Nimetu (0)

Kordamisküsimused
MOLEKULAAR - JA RAKUBIOLOOGIA EKSAM 2011
KEEMILINE SIDE
1. Keemilise sideme tüübid ( kovalentne , mitte-kovalentne – vesinik -, ioon -, van der Waalsi ja hüdrofoobne side). Keemilise sideme omadused. Sideme energia, pikkus, küllastatavus, suund.
2. Miks vesi on hea lahusti (solvent)? Sest moodustuvad vesiniksidemed .
3. Termodünaamika II seadus. Isoleeritud süsteemis kulgevad kõik protsessid entroopia kasvu suunas.
4. Mis on kiraalsus ja kuidas seda kasutab loodus? Üks asümmeetriline aatom on kovalentselt seotud nelja erineva aatomi või rühmaga; enamik suhkruid on D isomeerid, aminohapped L isomeerid, ka ensüümid on kiraalsed. ravimitööstus? Sünteesitakse ravimühendte enantiomeere, mida ensüümid seoksid ning millel oleks vajalik toime. Tihti omab bioloogilist aktiivsust vaid üks isomeer ning ravimitööstuses kasutatakse seda bioloogiliselt aktiivsemate ainete saamiseks, looduses mitmekesisuse tõstmiseks. Valkude D-isomeersed vormid on väga stabiilsed, kuna neile ei leidu looduslikke lagundavaid ensüüme, seda kasutatakse ära ravimitööstuses.
5. Puhverlahused . Vesilahused, mille pH ei muutu väikese koguse happe või aluse lisamisel. Enamik puhvreid koosnevad nõrgast happest ja tema soolast. Bioloogiliste süsteemide puhverdusvõime. Ühe pH ühiku piires nende pKa ümbruses.
6. Bioloogilistele süsteemidele iseloomulikud energiavormid. Algne energia pärineb 99,9% fotosünteesist. ATP hüdrolüüs on tavalisim energiaallikas bioloogilistes süsteemides.
GEEN, GENOOM JA KROMOSOOM
1. Prokarüootse geeni struktuur. Ei sisalda introneid. Operon. Prokarüootidel geneetilise ekspressiooni ühik, mis koosneb ühest või enamast geenist ning operaator - ja promootorjärjestusest, mis reguleerivad nende transkriptsiooni. Geenide klaster, mis moodustab bakteriaalse operoni, sisaldab ühe transkriptsiooniühiku, kuna ühelt promootorilt transkribeeritakse üks primaarne transkript. Teisiti öeldes on geenid ja transkriptsiooniühikud prokarüootides tihtipeale üksteisest eristatavad.
2. Prokrüootsed kromosoomid . Rõngaskromosoomid. Struktuur üks replikatsiooni alguspunkt, geenid organiseeritud operonidesse, suurus – 160 000-12 200 000 aluspaari , pakituse tasemed – tuuma pole, selle asemel on tuumapiirkond , kromosoom on superkeerdunud ning assotsieeritud polüamiinide ja madalmolekulaarsete aluseliste valkudega, mis võimaldavad DNAd tihedalt bakteriraku keskosas pakkida.
3. Eukarüootse geeni struktuur. Sisaldab introneid ja eksoneid ning enhancer ’eid ja funktsionaalselt olulisi mittekodeerivaid alasid, mis määravad ära 3’ lõikamise ja polüadenülatsiooni toimumise koha. Eksonid – geenide osad, kodeerivad alad, tihti intronitest palju lühemad, intronid – geenide osad, mittekodeerivad alad, mis eemaldatakse RNA protsessingu käigus. Eksonid on geenis teineteisest eraldatud erineva pikkusega intronitega. Lihtsad ja komplekssed transkriptsiooniühikud. Eukarüootides on geenid ja transkriptsiooniühikud identsed. Eukarüootsed transkriptsiooniühikud jagatakse vastava primaarse transkripti edasise protsessimise järgi. Primaarset transkripti, mida sünteesitakse lihtsalt transkriptsiooniühikult, protsessitakse nii, et tulemuseks on vaid üht tüüpi mRNA, mis kodeerib üht tüüpi valku. Mutatsioonid eksonites, intronites ja transkriptsiooni kontrollivates piirkondades mõjutavad lihtsalt transkriptsiooniühikult sünteesitava valgu ekspressiooni ja funktsiooni. Kompleksse transkriptsiooniühiku korral saab RNA primaarset transkripti protsessida mitmeti, mille tulemusena tekivad erinevaid eksoneid sisaldavad mRNAd. Iga mRNA on aga monotsistroonne, st sellelt sünteesitakse vaid üht tüüpi valku. Primaarseid transkripte võib protsessida kolmel erineval moel: erinevate splaissaitide kasutamisega, polü(A) saitide alternatiivse kasutamisega ja alternatiivsete promootorite kasutamisega. Mutatsioon kontrollalas või eksonis, mis on ühised kõigile alternatiivsetele mRNAdele, mõjutab kõiki alternatiivseid valguprodukte. Mutatsioonid, mis esinevad vaid ühe mRNA koosseisus olevas eksonis, mõjutavad vaid ühte konkreetset valguprodukti, mida see mRNA kodeerib.
4. Eukarüootsete geenide ja mittekodeeriva DNA paiknemine kromosoomides. Geenide tihedus varieerub kromosoomidel suuresti: on geenirikkaid piirkondi, näiteks β-globiini klaster, geenivaesemaid piirkondi ja “geenikõrbeid”. Vaid väga väike osa sisaldab valkukodeerivaid eksoneid. Geeniperekonnad. Rühma duplitseeritud geene, mis kodeerivad aminohappejärjestuselt sarnaseid aga mitte identseid valke, nimetatakse geeniperekonnaks. Mittefunktsionaalne DNA. Ei kodeeri mRNAd ega ühtki muud organismile vajalikku RNAd ning ei oma mingit muud funktsionaalset tähtsust. Korduvjärjestused. Jaotuvad lihtjärjestusega DNAks (tsentromeersed alad) ja mõõdukalt korduvateks DNA järjestusteks (mobiilsed DNA elemendid). Tandemid. Tandeemselt korduvad geenid kodeerivad rRNAsid, tRNAsid ja histoone. Neid eristavad duplitseerunud geeniperekondadest identsed või peaaegu identsed valgulised või funktsionaalsed RNA- produktid . Tandemkordusega geenide paljusus on oluline, kuna rakul on vaja nende produkte suures koopiaarvus. Hajuskordused. Enamlevinud korduv-DNA vorm, nende hulgas on transposoonid , retrotransposoonid, mitte-LTR transposoonid ja protsessitud pseudogeenid . DNA “sõrmejäljed” ja nende määramine. Tekivad lihtsa järjestusega DNA järjestuste pikkuste erinevustest. Inimestele ja teistele imetajatele on iseloomulikud alad nimega minisatelliidid. Mikrosatelliitidest erinevad need selle poolest, et esimeste kordusalad on lühemad. Minisatelliidid on polümorfsed ning nende alade pikkuse järgi saab iga inimese jaoks koostada unikaalse DNA sõrmejälje. Speiser DNA. Mitteklassifitseeritud, mittetranskribeeritav, genoomis esindatud üksikkoopiana, sisaldub rRNA transkriptsiooniühikus. Inimese genoomi suurus ca 3 miljardit bp ja struktureeritus 46 kromosoomi, 23 000 geeni, valke ja funktsionaalseid RNAsid kodeerib vaid 5%, võrdlus teiste organismide genoomidega varieerub suuresti, seost genoomi suuruse ja organismi keerukuse vahel pole.
5. Liikuv DNA (transposoonid). DNA järjestused, mis suudavad ühe raku piires genoomis ümber paigutuda. Erinevad klassid. Klass I ehk retrotransposoonid (retroviiruse tüüpi, tuntud ka kui LTR-tüüpi ja mitte-LTR-tüüpi (LINEd ja SINEd)) ning klass II ehk DNA transposoonid. Evolutsiooniline tähtsus. Transpositsioon võib esile kutsuda mutatsioone ja geenide duplikatsioone.
6. Kuidas tekkisid pseudogeenid? Eellasgeeni korduvate duplikatsioonide tulemusena, samas on aga evolutsiooni käigus lisandunud neisse geenidesse geneetilise triivi tulemusena rida muutusi, mis transkriptsiooni enneaegselt termineerivad või inhibeerivad mRNA protsessingut, nii et need alad on muutunud mittefunktsionaalseks ehkki neilt transkribeeritakse RNAd. Teine võimalus pseudogeenide tekkeks on RNA pöördtranskriptsioon cDNAks ja viimase integratsioon genoomi intron -vaba DNAna.
7. Organellide DNA. Mitokondritel ja kloroplastidel on oma DNA. mtDNA : suurus 16 kb, struktuur rõngasmolekul, ei sisalda introneid, kodeeriv potentsiaal 37 geenist 13 kodeerivad valke, 22 tRNAsid ja 2 rRNAsid, geneetiline kood loomade ja pärmide puhul kodeerivad paljud koodonid alternatiivseid aminohappeid või stoppkoodoneid, mutatsioonid võivad põhjustada inimesel neuromuskulaarseid haigusi, arvatavasti vastavate kudede suurest ATP nõudlusest tingituna . Haigetel on rakkudes reeglina metsik-tüüp ja mutantne mtDNA segamini . Fenotüübiline muutus on seda suurem, mida rohkem on mutantset mtDNAd. Kloroplastide DNA on rõngasmolekul, mis sisaldab u. 120-160 kb, sõltuvalt taimeliigist. Kodeerib u. 120 valku ja kasutab standardset geneetilist koodi.
8. Eukarüootse kromosoomi struktuur. DNA biheeliks on pakitud nukleosoomide ümber, tekitades “pärlikee”, see omakorda on pakitud 30 nm fiibriteks, see omakorda lingudeks, viimane veel eriti kondenseerunud vormiks ning lõpptulemus on metastaasi kromosoom. Kromatiini pakkimine: nukleosoomid koosnevad valgulisest tüvest, millele DNA on keermeliselt ümber keeratud, oktameerne tüvi koosneb iga histooni (H2A, H2B, H3 ja H4) kahest koopiast, 30-nm fiibrid , neis on nukleosoomid pakitud irregulaarse struktuurina või solenoidi struktuuri, H1, viies histoon, on solenoidi sisemuses otseses kontaktis DNAga, nii et iga H1 molekul on assotsieeritud ühe nukleosoomiga. Eu- ja heterokromatiin. Eukromatiin on ala, kus kromatiin on vähem kondenseerunud, annab värvimisel heledaid vööte, suurem osa transkriptsioonist toimub eukromatiini piirkondades. Heterokromatiin on ala, kus kromatiin on rohkem kondenseerunud, annab värvimisel tumedaid vööte, esineb sagedamini tsentromeeride piirkonnas ja telomeeride aladel. Kromatiid . Iga metafaasi kromosoom koosneb kahest tsentromeerile kinnitunud tütarkromatiidist.
9. Kirjelda eksperimenti, mis võimaldaks teha kindlaks, et transkriptsiooniliselt aktiivne DNA on teisti pakitud, kui transkriptsiooniliselt inaktiivne DNA. Histoonide N-terminuste deatsetüleerimine põhjustab kromatiini kondenseerumist ning kondenseerunud kromatiinilt transkriptsiooni ei toimu; histoonide atsetüleerituse astet seostatakse kromatiinse DNA suhtelise resistentsusega nukleaaside toimele; osaline DNaas I töötlus, DNA eraldamine kromatiinsest kompleksist, restriktsioonanalüüs, Southern blotting – see on klassikaline skeem, kuidas määrata kindlaks DNaas I hüpersensitiivseid alasid kromatiinis. Tundlikus alas on DNA transkriptsiooniliselt aktiivne (vähem kondenseerunud).
10. Histoonide N- ja C-terminuste modifikatsioonid: kromatiini kondensatsiooni ja funktsiooni regulatsioon . Histooni N-terminuste modifitseerimisega kontrollitakse kromatiini kondenseerituse astet. Histoonsed sabad võivad siduda ka teisi kromatiiniga seonduvaid valke, mis osalevad sellistes protsessides nagu transkriptsioon ja replikatsioon . Ulatuslik ubikvitiinimine viib valkude proteosoomse lagundamiseni. Histoonide N-terminuste atsetüülimise regulatsioon on üks geeniregulatsiooni mooduseid, mis teatud kromosoomialas mõjutab oluliselt DNA-histoonide omavahelisi interaktsioone ja kromatiini pakkimist kondenseeritud või vähem kondenseeritud struktuuriks. Histoonide (de)atsetüleerimise mehanism ja teostavad valgud . Toimub peamiselt histoonide H3 ja H4 sabas asuvate positiivselt laetud lüsiinijääkide (de)atsetüleerumise tulemusena, atsetüleeritud vormis neutraliseerib DNA fosfaatrühma negatiivne laeng lüsiini ε-aminorühma positiivset laengut. Histooni kood. Ühel histoonil/nukleosoomil võib toimuda mitu modifikatsiooni ja need kombinatsioonid moodustavad niinimetatud histooni koodi.
11. Mis roll on histoondeatsetülaasidel (HDAC) need on ensüümid, mis eemaldavad histoonide N-terminustelt atsetüülrühmi, muutes kromatiini kondenseerunumaks ja mis funktsioon on histoonatsetülaaltransferaasidel (HAT)? Need on ensüümid, mis lisavad histoonide N-terminustele atsetüülrühmi, muutes kromatiini vähem kondenseerunumaks.
12. Mis on kromatiini metüleerimise tähtsus? See protsess segab atsetüülimist ning säilitab histoonide sabades asuvate lüsiinide ε-rühmadele positiivse laengu, represseerib transkriptsiooni.
