Otsi
Vajad kellegagi rääkida?
Küsi julgelt abi LasteAbi
Logi sisse ☰

Eksam molekulaarbioloogia (0)

Bioloogia - Molekulaarbioloogia
5 VÄGA HEA
Punktid
  • Milliseid RNA polümeraasi subühikuid peate transkriptsiooni aktivatsiooni regulatsiooni seisukohalt olulisteks ? Selgitage.
    Aktivatsiooni seisukohalt olulised α ja σ faktor.
    Eubakterite RNA polümeraas, suurusega 480 kDa, koosneb viiest subühikust. α2ßß‘ - apoensüüm - koosneb neljast subühikust ja on võimeline katalüüsima RNA sünteesi.
    α – ülesandeks on apoensüümi assambleerumine (N-terminus) ja interaktsioon TF-dega või promootori UP-elemendiga (C-terminus). Sageli on transkriptsiooni initsiatsiooniks vajalik ka spetsiifiliste TF-de olemasolu. Kui transkriptsiooni kontrolliv järjestus -35 on vaevu äratuntav on vajlikud transkriptsiooni aktivaatorid. Miks ei ole konsensus igalpool? vaja geeniregulliks.
    Aktiveeritavatel promootoritel on -35 heksameer konsensusjärjestusest TTGACA märkimisväärselt erinev konsensusjärjestusest ja sel juhul soodustab aktivaator polümeraasi seondumist promootorile.
    Lisaks TF-dele toimub transkriptsiooni regulatsioon ka erinevate σ faktorite kaudu. RNA polümeraasi subühikud on eraldivõttes inaktiivsed. Ainult ß‘on võimeline DNA-ga mittespetsiifiliselt seonduma. Seetõttu seondub ka RNA polümeraasi apoensüüm DNA-ga mittespetsiifiliselt. σ faktori lisandumisel toimub RNA polümeraasi spetsiifiline seondumine promootoralale ligikaudu 1000 korda kõrgema efektiivsusega.
    Holoensüümi koosseisu kuulub ka σ faktor. σ faktor on vajalik RNA polümeraasi spetsiifiliseks seondumiseks promootoralale ja transkriptsiooni avatud kompleksi moodustumiseks. Pärast esimese 10 nukleotiidi sünteesi (abortiivne transkriptsioon ) vabaneb σ faktor multiensüümkompleksist ning RNA polümeraas on võimeline DNA-l edasi liikuma. Toimub RNA ahela elongatsioon .
    Miks need ei ole olulised aktivatsioonis:
    ß - katalüüsib RNA sünteesi
    ß‘ - seondumine DNA matriitsahelaga.
    ω – shaperonvalk, osaleb β’ subühiku voltimisel (selle subühiku puudumine ei mõjuta polümeraasi
    aktiivsust)
  • Kas üks ja sama valk võib toimida nii transkriptsiooni aktivaatorina kui ka repressorina? Põhjendage.
    Ühe ja sama geeni puhul ei, sest transkriptsiooni aktivaatorite ja repressorite seondumisalad promootor -regioonis on erinevad.
    Repressorite seondumisalad võivad kattuda promootoriga, jääda sellest üles- või allapoole. Näiteks lac repressor (lacI produkt ) seondub tetrameerina operaatoralaga regiooni nii et takistab polümeraasil avatud kompleksi moodustamist.
    Erinevalt repressorite seondumissaitidest jäävad aktivaatoreid siduvad järjestused alati -10 heksameersest järjestusest ülespoole, sest vastasel juhul takistaks nende seondumine DNA ahelate lahtisulamist. Samalt promootorilt võib toimuda nii aktivatsioon kui repressioon ja aktivaatorid võivad seonduda eri kohtadesse .
    Erinevate geenide puhul miks mitte. Näiteks erinevaid regulone kontrollivad regulaatorid võivad transkriptsiooni kas stimuleerida (näiteks PhoB), inhibeerida (näiteks LexA) või mõnede geenide puhul stimuleerida ja teiste puhul inhibeerida (näiteks Lrp – leucine response protein ).
    Repressor + korepressor= transkriptsioon
    Repressor + induktor = ei transkribeerita
    Aktivaator + induktor= transkriptsioon
    Aktivaatori represseerimine=ei transkribeerita
  • Transkriptsiooni regulatsioon DNA superspiralisatsiooni kaudu.
    Normaaltingimustel pöörab iga aluspaar kaksikheeliksi telge 34,5 kraadise nurga võrra. DNA heeliksi täispööre saavutatakse 10,4 aluspaariga.
    Promootorjärjestuse TTGACA N17 TATAAT puhul on -35 ja -10 heksameerid DNA heeliksis samasse suunda eksponeeritud. See võimaldab RNA polümeraasil kontakteeruda mõlema heksameeriga.
    Juhul, kui heksameerid asuvad teineteisest kaugemal või lähemal kui 17 bp, on RNA polümeraasi kontakteerumine mõlema heksameeriga korraga takistatud. Heksameeride ebaoptimaalset asetust võib kompenseerida DNA superspiralisatsioon .
    Negatiivne superspiralisatsioon vähendab aluspaaride pöördumist teineteise suhtes. Sel juhul võivad DNA ahelad lahti keerduda ja eralduda. Negatiivset superspiralisatsiooni tekitab näiteks güraas. lac promootoril on heksameeride vaheala 18 bp – transkriptsioon võimendub anaeroobses keskkonnas, kus suureneb DNA negatiivne superspiralisatsioon E. colil.
    Positiivse superspiralisatsiooni puhul (seda tekitab näiteks topoisomeraas I) kulub ühe DNA heeliksi täispöörde saavutamiseks vähem aluspaare. RecA (DNA rekombinatsioon , reparatsioon , kõrvaldab repressori nende promootorite eest, mis kontrollivad DNA polümeraasi ja rekombinatsiooni) promootoril on heksameeride vaheala 16 bp – transkriptsioonitase suureneb DNA positiivse supespiralisatsiooni korral. Näit. külmashoki puhul suureneb RecA valgu kogus rakus positiivse superspiralisatsiooni tõttu.
  • Selgitage mõne näite varal regulatoorseid mehhanisme bakterirakus, mis käivituvad aminohapete limitatsiooni korral.
    Transkriptsiooni regulatsioon attenuatsiooniga
    Enamasti on klassikaliseks attenuatsiooni näiteks toodud trp operoni transkriptsiooni regulatsioon.
    Operoni mRNA liiderjärjestuses on 4 regiooni, mille baasil võivad moodustuda alternatiivsed sekundaarstruktuurid. Regioonide 3 ja 4 paardumisel moodustub rho-sõltumatu transkriptsiooni terminaator . Omavahel võivad paarduda ka regioonid 1 ja 2 või 2 ja 3. Just regioonide 2 ja 3 paardumine takistab teminaatorstruktuuri moodustumist. Milliste regioonide baasil juuksenõelastruktuurid moodustuvad, sõltub sellest, kui palju on rakkudes trüptofaani. Operon kodeerib liiderpeptiidi, milles asuvad nn. kontrollkoodonid, antud juhul Trp koodonid . Trüptofaani defitsiidi korral peatub translatsioon kontrollkoodoni kohal ja liider-RNA-s paarduvad regioonid 2 ja 3. Regioonide 3 ja 4 omavaheline paardumine on takistatud. Selle tulemusena trp operoni transkriptsioon jätkub.
    Kui aga rakus on piisavalt trüptofaani, peatub ribosoom alles liiderpeptiidi kodeeriva mRNA lõpus, regioonide 2 ja 3 omavaheline paardumine on takistatud ja omavahel saavad paarduda regioonid 3 ja 4, termineerides transkriptsiooni.
    Sarnane regulatsioon toimub ka teiste aminohapete biosünteesi operonide transkriptsioonil. Juhul, kui operon kodeerib rohkem kui ühe aminohappe biosünteesi, sisaldavad vastavate operonide liiderpeptiidi kodeerivad järjestused kõigi nende aminohapete koodoneid. Näiteks ilvGDMEA kodeerib isoleutsiini, valiini ja leutsiini biosünteesi ning sel juhul on liiderpeptiidi kodeerivas järjestuses kontrollkoodoniteks Ile, Val ja Leu.
  • Aminoatsüül tRNA süntetaasid
    Aminohapete nälja korral tõuseb rakkudes aminoatsüül tRNA süntetaaside hulk. See võimaldab efektiivsemalt kasutada veel olemasolevaid aminohapete ressursse enne, kui vastavad biosünteesirajad on uuesti tööle lülitatud.
    Süntetaaside geenidel on konserveerunud sekundaarstruktuuridega liiderjärjestus, mis sisaldab ka potentsiaalset transkriptsiooni terminaatorjärjestust. Terminaatorjärjestuse destabiliseerib vastava tRNA antikoodonjärjestuse ja süntetaasi geeni mRNA liiderjärjestuses asuva koodonjärjestuse interaktsioon. Erinevate tRNA süntetaaside liiderjärjestused sisaldavad erinevaid koodonjärjestusi sõltuvalt sellest, millise tRNA süntetaasiga on tegemist. Kui teatavat aminohapet on rakus vähe, on enamus sellele aminohappele vastavaid tRNA molekule vabad ja võimelised interakteeruma liiderjärjestuses paikneva koodonjärjestusega. Aminohappe kõrge kontsentratsiooni korral on enamus tRNA molekule laetud ja seega võimetud interakteeruma liiderjärjestuses asuva koodoniga. Tulemuseks on aminoatsüül tRNA süntetaasi geeni transkriptsiooni terminatsioon.



