. HCD-domeen seondub CheW ja CheA valkudega ning reguleerib CheA autofosforüleerumist. CheA fosforüleerib CheY, mis on ebatüüpiline vastuseregulaator kuna see ei reguleeri geenide transkriptsiooni vaid seondub flagella FliM valguga ning põhjustab viburi päripäeva pöörlemist, st reguleerib bakteri liikumise suunda.
HAMP-domeenid on kahekomponentsete süsteemide sensoritel laialt levinud. HAMP-domeen asub tsütoplasmas kohe transmembraanse domeeni järel ning ühendab sensori autokinaasset osa membraanse osaga. HAMP-domeenid on olulised nii signaali edasikandmisel kui ka vastuvõtmisel, sest selle osaga sensor dimeriseerub. HAMP-domeen kujutab endast kahte ⍺-heeliksit, mis sensori subühikute dimeriseerumisel moodustab neljase ⍺-heeliksite puntra nii, et puntra sisemusse jäävad heeliksite hüdrofoobsed aminohapped.
Enamikel juhtudel pole aru saadud, kuidas signaali vastuvõtmisega keskkonnast annab sensor signaali edasi tsütoplasmaatilisele HATPaassele domeenile. Siiski, kahekomponentsete süsteemide paljud sensorid on dimeerid ning nende transmembraansed osad hoitakse üksteisest eemal tsütoplas-maatilise lingu abil. Kui EnvZ seondub ligandiga, siis monomeeride transmembraansed osad dimeriseeruvad ning moodustavad nelja transmembraanse domeeni puntra ning libisevad kolvina üles-alla. Teine võimalus on, et signaali vastuvõtmine põhjustab monomeeride pöörlemise ümber oma telje, mis annab konformatsioonilise muutuse edasi HATPaassele domeenile. Üldiselt sensori vastuvõtvad sensordomeenid on nõrgalt dimeriseerunud, kuid HAMP-domeen ja histidiinkinaassed osad dimeriseeruvad. Sellest johtuvalt võib sensor moodustada heterodimeere mõne teise spetsiifilise transmembraanse sensori monomeeriga, mis on signaali vastuvõtmisel ja edasikandmisel regulatoorse tähtsusega. Näiteks Pseudomonas aeruginosa kahekomponentse süsteemi sensor GacS on homodimeerina aktiivne ning autofosforüleerub kroonilise infektsiooni korral. Akuutse infektsiooni korral moodustab GacS heterodimeeri RetS-ga, mis pärsib signaali edasikandumist vastuseregulaatorile GacA.
Sensor inhibeerib HATPaasset domeeni, kui pole ligandiga seondunud. Kui HATPaasne domeen ekspresseerida eraldi, siis on ta kogu aeg aktiivne. Tavaliselt on tsütoplasmaatiline domeen dimeerina ning autofosforüleerimine toimub in trans, mis tähendab ühe subühiku ATP-d siduv HATPaasne domeen kineerib teise monomeeri HisKa domeenis histidiini jäägi. Siiski on teada ka in cis kineerimist. Tavaliselt kasutatakse fosforüleerimiseks ATP-d, kuid mõni sensor võib kasutada fosforüülimiseks GTP-d.
Sensori fosforüülitud histidiini jäägilt kantakse fosfaatjääk üle vastuse regulaatori aspartaadi jäägile. Reaktsioon võib olla ka vastupidine, regulaator fosforüleerib sensori histidiini jäägi HisKa domeenis või Hpt-domeenis. Siiani pole aru saadud, kuidas toimub täpne transfosforüleerimine sensorilt õigele regulaatorile, sest sensori ja regulaatori omavaheline seondumine on nõrk ning rakus on tavaliselt palju sarnaseid regulaatorvalke, mida sensor võiks fosforüleerida. Kuigi on kirjeldatud histidiini-kinaase, mis võivad fosforüleerida mitut regulaatorit, nagu näiteks CheA fosforüleerib CheB-d ja CheY-t, siiski enamik histidiinkinaase fosforüleerib ainult kindlat partnerit. Ristfosforüleerimine on harv ning arvatakse, et seda juhtub ainult mürana, juhuslikult. Sama on ka vastuseregulaatori pöördreaktsiooni korral, enamik vastuseregulaatoreid on võimelised pöördfosforüleerima kindlat histidiinikinaasi.
Regulaatori vastuvõtva domeeni fosforüleerimine põhjustab ümbritsevate aminohapete liikumist, mis viib valgu konformatsioonilisele muutusele. Signaali vastuvõtval regulaatorvalgul on tavaliselt DNA-d siduv domeen, mille aktiivsus sõltub valgu fosforüleeritusest. Selle abil reguleeritakse geenide transkriptsiooni. Samas, mitte alati ei pea olema signaali vastuvõtval regulaatoril väljundiks DNAga seondumine. Regulaator võib olla ensümaatilise aktiivsusega, see võib olla metüültransferaas, diguanülaat tsüklaas (alarmooni süntaas), fosfataas , adenülaat tsüklaas. Regulaator ei pruugi olla ka ensümaatilise aktiivsusega, vaid valgu fosforüleerimisega reguleeritakse valk-valk interaktsioone, mis näib olevat just eriti oluline kemotaksise signaali ülekandmisel liikumiseks ning viburite asukoha muutmiseks. Näiteks CheY seondub fosforüleerimise järel flagella FliM valguga ning mõjutab liikumist. Samuti võib fosforüleerimine mõjutada transkriptsiooni regulaatori aktiviseerimisel. Näiteks mittefosforüleeritud NarL seondub DNA seondumisdomeeniga ning inaktiveerib sedasi regulaatori.
10.4 Signaali reguleerimine
Väga paljudel kahekomponentsete süsteemide sensoritel (hübriidsetel histidiinkinaasidel) on peale peamise HisKa domeeni veel vastuvõtmisdomeene, mida saab fosforüleerida. Kui peamisel HisKa domeenil on signaali edasi andev roll, siis lisadomeenidel on assisteeriv roll või on nad olulised signaali edasiandmisel kaskaadina fosforüleerimisel. Helicobacter pylori kemotaksise signaali edasi andev CheA võib fosforüleerida CheY1 ning sedasi mõjutada viburite liikumist või fosforüleerida enda (CheA) C-terminuses asuvat lisadomeeni, mida nimetatakse CheY2-ks. Samas, fosfaatjääk võib liikuda CheY1-lt CheA-le ja sealt CheY2-le. Seetõttu arvatakse, et CheA koosseisus olevat lisadomeeni kasutatakse CheY1 fosforüleerituse aja modifitseerimiseks.
Signaali ülekandeks on oluline sensorkinaasi ja vastusregulaatori fosforüleeritus ning fosfaatjäägi liikumine sensorilt regulaatorile. Seetõttu pole üllatav, et mitmesugused fosfataasid (ensüümid, mis eemaldavad substraadilt fosfaadi) reguleerivad sensori ja regulaatori fosforüleeritust ja sellega ka signaali ülekannet. Nii vastuseregulaatorid kui ka sensorkinaasid ise võivad sisaldada fosfataasi domeeni. Samas vastuseregulaator ise käitub kui sensorkinaasi spetsiifiline fosfataas ja samuti enamik sensorkinaase võivad olla vastuseregulaatori suhtes fosfataasi aktiivsusega ehk eemaldada fosfaatjääki regulaatorilt. Kahekomponentsete signaalsüsteemide puhul on olemas samuti süsteemivälised fosfataasid, mis nn võtavad signaali maha. Signaali on võimalik eemaldada nii sensorilt kui ka regulaatorilt. Fosfataaside aktiivsus ise võib olla reguleeritud valgu degradatsiooniga.
Sensori autofosforüleerimist võivad reguleerida signaali inhibiitorid. Signaali regulatoorsed valgud võivad olla membraaniseoselised ning moodustada sensoriga heterodimeere nagu inhibeerib GacS-i autofosforüleerimist RetS. Regulaatorid võivad olla ka tsütoplasmaatilised ning seonduda sensori HisKa domeeniga ning sedasi pärssida autofosforüleerimist. Näiteks Bacillus subtilis’e sporulatsiooni signaali sensorit KinA-d inhibeerivad Sda ja KipI. Kahekomponentsete süsteemide signaali edasikandumisest võivad osa võtta veel regulaatorid, mis võimendavad signaali levimist rakku. Sellised lisakomponendid võivad olla nii tsütoplasmaatilised, periplasmaatilised või transmembraansed.
10.5 GacS-GacA süsteem
Inimese patogeen Pseudomonas aeruginosa reguleerib umbes 8% geenide transkriptsiooni kahekomponentsete signaalsüsteemide abil. Selles bakteris on leitud umbes 70 kahekomponentset süsteemi, mis tunnetavad keskkonda, ning reguleerivad virulentsusgeenide, viburi liikumisgeenide ja tüüp III sekretsioonisüsteemi (vajalik mitmesuguste patogeneesifaktorite süstimiseks eukarüooti).
GacS-GacA süsteem on üks paremini kirjeldatud P. aeruginosa signaalisüsteemidest, mille abil bakter reguleerib nii akuutset kui ka kroonilist infektsiooni. Mõlemad funktsionaalsed valgud GacS ja GacA on vajalikud taimede, nematoodide, putukate ja imetajate nakatamiseks ning bakteri patogeneesiks. GacS-GacA süsteem on vajalik virulentsusgeenide aktiveerimiseks, kui ka kroonilise infektsiooni korral biofilmi ja N-atsüül-homoseriini (hulgatunnetuse signaalmolekul) geenide aktiveerimiseks ja liikumisgeenide transkriptsiooni pärssimiseks.
Vaatamata sellele, et GacS-GacA on põhjalikult uuritud kahekomponentne signaalsüsteem, pole pseudomoonastes teada, mis on signaaliks, mida GacS vastu võtab. Sugukonna Enterobacteriaceae liikidel on teada, et GacS paraloog BarA tunnetab orgaaniliste hapete nagu atsetaadi kogunemist keskkonda.
GacS on hübriidne sensorkinaas, mis kannab fosfaatjäägi GacA-le, mis on transkriptsiooni regulaator. GacS-i N-terminuses on kaks transmembraanset domeeni, millele järgneb tsütoplasmaatiline HAMP-domeen ning tüüpiline HisKa-HATPaasne domeen. Lisaks on GacS-l veel regulaatori vastuvõttev domeen REC (fosforüülitakse Asp) ning Hpt domeen. GacA-ga seondumiseks on GacS-l vaja vähemalt HisKa-HATPaasset domeeni ja REC domeeni ning Hpt-domeeni pole vaja sensori spetsiifiliseks seondumiseks GacA-ga. GacS fosforüleerib GacA ning fosforüleeritud GacA aktiveerib väikeste mittetransleeritavate RNAde ehk sRNA-de transkriptsiooni, mis on vajalikud translatsiooniregulaatori RsmA aktiivsuse reguleerimiseks. Regulatoorseid sRNAsid on P. aeruginosas kaks: RsmZ ja RsmX.
RsmA tunneb RNAdel ära ANGGA järjestuse ning seondub sellele. Kuna see nukleotiidne järjestus on sarnane ribosoomi seondumisjärjestusega mRNA-l, mis sisuliselt on A ja G-rikas järjestus (AGGAGG), siis RsmA seondub Shine - Dalgarno järjestusele ja takistab ribosoomi seondumist mRNAle, pärssides translatsiooni initsiatsiooni. RsmA võib ka soodustada mRNAde translatsiooni, sellisel juhul asub RsmA seondumisjärjestus Shine-Dalgarno järjestusest eemal, tihti on seotud aktiveeriv toime mRNA sekundaarstruktuuri avamisega, mille tulemusel Shine-Dalgarno järjestus muutub ribosoomile kättesaadavaks. Tavaliselt RsmA pärsib hulgatunnetuse signaalmolekulide sünteesi, millest tulenevalt inhibeeritakse ka patogeneesiks vajalike faktorite süntees, nagu püotsüaniid (phz), vesiniktsüaniid (hcnABC), elastaas (lasB), ja lektiin ( lecA ). RsmA reguleerib positiivselt lipaasi (lipAH) ja ramnolipiidide (rhlAB) sünteesi ja seeläbi liikumist.
GacS-GacA süsteem on seotud P. aeruginosa antibiootikumitundlikkusega. Kuigi täpne mehhanism on teadmata, on nähtud, et P. aeruginosa ΔgacS tüved on tundlikumad gentamütsiinile ning klooramfenikoolile. Samas tetratsükliini juuresolekul (kontsentratsioonil, mis on kasvu pärssivast doosist madalam), on gacS transkriptsioon alla reguleeritud ning RsmA kontsentratsioon rakus kuni 3 korda kõrgem. Samas teised antibiootikumid ning katioonsed peptiidid ei mõjuta bakterit kui rakus puudub GacS.
Signaali vastuvõtmise ja edasiandmise reguleerimine GacS-GacA signaalirajas. Kaks olulist membraaniseoselist valku on seotud GacS-i fosforüleerumisega ning regulaatori GacA fosforüleerimisega: RetS ja LadS. GacS moodustab mõlema valguga heterodimeere, RetS-ga moodustab ta heterodimeere sama efektiivselt kui iseendaga ning LadS-ga on interakteerumine nõrgem. RetS ja LadS omavahel ei dimeriseeru ega kontakteeru ka GacA-ga. RetS (inglise keeles regulator of exopolysaccharide and type III secretion) leiti kui P. aeruginosa biofilmi reguleeriv valk. Geeni retS deleteerimisel moodustasid bakterid väga tugeva biofilmi, millest järeldub, et RetS takistab biofilmi moodustumist (eksopolüsahhariidide ekspressiooni) ning soodustab nn akuutse infektsiooni fenotüüpi – tüüp III sekretsioonisüsteemi ja eksotoksiinide ekspressiooni. RetS on sarnaselt GacS-le hübriidne sensorkinaas, millel on tüüpiline sensori kinaas (HisKa + HATPaasne domeen) ning kaks järjestikulist vastuseregulaatori domeeni (sisaldavad Asp jääki).
RetS-i ekspresseeritakse sarnaselt GacS-le kogu aeg ning RetS on P. aeruginosa membraanis olemas kogu aeg. RetS moodustab homodimeere ning võtab keskkonnast vastu seniteadmata signaali. Signaali vastuvõtnud RetS monomeriseerub ning on võimeline seonduma GacS-i monomeeriga. RetS-GacS heterodimeeris RetS pärsib GacS-i autofosforüleerumist, sest GacS ei suuda heterodimeeris ennast autofosforüleerida ning signaali edasikandumine rakku katkestatakse.
LadS (inglise keeles lost adherence sensor) on samuti seotud GacS-GacA süsteemiga ning biofilmi moodustumisega. Sarnaselt RetS-le ja GacS-le on LadS hübriidkinaas. Sarnaneb ehituselt RetS-ga, kuid erinevalt RetS-st pole LadS-l teist fosfaatjääki vastuvõtvat domeeni. LadS aktiveerib eksopolüsahhariidide ekspressiooni ning seetõttu ka biofilmi moodustumise, soodustab nn kroonilise fenotüübi teket. LadS-i mehhanismi kohta on vähem teada, kuidas ta mõjutab GacS-i signaali ülekandmis GacA-le.

11. Bakterite programmeeritud surm

Rakkude programmeeritud surma on siiani peetud hulkraksete eukarüootidele omaseks protsessiks, mis aitab organismi kudedel diferentseeruda ning hoiab ära organismi hukkumise . Nüüd on leitud, et rakkude programmeeritud surm on iseloomulik ka ainuraksetele eukarüootidele ja isegi bakteritele. Bakterite programmeeritud surm võib toimuda kolmel moel:
1. toksiin-antitoksiin süsteemide abil esile kutsutud surm. Selle süsteemi abil võetakse signaal vastu keskkonnast või rakk-rakk kommunikatsioonist.
2. rakukesta lagundamisega seotud lüüs. Peptidoglükaani hüdrolaasid (mureiini hüdrolaasid) vahendavad lüütilist aktiivsust G(+) bakterites vastuseks keskkonnast tulnud signaalidele.
3. hingamisahela blokeerimine, mis toimub biofilmi moodustumise ajal, mille tulemusena vabaneb keskkonda eDNA (ekstratsellulaarne DNA), mikrokoloonia teke ja rakkude levimine biofilmist
Bakteritepopulatsioonis üksikute bakterite lüüsi tähtsuse üle on pead murtud palju. Tavaliselt on peetud seda oluliseks faagipartiklite vabastamiseks ning faagide levimiseks. Tavaliselt ei peeta bakterite lüüsi kasulikuks bakteritele endile, sest paljudel juhtudel on bakterite lüüs seotud nn isekate DNA-dega või faagidega, DNA-elementidega, mis pole bakteri enda päritolu, või kemikaalidega nagu antibiootikumid ja teised biotsiidsed ained.
Tekib küsimus, miks bakter peaks ise ennast lüüsima? Üksikorganismi seisukohalt on programmeeritud surm fataalne ning ei anna üksikule bakterile eeliseid kohanemiseks keskkonnaga. Programmeeritud rakusurma korral tuleb vaadelda bakteripopulatsiooni tervikuna, sest osa populatsiooni surmast võib saada bakteripopulatsioon tervikuna kasu. Üha rohkem tekib paralleele hulkraksete organismidega, kus osa populatsioonist sureb tervikorganismi nimel. Välja on toodus viis põhjust, miks rakud võiks ennast lüüsida:

Biofilmi moodustumiseks. Teatud liigid sisaldavad biofilmi maatriksis palju ekstratsellulaarset DNA-d ehk eDNA-d. Seda kasutavad bakterid biofilmi vajaliku struktuuri moodustumiseks, mis laseb veel ja toitainetel biofilmist läbi liikuda. Ekstratsellulaarne DNA võib olla mitme päritoluga, kuid enamasti on see populatsioonisisene – osa rakke lüüsub.

Faagide vastu kaitseks. Lüütiliste faagide korral tapavad bakterid ennast ise, et peatada faagipartiklite levik populatsioonis.

Toitainete vabastamiseks naabrile. Kui bakteri kasv on teatud põhjusel häiritud võib bakter lüüsuda ning naaberbakterid saavad kasutada lüüsunud bakterit toitaineteks. Sellisel moel üksik rakk ei ela stressi üle, kuid tema lüüsiga saavad populatsioonis ellu jäänud rakud lisaenergiat, mis aitab näguripäevi üle elada.

Petjate tapmiseks. Hulgatunnetuse korral võib populatsioonis olla kahte tüüpi baktereid: need kes toodavad ekstratsellulaarseid ensüüme lagundamaks peremeesorganismi, mille laguprodukte kasutab bakter toitaineteks. Teised bakterid saavad signaalidest aru, kuid ise ei kuluta energiat ekstratsellulaarsete ensüümid ekspressiooniks, vaid kasutavad ainult vabanenud toitaineid. Need bakterid on nn petjad. Bakterid, mis ekspresseerivad ekstratsellulaarseid ensüüme ekspresseerivad ka toksiine , mis tapavad petjaid.

DNA mutatsioonide ärahoidmine. Mutatsioonide kuhjumine võib viia kohasuse vähenemiseni, lisaks kaitseb bakter ennast faagide, transposoonide jms inserteerumise eest kromosoomi, mis võib populatsioonile pikas perspektiivis olla kahjulik.

11.1. Toksiin-antitoksiin süsteemid

Termin toksiin-antitoksiin kirjeldab geenipaari, millest üks kodeerib stabiilset toksiini, teine ebastabiilset antitoksiini. Toksiin on bakterile letaalse toimega, samas kui antitoksiin inhibeerib toksiini toime. Algselt leiti neid süsteeme kromosoomivälistelt DNA-elementidelt, nagu madala koopiaarvuga plasmiidid ja faagid, mille koosseisus on toksiin-antitoksiin süsteemid. Nende süsteemide abil tagavad kromosoomivälised DNA-elemendid enda säilimise bakteri genoomis. Näiteks kui raku jagunemise käigus ühte tütarrakku plasmiidi ei satu , siis tsütoplasmaga kaasa saadud toksiin-antitoksiini paarist laguneb antitoksiin suhteliselt kiiresti ning toksiin tapab bakteriraku. Sedasi kontrollib plasmiid enda edasipärandumist. Tänaseks on leitud, et nii eubakterite kui arhede kromosoomid sisaldavad toksiin-antitoksiin süsteeme ning on olulised rakkude metabolismi kiiruse reguleerimisel ning autolüüsi indutseerimisel.
Tihti asuvad antitoksiini ja toksiini geenid ühes operonis, antitoksiin esimese geenina. Tavaliselt on operon positiivselt autoreguleeritud antitoksiiniga, samas kui toksiin käitub repressorina. Tihti jaotatakse süsteemid kaheks (mõnikord viieks). Tüüp I korral inhibeerib antitoksiini antisens-RNA toksiini geeni ekspressiooni ning tüüp II korral antitoksiin neutraliseerib toksiini valguna.
Toksiin-antitoksiin süsteemid ei pea olema letaalse efektiga bakterile. Mõned süsteemid pärsivad bakterite metabolismi. Näiteks RelBE (leidub andmeid ka MazEF-i kohta) toksiin-antitoksiin süsteemi toksiin RelE on mRNA ribosoomis-sõltuv RNaas, mis lõikab transleeritavat mRNA-d. Sellisel moel rakk kaitseb ennast näljatingimustes sellega, et vähendab energia kulutamist translatsioonile. Lõigates mRNA-sid katki läheb bakter metaboolselt inaktiivsesse seisundisse. Selliseid baktereid nimetatakse persistoriteks. Osa teadlasi arvab , et toksiin-antitoksiin süsteemiga indutseeritud metaboolne inaktiivsus on tagasipööratav. Et kui bakter satub toitaineterikkasse keskkonda, siis uuesti sünteesitud antitoksiin RelB inhibeerib RelE toime ning bakter muutub metaboolselt aktiivseks. Osa teadlasi arvab, et toksiin-antitoksiin süsteemidega pole võimalik bakteri metabolismi reaktiveerida.

11.1.1. MazEF-süsteem

E. coli toksiin-antitoksiin süsteem. MazF on toksiin ja MazE on antitoksiin. MazF on endoribonukleaas, mis tunneb ära mRNA-l ACA järjestuse ning lõikab mRNA katki esimese A ja C vahelt. MazE pool eluiga on umbes 30 minutit ning MazE on degradeeritav ATP-st sõltuva proteaasiga ClpAP. MazF on stabiilne, selle pool eluiga on umbes 4 tundi. Kui rakud on näljastressis ning aminohapete puudusel suureneb alarmooni ppGpp kontsentratsioon rakus, siis ppGpp pärsib mazEF operonilt transkriptsiooni. Kuna MazE on lühema elueaga, siis proteaasid lagundavad antitoksiini ning MazF vabaneb inhibitsioonist.
MazEF-ga vahendatud autolüüs on populatsiooni fenomen . Antibiootikumid, mis takistavad transkriptsiooni ja/või translatsiooni (rifampitsiin, klooramfenikool) pidurdavad ka antitoksiini sünteesi. Sarnase toimega võivad olla ka ulatuslikud DNA-kahjustused, mis pärsivad antitoksiini sünteesi ja põhjustavad programmeeritud surma. Toksiin MazF tükeldab mRNA-sid ja sellega soodustab väikeste valkude sünteesi, mis on alla 20 kDa raskused.
MazEF-ga vahendatud programmeeritud surma korral on väga oluline nn surmafaktor EDF (inglise keeles extracellular death factor), mis on pentapeptiid järgmise järjestusega: Asn-Asn-Trp-Asn-Asn. Tõenäoliselt on see peptiid pärit glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaasi (Zwf) modifitseerimisest. Zwf (vt metabolismiraja skeemi tsentraalse metabolismi koordineerituse peatükist) on pentoosfosfaatse raja võtmeensüüm, mis on oluline nukleotiidide sahhariidse osa sünteesis. See surmafaktor on oluline MazEF-ga vahendatud bakterite surma korral ja vajalik ROS-i tekitamiseks.

11.2. Rakukesta lagundamisega seotud lüüs

Rakukesta lüüsiga on seotud kaks mehhanismi – faagide vahendatud lüüs ning bakteri enda indutseeritud lüüs, kui bakter on nõrgenenud. Mõlemal juhul põhineb autolüüs peptidoglükaani hüdrolaaside transpordil tsütoplasmast välja ning peptidoglükaankihi lõhkumises. Selleks, et autolüüs oleks kiire ja efektiivne ehk programmeeritud, sünteesitakse tsütoplasmamembraani kahesuguseid valke – holiinid ja antiholiinid. Esimesed soodustavad peptidoglükaani hüdrolaaside transporti tsütoplasmast välja, teised takistavad transporti. Antiholiinid takistavad holiine nii kaua kuni signaal vallandab peptidoglükaani hüdrolaaside transpordi ja kiire lüüsi. Mõlemad valgud on väikesed 10 – 100 kDa ning omavad 2 või rohkem transmembraanset järjestust.