13. Kuidas mõjutab kromatiini struktuur transkriptsiooni? Kui kromatiin on kondenseerunud, ei pääse RNA-polümeraasid ja transkriptsioonifaktorid DNAle ligi ning transkriptsiooni ei toimu.
14. Kromatiini-seoselised mittehistoonsed valgud maatriksivalgud, transkriptsioonifaktorid, replikatsioonivalgud, HMGd ja nende mõju kromatiini struktuurile moodustavad kromatiini lingumiseks vajalikke struktuurseid võrgustikke, transkriptsioonile teatud HMG valgud seonduvad DNAle kooperatiivselt transkriptsioonifaktoritega, mis tunnevad ära teatud DNA järjestusi, stabiliseerides sellega transkriptsiooni-multivalkkomplekse sellel geeniregulaatoralal ja replikatsioonile osalevad eukarüootse rakutsükli regulatsioonis. Mis on MARid ja nende tähtsus? Matrix-attachment regions, alad kromatiinikiududel, mis seonduvad võrgustikule (maatriksile), organiseerivad kromatiini struktuurseteks domeenideks (lingudeks), neil on oluline roll geeniekspressiooni reguleerimisel, hoiavad ära DNA vaba liikumise tuumas.
15. Kirjelda kromatiini immunosadestamismeetodit. Kromatiinseoseliste valkude ja DNA vahele luuakse ristsidemed, rakud lüüsitakse, neis olev DNA tükeldatakse restriktaasidega, lüsaadile lisatakse huvitava valgu spetsiifiline antikeha , moodustub stabiilne antikeha-valk-DNA kompleks , mida on lihtne eraldada, seejärel eemaldatakse valk-DNA kompleks ja nende vahel olevad ristsidemed lõhutakse, proteinaasiga töötlemise järel on lahuses valgud ja DNA eraldi, DNA puhastatakse välja, selleks ajaks on proovi jäänud vaid see osa DNAst , millega oli seotud huvitav valk, tuvastatakse uuritava valgu seondumispiirkond.
16. Eukarüootsete kromosoomide morfoloogia . Kromosoomide arv, suurus, kuju on liigispetsiifiline. Karüotüüp on igale liigile iseloomulik metafaasi kromosoomide arv, suurus ja kuju. Kromosoomide värvimine teatud histoloogilised värvid seonduvad teatud metafaasi kromosoomialadega tugevamalt kui teistega , mistõttu moodustub kromosoomidele iseloomulik värvusmuster, värvitriipe saab kasutada kromosoomi pikkuse (vahemaade) hindamiseks ning teistest kromosoomidest eristamiseks. Milleks kasutatakse FISH analüüsi? Kromosoomialade täpsemaks kirjeldamiseks.
17. Eukarüootsete kromosoomide funktsionaalsed elemendid - replikatsiooni ORId on DNA järjestused, kuhu seondub DNA polümeraas koos valkudega, mis on vajalikud DNA sünteesiks, tsentromeerid on kromosoomi osad, kuhu mitoosi ja meioosi protsessides kinnituvad mikrotorukeste kääviniidid, koosnevad lihtsa järjestusega DNAst, heterokromatiin, väga erineva pikkusega nukleosoomsed piirkonnad, telomeerid on kromosoomi kaks otsa, telomeersete järjestuste lisamine telomeraasi poolt hoiab ära kromosoomide lühenemise, enamjaolt korduvad, oma 3’ otsas kõrge G sisaldusega oligomeerid. - struktuur ja tähtsus neid kolme elementi on vaja replikatsiooni ja segregatsiooni korrektseks toimumiseks.
18. Telomeeri replikatsiooni mehanism. Et telomeeride lühenemist ei toimuks, lisab telomeraas , mis on valk-RNA kompleks, iga kromosoomi otstesse telomeerseid järjestusi. Telomeraas-assotsieeritud RNA on matriitsiks, millelt kromosoomi otstesse lisatav DNA-järjestus kopeeritakse.
19. Eukarüoodi (pärm) rakus toimub DNA vaigistamine (silencing) telomeersetes alades. Missugused biokeemilised protsessid on telomeerse vaigistamise taga? Heterokromatiini formeerumine, milleks on vajalikud valgud RAP1 ja SIR, mis paiknevad telomeeride piirkonnas. RAP1 seondub DNA järjestusele, mida nimetatakse vaigistajaks, SIR aga deatsetüleerib histoonide H3 ja H4 N-terminused.
20. Kromosoomsed aberratsioonid: mutatsioonid on organismi pärilikkusekandja püsivad, edasikanduvad muutused, deletsioonid eemaldavad osa kromosoomist, inversioonid on kromosoomiosa ümberpööramised, translokatsioonid on mittehomoloogsete kromosoomide osade vahetumised. Üks näide. 5. kromosoomi lühikese õla osaline deletsioon tekitab Cri cu chat sündroomi.
REPLIKATSIOON
1. Eukarüootne replikatsioon. Mehanism, läbiviivad ensüümid. Okazaki fragmentide rolli DNA replikatsioonil. Helikaas avab DNA ahelad , Pol α/primaasi kompleks sünteesib praimeriks RNA oligonukleotiidi, Pol ε võtab DNA sünteesimise üle, juhtivahel sünteesitakse Pol ε poolt ühe lõiguna, mahajääv ahel Pol δ poolt Okazaki fragmentidena. Telomeraas on pöördtranskriptaas, mis pikendab telomeeridel olevaid kordusjärjestusi niipalju, et replikatsiooni käigus kromosoom ei lüheneks. DNA replikatsiooni origin ’id on kohad kromosoomidel, kust alustatakse DNA sünteesi. DNA replikatsiooni eukarüootides iseloomustavad: palju replikatsiooni origin’e, millel üldjuhul puudub konsensus DNA järjestuse tasemel ning DNA sünteesi initsiatsiooni ajastus erinevatelt origin’idelt on erinev, nende kasutamine sõltub rakutüübist, organismi arengustaadiumist, kasvutingimustest ning epigeneetilistest faktoritest. Replikatsiooni initsiatsioonil on eriti olulised kaks valgukompleksi: ORC (origin recognition complex ) ja MCM (minichromosomal maintenance). ORC seondub origin’ile ja koos teiste valkudega moodustab pre-replikatsioonikompleksi (pre-RC). Selleks, et origin funktsionaalseks muutuks, on vaja, et sinna seonduks MCM kompleks. MCM on replikatiivne DNA helikaas, MCMi toomine origin’ile = replication licensing. Pärast veel mitmete valkude seondumist selle kompleksiga lisandub DNA polümeraas α-primaasi kompleks, MCM kompleks fosforüleeritakse ja algab DNA süntees, mille käivitumisel osa valke lahkub kompleksist.
TRANSKRIPTSIOON.
1. Geenide ekspressiooni regulatsioon bakterites. Bakteriaalse geeni struktuur. Ei sisalda introneid. Bakteriaalse RNA polümeraasi struktuur. Oligomeerne valk, mis koosneb α₂, β, β’ ja σ subühikust. Bakteriaalse promootori elemendid. -35 regioon, σ subühik seotakse siin ja Pribnow box -10 juures, siin lahkevad DNA biheeliksi ahelad. Defineeri prokarüootne operon. Geneetilise ekspressiooni ühik, mis koosneb ühest või enamast geenist ning operaator- ja promootorjärjestusest, mis reguleerivad nende transkriptsiooni. Kirjelda geeni aktivatsiooni protsessi prokarüoodis trp või lac operoni näitel. Laktoosi seondumisel repressoriga lac operonil muutub repressor inaktiivseks ja transkriptsioon saab toimuda. Alternatiivsed sigma faktorid . Kontrollivad teatud geenirühmade avaldumist , on initsiatsioonifaktorid, tunnevad ära promootori. Aktivaatorite osatähtsus 54-RNA polümeraasi regulatsioonis. Aktivaator aktiveerib transkriptsiooni σ54-sõltuvalt promootorilt. Kahekomponentsed transkriptsiooni regulatsiooni süsteemid. Induktsioon – geenide ekspressiooni suurenemine vastuseks metaboliidi kontsentratsiooni tõusule ja repressioon – geenide ekspressiooni vähenemine vastuseks metaboliidi kontsentratsiooni tõusule.
2. Mis on sigma faktori funktsioon? Tunneb ära DNA promootorjärjestused, on vajalik regulatoorsete valkude sidumiseks ja RNA polümeraasi aktivatsiooniks. Mis juhtub sigma faktoriga initsiatsiooni lõppedes? Dissotsieerub RNA polümeraasilt.
3. Eukarüootne geeni regulatsioon. Eukarüootse geeni struktuur. Sisaldab introneid ja eksoneid ning enhancer’eid ja funktsionaalselt olulisi mittekodeerivaid alasid, mis määravad ära 3’ lõikamise ja polüadenülatsiooni toimumise koha. RNA polümeraasid I sünteesib ainult pre- rRNAd , II sünteesib mRNAsid ja mõnesid väikseid tuuma RNAsid, mis osalevad mRNA splaisingus ja III sünteesib tRNAsid, 5S rRNAsid ja mitmeid suhteliselt lühikesi stabiilseid RNAsid. RNA polümeraas II  alaühiku C- terminaalne domään (CTD). Transkriptsiooni initsiatsiooni käigus fosforüülitakse RNA polümeraas II suurima alaühiku karboksüterminaalne domeen (CTD), korduv heptapeptiidne järjestus, mis jääb fosforüülituks kuni matriitsilt transkriptsiooni lõpuni.
4. Võrdle prokarüootsete ja eukarüootsete RNA polümeraaside struktuuri ja funktsiooni. Prokarüootidel ainult üks, eukarüootidel kolm polümeraasi. Kõik kolm polümeraasikompleksi sisaldavat kahte suurt ja kahte väiksemat kompleksivalku, millel on suur homoloogia prokarüoodi RNA polümeraasi β, β’ ja α alaühikutega. Sarnaselt bakteri RNA polümeraasiga initsieerib RNA polümeraas II geeni transkriptsiooni DNA matriitsilt teatud nukleotiidipaari juurest või alternatiivina naabernukleotiidipaari juurest.
5. Promootorite regulatoorsed elemendid. cis- ja trans-elemendid. Eukarüoodi valku-kodeerivate geenide ekspressiooni regulatsioonis osalevad mitmed cis-aktiivsusega transkriptsiooni regulaatoralad. TATA box on üks kolmest eukarüoodi DNAs leitud promootorjärjestusest, see on kõige sagedasem , mis esineb tavaliselt kõrge transkriptsioonitasemega geenide promootorites, initsiaator – enamikul neist on C positsioonis -1 ja A positsioonis +1, erinevalt TATAst pole konserveerunud, CpG saarekesed . TATAboxi või initsiaatorjärjestust sisaldavate geenide transkriptsioon algab vastavalt elemendilt, CpG saarekeste puhul aga 20-200bp ulatuses mitmelt võimalikult elemendilt. Enamikul neist geenidest on ca 100bp kaugusel start-saidist 20-50bp pikkune GC-jada. Proksimaalne promootor . Regulaatorelemendid, mis asuvad 100-200bp start-saidist, moodustavad koos TATAboxi või initsiaatoriga promootori proksimaalsete elementide kogumi ehk proksimaalse promootori. Distaalne promootor. Kaugemal asuvad elemendid moodustavad koos TATAboxi või initsiaatoriga distaalse promootori.
6. Defineeri enhancer ja loetle enhanceri omadused. Enhancer on promootorist kaugelasuv transkriptsiooni regulaatorala. Tavaliselt 100-200bp pikad, sisaldavad hulgaliselt 8-20bp regulaatorelemente. Need võivad asuda 200bp kuni kümnete kbp kaugusel promootorist üles- või allavoolu , asuda nii intronis kui geeni viimasest eksonist veel allavoolu, on tihti rakutüüp-spetsiifilised, omades aktiivsust vaid kindlates rakutüüpides. Missuguseid analüüsimeetodeid kasutatakse enhanceralade tuvastamiseks? Linker -skaneerivat mutatsioon- ja 5’-deletsioonanalüüsi.
7. Regulatoorsete elementide tuvastamise meetodid: 5’ deletsioon analüüs – 5’ otsast hakatakse deletsioone tegema ja linker skaneeriv mutatsioonanalüüs – analüüsitakse kattuvate mutatsioonidega geeni promootor-reporter konstruktide rühma mõõtes rakus reportergeeni ekspressioonitaset või teatud kindla mRNA sünteesi taset. Kui tase on langenud, on mutatsioon regulaatorelemendis.
8. Mis on sidumissait ? Koht DNAl, kuhu seonduvad erinevad valgud ja mille poolest ta a) sarnaneb TATAbox-le, ka TATAboxile seonduvad valgud b) erineb TATAbox-st? TATAboxilt algab transkriptsioon, see on promootorjärjestus.
9. Joonista tüüpilise RNA Pol II promootori struktuur ja kirjelda faktoreid, mis sinna transkriptsiooni initsiatsiooni käigus seovad. Seostuvad transkriptsioonifaktorid, mis on vajalikud transkriptsiooni toimumiseks, näiteks RNA Pol II sidumiseks start-saiti, enhancer’ite ja muude regulatsioonielementide seondumiseks, aga ka aktivaatorid ja repressorid. Generaalsed TFd paigutavad RNA Pol II start-saidile ja osalevad initsiatsioonis. TATAboxi siduv TFIID seob oma TATAbox siduva alaühiku, TBP, kaudu. Kui Pol II jätkab transkriptsiooni startsaidist edasi, siis üks TFHII alaühikutest fosforüülib CTD.