  • Trüptofaani degradatsioon
    Transkriptsiooni regulatsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud ka kataboolsetel operonidel. Üheks näiteks on trüptofaani katabolismi operoni tnaAB regulatsioon. Kui trüptofaani rakus pole, translatsioon peatub, sest rho-faktor saab seonduda RNA-ga, mille tulemusena transkriptsioon termineerub.
    Antiterminatsioon valgulise faktori abil, mis seondub mRNA-ga
    Bacillus subtilise trp operon on negatiivselt reguleeritud TRAP (Trp Attenuator Protein) poolt. Trp olemasolul seondub see valk (G/U)AG kordusjärjestustele, mis asuvad trp mRNA liiderjärjestuses. Trp puudumisel TRAP ei seondu ja moodustub antiterminaator – alternatiivne sekundaarstruktuur, mis kattub terminaatorjärjestusega.
    Globaalne regulatsioon aminohapete nälja puhul
    Kui keskkonnatingimused muutuvad toitainete ammendumise tõttu ebasoodsamaks , vallandub rakkudes esmalt nn “stringent response” (SR). SR vallandub rakkudes vastusena aminohapete näljale ja võimaldab neil adapteeruda tingimustes, kus energiaressursid on väiksemad. “Stringent response” tulemusena toimuvad geenide ekspressioonitasemes globaalsed muutused. SR-i vallandumiseks sünteesitakse alarmooni ppGpp, mille toimel: väheneb nii RNA kui ka valkude süntees, langeb rRNA ja tRNA geenide transkriptsioon ning sellest tulenevalt väheneb ka ribosoomide hulk antud tingimustel optimaalse tasemeni. Samuti on inhibeeritud DNA replikatsiooni initsiatsioon ning rakukesta komponentide ja fosfolipiidide biosüntees. Samas on aktiveeritud aminohapete biosüntees ning tõusnud translatsiooni täpsus.
    ppGpp süntees
    ppGpp-d sünteesitakse siis, kui rakus on aminohapete nälg, selle tulemusena seondub transleeriva ribosoomi aktseptorsaiti laadimata tRNA molekul . Translatsioon peatub ning aktiveerub ribosoomi 50S subühikuga seondunud RelA . RelA on (p)ppGpp süntetaas I. ppGpp mõjutab otseselt geeniekspressiooni , seda nii transkriptsiooni kui ka translatsiooni tasemel. Kaudselt on ppGpp olemasolust mõjutatud DNA sünteesi, rekombinatsiooni ja reparatsiooniga seotud protsessid.
    ppGpp mõju transkriptsioonile
    Stabiilse RNA (rRNA ja tRNA) geenide transkriptsioon on ppGpp poolt inhibeeritud. Aminohapete biosünteesi ja C-allikate degradatsioonil osalevate operonide transkriptsioonitase suureneb. ppGpp poolt negatiivselt reguleeritavate promootorite puhul põhjustab see nukleotiid RNA polümeraasi dissotseerumise avatud kompleksist.
    ppGpp mõju translatsioonile
    ppGpp translatsiooni pärssiv mõju ilmneb mitmeti. ppGpp interakteerub translatsiooni initsiatsioonifaktoriga IF-2 ning blokeerides initsiaator -tRNA-kompleksi seondumise ribosoomiga. ppGpp võib mõjutada ka translatsiooni elongatsiooni, seondudes elongatsioonifaktoritega EF-TU ja EF-G (seondub eeskätt EF-G-ga) ja inhibeerida sel viisil elongatsiooni. Translatsioonil kulutatakse GTP energiat. Kuna ppGpp on sünteesitud GTP-st, langeb rakkudes GTP kontsentratsioon ja ka see võib hakata translatsiooni piirama.
  • Selgitage geeniregulatsiooni mehhanisme, mida võimaldab transkriptsiooni ja translatsiooni samaaegne toimumine bakterirakus?
    Transkriptsiooni regulatsioon
    Parasjagu sünteesitavalt mRNA-lt algab kohe ka translatsioon. Nende kahe protsessi praktiliselt samaaegne toimumine võimaldab reguleerida transkriptsiooni termineerumist transkriptsiooni ja translatsiooni elongatsiooni kiiruste kaudu. Regulatsioon toimub spetsiifilistelt liiderjärjestustelt, millel on potentsiaal moodustada RNA sekundaarstruktuure ning sellesse ei ole kaasatud regulaatorvalke. Transkriptsiooni attenuatsioonil osalevad nii rho-sõltuvad kui ka rho-sõltumatud terminaatorid. Regulatsiooni transkriptsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud näiteks aminohapete biosünteesi operonidel, pürimidiini biosünteesi operonil, aminoatsüül tRNA süntetaasi operonil ja trüptofaani degradatsiooni operonil.
  • Pürimidiini biosünteesi operonid
    Pürimidiini biosünteesi kodeeriv pyrB1 operon kodeerib liiderpeptiidi. Transkriptsiooni terminatsiooni põhjustav sekundaarstruktuur lõhutakse transkriptsiooni ja translatsiooni koosmõjul. 20 nt enne liiderpeptiidis olevat terminatsioonisaiti asuvad 8 uridiinnukleotiidi. UTP madala kontsentratsiooni korral aeglustub traskriptsiooni elongatsioon U-järjestuse sünteesil. Sel juhul jõuab transleeriv ribosoom RNA polümeraasile järele ning nende koostoime tulemusena lõhutakse transkriptsiooni terminaatorina toimiv sekundaarstruktuur. Kõrge UTP kontsentratsiooni korral RNA polümeraas U-järjestuse kohal ei peatu, mistõttu translatsiooni ja transkriptsiooni koosmõjul ilmnevat RNA sekundaarstruktuuri lõhkumist ei toimu. Esitatud mudeli tõepärasust kinnitavad katsed ribosoomi mutantidega, kus translatsiooni elongatsioon toimub aeglasemalt ning sel juhul väheneb proportsionaalselt ka operoni transkriptsioonitase.
    Translatsioon
    Alles sünteesitavalt mRNA-lt algab koheselt translatsioon, mistõttu ta on ribosoomidega kaetud. Translatsioon kaitseb mRNA-d degradatsiooni eest, sest sel juhul on mRNA tänu ribosoomidele vähem nukleaasidele eksponeeritud.
    Samas on kirjeldatud ka mRNA-sid (näiteks lac operoni mRNA), mille eluiga ei sõltu nende translatsiooni efektiivsusest. Seega sõltub konkreetse mRNA stabiilsus sellest, kas mRNA ribosoomidega katmata ala on nukleaaside poolt atakeeritav või mitte.
  • RNA sekundaarstruktuuride osa geeniregulatsioonis.
    Transkriptsiooni terminatsioon
    Transkriptsiooni elongatsioon ei toimu ühtlase kiirusega. RNA polümeraas võib transkriptsiooni käigus peatuda (ingl. k. “pausing”) juuksenõelastruktuuride moodustumise tõttu vast-sünteesitud mRNA-s. Tänu moodustuvatele sekundaarstruktuuridele tekib võimalus transkriptsiooni regulatsiooniks läbi elongatsiooni ja terminatsiooni mõjutavate faktorite.
    NusA on multifunktsionaalne elongatsioonifaktor, mis stimuleerib teatud tüüpi pausingut (näit. trp ja his operonide sekundaarstruktuuridel) ja Rho-sõltumatut transkriptsiooni termineerumist. Indutseerib anti-terminatsiooni Rho-sõltuvatelt terminaatoritelt. Antiterminatsiooni kompleksis teiste faktorite juuresolekul takistab termineeruva sekundaarstruktuuri teket.
    Attenuatsioon
    Parasjagu sünteesitavalt mRNA-lt algab kohe ka translatsioon, see võimaldab reguleerida transkriptsiooni termineerumist transkriptsiooni ja translatsiooni elongatsiooni kiiruste kaudu. Regulatsioon toimub spetsiifilistelt liiderjärjestustelt, millel on potentsiaal moodustada RNA sekundaarstruktuure ning sellesse ei ole kaasatud regulaatorvalke.
    mRNA stabiilsus
    Iga individuaalse mRNA stabiilsuse seisukohalt on olulised nii tema sekundaarstruktuur kui ka translatsiooni kiirus. Teatavad sekundaarstruktuurid stabiliseerivad mRNA-d, osa on aga substraadiks endonukleaasidele.
    Paljudel mRNA-del on 3’ otsas juuksenõelastruktuur, mis on mRNA-d stabiliseeriva toimega. Erinevalt eukarüootidest on bakteritel kirjeldatud ainult 3’ 5’ suunas mRNA-d lagundavaid eksoribonukleaase. Endonukleaaside poolt teostatavad atakid määravad sageli mRNA degradatsiooni edasise kiiruse, kuna aitavad kõrvaldada mRNA 3’ otsast juuksenõelastruktuure.
    RNaas E on üks põhilisi mRNA degradatsioonil osalevaid endoribonukleaase. See ttunneb ära spetsiifilisi sekundaarstruktuure, kuid lõikab nende kõrvalt üksikahelalist RNA-d, mille puhul on erinevate mRNA-de degradatsiooni uurides pakutud välja erinevaid konsensusjärjestusi. RNA I 5’ otsas olev juuksenõelastruktuur stabiliseerib RNA-d, kuid 5 mittepaardunud, nt enne seda sruktuuri, on destabiliseeriva toimega, võimaldades RNaas E-l mRNA 5’ otsale seonduda ja RNA-d lõigata. Olulised on nii mRNA primaarjärjestus kui ka sekundaarstruktuurid.
    mRNA stabiilsust mõjutavad järjestused
    Sekundaarstruktuuride mRNA-d protekteeriv toime ei ole universaalne, vaid sõltub iga konkreetse mRNA atakeeritavate saitide kontekstist ja sellest, millised nukleaasid seda mRNA-d veel atakeerivad.
  • UTR järjestused
    ompA (kodeerib välismembraani valku A) mRNA 5’ otsas on 133 nt mittetransleeritav regioon UTR, mis stabiliseerib mRNA-d. UTR moodustab 3 juuksenõelastruktuuri. Stabiliseeriva toime seisukohalt on oluline, et nende ette ei jääks üksikahelalist ala.
    mRNA-d stabiliseerivad ka molekuli 3’ otsas mittetransleeritavasse alasse jäävad juuksenõelastruktuurid. Arvatakse, et eksonukleaaside kinnitumiseks 3’ otsale on vaja üksikahelalist ala vahetult molekuli otsas. Lisaks võib mRNA 3’ otsast sissepoole jääv sekundaarstruktuur nii stabiilne olla, et takistab eksonukleaasil mRNA edasist degradeerimist.
    REP järjestused
    REP – Repetitive Extragenic palindromic sequences, võivad mood sekundaarstre. Pakinevad geenide vahel. Kui moodustub vahetult geeni lõpus siis võiks kaitsta 3' 5' degradeerimise eest. Osadel juhtudel on näidatud, et mRNA-d 3´otsast stabiliseeriva toimega REP järjestuses.
    Translatsioon
    RBS-i maskeeriv sekundaarstruktuur tekib mRNA enda järjestuse baasil. mRNA translatsiooni aktiveerib regulatoorne RNA, valk või temperatuuri tõus, mis harutab juuksenõela lahti ja vabastab RBS-i.
  • Translatsiooni initsiatsiooni pärssivate sekundaarstruktuuride kadumine kõrgemal temperatuuril. Kuumashoki sigma faktori RpoH mRNA muutub transleeritavaks kõrgemal temperatuuril.
  • Translatsiooni initsiatsiooni pärssimine antisens-RNA abil
    micF on iseseisva geeni poolt kodeeritud antisens-RNA, mis paardub endale osaliselt komplementaarse mRNA 5’ otsaga. micF RNA on translatsiooniline repressor. micF paardub ompF (kodeerib välismembraani valku F) mRNA RBS-i ja initsiaatorkoodonit AUG sisaldava alaga, blokeerides ompF geeni translatsiooni. Need micF RNA molekulid, mis ei ole paardunud ompF mRNA-ga, võtavad sekundaarstruktuuri, mis soodustab nende degradatsiooni. micF RNA ekspressioonitase on rakus maksimaalne madala temperatuuri ja madala osmootse rõhu korral.
  • Translatsiooni attenuatsioon
    Translatsiooni attenuatsiooni on kirjeldatud MLS (makroliid, linkosamiid, streptogramiin) tüüpi antibiootikumide resistentsuse kujunemisel. Stafülokokid, streptokokid ja streptomütseedid saavutavad resistentsuse MLS antibiootikumide suhtes 23S rRNA modifitseerimise tulemusena.
    Staphylococcus aureus ’e resistentsus erütromütsiini suhtes tekib tänu RNA metülaasi kodeeriva geeni erm translatsiooni induktsioonile erütromütsiini madala kontsentratsiooni puhul. Selle tulemusena metüleeritakse 23S rRNA, muutes rakud resistentseks erütromütsiini kõrge kontsentartsiooni suhtes.
    erm operoni liider-mRNA kodeerib liider- peptiidi , mis on 19 aminohappe pikkune . Liider-mRNA sisaldab järjestusi, mille baasil võivad moodustuda alternatiivsed sekundaarstruktuurid. Kui induktorina toimivat erütromütsiini pole, transleerivad ribosoomid liiderpeptiidi tervikuna . See võimaldab liiderjärjestuses omavahel paarduda regioonidel 1 ja 2 ning 3 ja 4. Regioonide 3 ja 4 paardumise tulemusena on blokeeritud erm geeni RBS ja initsiaatorkoodon ning metülaasi ei sünteesita. Erütromütsiini madala kontsentratsioni puhul peatub liiderpeptiidi translatsioon 9-nda koodoni juures, mille tulemusena regioon 2 paardub hoopis regiooniga 3 ning erm geeni translatsiooni pärssivat sekundaarstruktuuri ei moodustu.
    Operonisisene geeniekspressiooni regulatsioon
    Operonide geenide vahel sek str kust lõikad – saad eri elueaga mRNAd.
  • Milliste mehhanismide abil võib olla tagatud samas operonis asuvate geenide erinev avaldumine bakterirakus?
    Transkriptsiooni antiterminatsiooni spetsiifiliste valkude abil on kirjeldatud eeskätt suurte operonide puhul, kus geenide avaldumine toimub etapiviisiliselt.
    Operonisisene geeniekspressiooni regulatsioon
    Kuigi geenide transkriptsioon võib alata sama(de) promootori(te) alt, vajab rakk vastavaid geeniprodukte sageli erinevas koguses. Operoni geenidevahelises alas on leitud järjestusi, mille baasil võivad tekkida RNA sekundaarstruktuurid. Polütsistroonse mRNA lõikamine algab enamasti geenide vahelt ning kuna tekkinud mRNA segmendid on erineva elueaga, võib see olla üheks mehhanismiks , mis aitab reguleerida geenide ekspressioonitaset operonisiseselt. Näiteks laktoosioperoni puhul toimub lacY-spetsiifilise mRNA degradatsioon ligikaudu 2-korda kiiremini kui lacZ mRNA lagundamine.
    Translational coupling
    Iga geeni ees peaks olema oma RBS, kus toimub uus initsiatsioon, eri segmentidel eri efektiivsusega, olenev järjestusest. Osade polütsistroonsete mRNA-de puhul paiknevad geenid nii lähestikku, et lõppeva geeni stop koodon ja temale järgneva geeni initsiaatorkoodon asuvad kõrvuti või kattuvalt. Sel juhul ei dissotseeru ribosoomid pärast stop koodonit mRNA-lt, vaid difundeeruvad külgneva geeni initsiaatorkoodonini ning alustavad järgmise polüpeptiidi sünteesi. Selline mehhanism võimaldab erinevate valkude sünteesi täpsemalt koordineerida. Sel viisil on sünteesitud näiteks faag lambda hiliste geenide poolt kodeeritud kapsiidivalgud, mida on vaja kindlal ajal kindlas hulgas ja vahekorras faagipartiklite assambleerimisel.
  • Ribosoomivalkude operonide translatsiooni regulatsioon
    Ribosoomivalkude (R- valgud ) geenid rps ja rpl asuvad mitmes operonis ning nende süntees on kontrollitud R-valkude endi poolt. Sellise autoregulatsiooni puhul seondub üks reguleeritava operoni poolt kodeeritud R-valkudest vastava polütsistroonse mRNA spetsiifilisele järjestusele, mis külgneb RBS-iga ja sisaldab initsiaatorkoodonit AUG. See spetsiifiline järjestus sarnaneb rRNA järjestusele, kuhu vastav regulatoorne R-valk seondub ribosoomis. Mida aeglasem on rakkude kasvukiirus, seda vähem on neis ribosoome. R-valkude sünteesi autoregulatsioon võimaldab hoida rakkude kasvukiiruse muutumisel proportsioonis erinevate ribosoomikomponentide sünteesi. Rakkude kasvukiiruse aeglustumisel väheneb rRNA sünteesi hulk. Kui rakud kasvavad kiiresti, on rakusisene rRNA hulk kõrge ja regulatoorsed R-valgud seonduvad rRNA-ga, kuna nende seondumisafiinsus rRNA-le on kõrgem kui mRNA-le. Kui kogu rRNA on asambleeritud ribosoomidesse, seonduvad regulatoorsed R-valgud mRNA-le ja pärsivad iseenda ja ka teiste sama polütsistroonse mRNA poolt kodeeritud R-valkude sünteesi.
  • Millest sõltub konkreetse mRNA hulk bakterirakus?
    mRNA hulk rakus sõltub sellest, kui kiiresti mRNA-d sünteesitakse ja degradeeritakse. Seega on geeniekspressiooni seisukohalt lisaks transkriptsiooni aktivatsiooni regulatsioonile oluline ka mRNA stabiilsus rakus. Kui teatavat geeni enam ei transkribeerita, kuna vastavat geeniprodukti pole hetkel rakus vaja, tuleb vastav mRNA kiiresti lagundada. mRNA degradatsioonil on sageli oluline roll ka geenide ekspressiooni taseme reguleerimisel operonisiseselt. Erinevate mRNA-de poolestusaeg bakterirakus varieerub enamasti vahemikus poolest minutist kuni 5 minutini. Nii võib ka erinevate geenide mRNA eluiga operonisiseselt olla väga erinev.
    mRNA degradatsioonil puudub ühtne rada. Iga individuaalse mRNA stabiilsuse seisukohalt on olulised nii tema sekundaarstruktuur kui ka translatsiooni kiirus. Teatavad sekundaarstruktuurid stabiliseerivad mRNA-d, osa on aga substraadiks endonukleaasidele. Degradatsiooni viivad läbi erinevad ekso- ja endoribonukleaasid. Paljud mRNA-d on stabiilsemad siis, kui neid efektiivselt transleeritakse, sest siis on nad ribosoomidega tihedalt kaetud ja seetõttu kaitstud RNaaside toime eest.
    mRNA stabiilsust mõjutavad tegurid
    1. Translatsioon –kaitseb mRNA-d degradatsiooni eest, mRNA on tänu ribosoomidele vähem nukleaasidele eksponeeritud. Oluline on aga seegi kas mRNA ribosoomidega katmata ala on nukleaaside poolt atakeeritav või mitte.
    2. mRNA järjestused
    mRNA stabiliseerimisel on näidatud nii 5´ kui ka 3´ otsas paiknevate sekundaarstruktuuride mõju,
    UTR (untranslated regions) mRNA 5´ ja 3´otsas.
    REP – Repetitive Extragenic palindromic sequences.
    Polü(A) järjestused mRNA 3´otsas - eukarüootides on polü A et stabiliseerida. Bakteritel vatsupidine funktsioon. 3´otsas polü(A)-järjestust sisaldavad RNA molekulid on PNPaasi ja RNaas II poolt paremini atakeeritavad. polü(A)-järjestus on nende eksonukleaaside kinnitumis-kohaks muidu vahetult 3´otsas sekundaarstruktuuri sisaldavatele mRNA-dele.
    Vajatakse helikaasi abi ja ribonukleaas kinnitub kehvemini, kui on sek struktuur, selliseid lagunatakse muidu aeglasemalt – poly a annab toetsupinna. Polü(A) järjestusi sünteesivad polü(A) polümeraasid PAP I ja PAP II
    mRNA polüadenüleerimine on bakterirakus pidevalt toimuv protsess, mis aitab kaasa mRNA molekulide täielikule degradeerimisele.
  • Globaalne geeniregulatsioon bakterites ja selle uurimist võimaldavad meetodid.
    Erinevaid bioloogilisi protsesse koordineeritakse globaalse regulatsiooni kaudu. Globaalsele regulatsioonile alluvad kõik operonid.
    Operonid, mida kontrollib üks regulaatorvalk, moodustavad reguloni. Samasse reguloni kuuluvate operonide induktsioon võib üsna ulatuslikult varieeruda.
    Erinevatesse regulonidesse kuuluvad operonid või geenid võivad kuuluda modulonidesse. Samasse moduloni kuuluvaid geene/operone kontrollib lisaks nende erinevatele regulaatoritele ka ühine globaalne regulaator (näiteks cAMP retseptorvalk CRP e. CAP).
    Globaalse regulatsiooni kirjeldamiseks on võetud kasutusele veel mõiste stimulon. Stimuloni kuuluvad geenid, operonid, regulonid ja modulonid, mille tööd mõjutab üks ja sama keskkonnastiimul. Suur osa neist stiimulitest on tunnetatavad rakusiseselt. Samasse stimuloni kuuluvate regulatoorsete üksuste tööd kontrollivad erinevad regulaatorid. Stiimulite mõjul võidakse sünteesida väikeseid signaalmolekule nagu näiteks cAMP, ppGpp või homoseriin laktoon, mis mõjutavad transkriptsiooni kas otseselt või interakteerudes transkriptsioonifaktoritega.
    Globaalse regulatoorse võrgustiku uurimine eeldab erinevate meetodite kombineeritud rakendamist:
  • Genoomi järjestuse analüüs võimaldab identifitseerida potentsiaalseid promootoreid ja motiive, mis on konserveerunud sama regulaatori poolt kontrollitavate geenide ees. Regulaatori seondumisala suurem kokkulangevus konsensusjärjestusega esineb geenide puhul, mille avaldumisele on uuritaval regulaatoril tugevam efekt ja siis, kui regulaatorvalk seondub ühte kindlasse saiti promootorala ees. Samas valgud, mis seonduvad paljudesse saitidesse, interakteeruvad tavaliselt ka teiste valkudega. Valkude kooperatiivsel seondumisel DNA-ga ei pruugi uuritava valgu seondumissait olla DNA järjestuse põhjal ennustatav.
  • Reportergeenide kasutamine transkriptsiooni liitjärjestuste konstrueerimiseks. Promootorita reportergeen (näiteks lacZ) inserteeritakse genoomi erinevatesse piirkondadesse, nii et see satub erinevate promootorite kontrolli alla. Edaspidi on võimalik uurida, milliste geenide promootorite kontrolli all muutub reportergeeni ekspressioonitase (tõuseb või langeb) vastusena stressifaktoritele. Kromosomaalsete liitjärjestuste tekkimine võib viia märklaudgeeni aktiivsuse pärssimisele. Reportergeeni poolt kodeeritud valk võib rakus ka ise stressi indutseerida.
  • Geenikiibid (gene chips , microarrays). Tahkele kandjale viidud DNA järjestused pärinevad organismi erinevatest geenidest ning neile hübridiseeritakse rakkudest eraldatud totaalsele mRNA-le sünteesitud cDNA proov . Sel viisil võrreldakse erinevate mRNA-de ekspressioonitaset bakterirakus nii erinevate stressitingimuste korral kui ka teatava regulaatori olemasolu või puudumise või üleekspressiooni korral. Seda meetodit on hea rakendada organismide puhul, kelle genoomi primaarjärjestus on teada.
  • Translatsiooni liitjärjestused. Bakterirakus mõõdetud mRNA hulk ja sellelt sünteesitud valgu hulk ei ole üks-üheses vastavuses. Translatsiooni efektiivsuse uurimiseks konstrueeritakse translatsiooni liitjärjestusi. Sel juhul liidetakse reportergeenile (millel puudub promootor ja mRNA 5´otsas ribosoomiga seondumise ala) samas lugemisraamis uuritava geeni valgu N-terminaalset osa kodeeriv DNA järjestus ja mõõdetakse liitvalgu ekspressiooni. Arvestama peab võimalusega, et sellise liitjärjestuse puhul võib olla muutunud mRNA stabiilsus ning see võib samuti mõjutada liitvalgu ekspressioonitaset.
  • 2-D geelid ja mass- spektromeetria . Erinevate valkude hulga hindamiseks bakterirakus kasutatakse totaalvalgu lahutamist 2-D polüakrüülamiid-geelelektroforeesil. Igale valgule vastab geelis kindel koht, kus valk on visualiseeritav täpina. Mida rohkem on valku, seda intensiivsem on vastav täpp. Kui eraldada totaalvalk erinevates tingimustes kasvatatud bakterirakkudest, näeme täppide mustris erinevusi. Mass-spektromeetria võimaldab määrata valgu järjestusi ka väga väikeste valgukoguste (pikomoolide ja isegi femtomoolide) korral, mida on võimalik saada valkude puhastamisel 2-D geelist. Geelist isoleeritud valkude aminohappelist järjestust võrreldakse bakteri geenijärjestustelt tuletatud aminohappelise järjestusega ja saadakse teada, milliste geenide poolt on uuritavad valgud kodeeritud. See meetod annab jällegi üldist informatsiooni erinevatel tingimustel üles või alla reguleeritavatest geenidest. Paljudel juhtudel ei pruugi antud geeni mRNA hulk ja sellelt sünteesitud valgu hulk rakus proportsionaalselt muutuda.
    Erinevate valkude funktsioonide uurimisel tuleb arvestada järgmiset asjaoludega, võivad muuta fenotüübi tõlgendamise raskeks:
  • Paljud valgud on multifunktsionaalsed;
  • Varusüsteemide (backup systems) olemasolu teatava funktsiooni täitmiseks.
    Reaalsema pildi rakuliste protsesside toimumise kohta annab erinevate in vitro meetodite kombineeritud kasutamine ja nende kombineerimine omakorda in vivo meetoditega.
  • Väliskeskkonna signaali rakku ülekandumisel osalevad komponendid. Tooge mõni näide.
    Lisaks rakusiseselt tunnetatavatele stiimulitele on neid, mida tunnetatakse rakupinnal. Sel juhul on tegemist väliskeskkonna otsese tunnetamisega spetsiifiliste transmembraansete retseptorite abil, mis kannavad signaali rakku. Vastavat protsessi nimetatakse signaalseks transduktsiooniks.
    Tavaliselt toimub signaali ülekandumine kahekomponendilise süsteemi abil. Stiimuliteks, mida tunnetatakse kahekomponendiliste süsteemide abil, on näiteks pH, osmolaarsus , kemoatraktandid ja repellandid (eemaletõukajad), taimepatogeenide puhul taime pinnal kahjustatud kohtades sisalduvad signaalmolekulid.
    Kahekomponendiline süsteem koosneb sensorist (sageli on selleks histidiini kinaas ) ja tsütoplasmas asuvast vastuvõtvast (ingl. k. response) regulaatorist. Väliskeskkonna stiimuli tunneb ära sensorvalgu N- terminaalne domään. Selle tulemusena muutub sensori aktiivsus.
    Näiteks histidiini kinaasi puhul toimub autofosforüleerumine, kus ATP-lt kantakse fosforüülrühm üle konserveerunud histidiini jäägile valgu C-termiaalses transmitter -domäänis. See omakorda on signaaliks tsütoplasmaatilisele regulaatorile. Regulaatori N-terminaalses vastuvõtvas (receiver) domäänis asub konserveerunud aspartaatjääk. Fosforüülrühm kantakse sensorvalgult regulaatori aspartaadile. Fosfoaspartaat omakorda põhjustab valgu C-terminaalses otsas paikneva efektor -domeeni aktivatsiooni, mille tulemusena valk käitub transkriptsiooni aktivaatorina.
    Näiteks kemotaksise puhul on sensorvalguks histidiini kinaas CheA , mis pärast autofosforüleerumist interakteerub regulaatorvalkudega CheB ja CheY ja fosforüleerib need.
    Fosforüülrühma ülekande ja kinaasse aktiivsusega domäänid histidiini kinaasil ning response regulaatori vastuvõttev (receiver) domään on konserveerunud sama perekonna valkude piires. Varieeruvad sensorvalgu signaali äratundev N-terminaalne domeen ja regulaatorvalgu efektor-domeen. Signaali tunnetavad retseptorid võivad asuda nii transmembraanses kui ka periplasmaatilises või tsütoplasmaatilises sensor -domäänis. Sama sensor võib anda signaali mitmele erinevale regulaatorile ja sama regulaator võib saada signaale erinevatelt sensoritelt. Kirjeldatud on ka ühekomponendilisi signaali ülekandesüsteeme.
    Näiteks Vibrio cholerae ToxR valk on transmembraanne. ToxR tunneb ära raku väliseskkonna signaali, mille tulemusena ta aktiveerub ning seondub seejärel tsütoplasmaatilise domeeniga virulentsusgeenide promootorregiooniga.
  • Milliste protsesside toimumisega võib olla seotud valkude translatsioonijärgne kovalentne modifitseerimine? Tooge mõni näide.