11.2.1. Faagide põhjustatud lüüs

Bakterifaagidele on oluline, et faagide DNA saaks replitseeritud, faagipartiklid pakitud ning siis toimub bakteri kiire lüüs, mis vabastaks partiklid keskkonda. Faagide põhjustatud bakterite lüüsi ei peeta bakterite enda indutseeritud surmaks, sest eksogeenne DNA-element, faag, on selle esile kutsunud. Samas faagide vahendatud programmeeritud surm on mehhanismi poolest väga sarnane bakterite enda autolüüsiga, mis on vahendatud peptidoglükaani hüdrolaasidega.
Faag  ja T4-baketifaagil on bakteri lüüsi kontrollimiseks lihtsaim variant. G(-) bakteri lüüsis osaleb kaks valku: holiin ja endolüsiin. Holiin on väike valk, mis on tsütoplasmamebraani-seoseline. Endolüsiiniks on peptidoglükaani (mureiini) hüdrolaas, millel puudub signaalpeptiid, mis signaliseeriks transporti periplasmasse. Endolüsiin koguneb tsütoplasmasse, kus ensüüm on bakteri jaoks ohutu. Endolüsiin ei pääse periplasmasse enne, kui holiin indutseerib endolüsiini transpordi. Kuidas täpselt see toimub, pole siiani teada. Arvatakse, et holiin polümeriseerub tsütoplasmamembraanis ning laseb passiivselt endolüsiinil liikuda periplasmasse.
Bakteriofaagi P1 kodeeritud peptidoglükaani hüdrolaasil on spetsiifiline domeen SAR (ingise keeles signal -arrest-reslease), mille abil ankurdub hüdrolaas membraani. Sec-süsteem transpordib hüdrolaasi periplasmasse, kuid hüdrolaas jääb inaktiivse vormina ankurdatuks tsütoplasma-membraani periplasmapoolsele küljele. Membraanist vabanemiseks on vaja holiine, mis indutseerivad vabanemise.
Signaal holiinide aktiveerimiseks. Bakteriofaagide vahendatud lüüsi uurides pandi tähele, et pärast holiini geeni aktivatsiooni langeb PMF. 20 minuti jooksul langes prootonpotentsiaal aeglaselt, kuid enne bakteri lüüsi järsult kuni rakud olid depolariseeritud ehk membraanipotentsiaal oli 0.
Faagidel on holiini geenid tihti kahe transkriptsiooni algusega, millelt ekspresseeritakse kahte suhteliselt sama suurt valku. Lühem vorm on holiin, pikem antiholiin. Antiholiinil on N-terminuses mõned aminohapped lisaks, mis tavaliselt on positiivse laenguga nagu arginiiin või lüsiin. Nendel aminohapetel on väga suur roll valkude orientatsiooni määramiseks tsütoplasmamembraanis. Positiivse laenguga antiholiin on N-terminusega tsütoplasma suunas (membraan on tsütoplasma-poolses osas negatiivse laenguga) ning lisaaminohapeteta holiin on N-terminusega periplasma pool.
Holiinide kuhjumine membraanis põhjustab membraanipotentsiaali vähenemist, kuna holiinid destabiliseerivad lipiidse kaksikkihi ning lasevad prootonitel tsütoplasmasse lekkida. Kui membraanipotentsiaal on piisaval hulgal langenud, liigub antiholiini N-terminus periplasmasse ning põhjustab väga järsu prootonpotentsiaali languse ning endolüsiinide pääsu periplasmasse. Arvatakse, et holiinid ja antiholiinid kogunevad membraanil ning moodustavad nn valguparvesid, mis destabiliseerivad lõplikult tsütoplasmamembraani, mille tulemusena hakkab periplasmasse lekkima tsütoplasma komponente.

11.2.2. Bakterite peptidoglükaani hüdrolaasidega vahendatud suitsiid

G(+) bakteril Staphylococcus aureus’el on uuritud faagidele analoogset süsteemi. Sarnaselt Pseudomonas aeruginosa suitsiidiga moodustab S. aureus normaalse biofilmi siis, kui osa rakke populatsioonist sureb ning keskkonda vabaneb ekstratsellulaarset DNA-d ehk eDNA-d. Mõlemal liigil sõltub korrektse biofilmi struktuur eDNA olemasolust, mida kasutatakse ehitusmaterjalina rakkude kinnihoidmiseks. Selleks osa bakterite populatsioonist lüüsub.
S. aureus kasutab faagide holiinidele ja peptidoglükaani hüdrolaasidele sarnast süsteemi, et ajastada suitsiidi . Sellel bakteril on kaks operoni cidABC, millest esimesed kaks geeni ekspresseerivad holiine, ning lrgAB, millelt ekspresseeritakse antiholiine. Mõlemaid geene ekspresseeritakse statsionaarses kasvufaasis. Erandlik on cidC geen, mis kodeerib püruvaadi oksüdaasi, mis konverteerib püruvaadi äädikaks. Kui cid operonist ükskõik milline geen deleteerida, siis rakkude eluvõime statsionaarses faasis suureneb. Lrg operoni geenide deleteerimisel rakud lüüsuvad metsiktüvest rohkem. Selles süsteemis pole peptidoglükaani hüdrolaaside geene, need ekspresseeritakse holiinidest ja antiholiinidest sõltumata. See süsteem reguleerib hüdrolaaside vabanemist tsütoplasmast sarnaselt faagide holiinidele, kuid S. aureus’e antiholiinid ainult pärsivad holiinide tööd, ise lüüsi soodustamata.
Ekspressiooni reguleerimine. Mõlemalt operonilt on geenide transkriptsioon aktiveeritud, kui bakterid kasvavad keskkonnas, kus on glükoosi palju. Glükoosi liia korral hakkab CidC aktiivsuse tõttu keskkonda akumuleeruma äädikhape. Operoni cidABC ekspressiooni reguleerib positiivselt cidR , mis asub operoni ees vastassuunaliselt. CidR on allosteeriline regulaator, mis tunnetab äädikhappe kogunemist rakku. CidR aktiveerib nii cidABC kui ka lrgAB operoni. Lisaks aktiveerib CidR veel alsSD operoni, mis konverteerib püruvaadi atsetooniks. Glükoosi külluses elades püüab bakter talletada glükoosi kui energiallikat kas äädikhappe või atsetooni näol, mida hakatakse hiljem lagundama energia saamiseks. Kui tavaliselt kataboliseeritakse püruvaat püruvaadi dehüdrogenaasi abil atsetüül-CoA-ks, siis mittebalanseeritud metabolismi korral võib rakk aktiveerida Als ja Cid metabolismi kõrvalrajad, mis on stressi signaaliks. Als-haru abil suundub püruvaat üle atsetooni atsetüül-CoA-ks, kuid katabolismi käigus redutseeritakse NAD -> NADH-ks. NAD-i kasutatakse ka glükolüüsis. Näiteks alsSD operoni deleteerimisel kuhjus glükoosirikkal söötmel rakku NAD, mis viis rakud kiiresti lüüsumiseni. Veel on leitud, et CidC võib suurendada ROS (inglise keeles reactive oxugen species ) hulka rakus, mis võib olla samuti rakkudele signaaliks stressist . Pole täpselt teada, mis on rakkudele signaaliks, kas ROS või suurenenud NAD/NADH suhe, mis põhjustab rakkude autolüüsi.
Operon lrgAB ekspressiooni kontrollib kahekomponendiline süsteem lytSR, mis tunnetab kahte signaali. LytS, mis on membraanis sensoriks, aktiveerub kui membraanipotentsiaal hakkab vähenema. Samas see signaal ei sõltu ei ATP hulgas rakus (ATP hulk sõltub membraanipotentsiaalist) ega ka CidR-st, mis näitab, et bakteri autolüüs on keerukalt reguleeritud.
LytR on tanskriptsiooniregulaator, mida fosforüleerib LytS. Peale selle võib LytR aktiveeruda ka LytS-st sõltumatult. LytR tunnetab rakusisest äädikhappe kontsentratsiooni ning arvatakse et äädikhappe kogunedes võib LytR-i aktiveerida atsetüülfosfaadid, väikesed molekulid.
LytSR süsteemi täpset funktsiooni pole teada, kuid arvatakse, et selle kahekomponendilise süsteemi abil tunnetab rakk üldist metabolismivõimekust. Kui mingil põhjusel rakk ei suuda transmembraanset potentsiaali metabolismi abil tagada, aktiveerib bakter LytSR signaaliraja, mis võib takistada autolüüsi teatud piirini. Veel on LytSR signaalirajale välja pakutud faagide levimist takistavat funktsiooni. Kui faagi tulemusena raku transmembraanne potentsiaal langeb, siis LytSR signaaliraja abil aktiveeritakse lrgAB geenid, mis takistavad raku lüüsumist. Faagi küll replitseeritakse ja pakitakse, kuid bakter takistab enda lüüsi ja ei lase faagipartiklitel keskkonda levida, isegi veel siis kui faagi tulemusena PMF on 0 ning bakter sisuliselt surnud.

11.3. Hingamisahela blokeerimine ja ROS

Bakter Pseudomonas aeruginosa on kliiniliselt oluline, sest see bakter põhjustab palju infektsioone, mis on sageli ravile allumatud. Uurides selle bakteri hulgatunnetuse mehhanisme, biofilmi moodustumist ning patogeneesi, on hakatud seda bakterit kutsuma hulkraksele organismile sarnaselt käituvaks bakteriks. Sest P. aeruginosa patogenees on bakterite kollektiivse käitumise tulemus.
Bakterid tunnetavad teiste bakterite kohalolekut hulgatunnetuse kaudu. Bakterid eritavad keskkonda väikeseid molekule, mis käituvad signaalmolekulidena. Selliste signaalmolekulide kontsentratsiooni kaudu saavad bakterid aru, kui palju on ümbruskonnas sarnaseid baktereid. Kui signaalmolekulide kontsentratsioon ületab teatud piiri, vallandab see bakterites kardinaalse transkriptsiooni ümberkorraldamise, mis tavaliselt päädib bakterite suunatud kollektiivse käitumisega, kas patogeneesiga või biofilmi moodustumisega. Signaalmolekulidega samas metabolismirajas võib toota bakter ka toksiine, mis mõjuvad mürgina ning vallandavad osa bakterite surma.
Näiteks Pseudomonas aeruginosa signaalmolekul HQNO (inglise keeles 2-N-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide) on anthiliinhappe derivaat, mida toodetakse koos teiste hulgatunnetusmolekulidega nagu HHQ (inglise keeles 4-hydroxy-2-heptylquinoline) ja PQS (inglise keeles 3,4-dihydroxy-2-heptylquinoline). Erinevalt HHQ ja PQS-st pole HQNO seotud transkriptsiooni regulatsiooniga bakterites, vaid on seotud hingamisahelas elektronide ülekande blokeerimisega. HQNO blokeerib mitokondrites bc1(hingamisahela kompleks III) töö ning oli kasutusel juba 1970-ndatel kui hingamismürk. HQNO-ga on P. aeruginosa võimeline tapma ka teisi baktereid nagu näiteks Staphylococcus aureus’t. P. aeruginosa toodavad HQNO-d imetajate kudedes, kus HQNO-l on biofilmi moodustamist soodustav efekt, mis toob endaga kaasa ka suurema antibiootikumiresistentsuse. Seega üksikindiviidi surm on kasulik bakteripopulatsioonile.
HQNO toimet mitokondri hingamsiahela tsütokroomile bc1 on paremini teada. Kui HQNO seondub bc1 Qi domeeniga ning kinoonide oksüdeerumine väheneb, mille tulemusena Q0 domeenis olev semikinooni radikaal võib elektronid üle kanda O2 ja tekib superoksiid O2.-. Mitokondris suureneb ROS-i hulk, mis toob kaasa membraanipotentsiaali nihke ning pooride avanemise, mille tulemusena liiguvad H+ mitokondrisse ning prootongradient kaob. Mitokonder selle tulemusena läheb apoptoosi .
HQNO põhjustab P. aeruginosa autolüüsi, millega on seotud nii oksüdatiivne purse kui ka hingamisahela bc1 tsütokroomi blokeerimine. Kuigi P. aeruginosa’l on väga harunenud hingamisahel, siis tsütokroom bc1 Qi järjestuse blokeerumine HQNO-ga on piisav, et bakteris põhjustada hingamisahela katkemise ning kutsuda esile tohutut oksüdatiivset purset. Sellele järgneb ulatuslik membraanikahjustus, mis päädib lüüsimisega.
HQNO sünteesiks vajab bakter hulgatunnetuse transkriptsiooniregulaatorit PqsR (MvfR), mis on pseudomoonastele iseloomuliku hulgatunnetussüsteemi PQS transkriptsiooniregulaator. PqsR lülitab sisse pgsABCD operoni, mis on vajalik nii HHQ, PQS kui ka HQNO tootmiseks. Kui need geenid on defektsed, siis bakter ei tooda HQNO-d ning ei lähe autolüüsi. Autolüüs on P. aeruginosa’s ajastatud kahe aine kontsentratsiooni muutusega. Suitsiidi toimumiseks on vajalik HQNO kogunemine ning glutatiooni kontsentratsiooni langus statsionaarse kasvu alguses. Glutatioon on oluline rakusisese ROS-i detoksifikatsiooniks.
P. aeruginosa vajab biofilmi moodustumiseks hulgatunnetuse kaudu tulevaid signaale. Kui kasutati hulgatunnetus-defektseid P. aeruginosa tüvesid, siis biofilmi moodustumine oli häiritud. Samas, kui keskkonda lisati HQNO-d siis biofilmi moodustumine paranes. Bakteritel oli vaja korrektse struktuuriga biofilmi moodustumiseks ektstratsellulaarset DNA-d ehk eDNA-d, mis vabaneb bakteripopulatsioonis autolüüsi tulemusena. Osa baktereid populatsioonist ei lüüsu HQNO toimelt, sest muidu poleks biofilmi üldse moodustunud. Arvatakse, et osa baktereid modifitseerib enda hingamisahelat nii, et HQNO ei toimi. Kuidas täpselt see käib, pole teada. Bakteripopulatsioon tervikuna saab osa bakterite autolüüsist kasu, sest biofilm annab bakteritele väga tugeva kaitse antibiootikumide vastu. Antibiootikumide difundeerumine biofilmi maatriksist läbi rakkudeni on tugevalt häiritud.
Peale biofilmi parema moodustumise saab bakteripopulatsioon veel teisiti kasu hingamis -mürkide sekretsioonist. Hulgatunnetuse kaudu on reguleeritud P. aeruginosa’s umbes 300 geeni ekspressioon ning nende hulgas on palju ekstratsellulaarseid ensüüme, mida bakter kasutab pere-meesorganismi ründamiseks ja lagundamiseks, et saada toitaineid paremini kätte. Bakteripopulat-sioonis on ka nn petjaid, bakterid, mis ise ei ekspresseeri ekstratsellulaarseid ensüüme, kuid kasuta-vad teiste bakterite ensüümide abil lagundatud C-allikat toiduks. Bakterid, mis elavad teiste kulul. HQNO ja tsüaniidi abil kontrollib bakteripopulatsioon selliste petjate arvu. HQNO mõjub petjate hingamisahelale, samas kui HQNO tootjad on enda hingamisahelat modifitseerinud ning HQNO-le tundetud.
Bakteritel on leitud tsüklosporiine, mis oma olemuselt arvatakse olevat sarnased mitokondri tsüklosporiin A-ga, mis takistab mitokondri apoptoosi, sidudes tsüklofiliin D-d, mis on mitokondri autolüüsiks oluline. Kuigi P. aeruginosa’s pole spetsiifiliselt uuritud HQNO toime blokeerimist tsükloporiinide abil, siis arvatakse, et bakterid võiks tsükloporiinide abil reguleerida enda autolüüsi.
Selline üksikindiviidi programmeeritud surm annab populatsioonile eelise ning näib olevat evolutsiooniliselt kinnistunud, sest P. aeruginosa isolaatidel on vajalikud geenid tugevalt konserveerunud. Põhjused, mis viitavad evolutsioonilisele kinnistumisele ning populatsiooni tasemel kasu saamisele:
1. bakter ise ekspresseerib „suitsiidigeene“, need geenid pole pärit faagidelt, ega suitsiid indutseeritud väliskeskkonnast,
2. tugevalt konserveerunud P. aeruginosa isolaatides,
3. HQNO pole metabolismi toksiline produkt, mis tapaks valimatult nagu äädikhappe kuhjumine keskkonda, HQNO tootmine on väga täpselt reguleeritud
4. P. aeruginosa toodab HQNO-d nii laboris kasvatades kui ka loomade kudedes
5. indutseerib biofilmi moodustumist ning suurendab bakteripopulatsiooni vastupidavust antibiootikumidele (kaudselt)

12. Konjugatsioon

DNA võib mikroorganismide seas üle kanduda horisontaalselt , see tähendab sama põlvkonna rakkude vahel. Horisontaalne geeniülekande vastand on bakteri tütarraku omandatud DNA koopia emarakult ehk DNA pärimine vertikaalselt. Horisontaalse geeniülekandega omandavad bakterid võõrast DNA-d keskkonnast, teistelt bakteritelt või viirustelt, mis teatud olukordades on keskkonnatingimustele kohasust tõstva väärtusega. Arvatakse, et 17-25 protsenti Escherichia coli genoomist on saadud horisontaalse geeniülekande abil. Horisontaalset geeniülekannet võimaldavad:

konjugatsioon

transformatsioon

transduktsioon
Prokarüootsed organismid on võimelised kiiresti kohanema keskkonna muutunud tingimustega, sest neil on olemas mitu mehhanismi, mis võimaldavad bakteri füsioloogiat muuta. Üheks selliseks on horisontaalne geeniülekanne konjugatsiooni abil. Arvatakse, et konjugatsioon on bakteritel olulisemaks mehhanismiks võõr-DNA hankimiseks, sest plasmiididega on võimalik üle kanda tunduvalt rohkem geene kui transduktsiooni abil (faag-bakter interaktsioon). Transformatsiooni abil on samuti eelistatud väiksemate DNA molekulide ülekandumine, sest üldiselt DNA laguneb keskkonnas kiiresti.
Konjugatsiooniks nimetatakse DNA võimet kanduda ühest elavast bakterirakust teise ning konjugatsiooniks on vajalik bakterite omavaheline kontakt. Nähtuse avastasid Joshua Lederberg ja Edward Tatum 1946. aastal, kui nad segasid kokku Escherichia coli K12 isolaate ning tõdesid fenotüübiliselt vahepealsete bakterite teket, millel oli sarnaseid geneetilisi jooni mõlema vanemtüvega. Sellest järeldati, et vanemtüved on vahetanud DNA-d. Konjugatsiooni käigus võib üle kanduda nii üheahelaline DNA ( ssDNA ) kui ka kaheahelaline DNA (dsDNA). Mõlemal juhul on konjugatsiooniks vajalikud geenid lokaliseerunud peamiselt plasmiididesse või integreerunud kromosoomi ICE-dena (integrative conjugative elements). Põhjalikult on uuritud Proteobacteria ja Firmicutes ssDNA konjugatsiooni, eriti Agrobacterium tumefaciens’i Ti-plasmiidi tüüp 4 sekretsioonisüsteemi (T4SS – type IV secretion system), mis vastutab DNA ülekande eest.
Konjugatsioon toimub peamiselt sarnaste bakteriliikide vahel, kuid DNA ülekanne on võimalik ka erinevate eubakterite hõimkondade vahel. Veelgi enam, bakteritest võib DNA kanduda konjugatsiooni abil üle arhedesse ja eukarüootidesse, kuid neid juhtumeid on siiani vähe teada ning DNA ülekandumine bakterilt eukarüooti konjugatsiooni abil tundub olevat haruldane . Siiski, Agrobacterium on võimeline üle kandma Ti plasmiidi taimerakku ning sellega mõjutama taime füsioloogiat.
Rakku, millest DNA üle kandub, nimetatakse doonoriks. Rakku, kuhu DNA molekul üle kantakse, nimetatakse retsipiendiks. Rakku, kuhu DNA on üle kandunud, nimetatakse transkonjugandiks. Plasmiidi, mis tagab konjugatsiooniks kõigi etappide toimumist nimetatakse konjugatiivseks ehk transmissiivseks plasmiidiks. Samas, on olemas palju plasmiide, mis pole võimelised konjugatsiooni täielikult läbi viima. Näiteks, plasmiidid, mis tagavad DNA ette-valmistamise, kuid ei taga sugupiili moodustumist, nimetatakse mobiliseeritavateks plasmiidideks. Mobiliseeritava plasmiidi korral võib see retsipientrakku kanduda juhul, kui doonorrakus on veel konjugatiivne (transmissiivne) plasmiid, mis tagab sugupiili moodustumise.
Konjugatsioon on bakterite seas väga laialt levinud, sest (konjugatsiooni tähtsus):

Konjugatsiooni abil on võimalik sarnaste genoomidega bakteritel läbi viia homoloogilist rekombinatsiooni, mis meenutab eukarüootide sugulist paljunemist. Konjugatsiooni nimetatakse sageli mikroorganismide suguliseks paljunemiseks.

Konjugatsiooni abil on bakteritel võimalik toime tulla keskkonnamuutustega ning suurendada kohasust. Konjugatsiooniga levivad antibiootikumide resistentsusgeenid, metabolismiradade geenid ja teised mobiilsed geneetilised elemendid.

Konjugatsioon on oluline ka nn sotsiaalsete fenotüüpide arengus ja tekkes, nagu biofilmi moodustumine ning hulgatunnetuses.

12.1. Konjugatsiooni etapid

Konjugatsiooni protsess jagatakse kahte etappi:
1. rakk-rakk interaktsiooni loomine ehk MPF (mating-pair formation )
1. sugupiili teke, mis on vajalik rakk-rakk kontakti tekkeks ning DNA ülekandumiseks (tüüp 4 sekretsioonisüsteem ehk T4SS type 4 secretion system)
2. DNA ülekanne
1. relaksosoomi teke, üheahelalise katke tekkimine oriT järjestuses ning DNA lahti-hargnemine. Selleks on vajalik konjugatsioonispetsiifilise endonukleaasi ehk relaksaasi ekspressioon (mõnel juhul eraldi helikaasi ekspressioon)
2. DNA-relaksosoomi kompleksi esitlemine T4SS-le T4CP (T4SS coupling proteiin ) abil ning DNA ülekandmine retsipienti
3. DNA süntees ja ligeerimine
4. (piili lagunemine ning) rakkude lahknemine .
Rakk-rakk kontakti loomiseks peab doonorrakk olema võimeline moodustama sugupiili. Sugupiilid võivad morfoloogiliselt erineda, neid on jagatud peenteks ja painduvateks F-piilideks (F-plasmiid), jämedateks, jäikadeks ja lühikesteks P-piilideks (RP4 plasmiid), kuid kõik sugupiilid kujutavad endas tüüp 4 sekretsioonisüsteemi (T4SS) alamklassi, mis transpordivad DNA-d rakust välja. Kuidas täpselt DNA üle kandub, pole siiani selge. Ühe hüpoteesi kohaselt on sugupiili hädavajalik rakk-rakk kontakti loomiseks, mille järel retsipientrakk tõmmatakse sugupiili abil doonorrakuni ning rakkude vahel tekib konjugatsioonipoor, mis on vajalik DNA ülekandumiseks. Escherichia coli F-plasmiidi puhul väidetakse konjugatsioonipoori olemasolu kõige sagedamini. Teise hüpoteesi järgi konjugatsioonipoori ei teki ning ssDNA ning relaksaas kandub retsipientrakku läbi sugupiili. Sellel seisukohal on Agrobacterium tumefaciens’i Ti-plasmiidi uurijad .
Rakk-rakk kontakti loomiseks peab sugupiili kinnituma retsipientrakule. F-plasmiidi puhul arvatakse, et F-piili adhesiin TraN tunneb retsipientraku pinnal ära OmpA valgu või mõned spetsiifilised lipopolüsahhariidid, kuid kindlat markerit, mis oleks kontakti loomiseks hädavajalik, pole siiani leitud. Kontakti loomiseks kulub 5 minutit.
Kahe doonori vahel konjugatsiooni vältimiseks on rakkude F-plasmiidi puhul olemas kaks MPF vältimise süsteemi. Esimene on välismembraanil kontakti välistamine, mida tagab TraT valk. TraT on 244/233 amh pikkune 5 oligomeerina esinev välismembraani valk. Arvatakse, et TraT takistab piili kinnitumist OmpA valgule. DNA sisenemise välistamine on tagatud F-plasmiidil TraS valguga, mis tõenäoliselt takistab relaksosoomi sisenemist rakku ning DNA replitseerumist. TraS on 149 amh pikkune valk sisemembraanis. Mõlemal valgu üleekspressiooni tulemusena väheneb F-plasmiidi sisenemine kuni 100 korda. TraS ja TraT valgud (mõlemad mehhanismid) on plasmiidispetsiifilised.
DNA ülekandumiseks on vajalik kahe etapi toimumine. Esmalt on vajalik relaksosoomi moodustumine oriT-l. Relaksosoomi keskseks valguks on konjugatsioonispetsiifiline endonukleaas – relaksaas –, mis sõltuvalt bakterist kinnitub oriT-le üksinda või abivalkude abil. Relaksosoomi moodustumisest võtavad osa ka kromosoomselt ekspresseeritud valgud nagu IHF (intgration host factor). Relaksaas lõikab DNA ühe ahela katki ning seob DNA 5’ otsa kovalentselt enda külge. DNA ülekandumise teises etapis on vajalik relaksosoomi esitlemine T4SS-le. Selleks seondub relaksosoomiga T4CP (T4SS coupling protein), mis esitleb kompleksi T4SS-le. Relaksaas-DNA kompleks kantakse üle retsipientrakku, sünteesitakse puuduv DNA ahel ning lineaarne DNA molekul ligeeritakse rõngasmolekuliks. Doonorrakus vabaks jäänud DNA 3’ otsast replitseeritakse puuduv ahel doonorraku DNA molekuli jaoks. Konjugatsiooni käigus viiakse retsipientrakku ainult koopia – DNA koopia jääb doonorrakku ja teine koopia viiakse retsipientrakku.
Kromosoomi ülekanne ning rekombinantne F-plasmiid. Tavaliselt toimub konjugatsiooni käigus plasmiidi ülekandumine, kuid mõnikord, kui konjugatiivne plasmiid on inserteerunud kromosoomi, võib konjugatsiooni käigus üle kanduda kromosoom. E. coli F-plasmiid on võimeline inserteeruma bakteri kromosoomi ja sealt ka välja tulema . E. coli tüve, mis kannab F-plasmiidi kromosoomis nimetatakse Hfr tüveks (High frequency of recombination).
Teada on umbes 20 piirkonda E. coli kromosoomis, kuhu F-plasmiid võib integreeruda, kuid enamasti on eelistatud mõned piirkonnad. F-plasmiidis on mitu transponeerivat elementi: kaks IS3, üks IS2 ja üks Tn1000 (). Neid kasutatakse F-plasmiidi integreerimiseks E. coli kromosoomi homoloogilse rekombinatsiooni abil (RecA valk). Tn1000 järjestusse inserteerunud F-plasmiid on kromosoomis kõige ebastabiilsem ning võib kõige kergemini kromosoomist tagasi plasmiidiks rekombineeruda. F-plasmiid võib kromosoomist välja tulla ebakorrektselt, olles kas lühem kui algne plasmiid või pikem, olles kaasa võtnud insertsioonijärjestuse kõrval olevaid geene. Väiksemat F-plasmiidi nimetatakse F’-plasmiidiks. Pikemate plasmiidid puhul näidatakse ära, mis geeni F-plasmiid on kromosoomist kaasa võtnud, näiteks F’lac-ga tähistatakse F-plasmiidi, mis sisaldab kromosomaalset laktamaasi geeni.
Konduktsiooniks nimetatakse teiste plasmiidide ülekandmist retsipientrakku F-plasmiidi koosseisus. Kui F-plasmiidis olev replikatiivne Tn1000 transponeerub uude plasmiidi, siis retsipientrakku võib üle kanduda transpositsiooni vaheprodukt, kahe plasmiidi kointegraat.
F-plasmiid võib algatada kromosoomi ülekandumise retsipientrakku. Kuna kromosoom on plasmiididest tunduvalt suurem, siis tavaliselt tervet kromosoomi üle ei kandu, ainult konjugatiivse plasmiidi kõrvalolev DNA. Selle põhjuseks on rakk-rakk interaktsiooni katkemine enne tervikliku kromosoomi ülekandumist. DNA kantake F-plasmiidi korral üle kiirusega 45 kbp/min ehk siis F-plasmiidi enda ülekandumiseks kulub 2 minutit, samas kui terve E. coli kromosoomi ülekandumiseks kuluks umbes 100 minutit.
Merosügootideks ehk merodiploidideks nimetatakse sellist bakterit, mille erinevates DNA molekulides on samad geenid ehk bakter on diploidne teatud geenide osas. Merosügootsus juhtub tavaliselt Hfr tüvedest kromosoomse DNA ülekandumisel retsipientrakku või F’-plasmiidide ülekandumisel retsipientrakku. Hfr tüvedest DNA ülekandumise korral ülekandunud DNA läheb kaotsi või rekombineerub retsipiendi kromosoomiga.
Peale plasmiidide võib konjugatsiooni abil üle kanduda veel konjugatiivne transposoon. Näiteks Enterococcus faecalis’e transposoon Tn916 sisaldab nii MOB geene (tra) kui ka oriT-d, puudub vegetatiivne origin. Sellest johtuvalt konjugatiivne transposoon ei replitseeru iseseisvalt, kui ta on väljunud kromosoomist. Siiski, Tn916 ligeeritakse rõngas-DNA-ks pärast kromosoomist väljumist. See on vajalik MOB geenide ekspressiooniks, sest geenide promootor asub transposooni teise õla läheduses, suunaga väljapoole. MOB geenide promootori asukohaga on tagatud konjugatiivse transposooni ülekandumine retsipienti ainult siis, kui transposoon on kromosoomist väljunud.