10. Transkriptsiooni repressorid ja aktivaatorid. Transkriptsioooni faktorite modulaarne struktuur. Paindlik selles mõttes, et üks või enam transkriptsiooni aktivatsiooni domeeni on seotud järjestus-spetsiifilise DNAd siduva domeeniga linkeralade abil, seetõttu regulaatorelementide vahekauguse muutmine oluliselt promootori aktiivsust ei mõjuta. Need TFid võivad sisaldada ühte või mitut aktivatsioonidomeeni, aga harva enam kui ühte DNAd siduvat domeeni. Transkriptsiooni faktorite klassifikatsioon DNAle sidumise järgi. Aktivaatorid ja repressorid. Nimeta peamised DNAd-siduvad domäänid, mis on iseloomulikud transkriptsioonifaktoritele (vähemalt 3) homeodomeen-valgud, heeliks -pööre-heeliks, leutsiin- lukk ja tsink -sõrm.
11. Kuidas tuvastada transkriptsiooniregulaatorite märklaud-geene? DNaas I footprinting ja EMSA analüüsiga.
12. DNA-valk interaktsioonide tuvastamise meetodid: footprinting põhineb asjaolul, et kui valk istub DNA peal, siis ta kaitseb viimast eksonuleaaside aktiivsuse vastu ja EMSA – üldjuhul on DNA fragmentide elektroforeetiline mobiilsus langenud, kui need on valguga kompleksis, mis põhjustab fragmendi geeli asukoha muutust (bänd jääb maha võrreldes vaba DNAga).
13. Nimeta transkriptsiooni aktivaatori kaks funktsionaalset domääni DNAd siduv domeen – mutatsioon võib viia TFi mittesidumiseni, seega transkriptsiooni mittetoimumiseni ja aktivatsioonidomeen – mutatsioon võib viia aktivatsiooni puudulikkuseni ja sellest tuleneva puuduliku või mittetoimuva transkriptsioonini ja kuidas mutatsioonid ühes või teises neist mõjutavad transkriptsiooni faktori omadusi? Kui DNAd siduv domeen fuseeriti teistest valkudest pärit aktivatsioonidomeenide fragmentidega, siis teatud konstruktidel säilis omadus reportergeeni ekspressiooni aktiveerida. Suure osa N-terminaalse DNAd siduva domeeni deleteerimisega kadus reportergeeni ekspressioon, suure osa C-terminaalse aktivatsioonidomeeni deleteerimisega aga säilis.
14. Transkriptsiooni faktorite kooperatiivne sidumine. Suurendab geeniregulatsiooni võimalusi. Transkriptsioonifaktorite võime heterodimeriseeruda või siduda monomeerina: selle tähtsus transkriptsiooni regulatsioonis. Suurendab äratundmissaitide hulka, aga mõned võivad ka inhibeerida. Mõnede faktorite afiinsus sidumissaitide suhtes on individuaalselt madal, aga nende omavaheline interaktsioon võib soodustada kompleksi moodustamist DNAle, mistõttu kompleksi afiinsus sidumissaidi suhtes tõuseb oluliselt.
15. Enhanceosoom. Enhancer’ites on reeglina palju TFide sidumissaite. Paljude aktivaatorite kooperatiivne sidumine enhancer’i lähedastele saitidele tekitab multivalkkompleksse struktuuri, mida nimetatakse enhancesome’iks. Enhancesome’ide kokkupanek vajab tihti väikseid valke, mis mahuvad DNA väiksesse vakku, DNAd oluliselt väänates. Viimane annab võimaluse valkudele kahel pool väändekohta paremini seonduda.
16. Too näide bioloogilisest protsessist, kus enhanceri’ aktiivsusega kontrollitakse geeni ekspressiooni taset. B-lümfotsüütide süntees. Kui inimesel eemaldada GADD45G enhancer, siis võib esiaju suureneda . Arengus on neil roll lülitada transkriptsioon sisse või välja vastavalt rakutüübile.
17. RNA Polümeraas II transkriptsiooni initsiatsioon . Generaalsed transkriptsiooni faktorid paigutavad RNA Pol II startsaidile ja osalevad initsiatsioonis, TFIIB , TFIIF, THIIE ja TFIIH, in vivo ka TFIIA ja TFIID. RNA Pol II preinitsiatsioonikompleksid moodustamine. See pannakse kokku valkhaaval. Kõigepealt istub TBP TATAbox promootorile, seejärel seondub TFIIB, sellele järgneb TFIIF ja RNA Pol II sidumine, viimase tulemusena seondub RNA Pol II startsaidile, lõpuks seonduvad veel TFIIE ja TFIIH.
18. Mis on TBP funktsioon initisiatsiooni kompleksi tekkes? Painutab DNA ahelat , et järgmine faktor saaks seonduda.
19. Kas transkriptsioonifaktorid (aktivaatorid) interakteeruvad otse(vahetult) TBPga? Mitte kõik.
20. Missugused TAFid on TBPga vahetus interaktsioonis? TFIIB, võib-olla ka TFIIF.
21. Missugune TFII kompleksi alaühik hüdrolüüsib ATPd ja mis protsessiga on tegu? TFIIH, selle energia abil keerataksegi startsaidi piirkonnas DNA kaksikahel lahti.
22. Transkriptsiooni repressioni ja aktivatsiooni molekulaarsed mehanismid in vivo. Heterokromatiinse vaigistamise mehanismid telomeeridel, tsentromeeri-alades ja muudes kromosoomi piirkondades. RAP1 seondub DNA järjestusele, mida nimetatakse vaigistajaks, SIR aga tunneb ära H3 ja H4 N-terminusi, mis on SIR2 aktiivsusest tingituna deatsetüleeritud vormis. Kromatiini remodelleerijad. Repressorid võivad teatud geenidel kontrollida histoonide deatsetüleerimist, aktivaatorid kontrollivad teatud geenidel histoonide atsetüleerimist, histoonide teatud AAjääkide modifitseerimise kaudu kontrollitakse kromatiini kondensatsiooni, kromatiini moduleerivad faktorid võivad aktiveerida või represseerida teatud geenide promootoreid. Mediaator kompleks ja selle tähtsus moodustab molekulaarse silla aktivatsioonidomeenide ja RNA Pol II vahel, on veel üks ko-aktivaatori tüüpe.
23. Transkriptsioonifaktorite aktiivsuse regulatsioon. INFγ-initsieeritud geeni regulatsioon: STAT1α fosforüülimine, dimerisatsioon ja translokatsioon tuuma, kus initsieerib INFγ-tundlike geenide transkriptsiooni.
24. Kus toimub transkriptsioon? Tuumas. Kus transkriptsioonifaktorid rakus paiknevad? Tuumas ja tsütoplasmas. Too näiteid, kuidas transkriptsioonifaktorite post-translatsioonilised modifikatsioonid mõjutavad nende a) DNAle sidumisevõimet – STAT valk tuleb fosforüülida selleks, et see saaks DNAga seonduda ja b) nende võimet initseerida transkriptsiooni – vajalik on ligandi seondumine, näiteks tuumaretseptorite puhul.
25. Transkriptsiooni elongatsioon ja terminatsioon. Elongatsioon on pärast esimese 50bp sünteesi väga kiire, nii et Pol II peatub alles 3’otsa järjestusel, mis kontrollib RNA ahela lõikamist ja RNA polüadenüülimist, millest moodustub mRNA saba.
26. RNA Polümeraas I ja III seoseline transkriptsioon. Initsiatsioon on väga sarnane Pol II omaga . Initsiatsioonikomplekside kokkupanek algab teatud generaalsete TFde sidumisega regulaatorelementidele. Need TFd on polümeraas-spetsiifilised ning iga polümeraas tunneb ära erinevaid DNA järjestusi. RNA Pol I sünteesib pre-rRNAsid ja Pol III tRNAsid ning lühikesi, stabiilseid RNAsid.
27. Mille poolest RNA Pol I ja Pol III-seoseline transkriptsioon erinevad RNA Pol II-seoselisest transkriptsioonist? Erinevalt Pol II-st ei vaja teised kaks transkriptsiooni initsiatsiooniks ATP hüdrolüüsi.
POST-TRANSKRIPTSIOONILINE GEENI REGULATSIOON
1. Eukarüootse pre-mRNA järeltöötlus (processing). 5’cap struktuuri lisamine toimub vahetult pärast transkriptsiooni initsiatsiooni, lisatakse metüülrühmad kaitsmaks mRNAd lagundamise (eksonukleaasse aktiivsuse) ja modifikatsioonide eest. RNAd-siduvad valgud. Pre-mRNA on kompleksis hnRNP valkudega, mis sisaldavad konserveerunud RNAga-seostumise domeene: (RRM on RNA rekognitsiooni (äratundmise) motiiv , enimlevinud hnRNP valkudel esinev RNAd-siduv domeen, KH esineb hnRNP K valkudel, domeeni struktuur sarnane RRMle, aga KH on väiksem, RGG box on teine hnRNP valkudel sagedasti esinev RNAga seostumise motiiv, sisaldab Arg-Gly-Gly kordusi, SR on domeen, mis sisaldab dipeptiidseid seriin -arginiin kordusi, SR valgud osalevad eksoni äratundmises pikkade pre-mRNAde puhul etc), pre-mRNAde kompleks hnRNP valkudega takistab lühikeste sekundaarstruktuursete alade moodustumist, mis teeksid pre-mRNA teistele RNAdele või valkudele äratundmismärklauaks. GT-AG reegel – peaaegu kõik eukarüootsed intronid algavad GT nukleotiidjärjestusega ja lõppevad AGga. Splaisosoom on ribonukleovalkkompleks, mis koosneb snRNPdest ja pre-mRNAst, teostab splaisingut. Splaisingu mehanism – splaisosoom katalüüsib kahe transeserifikatsiooni toimumist , mille tulemusena eksonid splaisitakse ja intron lõigatakse lariaatstruktuurina välja. Eksoni äratundmine toimub tänu sellele, et pre-mRNAdel on intronite otstes mõõdukalt korduvad lühikesed järjestused ja 3’ splaissaidist ülavoolu asub pürimidiin-rikas järjestus, SR valgud osalevad eksoni äratundmises pikkade pre-mRNAde puhul, SR valgud interakteeruvad eksoni järjestustega, mida nim. eksoonseteks splaisingu võimendajateks. Splaisingu ja transkriptsiooni sidusus – lühikeste transkriptsiooniühikute puhul toimub RNA splaising reeglina pärast 3’ lõikamist ja polüadenülatsiooni, pikkade transkriptsiooniühikute puhul, mis koosnevad mitmest eksonist, toimub eksonite splaising sünteesitavas RNAs enne, kui geeni transkriptsioon on lõppenud, s.o. transkriptsiooni ajal; transkriptsioon ja splaising toimuvad väikeses hulgas rakutuumas asuvates struktuurides. pre-mRNA 3’ lõikamine ja polüadenüülimine on omavahel tihedalt seotud protsessid. Primaarse transkripti 3’ lõikamine eelneb polüadenüülimisele. Suure multivalkse lõikamis/polüadenüülimiskompleksi moodustumine AU-rikka polü(A) signaali ümbruses on väga sarnane initsiatsioonikompleksi moodustumisele TATAboxil – mõlemal juhul moodustuvad kompleksid läbi valk-valk ja valk-NH interaktsioonide järjestikuse jada. Polüadenüülimine toimub kahes etapis – esimese 12 A lisamine toimub väga aeglaselt, sellele järgneb väga kiire 200 või enama A lisamine. Selgita lühidalt mRNA polüadenüleerimise tähtsust eukarüoodi rakus – kaitseb mRNAd lagundamise (eksonukleaasse aktiivsuse) ja modifikatsioonide eest; reguleerib mRNA eluiga ja translatsiooni initsiatsiooni. pre-mRNAst välja lõigatud intronite lagundamine – intron vabaneb lariaatstruktuurina, mis lagundatakse kiiresti tuumas olemasolevate RNaaside poolt.
2. Kirjelda eukarüootse mRNA molekuliga toimuvaid muutusi pärast transkriptsiooni lõppu ja translatsiooni algust – 5’cap struktuur eemaldatakse, mRNA seostub ribosoomiga, lisandub startkoodoniga (AUG) komplementaarne tRNA aminohappega, ribosoom liigub mööda mRNAd ning seostuvad järjest uued tRNAd aminohapetega, kuni ribosoom jõuab stopp -koodonini, kompleks laguneb, mRNA lagundatakse.