  • Valkude posttranslatsiooniline kovalentne modifikatsioon


    Regulatsioon valkude fosforüleerimise kaudu
    Valkude fosforüleerimine (ja mõnel juhul metüleerimine) toimub näiteks signaalse transduktsiooni radades, kus esmalt autofosforüleerub välise signaali mõjul spetsiifiline sensorvalk ning seejärel kantakse fosforüülrühm sensorvalgu poolt äratuntavale regulaatorile (response regulator) (näiteks viburi pöörlemissuuna muutus kemotaksisel, N-fikseerimisel osalevate geenide transkriptsiooni regulatsioon, Bacillus’e sporulatsioon jt.). Fosfotransferaasi süsteemi, PTS valkude fosforüleerimise/defosforüleerimise kaudu kontrollitakse süsivesinike transportimist rakku ja nende ühendite katabolismiradade tööd. Fosforüleerimine ja fosforüleeritud valkude defosforüleerimine toimub spetsiifilistest histidiini, tsüsteiini, türosiini, aspartaadi , treoniini või seriini jääkidest. Fosforüleerimise kaudu võidakse kontrollida metabolismiraja ensüümide aktiivsust.
    Isotsitraadi dehüdrogenaasi IDH aktiivsuse regulatsioon. Isotsitraadi dehüdrogenaas IDH on tsitraaditsükli (TCA) ensüüm, mille aktiivsuse kaudu kontrollitakse, kas isotsitraat metaboliseeritakse TCA või glüoksülaadi raja kaudu. TCA tsüklis oksüdeeritakse isotsitraat IDH toimel α-ketoglutaraadiks. Kui E. coli rakud kasvavad atsetaadil või rasvhapetel, on IDH fosforüleerimise tulemusena inhibeeritud. Sel juhul viiakse isotsitraat isotsitraadi lüaasi abil glüoksalaadiks. Vastasel juhul konverteeritaks kogu atsetaat CO2-ks ning rakkude kasvuks vajalikke metaboolseid vaheühendeid ei tekiks. IDH fosforüleerimist viib läbi IDH kinaas/fosfataas, mis on kodeeritud aceK geeni poolt. aceK mutandid ei ole võimelised atsetaadil kui ainsal C-allikal kasvama. AceK kinaasi aktiivsus avaldub siis, kui metabolismi vaheühendite kontsentratsioon rakus on madal (see olukord tekib siis, kui rakud atsetaadil kasvavad). Isotsitraat ja 3-fosfoglütseraat aktiveerivad AceK fosfataasse aktiivsuse ja IDH defosforüleerimise, soodustades sel viisil isotsitraadi metaboliseerimist TCA tsükli kaudu.
    Valkude metülatsioon
    Valkude metülatsiooni kaudu reguleeritakse näiteks E. coli rakkude kemotaksisel osalevate membraanseoseliste retseptorvalkude MCP-de ( methyl -accepting chemotaxis proteins) aktiivsust. MCP-de metülatsiooni viib läbi CheR metüültransferaas, kasutades metüülrühma doonorina S-adenosüülmetioniini. MCP-de tsütoplasmaatiline C-terminaalne domään on transmitter-domään, mis signaliseerib rakku kemo-effektori olemasolust kasvukeskkonnas. Signaal kantakse viburi mootorile läbi CheA ja CheY valkude fosforüleerimise/defosforüleerimise. Vastavalt viburi pöörlemissuunale liiguvad rakud kas kemoefektori kontsentratsiooni tõusu või languse suunas. Kui MCP valgud on metüleeritud, on rakud antud efektori kontsentratsiooniga adapteerunud ning võimelised reageerima efektori kontsentratsiooni muutustele. MCP demetüleerimise eest vastutab CheB, mille metüülesteraasi aktiivsus avaldub siis, kui ta on CheA poolt fosforüleeritud.
    Glutamiini süntetaasi aktiivsuse regulatsioon uridülüül- ja adenülüültransferaaside kaudu
    Glutamiini süntetaas GlnS osaleb ammooniumi assimileerimisel, kui ammooniumi kontsentratsioon on madal. GlnS sünteesi ja aktiivsust kontrollib glutamiini/α-ketoglutaraadi suhe rakkudes. Kui see suhe on kõrge ( viitab ammooniumi ülehulgale), on GlnS inhibeeritud, et mitte raisata ATP-d glutamiini sünteesile. Madala suhte korral aga GlnS aktiveeritakse. GlnS-i aktiivsust kontrollitakse kumulatiivse tagasisidestusliku inhibitsiooni ja kovalentse modifikatsiooni kaudu. Valgu 12 subühikut on adenüleeritavad adenülüültransferaasi ATaasi abil, mis kannab ATP-st AMP rühma spetsiifilisele türosiini jäägile. Täielikult adenüleeritud GlnS on inaktiivne, aktiivsus väheneb proportsionaalselt modifitseeritud subühikute arvule. Kumulatiivne tagasisidestuslik inhibitsioon toimib kõige efektiivsemalt osaliselt modifitseeritud ensüümile.
    Valkude proteolüütiline protsessing??
  • Selgitage proteaaside funktsioone bakterirakus. Tooge mõni näide.
    Proteaaside funktsioonid:
  • “housekeeping” funktsioon – nad kõrvaldavad rakkudest vigaselt transleeritud, kahjustatud, valesti volditud või organismile võõraid valke.
  • Regulatoorne funktsioon hoidmaks teatavate valkude hulk rakus madal kas pidevalt või muuta valkude ekspressioonitaset vastusena keskkonna signaalidele (näiteks nälg)
  • Komplekssete struktuuride nagu viburid ja fimbriad süntees
    Valkude proteolüüs:
  • Pidev, konstitutiivne
  • Reguleeritud
    Reguleeritud proteolüüs trans-translatsiooni kaudu
    Protsessis osaleb tmRNA – ssrA valgu poolt kodeeritud väike stabiilne RNA, hübriid millel on tRNA ja mRNA omadused, on transleeritav. Alaniiniga laetud tmRNA liigub kompleksis teiste valkudega ribosoomi, kui valgusüntees on peatunud, tekkinud on viga ja ribosoom enam edasi ei liigu. Originaalne mRNA vabaneb ning valgusüntees jätkub tmRNA matriitsilt. Valgu C-terminaalsesse otsa liidetud SsrA peptiidi tunneb ära SspB ja valk degradeeritakse proteaaside (näiteks ClpXP) poolt. tmRNA võimaldab jätkata mRNA transleerimist teiste ribosoomide poolt. Kui üks stopib, siis teised jäävad ka seisma kokkuvõttes oleks hulk poolikuid valke. Stoppavasse ribosoomi seotakse tmRNa, vabastatakse mRNAlt ja ülejäänud saavad järkata.
    Valgud, mis natiivset str ei säilita või translatsiooniviga, kuumashokk, toksiliste kemikaalidega kokkupuude, valgud võivad minna degradatsiooni.
  • Lon proteaas
    Koosneb 7 subühikust, on ringikujuline. Degradeerib nii ebanormaalseid valke kui ka spetsiifilisi regulaatorvalke (SulA rakutsükli regulaator). Eelistab degradeerida kas osaliselt või täielikult denatureerunud valke. Lon proteaas on ATP-sõltuv seriini endoproteaas.
    SulA - vajatakse rakus ainult ajutiselt . SulA indutseeritakse SOS vastusena. See valk inhibeerib septumi moodustumise raku jagunemisel. Kui SulA-d rakus ei degradeerita, moodustuvad pikad rakkude filamendid ning rakud surevad.
    ClpXP proteaasi poolne “märgitud” valkude degradatsioon
    a) SsrA peptiid valgu C-terminaalses otsas.
    b) RssB-vahendatud sigma faktori σS degradatsioon
    Ka teisi valke võib saata degradatsiooni ClpXP proteaasi, mis ei ole seotud tmRNAga. RssB-ga koos nt lagundatakse sigma faktor, statsionaarses faasis ei seo RssB enam sigma faktorit . Regulatsioon proteolüüsiga.
  • LexA repressori autoproteolüütiline inaktivatsioon
    DNA kahjustuste tulemusena (näiteks UV kiirguse toimel) vallandub rakkudes SOS vastus. Aktiveeruvad geenid, mis olid inaktiveeritud LexA repressori kaudu. LexA inaktivatsioon toimub autokatalüüütiliselt Gly-Ala sideme degradeerimise kaudu. LexA proteolüütiline aktiivsus avaldub ssDNA -ga assotsieerunud RecA. Proteolüüsil kulutatakse ATP energiat. RecA on allosteeriline aktivaator ka faag lambda CI valgu ja UmuD autoproteaassele aktiivsusele. CI proteolüüs viib profaagi induktsioonile, UmuD lõikus aga aktiveerib UmuD valgu.
  • Võrrelge primaarseid ja sekundaarseid transportsüsteeme. Miks võib bakteril ühe ja sama komponendi transportimiseks läbi membraani olla välja kujunenud mitu erinevat transportsüsteemi?
    Sekundaarne transportsüsteem - elektrokeemilise potentsiaali varal töötavad porterid, kuhu kuuluvad sümporterid, antiporterid ja laenguga molekulide uniporterid;
    Primaarsed aktiivsed transporterid – kasutavad primaarseid energiaallikaid, mille tagajärjel tekib ioongradient, mis on omakorda energiaallikaks sekundaarsetele transportsüsteemidele;
    Primaarsed transportsüsteemid on otseselt seotud kas keemiliste või fotokeemiliste reaktsioonidega. Nende süsteemide töö tulemusena tekkiv elektrokeemiline ioonpotentsiaal on kasutatav sekundaarsete transportsüsteemide poolt. Primaarseid transportsüsteeme jaotatakse nende toimimise alusel:
  • klass 1 – hingamise (või fototroofsetel bakteritel ka fotosünteesi) käigus toimuv H+ ioonide translokatsioon , mille tulemusena tekib membraani sise- ja välispinna vahele prootonpotentsiaal.
  • klass 2 – komponendi membraani läbimisega kaasneb ATP süntees või hüdrolüüs. Siia kuuluvad F tüüpi ATP süntaasid (F1F0 ATPaas ), mis on seotud primaarse energia konversiooniga ja mis toimivad mõlemas suunas. Oksüdatiivsel fosforüleerimisel (hingamisahel) sünteesivad nad ATP-d prootonite rakku pumpamisel. Fermenteerimisel luuakse aga plasmamembraani elektrokeemiline potentsiaal prootonite väljapumpamisel ja sel juhul toimub ATP hüdrolüüs.
    Kirjeldatud on ka P-tüüpi ATPaase, mis vastutavad K+, Ca+ või Mg2+ transpordi eest. Osmootse stressi korral osaleb K+ transpordil näiteks Kdp-ATPaas.
    Omaette alamklassi moodustab ATP-d tarbiv substraadiga seonduvate valkude kaudu vahendatud transportsüsteem (binding protein- dependent system). Periplasmaatilised valgud seonduvad spetsiifiliste substraatidega nagu näiteks sulfaadid, aminohapped , suhkrud ja kannavad need sobivatele membraanseoselistele kompleksidele. Edasi toimub nende transportimine tsütoplasmasse läbi ühesuunaliselt avaneva poori . Transportimisel hüdrolüüsitakse ATP-d. See süsteem ei toimi rakkudes, millel on osmootne shokk, kus välismembraan on muutunud läbilaskvaks ja selle kaudu saavad väljuda periplasmaatilised valgud.
  • klass 3 – Na+ ioonide transport dekarboksüleerimisel vabaneva energia baasil. Sel viisil tekib membraani sise- ja väliskülje vahel Na+ ioonide potentsiaal. Energiaallikaks on näiteks oksaloatsetaat. Selline süsteem on kirjeldatud bakteril Klebsiella pneumoniae.
    Mõnikord on ka PTS toodud ka primaarsete transporterite alla. Transpordi käigus toimub fosfoenoolpüruvaadi PEP hüdrolüüs. Kui suhkur seondub transporteriga, ta fosforüleeritakse. Fosforüülrühm pärineb PEP-ilt ja kantakse üle proteiini kinaasi Ensüüm I (EI) ning fosfoaktseptorvalkude HPr (Histidine Protein) ja Ensüüm II (EII) abil. EI ja HPr on kõigi PTS-de puhul ühised, EII on substraadile spetsiifiline.
    Sekundaarne transportsüsteem võimaldab molekulidel läbida membraani olemasoleva, primaarse transportsüsteemi abil loodud ioongradiendi arvelt, kasutades näiteks prootonpotentsiaali (mõnikord ka Na+-ioonide potentsiaali). Üheks kõige paremini iseloomustatud süsteemiks on laktoosi transport rakku laktoosi permeaasi LacY abil. Laktoosi sümportimisega kaasneb prootonite läbi membraani pumpamine.
  • Sümport – ühe kandja poolt vahendatud kahe substraadi samaaegne transport samas suunas. Prootongradient võimaldab sümportida vastupidiselt laetud ioone või neutraalseid molekule (näiteks laktoosi transportimine rakku laktoosi permeaasi LacY abil). Sümporterid töötavad enamasti H+ gradiendi varal, kuid alkalofiilidel ja atsidofiilidel on kirjeldatud ka Na+ sümportereid.
  • Antiport – kahe sarnaselt laetud ühendi samaaegselt vastassuunaline transportimine. Sellesse süsteemi kuulub näiteks Na+ ja H+ ioonide transportimine NhaA ja NhaB abil, mis võimaldab rakkudel aluselises keskkonnas kasvamisel säilitada tsütolasmas neutraalse pH.
  • Uniport – transporditava substraadi membraani läbimine ei sõltu teiste ühendite kontsentratsioonist või transportimisest. Põhimõtteliselt toimub sel viisil eelpoolkirjeldatud glütserooli soodustatud difusioon .
    Konkreetse substraadi rakku transportimiseks on mitu erinevat süsteemi välja kujunenud tavaliselt siis, kui vastav substraat on rakkude kasvu seisukohalt oluline, kuid selle kontsentratsioon võib ulatuslikult varieeruda. Sel juhul on üks süsteemidest konstitutiivne ning substraadi suhtes madala afiinsusega.
  • Bakterirakkude adapteerumine näljaga.
    Rakkude nälgimine (mille tulemusena rakkude kasv peatub ja nad püsivad statsionaarses kasvufaasis ) kutsub esile üldise stressivastuse. Kui keskkonnatingimused muutuvad toitainete ammendumise tõttu ebasoodsamaks, vallandub rakkudes esmalt nn “stringent response” (SR). SR vallandub rakkudes vastusena aminohapete näljale ja võimaldab neil adapteeruda tingimustes, kus energiaressursid on väiksemad. Selle tulemusena pikeneb rakkude generatsiooniaeg . Pikemaajalise nälgimise puhul võib rakkude kasv hoopis peatuda ja rakud püsivad puhkeasendis e. statsionaarses faasis. Statsionaarsesse faasi minekul võib olla ka muid põhjuseid kui ainult nälg.

  • “Stringent response”