12.1.1. Plasmiidide klassifikatsioon konjugatsiooni seisukohast

Konjugatsiooni silmas pidades saab plasmiidid jagada kolme rühma:
1.konjugeeruvad plasmiidid on võimelised iseseisvalt konjugeeruma kuna kannavad konjugatsiooniks kõiki vajalikke geene (MPF, MOB geenid) ja oriT-d. Lisaks konjugatsiooniks vajalikele geenidele sisaldavad sellised plasmiidid enamjaolt veel teisi geene, mis aitavad plasmiidil säilida transkonjugandis. Näiteks antirestriktaaside ja ssDNA-ga seonduvate valkude geene.
2.mobiliseeritavad plasmiidid sisaldavad relaksosoomi moodustumiseks vajalike valkude geene (MOB geenid) ning oriT-d. Konjugeeruda saavad ainult siis, kui MPF-ks vajalikud valgud (T4SS) ekspresseeritakse bakteris teiselt (konjugatsioonivõimeliselt) plasmiidilt või kromosoomilt.
3.mittekonjugeeruvad plasmiidid pole võimelised konjugeeruma, sest puuduvad nii MOB kui ka MPF geenid või oriT. Mõnikord on mittekonjugeeruvatel plasmiididel olemas oriT, kuid selliste plasmiidide konjugatsioon on eriti harv. Piiravaks teguriks on relaksosoomi moodustumine, sest oriT äratundmiseks on vajalik spetsiifiline relaksaas. Ülekandumine on võimalik ainult siis, kui relaksosoomi valgud on ekspresseeritud väga lähedaselt plasmiidilt, mille relaksaas tunneb ära oriT.
Pilar et. al (2010) võrdlesid kõiki plasmiide (kokku 1730 plasmiidi suurusega 0,8 kbp kuni 2 Mbp), mis 2009. aastal oli andmebaasidesse üles laaditud ning täielikud sekveneeritud. Kõigist prokarüootide plasmiididest 15% on konjugatiivsed, 24% mobiliseeritavad ning 61% mittekonjugatiivsed plasmiidid. Proteobakterite hulgas on konjugatiivseid plasmiide pisut rohkem, vastavalt konjugatiivseid 28%, mobiliseeritavaid 23% ning mittekonjugatiivseid 49%. Rohkem kui poolte plasmiidide mittemobiliseerumine näitab, et plasmiide ei saa pidada parasiitideks, mis püüavad ennast ohjeldamatult paljundada.
Mobiliseeritavad plasmiidid on üldjuhul väiksemad kui konjugatiivsed plasmiidid, sest konjugatiivsed plasmiidid peavad lisaks MOB-geenidele sisaldama ka MPF-geene. Mobiliseeritavad plasmiidid on üldjuhul väiksemad kui 35 kbp, keskmiselt 5 kbp pikkused, ning konjugatiivsed plasmiidid umbes 100 kbp pikkused. Mittekonjugeeruvad plasmiidid võivad olla igas suuruses, kuid tavaliselt on sellised plasmiidid kas keskmiselt 5 kbp ja 35 kbp pikkused. Mõni mittekonjugeeruv plasmiid võib olla ka ülisuur, keskmiselt 1 Mbp pikkune, suurimad u 2 Mbp pikkused.
Kõige väiksem plasmiid, mis võiks olla iseseisvalt konjugeerimisvõimeline, on Yersinia pestis 21,8 kbp pikkune pCRY, mis kannab nii relaksaasi geeni kui ka T4SS geene. Kõige suurem konjugatiivne plasmiid on leitud Sinorhizobium meliloti 1012-l, 1,35 Mbp pikkune pSymA, samas kõige suurem mobiliseeritav plasmiid on leitud samuti Sinorhizobium meliloto 1021-l, 1,68 Mbp pikkune pSymB. Seega kõige suuremad plasmiidid pole konjugatsioonivõimelised.
Plasmiidide ülakandumisvõime mehhanisme silmas pidades on plasmiidid jaotatud 4 klassi T4SS alusel ning 6 mobilisatsiooniklassi MOB-geenide alusel, võttes arvesse valkude sarnasust , mis tagab DNA liikumise bakterite vahel. DNA ülekandumisel on kõige olulisemateks valkudeks relaksaas, T4CP (T4SS coupling protein, mis tagab substraadi äratundmine) ja ATPaasid. Need on konjugatsiooni tuumaks. Relaksaas on ainuke valk, mis on olemas kõigil konjugatsiooni käigus ülekanduvatel plasmii-didel (konjugatiivsed pluss mobiliseeritavad plasmiidid). Relaksaas on konjugatsiooni alustamise ja lõpetamise võtmeensüüm, sest ta tunneb ära oriT järjestuse ja initseerib DNA üheahelalise katke, lisaks ligeerib transkonjugandis ülekantud DNA kokku. Mobiliseeritavad plasmiidid kannavad konjugatsiooniks vajalikest geenidest ainult oriT-d, relaksaasi geeni ja veel mõnda abivalgu geeni. Konjugatiivsed plasmiidid sisaldavad nii relaksosoomiks vajalikke geene kui ka MPF geene (T4SS).

10.1.2. Tüüp IV sekretsioonisüsteem

Konjugatsiooni toimumiseks on vajalik sugupiili ehk konjugatiivse piili teke. Sugupiili peab tekkima rakk-rakk interaktsiooniks ning DNA transpordiks retsipientrakku. Kui veel möödunud sajandi lõpus polnud täiesti selge, kuidas DNA transporditakse doonorrakust retsipientrakku, siis praeguseks on kindlaks tehtud, et DNA kantakse üle tüüp IV sekretsioonisüsteem (T4SS) abil. Seega, sugupiili on tüüp IV sekretsioonisüsteemi üks alamklass. T4SS abil ei kanta sihtmärkrakku mitte ainult DNA-d, vaid ka toksiine ja efektorvalke. Konjugatsiooni mudeliks on praegu võetud Agrobacterium tumefaciensi T4SS, mis koosneb 12 valgust – VirB1-11 ja VirD4 –, mis assambleerub eraldiseisvaks suureks membraanseks transporteriks. T4SS on üks kuuest suurest sekretsioonisüsteemist, mida kasutavad G(-) bakterid mitmesuguste molekulide transportimiseks. T4SS on suur trasnportsüsteem, mis ulatub läbi raku sisemise ja välimise membraani.
T4SS on jaotatud klassidesse erinevatel põhimõtetel.
Ajaloolised klassifikatsioonid:
1. Plasmiidide mittesobivusgruppide järgi: 1. F-tüüpi piilid – Sugupiili 2-20 m pikk, painduv, konjugatsioon nii vedelikus kui tahkel pinnal, F-plasmiid; 2. P-tüüpi piilid –Sugupiili 2. Funktsiooni järgi: 1. konjugatiivsed sekretsioonisüsteemid – sihtmärkrakku ainult DNA-d transportivad sekretsioonisüsteemid. Levinud eubakteritel ja arhedel; 2. efektorit transportivad sekretsioonisüsteemid – sihtmärkrakku toksiine ja efektorvalke transportivad T4SS-d. Nii patogeensed kui sümbiontsed bakterid kasutavad selle alamkassi T4SS transportimaks valke eukarüoodi rakku. Levinud G(-) bakteritel, nt Agrobacterium tumefaciens’ VirE1 ja VirE2 valgud;
3. DNA sisse/välja sekretsioonisüsteemid – retsipienti mittevajavad T4SS-d. Võivad transportida DNA-d keskkonda (Neisseria gonorrhoeae) või keskkonnast rakku (Helicobacter pylori).
Tänapäevane klassifikatsioon MPF-i geenide sarnasuse ja paigutuse järgi klassifitseeritakse konjugatiivsed plasmiidid nelja klassi: 1. MPFF, F-plasmiid; 2. MPFI, R64 plasmiid, 3. MPFG, Haemophilus influenzae plasmiid ICEhin 1056; 4. MPFT, plasmiid Ti, vir-süsteem

T4SS ehitus

T4SS valgud võib jagada viide rühma:
1.T4CP (T4SS coupling protein) – VirD4
2.ATPaasid, mis on vajalikud DNA ülekandmiseks kuluva energia tootmiseks – VirB4, VirB11
3.translokatsioonikanali valgud
sisemembraanis – VirB3, B6, B8
välismembraanis – VirB7, B9, B10
4.hüdrolaas – VirB1
5.piilivalgud – VirB2, B5
Esimesena tuvastati T4SS põhikompleks, mis koosneb torujalt asetsevatest VirB7, 9 ja 10-st valkudest. Põhikompleks läbib A. tumefaciens’i mõlemat membraani ning on umbes 1,1 MDa raskune. Põhikompleksi koosseisus on igast valgust 14 koopiat ning moodustusb sisering ja välisring. Välisringis on kõik kolm valku, kuid siseringis ainult VirB9 ja VirB10. VirB10 moodustab T4SS kanali, milles substraat liigub rakust välja.
Sisemembraani kompleks paikneb põhikompleksi all ning on seotud põhikompleksiga kitsa varre abil. Koosneb VirB3, 4, 5,6 ja 8-st ning on umbes 3,4 MDa raskune.
Translokatsioonikanalis asuva varre ehitus ja koostis pole päris selge. Arvatakse, et T4SS põhikompleksi ja sisemembraanset kompleksi ühendav vars võib olla VirB10 N-terminaalne domeen või VirB6 ja VirB8 domeenid. Arvatakse, et vars pole jäik moodustis , vaid muutuv struktuur.

Sugupiili komponendid

Sugupiili on rakuväline valguline toru, mis on seotud DNA transpordiga retsipentrakku. Morfoloogiliselt eristatakse kahte sugupiili tüüpi: F-tüüpi sugupiili, mis on pikk ja painduv ning P-tüüpi sugupiili, mis on lühike ja jäik. F-piili keskel on luumen, mille kaudu transporditakse edasi üheahela-line DNA või mittepakkunud valk. Pakitud valke F-pili kaudu ei transpordita. Agrobacterium tumefaciens’i piili koosneb kahest Vir valgust ehk piliinist – VirB2-st ja VirB5-st.

Hüdrolaas

VirB1 on periplasmaatiline transglükosülaas, mis sarnaneb lüsotsüümile. VirB1 lõikab -1,4-glükosiidsidemeid MurNAc (N-atsetüülmuramiidhape) ja GlcNAc (N-atsetüülglükoosamiin) peptiidoglükaanil. Periplasmas lõigatakse VirB1 kaheks: N-terminaalne osa jääb periplasmasse ning käitub kui muramidaas, C-terminaalne osa transporditakse rakust välja ning arvatakse, et C-terminaalne osa valgust on seotud piili biogeneesiga.

T4SS ATPaasid

T4SS-l on 3 ATPaasi, mis tagavad substraadi transpordi: VirB4, VirB11 ja VirD4.
VirB4 – konjugatsiooniaparaadi levinud ATPaas, seda on konserveerunud nii G(-) kui ka G(+) bakteritel. VirB4 on sisemembraanivalk, mis interakteerub VirB3, 6, 7 ja 8-ga. C-terminaalne domeen on tugevalt konserveerunud, ATPaasne aktiivsus. Eraldiseisvana dimeriseerub, kuid on leitud ka monomeere, trimeere ja heksameere.
VirB11 – AAA+ perekonna heksameerne liikuv ATPaas, mis on T4SS moodustumiseks ja konjugatsiooni toimumiseks asendamatu. Seotud sisemembraaniga, moodustab heksameeridest ringja struktuuri, seondub nii VirB4 kui ka VirD4-ga. Seondudes VirB4-ga initseerib piili biogeneesi, seondudes VirD4-ga sunnib T4SS-i seonduma translokeeritava substraadiga.
VirD4 – suur sisemembraaniga seotud valk, millel on kaks domeeni: N-terminuse domeen on väiksem ning tagab membraaniga seondumise, seevastu C-terminuses asuv domeen on suur ning tsütoplasmaatiline. Heksameerne. C-terminuses on ssDNA-sõltuv ATPaasne domeen. VirD4 ATPaasseks aktiivsuseks on vajalik 40-45 bp pikkune ssDNA ahel. VirB4 võib pärssida VirD4 DNA-st sõltuvat ATPaasset aktiivsust. VirD4 seondub eelistatult nelja järjestikuse G nukleotiidiga. VirD4 on hädavajalik substraadi transpordiks kuid mitte piili biogeneesiks. VirD4 seondub relaksosoomiga ning suunab kompleksi T4SS-i VirB10-ga. Seetõttu on VirD4 nimetatud ka relaksosoomi esitlevaks valguks (T4CP).
Konjugatsiooniks on vajalik relaksosoomi moodustumine ning kinnitumine T4SS-le. T4SS formeerub kahes etapis ning see on seotud erinevate ATPaaside omavahelise seondumisega. Esmalt sünteesitakse sugupiili ning selleks on vajalik VirB11 seondumine VirB4-ga. Arvatakse, et VirB10 luumenis olev vars on piili sünteesi platvormiks. Kui sugupiili on sünteesitud, tunneb adhesiin VirB5 ära retsipientrakus seniteadmata retseptori. Seejärel toimub ATPaaside seondumises muutus, VirB11 ja VirD4 seonduvad ning toimub relaksosoomi esitlemine T4SS-le. Seejärel toimub relaksosoomi lagunemine ning DNA (ning relaksaasi) transport retsipeintrakku. Kuidas täpselt relaksaas T4SS-s transporditakse pole teada.

12.1.3. Relaksosoom

Konjugatsiooni initseerimine toimub bakteri tsütoplasmas, kui moodustub oriT-l (origin of transfer) keerukas valk-DNA kompleks, mida nimetatakse relaksosoomiks. Relaksosoomi moodustumisel on võtmetähtsusega relaksaas (konjugatsioonispetsiifiline endonukleaas), samas mitmed abivalgud võivad abistada oriT äratundmist ja relaksosoomi moodustumist. Relaksosoom koosneb: plasmiidilt kodeeritud relaksaasist, plasmiidilt kodeeritud abivalkudest, plasmiidsest oriT-st ning kromosoomilt kodeeritud IHF-st.
Relaksosoomi moodustumise järel seotakse kompleks VirD4-le, mis esitleb kompleksi T4SS-le. VirD4-ga seondumine on substraadi valikul määrava tähtsusega. Plasmiidsel süsteemil R388 seondub VirD4-ga TrwC ja abivalk TrwA, samas F/R1 plasmiidse süsteemi korral toimub seondumine abivalgu TraM vahendusel. Lisaks on näidatud, et R388 relaksaas TrwC võib seonduda VirD4-ga DNA-st sõltumata. TrwC-l paikneb translokatsiooni signaaljärjestus valgu keskel, mis on transporditavate valkude seas haruldane, sest üldiselt paikneb signaaljärjestus kas N- või C-terminuses.
F/R1-tüüpi ja R388-tüüpi konjugatsiooni relaksosoome on enim uuritud.
Relaksaasid on suured valgud, mil pea kõikidel on fosfodiesteraasne aktiivsus ja DNA-d protsessiv aktiivsus. R388 TrwC relaksaasi N-terminaalne domeen tunneb ära oriT järjestuse, teeb DNA-sse lõike ning seob kovalentselt DNA 5’ otsa katalüütilise türosiini (Tyr18) jäägiga. Pärast lõiget jääb DNA 3’ ots seotud relaksaasiga tugeva mittekovalentse sideme abil. R388 TrwC jääb DNA 5’ otsaga seotuks Tyr amh-jäägi kaudu kuni DNA translokatsiooni lõpuni.
Relaksaasil on helikaasne domeen 5’-3’ suunalise helikaasse aktiivsusega, ATP-st sõltuv. Relaksaasi TraI domeenid ei seondu korraga oriT-le, vaid enne seondub endonukleaasne domeen ja siis helikaasne domeen. F-plasmiidi TraI vajab signaali, mis aktiveeriks autoinhibeeritud TraI helikaasse aktiivsuse. Tõenäoliselt on selleks vaja relaksaasi seondumist T4CP valguga.
Abivalgud R388 plasmiidi korral on relaksaasil TrwC vaja seondumiseks abivalku TrwA, kuigi on näidatud, et TrwC on võimeline iseseisvalt oriT-ga seonduma ning DNA üksikahelalise katke tegema. TrwA seondub oriT-l kahte piirkonda: sbaA-le, mis on tugeva afiinsusega ning sbaB-le, mis on nõrga afiinsusega. SbaA piirkond kattub trwA promootoralaga ning TrwA seondumisega sbaA-le represseerib valk iseenda ekspressiooni.
F/R1 plasmiidi TraM käitub TrwC-ga homoloogselt. TraM-i kristallstruktuur on kindlaks tehtud ning näidatud, et TraM seondub DNA-le tetrameerina. F-tüüpi konjugatsiooni korral on vajalik veel lisavalk TraY, mis seondub oriT-l 2 spetsiifilise järjestusega. TraY tõenäoliselt painutab DNA-d ning aitab DNA ahelaid lahti harutada.
IHF on väike heterodimeerne valk, mida ekspresseeritakse bakteri kromosoomilt. IHF seondub DNA-ga ning painutab seda kuni 160 kraadi. R388 plasmiidi puhul seondub IHF kahele oriT-s asuvale järjestusele ihfA-le ja ihfB-le. Kui TrwA soodustas relaksaasil DNA-sse katke tegemist, siis IHF takistab. Kuidas moodustub oriT relaksaasi ja IHF-i kompleks pole siiani täpselt selge.

13. Bakterite transformatsioon

Bakterite transformatsiooniks nimetatakse bakterite võimet keskkonnast DNA-d „üles korjata“ ning lülitada enda genoomi. Transformatsiooniks pole vajalik rakk-rakk kontakt ega muul moel aktiivselt DNA-d esitleda rakkudele. Erinevalt konjugatsioonist initsieerib transformatsiooni retsipientrakk. Bakteripopulatsioonis on transformatsiooniks võimelised ainult teatud tüüpi bakterirakud, mida nimetatakse (transformatsiooniks) kompetentseteks rakkudeks.
Eristatakse bakterirakkude natiivset ehk looduslikku ja kunstlikult saavutatud kompetentsust. Looduslikes populatsioonides on osa rakke kompetentsed ning võimelised vastu võtma võõr-DNA-d. Kunstlikult saavutatakse rakkude kompetentsus keemiliselt rakke töödeldes, sundides rakke DNA-d vastu võtma. Ainult osa bakteriliike on natiivselt kompetentsed, kuigi selliseid rakke on nii G(+) kui G(-) bakterite hulgas. Bakterite transformatsioon on teada ainult eubakteritel, arhedel pole transformatsiooni siiani kirjeldatud. Tõenäoliselt bakterite transformatsiooni pole arhedel siiani põhjalikult uuritud.
Kompetentsete rakkude ilmumine looduslikku bakteripopulatsiooni sõltub bakterite füsioloogilisest seisundist ning on mõjutatud toitainete kättesaadavusest, pH-st, feromoonidest, antibiootikumistressist ning rakutihedusest. See tähendab, et kompetentsus on vastuseks keskkonnatingimuste muutumisele ning geneetiliselt reguleeritud. G(+) bakterid reguleerivad kompetentsust ekstratsellulaarsete peptiididega, mida nimetatakse ka kompetentsusferomoonideks.
Kompetentsus on bakteritel erinevalt reguleeritud. Näiteks Staphylococcus pneumoniae muutub kompetentseks enne kasvu aeglustumist (enne statsionaarset faasi), samas kui Bacillus subtilis muutub kompetentseks hilises statsionaarses faasis. Samas Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori ja Neisseria gonorhoeae on alati looduslikult kompetentsed ning valmis DNA-d rakku võtma.
Transformatsiooni etapid võib jagada kaheks:

DNA kinnitumine rakule ja sisenemine rakku

DNA inserteerumine bakteri genoomi

13.1. Transformatsiooni esimene etapp – DNA kinnitumine rakule, sisenemine rakku

DNA fragmenteerimine. G(+) liikidel frgamenteerivad endonukleaasid dsDNA enne kinnitumist rakkudele juppideks. B. subtilis’e korral lõigatakse DNA u 18 kbp pikkuseks , S. pneumonia ’l u 6 kbp pikkuseks. B. subtilis’el on raku pinnal u 50 DNA kinnitumise kohta, S. pneumonia’l 33-75.
DNA kinnitumine. Kuigi rakuga seondub ainult dsDNA, siis rakku transporditakse ssDNA. B. subtilis’el kestab seondumine 1 – 1,5 minutit, mille järel DNA pole enam nukleaasidele kättesaadav. Rakku kandumise kiirus on 180 bp/s ning DNA ahelat võib transportida nii 5’ -> 3’ kui ka 3’ -> 5’ suunaliselt. S. pneumonia’l toimub protsess sarnaselt, rakku transportimise kiirus on 90 – 100 bp/s 31 C juures, kuid DNA siseneb rakku ainult 3’ -> 5’ suunaliselt.
G(-) bakteritest on enim uuritud Haemophilus influenzae’t ja Neisseria gonorrhoeae’t. Neil bakteritel on leitud järjestusi, mis on vajalik DNA üleskorjamiseks keskkonnast. Enamasti on tegemist pöördkordusjärjestustega geenide vahelises piirkonnas. H. influenzae’l on nimetatud järjestused 29 bp pikkused ning DNA transport rakku toimub kiirusega 500-1000 bp/s. Rakul on 4-8 DNA seondumisjärjestust. N. gonorrhoeae fragmneteerib tsirkulaarsed DNA-d ning liidab rakus need uuesti kokku rõngasmolekuliks.
G(-) bakteritel esineb transformosoom, mis on DNA ühte ahelat lagundav valguline struktuur raku pinnal. Rakku transporditakse ainult ssDNA 3’ -> 5’ suunaliselt. Transport ja teise DNA ahela lagundamine toimub samaaegselt.
Nii G(+) kui G(-) bakteritel on DNA kinnitumine rakule väga sarnane, erinevus seisneb ainult selles, et G(-) bakteritel peab DNA läbima lisaks raku välismembraani. G(-) bakterites läbib DNA välismembraani kasutades PilQ sekretiini kanalit. G(-) bakterid kasutavad DNA välismembraanist ja peptiidoglükaankihist läbiviimiseks tüüp 2 sekretsioonisüsteemi või tüüp 4 piilisid. Siiski piilide täpne roll transformatsioonis on jäänud ebaselgeks. G(+) bakteritel on pseudopiilid, mis täidavad G(-) bakterite piilidega sama rolli. G(+) pseudopiilisid kodeerivad comG operoni geenid ning ComGC on peamine piliin. Transformatsioonipiili on hädavajalik dsDNA kinnitumiseks ja transformatsiooniks. Arvatakse, et nii G(+) kui ka G(-) bakterid kasutavad transformatsioonipiilisid selleks, et tuua ekstratsellulaarne dsDNA retseptorini ComEA.
DNA sisenemine rakku. Tõenäoliselt esitleb ComEA dsDNA nukleaasile, mis lagundab dsDNA üheahelaliseks, sisestamaks DNA-d rakku. S. pneumonia’l on nukleaasiks EndA, mis lagundab DNA üheahelaliseks ning suunab ComEC kaudu ssDNA rakku. Teistel bakteritel pole EndA ortolooge siiani suudetud tuvastada. Lisaks on näidatud, et ComEA on G(+) bakteritel transformatsiooniks hädavajalik, samas kui ComEC pole. ComEC ortolooge on leitud kõigist looduslikult transformeeruvatest bakteriliikidest. ComFA on ATPst sõltuv translokaas, mis tagab ssDNA sisenemise rakku.