3. pre-mRNA järeltöötluse regulatsioon. Alternatiivne splaising on mRNA protsessingu peamiseks regulatsioonimehhanismiks. Erinevate eksonite alternatiivne splaising on enimlevinud mehhanism ühelt transkriptsiooniühikult erinevate valkude sünteesiks. Toimib vaid juhul, kui geenis on intronite arv vähemalt üks. Näiteks pre-mRNA kõiki eksoneid ei pruugita küpse mRNA koosseisu võtta, nii saab ühest pre-mRNAst erinevaid küpseid mRNAsid. Näide alternatiivse splaisingu mõjust organismi kujunemisele, arengule, toimimisele etc – puuviljakärbse suguline diferentseerumine . Vaid puuviljakärbse emasisendid sünteesivad funktsionaalset SXL (sex lethal) valku, mis represserib eksonite 2 ja 3 splaisingut sxl pre- mRNAs ja eksonite 1 ja 2 splaisingut tra (transformer) pre-mRNAs. TRA- TRA2 kompleksi sidumine dsx ( double -sex) pre-mRNAle aktiveerib eksonite 3 ja 4 splaisingu. Sellise reguleeritud splaisingute kaskaadi tulemusena sünteesitakse puuviljakärbse emas- ja isasembrüotes erinevaid DSX valke. Need represseerivad vastassooliseks seksuaalseks diferentseerumiseks vajalike geenide ekspressiooni. DSX isasvorm represseerib naissooliseks diferentseerumiseks vajalike geenide ekspressiooni ja vastupidi. RNA redigeerimine (editing) on protsess, mille tagajärjel muudetakse pre-mRNA järjestust, st küpse mRNA järjestus erineb vastavast genoomsest järjestusest. Mis ensüümid katalüüsivad protsessi – RNA editing? Deaminaasid, ADARid. Kuidas nimetatud regulatsioonivorm muudab valku? Aminorühma eemaldamine nukleotiidilt muudab koodonit, mille tulemusena võib muutuda ka sünteesitav valk. Too näiteid. apoB mRNA kodeerib kahte alternatiivset seerumvalku apoB-100, mida ekspresseerivad maksarakud ja apoB-48, mida ekspresseerib sooleepiteel. Kahe apoB-tüübi rakutüüp-spetsiifiline ekspressioon on apoB pre-mRNA editingi tagajärg. Nukleotiid positsioonis 6666, s.o. C, konverteeritakse deamiinimise tagajärjel U-ks. See muutus, mis toimub vaid soolerakkudes, muudab CAA koodoni UAA poolt kodeeritud stopp-koodoniks ning lõpeb poole lühema valgu apoB-48 sünteesiga. See on C-U editing, on ka A-I editing.
4. Mis on peamine erinevus prokarüootse ja eukarüootse mRNA vahel? Paljud bakteriaalsed mRNAd on polütsistroonsed, st et üks mRNA molekul (nt trp operoni kodeeriv mRNA) sisaldab kodeerivaid järjestusi, mis kodeerivad mitut, samas bioloogilises protsessis osalevat valku. Eukarüootsed mRNAd on aga monotsistroonsed, st iga mRNA molekul kodeerib ühte valku. Polü- ja monotsistroonsete mRNAde erinevus on seotud nende mRNAde translatsiooniprotsesside fundamentaalse erinevusega (või siis eukarüootne mRNA sisaldab introneid ja vajab transkriptsioonijärgset töötlemist, prokarüootne on aga kohe küps ja sellelt alustatakse koheselt translatsiooni).
5. Missugused molekulaarsed mehanismid tagavad selle, et inimese genoomi 23000 geeni kodeerivad miljoneid erinevaid valke? Alternatiivne splaising, RNA editing, posttranslatoorsed modifitseerimised, mutatsioonid. Kirjelda post-transkriptsioonilise regulatsiooni võimalusi, mille tulemusena tekib ühest pre-mRNAst hulgaliselt erinevaid mRNAsid. Alternatiivne splaising. Kui geenis sisaldub palju introneid, võidakse neid pre-mRNAst kõrvaldada kas eraldi või kombineeritult. Kui näiteks kaks kõrvuti paiknevat intronit eraldatakse korraga, võidakse kõrvaldada ka nendevaheline ekson . Nii moodustuvad erinevad mRNA molekulid, mis kodeerivad erinevaid valke.
6. Tuuma-seoseline transport – kui mRNA protsessimine on tuumas lõppenud, siis mRNAd jäävad messenger ribonuclear protein complex’i osana seotuks teatud hnRNP valkudega ning nad transporditakse tuumast välja. Tuumapoori kompleksid - nende kaudu sisenevad ja lahkuvad tuumast väiksed ja suured molekulid. Iga tuumapoor on moodustunud struktuurist, mida nim. tuumapoori-kompleksiks (NPC) . Importiinid transpordivad tsütoplasmast tuuma valke, mis sisaldavad tuumalokalisatsioonisignaali. Eksportiinid transpordivad tuumast välja valke, mis sisaldavad tuumaekspordisignaali.
7. Post-transkriptsioonilise regulatsiooni mehanismid, mis toimivad tsütoplasmas – mikroRNAd ja tsütoplasmaatiline polüadenüülimine. RNA-sõltuv vaigistamine – lühikesed RNAd seostuvad märklaud-mRNAde 3’ UTRidele, mille tulemusena represseerivad märklaudgeenide ekspressiooni. siRNA – small interfering RNA – paardub märklaud-mRNA 3’ otsaga täiesti komplementaarselt, miRNA – mikroRNA – puhul on ka üksikuid mittepaardunud nukleotiide . RNA interferents indutseerib mRNAde lagundamist. Dicer on valk, mis lõikab kaksikahelalise RNA prekursor RNA stem-struktuuridest välja. RISC kompleks – RNA-indutseeritud vaigistav kompleks – multivalkkompleks, mis sisaldab vaid üht RNA ahelat. Seal protsessitakse kaksikahelalisi siRNAsid ja miRNAsid edasi. RISC lõikab märklaud-mRNA, mis on täpselt komplementaarne vastavale üksikahelalisele siRNAle, ahela katki. Funktsioneerib ka kui translatsiooni inhibiitor. RISC kompleksil arvatakse olevat kaks funktsiooni: siRNA funktsioon ehk RNA interferents ja miRNA funktsioon, mille tagajärjeks on üksikuid mittepaardunud nukleotiide sisaldavate märklaud-mRNAde translatsiooniline repressioon. Tsütoplasmaatiline polüadenüleerimine - vastusena välissignaalile hakatakse mõnede mRNAde lühikesi polü(A)- sabasid pikendama, see stimuleerib nende mRNAde translatsiooni. NMD (non- sense mediated decay ) – ühe või enama eksoni vahelejätmine, mis põhjustab ekson-intron liidese vahetus 3’ läheduses stoppkoodoni sissetuleku - ja teised mRNA järelevalve mehhanismid hoiavad ära ebaõigelt protsessitud mRNAde translatsiooni. mRNA lokalisatsiooni regulatsioon lubab sünteesida valke teatud tsütoplasma regioonides, tavaliselt on mRNA lokalisatsiooni määravad järjestused tema 3’ UTRis.
8. rRNAde ja tRNAde järeltöötlus. Pre-rRNAde geenid on kõigil eukarüootidel konserveerunud ning funktsioneerivad kui tuumakese organisaatorid. Väikesed tuumakese RNAd osalevad pre-rRNAde protsessingus ja ribosoomi alaühikute pakkimises.
TRANSLATSIOON JA VALKUDE SORTEERIMINE
1. Valkude ja nukleiinhapete sünteesi sarnasused ja erinevused – sarnasused: nii valgud kui nukleiinhapped on koostatud piiratud arvust monomeeridest, monomeere lisatakse ahelasse ükshaaval, iga polünukleotiid ja polüpeptiid sünteesitakse kindla orientatsiooniga ja see lõppeb kindlaksmääratud kohas, primaarne produkt modifitseeritakse; erinevused: valkudel monomeerideks aminohapped, nukleiinhapetel nukleotiidid , valkude süntees toimub tsütoplasmas, nukleiinhapete süntees tuumas.
2. RNA funktsioonid valkude sünteesil (mRNA – kannab koodonitena informatsiooni valgu primaarjärjestuse kohta, rRNA – assotsieerub ribosoomi valkudega moodustades ensüümkompleksi, mis otseselt sünteesib peptiidsideme, tRNA – identifitseerib koodi ja toob ribosoomi koodile vastava aminohappe)
3. Translatsiooniprotsess on kaheastmeline dekodeerimisprotsess, milline on presibosomaalne – aminoatsüül-tRNA süntees (ligaasid, ARS või ARL) ja ribosomaalne etapp – koodon - antikoodon translatsioon ja peptiidsideme süntees ribosoomil.
4. Mittestandartne paardumine (Wobble base pairing) millised on seaduspärasused ja milleks on see vajalik? Paarduvad uridiin - guaniin , adenosiin-inosiin, tsütidiin-inosiin ja uridiin-inosiin, vajalik tRNA sekundaarstruktuuris ja geneetilise koodi õiges tõlkimises. Tuleneb sellest, et enamikel organismidel on vähem kui 45 tRNAd, vaja oleks üle 60, mistõttu antikoodoni 5’ lämmastikalus, mis seostub mRNA 3’ lämmastikalusega, pole ruumiliselt nii piiratud kui kaks teist lämmastikalust (või ka tRNA3’ pole nii piiratud).
5. tRNA struktuur – sekundaarstruktuur ristikheinalehe kujuline, tertsiaarstruktuur L-kujuline, selle funktsionaalsed – antikoodon (seostub koodoniga mRNAl), aktseptorõlg (sinna seostub aminohape) ja struktuursed osad – kolm lingu (T-, D- ja antikoodon-õlg) ning 3’ paardumata osa. Struktuurid sarnased, kuna liituvad ribosoomi samasse saiti, erinevused antikoodoni ja aktseptorõla osas (ka teised nukleotiidid võivad olla erinevad).
6. tRNA identsuse elemendid – tRNA struktuurielemendid, mis määravad ära, millise aminohappega tRNA aminoatsetüleeritakse, diskriminaatoralused – isoaktseptoorsetel tRNAdel on 4. nukleotiidid 3’ otsast identsed.
7. Aminoatsüül-tRNA süntees, kirjelda protsessi – aminohappe liitmine on kaheastmeline: kõigepealt liituvad süntetaasiga aminohape ja ATP ning moodustub aminoatsüüladenolaat, seejärel toimub estersideme süntees COOH ja riboosi 2’ või 3’ C vahel ja ensüüme – aminoatsüül-tRNA süntetaas aktiveerib aminohapped ja liidab need tRNAle; iga aminohappe jaoks on oma, spetsiifiline aminoatsüül-tRNA süntetaas, need jagatakse kahte klassi (I ja II), kummassegi kuulub 10 liiget. Jaotus põhineb ensüümide aminohappelisel järjestusel ja katalüütilise saidi ehitusel.
8. Milliste protsessidega tagatakse vigade vältimine translatsioonil (tRNA tasemel) – editeerimisaktiivsusega – spetsiifiline hüdrolüütiline aktiivtsenter, mille abil välditakse vale aminohappega laetud tRNA vabanemist. Ülekande-eelne editeerimine: kontrollitakse aminoatsetüleerimisreaktsiooni esimest etappi, st välditakse vale aminoatsülaadi moodustumist (vale aminoatsülaat lagundatakse enne selle ülekannet tRNA külge). Ülekande-järgne editeerimine: kontrollitakse aminoatsüüladenülaadi ülekandmist tRNAle (hüdrolüüsitakse esterside aminoatsüüladenülaadi ja vale tRNA vahel).
9. Ribosoomide struktuur – suur ja väike alaühik, mis koosnevad rRNAst ja valkudest, mille poolest erineb eukrüootne ja prokarüootne ribosoom – prokarüootidel on 70S ribosoomid , mis koosnevad 30S ja 50S subühikutest; eukarüootidel on 80S ribosoomid, mis koosnevad 40S ja 60S subühikutest. Eukarüootide ribosoom on suurem.
10. A – sinna seondub aminoatsüül-tRNA, paikneb nii väiksemal kui suuremal subühikul, P – sinna seondub peptidüül-tRNA, pärast kasvava peptiidahela kandmist ribosoomis peptidüül-tRNAlt A-saidis asuvale aa-tRNAle jääb P-saiti deatsüleeritud tRNA ja E – deatsüleeritud tRNA-spetsiifiline, pärast seda, kui P-saidis tekkis deatsüleeritud tRNA, liiguvad tRNAd koos mRNAga ribosoomis ühe koodoni võrra edasi; asub põhiliselt ribosoomi suuremal subühikul sait ribosoomil on tRNAde sidumiskohad, ribosoomi subühikute vahele jääv põhiline aktiivtsenter.
11. Ribosoomi tsükkel – selle läbib ribosoom translatsiooni kolme etapi (initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon) käigus. Valku kodeerivat järjestust nii mRNAl kui DNAl nim. avatud lugemisraamiks (ORF). Avatud lugemisraam – nukleiinhappe järjestus, mis sisaldab järjestikuseid aminohappeid kodeerivaid koodoneid ja mis algab initsiaatorkoodoniga ning lõppeb stoppkoodoniga.
12. RBS ( Shine Dalgarno järjestus, Kozaki järjestus), bakteriaalne mRNA on polütsistroonne. Bakterites eelneb initsiaatorkoodonile ribosoomi sidumispiirkond (RBS) ehk Shine Dalgarno järjestus, mis aitab ribosoomi väikesel subühikul õigesti positsioneeruda. Kozaki järjestus – eukarüoodis spetsiifilised järjestused AUG ümber, mis kergendavad äratundmist.