    Rakkude pooldumiseks kuluv aeg võib sõltuvalt bakterite kasvutingimustest varieeruda 20 minutist kuni nädalani. Rakkude füsioloogiline seisund, mis väljendub makromolekulide biosünteesi kiiruses ja rakusuuruses, on seotud rakkude kasvukiirusega. Rakkude kasvukiirus on aga omakorda mõjutatud toitainete kättesaadavusest väliskeskkonnast. Mida rikkalikumalt toitaineid, seda kiiremini rakud kasvavad. Sellised rakud on suuremad, nad sisaldavad rohkem DNA-d, RNA-d, valke, fosfolipiide ja rakuseina materjale. Kiiremalt kasvavates rakkudes on raku kohta rohkem ribosoome kui aeglaselt kasvavates rakkudes. SR tulemusena väheneb nii RNA kui ka valkude süntees, võimaldades rakkudel adapteeruda uue keskkonnaga. Eriti markantselt langeb rRNA ja tRNA geenide transkriptsioon ning sellest tulenevalt väheneb ka ribosoomide hulk antud tingimustel optimaalse tasemeni. Samuti on inhibeeritud DNA replikatsiooni initsiatsioon ning rakukesta komponentide ja fosfolipiidide biosüntees. Samas on aktiveeritud aminohapete biosüntees ning tõusnud translatsiooni täpsus. SR-i vallandumiseks sünteesitakse alarmooni ppGpp ning eespool kirjeldatud muutused rakkude füsioloogilises seisundis leiavad suures osas aset just vastusena selle molekuli olemasolule rakkudes.
    Statsionaarne faas
    Üleminek eksponentsiaalsest faasist statsionaarsesse faasi on järk-järguline protsess, kus rakkude kasvukiirus järjest aeglustub. Kasvu aeglustumise peamisteks põhjusteks on kasvuks vajalike komponentide ammendumine keskkonnast (C, P ja N nälg), toksiliste produktide akumuleerumine kasvukeskkonda, hapnikunälg, kasvukeskkonna pH muutumine ebasoodsaks, ulatuslikud temperatuurimuutused jne. Statsionaarse faasi rakud säilitavad mõne aja potentsiaali paljuneda. Seejärel hakkab elusrakkude arvukus populatsioonis langema . Samas tuleb arvestada ka seda, et rakupopulatsioon on statsionaarses faasis dünaamiline. Osa rakke populatsioonist adapteeruvad keskkonnaga ja on võimelised kasvama surnud rakkudest vabanevate resursside arvel. Kui keskkonnatingimused paranevad, hakkab rakkude arvukus populatsioonis jällegi tõusma. Enamasti ei ole looduslikes tingimustes elavatele bakteritele kasvuks piisavalt toitaineid. Seega on rakkude kasv üldjuhul limiteeritud ning rakkude väga aeglane paljunemine või viibimine statsionaarses faasis pigem reegel kui erand .
  • Signaalmolekulid globaalses geeniregulatsioonis. Tooge mõni näide.
    Alarmoonid on väikesed molekulid, mida rakk sünteesib vastusena muutustele keskkonnatingimustes stressivastuse käigus. Alarmoonid sünteesitakse tsütoplasmas. käigus Stiimulite mõjul võidakse sünteesida väikeseid signaalmolekule nagu näiteks cAMP, ppGpp või homoseriin laktoon, mis mõjutavad transkriptsiooni kas otseselt või interakteerudes transkriptsioonifaktoritega.
    ppGpp süntees
    ppGpp-d sünteesitakse siis, kui rakus on aminohapete nälg ja selle tulemusena seondub transleeriva ribosoomi aktseptorsaiti laadimata tRNA molekul. Siis translatsioon peatub ning aktiveerub ribosoomi 50S subühikuga seondunud RelA. RelA on (p)ppGpp süntetaas I, mis katalüüsib ATP-lt pürofosforüülrühma ülekande GTP 3’ hüdroksüülrühmale. ppGpp snteesi puhul on kirjeldatud ka RelA-sõltumatu rada, milles osaleb (p)ppGpp süntetaas II nimetusega SpoT . SpoT aktiveerub vastusena pikemaajalisele C-näljale ja ei sõltu ribosoomide seisundist. Kui vajadus SR-ile kaob, rakkudes on piisavalt energiat ja aminohappeid valgusünteesiks ning kasvukeskkonnas toitaineid, ppGpp lagundatakse. ppGpp degradatsiooni GDP-ks viib läbi SpoT.
    ppGpp mõjutab otseselt geeniekspressiooni, seda nii transkriptsiooni kui ka translatsiooni tasemel.
    ppGpp mõju transkriptsioonile
    Stabiilse RNA (rRNA ja tRNA) geenide transkriptsioon on ppGpp poolt inhibeeritud. Samas on ka ppGpp poolt positiivselt kontrollitavaid geene. Näiteks aminohapete biosünteesi ja C-allikate degradatsioonil osalevate operonide transkriptsioonitase suureneb ppGpp olemasolu korral.
    ppGpp mõju translatsioonile
    ppGpp interakteerub translatsiooni initsiatsioonifaktoriga IF-2 ning blokeerides initsiaator-tRNA-kompleksi seondumise ribosoomiga. ppGpp võib mõjutada ka translatsiooni elongatsiooni, seondudes. elongatsioonifaktoritega EF-TU ja EF-G (seondub eeskätt EF-G-ga) ja inhibeerida sel viisil elongatsiooni. Translatsioonil kulutatakse GTP energiat. Kuna ppGpp on sünteesitud GTP-st, langeb rakkudes GTP kontsentratsioon ja ka see võib hakata translatsiooni piirama.
    Glükoosi-nälgimisel on cAMP alarmooniks, mis on vajalik lisaks laktoosile paljudel teistel C-allikatel kasvamiseks. cAMP on fosfodiesteraasi poolt kiiresti AMP-ks degradeeritav. Kui bakterite kasvukeskkonnas on glükoosi, on cAMP süntees inhibeeritud. CRP (CAP) valk on globaalne regulaator, mis kontrollib nii üksikute operonide (laktoosi ja sorbitooli operonid) kui ka regulonide (galaktoosi, glütseroolfosfaadi, maltoosi reulonid) transkriptsiooni. CRP (cAMP Receptor Protein), tuntakse ka nimetuse all CAP (Catabolite Gene Activator Protein) on aktiivne ainult cAMP juuresolekul.
    cAMP, aktiveerib CRP e CAP, mis aktiveerib kataboliitseid geene
  • Regulatoorsed ümberkorraldused statsionaarse faasi rakkudes.
    Statsionaarne faas – rakud jäävad stressitingimustes metaboolselt aktiivseteks , kuid nad ei jagune, teine võmalus oleks sporulatsioon kehvade keskkonnatingimuste juures. Rakkude sisenemine statsionaarsesse kasvufaasi ei ole järsk. indutseeritakse uued ensüümsüsteemid limiteeriva komponendi juurdehankimiseks juba C, N või P vaeguse esmaste signaalide ilmnemisel . Kui limiteerivat komponenti ei õnnestu juurde hankida, rakkude kasv aeglustub, kuni rakupopulatsioon jõuab statsionaarsesse kasvufaasi. Statsionaarsesse faasi sisenemisel sünteesitakse uusi valke, millest paljud muudavad rakud resistentsemaks ka teistele stressidele nagu näiteks oksüdatiivne stress , osmootne stress ja temperatuuristress.
    Regulatsioon nukleoidi valkudega
    Nukleoidi kokkupakkimine on ajas muutuv. Geeniekspressioon varieerub kromosoomi piirkondades ja on seotud kromosoomi topoloogiaga. DNA-ga on üle genoomi pidevalt seondunud ligikaudu 10 valku, mille hulk varieerub rakus kasvufaas-sõltuvalt. Need valgud muudavad nii lokaalselt kui ka globaalselt kromosoomi struktuuri ja osalevad sel viisil globaalses geeniregulatsioonis. Statsionaarses faasis pole peaaegu detekteeritavat Fis valku, ei toimu ribosomaalsete RNA geenide ekspressiooni. Dps-i hulk suureneb 30 korda statsionaarses faasis. Lisaks üleüldistele muutustele DNA superspiralisatsioonis (näiteks statsionaarse faasi rakkudes suureneb negatiivne superspiralisatsioon) ja DNA kompaktsuse astmes mõjutab transkriptsiooni regulaatorite seondumisefektiivsust DNA-le ka spetsiifiliste DNA regioonide lokaalne konformatsiooni muutus.
    Stressipromootorid - promootorid, millelt lähtuv transkriptsioonitase on kõrgem rakkude kasvukiiruse aeglustumisel ja statsionaarse faasi rakkudes. Statsionaarse faasi σ faktor σS, geeni rpoS produkt on oluline nende geenide avaldumisel, mida bakterid vajavad tingimustes, kus nende kasv on pärsitud. Rakkude üleminekul eksponentsiaalsest kasvufaasist statsionaarsesse tõuseb rpoS mRNA kogus raku kohta 20 korda, valgu hulk aga 100 korda. rpoS mRNA moodustab sekundaarstruktuuri, mis takistab mRNA transleerimist. Selleks, et mRNA muutuks transleeritavaks, peab temaga seonduma RNA shaperon Hfq.
    Muutused statsionaarse faasi rakkudes:
  • Membraanis muutub rasvhapete sisaldus, suureneb rakkude adhesioon ning rakud agregeeruvad. Rakud on ka väiksemad ja ümaramad. Suureneb rakkude liikuvus. Viburite süntees on siiski ajutine, kuna nõuab liialt energiat.
  • Toimuvad muutused kromosoomi topoloogias, väheneb DNA superspiralisatsioon. Rakus muutub DNA-ga seonduvate valkude tase (H-NS, IHF, Dps). Need valgud reguleerivad geenide ekspressiooni taset rakus ning kaitsevad DNA-d füüsiliste ja keemiliste atakkide eest. Eksponentsiaalses kasvufaasis on IHF-i molekule raku kohta 10000-15000, statsionaarsesse faasi sisenemisel nende hulk viiekordistub ning valk seondub ka väiksema afiinsusega saitidesse. Dps seondub DNA-ga mittespetsiifiliselt, kaitstes DNA-d oksüdatiivsete kahjustuste eest. Paljud valgud degradeeritakse ja väheneb ka RNA stabiilsus.
  • Toimub valkude denaturatsioon ja proteolüüs. Selle kaitseks on indutseeritud HSP valgud ja valgud, mis parandavad kahjustusi aminohapetes (Pcm, MsrA).
  • Sünteesitakse uusi valke. Praeguseks on bakteris E. coli identifitseeritud ligi 100 statsionaarsele faasile spetsiifilist geeni.
  • Ribosoomide arv rakus väheneb. 70S ribosoome konverteeritakse 100S dimeerideks. Dimeriseerumisel osaleb 55 aminohappe suurune aluseline valk RMF (ribosome modulation factor ). RMF-defektsed rakud elavad statsionaarset faasi halvasti üle. Dimeersed ribosoomid on resistentsemad proteaasidele ja nukleaasidele ning translatsiooniliselt inaktiivsed. Seni puuduvad andmed, kuidas toimub sellistel ribosoomidel statsionaarse faasi-spetsiifilise mRNA translatsioon.
  • Märgatavat DNA degradatsiooni esialgu pole.
  • Statsionaarse faasi rakkudes tõuseb mitmete tsütoplasma komponentide rakusisene kontsentratsioon. Nende komponentide hulka kuuluvad näiteks K-glutamaat, trehhaloos , glütsiin, betaiin, glükogeen ja polüfosfaat (polü P).
  • Milliste mehhanismide abil on kontrollitud alternatiivsete sigma faktorite seondumine RNA polümeraasiga?
    σ70 on vajalik bakterile eluliselt tähtsate geenide, nn. “house keeping” geenide avaldumiseks eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes. Seetõttu nimetatakse seda põhiliseks σ faktoriks.
    Stressitingimustes (näit. temperatuuri tõus kasvukeskkonnas, toitainete nälg, oksüdatiivne stress) lülitatakse tööle geenid, mille promootoreid tunnevad ära alternatiivsed σ faktorid .
    Alternatiivsed σ faktorid bakteris E. coli kontrollivad teatud geenirühmade avaldumist :
    σ32 , σE - kuumashoki ( heat shock ) geenid; σE aktiveerub vastusena valkude denaturatsioonile periplasmas
    σS - statsionaarne faasi ja oksüdatiivse stressi geenid
    σ54 - N- metabolism , dikarboksüülhapete transport, pilide süntees, tolueeni/ksüleeni katabolism
    σF - viburite süntees
    fecI – Fe-tsitraadi transportsüsteemi regulaator
    Eσ70 ja EσS afiinsust DNA-le mõjutavad RNA polümeraasi modifitseerimine. Statsionaarse faasi rakkudes on RNA polümeraas assotsieerunud happeliste ühenditega nagu näiteks polüfosfaat (polü-P). Polü-P akumuleerub statsionaarse faasi rakkudes. Arvatakse, et polü-P modifitseerib apoensüümi statsionaarse faasi rakkudes, nii et see seob eelistatult σS molekule. Polüfosfaadi kinaasi PPK defektse tüve ellujäävus statsionaarses kasvufaasis on võrreldes algse baktritüvega langenud.
    σS stabiilsust bakterirakus kontrollivad ClpXP proteaas ja RssB. RssB eksponeerib valgu proteaasile. PhoP/PhoQ poolne kontroll - PhoP aktiveerib iraP (yaiB) geeni, mille poolt kodeeritud valk stabiliseerib σS-i interakteerudes RssB-ga. Erinevad anti-adaptorvalgud stabiliseerivad RpoS-i. Slaid!??
    Valk Rsd (regulator of sigma D), mis seondub spetsiifiliselt 70-ga, toimides anti-sigma faktorina. Seondumine toimub piirkonda, mis kattub promootorite –35 heksameerset järjestust äratundva domääniga. Rsd hulk tõuseb siis, kui rakkude kasv aeglustub ja on maksimaalne statsionaarsesse faasi rakkudes. Kuna enamus 70-st on statsionaarse faasi rakkudes inaktiivses olekus, seondub RNA polümeraasiga eelistatult S. Lisaks on kirjeldatud veel faktor Crl, mis soodustab S-i seondumist RNA polümeraasiga.
    Erinevalt 70-st on 54 võimeline seonduma promootoriga ka ilma RNA polümeraasi koostisesse kuulumata. 54 võimaldab RNA polümeraasil seonduda spetsiifiliselt promootoriga, kuid sellest ei piisa avatud kompleksi tekkeks. Avatud kompleksi moodustumiseks on vajalik RNA polümeraasi interaktsioon aktivaatorvalguga ja ATP hüdrolüüs. Ilma aktivaatorita on promootor inaktiivne. Seega on 54-sõltuvad geenid kas vaikivas olekus või kõrgel tasemel ekspresseeritud.
    32 konkureerib 70-ga. Kuna 32 ja 70 on RNA polümeraasi suhtes ühesuguse afiinsusega, toimub regulatsioon faktorite aktiivsuse kaudu. 70 on RNA polümeraasi subühikutest temperatuurile kõige tundlikum . Temperatuuritõusu tagajärjel on 70 inaktiivne, agregeerunud vormis. Nii saab RNA polümeraasi apoensüüm siduda teist faktorit. DnaJ, DnaK ja GrpE moodustavad 32-ga stabiilse kompleksi, eksponeerides teda proteaasidele (membraanseoseline ATP-sõltuv proteaas FtsH e. HflB ning tsütoplasmaatilised ClpAP, SslVU ja Lon). HS tagajärjel on shaperonid hõivatud denatureerunud valkude kõrvaldamisega rakust. Selle tagajärjel vabaneb 32 shaperonidest ning seondub RNA polümeraasi apoensüümiga, olles seal paremini kaitstud ka proteaaside eest. 32 toimub suureneb drastiliselt HS geenide transkriptsioonitase, mis võimaldab kiiresti sünteesida HS valke, k.a. shaperone. Shaperonide toimel 70 reaktiveeritakse ning ta on jällegi võimeline seonduma konkureerivalt RNA polümeraasi apoensüümiga. 70 kogus raku kohta on võrreldes 32 hulgaga märksa kõrgem. Nii faktorite kontsentratsioonide erinevus kui ka shaperonide ülehulk rakus viivad 32 konkurentsist välja.
  • Kirjeldage mehhanisme, mis takistavad laktoosioperoni avaldumist E. coli rakkudes, kui bakterite kasvukeskkonnas on lisaks laktoosile ka glükoosi.
    Kui bakterite kasvukeskkonnas on korraga erinevaid C- allikaid , mille kontsentratsioon on suurem kui 1 mM, kasutatakse esmalt ära need, mis võimaldavad rakkude kiiremat kasvu. Sel juhul on rakus indutseeritud ainult need ensüümid, mis osalevad eelistatud substraadi kasutamisel . Teiste substraatide kasutamisel osalevate ensüümsüsteemide süntees on maha surutud. Sellist regulatoorset mehhanismi nimetatakse kataboliitseks repressiooniks. Bakteril E. coli ja teistel enterobakteritel on kataboliitset repressiooni kirjeldatud glükoosi puhul. Kui kasvukeskkonnas on lisaks glükoosile ka teisi C-allikaid, näiteks laktoosi, kasutab rakk toiduks ainult glükoosi, laktoosi kasutamisel osalevad ensüümid on represseeritud. Kui glükoos on ära kasutatud, järgneb bakterite kasvu aeglustumine, mil nad adapteeruvad teise substraadiga.
    Kataboliitne repressioon bakteris E. coli
    Transkriptsiooni aktivaator CAP (CRP) aktiveerib transkriptsiooni lac operoni (laktoosi metabolism) promootorilt ainult siis, kui ta on seondunud cAMP-ga. cAMP sünteesi eest vastutab adenülaadi tsüklaas (kodeeritud cya lookuse poolt). cAMP tase varieerub rakus vahemikus 1-10 μM. Glükoosi-nälgimisel on cAMP alarmooniks, mis on vajalik lisaks laktoosile paljudel teistel C-allikatel kasvamiseks. cAMP on fosfodiesteraasi poolt kiiresti AMP-ks degradeeritav. Kui bakterite kasvukeskkonnas on glükoosi, on cAMP süntees inhibeeritud.
    Glükoosi-spetsiifiline permeaas EIIGlc koosneb kolmest domäänist IIA, IIB ja IIC. Regulatsiooni seisukohalt on keskse tähtsusega EIIAGlc. EIIAGlc, kui ta on fosforüleerimata (fosforüülrühm on üle kantud glükoosile), seondub ja inhibeerib teiste C-allikate permeaasid (laktoosi, melibioosi, maltoosi permeaasid ning glütserooli kinaasi). Fosforüleeritud vorm ei seondu nende permeaasidega, kuid aktiveerib adenülaadi tsüklaasi ja rakkudes sünteesitakse cAMP-d.
    Glükoosi olemasolul bakterite kasvukeskkonnas on EIIAGlc fosforüleerimata, adenülaadi tsüklaasi ei aktiveerita ning inhibeeritud on ka laktoosi permeaas. Kuna laktoosi permeaas on inaktiivne, ei saa laktoos rakku ning rakus ei saa tekkida laktoosi operoni induktormolekuli allolaktoosi, mis pärsiks repressori seondumise operoni operaatoralale. Sellist kontrollmehhanismi nimetatakse induktori välistamiseks (inducer exclusion). EIIAGlc defosforüleerimist põhjustab glükoos-6- fosfaadi olemasolu rakkudes. Kui EIIAGlc molekulide arv langeb rakus alla 20000, jäävad mõned permeaaside molekulidest mõjutamata ja toovad rakku induktorit – sel viisil toimub induktori välistamise süsteemi kontrolli alt vabanemine . EIIAGlc seondub laktoosi permeaasi ja glütserooli kinaasiga vaid siis, kui, need on seondunud vastavate substraatidega. Sel viisil välditakse EIIAGlc asjatut seondumist alternatiivsete substraatide transporteritega.
  • Lämmastiku fikseerimisel ja lämmastikühendite metabolismis osalevate geenide regulatsioon bakterites.
    Bakteri K. pneumoniae nitrogenaasi kompleks I (dinitrogenaas) on tetrameerne multiensüümkompleks, mis on kodeeritud geenide nifK ja nifD poolt. Rauda ja molübdeeni sisaldav kofaktor FeM-Co on kodeeritud 6 erineva nif geeni (nifQBVNEH) poolt. Dinitrogenaasi reduktaas ( komponent II) on kodeeritud nifH geeni poolt. nif geenide transkriptsiooni reguleerivad geenid nifLA, mis on lämmastiku limitatsioonis aktiveeritavad NtrC poolt. NifA on positiivne transkriptsiooni aktivaator, mis aktiveerib transkriptsiooni 54-sõltuvalt promootorilt. nifL geeni produkt interakteerub NifA-ga, takistades NifA-vahendatud transkriptsiooni aktivatsiooni fikseeritud lämmastiku ( ammoonium või aminohapped) olemasolul.
    Lisaks nif geenidele osalevad lämmastiku fikseerimisel fix geenid. Näiteks fixABCX operon kodeerib ensüüme, mis osalevad elektronide transpordil nitrogenaasi kompleksile. Need geenid on analoogilised K. pneumoniae nifF ja nifLJ geenidele, mis kodeerivad samuti elektronide transpordi süsteemi. fixNOQP geenid kodeerivad membraanseoselist tsütokroomi oksüdaasi, mis osaleb bakterioidi-spetsiifilises hingamisahelas, võimaldades hingamist madalal hapniku kontsentratsioonil. nif ja fix geenide derepressiooniga koordineeritult avaldub dctA (dikarboksülaadi transport), mis kodeerib permeaasi. Permeaas transpordib dikarboksüülhappeid nagu näiteks suktsinaat , malaat ja fumaraat lämmastikku fikseerivatesse bakterioididesse. Need ühendid on energiaallikaks lämmastiku fikseerimisel, kus kulub palju ATP-d. TCA tsükli ensüümid töötavad bakterioidis täie võimsusega. Sel ajal, kui nif, fix ja dct geenid avalduvad, on ammooniumi assimileerimine represseeritud. Tänu sellele saab taimerakk omastada suurema osa fikseeritud lämmastikust.
    nif ja fix geenide regulatsioon Rhizobium’is
    Response regulaatorid, mille aktiivsust kontrollitakse läbi bakterioidi elukeskkonnas oleva hapnikuhulga, vallandavad lämmastiku fikseerimise protsessi kontrolliva signaalse transduktsiooniraja. nif ja fix geenide transkriptsiooni σ54-sõltuvatelt promootoritelt aktiveerib NifA. NifA on hapniku-tundlik valk. Ta sisaldab tsüsteiini motiivi, mis seob rauda ning arvatakse, et Fe-ioonide oksüdatsiooniaste mõjutab valgu konformatsiooni ja aktiivsust. Madalal hapniku kontsentratsioonil toimub NifA autoregulatsioon nifA geeni transkriptsiooni tasemel.
    Valgud FixL ja FixJ moodustavad kahekomponendilise regulaatorsüsteemi, mis aktiveerib märklaud-geenid madala hapniku kontsentratsiooni tingimustes. FixL on hapniku sensoriks. Tegemist on hemoproteiiniga, mis autofosforüleerub tingimustes, kus hapnikku on vähe. Seejärel fosforüleerib FixL efektorvalgu FixJ, mis omakorda aktiveerib nifA geeni transkriptsiooni. Sama valk aktiveerib ka fixK geeni transkriptsiooni. fixK kodeerib osade fix geenide transkriptsiooni aktivaatorit.
    NifA C-terminaalne domeen sisaldab “helix- turn -helix” motiivi, mille abil NifA seondub tema poolt reguleeritavate promootorite transkriptsiooni initsiatsioonisaidist 100 bp ülespoole UAS ( upstream activating sequence) järjestustele. Valgu keskmine domeen vastutab RNA polümeraasiga seondumise ja ATP hüdrolüüsi eest. ATP hüdrolüüsi on vaja transkriptsiooni aktivatsioonil avatud kompleksi moodustumiseks.
    Anorgaaniliste lämmastikühendite metabolism
    Sõltuvalt ammooniumi hulgast domineerivad enterobakteritel erinevad metabolismirajad:
  • Ammooniumi ülehulgas domineerib glutamaadi süntees α-ketoglutaraadist ja ammooniumist glutamaadi dehüdrogenaasi GDH toimel, kasutades NADPH -d. Glutamiini süntetaasi GS toimel sünteesitakse vähesel hulgal ka glutamiini (glutamaat + ammoonium, toimub ATP hüdrolüüs)
  • Ammooniumi madala kontsentratsiooni puhul (rakuväline kontsentratsioon madalam kui 1 mM), siis on ka glutamiini tase madal, on GDH poolt läbiviidava reaktsiooni tasakaal nihutatud, mistõttu glutamaadi sünteesi enam ei toimu (glutamaadi sünteesiks on vaja glutamiini!). Glutamiini rakusisene kontsentratsioon langeb ning selle tulemusena aktiveeritakse seni osaliselt inaktiivne GS. Tõuseb ka GS-i kodeeriva glnA transkriptsioonitase. GS katalüüsib glutamiini sünteesi, glutamiini hulk rakus tõuseb ja sellest sünteesitakse glutamaadi süntaasi GOGAT toimel glutamaati (reaktsioonis osalevad glutamiin, -ketoglutaraat ja NADPH).
  • NtrB/NtrC süsteem ammooniumi assimileerimise regulatsioonis
    Lisaks glutamiini süntetaasi kodeerivale geenile glnA asuvad samas operonis veel geenid glnL ja glnG, mis kodeerivad kahe-komponendilist regulaatorsüsteemi. GlnL on tuntud ka nimetuste all NtrB ja NRII ning GlnG asemel kasutatakse sageli nimetusi NtrC ja NRI. Enamlevinud on siiski nimetused NtrB ja NtrC (tuletatud terminist “nitrogen regulation”).
    Juhul, kui N-allikat on bakterite kasvukeskkonnas piisavalt, toimub transkriptsioon nõrkadelt σ70-sõltuvatelt promootoritelt. Lämmastiku limitatsiooni tingimustes aktiveerib fosforüleeritud NtrC (P-NtrC) transkriptsiooni tugevalt σ54-sõltuvalt promootorilt ja inaktiveerib teistelt promootoritelt.
    NtrC fosforüleeritakse sensorvalgu NtrB poolt. NtrB-l on nii autokinaasi kui ka fosfataasi aktiivsus, mida kontrollib bifunktsionaalne ensüüm PII. Sellel ensüümil on uridüültransferaasi (UT) aktiivsus türosiinile ja uridüülrühma kõrvaldav (UR) aktiivsus. UT aktiivsus on stimuleeritud N-vaeguse korral, kus glutamiini kontsentratsioon on rakus madal ja -ketoglutaraadi kontsentratsioon kõrge. Selle tulemusena tekib PII uridüleeritud vorm UMP-PII, mis stimuleerib NtrB-l kinaasi aktiivsust ja NtrC fosforüleeritakse. Vastupidises olukorras, kus ammooniumi hulk on kõrge (suurem kui 1 mM), domineerib PII puhul UR-aktiivsus. UR-aktiivsusega valk valk interakteerub NtrB-ga, stimuleerides NtrB fosfataasset aktiivsust, mille tulemusena NtrB defosforüleerib NtrC.
    Kokkuvõttvalt: Kõrge ammooniumi kontsentratsiooni puhul on NtrB regulaator PII uridüleerimata, NtrB-l avaldub fosfataasne aktiivsus, NtrC ei ole fosforüleeritud ja glutamiini süntetaasi geeni transkriptsioon toimub madalal tasemel. Kui aga ammooniumi kontsentratsioon on madal, on PII uridüleeritud, NtrB-l avaldub kinaasne aktiivsus, mille tulemusena NtrC fosforüleeritakse ja glnA transkriptsioonitase tõuseb.
    Lisaks glnA transkriptsiooni regulatsioonile toimub glutamiini süntetaasi aktiivsuse kontroll ka valgu kovalentse modifitseerimise kaudu.
    NtrC teised funktsioonid
    Bakteris Klebsiella pneumoniae on nitrogenaasi sünteesi eest vastutavad geenid nifHDK samuti fosforüleeritud NtrC poolt aktiveeritavad. N-limitatsioonis aktiveerib P-NtrC NifA transkriptsiooni ning nifA omakorda nifHDK geenide transkriptsiooni. NtrB/NtrC poolt on kontrollitud ka selliste operonide transkriptsioon nagu näiteks hut operon, mis kodeerib histidiini utiliseerimist ja put operon, mis kodeerib proliini utiliseerimist.
  • Aeroobse ja anaeroobse hingamise regulatsioon E. coli näitel. Millal toimub E. coli metabolismi ümberlülitumine käärimisele?
    Bakterites toimub metaboolse energia genereerimisel elektronide astmeline ülekanne kas:
  • Aeroobne hingamine (oksüdatiivne fosforüleerimine) – kõige efektiivsem energia genereerimise viis. Rakumembraanis töötab elektronide transpordi ahel (hingamisahel), kus terminaalseks elektroniaktseptoriks on molekulaarne hapnik. Elektronide transpordi käigus viiakse läbi tsütoplasm membraani prootoneid H+, mille tulemusena tekib elektrokeemiline gradient (prootonpotentsiaal). Prootonite läbi tsütoplasma membraani tagasipumpamisel sünteesitakse F1F0 ATPaasi abil ATP-d
  • Anaeroobne hingamine – membraanis toimuv elektronide ülekandmise protsess. Kasutab hapnikule alternatiivseid elektronaktseptoreid nagu nitraat , nitrit , fumaraat, dimetüülsulfoksiid ( DMSO ) ja trimetüülamiin N- oksiid ( TMAO )
  • Fermenteerimine e. käärimine – toimub anaeroobsetes tingimustes terminaalsete elektronaktseptorite puudumisel. Energiat genereeritakse substraadi tasemel fosforüleerimisel.
    Energiametabolismiga seotud geene kontrollitakse nelja erineva regulaatorite rühma poolt
    • ArcA /ArcB represseerib peamiselt aeroobse hingamisega ja tsitraaditsükli tööga seotud funktsioone.
    • FnR toimib peamiselt anaeroobsete radade aktivaatorina, kuid represseerib ka mõningaid geene, mis on aktiivsed bakterite aeroobsel kasvul.
    • NarL/NarP/NarX/NarQ on aktiveeritavad anaeroobsetes tingimustes nitraadi ja nitriti poolt. Need regulaatorid stimuleerivad nitraadi reduktaasi geeni transkriptsiooni ning nitraadi ja nitriti metabolismiga seotud geenide transkriptsiooni; teiste terminaalsete reduktaaside geenid on inhibeeritud.
    • FhlA regulon aktiveeritakse anaerobioosis ja formiaadi poolt, represseeritakse aga hapniku ja nitraadi poolt. Aeroobsetes tingimustes formiaati püruvaadist ei teki, kuna vastav ensüüm Pfl (püruvaadi-formiaadi lüaas) ei tööta. Pfl kodeeriva geeni transkriptsiooni aktiveerib Fnr.