13.2. Transformatsiooni teine etapp – võõr-DNA integreerimine genoomi

Üheahelaline DNA initseerib kõigis bakterites homoloogilise rekombinatsiooni, seega rakku sisenenud ssDNA on ideaalne materjal homoloogiliseks rekombinatsiooniks. Homoloogilist rekombinatsiooni läbi viiv RecA valk vajab rekombinatsiooniks abivalke, mis seonduks ssDNA-ga ning aitaks rekombinatsiooni läbi viia. S. pneumoniae’l on selliseks valguks DprA (DNA processing protein A). DprA ortoloogid on levinud kõigil loodusliku transformatsioonivõimega bakteritel ning bioinformaatilised uuringud on näidanud, et DprA ja ComEC ortoloogid on evolutsioneerunud koos. RecA polümeriseerub ssDNA-l ning algab homoloogia otsimine bakteri kromosoomist, millele järgneb DNA ahela vahetus. Võõr-DNA võib olla täiesti homoloogne retsipiendi kromosoomiga või mõnes osas erineda. Kui võõr-DNA pole metüleeritud, siis see DNA osa jääb pärast replikatsiooni metüleerimata ning restriktaasid võivad DNA-sse katkeid teha, mis võib bakteri tappa. Sedasi pärsitakse liiga erineva võõr-DNA sisenemist genoomi.

13.3. Transformatsiooni tähtsus bakteritele

Transformatsiooni käigus ei võeta fülogeneetiliselt väga kaugete liikide DNA-d rakku. Üldjuhul toimub sama liigi või lähedaste liikide DNA liitmine bakteri genoomi. Mõnikord initsieerivad kompetentsed rakud ise liigikaaslaste lüüsi ning DNA vabanemise. Nt S. pneumoniae puhul lüüsivad kompetentsed rakud mittekompetentsete rakkude peptiidoglükaankihti ning sellega põhjustavad bakterirakkude lüüsi.
1. Võimaldab rekombinatsiooni ning välja vahetada defektseid geene. Selleks on vaja liigile sarnast DNA-d.
2.Võimaldab omastada uusi geene, mis aitavad hakkama saada stressitingimustega.
3.DNA-d võib kasutada toiduks.

13.4. Bakterite kunstlik transformatsioon

Tänapäeval on bakterite transformatsioon tavaline laborimetoodika, konstrueerimaks uusi DNA-vektoreid või bakteritüvesid. Kuigi bakterite transformatsioon on lihtne ja levinud metoodika, määrab transformatsioon paljuski ära, milliseid baktereid tänapäeval uuritakse. Bakterid, mida ei saa kunstlikult kompetentseks muuta, on üldiselt jäetud uurimise alt välja.
Transformatsiooni efektiivsuseks nimetatakse transformantide arvu 1 g DNA kohta. E. coli puhul kasutatakse transformatsiooniefektiivsuse arvutamiseks pBR322 DNA-d. Transformatsiooni võivad takistada retsipientraku restriktaasid, mis tunnevad erinevalt metüleeritud DNA-d ära ning lõikavad transformeeritud DNA tükkideks. Selle vältimiseks kasutatakse metülatsioonidefektseid või restriktaaside defektseid tüvesid.
Kunstlik kompetentsuse tekkimine on üsna segane ning sõltub bakteri liigist, puhvrist ning bakterite kasvatamisest. Sellest johtuvalt pole leitud universaalset metoodikat kõigi bakterite jaoks, vaid levinud metoodikaid kohandatakse iga liigi jaoks eraldi, otsides parimaid tingimusi. Kunstliku transformatsiooni korral on vaja leida balanss bakterite ellujäämise ja vigastamise vahel. Baktereid on vaja vigastada, et DNA pääseks rakku, samas on oluline, et vigastused poleks letaalsed ning bakterid toibuksid transformatsioonist. Kõik faktorid, mis tõstavad ellujäämist, vähendavad vigastamist, ning vastupidi. Sellest johtuvalt on palju juhuslikkust ning laboriti võivad transformatsiooni täpsed protokollid erineda.
Peamiseks takistuseks bakterite transformatsiooniks laboris on rakukest, mille tõttu ei pääse DNA rakku. Kui loodusliku kompetentsuse korral tekib rakku valgukompleks, mis võtab DNA-d vastu ja viib rakku, siis kunstliku kompetentsuse korral on tegu rakumembraanide ja peptiidoglükaankihi lõhkumisega väikeste pooride tekkimise näol. Sellest johtuvalt on G(+) bakteritel kunstlik kompetentsus raskemini saavutatav ning transformatsioonisagedus madalam.
Üldiselt võib jagada kunstliku transformatsiooni kolmeks etapiks:

rakkude ettevalmistamine. Selles etapis on oluline rakkude kasvukiirus ( millisest kasvufaasist kompetente tehakse), temperatuur ja puhvri koostis.

mikropooride tekitamine ning DNA sisenemine rakku. Levinuim meetod on temperatuurišokiga või elektriga rakkude mõjutamine

bakterite toibumine šokist. Selles etapis on kõik metoodikad sarnased, rakke kasvatatakse rikkal söötmel bakteri kasvu temperatuurioptimumil.
Klassikaline ja ka kõige levinum meetodika kunstlike kompetentside saamiseks on rakkude mõjutamine kahevalentsete metalliioonidega. Selliste kompetentide trasformatsiooni nimetatakse keemiliseks transformatsiooniks, mis kirjeldati 1970. aastal. Transformatsiooniefektiivsus 105 – 109 CFU/1 g DNA kohta. Kuigi keemiline transformatsioon on ammu teada ja väga levinud, siis täpset mehhanismi, kuidas DNA rakkudesse transporditakse, pole teada. Arvatakse, et DNA transport on kaheetapiline. Esimeses etapis toimub DNA passiivne kinnitumine raku välismembraani liposahhariididele Ca-ioonide vahendusel. Järgnev temperatuurišokk tagab aktiivse transpordi rakku.
Baktereid kasvatatakse ette tavaliselt rikkal söötmel teatud kasvufaasi. E. coli rakke kasvatatakse kuni kesk- logaritmilise faasini (OD 0,4), mil on rakud kõige kergemini muudetavad kompetentseteks. Samuti on oluline rakkude tihedus kompetentide lahuses. Üldiselt, mida rohkem rakke on lahuses, seda kõrgem on transformatsiooniefektiivsus. E. coli puhul peetakse optimaalseks 107-108 rakku 1 ml kohta. Mõnel bakteriliigil suurendab ettekasvatamise temperatuuri langetamine bakterite kompetentsust, näiteks E. coli puhul on transformatsiooniefektiivsus kõrgem, kui rakke kasvatati ette 18 – 30 C juures.
Sellele järgneb rakkude hoidmine jääl transformatsioonipuhvris. Tõenäoliselt on jääl hoidmine vajalik rakumembraani voolavuse vähendamiseks, sest on leitud, et vähemvoolavate membraanidega bakteritel tekivad mikropoorid paremini. Sel ajal lisatakse ka DNA ning DNA kinnitub passiivselt rakumembraanile. Ettekasvatatud rakud võetakse üles 0 – 4 kraadises transformatsioonipuhvris, mille koostis varieerub väga tugevasti. Keemilise transformatsiooni puhul on oluline, et puhver sisaldaks kahevalentseid metalliioone, elektroporeerimise korral on oluline lahuse isotoonilisus . Üldiselt kasutatakse keemilise transformatsiooni korral lahuses Ca2+ ja/või Mg2+ ioone muutmaks bakterirakke kompetentseks. On leitud, et kahevalentsed metallioonid mõjuvad kompetentsuse tekkimisele erinevalt ning on välja selgitatud pingerida, millised metallid paremini mõjuvad.
Mn2+ > Ca 2+ > Ba2+ > Sr2+ > Mg2+
Teatud ühevalentsed metallioonid suurendavad kompetentsuse teket, kui neid lisada kahevalentsete metalliioonide lahusesse. Sellised metallioonid on: Cs+, Na+, Li+, K+ ja Rb+
Puhvris tuleb leida konkreetse liigi jaoks optimaalne metalliioonide kontsentratsioon, sest nii madalamal kui ka kõrgemal kontsentratsioonil optimaalsest vähendavad metallioonid transformatsiooniefektiivsust. E. coli transformatsiooni puhul peetakse optimaalseks 10 mM Ca2+ ja 40 mM Mn2+. Nõrgalt happeline puhver soodustab transformatsiooni. Soodustab ka DMSO lisamine puhvrisse. Keemilise transformatsiooni puhul järgneb rakkude töötlemine kõrge temperatuuriimpulsiga, mille ajal arvatavasti tekivad rakukesta mikropoorid ning DNA transporditakse aktiivselt rakku. E. coli transformatsiooni ajal hoitakse rakke 37 – 42 kraadi juures 0,5 – 3 minutit. Optimaalseks peetakse 42 kraadi ja 0,5 minutit.
Temperatuurišokile järgneb rakkude hoidmine 2-5 minutit jääl ning kasvatamine rikkal söötmel kasvuks temperatuurioptimumi juures.
Grampositiivsete bakterite korral vähendatakse rakukesta muralüütiliste ensüümidega või EDTA lisamisega transformatsioonipuhvirsse. Tekitatakse nn sfäro- või protoplastid – elusad rakud, mille peptiidoglükaankiht on nõrgendatud nii, et tekivad sfäärilised rakud. G(+) bakterite puhul on oluline, et transformatsioonipuhver oleks isotooniline. Streptococcus faecium’i korral suurendab sfäroplasti teket 80 mM NaCl lisamine, Lactobacillus lactis ’el saadakse sfäroplastid -amülaasi lisamisel. Mõnikord lisatakse G(+) bakterite söötmesse penitsilliini või glütsiini, mis samuti vähendavad peptiidoglükaanikihi tugevust. Bakterite söötmetesse ettevalmistamise ajal on lisatud veel isonikotiinhappe hüdroasiidi (isoniatsiin, nt Streptomyces sp., Bacillus sp. Streptococcus sp., Clostridium sp.) või sahharoosi koos glütsiiniga (Lactobacillus lactis). Igal juhul on oluline vältida rakkude täieliku lüüsi.
DNA. Üldiselt on DNA suurus ja transformatsiooniefektiivsus pöördvõrdelised. Mida väiksem on plasmiid, mida tahetakse transformeerida, seda efektiivsemalt see toimub. Erandiks paistab olevat E. coli, mis näib võtvat suuremaid plasmiide paremini sisse kui väikeseid. Transformatsiooniefektiivsus sõltub DNA puhtusest. Mida puhtam on DNA, seda kõrgem on transformatsiooniefektiivsus. Samuti on DNA hulk ja transformatsiooniefektiivsus omavahel võrdelises sõltuvuses, kuni DNA-ga küllastumiseni, millest efektiivsus enam ei suurene. Mõnel bakteril, nt Bacillus subtilis, on oluline DNA topoloogia. Superspiraliseeritud DNA annab kõrgema transformatsiooniefektiivsuse kui lineariseeritud DNA. Samas Pseudomonas putida’l seda pole täheldatud.
Elektroporeerimiseks nimetatakse bakterite transformatsiooni elektri abil. Üldiselt efektiivsem kui keemiline transformatsioon. Transformatsiooniefektiivsus 105 – 1010 CFU/1 g DNA kohta. Ettekasvatatud rakkudele, mida on eelnevalt töödeldud, antakse lühiajaline elektriimpulss , mis polariseerib rakud ning teatud väärtusest põhjustab polariseeritus mikropooride teket rakukesta. Nendest mikropooridest lähevad rakku sisse laenguga molekulid nagu DNA. Mikropoorid tekivad nanosekundite jooksul ning need parandatakse sekundite jooksul.
Rakkude ettekasvatamisel on oluline kasvufaas . E. coli rakud on elektroporeerimisele vastupidavamad logaritmilise faasi lõpus, samas hilises kasvufaasis väheneb rakkude võime muutuda kompetentseks. Lactobacillus lactis, Pseudomonas putida korral tehakse kompetentseid rakke statsionaarse faasi rakkudest. Bacillus cereus , Bacillus thuringiensis aga varajasest logaritmilisest faasist.
Elektroporeerimise korral on oluline, et kompetentseid rakke pestaks korralikult enne elektroporeerimist, sest kõrge ioonjõud vähendab elektroporeerimise efektiivsust. Elektroporeerimise puhver on üldjuhul isotooniline, vältimaks rakkude lüüsi pärast elektriimpulssi. Nt 10 % glütserool või 300 mM sahharoos on piisav vastavalt E. coli ja Pseudomonas putida efektiivseks elektroporeerimiseks.
Elektroporeerimine toimub üldjuhul madalal temperatuuril. Nt E. coli rakke peab ette valmistama jääl, samas kui Pseudomonas putida korral pole ettevalmistamistemperatuur oluline. Erinevalt keemilisest transformatsioonist vähendab rakkude kõrge kontsentratsioon elektroporeerimise korral transformatsiooniefektiivsust, sest rakkude pind võib tõsta ioonjõudu.

13.5. Teised metoodikad bakterite kunstlikuks transformatsiooniks

Külmutamine- sulatamine . Bakterid külmutatakse -80 – -196 kraadi juures ning sulatatakse 42 kraadi juures üles. Ebaefektiivne, transformatsiooniefektiivsus u 103 CFU/1 g DNA kohta.
Sonikeerimine. Bakterite rakukest lõhutakse ultraheliga. Kasutatakse 40 kHz. Tavaline metoodika taimerakkudesse võõr-DNA viimiseks . Edu on saavutatud E. coli ja Pseudomonas’te liikidega.
DNA kandja külge sidumine. Kasutatakse fosfolipiide, kulda, polüsahhariide (chitosan) DNA sidumiseks ning rakku viimiseks. Kandjaid kasutatakse teiste meetoditega ühendatult.

14. Biofilm

Biofilmiks (ka katuks, biokileks jne) nimetatakse struktureeritud mikroorganismide kogumit, mis on kinnitunud kas elutule või elusale pinnale mikroorganismide endi toodetud polümeerse maatriksi abil. Samas, biofilm võib moodustuda ka vedeliku ja õhu piirpinnale. Biofilmi moodustamist peetakse prokarüootide loomulikuks kasvuviisiks looduses, mis võimaldab neil toime tulla ebasoodsate keskkonnatingimustega. Biofilmi võib leida looduses kõikidelt pindadelt, mis on piisavalt niisked ja toitainerikkad. Näiteks nii liikuva veega veekogude põhjas olevatelt kividelt kui seisvate veekogude pinnalt. Biofilme leidub isegi Yellowstone rahvuspargi eriti kuumades ja happelistes veekogudes ning Antarktika jääliustikel, rääkimata taimede, loomade, inimeste kudedest.
Biofilmi moodustamine on tavaline nii arhede kui bakterite seas. Sellest, et tegemist on iidse protsessiga, mis tagas prokarüootide ellujäämise Maa algusaegadel valitsenud karmides tingimustes, annavad tunnistust fossiilsed leiud. Austraalia (Pilbara Craton) süvamere hüdrotermaalsetelt kaljudelt pärinevate fossiilsete leidude põhjal järeldati, et biofilmi oli olemas juba 2,7 miljardit aastat tagasi. Sarnaseid biofilmi struktuure võib leida ka tänapäeva hüdrotermaalsetest keskkondadest, nagu nt kuumaveeallikad ja süvamere hüdrotermilised lõõrid. Ürgaegkonnas võimaldas biofilm prokarüootidel tekitada enda ümber kaitsev, homostaatiline keskkond, mis kaitses füüsikaliste tingimuste suurte kõikumise eest algsel Maal (ekstreemsed temperatuurid, pH ja UV-kiirgus).

12.1. Biofilmi uurimise ajalugu

Biofilmi esimeseks uurijaks oli Antonie van Leeuwenhoek , kes 1674 . aastal kirjeldas oma algelise mikroskoobiga hambakatus elavaid nn väga väikeseid animalculi’eid. Esimene teaduslik artikkel bakterite biofilmi moodustamisest avaldati 1933. aastal. Artikli autor Henrici väitis, et ilmselgelt pole vees leiduvad bakterid vabalt ringi ujuvad organismid, vaid kasvavad hoopis kinnitunult veealustel pindadel (Henrici AT 1933, J Bact.). Veel isegi 1987. aastal kujutati biofilmi kui maatriksi plaati, milles liikumatud bakterid paiknevad enam-vähem juhuslikult üle kogu maatriksi. See tulenes preparaadi eelnevast töötlemisest, kui töötlemise ajal rakud tahtmatult tapeti . Sellest johtuvalt hävisid elusate rakkude biofilmi struktuurid ega osatud vastata küsimusele, kuidas maatriksi sügavustesse sukeldunud bakterirakkudel on ligipääs toitainetele ja hapnikule. Alles 1990. aastate alguses, koos uue mikroskopeerimise tehnika tulekuga, suudeti välja selgitada biofilmi struktuur. Esimesed skanneeriva lasermikroskoobiga (SCLM) tehtud pildid elusast biofilmist näitasid, et biofilmid on mikroorganismide kõrgelt organiseeritud struktuurid, mis oma kujult meenutavad seeni ning mille eksopolüsahhariidsest maatriksis paiknevad rakud on ümbritsetud avatud veekanalitega. Veekanaleid läbiv vesi varustab biofilmi sügavamates kihtides paiknevaid rakke toitainete ja hapnikuga ning samas tagab ka rakkude elutegevuse käigus vabanevate jääkainete eemaldamise. Seega kaasaegse biofilmi uurimise ajajärk algas alles 1990. aastate alguses.
Biofilmi uurimiseks kasutatavad metoodikad. Selleks, et biofilmikatsed oleks erinevates laborites reprodutseeritavad, kasutatakse biofilmi uurimiseks põhiliselt 3 erinevat metoodikat, mis enamasti täiendavad üksteist.
1.Staatilised metoodikad. Nt mikrotiiterplaadi-biofilm – mikrotiiterplaadi kannudes olev sööde inokuleeritakse ja plaati inkubeeritakse termostaadis. Biofilmi visualiseerimiseks värvitakse järgneval päeval plaadi kannude seintele moodustunud biofilm kristallvioletiga. Kolooniad tardsöötmel. Tardsöötme pinnale tekkinud struktureeritud bakterikogumikud ehk kolooniad varieeruvad ulatuslikult oma morfoloogialt. Elektronmikroskoobi pildid näitavad muutust kolooniate pinnas, mis tuleneb muutusest maatriksi komponentides. Vedelsöötme pinnale tekkiv biofilm – bakterikultuuriga inokuleeritud ja üleöö seisma jäetud söötmete vedelik-õhk piirpinnale moodustuva biofilmi (pellicle) jälgimine.
2.Dünaamilised metoodikad, mikrokosmid. Läbivoolukultuuri biofilm – klaastorudes teatud kiirusega voolav sööde inokuleeritakse ja jälgitakse konfokaal-skanneeriva lasermikroskoobiga (CSML) biofilmi moodustumist. Mikrokosmides püütakse jäljendada keskkonda, kus bakter elab. Nt suudetakse jäljendada epidermist, mitmeid sisekudesid ning hambaemaili.
3.Loomkatsed. Selleks, et aru saada bakterite patogeneesist, sealhulgas biofilmi kujunemisest, kasutatakse biofilmi uurimiseks siiani loomi, sest mikrokosmides pole võimalik luua reaalseid tingimusi, mis on organismis.

12.2. Biofilmi tähtsus bakterile

Biofilmi eelised:

Biofilmi moodustamine võimaldab jääda eelistatud nišši. Kuna pindadele koguneb rohkem toitaineid, siis biofilmi moodustamine toitaineterikastele pindadele nagu näiteks loomsetele kudedele või kivide pinnale ojades, tagab bakterite püsimise kohas kus toitaineid on külluses või kus toitanete varud täienevad aeg-ajalt.

Biofilm on prokarüootide üks kaitsemehhanismidest. Looduslikes tingimustes kaitseb biofilm baktereid mitmete füüsikalis-keemiliste stressi eest, nagu näiteks UV kiirguse, temperatuuri järskude muutuste, metallide ja hapete toksiliste efektide eest, oksüdatiivse stressi, kuivamise ja biotsiidsete ühendite eest. Samuti on biofilm looduses osaliseks kaitseks bakterimaailma „kiskjate“ eest, nagu näiteks algloomade (nt amööb), bakterisööjate bakterite (nt Bdellovibrio spp.) ja bakteriofaagide eest. Biofilmid peavad vastu nii füüsikalistele jõududele, nt voolu tugevusele voolavates veekogudes, kui ka loomorganismide immunsüsteemi fagotsüütidele, ja toksilistele ühenditele (antibiootikumid ja antimikroobsed ühendid ei suuda biofilmi sügavamatesse kihtidesse tungida ).

Biofilm võimaldab prokarüootidel paikneda üksteise vahetus läheduses, mis on oluline erinevateks rakkudevahelisteks interaktsioonideks nt signaalmolekulide vahendusel sotsiaalse käitumise reguleerimine hulgatunnetusega, geneetilise materjali vahetus, katalüütiliste funktsioonide ehk tööjõu jagamine biofilmisiseselt (nt tselluloosi lagundamise erinevates etappides osalevate erinevate mikroorganismide kõrvutipaiknemine).