13. Kirjelda translatsiooni initsiatsiooni eukarüoodi ja prokarüoodi võrdlus – bakteriaalne saab alguse Shine Dalgarno järjestusel mRNAl, eukarüootne toimub mRNA 5’ otsa juures. Prokarüoot - initsiatsiooni käigus moodustub vastavatest ribosoomi subühikutest, initsiaator-tRNAst ja mRNA-st ribosoomi 70S kompleks. Funktsioneeriva kompleksi moodustumiseks on vajalikud nn. initsiatsioonifaktorid (IF-1, IF-2, IF-3). Initsiatsiooni alustab mRNA seondumine 30S subühikuga, subühik seondub mRNA puriinirikka piirkonna külge, mis asetseb enne AUG startkoodonit. Seda piirkonda nimetatakse Shine Dalgarno järjestuseks ning see on komplementaarne 30S subühikus asuva rRNA järjestusega. Järgmisena katalüüsib IF-2 initsiaator-tRNA seondumist ribosoomi P-saiti. Pärast seda toimub 30S ja 50S subühikute ühinemine, mille käigus eemaldub IF-2 initsiaator-tRNA küljest, kasutades GTP energiat. Kui see protsess on lõppenud, on moodustunud funktsioneeriv 70S ribosoomi kompleks. Eukarüoot - initsiatsiooniks vajalike initsiatsioonifaktorite arv eukarüootidel on palju suurem kui prokarüootidel. Tähtsad on ka faktorite omavahelised interaktsioonid . Eukarüootsed initsiatsioonifaktorid on: eIF1, eIF2, eIF3, eIF4, eIF5 ja eIF6. eIF1 ja eIF3 takistavad väikese subühiku ühinemist suure subühikuga ning on seotud 40S subühikuga. eIF2 on sarnane prokarüootse IF2-ga, ta osaleb initsiaator-tRNA sidumisel 40S subühiku P-saiti ning GTP energiat kasutades dissotseerub koos eIF1 ja eIF3-ga, et subühikud saaksid ühineda. eIF4 on RNA helikaas, mis vähendab mRNA sekundaarstruktuure, et väiksel subühikul oleks võimalik seonduda. eIF5 on kofaktor subühikute ühinemisel. eIF6, nagu eIF3, takistab subühikute ühinemist, kuid seondub 60S külge. mRNA 5’otsas on seondumiskohad, kuhu vastavate valguliste faktorite olemasolul seondub 40S subühik. Kuna mRNA seondumine võtab aega, on 40S seotud eIF-3ga, mis takistab 60S subühiku ühinemist 40S-ga. Järgmisena seondub väikse subühikuga initsiaator-tRNA, mille ühinemine on sarnane prokarüootsete organismidega , ainult katalüüsi viib läbi eIF-2. Pärast seda hakkab kogu kompleks liikuma mööda mRNA-d, otsides startkoodonit. Startkoodoni leidmisel seonduvad 40S ning 60S subühikud, moodustades 80S kompleksi.
14. Elongatsioon – aminoatsüül-tRNA liigub läbi kolme ribosomaalse saidi (A, P ja E) ja terminatsioon – valgusüntees termineeritakse mRNA stoppkoodonini jõudmisel ribosoomi vastavate faktorite poolt (release factors).
15. Transkriptsiooniline regulatsioon eukarüoodis – translatsioonilised repressorid, nt akonitaas, initsiatsioonifaktorite modifikatsioon, AUG kontekstist sõltuv regulatsioon (lekkiv skaneerimine ), uORF (ribosoomkompleks dissotsieerub enne ORF jõudmist), IRES (ei teki kompleksi 5’ capil), eIF4E defosforülatsioon (inhibeerib 5’ sõltuvat translatsiooni) ja prokarüoodis – Shine Dalgarno järjestuse blokaad valguliste regulaatoritega (repressorid), Shine Dalgarno järjestuse paardumine mRNA komplementaarse osaga.
VALKUDE SORTEERIMINE
1. Millel põhineb valkude topoloogia , mis on signaaljärjestus - valkude bioloogilise aktiivsuse avaldumine toimub kindlates kohtades, selle realiseerumiseks kasutatakse kahte tüüpi signaaljärjestusi – võivad olla järjestikused või moodustuda valgu eri osadest selle pakkimise tulemusena. 20% juhuslikest järjestustest moodustavad erinevaid topoloogilisi signaale. Topogeensed järjestused määravad integraalsete valkude paigutamise membraanidesse (et toimuks õigesti orienteeritult).
2. Kirjelda sekretoorset rada – valkude süntees toimub karedapinnalisel ERil, kust vastsünteesitud valgud suunatakse läbi Golgi kompleksi erinevatesse lokalisatsioonidesse rakus või sellest väljaspool; selle kaudu sorteeritakse ER, Golgi kompleksi, lüsosomaalsed, membraansed ja sekreteerivad valgud. Mis on eksotsütoos - transportvesiikulite abil sisekeskkonnast makromolekulaarsete komponentide omastamine ning nende ühinemine raku välismembraaniga ja endotsütoos - väliskeskkonnast transportvesiikulite abil makromolekulaarsete komponentide omastamine (pinotsütoos - lahustunud makromolekulide sissevõtmine väikeste vesiikulite abil, vesiiklid liiguvad lüsosoomi, fagotsütoos – suuremate (tahkete) partiklite omastamine ja lagundamine, konstitutiivne – selle kaudu sorteeritud valgud liiguvad väikestes, vähempakitud vesiiklites ja reguleeritud sekretsioon – selle kaudu sorteeritud valgud liiguvad tihedamalt pakitud, suuremates vesiiklites, need vabanevad mingi signaali tulemusena)?
3. ER signaaljärjestus, kus paikneb ja millised on seaduspärasused – laetud N-terminaalne signaal (Met + 2-5 laetud aminohapet), signaaljärjestuse pikkus on 16-20 AHd, 6-12 hüdrofoobset AHd sisaldav regioon, 5 polaarset AHd sisaldav N-terminus, preproteiin ja preproproteiin. Sellise struktuuriga järjestus määrab ära tema äratundminse SRPde poolt ja selline polüpeptiid suunatakse ERi. Pärast seda lõigatakse signaal ära vastavate signaalpeptidaaside poolt. SRPga interaktsioon on adapteriks ribosoomide ja ER vahel. Polüpeptiidid, millel selline signaal puudub, suunatakse tsütosooli.
4. Valkude suunamine ER-I, SRP ja translokoon, energeetilised aspektid – sekretoorsete valkude signaaljärjestus suunab need ERi, seejärel lõigatakse selline järjestus kui funktsionaalselt mittevajalik . Sekretoorsed valgud sisenevad ER luumenisse vahetult pärast sünteesi algust – kotranslatoorselt. SRP on signaali äratundmise partikkel . Signaaljärjestuse interaktsiooniks ER membraaniga on vaja kahte valku: SRP ja SRP retseptor . Translokalisatsiooni põhjustab ribosoomi liikumine mRNA-l ja sellest tulenev polüpeptiidahela liikumine ribosoomist välja. Polüpeptiid liigub ER luumenisse läbi translokoni. GTP hüdrolüüsi tulemusena tekkiv konformatsioonimuutus vabastab SRP ja rSRP kompleksi.
5. Millal ja kus toimub signaaljärjestuse lõikamine ja valkude pakkimine ER valkudel – ERis (luumenis) pärast sinna suunamist signaaljärjestuste järgi vahetult pärast sünteesi algust.
6. Transmembraansete valkude membraani suunamine signaalankurjärjestus on signaaliks SRPle ja peatab translokalisatsiooni ja “stop- transfer ” ankurjärjestus peatab translokalisatsiooni.
7. Kuidas viiakse membraani intra- N-terminusele lähim hüdrofoobne järjestus initsieerib vastsünteesitud ahela sisestamise ER membraani nii, et N-terminus on tsütosooli poole orienteeritud; seega see α-helikaalne segment funktsioneerib kui signaalankurjärjestus ja ekstratsellulaarse N-terminusega transmembraanseid valke? N-terminusele lähimale hüdrofoobsele järjestusele järgneb grupp positiivselt laetud aminohappeid; tulemusena sisestab esimene α-heeliks vastsünteesitud ahela translokonisse nii, et N-terminus ulatub luumenisse.
8. Mitokondriaalsed signaaljärjestused on signaaliks vastavatele retseptorvalkudele, mis translokeerivad vastavad valgud läbi organelli membraani, kuidas toimub valkude suunamine erinevatesse lokalisatsioonidesse mitokondris( matriks – valk viiakse tšaperonide abil maatriksisse, seal lõigatakse signaaljärjestus maha ning valk jääb maatriksisse , membraan – sisemembraan: samamoodi nagu maatriksisse, aga valk seostub sisemembraaniga; välismembraan: valgul on välismembraani lokalisatsioonisignaal ja stop-transfer ankurjärjestus, proteolüütilist lõikamist ei toimu, membraanidevaheline ruum – valk viiakse maatriksisse, seal lõigatakse esimene signaaljärjestus, siis paljastub membraanidevahelisse ruumi suunav järjestus, sinna jõudnuna lõigatakse valgult seegi ära)?
9. Tim sisemembraaniga seotud mitokondriaalsete valkude transpordiga seotud valgud ja Tom valgud – välismembraaniga seotud mitokondriaalsete valkude transpordiga seotud valgud.
10. Mitokondriaalsete valkude pakkimine – transporditavad valgud peavad olema lahti pakitud.
11. Peroksüsomaalne transport, erinevused ja sarnasused mitokondriaalsest transpordiga – erinevalt mitokondriaalsetest pakitakse peroksüsomaalsed valgud tsütosoolis; transport nõuab ATP energiat (sarnasus), kuid mitte elektrokeemilist gradienti (erinevus).
12. Millised valgud on võimelised tuuma sisenema passiivse transpordiga? Madalmolekulaarsed, kuni 17000 Da puhul suhteliselt kiire difusioon .
13. NLS - nuclear localization signal , vajalik aktiivseks transpordiks suuremate kui 60 kDa valkude puhul, tunneb ära tuumaimpordi retseptori, ja NES – sama, mis NLS, ainult ekspordi puhul, tuumatranspordi mehhanism – NLSi või NESiga valk seondub tugevalt importiini või eksportiiniga ja see kompleks liigub läbi tuumapoori ja energeetilised aspektid – GTP ja GDP.
14. Ran valkude tsükkel, nende osa transpordil – impordi puhul: Ran-GTP liitub tuumas eelnevalt tekkinud kompleksiga, see vabastab valgu importiinist ja Ran-GTP/importiini kompleks liigub läbi poori tuumast välja. Tsütoplasmas hüdrolüüsitakse Ran-GTP GDPks, see põhjustab importiini vabanemise ja Ran-GDP liigub tagasi tuuma, kus selle GDP vahetatakse GTPks. Ekspordi puhul: kõigepealt seondub Ran-GTP eksportiiniga, mis suurendab eksportiini afiinsust eksporditava valgu suhtes. Kui valk seotud, liigub kolmikkompleks poori kaudu tuumast välja. Seejärel hüdrolüüsitakse Ran-GTP GDPks, see põhjustab eksportiini vabanemise. Eksportiin, mis pole enam Ran-GTPga seotud, kaotab valgu suhtes afiinsuse ja kompleks laguneb. Eksportiin ja Ran-GDP liiguvad tuuma tagasi eraldi, seal vahetatakse Ran-GDP GTPks.
ENDOTSÜTOOS JA LÜSOSOMAALNE TRANSPORT
1. Millised on kaetud vesiiklite tüübid ja millist transporti sellised vesiiklid vahendavad – COPII transpordivad valke ERst Golgisse, COPI viivad läbi retrograadset transporti Golgis, klatriinkaetud vesiiklid transpordivad valke trans-Golgist ja membraanist endosoomidesse.
2. Mille poolest erinevad klatriin kaetud vesiiklid COPI ja COPII vesiiklitest – GTP hüdrolüüs muudab dünamiini konformatsiooni ja on vajalik klatriinkaetud vesiiklite eraldumiseks membraanist, COP tüüpi vesiilklid ei vaja sellist GTPaasset energiat.
3. Kirjelda retseptor-vahendatud endotsütoosi protsessi (LDL ja raua transpordi näited) – spetsiifiline; toimub AP2/klaritiin seoseliste vesiiklite kaudu; alati viiakse transporditav molekul endosoomidesse; initsieeritakse klaritiin-kaetud aladel, kuhu on juba viidud retseptorid . LDL kolesterooli transporti rakkudesse vahendab apoB100 retseptor. Raua transport toimub üle transferiini retseptori: ferrotransferiin seostub retseptoriga, see läheb klatriinkaetud vesiiklina rakku, edasi endosoomi, kus rauaaatomid vabanevad madala pH tõttu ligandilt ja liiguvad tsütosooli, järele jääb apotransferiin, mis ei dissotsieeru endosoomides ja viiakse raku pinnale, kus see vabaneb retseptorilt.
4. Mis on retseptorite retsükleerimine – retseptoreid viiakse membraanilt rakku ja hiljem tagasi, milleks on vajalik? Neurotransmitterite puhul sünaptilise plastilisuse jaoks.
MEMBRAANIVALGUD JA MEMBRAANIPOTENTSIAAL
1. Membraanivalgud 25-75% membraani massist ja nende erinevad klassifikatsioonid: integraalsed valgud – transmembraansed, membraaniga assotsieerunud valgud – kovalentselt ankurdatud; perifeersed valgud – pole otseselt membraaniga seotud, vaid läbi adaptervalkude või lipiidide.
2. Transportervalgud (uniporterid – üks ioon liigub piki gradienti, sümporterid – kaks iooni liiguvad samas suunas, üks piki gradienti, teine vastu, antiporterid – kaks iooni liiguvad erinevas suunas, üks piki gradienti, teine vastu)
3. Ioonkanalite klassifikatsioon, millises suunas toimub ioonide transport ja mis tüüpi transpordiga on tegu? Aitavad transportida ioone piki gradiente (facilitated transport): membraanipotentsiaali poolt kontrollitud, mehaaniliselt kontrollitud, ligandi poolt kontrollitud, transmitteri poolt kontrollitud ja lekkivad kanalid.