    Hapniku ja erinevate lämmastikühendite hulk määrab, milline energiagenereerimise süsteem käivitub:
    Aeroobne hingamine – hapnikurõhk vähemalt 5 millibaari
    Anaeroobne hingamine toimub 1-5 millibaarise hapnikurõhu korral
    Kui hapnikurõhk jääb alla 1 millibaari, lülitub metabolism fermenteerimisele
    Sõltuvalt hapniku kontsentratsioonist on aeroobsel hingamisel aktiivne kas tsütokroom
    o või tsütokroom d oksüdaas:
    1) kõrge hapniku kontsentratsioon – aktiivne on hapniku suhtes madala afiinsusega tsütokroom o oksüdaas (kodeeritud geenide cyoABCDE poolt)
    2) Madal hapniku kontsentratsioon – aktiivne on hapniku suhtes kõrge afiinsusega tsütokroom d oksüdaas (kodeeritud geenide cydAB poolt)
    Vastavate geenide transkriptsiooni reguleerib ArcB/ArcA 2-komponendiline süsteem. Mõlema tsütokroomi geenid on Fnr poolt represseeritavad.
    Muutused geeniekspressioonis – kui energiat genereeritakse ühel viisil, on teiste energia genereerimisviisidega seotud geenid represseeritud.
    1) Erinevate reduktaaside geeniregulatsioon
    Aeroobsetes tingimustes on represseeritud geenid, mis kodeerivad nitraadi reduktaasi, fumaraadi reduktaasi ja teisi reduktaase ning toimub ainult aeroobne hingamine.
    Hapniku puudumisel, kuid nitraadi olemasolul on aktiveeritud ainult nitraadi reduktaasi geen. Samas on teiste lämmastikühendite reduktaaside geenid inaktiivsed – toimub nitraatne hingamine.
    2) Püruvaadi dehüdrogenaasi geeni avaldumise kontroll
    Aeroobsetes tingimustes moodustub püruvaadist püruvaadi dehüdrogenaasi toimel atsetüül-CoA. Anaeroobsetes tingimustes on püruvaadi dehüdrogenaasi geeni avaldumine aga pärsitud ja püruvaadist tekivad püruvaadi-formiaadi lüaasi (Pfl) toimel atsetüül-CoA ja formiaat, millest lähtuvad fermenteerimisrajad.

  • Aeroobse hingamise regulatsioon


    Elektronid kantakse NADH dehüdrogenaasi abil FMN-le, edasi Fe/S rühmale, siis ubikinoonile, sealt tsütokroom o või d oksüdaasile ja lõpuks hapnikule. Elektronid kantakse üle kas NADH-lt või teistelt substraatidelt (laktaat, suktsinaat, formiaat, glütserool 3- fosfaat ) dehüdrogenaaside abil. ETS:
  • heemi sisaldavad komponendid – tsütokroomid
  • Fe/S valgud
  • flavoproteiinid (sisaldavad flaviinmononukleotiidi FMN)
  • kinoonid
    Elektronide transpordi käigus viiakse läbi tsütoplasma membraani prootoneid H+, mille tulemusena tekib elektrokeemiline gradient (prootonpotentsiaal) Prootonite läbi tsütoplasma membraani tagasipumpamisel sünteesitakse F1F0 ATPaasi abil ATP-d
    ATPaasi regulatsioon
    Selleks, et F1 komponent oleks võimeline sünteesima ATP-d, peab ta kompleksseeruma gamma , delta ja epsiloni subühikutega ning kinnituma F0 komponendi külge. Ainult alfa ja beeta subühikutest koosnev F1 komponent hüdrolüüsib ATP-d. Käärimisel vajavad rakud elutegevuseks samuti prootonpotentsiaali energiat. Sel juhul toimub F1F0 ATPaasi manulusel ATP hüdrolüüs ning hüdrolüüsi käigus vallandunud energia abil pumbatakse prootonid rakust välja.
    F1F0 ATPaasi kompleks on kodeeritud atp operoni poolt.
  • ArcA/ArcB represseerib peamiselt aeroobse hingamisega ja tsitraaditsükli tööga seotud funktsioone
    (aerobic respiration control ).
    Kahe-komponendiline Arc süsteem kontrollib mitmete metaboolsete radade tööd:
  • tsitraaditsükkel
  • glüoksülaadi rada
  • terminaalne elektronide transport molekulaarsele hapnikule – aeroobne hingamine
  • rasvhapete degradatsioon
    ArcA võib käituda nii aktivaatorina kui ka repressorina. Näiteks tsütokroom d operon (cydAB) on fosforüleeritud ArcA poolt aktiveeritav, tsütokroom o operon cyoABCDE aga represseeritav. Paljud arc moduloni kuuluvad geenid on ArcA poolt represseeritavad.
    ArcB on sensor-kinaas ja ArcA signaalile vastav (response) regulaator. ArcB autofosforüleerib ennast vastusena stiimulile ja seejärel toimub ArcA fosforüleerimine. Stiimuliks on mingi metaboliidi redutseeritud vorm (näiteks NADH, D-laktaat, atsetaat). Kui stiimul keskkonnast kaob, toimub ArcB ja ArcA defosforüleerimine ArcB poolt
    Püruvaadi metabolismi regulatsioon
    Aeroobsetes tingimustes ja olukorras, kus kataboolse repressiooni mõju on nõrk, suunatakse püruvaat tsitraaditsüklisse.
    Määravaks on siin püruvaadi dehüdrogenaasi ekspressioonitase: Ensüümkompleksi süntees on represseeritud anaerobioosis ja kompleks ise inhibeeritav NADH poolt.
    Anaeroobsetes tingimustes metaboliseeritakse püruvaat peamiselt püruvaadi-formiaadi lüaasi Pfl toimel, mille tulemusena moodustuvad atsetüül-CoA ja formiaat. Juhul, kui puuduvad hapnikule alternatiivsed elektronaktseptorid, metaboliseeritakse need ühendid fermenteerimise käigus lõpp-produktideks.
  • Anaeroobse hingamise regulatsioon
    Anaeroobse hingamise terminaalsed elektronide aktseptorid
    nitraat
    nitrit
    fumaraat
    dimetüülsulfoksiid (DMSO)
    trimetüülamiin N-oksiid (TMAO)
    Nende ühendite koosesinemisel kasutatakse neid samaaegselt, kuid nitraat on võrreldes teistega eelistatud. Fumaraadi, DMSO ja TMAO reduktaasid avalduvad vastavalt substraatide olemasolule ja nende redokspotentsiaalidele. Substraate kasutatakse järjekorras DMSO > TMAO > fumaraat.
    Valiku tegemine anaeroobse hingamise ja käärimisradade töötamise vahel on kontrollitud globaalsete regulaatorite abil. Samuti on reguleeritud ka see, kas domineeriv on anaeroobne nitraatne hingamine või mõni teine anaeroobne hingamisrada.
    Regulatsioon globaalse regulaatori Fnr “fumarate nitrate reduction ” kaudu
    Fnr kontrollib nii fermenteerimise kui ka anaeroobse hingamise radade ekspressiooni. Vastavad geenid ja operonid kuuluvad fnr moduloni ning on aktiveeritavad anaeroobsetes ja represseeritavad aeroobsetes tingimustes. Fnr on aminohappeliselt järjestuselt väga sarnane CRP valgule (v.a. tsüsteiini-rikas järjestus valgu N-terminuses). Mõlema valgu seondumisjärjestused on samuti sarnased
    Fnr tunnetab väliskeskkonna redoks -staatust: [4Fe-4S]2+ klaster võimaldab siduda kaks Fnr subühikut ja selline kompleks seondub DNA-ga. Hapniku toimel moodustuv [2Fe-2S]2+ klaster muudab Fnr-i konformatsiooni nii et see ei ole enam võimeline dimeriseeruma. Fnr-i monomeerid DNA-ga ei seondu
    Dimeriseerub ja seondub DNAle- (vähem O2te,) kui rohkem O2.te siis monomeer ja ei seondu
  • Anaeroobse hingamise kontroll kahe-komponendiliste süsteemide abil vastusena nitraadile ja nitritile
    Enamus geene, mis on seotud anaeroobse hingamisega, vajavad aktivatsiooniks Fnr valku. Juhul, kui elektronide aktseptoriteks on nitraat või nitrit, osalevad regulatsioonis Nar (nitrate reduction) transkriptsiooni regulaatorid. Nar valgud toimivad kahes signaaliülekande rajas:
  • NarX membraanne sensor – NarL tsütoplasmaatiline regulaator
  • NarQ membraanne sensor – NarP tsütoplasmaatiline regulaator.
    Nitraat stimuleerib mõlema sensori autofosforüleerumist. Fosforüleeritud sensorvalgud toimivad kinaasidena NarL-le ja NarP-le. Nitrit seevastu stimuleerib küll NarQ-vahendatud NarP ja NarL fosforüleerimist, kuid samas põhjustab NarL fosfaadi defosforüleerimist NarX poolt. Funktsionaalsete transkriptsiooniregulaatoritena käituvad ainult fosforüleeritud NarL ja NarP. Nitraadi kasutamine on nitriti suhtes eelistatud, kuna nitraat on parem elektronaktseptor. Nitriti kontsentratsioon ei tohi tõusta üle teatava piirväärtuse, kuna nitrit on rakkudele toksiline .
    Nar valgud reguleerivad paljude operonide transkriptsiooni. Näitena on toodud neist 4:
  • fdn operon - kodeerib formiaadi dehüdrogenaas N kompleksi
  • frdABCD operon - kodeerib fumaraadi reduktaasi
  • nap-ccm operon - kodeerib periplasmaatilist nitraadi reduktaasi kompleksi
  • narGHJ operon - kodeerib põhilist nitraadi reduktaasi kompleksi.
    Fosforüleeritud NarL aktiveerib nar (nitraadi reduktaas) ja fdn (formiaadi dehüdrogenaas) transkriptsiooni ning pärsib frd (fumaraadi reduktaas) ja nap (periplasmaatiline nitraadi reduktaas) transkriptsiooni.
    Fosforüleeritud NarP aktiveerib fdn ja nap transkriptsiooni ja surub maha fosforüleeritud NarL negatiivse toime nap-le. Nitraadi reduktaasid vajavad kofaktorina molübdeeni.
    Fosforüleeritud NarL ja NarP represseerivad püruvaadi-formiaadi lüaasi operoni pfl. Kuna püruvaadi-formiaadi lüaasi reaktsioonist lähtuvad mitmed erinevad fermenteerimise rajad, on Nar valkude vahendatud repressioon nitraadi olemasolu korral väga efektiivne mehhanism, vähendamaks nitraatse hingamise korral fermenteerimise üldist taset rakus.
    Fumaraadi, DMSO ja TMAO reduktaasid avalduvad vastavalt substraatide olemasolule ja nende redokspotentsiaalidele. Substraate kasutatakse järjekorras DMSO > TMAO > fumaraat.
  • Oksüdatiivseid kahjustusi ärahoidvad ja kõrvaldavad süsteemid bakterirakus.
  • Mehhanismid , mis kaitsevad rakku oksüdatiivsete kahjustuste eest
    Aeroobse hingamise käigus tekivad rakus reaktiivsed hapniku vormid ROS (reactive oxygen species ).
    ROS mitteensümaatiline kahjutustamine toimub glutatiooni toimel. O2- , OH ja H2O2 redutseerimisel glutatiooni abil tekib H2O. Glutatiooni rakusisene kontsentratsioon on kõrge (kuni 10 mM).
    VAATA MARKUSE ARVUTIST SEDA KOHTA
    ROS ensümaatiline kahjutustamine
    Põhiline reaktiivse hapniku detoksifitseerimine toimub ensümaatilisel teel.
    1)O2- konverteeritakse superoksiidi dismutaasi (SOD) abil vesinikperoksiidiks, mis on vähem toksiline.
    2) Katalaasi reaktsiooni tulemusena moodustuvad H2O2-st vesi ja hapnik: H2O2  2 H2O + O2
    Hüdroksüülradikaali OH kõrvaldamiseks ei ole spetsiifilist ensüümsüsteemi välja kujunenud, kuna see ühend on keemiliselt liiga reaktiivne. Hüdroksüülradikaalid moodustuvad siis, kui vesinikperoksiid reageerib Fe2+-ga (H2O2 + Fe2+  OH + Fe3+ (Fentoni reaktsioon )). Fe2+ on enamasti seotud valkudega, asudes nende aktiivtsentris – OH märklauaks on ensüümi aktiivtsentris asuvad aminohapped.
    Alkoholi dehüdrogenaas on hapnikutundlik, kuna sisaldab Fe2+.
    Neil oksüdoreduktaasidel, mida vajatakse nii aeroobsetes kui ka anaeroobsetes tingimustes, on Fe2+ asemel aktiivtsentris Zn2+.
    Superoksiidi dismutaasid on esindatud peaaegu kõigis aeroobsetes bakterites. Leitud on nii Fe3+ kui ka Mn3+ seoselisi ensüüme. Bakteris E. coli on olemas mõlemad SOD-id. Fe- seoseline SOD ekspresseerub nii aeroobsetes kui ka anaeroobsetes tingimustes, Mn-seoseline (SodA) on aga indutseeritud ainult rakkude aeroobse kasvu korral.
    Katalaasid on esindatud nii aeroobsetes kui ka fakultatiivselt anaeroobsetes bakterites. Bakteris E. coli asuvad reaktiivse hapniku kahjutustamisel osalevaid ensüüme kodeerivad geenid kahes oksüdatiivse stressi modulonis, mida kontrollivad SoxS ja OxyR .
  • SoxS modulon
    soxSR geenid on vastassuunaliselt transkribeeritavad. SoxR on FeS-sisaldav valk, mis kontrollib SoxS geeni transkriptsiooni. SoxR aktiveerub vastusena signaalile, milleks on kas O2- või NO. Seejärel aktiveerib SoxR globaalse transkriptsiooniregulaatori SoxS, mis kontrollib ligikaudu 40 geeni transkriptsiooni. Enamus neid geene kodeerivad valke, mis kaitsevad rakku oksüdatiivse stressi puhul ja peaaegu kõik neist on SoxS poolt positiivselt reguleeritavad . SoxS moduloni kuulub ka SodA – Mn-seoseline superoksiidi dismutaas, millest oli juttu eelpool. SodA-d kodeeriva operoni transkriptsioon on tegelikult väga kompleksselt reguleeritud – praeguseks on kirjeldatud vähemalt 6 regulaatorit.
  • OxyR modulon
    Globaalne transkriptsiooniregulaator OxyR on otseselt aktiveeritav vesinikperoksiidi poolt (kahe tsüsteiini vahel moodustub disulfiidsild). OxyR kontrollib positiivselt vähemalt 30 geeni transkriptsiooni. Need geenid kodeerivad valke, mis osalevad raku antioksüdantsetes kaitsemehhanismides ja tagavad resistentsuse paljudele antibiootikumidele (Mar valgud – multiple antibiotic resistance). OxyR kontrolli all on näiteks HPI katalaas (katG geeni produkt). oxyS kodeerib väikest mittetransleeritavat RNA molekuli, mis on samuti OxyR poolt aktiveeritav ning vajalik raku kaitsmisel oksüdatiivse stressi poolt põhjustatud kahjustuste vastu. oxyS RNA reguleerib translatsiooni, seondudes mitmete geenide mRNA-ga (kaasaarvatud rpoS mRNA).
    Teised kaitsemehhanisme ROS vastu
    ROS toimel tekib rakkudes nii DNA kui ka valkude kahjustusi, seda nii kasvavates kui ka statsionaarse faasi rakkudes. Lisaks ROS ensümaatilisele kõrvaldamisele on rakkudel ka teisi kaitsemehhanisme.
  • DNA kahjustused on seotud peamiselt hüdroksüülradikaalide toimega, mida stimuleerib Fe2+. Dps, mis seondub statsionaarses faasis DNA-ga, kaitseb DNA-d Fe-ioonide eest. Lisaks on mitmeid DNA reparatsioonisüsteeme, mis kõrvaldavad DNA-st hapnikukahjustusi (sellest täpsemalt hiljem).
  • Stressivalgu UspA üleproduktsioon surub alla Fe rakku transportimisega seotud geenide cirA, fepA ja pbuA ekspressiooni, vähendades sel viisil hüdroksüülradikaalide tekkevõimalust.
  • Enamus superoksiidi anioone genereeritakse NADH dehüdrogenaasi ja ubikinooni saitides aeroobsel hingamisel. Paljud tsitraaditsükli ensüümid on hapniku-tundlikud ja kontrollivad tagasisidestuslikult hingamist. Kui elektronide transport toimub aeroobsel hingamisel liiga aktiivselt, suureneb ROS produktsioon ning tsitraaditsükli ensüümide aktiivsus langeb. Selle tulemusena muutub NADH (põhiline elektronide doonor hingamisahelale) limiteerivaks ning aeroobse hingamine tase langeb.
  • DnaK on molekulaarne shaperon, mis hoiab kuumashoki sigma faktorit inaktiivsena. DnaK on tundlik oksüdatiivsele karbonüülimisele. Kui DnaK on kahjustatud, see sigma faktor vabaneb ning seondub RNA polümeraasiga, indutseerides kuumashoki geenide transkriptsiooni tugevatelt promootoritelt. Kuumashoki valgud (enamus neist on molekulaarsed shaperonid) on vajalikud kahjustatud valkude aktiivsesse konformatsiooni viimisel või kõrvaldamisel.
  • Millal on bakterirakud stressis ? Stressivastuste kattuvus bakterirakus. Milline funktsioon on universaalsetel stressivalkudel?
    Alati, kui bakterite paljunemine on takistatud kas toitainete nappuse või ebasobivate keskkonna füüsikalis-keemiliste parameetrite tõttu (kõrvalekalded optimaalsest temperatuurist, pH-st, osmolaarsusest, hapnikuga varustatusest, jne.), tekitab see neile stressi.
    Stressina toimivad kõik keskkonnamuutused, mille tulemusena bakterite kasvukiirus aeglustub. Stressi põhjustavad faktorid kutsuvad esile muutusi rakkude füsioloogilises seisundis. Rakkude füsioloogiline seisund kajastub nendes toimuva makromolekulide biosünteesi kiiruses ja rakkude suuruses. Näiteks, kui toitaineid on kasvukeskkonnas rikkalikult, toimub rakkudes aktiivne valgusüntees. Sellised rakud on suuremad, nad sisaldavad rohkem ribosoome ning neis toimub ka aktiivne DNA replikatsioon ja transkriptsioon. Mida rikkalikumalt on keskkonnas rakkudele kasvuks vajalikke komponente, seda vähem kulub energiat nende ühendite de novo sünteesiks ning seda efektiivsemalt saavad rakud paljuneda.
    Enamasti on bakterite kasvuks vajalike toitainete hulk limiteeritud. Seega on kõige raskem defineerida olukorda, kus bakterid ei ole stressis. Pigem on suvalistel kasvutingimustel rakkudele mingit stressi põhjustav toime ja rakud adapteeruvad antud tingimustega. Lisaks näljastressile on palju teisi stressi põhjustavaid olukordi :
  • Kuumashokk - valgud denatureeruvad.
  • Külmashokk - väheneb membraanide voolavus . Madalal temperatuuril stabiliseeruvad DNA ja RNA sekundaarstruktuurid, vähendades translatsiooni, transkriptsiooni ja DNA replikatsiooni toimumise efektiivsust .
  • Oksüdatiivne stress - rakus tõuseb superoksiidi anioonide, hüdroksüülradikaalide ja vesinikperoksiidi hulk, millega kaasnevad kahjustused valkudes ja nukleiinhappes.
  • Aeroobse/anaeroobse kasvukeskkonna vaheldumine - fakultatiivsetel anaeroobidel on erinevad mehhanismid energia genereerimiseks sõltuvalt sellest, mis on terminaarseks elektronaktseptoriks.
  • Osmootne stress - käivituvad mehhanismid, kus rakk püüab säilitada normaalset siserõhku, turgorit. Äärmuslikes tingimustes aga raku tsütoplasma kas dehüdreerub (hüpertooniline keskkond) või rakud ei suuda piisavalt vett välja viia ja lõhkevad (hüpotooniline keskkond).
  • Keskkonna pH muutustest põhjustatud stress - muutused makromolekulide struktuuris ja biokeemiliste reaktsioonide toimumises. Happestressiga puutuvad kokku näiteks patogeenid .
  • Na+ ioonide kõrge kontsentratsioon.
  • DNA kahjustused - rakus indutseeritakse SOS vastus, käivitub DNA reparatsioon (rekombinatsiooniline reparatsioon), SOS mutagenees ning alternatiivne DNA replikatsioon.
    Üldise stressivastusega kaasnevad muutused raku füsioloogias ja morfoloogias, mis suurendavad raku resistentsust erinevatele stressidele. Pigem kaitseb rakku kahjustuste eest kui kõrvaldab tekkinud kahjustusi. Üldise stressivastuse kutsuvad esile näiteks rakkude nälgimine (mille tulemusena rakkude kasv peatub ja nad püsivad statsionaarses kasvufaasis), kõrge osmolaarsus, kõrge või madal temperatuur ja keskkonna happesus.
    Paljud valgud, mis erinevate stresside toimel indutseeritakse, kattuvad. Seetõttu ongi rakud ühe stressi puhul taluvamad ka teiste stresside osas. Näiteks temperatuuri tõstmine 57 C-ni on rakkudele letaalne . Kui rakke on eelnevalt 2 tundi näljutatud, jääb neis 57 C juures 7 minuti vältel hoidmisel 40% ellu, 4 tunnise näljutamise tagajärjel aga isegi 85%. Kui rakkude hoidmine 20 tunni vältel pH 5 juures on neile samuti letaalne, siis eelnevalt 3 tundi näljutatud rakkudest jääb ellu 40%.
    Üldise stressivastuse käigus on indutseeritud paljud “heat shock” valgud, millest osa on molekulaarsed shaperonid. Molekulaarsed shaperonid osalevad valkude pakkimisel, makromolekulide assambleerimisel ning valkude transpordil ja translokatsioonil läbi membraani. Olles oma funktsiooni täitnud, vabanevad nad lõpproduktilt ilma seda eelnevalt keemiliselt muutmata.
  • Kuidas on kontrollitud kuumashoki geenide avaldumine bakteris E. coli’s?
    Kuumashoki valgud HSP-d (heat shock proteins) ekspresseeruvad basaalsel tasemel ka normaalsel temperatuuril. Enamus HSP-sid molekulaarsed shaperonid ja ATP-sõltuvad proteaasid (Lon, ClpAP), mis osalevad valkude voltimisel, assambleerimisel, transpordil, reparatsioonil ja degradatsioonil.
    Hsp70 perekond - siia kuulub DnaK, mis toimib koos GrpE ja DnaJ-ga ning on eeskätt stabiliseeriva funktsiooniga.
    Hsp60 perekond - siia kuulub GroEL kompleks, mis on tõeline shaperon, organiseerides valkude voltimist aktiivsesse konformatsiooni.
    E. coli rakkudes on kuumashoki vastus kontrollitud 2 alternatiivse sigma faktori - σ32 ja σE poolt. σ32 poolt kontrollitavad geenid aktiveeruvad temperatuuri tõstmisel 37C-lt 42C-ni. Lisaks temperatuuritõusule võivad signaaliks olla ka pH ja osmootse rõhu muutused, UV kiirgus, etanool, antibiootikumid , raskemetallid, DNA-d kahjustavad ained ja komplekssed metaboolsed protsessid (nälgimine, oksüdatiivne stress ning viirusinfektsioon).