14.3. Biofilmi struktuur ja moodustumine

Biofilm võib moodustuda erinevatele niisketele abiootilistele ja biootilistele pindadele kas ühe bakteriliigi esindajatest või mitmest erinevast liigist. Kuigi erinevatest liikidest koosnevad biofilmid domineerivad looduslikes keskkondades, siis ühest bateriliigist koosnevaid biofilme leidub erinevates loomorganismide põletikukolletes ja inimese meditsiinilistel implantaatidel.
Üheks põhiliseks biofilmi kuju ja struktuuri määravaks teguriks on biofilmi rakkude toodetud eksopolüsahhariidne maatriks (EPS), mille koostis on sama varieeruv kui biofilmi koosluski. Nii nagu looduslikud biofilmid võivad olla väga heterogeensed oma liigiliselt koostiselt, varieerub ka biofilmi arhitektuur ja kuju, sõltuvalt keskkonna erinevate füüsikalis-keemiliste tegurite koostoimest. Näiteks kivile kinnitunud filamentse kujuga biofilm voolavas ojas erineb oluliselt hamba pinnale tekkinud lamedakujulisest biofilmist e hambakatust. Kuna biofilm sõltub paljudest teguritest, siis pole võimalik välja tuua biofilmi kindlat struktuuri, mis oleks universaalne. Biofilm võib varieeruda suhteliselt ilmetust, tasapinnalisest struktuurist kuni üksteisest veekanalitega eraldatud keerukate seenekujuliste agregaatideni.
Siiski on iseloomulik biofilmile bakteriliigile spetsiifiline mikrokeskkond , mille pH, toitainete ja hapniku kättesaadavus on määratud ümbritsevate rakkude ja veekanalite lähedusega ümbritsevas EPS-i maatriksist.
Biofilmi moodustumises eristatakse 3 etappi:
1. Kinnitumine Lühiajaline kinnitumine – niiskele pinnale kinnitunud bakterirakud on võimelised mööda pinda liikuma, kas piilide või viburite abil. Samas, enamik selles etapis olevatest rakkudest võivad irduda pinnalt ning muutuda planktiliseks.
Pinnaga esmase kontakti loomisel toimuvad geeniekspressioonis ulatuslikud muutused, mis kajastuvad bakteri fenotüübis. Näiteks Proteus mirabilis tunnetab pinnale kinnitumist viburi pöörlemise takistatuse kaudu (vibur on mehhanosensoriks). Seejärel vallandub rakus signaalikaskaad, mille tulemusena lühikeste ja väheste viburitega liikuvast peritrihhist areneb 20-40 korda pikem, mitmete kromosoomidega ning enam kui 50 korda viburirikkam, P. mirabilise voogav rakk. Sellised voogavad rakud hõivavad vaba pinna. Näiteks pärast esmast kinnitumist hõivavad Proteus mirabilise voogavad rakud meditsiinilise kateetri pinna. Pseudomonas aeruginosa morfoloogia muutub pärast esmast kinnitumist, voogavatel rakkudel on teistsugune morfoloogia (pikenenud, ühe polaarse viburi asemel omavad kahte) kui planktilistel rakkudel.
Jääv kinnitumine. Vastusena keskkonnast tulevale signaalile pärsitakse osadel voogajatel liikumine ja indutseeritakse eksopolüsahhariidide süntees, mis omakorda aitab tugevamalt pinnale kinnituda. Paljudes bakteriliikides on rakusisese signaalmolekuli tsüklilise di-GMP (c-di-GMP) tase oluliseks lülitiks 2 erineva eluviisi vahel. Suurem rakusisese c-di-GMP tase pärsib liikuvust ja virulentsust ning soodustab biofilmi teket. C-di-GMP sünteesitakse diguanülaattsüklaaside abil (GGDEF domääniga valgud) ning lagundajateks on spetsiifilised fosfodiesteraasid (enamasti EAL-domääniga valgud). Paljudel neist valkudest on ka periplasmaatiline või tsütoplasmaatiline sensormoodul, mille vahendusel füsioloogilised ja/või keskkonna signaalid mõjutavad c-di-GMP kas üldist või lokaalset taset rakus.
Mikrokoloonia moodustumine– pinnale kinnitunud ning eksopolüsahhariide tootva raku klonaalse paljunemise tulemusena tekib mikrokoloonia.
2. Küps biofilm – mikrokoloonia areneb biofilmiks, mille limamaatriksis paiknevad nii rakud kui ka avatud veekanalid struktureeritult. Mikrokolooniast biofilmi moodustumisel on oluline osa bakterite hulgatunnetamisel (quorum sensing). Näiteks ramnolipiidide ajaliselt reguleeritud ekspressioon Pseudomonas aeruginosas. Suuremas kui 20 µm-s P. aeruginosa mikrokoloonias lülitatakse hulga tunnetuse vahendusel sisse ramnolipiidide süntees, mis soodustab nii mikrokoloonia arengut, seenekujuliste struktuuride teket biofilmis, veekanalite püsimist avatuna biofilmi maatriksi küpsemise käigus, kui ka P. aeruginosa irdumist biofilmist.
3. Biofilmist irdumine /biofilmi lagunemine – kõige vähem uuritud etapp. Arvatakse, et tegemist on reguleeritud levimisstrateegiaga, mis võimaldab uute niššide koloniseerimist enne toitainete limiteerivaks muutumist biofilmis. Näiteks on täheldatud, et mikroobide kasvamise käigus ärakasutatud söötmed indutseerivad rakkude irdumist samaliigilisest biofilmist (näidatud nii Pseudomonas fluorescensi kui P. aeruginosa puhul).
Perioodiline biofilmist irdumine võib olla:
1) aktiivne protsess, mille käigus rakud vabanevad biofilmist üksikute planktiliste rakkudena. Osadel bakteriliikidel (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis jt) on täheldatud biofilmi keskse osa muutumist vedelaks ja liikuvate planktiliste rakkude lahkumist , jättes endast biofilmi haigutava augu . Biofilmi keskse osa vedeldumise põhjuseks arvatakse olevat profaagi aktivatsioonist põhjustatud osaline rakupopulatsiooni lüüs.
2) passiivne protsess, mille käigus biofilmist vabanevad EPS-ga ümbritsetud rakkude agregaadid. Rakuklompide vabanemise põhjusteks võivad olla nii muutused keskkonnategurites (nt veekogu voolutugevuse muutus) kui ka biofilmisisestes protsessides. Näiteks bakterite eritatud ensüümid lagundavad EPS-i.
Nii biofilmist vabanenud üksikrakud kui ka rakuklombid võivad uutes toitaineterikastes kohtades uuesti kinnituda ja alustada uut biofilmi moodustumise protsessi.

14.4. Biofilmi moodustumiseks vajalikud polümeerid

Amüloidpiilid on valgulise koostisega polümeerid, mis katavad bakteri välispinna. Amüloidid võivad koosneda erinevatest valkudest, kuid nad kõik on vees lahustumatud ning vastupidavad enamikele ensüümidele ning keemilisele töötlemisele. Amüloidid on bakteri jaoks olulised rakuvälised struktuurid, mis kaitsevad bakterit mitmete väliskeskkonnategurite eest. Amüloidid katavad spoore, käituvad tsütotoksiinidena ning on olulised bakterite adhesioonil ning biofilmi moodustumisel.
Amüloidpiilide abil seonduvad enterobakterid ja pseudomonased mitmete maatriksitega k-a eukarüootide membraanile ning on olulised biofilmi algetappidel, kui toimub üleminek lühiajalisest kinnitumisest pöördumatule kinnitumisele.
Amüloidpiilid assambleeritakse rakuvälises ruumis, ning on biofilmi moodustumisel patogeensetel enterobakteritel olulised maatriksi komponendid. Amüloidpiilid koosnevad mitmetuhandest subühikust, mille ehituses on 5 -lehte kuju tekkimisel määrava tähtsusega.
Tabel 1. Amüloidpiilide mõned näited.
organism
I operon
II operon
Escherichia coli
csgBA
csgDEFG
Curli
Salmonella typhimurium
agfBA
agfDEFG
Taf ( Thin aggregative fimbrae)
Pseudomonas
fapABCDEF
Erineb enterobakterite geenidest, kuid põhimõte assambleerumiseks sama. Üks operon, mis on indutseeritav , kuid ei vasta samadele stiimulitele kui csg ja agf süsteemid.
E. coli’l on CsgA (FapA) põhiline amüloidpiili subühik. CsgB (FapB) ankurdab assambleeruva amüloidpiili rakule. Selle puudumisel sekreteeritakse CsgA rakust välja ning piili assambleerub sellise raku pinnale, millel on CsgB olemas. Interbakteriaalset assambleerumist on kirjeldatud E. coli’l (toimub mõne millimeetri kauguselt). Salmonella typhimurium’il seda kirjeldatud pole, mis viitab alternatiivsele rajale.
Geeni csgD produkt aktiveerib csgBA transkriptsiooni, aktivatsiooniks vajalik CsgD fosforüleerimine. Geeni csgD transkriptsioon sõltub temperatuurist. Madal temperatuur (alla 30 kraadi) soodustab transkriptsiooni. Mutatsioonid promootoralas võivad temperatuurist sõltuva transkriptsiooni kaotada.
Tabel 2. Teadaolevad transkriptsiooniregulaatorid, mis reguleerivad csg operone enterobakterites.
Regulaator
PcsgBA
PcsgDEFG
CsgD
aktivaator
OmpR/EnvZ
aktivaator
RpoS
aktivaator
(nii otse kui kaudselt)
Crl
aktivaator
(osades tüvedes ei mõjuta)
CpxA/R
repressor
repressor
(kahekomponendiline regulaatorsüsteem, aktiveerub välismembraani stressi korral, mõjub amüloidpiilide sünteesile negatiivselt, võtab sünteesi biofilmi küpsedes maha, reguleerib ka CU piilide ekspressiooni – degradeeritakse valesti pakitud subühikud periplasmas)
Rcs
repressor
repressor
(vajalik biofilmi tekkeks, vt eelmist)
IHF
aktivaator
H-NS
aktivaator/repressor
(S. t. positiivselt, E. c. K12 negatiivselt)
csgG - välismembraani lipoproteiin, vajalik CsgA ja CsgB sekretsiooniks
csgE – periplasmaatiline seondub CsgG-ga ning oluline normaalse amüloidpiili formeerumiseks
csgF – periplasmaatiline, seondub ka CsgG-ga, kuid rakk moodustab mõningaid amüloidpiilisid, fenotüüp sarnaneb csgB- fenotüübiga
Curlisid ekspresseeritakse enterobakterites madalal temperatuuril soolavaeses keskkonnas (N, P ja Fe).
CU-piilid (chaperone-usher) ehk fimbriad on biofilmi moodustumisel olulised adhesioonimolekulid. CU-piilid jaotatakse 6 klaadi, mis omakorda jagunevad alarühmadeks. CU (chaperon-usher) piilid transporditakse periplasmasse ning polümeriseeritakse välismembraanis asuva värativalgu (ingl k usher) abil pikaks mitteharunenud polümeeriks. Silinderjas polümeer võib küündida kuni 2 mikromeetri pikkuseks. CU-piilide hulka kuuluvad nii P-piilid kui ka tüüp 1 piilid, mõlemad kirjeldatud uropatogeensel E. coli’l. CU-piilide põhiosa koosneb umbes 1000 piliini subühikust, mis kinnitub välismembraanile. Piliini raskus 12-20 kDa.
Enterobakteritel P-piili (Pap valgud) ja tüüp I piilid (Fim valgud) on suhteliselt sarnase ehitusega, kuid tüüp I piilid on tipust lühema ja lihtsama valgukompleksiga ja neil pole teada ankurvalke. P-piili ehitus tipust bakteri välismembraani poole: PapG (adhesiin), PapF ( adapter ), 5-10 molekuli PapE-d, umbes 1000 molekuli PapA (piili põhivalk, piliin), PapK (adapter) ja PapH ( ankur välismembraanis).
Tüüp I piili FimH (adhesiin), FimG, FimF, u 1000 FimA . Terminatsioonisubühikut pole teada.
Subühikud sekreteeritakse periplasmasse Sec-süsteemiga. Periplasmas aitavad PapD ja FimC piili subühikud pakkida õigesse konformatsiooni ning värativalkudes (PapC ja FimD) toimub piili polümeriseerumine.
Adhesiinisubühik (PapG ja FimH) on olulised substraadile kinnitumiseks. Piilide adhesiinid pole järjestuse alusel sarnased, kuid nende struktuur on sarnane – moodustavad -lehtedest tünja struktuuri, mille sisse seotakse retseptormolekul. PapG tunneb ära glükolipiide ning FimH D-mannoospüranosiide.
Pseudomonas aeruginosa CU-piili näiteks on Cup-fimbriad, vastavad geenid viies cup (chaperone-usher pathway) klastris (operonis). Need klastrid on erinevalt reguleeritud ning arvatavasti täidavad raku pinnal erinevaid ülesandeid. Kusjuures cupC klaster koosneb ainukesena kolmest põhivalgu geenidest: piliin, šaperon ja värativalk. Teised klastrid on pigem erinevad piliinid. Cup klastrid on P. aeruginosa’s rangelt kontrollitud ning vedelsöötmes kasvatades neid ei ekspresseerita. (Pseudomonas putida’s fim geenid, millest FimI (piliin) sarnane CupB1 valguga).
Cup-geenide ekspressiooni reguleerimine Pseudomonas aeruginosa’s. MvaT (H-NS-i analoog P. aeruginosa’s) represseerib cup geenide positiivset regulaatorit cgrABC ( lokaalsed regulaatorid, siiani kirjeldatud kui teadmata funktsiooniga valgud), lisaks mõjutab positiivselt cupA klastrit Anr (anaerobioosi globaalne regulaator). Lisaks eelnevatele mõjutab cup geenide ekspressiooni Roc (regulaator of cup) kahekomponendiline süsteem. Roc-süsteemil on 2 paraloogi: Roc1 ja Roc2. Roc1 lookus koosneb 3 geenist: RocS1, RocA1 ja RocR-st. Roc2 lookus koosneb kahest geenist: RocS2 ja RocA2-st.
RocS1 ja RocS2 on plasmamembraanis asuvad sensorvalgud. RocS1-l on periplasmadomään, RocS2-l seda pole. Mõlemad on võimelised andma signaali edasi RocA1-le, mis on tsütoplasmaatiline. RocA1 aktiveerib cupC ja cupB klastri. RocA2 inaktiveerib mexAB-oprM geenide klastri, mis on vajalikud mitmesuguste antibiootikumide väljapumpamiseks sealhulgas ka -laktaamide. (NB! Paljud P. aeruginosa tüved, mis on isoleeritud tsüstilise fibroosiga patsientide kopsust leitud biofilmist on antibiootikumidele tundlikud). RocR-l on EAL domään ning seega c-di-GMP lagundaja. Tema represseerib teadmata signaalraja abil cupB ja cupC klastrid.
(P. putida’s on olemas rocS1 ja rocA2 paraloog)
Tüüp IV piilid on piliini polümeerid paljudel gram-negatiivseltel bakteritel, sealhulgas peamistel inimpatogeenidel nagu Neisseria gonorrhoeae, N. meningiidis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Salmonella enterica, Legionella pneumophila ja enteropatogeensel Escherichia coliI. Need piilid on pikad, küündides 1-4 µm-ni, painduvad vastupidavad kiud raku välispinnal. Erinevalt amüloid ja CU-piilidest ulatuvad tüüp IV piilid tsütoplasmast läbi rakumembraani, peptiidoglükaankihi ja välismembraani rakust välja. Tüüp IV piilid on olulised mitmesugustes rakuprotsessides, nagu virulentsus, agregatsioon , adhesioon, piili-tõmbumine, biofilmi moodustumine ning rakku tungimine. P. aeruginosa’l on tüüp IV piilid rakupoolustel.
Tüüp IV piilid jagatakse kaheks piliini signaalpeptiidi järgi. IV a piliinil on 5-6 aminohappe pikkune signaalpeptiid, IV b piliinil on see pikem, 15-30 aminohappe pikkune. Kõik IV tüüpi piliinid on järjestuselt sarnased ning neid protsessitakse sarnaselt. Tüüp IVa piilid on olulised bakteri liikumisel mööda tahket pinda. Liikumist nimetatakse piili-tõmbumiseks (twiching).
Erinevalt amüloidpiilidest ja CU-piilidest vajab tüüp IV piili assambleerumiseks suurt mehhanismi, mis kulutab ATP-d ning ulatub läbi mõlema membraani, meenutades flagella ehitust. Erinevalt eelnevast suudab tüüp IV piili assambleerumine olla pöörduv (kulutab ATP-d), mille tulemusena toimub liikumine (tüüp IV a piili) või DNA sissevõtmine, biofilmi moodustumine, adhesioon (tüüp IV b piili).
PilRS kahekomponendiline süsteem kontrollib positiivselt tüüp IV a piilide geene. PilS tsütoplasmaosas on PAS domään, millega seonduvad diguanülüül tsüklaasid ja fosfodiesteraasid.
Alginaat on polüsahhariid, mille hargnemata polümeer koosneb D-manuroon ja L-guluroonhappejääkidest (manuroonhappe epimeer). Annab bakteritele limaja pinna, mis on peamiselt kaitsefunktsiooniga. Alginaadita bakterid on antibiootikumidele tundlikumad, kui alginaadiga. Pseudomonas aeruginosa tüved tsüstilise fibroosi haigete kopsudes on tüüpilised alginaadi tootjad. Alginaat on oluline biofilmi moodustumise algetappidel, aga ka hiljem kui eksopolüsahhariid, mis hoiab biofilmi maatriksit koos. Samas, alginaat pole hädavajalik biofilmi moodustumiseks. On näidatud, et P. aeruginosa tüved, mis pole võimelised alginaati tootma moodustavad biofilmi (neil on olulised Pel ja Psl polüsahhariidid). Alginaati kunstlikult üle tootvatel P. aeruginosa rakkudel on langenud maatriksile kinnitumise võime võrreldes metsiktüvega või alginaat- miinus tüvega.
Süntees. Alginaadi sünteesis ja transpordis osaleb 13 geeni: operon algD-8-44-KEGXLIJFA ja algC geen. Aktiveeritud GDP-manuronaadi sünteesivad AlgA , C ja D valgud. Alginaadi polümeriseerimiseks, modifikatsiooniks ja ekspordiks on vaja 10 valku, mis moodustavad sekretsioonikompleksi, ulatudes läbi periplasma ning kaitstes polümeere lagunemise eest. Manuroonhapete polümeriseerimiseks on vajalik Alg8 (glükosüültransferaas) ja c-di-GMP seondumist Alg44 PilZ domääni. Alg44 aktiivsust reguleerib MucR, mis sisaldab GGDEF motiivi (EAL motiivi ka) ning on diguanülaat-tsüklaas tootes c-di-GMP-d. Arvatakse, et need valgud on olulised ka polümeeri eksportimiseks periplasmasse. AlgI, AlgJ, AlgF valgud atsetüleerivad periplasmas kasvava polümeeri ning AlgG epimeriseerib selektiivselt D-manuuroonhappejäägi L-guluroonhappejäägiks. AlgL-l arvatakse olevat kaks rolli, juhtida kasvav polümeer läbi periplasma kui ka degradeerida vaba alginaat, mis ei ole transporditud. AlgX-i funktsiooni ei teata, kuid arvatakse, et ta kaitseb kasvavat polümeeri degradeerimise eest, kui polümeeri transporditakse periplasmas. AlgK aitab transportida polümeeri AlgE-le, mis on sukeldunud välismembraanis, hoides omavahel alginaadi sünteesiaparaati ja sekretsioonivalku AlgE omavahel koos.
Regulatsioonis oluline anti-sigma faktor MucA ( AlgU on sigmafaktor), mis on algD operoni transkriptsiooni negatiivne regulaator. Kahekomponendilistest süsteemidest reguleerivad alginaadi sünteesi positiivselt FimS/AlgR ning KinB/AlgB süsteemid.
Pel-polüsahhariidid on glükoosirikkad polüsahhariidid, kuid siiani pole Pel-i koostis täpselt kindlaks määratud. Pel-polüsahhariidid, leiti Pseudomonas aeruginosa PA14 ja PAK tüvede rakkudel, kui rakuvälised hargnemata polümeerid. Esialgu arvati, et Pel-polüsahhariidid on vajalikud vedelik-õhk piirpinnal biofilmi tekkimiseks, kuid hiljem on selgunud , et on olulised ka biofilmi moodustumiseks ning rakkude agregatsiooniks nagu Psl-polüsahhariidid.
Süntees. Erinevalt alginaadi prekursoreid sünteesivatest valkudest Pel süsteemil pole leitud valku, mis sünteesiks polüsahhariidi spetsiaalseid prekursoreid. Sellest johtuvalt arvatakse, et prekursorid võetakse otse süsiniku tsentraalsest metabolismirajast. Sünteesiks on vajalik seitse geeni, mis asuvad pel operonis pelABCDEFG. Tsütoplasmaatiline PelF on oletatav glükosüültransferaas, PelD seob c-di-GMP-d ning reguleerib seeläbi polümeeri sünteesi positiivselt. PelB on välismembraanivalk, mis on AlgK ja AlgE homoloog. PelA, C, E ja G funktsioone arvatakse olevat sarnased alginiini sünteesiraja valkudele.
Regulatsioon. FleQ represseerib pel operoni, seondudes c-di-GMP-ga toimub operoni aktivatsioon. Peamine regulatsioon käib GacS/RetS/LadS-GacA signaaliraja kaudu läbi RsmA posttranskriptsioonilise regulatsiooni.
Psl-polüsahhariidid koosnevad D-mannoosist, L-rhamnoosist ja D-glükoosist. Leiti P. aeruginosa PAO1 ja ZK2870 tüvede rakkude pinnalt (PAO1-l on olemas ka pel operon). Psl-polüsahhariidid on olulised rakk-rakk interaktsioonideks ning biofilmi moodustumiseks. Psl operon koosneb 12 geenist pslA-L.
Süntees. Prekursorite sünteesiks on oluline pslB geen, sest teisi prekursoreid saab sünteesida operoniväliste geenide produktidega. Psl polümerisatsioonikompleksi moodustavad PslA,E,J,K,L valgud, mis on sukeldunud rakumembraani. PelE periplasmaatiline osa määrab Psl polümeeri pikkuse ja ekspordi PslD valgule. Arvatakse, et PslK-l on flipaasi roll. PslD on periplasmaatiline valk, arvatavasti sukeldunud välismembraani ning tagab Psl polümeeri transpordi raku välispinnale. PslG-l arvatakse olevat sama funktsioon, mis AlgL-l.
Regulatsioon. Reguleeritud positiivselt c-di-GMP-ga ning GacS/RetS/LadS-GacA regulatsioonirajaga. Lisaks on oluline polümeeri sünteesimisel CdrA, B valgud.

14.5. Biofilmi kesksed signaalrajad

C-di-GMP signaalirada. Tsütoplasmaatiline c-di-GMP (bis-(3’-5’)-tsükliline dimeerne GMP) on bakteritel laialt levinud ning peamine alarmoon, mille abil lülitatakse bakteri füsioloogia ümber planktiliselt eluviisilt paiksele (biofilm) või vastupidi. Üldiselt, kõrge c-di-GMP kontsentratsioon rakus soodustab biofilmi moodustumist, madal kontsentratsioon, aga biofilmist irdumist ja planktilist eluvormi. Bakteris reguleeritakse c-di-GMP kontsentratsiooni kahe vastandlike reaktsioonidega ensüümide aktiivsuse ja hulgaga : diguanolüül tsüklaasid (DGC), konserveerunud GGDEF motiiv , toodavad alarmooni ning fosfodiesteraasid (PDE), konserveerunud EAL motiiv , lagundavad alarmooni. Gamma- proteobakterid torkavad eriti silma oma ortoloogide rohkusega, mis on seotud c-di-GMP metabolismis. Eriti palju on neis bakterites valke, millel on mõlemad domäänid – alarmooni sünteesi ja lagundamisdomään. Tavaliselt on nendel domäänidel erinev substraadiga seondumis ja inhibitsioonikonstant, mille tõttu ensüüm tagab c-di-GMP kontsentratsiooni ühe domääni inhibitsioonikonstandi lähedal. Kui arvestada, et alarmooni metabolismis osalevate geenide ekspressioon sõltub erinevatest signaalidest, seega ka erinevalt reguleeritud, on bakterites olemas tundlik regulatsioonisüsteem, mis vastutab planktiliselt eluviisilt paiksele eluviisile ümberlülitamise eest ja vastupidi. Samas paljude DGC ja PDE-de ekspressiooni kontrollib RpoS.
C-di-GMP jaotatakse globaalseks, mis on raku üldine alarmooni kontsentratsioon, mõjutades globaalset transkriptsiooni, ja lokaalseks, teatud bakteri piirkonnas (üldiselt membraani lähedal, kahekomponendiliste süsteemide sensorite läheduses) muutub c-di-GMP kontsentratsioon lokaalselt, mõjutades konkreetset signaalirada.
Paljudel (kahekomponendiliste) süsteemide sensoritel on PAS domäänid, millega seonduvad DGC-d või PDE-d. Sellega reguleeritakse konkreetse signaali ülekannet. Näiteks O2, NO ja CO sensoritel.
c-di-GMP märklauad. Alarmooni märklauaks võivad olla nii transkriptsiooniregulaatorid (nt FleQ) kui ka sünteesiraja ensüümid (nt PelD ja Alg44).
Näited. FleQ on viburite sünteesi masterregulaator P. aeruginosa’s ning aktiveerib viburigeenide transkriptsiooni, samas on FleQ ka Pel polüsahhariidide geenide repressor (pel operon). C-di-GMP seondub FleQ-ga ning regulatsioon deaktiveerub, kaob viburite geenide süntees ja aktiveerub pel-operon. Arvatekse, et E. coli’s seondub c-di-GMP MlrA-le ning kompleks aktiveerib csgD operoni (amüloidpiilid).
GacS/RetS/LadS-GacA signaalirada
GacS ja GacA moodustavad P. fluorescens’is kahekomponendilise regulaatorsüsteemi, mis annab väliskeskkonnast signaale edasi rakule. GacS on sensorkinaas, mis võtab signaali vastu ja autofosforüleerub. Ta kannab fosfaatjäägi edasi transkriptsiooniregulaatorile GacA, mis mõjutab väikeste regulatoorsete sRNA-de tootmist. Nende abil reguleeritakse ekstratsellulaarsete produktide tootmist, bakteri hulgatunnetust, biofilmi moodustumist ja liikumist. On näidatud, et Gac-süsteem represseerib liikumist: Melilotus albus ’e risosfäärist tagasi isoleeritud hüperliikuvates tüvedes oli inaktiveeritud gacS või gacA geen. Teiselt poolt mõjutab Gac-süsteem positiivselt biofilmi moodustumiseks vajalike eksopolüsahhariidide tootmist pel ja psl operonidelt. Lisaks on GacS/A süsteem P. fluorescens’is seotud biokontrolli faktorite tootmisega. Näiteks kontrollib GacS/A süsteem sekundaarsete antimikroobsete metaboliitide sünteesi, mis kaitsevad taime patogeensete seente eest. P. aeruginosa’s on Gac-süsteem seotud virulentsusega, reguleerides sekreteeritavate ensüümide nagu proteaas, fosfolipaas C ja kitinaas, kudede koloniseerimiseks vajalike faktorite ja virulentsusfaktorite ( lipaas , tsüaniid ja püotsüaniin) tootmist.
E. coli’s on GacS-i homoloogi BarA (ingl k bacterial adaptive response) signaalmolekuliks atsetaat, formaat ja lisaks veel teised tsitraaditsükli vaheühendid, kusjuures atsetaat võib mõjuda otse GacA homoloogile UvrY-le. Perekonna Pseudomonas liikidel pole GacS-i signaalmolekuli kirjeldatud, kuid põhjalikult on uuritud GacS/A rakusisest signaalirada. Aktiveeritud GacS/A süsteem tõstab sRNA-de taset, mis kontrollivad posttranskriptsioonilist regulaatorit RsmA. Kaks sRNA-d RsmY ja RsmZ seonduvad RsmA-ga ja takistavad RsmA seondumist mRNA-dega (SD järjestusel või lähedal), millelt translatsiooni RsmA reguleerib.