4. Ioonpumpade (ATPaaside – transpordivad ioone vastu gradiente ja kulutavad selleks ATP energiat) klassifikatsioon – P-klassi pumbad , V-klassi prootonpumbad, F-klassi prootonpumbad, ABC superperkond ja nendevahelised erinevused – F-klassi pumbad ei kasuta transpordiks ATP energiat, on peamised ATP tootjad, kasutades selleks prootongradienti, esinevad mitokondrites, kloroplastides ja bakterite plasmamembraanis; P-klassi pumbad transpordivad palju erinevaid ioone läbi membraani, nt Na+/K+ ATPaas tagab nende ioonide gradiendid kõrgemates eukarüootides; V-klassi pumbad esinevad põhiliselt vakuoolsetes organellides, kasutavad prootongradienti ja ATP energiat; ABC pumbad esinevad peale bakterite ka imetajate plasmamembraanides, kus transpordivad fosfolipiide, kolesterooli ja teisi väikseid molekule.
5. Mis on membraanipotentsiaal? Elektrilise potentsiaali erinevus plasmamembraani sise- ja väliskihi vahel. Milline on selle tekke põhimõte (millised ioonkanalid ja –pumbad osalevad) – K+ kanalid, kuna nad on tavaolekus avatud; ka Na+/K+ pumbad ja Na+/lüsiin sümporterid.
SIGNAALIÜLEKANNE
1. Rakkudevahelise kommunikatsioon, milliseid protsesse sisaldab? Kuute astet: signaalmolekuli sünteesimine signaliseerivas rakus; signaalmolekuli vabanemine signaliseerivast rakust (eksotsütoos); signaalmolekuli transport märklaudrakuni; signaalmolekuli detektsioon spetsiifilisel retseptoril; muutus raku metabolismis, funktsioonis või arengus, mille on esile kutsunud signaalmolekuli ja retseptori komplekseerumine; signaali eemaldamine ja rakulise vastuse kadumine.
2. Signaalmolekulide klassifikatsioon vastavalt toime ulatusele, endokriinsed – signaalmolekulid (hormoonid) toimivad oma sünteesikohast eemal, tavaliselt imetajates kantakse hormoone edasi vereringe kaudu, parakriinsed – signaalmolekulid ( neurotransmitterid ) toimivad oma sünteesikoha vahetus läheduses ja autokriinnsed signaalmolekulid – toimivad samale rakule, kus sünteesiti.
3. Hormoonide klassifikatsioon – vastavalt nende lahustuvusele ja retseptori lokalisatsioonile: väikesed lipofiilsed molekulid on võimelised läbima plasmamembraane ( steroidid , türoksiin, retionoolhape), seonduvad tsütosoolsetele retseptoritele; hüdrofiilsed molekulid, mis seonduvad rakupinna retseptoritele (peptiidhormoonid, kateholamiinid); lipofiilsed molekulid, mis seonduvad rakupinna retseptoritele (prostaglandiinid).
4. Sekundaarsed vahendajad – rakusisesed molekulid, mille struktuur muutub pärast mingi kindla aine retseptorile seondumist, kutsuvad esile rea ensümaatilisi protsesse, mille tulemusena realiseerub geeniekspressioon; aktiveerivad spetsiifilisi proteiinkinaase – cAMP aktiveerib spetsiifiliselt cAMP sõltuvaid proteiinkinaase, CREB valgud seovad cAMP signaali transkriptsiooniga, hormoon-indutseeritud cAMP taseme tõus ja sellele vastav füsioloogiline vastus on erinev; cGMP vahendab NO signaliseerimist; DAG ja IP3 moodustuvad fosfolipiidide ensümaatilisel modifitseerimisel; IP3 vahendab hormoonide poolt indutseeritud Ca2+ vabanemist ERst. Suurema osa hormoonide efektid vahendatakse efektormolekulideni sekundaarsete vahendajate abil.
5. Ras-valgud (väikesed G-valgud) on GTPaasse aktiivsusega lülitid ja nende tsükkel - toimub üleminek aktiivse ja inaktiivse vormi vahel.
6. G-valk seoselised retseptorid ja nende effektorid - retseptorid on funktsionaalselt kompleksis trimeersete GTPaasse aktiivsusega valkudega; ligandi seondumine retseptoriga aktiveerib G valgu, see omakorda aktiveerib efektorensüümi, mis sünteesib sekundaarse vahendaja ; kõik GPCRd on väga sarnase struktuuriga, koosnedes 7 transmembraanse domeeniga monomeersest valgust, kusjuures N-terminus on rakust väljas ja C-terminus raku sees; GPCRd vahendavad väga erinevaid signaale, nt. nägemine, lõhnad, ( peptiid )hormoonid, neurotransmitterid jne. Suurte G -valkude klassifikatsioon – Gs (effektor adenülaadi tsüklaas), Gi (adenülaadi tsüklaas ja K+ kanal ), Golf (adenülaadi tsüklaas), Gq (fosfolipaas C), Go (fosfolipaas C) ja Gt (cGMP fosfodieseraas).
7. Adenülaadi tsüklaas on ensüüm, mis katalüseerib ATP muutmist cAMPks, on mitmete G-valk seoseliste retseptorite efektoriks. Nt trimeersed Gs valgud vahendavad retseptori signaali adenülaadi tsüklaasini, mis sünteesib sekundaarse vahendaja – cAMP.
8. Proteiinkinaas A ja CRE- valgud – saavad reguleerida valgusünteesi: PKA aktiveerib otseselt CREB valgu, mis omakorda seob CRE (cAMP response element), seeläbi stimuleerib transkriptsiooni.
9. Fosfolipaas C aktiivsusega seotud signaaliülekanne (Inositooltrifosfaat, Diatsüülglütserool, Proteiinkinaas C) - Gq ja Go valgud vahendavad retseptori signaali fosfolipaas Cni, mis sünteesib sekundaarsed vahendajad DAG ja IP3. DAG aktiveerib PKC, mis omakorda fosforüülib seriini ja treoniini hüdroksüülrühmi valkudel, kontrollides seeläbi nende funktsiooni.
10. NO retseptorid ja Proteiinkinaas G – NO seondumisel NO retseptoritega sünteesitakse GTPst cGMP, mis omakorda aktiveerib PKG, see fosforüülib mitmeid erinevaid valke, muuhulgas on tulemuseks näiteks silelihaste lõdvestumine.
11. Retseptor türosiinkinaasid (RTK) ja Ras valgud - RTKd seovad lahustunud või membraanseoselisi peptiidhormoone, mis toimivad tavaliselt kasvufaktoritena. Ligandi seondumine kutsub esile retseptori türosiinkinaasse aktiivsuse, fosforülatsiooni tagajärjel retseptor aktiveerub ja see omakorda käivitab signaaliülekande rakus. RTKd on tavaliselt aktiveeritud olekus dimeersed, kusjuures alati ei ole tegemist homodimeerse interaktsiooniga. RTK rajad on olulised rakkude prolifereerumise regulatsioonis, rakkude vananemise signaalide vahendamisel ja metabolismi moduleerimisel. RTKd transmiteerivad signaali Ras-valkudeni. Ras valgud on GTPaasse aktiivsusega lülitid, mis aktiveerituna indutseerivad kinaasse signaalikaskaadi, mis omakorda kulmineerub MAP kinaasi aktivatsiooniga.
12. MAP kinaaside rada - MAP kinaas on seriini/treoniini kinaas, mida iseloomustab võime translokeeruda tuuma ja fosforüleerida erinevaid valke (nt. transkriptsioonifaktoreid), seeläbi reguleerivad MAP kinaasid transkriptsiooni. Kinaaside kaskaadid lubavad hormoonsignaale võimendada ja täpselt reguleerida.
RAKUBIOLOOGIA.
1. Rakuorganellid . Nende funktsioonid. Vakuoolid sisaldavad erinevaid lahustunud jääk- ja varuaineid ning pigmente, mis annavad taime õitele ja lehtedele värvuse; aitavad tagada kõrget siserõhku. Kloroplastides toimub fotosüntees. Tuumas paikneb raku DNA ning seal toimub ka RNA süntees. Endoplasmaatiline retiikulum on tsütoplasmavõrgustik, osa sellest on karedapinnaline, kuna seal paiknevad ribosoomid ning seal toimub valgusüntees. Ribosoomidest vaba ER-i nimetatakse siledaks ER-ks ning seal toimub, näiteks, teatavate hormoonide süntees. Golgi kompleksis säilitatakse ning sageli modifitseeritakse sünteesitud valke. Golgi kompleksis toimub ka näiteks süsivesikute süntees. Golgi kompleksist eralduvad vesiikulid, mida nimetatakse lüsosoomideks, moodustavad membraaniga ümbritsetud kotikesi, mis sisaldavad ensüüme, mis on võimelised lagundama kõikvõimalikke rakus leiduvaid molekule. Lüsosoomidele funktsionaalselt sarnased on peroksisoomid. Peroksisoomid sisaldavad ensüüme, mis kasutavad orgaaniliste molekulide oksüdeerimiseks molekulaarset hapnikku. Mitokondrid on rakkude “jõujaamad”, sest neis toimub energia konverteerimine lipiididest ja süsivesikutest adenosiintrifosfaadiks ATP. Tsütoskelett koosneb valgukiududest, mis annavad rakkudele kuju, võimaldavad neil liikuda ning osalevad rakusiseses organellide paigutuses. Plasmamembraan piirab raku ja defineerib raku piirid; tagab erinevuse tsütosooli ja rakuvälise keskkonna vahel; tagab kontrollitud ainevahetuse väliskeskkonnaga; vastutab signaaliülekande eest; adhesioon . Taimedel veel rakukest, mis hoiab selle piirides. Tsentrioolid osalevad DNA kahekordistamises ja võrdses jaotamises tütarrakkude vahel.
2. Missugused organellid on omased nii bakteritele kui eukarüootidele? Tsütoplasma, rakumembraan, DNA, ribosoomid. Missugused vaid bakteritele? Tuumapiirkond, plasmiidid, viburid . Eukarüootidele? Rakutuum , vakuool , kloroplast, ER, Golgi kompleks, mitokondrid, tsütoskelett, tsentrioolid. Missugused organellid on omased taime- ja missugused loomarakkudele? Muidu samad, taimedel lisaks rakukest, vakuoolid ja kloroplastid.
3. Loetle kõik tuumakeses sünteesitavad RNA tüübid. mRNA, tRNA, rRNA. Missugused ensüümid neid RNAsid transkribeerivad? Vastavalt RNA polümeraasid II, III ja I.
4. Organelli membraani koostis - nad koosnevad fosfolipiidsest kaksikkihist ning valgu molekulidest, mis on omavahel seotud pôhiliselt mittekovalentsete sidemetega; membraanid on ebasümmeetrilised : nende sise- ja välispind erinevad oma molekulaarselt koostiselt; membraanis on ka kolesterool , selle tähtsus organelli ja raku kui terviku normaalseks funktsioneerimiseks - membraani komponendid on vôimelised lateraalseks difusiooniks; kolesterool membraanis seob ja immobiliseerib fosfolipiide (muudab membraani vähem vedelaks ja tugevamaks). Loetle organelli membraanide üldised omadused. Mitokondritel on kaks membraani. Sisemisel membraanil asuvad ensüümid, mis on seotud energia konverteerimisega. Selleks, et suurendada sisemembraani pinda, on ta sisse sopistunud, moodustades harju e. kriste (cristae). Kirjelda, kuidas need omadused võimaldavad antud organellil täita oma funktsiooni. Tagavad nende organellide ja tsütosooli vahelise iseloomuliku keskkonnaerinevuse: läbimatu hüdrofiilsetele molekulidele; stabiilne, kuna on stabiliseeritud hüdrofoobsete ja van der Waals interaktsioonidega ning polaarne peaosa annab vesiniksidemeid ja ioonseid interaktsioone; moodustavad iseenelikult suletud struktuure (liposoomid ja mitsellid). Sealhulgas too näiteid organelli membraani integraalsetest komponentidest, nende paiknemisest ja kuidas see (asukoht) on seotud antud organelli funktsiooniga – retseptorvalgud on integraalsed, et signaal jõuaks rakku. Fagotsütoos - suurte partiklite ( mikroorganismid , surnud rakkude osad jne.) sissevõtmine. Pinotsütoos (= endotsütoos) - lahustunud makromolekulide sissevõtmine väikeste (Ekso - ja endotsütoosi puhul vastavad makromolekulid eraldatakse vesiikulisse ning nad ei segune teiste tsütoplasmas olevate makromolekulidega. Eksotsütoos - pidev eksotsütoos toimub kõigis eukarüootsetes rakkudes – transportvesiikulid kannavad pidevalt uusi membraanikomponente Golgi kompleksist välismembraani. Eksotsütoosi teel toimub pidev plasmamembraani uuendamine. Reguleeritud eksotsütoosi puhul kogutakse vastavad ained sekretoorsetesse vesiikulitesse, mis ühinevad raku välismembraaniga pärast keskkonnast tulevat kindlat signaali.