  • Transkriptsioon “heat shock” promootoritelt


    HS geenide transkriptsiooni aktivatsiooniks on vaja alternatiivset σ faktorit σ32. σ32 poolt kontrollitavad promootorid erinevad järjestuselt σ70-tüüpi promootoritest.
    σ 32 geeni rpoH mRNA toimib termosensorina
    σ 32 rakusisene hulk on reguleeritud peamiselt transkriptsioonijärgselt. Regulatsioon toimub nii translatsiooni efektiivsuse, mRNA stabiilsuse kui ka valgu stabiilsuse kaudu. σ32 geeni rpoH mRNA 5’ otsas on järjestus, mille baasil moodustub sekundaarstruktuur, mis blokeerib osaliselt translatsiooni initsiatsiooni regiooni. Selle sekundaarstruktuuri püsivus rakus sõltub temperatuurist. Kõrgemal temperatuuril sekundaarstruktuur laguneb, muutes mRNA on ribosoomidele kättesaadavaks. Seega toimib rpoH mRNA termosensor.
    σ32 geenil rpoH on mitu promootorit. Promootorid P1, P4 ja P5 on transkribeeritavad normaalsel temperatuuril, P3 HS vastusena (σE kontrolli all) ja P5 on reguleeritud cAMP poolt. Promootorite P4 ja P3 ees on DnaA boxid.
    σ70 on RNA polümeraasi subühikutest temperatuurile kõige tundlikum. Temperatuuritõusu tagajärjel on σ70 inaktiivne, agregeerunud vormis. Nii saab RNA polümeraasi apoensüüm siduda teist σ faktorit. DnaJ, DnaK ja GrpE moodustavad σ32-ga stabiilse kompleksi, eksponeerides teda proteaasidele (membraanseoseline ATP-sõltuv proteaas FtsH e. HflB ning tsütoplasmaatilised ClpAP, SslVU ja Lon). HS tagajärjel on shaperonid hõivatud denatureerunud valkude kõrvaldamisega rakust. Selle tagajärjel vabaneb σ32 shaperonidest ning seondub RNA polümeraasi apoensüümiga, olles seal paremini kaitstud ka proteaaside eest. σ32 toimub suureneb drastiliselt HS geenide transkriptsioonitase, mis võimaldab kiiresti sünteesida HS valke, k.a. shaperone. Shaperonide toimel σ70 reaktiveeritakse ning ta on jällegi võimeline seonduma konkureerivalt RNA polümeraasi apoensüümiga. σ70 kogus raku kohta on võrreldes σ32 hulgaga märksa kõrgem. Nii σ faktorite kontsentratsioonide erinevus kui ka shaperonide ülehulk rakus viivad σ32 konkurentsist välja.
  • Millised regulatoorsed ümberkorraldused toimuvad bakteris E. coli väliskeskkonna temperatuuri langusel alla 15C?
    Külmashoki (CS) puhul väheneb rakumembraanide läbilaskvus. Sellest ülesaamiseks asendatakse membraanis olevad lahustumatud rasvhapped lahustuvatega. CS vastuse indutseerivad ka valgusünteesi inhibiitorid kloroamfenikool ja tetratsükliin, mis näitab, et peamiseks CS sensoriks rakkudes on ribosoomide füsioloogiline seisund. CS vastuse funktsiooniks on ületada translatsiooni initsiatsiooni blokk .
    Rakkude külmaga adapteerumiseks sünteesitakse mitmeid valke. Neist osade valkude ekspressioon on 37C juures praktiliselt tuvastamatu või äärmiselt madal. Neid valke liigitatakse klass I CS valkudeks. Klass II CS valgud on need, mis ekspresseeruvad olulisel määral ka 37C juures ning temperatuurilanguse korral indutseeritakse neid vähem kui 10 korda.
  • Klassi I kuuluvad valgud – CspA, CspB, CspG, CsdA, RbfA, NusA ja PNPaas. CspA, CspB ja CspG on RNA/DNA shaperonid, CsdA on ribosoomiga assotsieerunud valk, millel on RNA sekundaarstruktuure lahtikeerav aktiivsus. RbfA on ribosoomiga seonduv valk. NusA osaleb transkriptsiooni terminatsioonil ja antiterminatsioonil. PNPaas on ribonukleaas.
  • Klassi II kuuluvad valgud – RecA, translatsiooni initsiatsioonifaktor IF-2, H-NS, DNA güraas GyrA.
    CS-spetsiifilisi σ faktoreid pole leitud. CS vastusega kaasnevad regulatoorsed muutused toimuvad transkriptsiooni aktivatsiooni järgselt. CS valkude induktsioonitase sõltub temperatuurilanguse ulatusest. Hiljuti leiti veel valk TF (trigger factor), mille madalal tasemel süntees indutseeritakse vastusena külma-shokile pärast 2 – 3- tunnist lag perioodi. TF katalüüsib peptiidsidemete cis/trans isomerisatsiooni, mis aitab valke säilitada ja repareerida madalal temperatuuril. Külmakahjustustega valke volditakse uuesti. TF soodustab GroEL-ga assotsieerudes GroEL shaperoni funktioone.
    Põhiline CS valk E. coli’s on CspA. CspA funktsioon on komplementeeritav tema homoloogide CspB ja CspG poolt. 10C juures moodustab CspA 13% kogu raku valgust. csp geenidel on 5’ otsas konserveerunud 159 bp-pikkune mittetransleeritav järjestus UTR. See regioon sisaldab unikaalset 11 bp pikkust “külmaboksi” (CB, cold box), mis on kõrgelt konserveerunud kõigil CS geenidel. Normaalsel temperatuuril transkriptsioon CB järjestusel peatub, kuid temperatuurilangusel liigub RNA polümeraas sellelt järjestuselt edasi. Mis mehhanismi abil, on seni veel selgusetu. csp geenide UTR järjestus mõjutab ka mRNA eluiga. 37C juures kasvanud rakkudes on 5’-UTR järjestusega mRNA väga ebastabiilne (poolestusaeg 12 sekundit), kuna ta on atakeeritav RNaas E poolt. 10C juures on sellel järjestusel aga mRNA-d stabiliseeriv funktsioon. Stabiliseeriv efekt on ajutine ja kaob, kui rakud on külmaga adapteerunud.
    CS valkude ekspressiooni regulatsioon toimub ka translatsiooni tasemel. cspA, cspB, cspG, csdA ja rbfA mRNA-del asub 14 nukleotiidi translatsiooni initsiaatorkoodonist allpool DB-järjestus (downstream box), mis on komplementaarne 16S rRNA regiooniga. Temperatuuri langemisel alla 15C on translatsiooni initsiatsioon häiritud. DB järjestuse paardumine 16S rRNA järjestusega võimaldab translatsiooni preinitsiatsioonikompleksi moodustumist madalal temperatuuril. Pärast aklimatiseerumise perioodi on ribosoomid võimelised transleerima ka teisi mRNA-sid. Selleks ajaks on rakus sünteesitud piisaval hulgal CS-spetsiifilisi ribosoomi faktoreid RbfA (30S ribosoomi subühikuga assotsieerunud valk) ja CsdA (DEAD-box perekonna helikaas ).
    CspA aktiveerib transkriptsiooni H-NS-i ja güraas-i geenide promootoritelt, seondudes järjestusele ATTGG. Samuti interakteerub CspA RNA-ga ning harutab lahti mRNA-de sekundaarstruktuure, muutes nende transleeritavust. Seetõttu nimetatakse CspA-d ka RNA shaperoniks.
  • Millised protsessid käivituvad bakterirakus väliskeskkonna osmootse rõhu tõusu korral?
    Kui raku väliskeskkonna osmootne rõhk tõuseb, peab turgori säilimiseks tõusma ka tsütoplasma osmootne rõhk. Kui osmootne rõhk rakus suureneks ainult soolade kontsentratsiooni tõusu arvel, inhibeeriks see ensüümid. Selleks, et ensüümid ei inaktiveeruks, kuid turgor rakus siiski püsiks, sünteesitakse rakkudes osmolüüte - betaiini, ektoiini, trehhaloosi, glütserooli, sahharoosi, proliini ja väikeseid peptiide. Need ühendid on lahustuvad kõrgel kontsentratsioonil, keemiliselt neutraalsed, ei mõjuta ensüümide aktiivsust vaid pigem stabiliseerivad ensüüme denatureerivate soolade suhtes ning tagavad rakus kõrge osmootse rõhu. Osmolüüte on rakkudel võimalik hankida ka kasvukeskkonnast. Kui osmolüütide kontsentratsioon rakus on kõrgem kui väliskeskkonnas, võimaldab see vee liikumist rakku. Selleks, et rakud ei lõhkeks hüpotoonilises keskkonnas ega dehüdreeruks hüpertoonilises keskkonnas (et säiliks turgor ning oleks vajalikul hulgal vett tsütoplasmas) on bakteritel kaitsemehhanismid , mis tagavad rakus optimaalse osmootse rõhu osmolüütide akumuleerumise või rakust väljaviimise teel.
    Osmolüüdid kaitsevad rakke lisaks dehüdreerimisele ka muude stresside eest. Näiteks suureneb glütsiin-betaiini akumuleerumise tulemusena bakterite külmatolerantsus. Osmolüüdid stabiliseerivad valke ja soodustavad valkude voltimist aktiivsesse konformatsiooni. Seetõttu on nad rakendatavad biotehnoloogias kui ensüümide stabilisaatorid, vähendamaks kuumutamise, külmutamise ja kuivatamisprotsesside kahjulikku mõju.
    Osmootse stressiga kaasnevad ulatuslikud muutused raku üldises metabolismis. Rakkude kasv on ajutiselt inhibeeritud. Toimuvad muutused DNA topoloogias ning aktiveerub statsionaarse faasi-spetsiifiline sigma faktor σS. Rakkudesse koguneb ppGpp. Metaboolsete radade ümberlülituste käigus koguneb rakkudesse toksilisi produkte, mis indutseerivad kaitsemehhanismide käivitumist (DNA reparatsioon, peroksiidi kõrvaldamine).
    Kui E. coli kasvukeskkonna osmolaarsus tõuseb, liigub vesi aquaporiinide kaudu rakust välja ning turgor langeb. Selle tulemusena aktiveeritakse TrkAEH kaaliumi rakkutoomise süsteem. Süsteem töötab seni, kuni turgor on taastatud. Kui sellest ei piisa ning turgori vähenemisest põhjustatud stress kestab, aktiveeritakse Kdp transportsüsteem, mis on K suhtes kõrge afiinsusega. K-limitatsiooni korral on kdp geenid pidevalt ativeeritud.
    Samaaegselt sünteesitakse (või transporditakse väliskeskkonnast) proportsionaalses hulgas rakku toodava K hulgaga glutamaati. Väliskeskkonna kõrge osmootse rõhu korral võib sel viisil K-glutamaadi tase tõusta ajutiselt kuni 0,7-0,8 M kontsentratsioonini, mis pärsib ensüümide aktiivsuse. Seetõttu lülitatakse kiiresti tööle süsteemid, mis võimaldavad betaiini, proliini ja trehhaloosi akumuleerumist rakkudesse. Aktiveeruvad nii vastavate ühendite sünteesirajad kui ka rakku transportimise süsteemid. Samal ajal väheneb proportsionaalselt K ja K-glutamaadi rakusisene kontsentratsioon.
    Raku väliskeskkonna osmootse rõhu muutustega kaasnevad muutused OmpC ja OmpF ekspressioonitasemes. Väliskeskkonna madala osmolaarsuse korral on ülekaalus OmpF poorid , kõrge osmolaarsuse korral aga OmpC poorid. OmpC baasil moodustunud kanal on väiksem kui OmpF kanal. Looduslikes tingimustes, kus keskkonna temperatuur ja osmolaarsus on madalamad (jõed, järved), on eelistatud suuremad, OmpF kanalid. Ühe poriini eelistamine teisele ei muuda rakusisest osmootset rõhku. Arvatakse, et poori suurus võib mõjutada toitainete ja muude komponentide difusiooni väliskeskkonnast läbi membraani. Seega – suuremad poorid lasevad läbi välismembraani sisse rohkem toitaineid.
    Üldjuhul on osmoprotektantide kontsentratsioon väliskeskkonnas madal (nM – μM kontsentratsioonid). Molaarse kontsentratsiooni saavutamiseks on vaja kõrge afiinsusega transportereid. Sellised transporterid peavad olema võimelised töötama tingimustes, mis tavalised transporterid inaktiveerib (kõrge osmolaarsus ja ioonide kontsentratsioon).
  • Bakterite kohanemine väliskeskkonna pH muutustega.
    Vastavalt kasvukeskkonna pH-le klassifitseeritakse baktereid atsidofiilideks (optimaalne pH neutrofiilideks (optimaalne pH on 6-7) ja alkalofiilideks (pH optimum 8-9). Ekstreemsetes tingimustes kasvavates bakterirakkudes toimivad mehhanismid, mis hoiavad nende tsütoplasmaatilise pH (pHi) neutraalse ning säilitavad ekskreteeritud ja rakupinnale eksponeeritud valkude aktiivsuse.
    Võimet hoida tsütoplasmaatilist pH-d (pHi) konstantsena sõltumata väliskeskkonna pH (pH0) kõikumisest nimetatakse pH homöostaasiks. E. coli kasvab maksimaalse kiirusega väliskeskkonna pH 6,0-8,0 piires, väljaspool seda vahemikku rakkude kasv aeglustub. Väliskeskkonna pH 5,0-9,0 juures püsib raku sisemine pH 7,4-7,8 vahel, muutudes seega vähem kui 0,1 ühikut väliskeskkonna pH ühe ühiku võrra muutuse kohta. Kui väliskeskkonna pH muutused on ulatuslikumad, põhjustab see tsütoplasma pH-s suuremaid muutusi. Tsütoplasma pH väärtuse langemine alla 5,0 on E. coli rakkudele letaalne. Seetõttu lülituvad äärmuslikes tingimustes tööle spetsiifilised kaitsemehhanismid. Rakusisene pH homöostaas saavutatakse passiivsete ja aktiivsete mehhanismide toimimise kooskõlana.
  • Passiivne homöostaas
    Väliskeskkonna pH muutustest põhjustatud pHi kõikumisi takistab prootonite ja teiste ioonide vilets membraaniläbimise võime. Lisaks on rakkudel on loomulik puhverdamisvõime, mis on tagatud nukleiinhapete, tsütoplasmaatiliste valkude ning tsütoplasmas sisalduva glutamaadi ja polüamiinide poolt. Madalate pH väärtuste juures on kõige paremaks puhverdajaks glutamaat.
  • Aktiivne homöostaas
    Aktiivne homöostaas saavutatakse ioonide – prootonite, kaaliumi- ja naatriumiioonide ringlemisega. Na+ ioonide translokatsioon on oluline komponent homöostaasi säilitamisel alkalofiilidel (Na+/H+ antiport süsteem soodustab aluselises keskkonnas prootonite rakku sisenemist). Prootonite translokatsioon läbi membraani genereerib membraanpotentsiaali, mis seab prootonite edasisele liikmisele läbi membraani piirangud. Membraanpotentsiaali genereerimiseks piisab juba vähese arvu prootonite translokatsioonist läbi membraani. Prootonite rakust väljaviimine jätkub siis, kui nad vahepeal uuesti energiat muundavate valk-komplekside (näiteks ATP süntaaside ja transportvalkude) abil rakku sisenevad. Ulatuslikum prootonite liikumine läbi membraani toimub juhul, kui membraanpotentsiaal on ajutiselt katioonide (näiteks K+ ioonide) rakku sisenemise tulemusena muutunud.
    Muutused tsütoplasma pH-s indutseerivad teatud geenide avaldumise. Need geenid on seotud madalast pH-st põhjustatud metaboolsete defektide korrigeerimisega ja kaitsefunktsioonidega, mis võimaldavad rakkudel madala pH tingimustes ellu jääda. Madala pH korral derepresseeritakse näiteks aminohapete dekarboksülaasid. Tänu nendele ensüümidele tekivad rakkudes ühendid, mille rakust väljaviimine aitab keskkonda neutraliseerida. Näiteks lüsiini dekarboksülaas (kodeeritud cadA geeni poolt) degradeerib lüsiini ja selle tulemusena moodustub aluseline kadaveriin . Kadaveriin transporditakse kadaveriini transporteri CadB abil rakust välja. Lisaks happelisele keskkonnale aktiveerib cadBA geenide transkriptsiooni lüsiini olemasolu keskkonnas ja anaerobioos. Geenide ekspressioonitase on maksimaalne nende kolme komponendi koosesinemisel. Vastusena happelisele keskkonnale indutseeritakse veel arginiini dekarboksülaas Adi ja ornitiini dekarboksülaas SpeF. Nende ensüümide toimel tekivad aluselised ühendid agmatiin ja putrestsiin, mis transporditakse samuti väliskeskkonda.
    Aluselise pH korral ekspresseeruvad deaminaasid, mida on vaja ammooniumi genereerimiseks. Ensüümreaktsioonide kaasproduktina tekivad nõrgad happed , mis langetavad rakust väljaviidutena väliskeskkonna pH-d.
    pH muutused kutsuvad esile ka muutusi rakkude käitumises. Happelise keskkonna korral ilmneb rakkudel negatiivne kemotaksis – rakud eemalduvad ebasoodsast keskkonnast. Sel juhul ei ole tegemist muutustega geeniekspressioonis, vaid kemoretseptoritele saabunud signaalide alusel muutub viburite pöörlemissuund.
  • Kuidas mõjutab bakteri kromosoomis asuvate geenide transkriptsioonitaset kromosomaalse DNA replikatsioon?