14.6. Biofilmi maatriks

Eksopolüsahhariidid on maatriksi peamine komponent. Paljude bakterite jaoks lausa hädavajalikud, et biofilmi moodustada. Kuigi polüsahhariid-miinus tüved on võimelised agregeeruma ning moodustama mikrokolooniaid, küpset biofilmi neil ei kujune. Polüsahhariidid moodustavad ka peamise kaitse peremehe rakkude, antibiootikumide ja antikehade eest.
Eksopolüsahhariidid on tavaliselt pikad harunenud või harunemata ahelaga polümeerid, mille mass on 0,5-2 106 daltonit. Enamjaolt on heteropolüsahhariidid, kuid ka homopolüsahahriidid on levinud. Enim on uuritud P. aeruginosa alginaati, mis koosneb uroonhappe jääkidest. Pealegi pole alginaat põhiline ja tähtsaim eksopolüsahhariid Pseudomonas’tel, vaid Pel ja Psl polüsahhariidid.
Rakuvälised valgud. Biofilmi maatriksis esinevaid valke võib jagada kahte rühma: ensüümid ning struktuurvalgud. Ensüümid on seotud biofimi maatriksi lagundamisega või ümberkujundamisega. Ensüümide substraadid võivad olla nii vees lahustuvad (paljud polüsahhariidid, valgud, DNA ja RNA) kui ka mittelahustuvad (tselluloos, kitiin ja lipiidid). Ensüümid võivad lagundada maatriksit nii energiaallikaks biofilmis olevatele bakteritele, kui ka modifitseerida biofilmi struktuuri. Biofilmi maatriksi modifitseerimine on vajalik selleks, et bakterid saaks biofilmist lahkuda või lausa biofilmil lagundada, kui keskkonnatingimused muutuvad järsku.
Struktuurvalkudest on tuntuim P. aeruginosa CdrA, mis seob Psl-polüsahhariide ning ristseondumine tugevdab biofilmi maatriksit. Samas on CdrA oluline ka Psl-polüsahhariidi polümeriseerumisel, ankurdades polüsahhariidi raku välismembraani külge.
Rakuväline DNA (eDNA) on biofilmi küpsedes väga oluline struktuuri kooshoidja. Sõltuvalt bakteriliigist on rakuvälisel DNA-l ses osas suurem või väiksem tähtsus, päritolu ning osakaal maatriksist. Eriti palju on eDNA-d heitvete biofilmides. Staphylococcus aureus’l on eDNA maatriksi peamine komponent, samas kui S. epidermidialis’l on eDNA-l ainult minoorne osakaal biofilmi maatriksis. Samas, DNaaside juuresolekul on Pseudomonas aeruginosa ja Bacillus cereus biofilmi kujunemine häiritud. Neil bakteritel on eDNA adhesiini tähtsusega.
Eriti palju eDNA-d on koondunud P. aeruginosa nn biofilmi varre populatsiooni peale. On andmeid, et vart moodustavates bakterite pealmises kihis toksiin-antitoksiin süsteem indutseerib rakusurma ning DNA vabaneb. See omakorda on vajalik P. a. küpse biofilmi kujunemiseks. Vabanenud eDNA-le kinnituvad bakterid, mis moodustavad seenekübara populatsiooni.
Rakuväline DNA võib pärineda samast bakteripopulatsioonist, mis moodustavad biofilmi nagu Pseudomonas’tel või pärineda keskkonnast nagu heitvete bakteritel.

14.7. Biofilmi resistentsus

Biofilmi üldise resistentsuse biotsiididele, kuid ka UV-kiirgusele tagab eksopolüsahhariidsest limamaatriksist (EPS) moodustunud barjäär. Biofilmi maatriks koosneb lisaks veest ja eksopolüsahhariididest veel ka valkudest, nukleiinhapetest ja surnud rakkudest. Oma omaduste poolest on biofilmid kui hüdrogeelid. EPS neutraliseerib või seob erinevad reaktiivseid (nt naatrium-hüpokloriid ja superoksiidid), laetud (nt metallid) või suuri (nt immunoglobuliinid) antimikroobseid ühendeid ning nende järk-järgulisel lahustumisel EPS-i hüdrogeelis ei oma nad enam tapvat mõju biofilmi sügavamate kihtide rakkudele. Biofilmi rakud taluvad 10-1000 korda suuremaid erinevate antimikroobsete ühendite koguseid kui sama liigi planktonrakud.
Teiseks resistentsuse mehhanismiks on biofilmi rakkude heterogeenne füsioloogia, st biofilmi osades piirkondades valitsevate toitainete puuduse tõttu on neis alades olevatel bakteritel statsionaarse kasvufaasi rakkudele iseloomulik füsioloogia ehk puudub aktiivne jagunemine ja metabolism. See selgitab miks osa biofilmis vabalt difundeeruvad antibiootikumid (nt metaboolselt aktiivsetele, jagunevatele rakkudele suunatud β-laktaamantibiootikumid) ei toimi biofilmi sügavamate kihtide rakkudele. Lisaks võib biofilmis esineda eriti suure tolerantsusega mikroobe ehk persistoreid. Persistorid on metaboolselt inaktiivsed. Neil on suurenenud mittespetsiifiliste antibiootikumipumpade ekspressioon ning aktiveeritud erinevad stressivastuse regulonid. Selle tulemusena elavad persistorid üle mitmesuguseid stressitingimusi, mida elusad bakterid ei suuda. Karmide keskkonnatingimuste või antimikroobsete ühenditega töötlemise kiuste võivad biofilmis ellujäänud rakud taastada biofilmi kasvu.

14.8. Biofilmi tähtsus inimesele

Looduses on biofilmi mikroobikogumikel oluline roll nii orgaanilise aine kui ka keskkonda sattunud saasteainete lagundamises (bioremedatsioon), lämmastiku- ja väävliringes, raua redutseerimises jne. Kõik need keerulised metaboolsed protsessid toimuvad tänu mitmete metaboolselt erinevate mikroobide ühistööle. Biofilme võib leida taimede pinnalt. Nimelt, taimede juured sekreteerivad mitmeid suhkruid, aminohappeid, vitamiine ja signaalmolekule, mis stimuleerivad bakterite kasvu ja biofilmi moodustumist taimede juurtel ja juurekarvadel. Bakterite kasv juurte pinnal omakorda hõlbustab taimel mullast toitainete omastamist. Looduses on biofilmil oluline osa toiduahelas , nt selgrootud toituvad veekogudes biofilmist. Tööstuslikes tingimustes on biofilmid olulised heitveekäitluses, kus nad puhastavad reovett liigsest lämmastikust. Biotehnoloogiliselt kasutatakse biofilme erinevate biokemikaalide tootmiseks, mis leiavad kasutust nii meditsiinis kui tööstuses.
Kuigi inimese erinevad väliskeskkonnale avatud kehapinnad (nt nahk, hambad, silma sarvkest , nii hingamisteid kui ka seedekulglat kattev limasekreet) soodustavad bakterite kinnitumist, on tänu kudede loomulikule puhastuvõimele biofilmi moodustumine neile siiski limiteeritud.
Suurim positiivne mõju inimese tervisele on seedekulgla mikroflooral, mille liigiline koostis varieerub piki seedetrakti (osad bakterid kinnituvad seedetrakti epiteelile, osad asuvad vabalt seedetrakti luumenis). Inimese seedekulgla bakterid toodavad vitamiine (enterobakterid sekreteerivad põhiliselt vitamiine K ja B12 ning piimhappebakterid teatud B vitamiine) ja aitavad kaasa nii toitainete seedimisele kui omastamisele. Soolemikrofloora suur mass ja arvukus (peensooles108/ml ja jämesooles ulatub 1012/ml) vaid soodustab eelnevalt mainitud funktsioone, kuid samas on ka kaitseks võõrmikroobide kolonisatsiooni eest. Näiteks bakterivaba katselooma nakkuseks piisab vaid 10 Salmonella bakterist, samas kui normaalse mikrofloora korral on nakkuslikuks doosiks 106 rakku. Soolemikroflooral on näidatud olevat inimese immuunsüsteemi (nt. seedekulgla teat. lümfaatilise koe - Peyer'i naastude) arengut ja aktiivsust stimuleeriv toime.
Biofilmi kaitsva rolli näideteks on veel naise suguteesid kattev põhiliselt laktobatsillidest moodustunud biofilm, mis tänu keskkonna hapestamisele ja bakteriotsiinide tootmisele hoiavad ära patogeenide kinnitumise ja/või vohamise ja seeläbi ka võimaliku põletiku tekke. Samuti ka hambakatt ehk hammastele moodustuv biofilm kaitseb hambaid välispatogeenide kolonisatsiooni eest. Siiski hammastele moodustunud biofilmi mõju võib olla vastandlik: ühelt poolt kaitsva funktsiooniga, teiselt poolt aga teatud tingimuste muutumisel võib põhjustada kõige levinumaid haigusi – kaariest, igemepõletikku ja parodontiiti e hambajuureümbrise põletikku.
Hambakatus võib olla enam kui 350 erinevat bakteriliiki. 16S rRNA sekveneerimisega on näidatud, et tegelikult ligikaudu pool hambakatu moodustanud liikidest moodustavad hetkel kultiveerimatud liigid, seega hambakatus esinevate liikide arv võib olla palju suurem (üle 700). Õnneks ühe indiviidi hambakatu proovist on võimalik välja kultiveerida ligikaudu 20-30 erinevat liiki (tegelik liikide arv võib siis olla 50). Suu mikroflooras domineerivad põhiliselt streptokokid ja Actinomyces spp., vähem esindatud on Veillonella, Haemophilus, Neisseria perekondadesse kuuluvad liigid ja gram-negatiivsed anaeroobsed batsillid . Sellised erinevatest organismidest moodustunud biofilmid võivad oma koostiselt püsida stabiilsetena tänu väljakujunenud interaktsioonidele erinevate liikide vahel, kuid seda stabiilsust võivad mõjutada mitmed keskkonnategurid . Näiteks kui indiviid otsustab süüa suuremas koguses süsivesikuid sisaldavaid toite või jooke, siis tema suu mikroflooras saavad kasvueelise happelist keskkonda taluvad bakteriliigid nagu Streptococcus mutans ja Lactobacillus spp., mis produtseerivad piimhapet ja seeläbi soodustavad hamba emailikihi lagunemist ning kaariese teket.
Parodontiidi puhul on keskkonna tingimuste osakaal põletiku tekkimises vähem selgem. Kui hamba ja igeme vahel olevat biofilmi e. hambakattu pidevalt ei eemaldata harjamise ja hambaniidiga, siis lõpuks võib ta tekitada organismis põletikulise vastuse, mille käigus suureneb seerumisarnase eritise (gingival cervicular fluid) hulk. Kuid see valgurikas vedelik võib olla toitaineks teatud bakteritele (nt Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus, Treponema jne.), kes muidu on hambakatus väheesindatud. Nende patogeenide paljunemisel hakkavad biofilmis domineerima gram-negatiivsed anaeroobid, mis toodavad hamba tugikudesid kahjustavaid proteolüütilisi ensüüme ning kutsuvad peremeesorganismil esile erinevate põletikumediaatorite (tsütokiinid, prostaglandiinid) üleprodutseerimise, mis samuti aitavad kaasa hamba tugikudede hävinemisele.
Vaatamata organismi loomulikule kaitsevõimele võivad meie mikrofloora bakterid sattuda vereringesse ja sealt edasi kanduda juba sügvamatesse kudedesse. Aja jooksul on biofilmiga seotud nakkuste mitmekesisus vaid suurenenud. Arvatakse, et tänapäeval on isegi kuni 80% kõigist bakteriaalsetest haigustest põhjustatud bakteriaalsest biofilmist. Selliseid haigusi on päris palju, hõlmates nii kroonilisi haigusi kui ka meditsiiniliste implantaadidega seotud nakkusi. Haiguste näidetena võiks välja tuua koliidi (jämesoolepõletik), vaginiidi (tupepõletik), uretriidi (kusitipõletik), konjuktiviidi (silma sidekesta põletik), otiidi e keskkõrva põletiku ja endokardiidi (südame klappide ja sisekesta põletik). Biofilmi nakkustel on kliiniliselt sarnaseid tunnuseid. Enamasti moodustuvad biofilmid organismi inertsetele pindadele, surnud kudedele, meditsiinilistele implantaatidele, kuid võivad tekkida ka elusatele kudedele nt endokardiidi korral. Enamasti on biofilmiseoseliste nakkuste eelduseks nõrgenud immuunsüsteem või teatud organite kaasasündinud anomaaliad. Kuna biofilmi moodustamine võtab aega, siis ka nakkuse sümptomid ei avaldu koheselt. Kinnitunud bakterid vabastavad antigeene, aktiveerides organismis nii antikehade tootmise kui ka fagotsüütide saabumise põletikukoldesse. Kuid ei antikehad ega ka fagotsüüdid suuda tõhusalt tappa biofilmis olevaid baktereid. Biofilmi ebaõnnestunud atakeerimise käigus võivad fagotsüüdid vabastada hapniku reaktiivseid vorme, mis pigem kahjustavad organismi enda kudesid kui limabarjääriga kaitstud baktereid. Isegi kui rakuline ja humoraalne immuunvastus suurepäraselt toimiks, ei suuda organism ise enamikel juhtudel biofilmi nakkust hävitada. Biofilmist aeg-ajalt vabanevate rakkude põhjustatud haiguse sümptomid küll kaovad antibiootikumiraviga, kuid kui biofilm jääb täielikult hävitamata, siis paljudel juhtudel tekivad haigusnähud uuesti (juhul kui võimalik, siis krooniliste haiguste nt. tonsilliidi puhul hakatakse kaaluma kirurgilist vahelesekkumist).

15. Bakterite hulgatunnetus

USA taimepatoloog Erwin F. Smith (1854 – 1927) ütles 1905. aastal prohvetlikud sõnad: „Ainus seletus, mille peale ma tulen, on see, et bakterid ületavad hulgakesi koos takistusi, mida üksikindiviidina bakter ei suudaks.“ Need sõnad võtavad kokku bakterite hulgatunnetuse olemuse.
Bakterite hulgatunnetuseks nimetatakse bakterite võimet muuta rakuväliste signaalmolekulide abil geeniekspressiooni vastavalt bakteripopulatsiooni tihedusele . Bakterid kasutavad hulgatunnetust omamoodi. Samas keskkonnas olevad bakteritüved, mis konkureerivad omavahel, võivad kasutada signaalmolekuli vastupidiselt, ühed aktiveerivad geenide ekspressiooni, teised inhibeerivad. Signaalmolekulide abil võib toimuda suhtlemine isegi domeenideüleselt – bakterite signaalmolekulid võivad modifitseerida eukarüootsete immuunrakkude ja epiteelrakkude transkriptoomi. Hulgatunnetuse abil võivad bakterid reguleerida erinevaid protsesse, nagu biofilmi moodustumine, DNA ülekanne, virulentsuse kujunemine, antiboiootikumiresistentsus, autolüüs, oksüdatiivse stressi talumine, liikuvus, metaboolne aktiivsus, antibiootikumide süntees. Hulgatunnetus on levinud nii patogeensete kui ka kommensantsete bakterite hulgas.
Meremikrobioloogid Nealson, Patt ja Hastings avastasid hulgatunnetuse 1970. aastal. Hulgatunnetus kirjeldati mutualistlikul bakteril Vibrio fischeri ’l, mis piisava bakteritiheduse korral oli võimeline sisse lülitama lutsiferaasi ekspressiooni ning hakkama helendama. V. fischeri’l on kaks eluvormi – planktiline ning kinnitununa kalmaari (Euprymna scolopes) valguselundis. Planktilised rakud ei helenda, samas kui kalmaari valguselundis bakterid on võimelised helendama. Kalmaar pakub bakterile turvalist keskkonda ning pidevalt toitaineid. Bakteri helendamise abil varjab kalmaar ennast süvakiskjate eest, kes jahivad pinnakihtides ujuvaid saakloomi nende tumedana näiva silueti järgi heleda taeva taustal. Bakterite helendamise tulemusel ei märka kiskjad kalmaari siluetti.
Hulgatunnetuse abil aktiveeritavad fenotüübid (kõik tüüp I signaalmolekulid).
Organism
Signaalmolekul
HT geenid
Fenotüüp
Pseudomonas aeruginosa
3- okso -C12-HSL
lasI-lasR
rhlI-rhlR
Virulentsusfaktorid, biofilm (alginaadi ekspressioon), liikumine (tüüp IV piilid, piilitõmbumine)
Agrobacterium tumefaciens
3-okso-C8-HSL
traI-traR
Ti-plasmiidi konjugatsioon
Vibrio fischeri
3-okso-C6-HSL
luxI-luxR
Bioluminestsents
Vibrio harveyi
3-hüdrokso-C4-HSL
luxLMN-luxR
Bioluminestsents
Serratia liquefaciens
C4-HSL, C6-HSL
swrL
Voogamine
Erwinia carotovora
3-okso-C6-HSL, laktoon
car
Ekstratsellulaarsed ensüümid (pektaatlüaas, tsellulaas , proteaas)

15.1. Hulgatunnetuse signaalmolekulid ja sensorsüsteemid

Signaalmolekule, mis võivad vahendada hulgatunnetust G(-) ja G(+) bakteritel, on väga palju ning nad on jaotatud 4 rühma. Peamised tunnusjooned on toodud allolevas tabelis.
Hulgatunnetuse tüüp
Signaalmolekul
Retseptor
Eritunnusjooned
Autoinduktor 1, LuxR/I rühm
N-atsüül-homoseriin-laktoon
Rakusisene LuxR-i homoloogid, transkriptsiooni aktivaator
G(-) nagu Bulkholderia, Vibrio, Pseudomonas; võivad mõjutada inimese geeniekspressiooni
Autoinduktor 2, LuxS rühm
Heterotsükliline furanosüül-boraat
Kahekomponendiline signaalsüsteem, retseptor membraanis
Laialt levinud G(-) ja G(+) bakterid; võib olla pigem primaarne metabolismisüsteem kui kommunikatsioonisüsteem
Autoinduktor 3, adrenaliin/noradrenaliin signaalsüsteem
Katehhoolamiini sarnased molekulid
Kahekomponendiline signaalsüsteem, sensor membraanis (QseBC)
G(-) enterobakterid, nagu Escherichia coli, Shigella, Salmonella, funktsioon ebaselge
Peptiidne süsteem (ArgC/ArgA Staphylococcus’el, kompetentsuspeptiidid Pneumococcus’el)
Tsüklilised lühikesed peptiidid tiolaktooni ringiga
Kahekomponendilised signaalrajad (ArgC – sensor,ArgA regulaator)
G(+) bakterid, Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus, Streptococcus
Autoinduktor 1 (AI-1) süsteem, LuxR-I, on levinud mitme G(-) bakterite perekondade seas ning nad on väga sarnased esimesena kirjeldatud luxI-luxR süsteemile Vibrio fisheri’s. Signaalmolekuliks on kergesti lahustuv ning vabalt membraanist läbi difundeeruv N-atsüül-homoseriin-laktoon (AHL – N-acetyl homoserine lactone). Põhimõtteliselt koosneb AHL tsükleerinud metioniinist ning rasvhappejäägist. Bakteri liikidel varieerub N-atsüül-radikaali pikkus 4 – 18 süsinikuni (rasvhappejäägis), rasvhappe küllastatus ja hapniku hulk radikaalis. LuxI või selle homoloog sünteesib signaalmolekulit. Kui bakterite tihedus on madal, siis AHL kontsentratsioon on samuti madal, ning hulgatunnetus on välja lülitatud. Kui rakkude arv populatsioonis suureneb, tõuseb ka AHL hulk ning teatud kontsentratsioonist alates lülitatakse hulgatunnetus sisse.
AHL-i retseptoriks on tsütoplasmaatiline valk LuxR Vibrio fisheri’s või selle homoloog teistes bakterites. AHL seondub LuxR valguga ning see kompleks käitub transkriptsiooni regulaatorina ning reguleerib hulgatunnetusgeenide transkriptsiooni. V. fisheri’l aktiveerib LuxR-AHL kompleks lutsiferaasi geeni transkriptsiooni, mis päädib bioluminestsentsiga.
Autoinduktor tüüp 1 on levinud paljude meditsiiniliselt oluliste patogeenide hulgas. Mõned perekonnad kasutavad sama AHL molekuli ning on tõenäoliselt võimelised ristaktivatsiooniks. Mõned bakterid nagu E. coli ei sünteesi AHL-i, kuid tunnetavad seda LuxR homoloogse valgu SdiA abil. Spekuleeritakse, et see võimaldab E. coli’l „pealt kuulata“ G(-) baktereid ning seda enda kasuks pöörata.
Tüüp 1 hulgatunnetusel on palju variatsioone, mis erinevad signaalmolekuli või retseptori poolest. Näiteks Pseudomonas aeruginosa toodab vähemalt kahte AHL-tüüpi signaalmolekule korraga, mis mõlemad reguleerivad biofilmi formeerumist. LasR-LasI tunneb ära 3-oxo-C12-homoseriin-laktooni ja RhlR-RhlI tunneb ära C4-homoseriin-laktooni.
Autoinduktor 2 (AI-2) süsteem, LuxS avastati esmalt Vibrio harveyi’l kui bioluminestsensi reguleeriv süsteem, mis on reguleeritud LuxS-ga. See hulgatunnetuse tüüpsüsteem on leitud umbes pooltel kõigist sekveneeritud genoomiga bakteritest. AI-2 on levinud nii G(-) kui ka G(+) bakteritel. AI-2 kasutab keerukamat signaaliäratundmisvõrgustikku kui AI-1, ning autoinduktor on keerukas tsükliline molekul, mis sisaldab boori aatomit (halogeenitud furanoon). Vibrio liikidel on retseptor membraaniseoseline, kahe domeeniga sensorkinaas, ning LuxQ on vastuse regulaator. Enterobakteritel on retseptor periplasmas, seondub signaalmolekuliga, ATP-sõltuv ABC-transportsüsteem fosforüleerib signaalmolekuli ning transpordib tsütoplasmasse. Tsütoplasmas tunneb fosforüleeritud signaalmolekuli ära transkirptsiooniregulaator, mis aktiveerib geenid, kui signaalmolekul on regulaatoriga seotud. Salmonella’s on signaalmolekuliks furaan, milles pole boori aatomit.
Paljud bakterid ei ekspresseeri LuxS valku, kuid neil on olemas AI-2 retseptorid. Arvatakse, et sellisel moel bakterid tunnetavad teiste bakterite signaale ning reguleerivad tänu sellele oma geenide avaldumist. Kuigi siiani pole näidatud AI-2 puhul ristreguleerimist.
AI-2 roll bakterite patogeneesis pole nii täpselt kirjeldatud, kui raja ensüümide osalus metabolismi vaheproduktide kahjutukstegemisel. AI-2 süntaas LuxS muudab toksilise vaheühendi S-adenosüül-L-homotsüsteiini (AdoHcy) kahjutuks ühendiks homotsüsteiiniks. Näiteks Streptococcus mutans’il oli muutunud 585 geeni ekspressioon (30% geenidest) luxS deletsiooni korral. Samal ajal kui AI-2 reguleerib ainult 59 geeni ekspressiooni. Sellest johtuvalt on LuxS pigem metabolismis oluline kui hulgatunnetuses.
Autoinduktor 3 (AI-3) süsteem on paljuski AI-2-ga sarnane – signaali võtab vastu kahekomponendiline süsteem, mis aktiveerib virulentsusgeenid. Kuid erinevalt AI-2-st kasutab AI-3 inimese stressihormoone adrenaliini või noradrenaliini süsteemi aktiveerimiseks. Näiteks, ained, mis blokeerivad -adrenergilised retseptorid blokeerivad ka E. coli AI-3 signaaliraja. Bakteriaalne signaalmolekul pole siiani täpselt defineeritud ning arvatakse, et see on katehhoolamiinile sarnane molekul. AI-3 signaal jõuab rakku kahekomponendilise süsteemi abil. Sensorkinaasiks on periplasmaatiline QseC, mis fosforüleerib tsütoplasmaatilise regulaatori QseB. Fosforüleeritud QseB on virulentsusgeenide aktivaator. AI-3 on leitud patogeensetelt ja kommensiaalsetelt entoerobakteritelt, kuid mitte G(+) bakteritelt. Patogeensetel (enterohemorraagiline – EHEC ja enteropatogeensed – EPEC) E. coli tüvedel aktiveerib AI-3 süsteem patogeneesiks vajaliku LEE ( locus of enterocyte effacement) geenid. Lookuses on 41 geeni, sealhulgas T3SS (type 3 secretion system), hemolüüsi ja viburi sünteesi rerpessori geenid.
Autoinduktor 4 (AI-IV) süsteem. Lühikeste peptiididega signaliseeritav süsteem on leitud G(+) bakterites, nagu Staphylococcus (Arg) ja Enterococcus faecalis (Frs). Autoinduktoris on lühikesed tsüklilised peptiidid, mida nimetatakse ka autoinduktorpeptiidideks (AIP). Staphylococcus aureus’e AIP-d koosnevad 7 – 9 aminohappest ning tiolaktoonist, mis moodustab tsükli.
Kõige paremini on uuritud Staphylococcus aureus’e AI-4, millel on ArgC sensoriks. ArgC fosforüleerib tsütoplasmaatilise ArgA, mis aktiveerib arg-lookuse. Arg-lookus koosneb kahest vastassuunaliselt transkribeeritavast operonist. Üks operon koosneb 4 geenist, argA-D. AIP sünteesitakse ArgD post-translatsioonilise protsessimise teel, sekreteeritakse membraaniseoselise ArgB abil, mis on ABC-tüüpi transporter. Sama AIP abil inhibeeritakse S. aureus’e teiste tüvede autoinduktorite süntees, vältimaks ressursside kulutamist ökonišis, kus toitaineid pole kergesti kättesaadavad.
ArgA-D operoniga vastassuunaliselt transkribeeritakse RNAIII-e, mis on virulentsuse kujunemisel kahesuguse rolliga. RNAIII aitab kaasa deltatoksiini küpsemisele ning aktiveerib mitmete virulentsusgeenide (eksotoksiinide) ekspressiooni. RNAIII reguleerib alla mitme pinnavalgu ja adhesioonivalgu sünteesi.