5. Nimeta lisaks fosfolipiididele veel vähemalt 3 membraani komponenti – valgud, kolesterool, proteoglükaanid.
6. Rakutsükkel - raku elukäik pooldumisest pooldumiseni. Rakutsükli faasid - interfaasis toimub raku kasvamine, mitoosiks vajalike toitainete kogumine ja DNA kahekordistamine (G0/G1, S, G2 faasid); mitoos – tulemuseks on raku jagunemine kaheks erinevaks rakuks, mida kutsutakse tütarrakkudeks; tsütokinees – toimub raku lõplik jagunemine. Rakutsükli regulatsioon imetajate rakkudes - raku kasv ja rakuvälised signaalid: G1 faasis on rakud tundlikud inhibeerivatele või stimuleerivatele rakuvälistele signaalidele (positiivsed on kasv, ellujäämis- ja mitogeenid; negatiivsed apoptootilised, tsütostaatilised; genotoksilised, metaboolsed, onkogeensed, oksüdatiivne stress ). Rakutsükli regulatsioon hõlmab hädavajalikke protsesse raku ellujäämiseks, kaasa arvatud pärilikkusmaterjali kahjustuste tuvastamine ja parandamine kontrollimatu rakujagunemise ennetamisena. Molekulaarsed sündmused, mis kontrollivad rakutsüklit, on järjestatud ja suunatud, mis tähendab, et iga protsess ilmneb järjestikuselt ja rakutsüklit on võimatu ümber pöörata. Valkude reguleeritud fosforüülimine ja degradeerimine kui rakutsükli kontrollimismehanismid - tsükliin-CDK hüperfosforüleerib Rb ning E2F transkriptsioonifaktor vabaneb. Tsükliinide roll mitoosi regulatsioonis - määravad ära raku edasijõudmise läbi rakutsükli. Kui CDK-d on tsükliini seondumisega aktiveeritud, viivad nad läbi tavapärast biokeemilist reaktsiooni, fosforüleerimist. See aktiveerib või inaktiveerib sihtmärgiks olevaid valke, mis koordineerivad rakutsükli järgmisesse faasi liikumist. . Rakutsükli kontrollpunktid - G1 restriktsioonipunkt (tomib hilises G1, kontrollib G1-S üleminekut, rakud ei sõltu enam mitogeensetest signaalidest S-faasi sisenemisel, nt. kasvufaktoritest), G2 kontrollpunkt , M kontrollpunkt.
7. Rakkude liikumine ja kuju - seotud mikrotuubulite ja mikrofilamentide pikenemise ja lühenemisega neis rakkudes. Tsütoskelett ehk rakuskelett on raku tsütoplasma niitjate ja torujate elementide süsteem, mis määrab raku väliskuju ja organellide paigutuse. Tsütoskelett koosneb peamiselt valkudest. Niitjaid elemente võib jagada kolmeks: mikrofilamendid , intermediaarfilamendid ja jämedad filamendid. Mikrofilamendid - eukarüootsete rakkude tsütoskeletis leiduvad aktiinist koosnevad kõige peenemad filamendid. Nad on oma funktsioonilt äärmiselt mitmekülgsed, võttes osa raku liikumisest ja kuju muutmisest. Mikrotorukesed - tsütoskeleti osad, õõnsad silindrilised polümeerid, mis on moodustunud tubuliini dimeeridest. Mikrotuubulid on põhikomponentideks (koos vahe- ja mikrofilamentidega) tsütoskeletis, ripsmetes ja viburites. Millel põhineb mikrotorukeste stabiilse struktuuri säilimine? Dimeerid lisanduvad "pluss" otsa ja dissotsieeruvad " miinus " otsast. Treadmill efekti olemus - kui G-aktiini kontsentratsioon langeb teatud kriitilise piirini, nii et polümerisatsioon (+)otsast saab võrdseks monomeeride eraldumisega (-)otsast, siis filamendi netopikkus küll ei muutu, muutub aga iga üksiku monomeeri asend filamendis. Treadmilling võib olla üks mehhanism, mille abil genereeritakse rakus liikumine. Intermediaarsed filamendid – tsütoskeleti komponendid vaheloomades (Metazoa). Enamik neist esineb tsütoplasmas, osa (tuuma lamiinid), aga tuumas. Väga paindlikud, saab venitada mitmekordseks. Kuidas mõjutab fosforüleerimine intermediaarsete filamentide struktuurseid omadusi? Põhjustab filamentide demonteerimist.
8. Aktiivsed filamendid ja mikrotorukesed osalevad eukarüootsete rakkudele iseloomuliku kuju tekitamises ja hoidmises, ometi ei ole need permanentsed struktuurid. Põhjenda, miks dünaamiline tsütoskelett on raku normaalseks funktsioneerimiseks oluline – et rakk saaks liikuda. Oma argumentide tugevdamiseks too näiteid olukordadest, kus on oluline eri tüüpi filamentide stabiilsuse säilitamine ja vastupidi – transmembraansete retseptorite toimimiseks (mikrofilamendid), lihaste liigutamiseks (mikrotorukesed). Nimeta keemilisi ühendeid, mis inhibeerivad mikrotorukeste struktuurset dünaamilisust – taxane, epothilone, nocodazole, vincristine, colchicine, eribulin.
9. Kirjelda tuuma lamiine – niitjas valk, millel on strukturaalne funktsioon, aga ka transkriptsiooni reguleerimisvõime rakutuumas. Interakteeruvad membraanseotud valkudega tuuma sisemuses, on seotud tuumaümbrise lagundamise ja tekitamisega mitoosi ajal ja tuumapooride paigutusega. Mille poolest erinevad tuuma lamiinid teistest intermediaarsetest filamentidest? Omavad funktsiooni rakutuumas, on teistest filamentidest pikemad . Kuidas mõjutab fosforüleermine tuuma lamiinide assotsatsiooni? Need ja tuumaümbris lagundatakse.
10. Rakkude integreerimine kudedeks : rakkudevaheline adhesioon ja ekstratsellulaarne maatriks . ECM talitleb : rakke toetava voodrina; ECM omadused mõjutavad rakkude liikumist, polaarsust, adhesiooni, agregatsiooni ja rakkude jagunemist; arengus suunab rakkude migratsiooni ja diferentseerumist; esineb reservuaarina mitmetele hormoonidele, kasvufaktoritele jne; liidab rakud kudedeks ja organiteks. Adhesioon on molekulaarjõududest (adhesioonijõududest) tulenev erinevatest materjalidest kehade pindade või erinevat tüüpi osakeste (molekulide või aatomite) üksteise külge kinnijäämine. Rakk- maatriks adhesioon: integriinid vahendavad nõrke rakk-rakk ja rakk-maatriks vahelisi interaktsiooone. ECM põhikomponendid: proteoglükaanid, kollageen , lahustuvad valgud (fibronektiin). Rakk-maatriks adhesiooni moduleeritakse integriinide arvu ja aktiivsuse muutuste kaudu. Deadhesiooni faktorid võimaldavad rakkude migratsiooni ja võivad rakupinda ümber modelleerida.
11. Rakkude diferentseerumine. Eristunud/diferentseerunud rakkudel on tihti oma kindel/äratuntav morfoloogia ja neis ekspresseeruvad valgud on spetsifitseerunud teatud kindlate bioloogiliste funktsioonide täitmisele, mis on siis omased vaid sellele rakutüübile. Morfogeenid , nende roll rakkude diferentseerumisel. Morfogeen on aine/ühend, mis kontsentratsioonist sõltuvalt määrab ära rakutüübi identiteedi. Morfogeeni pidev gradient kutsub esile terve rea unikaalseid rakulisi reaktsioone/vastuseid, ehkki küll vaid teatud, lõpliku arvu lävikontsentratsiooni väärtuste juures. Kui morfogeeni tase on läviväärtusest kõrgem, siis rakud vastavad ühte moodi, kui madalam, siis teistmoodi. Mis on rakulise diferentseerumise molekulaarseks aluseks? Loomade ja taimede arengus toimuv ulatuslik rakkude eristumine sõltub geeni ekspressiooni kvantitatiivsetest ja kvalitatiivsetest muutustest, mida reguleeritakse suures osas transkriptsiooni tasemel. Kas diferentseerunud rakk võib valida mõne muu arengusuuna? Jah, näiteks võib areneda vähirakuks. Võimalik on ka trans-diferentseerumine, nt kõhunäärme rakkude ja hepatotsüütide-vaheline üleminek.
12. Neuronil on 4 morfoloogiliselt eristatavat piirkonda (dendriidid, rakukeha , akson, sünaps). Missuguste protsesside abil tagatakse valkude õigeaegne olemasolu “õiges piirkonas” ja miks see on vajalik? Inhibiitorvalgulise regulatsiooniga, et tekkinud rakk oleks õigesti funktsioneeriv.
Tüvirakud ( toti - viljastatud munarakk on totipotentne, st ta sisaldab geneetilist infot, et areneda igaks keharakuks ja ka platsentaks ning embrüovälisteks rakkudeks, seega areneda terviklikuks inimorganismiks. Inimese arengu 4.-5. päevaks on see totipotentne rakk 3-4 jagunemise tulemusena andnud järglastena hulgaliselt omasuguseid, multi - (embrüonaalne tüvirakk (ES)): Umbes 5ndal arengupäeval hakkavad need totipotentsed rakud diferensteeruma (e. spetsialiseeruma ) ja moodustavad seest tühja rakukogumi, mida nim. blastotsüstiks. Blastotsüsti välimine rakukiht areneb platsentaks ja sisemisest rakukihist arenevad edasise arengu käigus kõik keha rakud. Sisemine rakukiht on pluripotentsete rakkude kogum, st et neil rakkudel on võime areneda igaks keha rakutüübiks va platsenta ja looteväliste kudede rakud ega seega ole võimelised arenema terviklikuks organismiks. Pluripotentseid rakke saab eraldada blastostüstist ja loote sugurakkudest, unipotentsed rakud - pluripotentsed rakud spetsialiseeruvad/ diferentseeruvad edasi multipotentseteks rakkudeks, mida tihti nim. ka somaatilisteks tüvirakkudeks. Multipotentsiaalsed tüvirakud on eritüübilised tüvirakud, mis on võimelised arenema vaid kindlateks kudedeks: veretüvirakud vereks, nahatüvirakud nahaks jne. Multipotentsed rakud on olemas nii varases arengus kui ka täiskasvanud organismis. Senini on suudetud identifitseerida umbes 60 erinevat tüvirakku, st ei ole teada, kas kõigi erinevate rakutüüpide jaoks on oma tüvirakud). Loetle tüviraku omadusi - ise- uuenev , multi- (või toti)
potentne rakk, mis on võimeline andma kõiki antud koele iseoomulikke/omaseid
13. rakupopulatsioone. Mis on somaatilised - eritüübilised tüvirakud, mis on võimelised arenema vaid kindlateks kudedeks: veretüvirakud vereks, nahatüvirakud nahaks jne. ja mis on embrüonaalsed tüvirakud? Embrüonaalne tüvirakk (ES)): umbes 5ndal arengupäeval hakkavad totipotentsed rakud diferensteeruma (e. spetsialiseeruma) ja moodustavad seest tühja rakukogumi, mida nim. blastotsüstiks. Blastotsüsti välimine rakukiht areneb platsentaks ja sisemisest rakukihist arenevad edasise arengu käigus kõik keha rakud. Sisemine rakukiht on pluripotentsete rakkude kogum, st et neil rakkudel on võime areneda igaks keha rakutüübiks va platsenta ja looteväliste kudede rakud ega seega ole võimelised arenema terviklikuks organismiks. Pluripotentseid rakke saab eraldada blastostüstist ja loote sugurakkudest. Mis on indutseeritud pluripotentsed tüvirakud? Kindlate faktoritega reprogrammeeritud somaatilised tüvirakud. Tüvirakkude saamise võimalused. Loote sugurakkudest, viljastatud munarakust arenenud blastotsüstist või blastotsüstist, mis on saadud munarakust, kust on eemaldatud tuum ning sisestatud somaatiline rakutuum.
14. Millised on tüvirakkudega seotud rakuteraapia peamised probleemid (takistused)? Võib areneda vähk, koeasendustehnoloogias probleem leida sobivaid rakke, mõned idioodid ajavad oma “ eetika ” teemat.
15. Missugused oleksid potentsiaalsed , rakuteraapias kasutatavad tüvirakkude allikad? Blastotsüst, mis on saadud munarakust, kust on eemaldatud tuum ning sisestatud somaatiline rakutuum; indutseeritud tüvirakud; loote aju, üldse närvikude; neuraalharjarakud, skeletilihase (vöötlihase) tüvirakud, epiteelirakkude eellased pärisnahas ja seedesüsteemis, kõhunäärme ja maksa tüvirakud.