    Transkriptsioon ja replikatsioon ei ole bakterirakus ajaliselt lahutatud. Eriti tihedalt on need protsessid seotud kiiresti kasvavates bakterirakkudes, kus korraga töötavad 6 või rohkem replikatsioonikahvlit. Replikatsiooni kiirus on transkriptsiooni kiirusest ligikaudu 20 korda suurem. Seega peaksid RNA-d ja DNA-d sünteesivad ensüümkompleksid omavahel kokku põrkuma. Eelistatult toimuvad replikatsioon ja transkriptsioon samasuunaliselt . Kui replikatsioonikahvel jõuab järele RNA polümeraasile, pühib ta selle teelt ning liigub edasi. Promootorilt toimub uus transkriptsiooni initsiatsioon. Kui replikatsioon ja transkriptsioon toimuvad vastassuunaliselt, on replikatsioonikahvli liikumine tugevasti pidurdatud ning ka sel juhul toimub RNA polümeraasi kõrvaldamine DNA ahelalt. Lisaks, kui replikatsioon ja transkriptsioon toimuvad vastassuunaliselet ning replikatsioon toimub operoni lõpust promootori suunas, on transkriptsioon inhibeeritud kogu selle aja vältel, mis kulub operoni replitseerumiseks. Seega on geenide avaldumise seisukohalt väga oluline, kas neid transkribeeritakse replikatsioonikahvli liikumisega samas suunas või sellele vastu. > 90% geenidest paiknevadki E. coli kromosoomis nii, et nende transkriptsioonisuund ühtib replikatsioonisuunaga. Eriti kehtib see geenide kohta, mille avaldumine on oluline rakkude kiire kasvu korral. Geenid, mille transkriptsioon toimub harva või neid transkribeeritakse kehvades kasvutingimustes, on kromosoomis juhuslikult orienteeritud.
  • Milliste mehhanismide abil jätkub DNA replikatsioon siis, kui DNA replikatsiooni elongatsioonikompleksi töö on pärsitud DNA kahjustuse tõttu?
    Iga replikatsiooni initsiatsiooni korral oriC -lt on aeroobsetes tingimustes kasvavate rakkude puhul 10-45%-line tõenäosus, et üks või mõlemad replikatsioonikahvlitest peatuvad DNA kahjustuste tõttu, mida pole jõutud parandada ning vajavad replikatsiooni jätkumiseks rekombinatsioonilist DNA reparatsiooni.
    DNA replikatsioonikahvel peatub, kui DNA ahelas on kas DNA kahjustus, üksikahelaline või kaksikahelaline katke . Toimub rekombinatsiooniline reparatsioon RecF, RecO ja RecR osalusel. RecA soodustab DNA ahelate ülekannet, aitab neil paarduda ning osaleb DNA ahelate hargnemiskoha migratsioonil.
    Juhul, kui DNA-s on tekkinud kaksikahelaline katke, on lisaks RecA valgule vajalik RecBCD osalemine. RecBCD kompleksil on helikaasne aktiivsus, mis ilmneb dsDNA katke korral. Helikaasse aktiivsusega kaasneb ka eksonukleaasne aktiivsus, mis avaldub seni, kuni kompleks jõuab Chi saidini (asümeetriline 8-nukleotiidne järjestus) ning seal toimib RecBCD endonukleaasina. Chi sait inaktiveerib RecBCD eksonukleaasse aktiivsuse ning edasi käitub RecBCD kompleks ainult kui helikaas. RecA valgu abil moodustub dupleks homoloogilise alaga. Tekib “Holliday” struktuur kus DNA ahelad on risti. Kuna “Holliday” riststruktuur liigub helikaaside RuvA ja RuvB toimel edasi, võivad moodustuda dupleksid uuesti sünteesitud DNA ahelate vahel, mis ei ole veel metüleeritud. Sellistes regioonides on rohkem mutatsioone , kuna metülatsioonist sõltuv DNA “mismatch” reparatsioon ei toimi. “Holliday” struktuuri lahutab hiljem RuvC ning replikatsioonikahvel saab edasi liikuda .
    NHEJ – nonhomologous end joining
    Kui bakterirakus on vaid üks kromosoomikoopia, ei saa kaksikahelalisi katkeid HR teel parandada.
    SOS mutageneesi tulemusena DNA ahelast vigu ei kõrvaldata, vaid jätkatakse vigaderohket DNA replikatsiooni. Vigaderohkel DNA replikatsioonil osaleb UmuD2’C kompleks. Kui replikatsioon peatub vigase nukleotiidi juures, lülitatakse sünteesitavasse ahelasse juhuslik nukleotiid ja replikatsioon saab jätkuda. SOS vastuse käigus indutseeritakse E. coli rakkudes DNA polümeraasid Pol II, Pol IV ja Pol V. Pol IV ja Pol V. Pol IV ja Pol V võimaldavad jätkata DNA replikatsiooni kohalt, kus DNA polümeraas III kompleks on peatunud, DNA süntees toimub vigaderohkelt, sest Pol IV-l ja PolV-l puudub vigu korrigeeriv aktiivsus. Pol IV DNA sünteesi jätkamine mittepaardunud või valestipaardunud
    praimeri otsast – raaminihkemutatsioonid. DNA kahjustuste ületamine (TLS).
    Alternatiivne DNA replikatsioon
    Teatud juhtudel võib DNA replikatsioon alata ka DnaA-st sõltumatult ning teistest kromosoomipiirkondadest – stabiilne DNA replikatsioon SDR.
  • DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanismid oriC’lt bakteris E. coli.
    DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel ( faagid T4, T7, mõned ColE1 replikoni sisaldavad plasmiidid E. coli´s) või spetsiifiliste valkude seondumise tulemusena (DnaA oriC puhul, O ori puhul). Kuna DNA dupleksi avamine on lihtsam A-T rikastest regioonidest, on ori regioonid alati A-T rikkad. Bakterikromosoomi replikatsioon toimub rakutsükli teatud etapil.
    DNA replikatsiooni initsiatsioon oriC-lt
    Minimaalne oriC on 245 bp pikkune ning eubakterites tugevalt konserveerunud. Funktsionaalne oriC sisaldab kindlaid DNA järjestusi, mis esinevad kordustes:
    1) DnaA boksid initsiaatorvalgu DnaA seondumiseks (4 koopiat) 5’-TTAT(C/A)CA(C/A)A-3’
    2) 11 koopiat Dam metülaasi poolt äratuntavat järjestust 5’-GATC-3’, nendest 8 asukoht on tugevalt konserveerunud
    3) DnaA boksidest vasakule jääb 3 AT-rikast 13 nukleotiidi pikkust järjestust, mis on määrava tähtsusega DNA ahelate lokaalsel lahtisulamisel.
    DnaA seondumiseks oriC-le on vajalik dsDNA-ga seonduva valgu HU juuresolek , mis soodustab DNA paindumist ja DNA ahelate lahtikeerdumist. Lisaks seob oriC DNA-d painutavaid valke IHF ning Fis.
    Transkriptsiooni mõju replikatsiooni initsiatsioonile oriC-lt
    Ahelate lahtisulamist oriC regioonis stimuleerib ka transkriptsioon. oriC läheduses on 2 promootorit, mioC, millelt toimub transkriptsioon oriC suunas ning gidA , millelt transkriptsioon oriC suhtes eemaldub.
    Enne replikatsiooni initsiatsiooni on transkriptsioon mioC-lt inhibeeritud. mioC promootor ei kontrolli replikatsiooni initsiatsiooni. Transkriptsioon gidA promootorilt toimub nii enne kui ka replikatsiooni initsiatsiooni käigus. Transkriptsioonist tingitud negatiivne superspiralisatsioon soodustab DNA lahtikeerdumist AT-rikkast 13-meersest DNA järjestusest. Pärast replikatsiooni initsiatsiooni on gidA transkriptsioon pärsitud, sest vastav DNA regioon on seotud rakumembraaniga.
    Algne initsiatsioonikompleks moodustub 20-30 DnaA monomeeri sidumisel. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine, kusjuures DNA ahelate lahtikeerdumine algab kõige parempoolsemast 13-meerist. Seejärel moodustavad DnaB ja DnaC denatureerunud DNA-ga prepraimingkompleksi. SSB (üksikahelalise DNA-ga seonduv valk) ja güraasi juuresolekul jätkub DNA ahelate lahtikeerdumine mõlemas suunas. Järgneb praimeri süntees DnaG poolt, DNA polümeraas III moodustab replikatsioonikahvli ning edasi toimub oriC-st lähtuv tütarmolekulide süntees mõlemas suunas.
    Alternatiivne DNA replikatsioon
    Indutseeritud stabiilne DNA replikatsioon iSDR:
    Toimub rakkudes, kus on indutseeritud SOS vastus ning sõltub homoloogilisest rekombinatsioonist. iSDR algab nii oriC piirkonnast kui ka terC-st (oriM). Initsiatsiooniks vajaliku praimeri genereerimiseks toimub DNA rekombinatsioon, mille käigus tekib D- ling (3-st DNA ahelast moodustunud struktuur vaba 3´-OH otsaga.
    Limiteeriv faktor DNA replikatsiooni initsiatsioonil.
    GATC saitide metülatsioon oriC regioonis
    Bakteri DNA-s on A nukleotiid GATC järjestustes Dam metülaasi poolt metüleeritud. DNA replikatsiooni käigus jääb sünteesitud tütarahel mõneks minutiks metüleerimata. DnaA seondub ainult metüleeritud DNA-ga. oriC regioonis jäävad GATC saidid metüleerimata pikemaks ajaks kui mujal (30-40% rakutsükli ajast). Sel ajal on oriC assotsieerunud rakumembraaniga. Membraaniga seondumine on oluline ka kromosoomi segregatsioonil, võimaldades tütarmolekulidel teineteisest eemalduda. Seda, et GATC saitide metüleeritus on replikatsiooni initsiatsiooni kontrolliks oluline, näitavad katsed Dam- tüvedega. Dam- tüved on Dam metüültrasferaasi defektsed ning sellistes rakkudes toimub DNA replikatsiooni initsiatsioon asünkroonselt, st. ei alga, juhul kui rakutsükli vältel on käigus korraga mitu replikatsiooni, kõigilt oriC-delt korraga.
    DNA replikatsiooni initsiatsiooni sünkroonsust on võimalik testida DNA replikatsiooni “runout” katsetega. DNA replikatsiooni elongatsioon ei vaja de novo valgusünteesi. Kui rakkudes blokeerida kas valgusüntees (kloroamfenikooli lisamisel) või transkriptsioon (rifampitsiini lisamisel), viiakse parasjagu pooleliolev replikatsioon lõpuni. Samas on pärsitud replikatsiooni initsiatsioon. Cephalexiini lisamisega on võimalik blokeerida rakkude jagunemine. Sõltuvalt sellest, kas replikatsiooni initsiatsioon toimus kõigilt oriC-delt või mitte, on pärast replikatsiooni lõpuni jõudmist (runout replication) rakus paaris või paaritu arv genoomi ekvivalente. Paaritu arv viitab DNA replikatsiooni asünkroonsusele.
    DnaA tase rakus
  • Totaalne rakusisene DnaA tase hoitakse erinevatel kasvukiirustel konstantsena. dnaA geeni ekspressioonitase tõuseb, kui rakkude kasvukiirus suureneb. Aeglasemalt kasvavates toitainete vaeguses olevates rakkudes suureneb ppGpp hulk, mis viib transkriptsioonitaseme dnaA promootoritelt alla.
  • DnaA valgu puhul on kirjeldatud autoregulatsioon. dnaA geenil on 2 promootorit ning nende vahel on DnaA seondumise järjestus. DnaA seondumine sellele järjestusele represseerib transkriptsiooni 1p promootorilt.
  • dnaA promootorregioonis on mitu GATC saiti. Transkriptsioon promootorilt 2p on represseeritud, kui GATC saidid on metüleerimata.
    dnaA geeniga samas operonis asuvad veel geenid, mis kodeerivad RNA polümeraasi  subühikut, DNA rekombinatsiooni valku RecF ja ühte DNA güraasi subühikutest.
    Rakus on leitud erinevaid DnaA vorme - DnaA, DnaA-ADP ja DnaA-ATP. In vitro katsetes on näidatud, et DNA replikatsiooni initsiatsioonil on võimeline osalema ainult DnaA-ATP. Aktiivse vormi teke on katalüüsitud fosfolipaasi A2 poolt, interaktsioon membraankompleksis olevate fosfolipiididega viib DnaA inaktiivsesse vormi.
  • Selgitage mehhanisme, mil viisil on kontrollitud E. coli rakkude jagunemine.

  • Raku jagunemisel osalevad valgud


    Primaarse tähtsusega on FtsZ. Molekulid agregeeruvad ning kogunevad raku pooldumissaiti, moodustades tsütoplasmaatilise membraani sisepinnale ringi, mis on signaaliks tsütokineesile ja septumi moodustumisele. FtsZ on GTP-aasse aktiivsusega. Raku jagunemisega on seotud ka valgud FtsA, FtsQ, FtsI (PBP3), FtsW ning FtsE. PBP3 on peptidoglükaani transpeptidaas, mis viib läbi peptidoglükaani transglükosüleerimise ning ahelate krosslinkimise. FtsZ interakteerub ZipA ja FtsA-ga, mis seejärel läbi interaktsioonide teiste valkudega viib PBP3 (FtsI) aktivatsioonile. PBP3 ning temaga assotsieerunud valkude toimel moodustub jaguneva raku keskele peptidoglükaani kaksikkiht. Min valgud MinCDE ja SlmA inhibeerivad FtsZ ringi moodustumist EnvA toimel toimub nende kihtide eemaldumine ja sellele järgneb välismembraani sissekasvamine.
    Raku jagunemisel osalevate valkude regulatsioon
    Suur osa raku jagunemisel osalevatest geenidest on kodeeritud mra operoni poolt. Selles operonis on leitud 16 avatud lugemisraami (ORF-i). Valgulised produktid on identifitseeritud 14 ORF-i puhul. Operonis on sisemisi promootoreid. ORF-ide vahed on väga lühikesed ning sageli asuvad kodeerivale järjestusele eelnevad RBS järjestusi sisaldavad regioonid eespoololevate ORF-ide lõpus.
    Neid geene sisaldavas regioonis on 7 sisemist promootorit, 4 neist paiknevad ftsA ja 1 ftsQ geenis. See võimaldab erinevaid geene erineval tasemel transkribeerida. Lisaks on promootorid veel erineva tugevusega . Aeglaselt kasvavates rakkudes on fts geenide transkriptsioonitase kõrgem, kiiresti kasvavates madalam. Sellest tulenevalt on kiirema kasvukiirusega rakud suuremad.

  • Raku jagunemise koht ja ajastamine


    Kui blokeerida DNA replikatsioon, rakk ei jagune. DNA replikatsiooni blokeerimine põhjustab SOS vastuse, mille tulemusena aktiveerub SulA valk ning raku jagunemine pärsitakse. Arvatakse, et SulA inaktiveerib FtsZ-i. DNA replikatsioon ja raku jagunemine ei ole aga otseses sõltuvuses, sest kui blokeerida replikatsiooni initsiatsioon, jätkub rakkude kasv ning nad jagunevad, kuigi sel juhul jääb osa rakke ilma DNA-ta. Ilma DNA-ta rakud on väiksemad, mistõttu neid nimetatakse minirakkudeks.
    Normaalne raku jagunemine toimub jaotunud tütarkromosoomide vahelt, raku keskelt, nii et raku pooldumiskoht jääks kromosoomist L/2 kaugusele. Põhimõtteliselt võivad rakud jaguneda ka poolustelt ning moodustada DNA-ta minirakke.
    MinC ja MinD on raku jagunemise inhibiitorid, mis blokeerivad septumi moodustumise kõigis potentsiaalsetes raku jagunemise kohtades. MinE tagab selle, et septumi jagunemine oleks inhibeeritud ainult raku poolustelt. Ta lokaliseerub eelistatult raku keskel olevasse regiooni. Sinna koguneb ka FtsZ, raku jagunemise initsiaatorvalk, kuigi MinE ja FtsZ omavahel otseselt ei interakteeru. MinE N-terminaalne domään kõrvaldab MinC-MinD inhibeeriva toime, C terminaalne domään eristab jagunemise koha raku keskel potentsiaalsetest saitidest poolustel. Et selektiivsus säiluks, peab MinE kontsentratsioon rakus olema limiteeriv (200 molekuli raku kohta). Kui MinE kontsentratsiooni tõsta, tekivad minirakud.
  • Erinevad DNA reparatsiooni strateegiad bakterirakus.
    DNA reparatsioonistrateegiad üldiselt
    • Vea parandamine kohapeal
    • Lämmastikaluse kõrvaldamine
    • Nukleotiidide kõrvaldamine DNA ahelast

    I.Vea parandamine kohapeal
    Kõige lihtsamaks ja otsesemaks mehhanismiks on vea parandamine kohapeal, ilma nukleotiidide DNA ahelast kõrvaldamiseta. Nii toimub näiteks alküleerivate ühendite poolt tekitatud kahjustuste kõrvaldamine metüültransferaaside abil.
    Metüültransferaas Ada kannab metüülguaniinilt O6-MeG metüülrühma iseenda tsüsteiini jäägile (Cys-321). Selle tulemusena valk inaktiveerub. Seega kulub iga metüülrühma kõrvaldamisele DNA-st üks Ada valgu molekul.
    Ada ekspressioonitase on rakus reguleeritav. Tegemist on autoregulatsiooniga, kus metüleeritud Ada valk seondub teda kodeeriva geeni promootoralale, mille tulemusena ada geeni transkriptsioonitase rakus tõuseb. Metüleerimata Ada valk on samuti võimeline promootoralale seonduma, kuid tunduvalt väiksema efektiivsusega ning sel juhul ada geeni transkriptsioonitase rakus langeb. Nii on võimalik Ada valgu ekspressioonitaset kontrollida vastavalt DNA kahjustuste hulgale rakkudes.
    Lisaks Ada valgule on bakterites veel konstitutiivselt ekspresseeruv O6-MeG metüültransferaas Ogt.
    UV kiirgusest põhjustatud pürimidiini dimeeride lahutamine fotolüaasi abil toimub samuti kohapeal. Fotolüaas võib substraadile seonduda pimedas , kuid dimeeride lahutamiseks kasutab ta valguseenergiat. Seetõttu nimetatakse seda reparatsiooniprotsessi ka fotoreaktivatsiooniks.