15.2. AHL ja AI-2 biosüntees

Mõlema signaalmolekuli biosüntees algab S-adenosüül-L-metioniini (AdoMet; SAM) sünteesiga ATP-st ja L-metioniinist. Reaktsiooni viib läbi metioniini adenosüültransferaas (MAT). AdoMet-i väävliga seotud metüülrühma kasutatakse eukarüootides ja prokarüootides DNA, RNA, valkude, fosfolipiidide ja paljude teiste väikeste molekulide metüleerimiseks.
AI-1 süsteemi AHL süntaas, LuxI või selle analoogid (LasI), tsükleerivad metioniini nii, et väävli aatom jääb tsüklist välja (tekib tsükleerinud homoseriin – homoseriinlaktoon). Homoseriinlaktooni lämmastikule liidetakse rashvhappe (atsüüljääk). AHL C-ahela pikkus ning modifikatsioonid (ketoonradikal või hüdroksüülradikal) sõltub rasvhappest, msi liideti homoseriinlaktooni tsüklile.
AI-2 prekursoriks on S-adenosüülhomotsüsteiin (AdoHcy), mis tekib kui AdoMet-lt kantakse metüültransferaaside abil üle metüülradikaal erinevatele substraatidele. AdoHcy on metüültransferaaside inhibiitor ning muutub rakku kogunemisel toksiliseks. AdoHcy degradeerimiseks on kaks rada. Hüdrolüüsi abil lõhutakse AdoHcy adenosiiniks ja L-homotsüsteiiniks. AdoHcy nukleosidaasi abil lagundatakse AdoHcy adeniiniks ja S-ribosüülhomotsüsteiiniks. LuxS eemaldab homotsüsteiini ning edasi vaheühend tsükleerub spontaanselt ning seondub boorhappega, mis päädib AI-2 tekkega.
Bakterid, mis sünteesivad hulgatunnetuse signaalmolekule, peavad olema võimelised ka signaali maha võtma ning AHL molekule lagundama. Tavaliselt toimub see, kas laktooni avamisega laktonaaside abil või atsüülrühma eemaldamisega lämmastikust atsülaaside abil. AHL võib ka spontaanselt degradeeruda inaktiivseks tetraamhappeks (TAM) ensüümide abita.

15.3. Hulgatunnetus ja bakterite biofilm

Arvatekse, et hulgatunnetus on mingil moel oluline kõigi biofilmi moodustumise ja küpsemise etappidel. Hulgatunnetus reguleerib bakterite metaboolset aktiivsust ning rakutihedust biofilmis, et leida tasakaal toitainete vajaduse ning kättesaadavuse vahel. Bakterite transkriptoom biofilmis erineb planktilistest rakkude transkriptoomist märgatavalt. On väidetud, et Staphylococcus penumoniae on võimeline biofilmis elades põhjustama paremini kroonilisi infektsioone kui planktiline bakter, kuid planktiline S. pneumonia on virulentsem kui biofilmis kasvanud bakterirakk .
Hulgatunnetus on bakterite puhul oluline mehhanism biofilmist vabanemiseks. Näiteks Staphylococcus’e biofilmit vabanemiseks kasutatakse tõenäoliselt AI-2, vähendamaks eksopolüsahhariidide ekspressiooni, mis võimaldab bakteritel biofilmist eralduda. Pseudomonas putida ekspresseerib küpses biofilmis putisolviini, mis on peptiid, ning lagundab biofilmi maatriksit. Patogeensed bakterid levivad hulgatunnetuse abil organismis. Näiteks Staphylococcus’te liiga tiheda biofilmi korral laguneb biofilm hulgatunnetuse abil planktilisteks bakteriteks, mis veresüsteemis levides on võimelised moodustama mujal uusi kolooniaid ning biofilme.
P. aeruginosa’l on LasR-I süsteem oluline küpse biofilmi väljakujunenud arhitektuuri kujunemiseks. Kui selle süsteemi geenid deleteerida bakteri genoomist, siis kujub välja nõrk biofilm. Geenide komplementatsioon taastab biofilmi struktuuri.

15.4. Hulgatunnetuse tähtus bakterite patogeneesis

Patogeensel bakteril on kolm strateegiat, kui ta satub kokku uue peremehega . 1. Bakter võib kinnituda uuele organismile/organismi ning moodustada biofilmi. Ning põhjustada kroonilist infektsiooni. 2. Kinnituda ainult lühiajaliselt, ammutada kõik võimalikud ressursid ning seejärel otsida uut peremeesorganismi. 3. Minna täispangale – ekspresseerida täies mahus virulentsusfaktoreid ning vallutada peremeesorganism. Patogeeni otsus rünnata peremeesorganismi „võetakse vastu“ kollektiivselt, mis hõlmab informatsiooni vahetamist ning aktiivset koostööd.
Kuigi hulgatunnetus on levinud nii patogeensetel kui ka mittepatogeensetel bakteritel, tuntakse rohkem huvi patogeensete bakterite hulgatunnetuse vastu. Patogeensetel bakteritel on hulgatunnetus mehhanism, mis võimaldab bakteri populatsioonil kõige efektiivsemalt peremeesorganismi rünnata. Kui bakter ekspresseeriks virulentsusgeene konstitutiivselt, siis bakterite madala arvukuse korral saaks peremeesorganismi immuunsüsteem vähestest bakteritest jagu. Ära hoidmaks immuunsüsteemi vastust, ekspresseeritakse virulentsusgeene ainult piisava bakteriarvukuse korral.
Pseudomonas aeruginosa ekspresseerib kahte olulist AHL signaalmolekuli: LasR-I (LuxR-I süsteemi ortoloog ) süsteemi abil 3-oxo-C12-homoseriin laktooni ja RhlR-I süsteemi abil C4-homoseriin laktooni. Need signaalmolekulid on hierarhiliselt sünteesitud ning kontrollivad bakteri virulentsust ja biofilmi moodustumist.
LasR-I süsteemi signaalmolekul on esmane ning reguleerib nii biofilmi moodustumist, virulentsust kui ka RhlR-I süsteemi tööd. Kiiresti kasvavates rakkudes sünteesib LasI 3-okso-C12-HSL (dodekanoüül-homoseriinlaktoon), mille tunneb ära LasR. LasR aktiveerib akuutse infektsiooni virulentsusgeenid, nagu lasA , lasB (elastaas, oluline ekstratsellulaarne proteaas, mis põhjustab kahjustusi kudedes, lõikab immuunoglobuliine, tsütokiine jt olulisi immuunvastuse valke), eksotoksiin A (inhibeerib EF-2, translatsiooni) ja aluselise proteaasi geeni. Lisaks aktiveerib LasR teise hulgatunnetusraja regulaatrogeeni rhlR.
Rhl-süsteem tunnetab C4-HSL (butanoüül-homoseriinlaktoon), mida sünteesib RhlI ja millega seondub regulaator RhlR, mis aktiveerib ramnolipiidide sünteesi (vajalik voogamiseks) ning LasA ja LasB ekspressiooni.
Hulgatunnetus peab olema bakteritel täpselt regulaaritud tagamaks õiget ajastatust ning õiges keskkonnas virulentsusgeenide ekspressiooni. P. aeruginosa’l on 4 valku, mis reguleerivad hulgatunnetussüsteemide ekspressiooni või vastust signaalmolekulile. Lisaks neile neljale on bakteril palju regulaatorvalke, mis sarnanevad LasR-i või RhlR-ga. Need valgud on transkriptsiooni-regulaatorid, mis osalevad hulgatunnetuse reguleerimisel, kuid neil pole oma signaalmolekuli süntetaasi. Enamikel juhutudel on selliste regulaatorite roll teadmata, välja arvatud QscR-i puhul. QscR seondub LasR ja RhlR valkudega, takistab transkriptsiooni aktivatsiooni ning sedasi vähendab P. aeruginosa virulentsust.
RsaL on Las-süsteemi signaali peamine repressor, kontrollides, millal bakter signaali edastab. RsaL seondub lasI promootoralale simultaanselt 3-oxo-C12-HSL/LasR kompleksiga ning represseerib lasI transkriptsiooni. Sarnaselt lasI repressiooniga, represseerib RsaL ka teisi virulentsusgeenide transkriptsiooni nagu püotsüaniini ja vesiniktsüaniidi sünteesi geene.
QslA hoiab ära süsteemi aktiveerumise varajases logaritmilises faasis. QslA seondub LasR-ga ning takistab LasR-l DNA-ga seondumist ning transkriptsiooni aktivatsiooni. QslA ei mõjuta LasR-i stabiilsust ega RhlR-i kaudu hulgatunnetuse signaali aktiveerimist.
QteE on neljas hulgatunnetuse vastuse modifitseerija. QteE mõjutab LasR ja RhlR stabiilsust ning sellest johtuvalt regulaatorvalkude kuhjumist bakteris. QteE üleekspressioonitüved pärsivad P. aeruginosa patogeensust Drosophila mudelsüsteemis.
PQS-süsteem (Pseudomonas quinolone signal) on P. aeruginosa kolmas hulgatunnetuse süsteem, mida vahendab PQS (2-heptüül-3hüdroksü-4-kinoloon) ja HHQ signaalmolekulid (PQS eellasmolekul). Kinoloonisüsteemi signaalmolekul sünteesitakse antranilaadist ning pole AHL-süsteemiga seotud. Signaaliraja regulaator PqsR tunneb ära nii PQS kui ka HHQ ning tekkinud kompleks aktiveerib kinolooni sünteesigeenide pqsABCDE ekspressiooni. Erinevalt PQS signaalmolekuli sünteesioperoni aktivatsioonist, aktiveerib PqsR püotsüaniidi sünteesigeenide ekspressiooni ainult PQS-ga seotult. PQS operonis olev pqsE geen ei osale PQS signaalmolekuli sünteesis vaid kontrollib püotsüaniini, lektiini, ramnolipiidide ja vesiniktsüaniidi sünteesi.
PQS-süsteemi signaali leviku eest rakust rakku vastutab HHQ. Kui deleteerida P. aeruginosa genoomist pqsH, mis vastutab PQS-molekuli sünteesi eest HHQ-st, siis bakterid on ikkagi virulentsed. Pealegi teistel Pseudomonas’tel on sünteesi lõpp-produktiks just HHQ, mitte PQS. Miks P. aeruginosa sel juhul sünteesib PQS-i? PQS seob Fe-ioone ning akumuleerib raua bakteri lähedale. Erinevalt siderofooridest, millega transporditakse seotud raud rakku, jääb PQS rakust välja. PQS-Fe on tõenäoliselt rakuväliseks rauadepooks.
PQS-süsteem on hierarhiliselt reguleeritud, LasR aktiveerib pqsR transkriptsioon ja RhlR inhibeerib pqsR-i transkriptsiooni. H-NS-i analoogid P. aeruginosa’s MvaT ja MvaU represseerivad PQS-süsteemi. Kinolooni signaalsüsteem on aktiveeritud siis, kui bakter asub haavades. Kinolooni signaalsüsteemiga indutseeritaks mitme virulentsufaktori ekspressioon – püotsüaniin, vesiniktsüaniid, ramnolipiidid, lektiinid ja elastaasi süntees.
Tüved, mil on hulgatunnetussüsteemid deleteeritud või nende töö häiritud, on metsiktüvest vähem virulentsed. P. aeruginosa AHL produktsioon võib pärssida konkurendi virulentsust, nagu näiteks Staphylococcus aureus’e korral.
Lisaks on P. aeruginosa’l AI-2 retseptorkompleks, mis tunneb keskkonnast ära AI-2 signaalmolekuli. Samas P. aeruginosa’l pole AI-2 signaalmolekuli sünteesivat ensüümi. Arvatakse, et selle retseptori abil tunnetab bakter konkureerivate kommensantide olemasolu.
Gac-süsteem (global activator of antibiotic and cyanide synthesis) kontrollib AHL ekspressiooni P. aeruginosa’l negatiivselt. Gas-süsteem on olulisem kahekomponentne süsteem, mis reguleerib P. aeruginosa akuutse infektsiooni üleminekut kroonilisele infektsioonile. Gac-süsteemi oluliseks osaks on translatsiooni regulaator RsmA, mis seondub mRNA-dele ning reguleerib translatsiooni. RsmA repressoriteks on sRNA-d RsmZ ja RsmY, mis seonduvad RsmA-ga ning takistavad nii regulaatori seondumist mRNA-dega. Sensor GacS võtab signaali vastu, autofosforüleerub ning kannab fosfaatjäägi transkriptsiooniregulaatorile GacA-le. Fosforüleeritud GacA aktiveerib sRNA-de transkriptsiooni. Signaal, mis tuleb rakku GacS-i kaudu, aktiveerib biofilmi moodustumiseks vajalikud geenid ning represseerib palju akuutseks infektsiooniks vajalikke geene .
Pigmendid kui signaalmolekulid ja virulentsusfaktorid. Perekonna Pseudomonas liigid toodavad palju pigmente, mida kasutatakse Fe omastamiseks, elektronide akseptoriteks või patogeneesiks. Fenasiinid on redoksaktiivsed heterotsüklilised lämmastikku sisaldavad pigmendid. Fenasiinid on varieeruvad tsüklilised ühendid, mis on toksilised nii prokarüootidele kui eukarüootidele. Fenasiine sünteesivatel bakteritel on suur konkurentsieelis nende bakteri liikide või tüvede ees, mis fenasiine ei tooda. Eriti tugevas konkurentsis toitainete pärast risosfääris. Püotsüaniid on fenasiin, mida toodab ainult P. aeruginosa ning on selle bakteri üks peamistest virulentsusfaktoritest, mis on oluline nii kroonilise kui akuutse infektsiooni korral. Püotsüaniid surub maha lümfotsüütide paljunemise ning kahjustab epiteelrakke. Püotsüaniid põhjustab reaktiivsete hapnikuradikaalide tekke peremehe rakus ning sellega inaktiveerib proteaasid ning kahjustab palju rakufunktsioone.
P. aeruginosa kasutab püotsüaniidi signaalmolekulina ning selle abil kontrollib statsionaarses faasis mitme geeni ekspressiooni, mida nimetatakse PYO-reguloniks. PYO-regulonis on effluks- pumbad (mexGHI-ompD), raua omastamise geenid ning redokspotentsiaali geenid. Püotsüaniidi sünteesigeenid on PQS-i ja PqsE kontrolli all.
Escherichia coli tüvedelt pole leitud AI-1 sünteesi eest vastutavat LuxI-d, kuid mõnel tüvel on leitud LuxR-i analoogretseptor SdiA, mis tunnetab teiste bakterite AI-1. AI-2 puhul on tegemist pigem metaboolse tähtsusega ning vähe hulgatunnetuse signaliseerimisega. Adrenaliini/noradrenaliini tunnetav süsteem AI-3 on patogeensetel E. coli tüvedel, mis põhjustavad põletikke jämesooles. Loomkatsetes on näidatud, et AI-3 retseptori deleteerimine vähendades E. coli’st põhjustatud jämesoolepõletikke. Arvatakse et hulgatunnetus võib reguleerida patogeensetel E. coli tüvedel biofilmi varaseid etappe ja liikuvust.
Staphylococcus aureus’el on vähemalt kaks hulgatunnetussüsteemi ning lisaks palju muid süsteeme, mis reguleerivad bakteri füsioloogiat vastavalt keskkonnatingimustele. S. aureus’el on kõige olulisemaks hulgatunnetussüsteemiks Arg-süsteem, samas mõned tüved võivad kasutada AI-2 süsteeme (LuxS), mida võidakse kasutada biofilmist eraldumiseks, milleks ekspresseeritakse peptiide. Siiski Arg-süsteem on peamine.
Patogeneesi alguses, kui baktereid on vähe, on enamik virulentsusgeenide ekspressioonist välja lülitatud. Ekspresseeritakse ainult pinna-adhesiine ning immunoglobuliini inhibiitormolekuli proteiin A-d. See on kontrollitud madala signaalmolekuli kontsentratsiooniga ning sarA reguloniga. Kui bakter ründab peremeesorganismi, siis hulgatunnetuse abil on eksotoksiini, proteaasi ja hemolüsiini ekspressioon kiiresti üles reguleeritud. Adhesiini ekspressioon on alla reguleeritud, millest tulenevalt koloniseeritakse uued piirkonnad peremehes. Hulgatunnetuse abil S. aureus’e biofilm lagundatakse, mis on iseloomulik G(+) patogeensetele bakteritele.

15.5. Liikide ja domeenidevaheline hulgatunnetus

Hulgatunnetuses kasutatavaid signaalmolekule võivad ära tunda teised bakteriliigid, mis ise neid signaalmolekule ei sünteesi, või isegi eukarüoodid. Bakter võib ära tunda samas ökoniššis oleva teise liigi toodetud AI-2 signaalmolekule ning sellega lahjendada hulgatunnetuse signaali või AI-2 süsteemi kasutada enda huvides, aktiveerides oma hulgatunnetuse geenid. Bakterikooslustes arvatakse olevat üsna palju sellised baktereid, mis ise ei tooda signaalmolekule ning hoiavad sellega energiat kokku. Samas tunnetavad sellised bakterid naabrite signaalmolekule.
Eukarüoodi ja bakteri vahelist signaalide tunnetamist on leitud ka inimese ja inimese patogeensete G(-) bakterite vahel. AHL molekulid difundeeruvad hõlpsasti läbi inimese epiteelrakkude ja immuunrakkude membraani ning seonduvad tsütoplasmaatiliste retseptoritega, mille tulemusel muutub inimese geenide ekspressioon (tsütokiniinid, kemokiniinid), mis reguleerivad inimese vastust patogeenidele. AHL molekulid lülitavad T-helper lümfotsüütide 1 tsütokiinse raja ümber 2 tsütokiinsele rajale (antikehade tootmisele), neutrofiilid suunatakse apoptoosi ja stimuleeritakse hingamisteede epiteelis mutsiinide sünteesi.
Bakterid võivad tunnetada inimese stressi. Pseudomonas aeruginosa mõne tüve välismembraanis on IFN retseptorid (klass II interferoon, mis on vajalik makrofaagide aktiveerimiseks). Kõrge IFN kontsentratsioon signaliseerib bakterile, et peremees on nõrk ning kergesti haavatav.
Mõnikord on hulgatunnetus seotud otseselt bakteri ellujäämisega teatud ökoniššides, kus on mikroorganisme väga palju koos ning toitained limiteeritud. Näiteks Staphylococcus’te Arg-süsteemi signaalmolekulid suruvad maha teise patogeeni, pärmi Candida albicans’i, metabolismi. Sellisel moel bakter surub maha konkurendi tingimustes, kus toitaineid on limiteeritud.
Bakteri ja seene koostoimimises võib inimese tervis märgatavalt halveneda ning lõppeda surmaga. Tervel inimesel võib leida baktereid ja seeni nahal, hammastel, soolestikus jne, kus mikroorganismid elavad kommensantidena ega ohusta inimese tervist. Kuid lokaalsed vigastused, halb suuhügieen, keemiaravi, kirurgilised operatsioonid vähendavad inimese vastupanuvõimet ning mikroorganismid võivad üheskoos rünnata inimest ning põhjustada kroonilisi või akuutseid infektsioone.
Inimese mikrobiootas mõjutavad bakterid ja seened teineteist. Tihti hulgatunnetuse signaalmolekulide abil võivad mikroorganismid segakultuuris kahjustada, modifitseerida füsioloogiat või soodustada teineteise patogeneesi. Inimese segainfektsioonid pole sagedased, kuid näiteks hingamisteede segainfektsiooni korral kiirendab Candida spp Pseudomonas aeruginosa põhjustatud kopsupõletiku tekkimist. On näidatud, et inimese immuunsüsteem saab segainfektsiooniga halvemini hakkama kui üksiku patogeeni infektsiooniga. Laborikatsetes on leitud, et kasvatades vedelsöötmes Candida albicans’i ja Pseudomonas aeruginosa segakultuuri, abistab C. albicans P. aeruginosa biofilmi moodustumist, samas biofilmi moodustumine tapab seene. P. aeruginosa kinnitub seene hüüfidele, kuid mitte seene rakule endale, ning tapab seene ROS-e põhjustava püotsüaniidi tootmise abil. Lisaks toodab bakter hemolüütilist fosfolipaasi C, mis lagundab eukarüoodispetsiifilisi fosfolipiide. Pseudomonas aeruginosa toodetud 3-oxo-C12-HSL pärisb Candida albicans’i filamenteerumist, mis on vajalik pärmi infektsiooni väljakujunemiseks. Samal ajal pärisb C. albicans’i farnesool P. aeruginosa PQS-signaalirada ning püotsüaniidi ekspressiooni. Farnesool ning 3-oxo-C12-HSL on struktuurilt sarnased ning arvatakse, et sarnased molekulid konkureerivad omavahel organismi retseptorile ning retseptor ei suuda signaali edasi anda, kui on seondunud võõra signaalmolekuliga. Farnesool vähendab P. aeruginosa voogamist, mis võib soodustada bakteri biofilmi moodustumist ning kroonilise infektsiooni tekkimist.

16. Taim-bakter interaktsioonid – endofüüdid

Taimed elavad interaktsioonis (sümbioosis) teiste organismidega. Peale traditsiooniliselt käsitlevate mikroorganismide, nagu sümbiondid, patogeenid ja risosfäärsed kommensandid, on taimede jaoks olulised taimede kudedes elavad mikroorganismid, mida nimetatakse endofüütideks. Endofüüdid on mikroorganismid, mis mingi eluetapi elavad taimekudedes. Kõik taimed sisaldavad endofüüte, milleks võivad olla eubakterid, arhed, seened või algloomad. Kõik taimekoed , juured, varred, lehed, õied ja ka meristeemkude sisaldab rohkem või vähem endofüüte. Endofüüditel on oluline roll taime arengus, kasvus ning vastupidavuse kujunemises abiootilisele ja biootilisele stressile. Endofüüdid võivad olla kommensandid, mutualistid või patogeenid ning taim-mikroorganismi interaktsiooni tüüp sõltub mikroorganismi ja taime genotüüpidest, abiootilistest teguritest ja teistest endofüütidest, mis taime koloniseerivad.
Endofüütidest johtuvalt ei pea taime genotüüp kodeerima kõiki taime fenotüübis ilmnevaid tunnusevariante. Näiteks taime kasv, saagivõime ja vastupanuvõime stressile võib tuleneda endofüütidest, mis elavad taimega seotult. Kasutusele on võetud taime mikrobioomi mõiste, mille all mõeldakse kõigi mikroorganismide, mis elavad taimega seotult (kas endo - või eksofüüdina), genoome. Sellises valguses võib Lamarcki kontseptsiooni elueal omandatud tunnusevariantide edasipärandamist seletada taime mikrobioomi edasipärandamisega.