16. Arengulised signaalirajad – WNT – beeta-kateniin on tsütoskeleti komponent, mis translokeerub tuuma, kus funktsioneerib kui TF; WNT’i sidumisel Frizzled retseptorile inhibeerib DSH GSK-3b aktiivsuse. Fosforüülitud beeta-kateniin ubikvinteeritakse ja lagundatakse proteosoomides. Mittefosforüülitud beeta-kateniin on stabiilne ja translotseerub tuuma, kus funktsioneerib koos TCFga kui TF. Beeta-kateniini/TCF kompleks aktiveerib geene, mis osalevad rakkude elushoidmises, proliferatsioonis ja arengulises diferentseerumises, SHH - Shh signaalirada algab kahe transmembraanse valguga: Patched (Ptc) ja Smoothened (Smo). Ptc seob Shh, samas kui Smo funktsioneerib kui signaali edastaja. Ligandi puudumisel interakteerub ja inhibeerib Ptc Smo. See inhibitsioon aktiveerib transkriptsiooni repressori. Ligandi olemasolul, Ptc ja Smo interaktsioon on muutunud ja Smo ei ole inhibeeritud. Gli valk võib nüüd translotseeruda tuuma ja funktsioneerida transkriptsiooni aktivaatorina, funktsioonid: arenguline, holoprosentsefaalia, keha parem-vasak asümeetria, hemopoeesis tüvirakkude elushoidja, vaskularisatsioon - veresoonkonna teke, RTK (retseptor-türosiinkinaasid) - Nerve growth factor (NGF) kuulub neurotrofiinide perekonda, mille liikmed osalevad rakkude elus hoidmises ja jagunemises. NGF on oluline ka neuronite regeneratsioonil ning on potentsiaalseks Alzheimer’i tõve ravimiks. NGFl arvatakse olevat ka teisi füsioloogilisi funktsioone, eeskätt immuunsüsteemis. NGFil on kaks retseptorit TrkA ja p75(NTR). NGFi signaali edastav retseptor on türosiinkinaasne TrkA ja mõnedes rakkudes indutseerib p75 programmeeritud rakusurma ( apoptoosi ). NGFi kõrge afiinsusega sidumiseks on vaja mõlemat retseptorit. Sidumise tulemusena retseptori türosiinkinaas aktiveerub ja indutseerib signaalsete kaskaadide tekke. Üheks signaali rajaks on phospholipaas C aktiveerumine, kusjuures vabaneb DAG ja IP3 ning aktiveeritakse assotseeritud rajad, nagu näiteks proteiinkinaas C rada. Teiseks NGF-aktiveeritud rajaks on ras-seoseline MAP kinaaside kaskaad . See rada aktiveerib TFi AP-1. Lisaks sellele TFile on NGFi radade märklaudadeks ka Egr ja CREB. Egr perekonna liikmed nagu ka Mek/Erk rada osalevad NGFseoselises neuriitide väljakasvus. CREB perekonna liikmed on olulised sünpaatiliste neuronite elus hoidmises, TGF/BMP - signaaliülekandeks on vaja heterodimeerset mõlemat tüüpi retseptoreid sisaldavat retseptorite kompleksi. Tüüp-2 retseptor seob ligandi, aga ei suuda TGFbeeta tüüp-1 retseptori puudumisel TGF-beeta vastust edastada . Tüüp-1 on peamiselt ekspresseeritud hemopoeetilistes progenitorrakkudes. Tüüp-1 ja tüüp-2 retseptorid kodeerivad valke, mille intratsellulaarne domeen funktsioneerib kui seriin/treoniinkinaas; SMADid on evolutsiooniliselt konserveerunud valgud, mis avastati kui TGF-beeta superperekonna liikmete, s.o. TGF-b, aktiviinide ja BMP, indutseeritud transkriptsiooni aktivatsiooni mediaatorid. Aktiveerudes translokeeruvad need valgud tuuma, kus nad initseerivad transkriptsiooni. Sõltuvalt rakutüübist või tingimustest, võib TGF-beeta sekretsiooni indutseerida paljude erinevate stiimulitega, nende hulgas steroidid, retinoidid , EGF, NGF, lümfotsüüt-spetsiifilised aktivaatorid, vitamiin D3 ja IL1. TGF-beeta mõjutab ka enda geeni ekspressiooni ning võib omada olulist osa haava paranemises. Pole liigispetsiifilised. Erinevatel TGF-beeta isotüüpidel on palju erinevaid bioloogilisi aktiivsusi, nt TGF-beeta-2 ja TGF-beeta-3, aga mitte TGF-beeta-1, pärsivad kana loote tsiliaarsete ganglionide neuronite elus püsimist, NOTCH - Notch’i aktivatsioon põhjustab tsütoplasmaatilise domeeni (ICD) eemaldamise (proteolüüsi) ja selle migratsiooni tuuma. Tuumas Notchi ICD interaktsioon teiste transkriptsioonifaktoritega aktiveerib Enhancer of Split’i transkriptsiooni. Selle geeni produkt inhibeerib achaete-scute geeni ekspressiooni, mis on vajalik neuroblastide tekkeks. Hairless ja teatud viiruste EBNA2 valk interakteerub Suppressor of Hairless’i promootoriga. Wingless aktiveerib dishevelled’i ja viimane blokeerib Notch geeni aktivatsiooni. Delta /Notch signaalirajad ja Neurogenin1 funktsioneerivad mitmetes eri staadiumites sensoorsete neuronite eristumisel, esmalt neuraalplaadi külgede ja hiljem migreeruva neuraalharja rakkude hulgas. Notch valgud kontrollivad arengulisi valikud ka hemopoeesis, so kas lümfoidsetest progenitoridest saavad B- või T-rakud. Lisaks normaalse hemopoeesi reguleerimisega on Notch valgud seotud ka inimese leukeemia tekkega. Nende signaaliradade komponendid, signaali edastamise mehanismid ja bioloogiline tähtsus erinevate organsüsteemide ning rakutüüpide kujunemisel. Arenguliste signaalide antagonistid - Fibroblast Growth Factor’i signaali inhibitsioon pidurdab hiire lootel kopsupungakeste harunemist. TGF-beeta sünteesi inhibeerivad EGF, FGF, deksametasoon, kaltsium, retinoidid ja folliikulit stimuleeriv hormoon (FHS).
17. Rakusurm . Programmeeritud rakusurm ehk apoptoos – soovimatute rakkude tahtlik eemaldamine; füsioloogiline; mittejuhuslik; aktiivne; kontrollitud; rakk osaleb enda surmas; esile kutsutud füsioloogiliste või patoloogiliste stiimulite poolt; morfoloogilised tunnused: kromatiini kondensatsioon , raku kahanemine, organellid ja rakumembraanid säilivad, põletiku ennetamiseks kiire allaneelamine naaberrakkude poolt, DNA tükeldamine. Kaspaaside kaskaad – apoptootilised proteaasid viivad läbi apoptoosi; kaskaad – aktiveeritud initsiaatorkaspaasid aktiveerivad efektorkaspaasid, mis viivad raku apoptoosi, pöördumatult. Troofiliste faktorite roll apoptoosi pidurdamisel – sekreteeritud lahustunud ellujäämisfaktorid. Troofiliste faktorite retseptorite seondumine ligandiga surub apoptoosi aktiivselt maha. Nekroos ehk programmeerimata rakusurm – rakkude tahtmatu tapmine tõsise vigastuse poolt; traumaatiline; juhuslik; passiivne; kontrollimata; esile kutsutud tugeva stressi poolt: välisbarjääride, energiat tootvate mehhanismide, ioonilise homeostaasi purustamine, äkiline muutus raku pHs; morfoloogilised tunnused: tuuma ja raku paisumine , organellide segilöömine, raku lõhkumine ja selle osade vabanemine, põletikuline vastus.
18. Vähiraku ja terve raku võrdlus – vähki iseloomustab rakkude autonoomne jagunemine, invasioon ümbritsevatesse kudedesse ning võime metastaseeruda. Vähirakkudel on tervetega võrreldes erinev kuju ning nad on kaotanud oma esialgse funktsiooni, paljunevad pidurdamatult, surematud.
19. Selgita vähi tekke tüviraku- kontseptsiooni - eellasrakkude jagunemine väljub kontrolli alt, ebaküpsete eelasrakkude akumulatsioon on tingitud diferentseerumise e. küpsemise blokaadist, teise variandi puhul läheb diferentseerumine küll lõpuni, kuid rakke on siiski ebanormaalselt palju. Tüvirakkudega on seostatud leukeemiat, rinnavähki, nahavähki, ajukasvajaid.
20. Mis on proto -onkogeenide funktsioon rakus - kodeerivad rakkude kasvus ja jagunemises olulisi valke ja kuidas proto-onkogeenide muutumine onkogeenideks mõjutab raku jagunemist? Hakkavad vohama eluspüsimist? Surematud diferentseerumist? Väheneb surma? Ei sure .
21. Mis on tuumorsupressorite funktsioon rakus - hoiavad ära rakkude piiramatu proliferatsiooni ja kontrollivad homeostaasi olulisi protsesse ja kuidas mutatsioonid tuumorsupressori geenides mõjutavad raku jagunemist? Hakkavad vohama eluspüsimist? Surematud diferentseerumist? Väheneb surma? Ei sure.
22. Aneuploidia (kromosoomide vale kordsus) kui vähi tekke üks võimalikke mehanisme - kutsub esile väga paljude geenide doosi muutuse, nii võib proto-onkogeene juurde tulla või tuumorsupressorite arv väheneda.
23. Mis on genoom? Ühes liigiomases kromosoomikomplektis (haploidne kromosoomistik) sisalduv geneetiline materjal proteoom? Organismis sisalduvate valkude kogum transkriptoom? Raku poolt toodetava RNA kogum reguloom? Rakus olevate regulatsioonikomponentide hulk (geenid, mRNA) tselloom (cellome)? Kõik molekulid ja nende interaktsioonid rakus metaboloom ? Ainevahetusprotsessi ehk metabolismi väikesemolekuliliste vahe- või lõppsaaduste – metaboliitide - kogum interaktoom? Makromolekulaarsete interaktsioonide kogum metüloom? DNA metüleerimiste kogum rakus morfoom? Organismi anatoomilise struktuuri, keemilise ja biokeemilise koostise ning materjali omaduste kvantitatiivne kirjeldus nukleoom? Raku nukleiinhapete kogum operoom? Operonide kogum bakterirakus ORFeoom? Avatud lugemisraamide summa genoomis translatoom? Translatsiooniproduktide kogum rakus transportoom? Membraanitransporterid ja kanalid rakus.
RAKKUDE MANIPULEERIMINE JA KASUTAMINE EKSPERIMENTAALSES TÖÖS
1. Rakukultuuride eelised - homogeensed võrreldes koerakkudega; eksperimenditingimused on selgelt defineeritud; rakukultuuris saab isoleerida huvipakkuva raku ja sellest kasvatada geneetiliselt homogeense koloonia – rakkude kloonimine ; geneetiliselt homogeenne rakutüvi - kloon ja puudused – ei saa jälgida kuidas uuritav käitub tervikorganismis või kuidas organism seda mõjutab võrreldes in vivo mudelitega.
2. Mikroorganismide kasvatamine kultuuris - Escherichea coli, Saccaromyces cerevisiae: kiire kasv ja väga lihtne kasvukeskkond .
3. Mikroorganismide kasvukeskkond kultuuris - süsiniku allikas: glükoos või glütserool; lämmastiku allikas: NH4+; soolad : Na+, K+, Mg2+, Ca2+, SO42 -, Cl-, PO43-. Pooltahke keskkond - agar vs. suspensioon.
4. Auksotrioofid, kuidas neid selekteerida? Auksotroofid - mikroorganismide tüvi, mis kasvavad mingi spetsiifilise toitaine olemasolu korral; auksotroofsete tüvede hoidmiseks tuleb nad pidada selektsiooni all. Replikajäljendite meetod - muteerunud tüvede tuvastamiseks. Kolooniale vajutatakse steriilse, velvettempliga ning see viiakse Petri tassidele, mis sisaldavad erinevaid söötmeid.
5. Loomsed rakukultuurid, nende erinevus mikroorganismide kultuurist. Loomsed rakud vajavad rikastatud söödet: aminohappeid, vitamiine, kasvufaktoreid, insuliini, transferriini. Tavaliselt kasvavad tasapinnal, mis on kaetud spetsiaalse maatriksiga. Selline maatriks on kinnituskohaks ECMile - hüaluroonhape, kollageen ja teised ECM valgud.
6. Defineeri primaarne rakukultuur - saadud loomsetest kudedest; suurem osa loomsest koest eraldatud rakke jaguneb piiratud arv kordi piiratud aja jooksul (keskmiselt 50 jagunemist), pärast seda rakud surevad ja rakuliin - “transformeeritud rakud” jagunevad lõpmatult ja selliseid ühest rakust alguse saanud immortaliseeritud kloone nimetatakse rakuliiniks. Rakuliinid sageli aneuploidsed - kromosoomide arv erinev normaalsest. Rakuliinid pole tavaliselt diferentsieerunud, osadel siiski algse koe funktsioonid.
7. Mis on transformatsioon – transformeeritud rakud jagunevad lõpmatult, transformatsiooni erinevad viisid? Võib tekkida iseeneslikult mutatsioonide tagajärjel, selliseid rakke saab eraldada ka nt kasvajakoest või tekitada nt. telomeraasi kodeeriva geeni sisseviimisega rakku.
8. Rakkude fusioonid – rakkude liitumised (teatud tingimustel - PEG, elektriimpulss ), milleks kasutatakse - geenide kaardistamiseks, monokloonsete antikehade saamiseks tekitatakse rakkude fusiooni teel hübriidrakud (hübridoomid).
9. Mis on hübridoom – hübriidrakk, mis on tekitatud rakkude fusiooni teel, millised on selektsiooni tingimused? Kindlal söötmel kasvavad ainult fuseeritud rakud.
10. Läbivoolu tsütomeetria ja FACS (Fluorescence activated cell sorting), põhimõte ja kasutusvaldkonnad – rakud pannakse fluorestseeruma ja need voolavad läbi aparaadi, mis eemaldab laenguta rakud; kasutatakse rakkude sorteerimiseks.
Meelespea:
Molekulaarselt on geen täielik DNA järjestus, mida on vaja funktsionaalse valgu või RNA molekuli sünteesiks. Lisaks kodeerivatele eksonitele sisaldab geen ka mittekodeerivaid alasid (introneid) ja kontrollregioone.
Enamikul bakteri- ja pärmigeenidel intronid puuduvad, samas kui hulkraksete geenidele on need väga iseloomulikud. Intronite pikkus on tihtipeale palju suurem kui eksonite oma.
Lihtne eukarüootne transkriptsiooniühik annab ühe monotsistroonse mRNA, millelt sünteesitakse üks valk.
Kompleksne eukarüootne transkriptsiooniühik transkribeeritakse esmalt primaarseks transkriptiks, mida hiljem protsessitakse kaheks või enamaks monotsistroonseks mRNAks sõltuvalt splaissaitide ja polüadenülatsioonisignaalide valikust.
Paljud komplekssed transkriptsiooniühikud (näiteks fibronektiini geenid) ekspresseerivad ühte mRNA tüüpi ühes rakutüübis ja teistsugust (alternatiivset) transkripti teises rakutüübis.