16.1. Mõiste „endofüüt“

Saksa botaanik Heinrich Friedrich kasutas 1809. aastal esimesena mõistet „endofüüt“. Sel ajal käsitleti endofüüdina poolparasiitseid seeni, mis elasid taimedel. Sel ajal arvati, et terve taim on steriilne ning arvati ainult parasiitsed seened või patogeenid kasvavad taimedel. Siiski juba 19. sajandil kirjeldas Galippe köögiviljades elavaid mikroorganisme, mis võivad olla migreerunud mullast taime ning olla taimede jaoks soodsad. Kuigi 19. sajandi lõpus ja 20. sajandi alguses leiti üha rohkem tõendeid, et taimekudedes elavad taimele kasulikud mikroorganismid, arvati ikkagi, et endofüüdid on peamiselt patogeensed organismid. 1888. aastal avastas Hollandi teadlane Martinus Willem Beijerinck liblikõieliste juuremügaratest Rhizobium leguminosarum’i, mis on võimeline omastama õhust lämmastikku. Samal ajal kirjeldati liblikõieliste puhul lämmastikust sõltumatut kasvatamist , mis toimub tänu sümbiontsele Rhizobium’ile.
1991. aastal defineeriti „endofüüt“ kui bakter, mis kasvab taimekudedes, kuid ei põhjusta taimele silmnähtavat kahju. Mõned aastad hiljem, 1997. aastal, defineeriti „endofüüt“ kui bakter, mida on võimalik eraldada taimekudedest, mille pinnad on muudetud steriilseks. Samas oli alles jäetud tingimus, et endofüüt pole taimele kahjulik. Selline definitsioon on liiga kitsas ning tänapäeval enam ei sobi kasutamiseks. Esiteks on teada, et sama bakter võib käituda erinevalt, kui muuta keskkonda. Bakterid võivad olla ühes taimes kommensandid või isegi taime jaoks kasulikud, kuid teises taimeliigis muutuda patogeenseks. Näiteks fluorestseerivate pseudomoonaste hulgas on liigid, mida peetakse üldiselt taimekasvu soodustavateks bakteriteks, nagu P. putida ja P. fluorescens. Samad bakteriliigid võivad olla nahksete lehtedega sõnajalgade jaoks patogeenid. Samuti on keeruline kitsa endofüüdi mõiste alla paigutada liike, mis taimedel võivad olla kommensandid, kuid inimesele ohtlikud patogeenid (nt P. aeruginosa). Teiseks, patogeensed bakterid võivad olla latentses seisundis ning muutuda taimpatogeenideks keskkonnatingimuste muutumisel. Kolmandaks , kõik bakterid pole kultiveeritavad ning traditsiooniliste mikrobiootiliste meetoditega pole võimalik taimekudedest kirjeldada kõiki baktereid. Sellest tulenevalt defineeritakse tänapäeval endofüüdiks mikroorganismid elukoha järgi, kus nad elavad, vaatamata funktsioonile. Seega endofüüdid on kõik mikroorganismid, mis teatud eluetapil või terve elu elavad taimekudedes.

16.2. Endofüüdid

Endofüütseid baktereid on leitud väga erinevatest taimehõimkondadest: lehtsammaltaimedest (Bryophyta), sõnajalgtaimedest (Pteridophyta), paljasseemnetaimedest (Gymnospermae) ja katteseemnetaimedest ehk õistaimedest (Angiospermae).
Taimedest on leitud väga palju erinevatest hõimkondadest baktereid. 16S rRNA sekveneerimise abil on kirjeldatud taimede kudedest 21 eubakterite hõimkonda ja 2 arhede hõimkonda, nagu näiteks Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chlamydiae, Frimicutes, Proteobacteria, Spirochaetae jpt. Kuigi taimedes on väga kirju seltskond baktereid, moodustavad valdava osa endofüütidest ainult 4 hõimkonna liigid: Proteobacteria (54%), Actinobacteria (20%), Firmicutes (16%) ja Bacteroidetes (6%). Samad hõimkonnad on valdavalt ka taimede risosfääris. Arhesid on kirjeldatud ainult üksikutel juhtudel, neid on leitud maisist, kohvipuu marjadest ning arktilises tundras kasvavates lugades (Juncus trifidus). Kuigi taimedest on leitud valdavalt neljast hõimkonnast baktereid, kuuluvad bakterid väga paljudesse perekondadesse ning taim-bakter suhe, kas tegu on mutualismi või patogeensusega, sõltub rohkem taime ja bakteri genotüübist, kui sellest, millise bakterina on ta varem kirjeldatud.
Proteobacteria hõimkonnast on enim leitud taimedest -proteobaktereid (26%), millest omakorda on enim kirjeldatud liike perekondadest Pseudomonas, Enterobacter , Pantoea, Stenotrophamonas ja Acinetobacter. Perekonna Pseudomonas tuntud liikidest on kirjeldatud nii taime kasvu soodustavaid liike, P. fluorescens, P. putida kui ka taimpatogeene nagu P. aeruginosa, P. syringae, kui ka inimpatogeene P. aeruginosa. Sarnaselt perekonnale Pseudomonas võib leida ka teistest bakteriperekondadest nii mutualistlikke baktereid, kommensante kui ka patogeenseid liike.
Klassist α-Proteobacteria on enim kirjeldatud perekonna Rhizobium ja Bradyrhizobium, mis on tuntud N2-fikseerijatena liblikõieliste juurtes . Lisaks veel perekondi Methylobacterium ja Sphinomonas. Methylobacterium on võimeline kasutama metaani kui ainukest süsiniku- ja energiaallikat ning arvatakse, et selle pärast on perekond Methylobacterium risosfääris domineeriv.
G(+) bakterite hulgas on kõige enam kirjeldatud hõimkonda Actinobacteria (20%), millest tuntuim on Streptomyces antibiootikumide tootmisvõime poolest. Firimicutes’te klass Bacilli (15%) on samuti endofüütide hulgas väga sagedasti kirjeldatud. Bacillus thuringiensis on tuntud kui kristalliliste valkude tootja, mis on insektsiidse tähtsusega.
Endofüüdid võivad taimedes olla kas obligatoorsed ehk teisisõnu mikroorganismid, mis vajavad taimedes elamist teatud elutsükliks. Sellised endofüüdid pole võimelised ilma taimedeta elama. Obligatoorseid endofüüte on väga palju kirjeldatud seente hulgas. Teiseks äärmuseks on oportunistlikud endofüüdid, mis ei vaja taime kudedes elamist, kuid siiski võivad sattuda taimedesse. Sellisteks bakteriteks on perekonna Pseudomonas ja Azospirillium liigid, mis on tüüpilised risosfääri bakterid. Enamikel juhtudel on tegu vahepealsete juhtudega ehk fakultatiivsete endofüütidega. Tänapäeval vaieldakse, kas fakultatiivsed endofüütsed bakterid kasutavad taimi kui vahendit levimiseks või on pigem tegemist taime aktiivse valikuga. Igal juhul fakultatiivsed endofüüdid kasutavad taime „pakutud“ toitaineid energiaallikaks. Tõenäoliselt on ka fakultatiivsed endofüüdid taimedele kasulikud, sest vastasel juhul taimede kohasus langeks, kuna endofüüdid oleks taimele energeetiliseks koormaks.

16.3. Endosfääri koloniseerimine

Edukas taimekudede koloniseerimine sõltub mitmest faktorist: taime ja bakteri genotüübist, taimekoest, abiootilistest ja biootilistest teguritest. Paljud endofüütsed bakterid pärinevad taimerisosfäärist ning on juurte välispinna koloniseerijad. Taimed võivad kuni 30% assimileeritud süsinikust eritada juurte kaudu mulda. Juurte eritistel on kaks funktsiooni – metallide omastamine mullast ning bakterite meelitamine taimede lähedusse. Juurte tippudest eritab taim kõige rohkem assimileeritud süsinikku ning seda kergesti omastavate ainetena nagu orgaaniliste hapetena, aminohapetena ning sahhariididena. Mercado-Blanco ja Prieto on pakkunud välja hüpoteesi, et juurte endofüüdid sisenevad taimekudedesse juurekarvakeste koloniseerimisega. On leitud, et teatud olukordades võib taim eritada süsinikallikaks kasutatavaid aineid ka varte ja lehtede kaudu, mida kasutavad bakterid vastavate taimekudede koloniseerimiseks. Vaatamata sellele vähendab UV-kiirgus, pindade kuivamine ja toitainete vähesus lehtede ja varte koloniseerimist. Ainult spetsiifilised bakterid on võimelised taime maapealseid osi koloniseerima ning see toimub õhulõhede ja hüdratoodide kaudu. Hüdratoodid on taimeorganid , mille kaudu taim vabaneb üleliigsest veest, kui aurumine on vähene.
Sõltuvalt bakterist on välja pakutud erinevaid koloniseerimisviise, mida võib jagada kaheks: passiivseks ja aktiivseks koloniseerimiseks. Bakterid peavad läbima taime eksodermi (koorerakkude kihi), mis on esmaseks barjääriks. Kui bakter tungib läbi endodermi ning jõuab ksüleemi (taime juhtkoed, millega transporditakse juurtest peamiselt vett taime maapealsetesse osadesse), saab bakter liikuda kõikidesse taimeosadesse. Samas liiguvad endofüüdid mööda juhtkimpe väga aeglaselt ning selle põhjust ei osata seletada. Ksüleemi poorid on piisavalt suured selleks, et bakterid sealt läbi mahuks, kuid taime maapealsete osadesse jõudmiseks võib endofüütidel kuluda nädalaid. Bakterid võivad liikuda katteseemnetaimedel (Angiospermae) paljunemisorganitesse. Eubaktereid on leitud taimede õitest, viljadest ja seemnetest. Paljasseemnetaimedel (Gymnospermae, tuntuimad on okaspuud ) on baktereid leitud ka tolmuteradest.
Enamik endofüüte kasutab taime koloniseerimiseks taime juuri. Taime juurte endofüüte on võrreldud inimese soolestiku mikrobiootaga. Kõige olulisemaks faktoriks, mis mõjutab endofüütide mitmekesisust ning koosseisu arvatakse olevat pinnasel , kus taim elab. Seejärel on oluliseks teguriks taime genotüüp.
Taime endofüüdid võivad edasi kanduda seemnetega. Näiteks maisi puhul määravad seemnetega endasikantavad endofüüdid taime vastupidavuse stressile. Samas seemnetega edasikantavate endofüütide koosseis erineb juurte kaudu koloniseerinud endofüütidest. Seemnetega endofüütide edasikandumine võib toimuda põlvkondi. Riisi puhul on näidatud, et kuni 45% seemnete endofüütidest kandus edasi taime kaks põlvkonda. Putuktolmlejatel taimedel on seemnete endofüüdid tunduvalt erinevamad ning sõltuvad pigem tolmeldavast putukast.

16.4. Endofüütide toime taimele

Osa endofüüte ei avalda taimedele silmnähtavalt mingit mõju. Nad elavad taimedes, kasutavad taimede metaboliite, kuid tavaliselt taimed kasu endofüütidest ei saa. Selliseid baktereid nimetatakse kommensantideks. Taimele kasulikud bakterid ehk mutualistid kaitsevad taime patogeenide ja herbivooride eest (herbivooride eest kaitsevad taimi peamiselt seened). Selleks produtseerivad bakterid mitmesuguseid abiootilisi aineid või kutsuvad taimes esile indutseeritud resistentsuse. Kasulikud endofüüdid võivad taime kasvu soodustada taimehormoonide hulga reguleerimise kaudu või aidata taimedel omastada mineraale või soodustada fotosünteesi. Kolmandaks endofüütide grupiks on latentsed patogeenid. Sellised endofüüdid võivad olla taimele tavatingimustes neutraalse või kohastust vähendava toimega, kuid ekstreemtingimustes kaitsta taime.
Taimede kaitse biootilise ja abiootilise stressi vastu. Mutualistlikud bakterid võivad taimedes esile kutsuda indutseeritud süsteemse reistentsuse ehk ISR (induced systemic resistance) ning selle abil muuta taimed patogeenidele resistentsemaks. Tuntuimad bakteriperekonnad, mis kutsuvad ISR esile, on Pseudomonas ja Bacillus, kuid ka teistest perekondadest liigid võivad taimedes ISR esile kutsuda. Taimedele kasulikud bakterid kutsuvad kolonisatsiooni alguses sarnaselt patogeenidega ISR-i esile, kuid on võimelised ISR-i vältima ning koloniseerimise edukalt lõpetama. Tavaliselt kutsub ISR-i esile: flagella, antibiootikumid, HSL, salitsüülhape, jasmoonhape, siderofoorid ja lipopolüsahhariidid. Näiteks varre endofüüt Methylobacterium sp. tüvi IMBG290 on võimeline hulgast sõltuvalt muutma kartuli resistentseks patogeenile Pectobacterium atrosepticum. Sõltuvalt taime endofüütide komplektist võib taim olla kaitstud patogeensete bakterite vastu või mitte, olenevalt sellest kui efektiivselt endofüüdid ISR-i esile kutsuvad.
Endofüütsed bakterid võivad taimi kaitsta antimikroobsete ainete tootmisega. Näiteks Enterobacter sp tüvi 638 toodab antibiootilisi aineid, mille hulgas on 2-fenüületanool ja 4-hüdroksübensoaat. Mõlemad ained mõjuvad taimsetele patogeensetele seentele kasvu pärssivalt. Samuti on leitud, et 2-fenüületanool pärsib Aafrika unetõve tekitaja Trypanosoma elutegevust. Endofüütsed aktinomütseedid on tuntuimad antibiootikumide tootjad. Näiteks Streptomyces sp NRRL 3052, mis on Austraalias kasvava taime Kennedia nigriscans endofüüt, toodab munumbitsiine, mis on uue põlvkonna antibiootikum. Olemuslikult on munumbitsiin peptiid, mis koosneb treoniinist, aspartaadist, glutamaadist, valiinist ja proliinist. Varieerides aminohapete vahekordi on võimalik munumbitsiini varieerida ning varieerida ka sihtmärkorganisme, millele antibiootikum mõjub. Munumbitsiin toimib nii taimepatogeenidele kui ka inimese ohtlikele patogeenidele nagu Staphylococcus aureus’e MRSA tüvedele, Bacillus anthracis’le, Mycoacterium tuberculosis’e multiresistentsetele tüvedele ning isegi Plasmodium falciparum’le (malaaria tekitaja). Veel on leitud, et endofüütsed Steptomyces’ed toodavad kakadumütsiine ja koronamütsiine, mis on pälvinud tähelepanu just inimpatogeenide vastaste antibiootikumidena, kuid millist rolli mängivad need taim-bakter suhetes vajab siiski veel täpsustamist.
Bakterid võivad sekundaarsete metaboliitide kaudu mõjutada taimede elutegevust. Sekundaarseteks metaboliitideks nimetatakse aineid, mis on antibakteriaalsed, antinematoodsed, antiviraalsed, antioksüdantsed või muu sarnase toimega. Lisakse eelpool toodud näidetele võivad bakterid sekundaarsete metaboliitide abil mõjutada taimede viljade aroomi ja maitset . Näiteks Methylobacter’i tüved võivad mõjutada maasikates aroomiainete tootmist, milleks on furanoonid . Sarnaselt bakteritele võivad endofüütsed seened mõjutada taime viljade keemilist koostist Näiteks mustika vilja fenoolsete ainete, flavanoolide ja oligomeersete proantotsüaniidide (pigmendid) sisaldust.
Raua omastamine. Palju baktereid, eriti risosfäärseid, toodavad siderofoore, saamaks keskkonnast kätte rauda ja teisi metalle . Näiteks fluorestseeruvad Pseudomonas’ed on fluorestseeruvad just püoverdiini tootmise tõttu, mis on üheks siderofooriks. Bakterid transpordivad siderofoorid rakust välja ning on võimelised spetsiifiliste retseptorite abil metalliga seondunud siderofoore rakku tagasi transportima.
Täpselt ei teata, kuidas siderofooride tootmine endofüütidel tõstab taimede resistentsust patogeenide suhtes. Arvatakse, et siderofoorid osalevad ISR tekkimises. Samas risosfäärsete bakterite korral arvatakse, et siderofoore tootvad bakterid „korjavad“ raua patogeenide eest ära ning patogeen ei saa rauda kätte. Täheldatud on, et endofüütsed Methylobacterium’i tüved, mis toodavad siderofoore, pärsivad tsitruseliste patogeenide kasvu. Lisaks on siderofoore tootvatel bakteritel tihti rohkem erinevaid retseptoreid siderofooride rakku transportimiseks, kui nad ise toodavad. Selle tulemusena võivad bakterid transportida rakku ka siderofoore, mida on tootnud teised bakteriliigid.
Abiootilist stressi aitavad leevendada paljud endofüütsed seened. Seentel on tähtis roll kaitsmaks taimi põua ja vähese lämmastiku korral. Samas on näidatud, et ka bakterid võivad tõsta taimede põuakindlust. Näiteks Bulkholderia phytofirmans’i tüvi PsJN suurendab maisi ja nisu põuakindlust ning viinapuu külmumiskindlust. Arvatavasti toimub see osmoosi ja õhulõhede reguleerimise abil.
Bakterid võivad taimede stressi leevendada ka etüleeni lagundamise abil. Etüleen on taimedel oluline hormoon viljade küpsemisel ja sügisel lehtede langemisel. Sellistel bakteritel on ACC deaminaas aktiivne. See ensüüm lagundab taimedes toodetud etüleeni prekursori 1-aminotsüklopropaan-1-karboksülaadi (ACC) ammooniumiks ja 2-oksobutanoaadiks, ennetades etüleeniks lagundamist. ACC deaminaas võib osaleda paljudes taimede kasvu soodustavates protsessides. Näiteks juurte endofüüt Bulkholderia pikendab õite eluiga ning juurte pikikasvu, vähendades ACC deaminaasiga taime etüleenistressi.
Endofüüdid võivad taime kasvu soodustada võimendades taimede fotosünteesi, klorofülli sisaldust, vee omastamisvõimet ning CO2 assimilatsiooni seni teadmata moel nagu näiteks soodustab Bulkholderia phytofirmans tüvi PsJN maisil. Samas, üsna hästi on uuritud endofüütidel taimehormoonide tootmist, mille abil endofüüdid võivad muuta taime morfoloogiat. Tavaliselt sünteesivad endofüüdid auksiine (IAA) ja giberrelliine, mis mõjutavad taime kasvu, meristeemi diferentseerumist ning seemnete idanemist.
Endofüütide õhulämmastiku sidumine ja seeläbi taime kasvu soodustamine on hästi teada tõik. Tavaliselt kirjeldatakse liblikõieliste juurtes elavaid Rhizobium’e, kuid lisaks võivad taimi koloniseerida ka teised õhulämmastikku omastavad bakterid, nagu Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillium spp, Azoarcus spp, Gluconacetobacter diazotrophicus jpt. Peale liblikõieliste võivad lämmastikku fikseerivad endofüüdid koloniseerida ka teistest sugukondadest pärit taimi, nagu lepp , drüüas ja suhkruroog. Üldiselt lämmastikufikseerijad omastavad õhulämmastikku tunduvalt halvemini, kui nad elavad planktiliselt. Lisaks sellele pole veel päris selge, kas lämmastiku fikseerimine endofüüdina on mõeldud bakterile endale või „vahetuskaubaks“ taimele. Igal juhul paraneb taimedel lämmastiku omastamine ning endofüütidega taimed saavad konkurentsieelise , kuna kasvavad kiiremini. See on eriti oluline liikidevahelises konkurentsis kasvukoha pärast.

16.5. Endofüütide genoom võrreldes teiste bakteritega

Laiaulatusliku genoomide võrdlemisega on leitud, et endofüüdid erinevad teistest bakteritest geneetiliste elementide poolest, mis soodustavad endofüütset eluviisi. Eriti oluline on horisontaalne geeniülekanne omandamaks vajalikke geene, mille abil kantakse üle plasmiide, transponeerivaid elemente või muid vajalikke geneetilisi elemente. Näiteks Enterobacter sp 638 on leitud palju transponeerivaid DNA-elemente, mis piirnesid kolonisatsiooniks vajalike geenidega, lisaks on sellel tüvel palju konjugatiivseid plasmiide, mis aitavad koloniseerimisele kaasa. Genoomi suurusel ja taimede koloniseerimisvõimel on leitud üldine seos. Suuremate genoomidega bakterid on võimelised koloniseerima mitmeid taimi, samas kui väiksema genoomiga bakterid on rohkem spetsialiseerinud ühele või mõnele taimeliigile.
Mutualistlikel bakteritel on genoomist võimalik leida palju biosünteesi eest vastutavaid geene, samas kui patogeenidel võib leida palju degradatsiooniks vajalikke ja virulentsusgeene. Patogeenidel on vaja degradeerida taimeraku seina, samas kui mutualistlikud bakterid pigem aktiveerivad stressivastuse geene, mis aitavad taime tekitatud stressist jagu saada. Kui patogeenidel on levinud palju sekretsiooniga seotud geene, siis mutualistlikel bakteritel on leitud lämmastiku fikseerimisega geene ning isegi ribuloos bisfosaat karboksülaas/oksügenaas (RubisCO) valke.
Võrreldes risosfäärsete bakteritega on endofüütide hulgas rohkem levinud aspartaadi/maltoosi (Tar) ja dipeptiidide (Tap) kemotaksisega ja katabolismiga seotud geene. Samas kui patogeensetel bakteritel on rohkem leivnud seriini metabolismiga seotud geene. Lisaks on nii endofüütidel kui ka risosfäärsetel bakteritel oluline kemotaksis ja viburitega liikumine. Endofüütidel on mitmeid kahekomponentseid süsteeme, mis on vajalikud just taimedes elamiseks. Näiteks aeroobne/anaeroobne hingamine, C-fikseerimine, N-fikseermine, denitrifikatsioon , elektrontransport ja aerotaksis on reguleeritud raku redokspotentsiaaliga ning nende funktrioonide reguleerimine aitab bakteril elada taimes. Endofüüdid tunnetavad redoksvastust regBA ja lämmastiku fikseerimisvajadust ntrYX. Endofüütidele on iseloomulik lämmastiku, süsiniku assimilatsiooni ning vitamiinide sünteesi regulaatorgeenide sage esinemine genoomis: N-assimileerimine nifA, lämmastikoksiidi redutseerimine norR, β-laktamaaside resistentsus ampR ja tiamiini metabolism tenA.
Lisaks metabolismi iseärasustele peab endofüüt taime kudedes hakkama saama taime kaitsesüsteemiga, mis hõlmab endas suurenenud reaktiivsete hapnikuradikalide (ROS) ja reaktiivsete lämmastikradikalide (RNS) kontsentratsiooni taimekoes. Geenid nagu glutatiooni peroksidaas btuE, glutatiooni S-transferaas gst, katalaas katE ja lämmastikoskiidi reduktaas norR on tunduvalt sagedamini esindatud endofüütide genoomis võrreldes sümbiontide ja patogeenidega. Samas vähendades reaktiivsete radikaalide hulka taimekudedes võivad endofüüdid vähendada ka taime enda stressi, mis võib tekkida taimes biootiliste (nt teine taim) või abiootiliste tegurite mõjul.
Võrreldes nooduleid moodustavate lämmastikfikseerijatega on endofüütidel levinud pigem tüüp IV sekretsioonisüsteem, mis on oluline konjugatsiooniks ning tüüp IVa piilid pinnal liikumiseks, lisaks veel teised adhesiooniks vajalikud geenid, mis soodustavad taimekudede koloniseerimist.

16.6. Inimese patogeenid ja kommensandid endofüütidena

Nii endofüüdid kui ka inimese patogeensed bakterid vajavad efektiivseks kudede koloniseerimiseks sarnaseid mehhanisme, nagu näiteks siderofooride retseptoreid raua homöostaasi hoidmiseks ning tüüp IV piilisid. Sarnaselt taime koloniseerivale Pseudomonas fluorescens’le kaotab ka inimpatogeen Salmonella typhimurium hiire kudede koloniseerimisvõime. Lisaks on inimese patogeenidel Pseudomonas aeruginosa ja Neisseria goborrhoeae’l eelnevatele organismidele sarnased tüüp IV piilid. Tüüp III sekrestsioonisüsteem, mille abil süstitakse efektoreid eukarüootidesse on sarnased nii inimpatogeenidel kui ka taime koloniseerivatel mikroobidel. Lisaks veel antibiootikumiresistentsuseks kasutatavad pumbad on olulised nii inimese kudede kui ka taimekudede efektiivseks koloniseerimiseks. Näiteks Stenotrophomonas maltophila kliiniliselt olulised tüved, mille kinoloonide resistsust tagav eflukspump SmeDEF on oluline tomati juurte edukaks koloniseerimiseks.
Taimekudesid on võimelised edukalt koloniseerima inim-, loom- kui ka taimpatogeenid. Inimese patogeenid perekondadest Enterobacter, Pseudomonas, Staphylococcus, Mycobacterium, Escherichia jpt võivad olla taimes mutualistlikeks endofüütideks ning soodustada taime kasvu, samas on nad tuntud kui inimese ohtlikud patogeenid. Enterobacteriaceae on suur sugukond , millest on paljud bakterid tuntud inimese patogeensete tüvedena. Need tüved võivad elada väljaspool loomade soolestiku taimedes endofüütidena ning olla looduslikuks reservuaadiks. Näiteks Escherichia coli inimesele patogeensed tüved võivad edukalt koloniseerida salatit ning liikuda mööda juhtkudesid salati organite vahel.
Berg jt (2015) ning Hanski jt (2012) on välja pakkunud hüpoteesi, et endofüütsed Enterobacteriaceae liigid on vajalikud inimese immuunsüsteemi korrektseks funktsioneerimiseks. Nimelt, on leitud seos Enterobacteriaceae loodusliku mitmekesisuse ja inimese naha mikrobioota ning allergilisuse vahel. Kui looduslik enterobakterite foon langes muutusid inimesed allergilisemaks. Pealegi enterobakterite endotoksiinidel on allergeensust mahasuruv efekt. Lisaks on leitud Acinetobacter’i arvukuse ja interleukiin 10 ekspressiooni vahel on positiivne seos. Acinetobacter’ga kokkupuutumine suurendas interleukiin 10 ekspressiooni ning allergia mahasurumist. Kuigi viimasel ajal on sagenenud endofüütidena elavate patogeensete Enterobacteriaceae liikidega nakatumine , arvatakse see olevat siiski pigem „tööõnnetus“ kui nakatumise sagenemine. Kui arvestada tohutut köögivilja kogust, mis aastas maailmas süüakse ning seda, et taimed on Entrobacteriaceae looduslik reservuaar , siis inimeste immuunsüsteem pigem vajab enterobaktereid endofüütidena immuunsüsteemi stimuleerimiseks selleks, et ära hoida allergia teket.
147