  • II. Lämmastikaluste väljalõikamine


    Kahjustatud lämmastikaluste kõrvaldamisel DNA-st osalevad N-glükosülaasid. Selle tulemusena tekib DNA ahelas AP sait (abasic site), mida atakeerib AP endonukleaas, lõhkudes fosfodiestersideme. Seejärel kõrvaldab desoksüriboosi DNA ahelast eksoribonukleaas või desoksüribofosfodiesteraas. Osadel glükosülaasidel (näiteks MutM) on ka AP endonukleaasne aktiivsus.
    Uratsiil DNA glükosülaas (ung geeni produkt) on väga spetsiifiline ja kõrvaldab DNA ahelast ainult uratsiili. Uratsiil tekib tsütosiini deamineerimise tulemusena. Sellel ensüümil AP endonukleaasne aktiivsus puudub.
    3-MeA DNA glükosülaasid I (Tag) ja II (AlkA) on erineva substraadispetsiifilisusega. AlkA on laiema substraadispetsiifilisusega, kõrvaldades nii 3-MeA, 3-MeG kui ka hüpoksantiini (hüpoksantiin tekib adeniini deamineerimisel). Tag ekspresseerub rakkudes konstitutiivselt, AlkA geeni transkriptsioon on aga samuti Ada valgu poolt reguleeritav.
    Oksüdeeritud guaniini GO reparatsioon
    Guaniini oksüdatsiooniproduktiks on 8-hüdroksüguaniin (GO). GO kahjustusi põhjustavad hapnikuradikaalid tekivad rakus ka tavaliste protsesside (elektronide transport, lipiidide peroksüdatsioon) tulemusena. Seetõttu on GO reparatsioon bakterirakus üks olulisemaid vigade ärahoidmise ja korrigeerimise süsteeme. GO-defektsetes tüvedes tõuseb mutatsioonisagedus võrreldavalt mutatsioonisageduse tõusuga, mis ilmneb replikatiivse DNA polümeraasi korrigeeriva (proofreading) funktsiooni rikkumise või DNA metülatsioonist sõltuva DNA “mismatch” reparatsioonisüsteemi defektsusel. Replikatsioonil viib DNA polümeraas GO võrdse efektiivsusega nii C kui A vastu (3% efektiivsusest, millega ta õiget nukleotiidi inkorporeerib). GO valepaardumisest põhjustatud asendusmutatsioonide vältimiseks on E. coli’s olemas 3 valku – MutM, MutT ja MutY.
    MutT on ennetava funktsiooniga – ta lagundab rakkudes GO-d.
    MutM ja MutY on glükosülaasid. MutM kõrvaldab DNA ahelast GO. MutY kõrvaldab valesti paardunud A nii A/G kui A/GO puhul. Kahjustuste kõrvaldamine võib toimuda ka valesti. Näiteks, kui A vastu lülitub GO, võib MutY DNA ahelast kõrvaldada hoopis A ning kui järgmise replikatsioonitsükli käigus lülitub GO vastu C, toimub selle tulemusena asendus AT  CG.
    III. Nukleotiidide DNA ahelast väljalõikamine
    Pikk reparatsioonirada - kõrvaldatakse 1500 nt, osaleb DNA pol I.
    Lühike reparatsioonirada - kõrvaldatakse 12 - 13 nt, osalevad UvrABC ekstsinukleaas ja UvrD.
    UvrA (kahjustust tundev valk) ning UvrB (helikaas) tunnevad DNA-d skanneerides ära defekti. Kahjustuse kohal toimuvad valkudes konformatsioonilised muutused, mille tagajärjel UvrA dissotseerub ning UvrB ja defektse ala kompleksiga seostub UvrC. UvrB-l on endonukleaasne aktiivsus, ta tekitab katke 5-ndasse fosfodiestersidemesse kahjustusest 3´ suunas. 8-nda fosfodiestersideme katke kahjustusest 5´suunas teostatakse UvrC poolt. Seejärel kõrvaldavad UvrD helikaas ja DNA polümeraas I oligo ning toimub tühiku täissüntees. UvrABC kompleksi nimetatakse ka UvrABC ekstinukleaasiks. Kuigi uvrA, uvrB ja uvrD geene transkribeeritakse rakus pidevalt, on nende transkriptsioonitase LexA repressori poolt mahareguleeritud ning tõuseb SOS vastuse käigus, kus DNA on kahjustatud.
    DNA “mismatch” reparatsioon MMR
    DNA “mismatch” reparatsioon MMR korrigeerib DNA replikatsioonijärgset järjestust, kõrvaldades valestipaardunud nukleotiide sellest DNA ahelast, mida pole jõutud veel metüleerida.
    MutS seondub otseselt mittepaarduva alaga, seejärel liitub MutL. MutS-MutL-DNA kompleks translokeerub hemimetüleeritud GATC saidiga seondunud endonukleaasi MutH juurde, stimuleerides MutH endonukleaasset aktiivsust. MutH lõikab fosfodiestersidet ajutiselt metüleerimata DNA ahelast. MutH poolne lõige võib toimuda kahjustusest kas 5´ või 3´ suunas. Seejärel toimub valestipaardunud nukleotiidi sisaldava regiooni kõrvaldamine eksonukleaaside toimel. DNA ahelate lahtikeeramisel osaleb helikaas UvrD. ssDNA-le sünteesib komplementaarse DNA ahela DNA polümeraas III kompleks.
    Graampositiivsetes bakterites on MutHLS reparatsioonisüsteem samuti olemas, kuid seal ei toimu vahettegemist metüleeritud ja metüleerimata DNA ahelate vahel.
  • Bakteripopulatsiooni evolutsioneerumine stressitingimustes.
    Traditsiooniliselt defineeritakse statsionaarset faasi kui olukorda, kus rakupopulatsiooni optiline tihedus või CFU ( colony forming units ) väärtus ei tõuse. Rakud püsivad statsionaarses faasis nälgimise korral. Looduslikes populatsioonides on nälgimine (ja seega statsionaarne faas) bakteritele tavaline seisund. Pigem on erandiks eksponentsiaalne paljunemine. Viimaste aastate uuringud on näidanud, et statsionaarses faasis olev rakupopulatsioon on dünaamiline, pidevalt evolutsioneeruv.
    Osadel rakkudel ilmneb kultuuri vananedes GASP ( growth advantage in stationary phase) fenotüüp. Suurem osa rakke sureb nälgimise käigus. GASP fenotüübiga mutandid on võimelised surnud rakkudest vabanenud toitaineid (näiteks aminohappeid) paremini omastama kui metsiktüüpi rakud. Eluvõimelisi rakke võib statsionaarse faasi kultuuris leida isegi kuude ja aastate pärast. Kultuuris toimub pidev evolutsioneerumine: esimesed GASP fenotüübiga mutandid konkureeritakse varsti välja uute GASP mutantide poolt, need hiljem omakorda järgmiste poolt. Nii on näidatud, et 10 päeva vanuse kultuuri mutandid konkureeritakse välja 20 päeva vanuse kultuuri GASP mutantide poolt ja need omakorda 30 päeva vanuse kultuuri mutantide poolt.
    Statsionaarses faasis oleva rakupopulatsiooni evolutsioneerumist on võimalik hinnata ka kolooniate morfoloogia alusel.
    Ühest inokulumist kasvatatud kultuuride GASP fenotüüp võib erineda, erinevates populatsioonides tekivad erinevad mutatsioonid , erinevate mutatsioonide tulemusena toimusid rakkudes erinevad füsioloogilised muutused ja rakukultuuride keskkond kujunes erinevaks. Sellest tulenevalt sattusid rakupopulatsioonid erineva selektsiooni alla ning eelise said erinevad mutandid.
    Mutatsioonid tekivad näiliselt staatilises rakupopulatsioonis, kus DNA replikatsioonitase on rakkudes oluliselt langenud. Kõrgenenud mutatsioonisagedus statsionaarse faasi rakkudes - vananevates bakterikolooniates tõuseb mutatsioonisagedus. Mutatsioonisagedust mõjutavad tegurid:
    • DNA replikatsiooni täpsus
    • DNA reparatsioonisüsteemide efektiivsus
    Mutaatorfenotüüp:
    1. Püsiv - Üldine mutatsioonisageduse tõus rakus – mutatsioonid DNA reparatsiooni geenides
    Lokaalne – osades geenides sisalduvad hüpermutabiilsed alad (contingency loci)
    2. Ajutine - Vigaderohkelt DNA-d sünteesivate DNA polümeraaside induktsioon
    DNA reparatsiooni alatalitlus
    Mobiilsete elementide transponeerumine
    GASP mutatsioonide geneetiline tagapõhi.
    GASP fenotüübi tagas just sigma faktori osaline funktsiooni kadu. Mutandid, kus RpoS on täielikult inaktiveeritud, GASP fenotüüpi ei oma. RpoS osalist funktsiooni kadu mutatsioonide tõttu rpoS geenis on täheldatud ka paljudel looduslikel isolaatidel. Eraldi tasub rõhutada, et rpoS geenis toimunud mutatsioonidest põhjustatud GASP fenotüüp ilmneb bakteritel ainult teatud kasvutingimustel (rikas aereeritud sööde).
    Bakterikultuuri vananedes ilmuvad uued GASP mutandid, mis sisaldavad lisaks rpoS mutatsioonidele mutatsioone ka teistes alleelides. Nii on leitud mutatsioonid geenides sgaA, sgaB ja sgaC (stationary-phase growth advantage). Kõik need mutandid kasvavad võrreldes metsiktüüpi rakkudega kiiremini teatud aminohapetel, kasutades neid C- allikana . Erinevad mutandid eelistavad kasvuks erinevaid aminohappeid. Aminohapete katabolismiradade ekspressioonitaseme tõus võimaldab mutantidel kasutada efektiivsemalt surnud rakkudest vabanenud toitaineid.
  • Sporogeensete bakterite diferentseerumist indutseerivad signaalid .
    Sporulatsiooni-spetsiifiliste geenide avaldumist kontrollivad regulaatorvalgud, mis toimivad vastusena teatud signaalidele:
  • Toitainete ammendumine. Kergesti metaboliseeritavate C- ja N-allikate ammendumise tõttu kasvukeskkonnast langeb rakkudes GTP tase. Kuna GTP sünteesi inhibeerimine indutseerib sporulatsiooni ka sel juhul, kui rakkudel on piisavalt toitaineid, peetakse just GTP kontsentratsiooni langust üheks sporulatsiooni stimuleerivaks signaaliks. Arvatavasti muutub rakus GTP hulga vähenemisel spetsiifilise regulaatorvalgu aktiivsus.
  • Rakkude tihedus. Sporuleerumine sõltub rakukultuuri tihedusest. Väikese tiheduse korral ei aita isegi näljutamine. Sporulatsiooni indutseerivad ekstratsellulaarsed faktorid, mida produtseerivad hilises eksponentsiaalses faasis sporuleeruma hakkavad rakud. Kui viia rakud hõredast rakukultuurist tiheda rakukultuuri filtraati , hakkavad ka need sporuleeruma. Seega ilmneb sporuleerumisel “quorum sensing” e. hulgatunnetuse efekt. Rakud produtseerivad väliskeskkonda teatud autoinduktormolekule, mis toimivad alates teatavast lävikontsentratsioonist. Mida tihedam on rakukultuur, seda kõrgem on autoinduktori kontsentratsioon.
  • DNA süntees. DNA süntees on obligatoorne emaraku ja spoori kromosoomi tekkeks. Kui DNA süntees inhibeerida, pärsitakse sporulatsiooni varajasel etapil avalduvad geenid.
    Eelpoolkirjeldatud 3-st signaalist saab alguse fosforüleerimise kaskaad, mis toimub Spo0 signaalse transduktsiooni raja kaudu. See signaali ülekandesüsteem koosneb Spo0A, Spo0F ja Spo0B valkudest. Spo0F on märklauaks histidiini proteiini kinaasidele KinA ja KinB. Fosforüleeritud Spo0F kannab fosfaadi edasi proteiini fosfotransferaasile Spo0B, mis omakorda fosforüleerib globaalse transkriptsiooniregulaatori Spo0A aspartaadi. Fosforüleeritud Spo0A (Spo0A-P) võib toimida nii transkriptsiooni aktivaatorina kui ka repressorina:
  • Spo0A-P represseerib geenid, mis suruvad maha sporulatsiooni tekke. Siia rühma kuulub AbrB repressor, mis pärsib paljude nälgimisel ja sporulatsioonil avalduvate geenide transkriptsiooni. AbrB represseerib ka sigma faktori H transkriptsiooni. H kontrollib paljude geenide transkriptsiooni, mis aktiveeritakse sporulatsiooni stimuleerimisel ning osaleb ka transkriptsiooni aktivatsioonil ühelt spo0A promootoritest.
  • Spo0A-P aktiveerib otseselt transkriptsiooni SpoIIA ja SpoIIG operonidelt, mis on vajalikud raku diferentseerumisel üksusteks, millest kujunevad emarakk ja prespoor. Diferentseerumisel moodustub sporulatsiooniseptum. Septumi moodustumise asukohta koguneb rakujagunemise initsiaatorvalk FtsZ.
  • Bacillus’e geenide ajaline regulatsioon sporulatsiooni erinevatel etappidel .

  • Emarakus ja prespooris avalduvad erinevad sigma faktorid, mis kontrollivad emaraku ja prespoori diferentseerumist. B. subtilis’e põhiline sigma faktor on A. Sporulatsiooni-spetsiifiliste geenide avaldumist kontrollivad sigma faktorid on σE, σF, σG ja σK. Sporulatsiooni erinevatel etappidel ekspresseeruvad erinevad sigma faktorid. Sporulatsioonis osalevate geenide avaldumine on kontrollitud nii ajaliselt kui ka ruumiliselt:


  • Faktorid σE ja σK on seotud emaraku varajaste ja hiliste geenide avaldumisega
  • Faktorid σF ja σG kontrollivad varajasi ja hiliseid prespooris avalduvaid geene.
  • Sporulatsiooni varajaste geenide avaldumine
    Prespooris avalduv sigma faktor σF on kodeeritud Spo0A-P poolt aktiveeritava SpoIIA operoni viimase geeni spoIIAC poolt. Sellele geenile eelnevate geenide spoIIAA ja spoIIAB produktid kontrollivad σF aktiivsust. SpoIIAB on anti-sigma faktor, mis inaktiveerib σF-i. SpoIIAB võib siduda nii ATP-d kui ka ADP-d. σF-iga seondub SpoIIAB-ATP, SpoIIAB-ADP seondub aga eelistatult SpoIIAA-ga. Seega sõltub σF-i aktiivsus ATP/ADP suhtest prespooris.
    Emarakus avalduv spoIIG operon sisaldab kahte geeni, spoIIGA, mis kodeerib membraan-seoselist proteaasi ja spoIIGB, mis kodeerib σE prekursorit. σE aktiveeritakse proteaasi poolt vahetult pärast septumi moodustumist. σE protsessingu käivitab prespooris avalduva σF poolt kontrollitud SpoIIR ning SpoIIGA proteaas lõikab σE prekursori N-terminusest maha 27 aminohapet.
  • Sporulatsiooni hiliste geenide avaldumine
    σF-i ekspressiooni tagajärjel transkribeeritakse geeni spoIIIG, mis kodeerib prespoori-spetsiifilist sigma faktorit σG. σG aktiivsus on samuti SpoIIAB poolt kontrollitud. Lisaks aktiveerib teda σE poolt kontrollitav hüpoteetiline faktor Y.
    σK ekspressiooni kontrollitakse nii transkriptsiooni, sait-spetsiifilise rekombinatsiooni kui ka valgu protsessingu kaudu. σE aktiveerib transkriptsiooni aktivaatori spoIIID transkriptsiooni. SpoIIID omakorda aktiveerib σE-sõltuva spoIVCB geeni transkriptsiooni, mis kodeerib σK N-terminaalset segmenti . Samas operonis sisalduv geen spoIVCA kodeerib sait-spetsiifilist rekombinaasi. σK C-terminaalne osa on kodeeritud spoIIIC geeni poolt, mis paikneb sigma faktori N-terminaalset poolt kodeerivast geenist 42 kb kaugusel. Sait-spetsiifiline rekombinaas katalüüsib nende 2 regiooni liitumist geeniks sigK. Rekombinatsiooni käigus deleteerub vahepealne 42 kb-pikkune DNA lõik. sigK kodeerib prekursorvalku, mis protsessitakse aktiivseks valguks. Seejärel aktiveeritakse σK moduloni geenid, millest paljud on seotud spoori kesta sünteesiga.
  • Streptomütseetide ja müksokokkide diferentseerumise regulatsioon.
    Streptomyces’e sporulatsioon
    Perekonda Streptomyces kuuluvad bakterid kuuluvad aktinomütseetide gruppi. Need graampositiivsed mullas elavad bakterid moodustavad hargnevaid niidistikke e. mütseeliume. Streptomütseetide puhul toimub kompleksne multitsellulaarne diferentseerumine , millel 2 faasi:
  • Vegetatiivne mütseeliumi kasv optimaalsetes tingimustes;
  • Reproduktiivne mütseeliumi kasv nälgimise korral.
    Reproduktiivsel kasvamisel mütseelium diferentseerub – niidistiku pinnalt kasvavad välja õhu kätte ulatuvad spoore moodustuvad struktuurid , mida nimetatakse sporangiumiks. Sporangiumiks spetsialiseerunud hüüfid võivad koosneda pikkadest, 50 või enamat spoori moodustavast rakkudeahelast. Diferentseerumise käigus produtseerivad streptomütseedid sekundaarseid metaboliite, milleks on enamasti mitmesugused antibiootikumid.

  • Streptomütseetide diferentseerumise regulatsioon


    Streptomütseetide mütseeliumi reproduktiivne diferentseerumine toimub vastusena toitainete näljale. Diferentseerumist indutseerivad mitmed erinevad signaalid.
  • Metaboolsete signaalidena toimivad nii GTP kontsentratsiooni langus kui ka ppGpp kontsentratsiooni tõus rakkudes, kusjuures GTP kontsentratsiooni muutus on otsesema toimega kui ppGpp hulga muutus.
  • Autoregulatoorsed faktorid. Osa streptomütseete produtseerivad difundeeruvaid faktoreid, mis indutseerivad sporulatsiooni juba väga madalal kontsentratsioonil. Neid faktoreid nimetatakse bakteriaalseteks feromoonideks. Üheks selliseks feromooniks on A-faktor (2-isokaprüloüül-3R-hüdroksümetüül -butüroollaktoon). A-faktori sünteesiga kaasneb ka streptomütsiini sünteesi induktsioon. Kui streptomütsiini produktsioon on jõudnud maksimaalsele tasemele, A-faktorit enam ei sünteesita. A-faktor seondub spetsiifilise repressorvalguga, mis kontrollib sporulatsiooni ja streptomütsiini biosünteesi geenide transkriptsiooni. Selle tulemusena kaotab repressor võime seonduda DNA-ga ja tema poolt pärsitud geenid aktiveeruvad. Lisaks A-faktorile sünteesitakse ka teisi autoregulatsoorseid faktoreid nagu B-faktor (sarnaneb struktuurselt cAMP-le) ja panamütsiin (seente ja bakterite vastase toimega makroliidide segu, mis madalal kontsentratsioonil indutseerib sporangiumi teket).
  • SapB valk (small aerial mycelium protein). SapB assotsieerub S. coelicolor’i spoorideks diferentseeruvate rakkude pinnaga ja toimib diferentseerumise ekstratsellulaarse induktorina.
    Streptomütseetide sporulatsiooniga seotud geenide identifitseerimisel on kirjeldatud terve rida mutante.
  • bld ( bald ) mutandid – spoore moodustavat mütseeliumi ei arene ja spoore ei teki;
  • whi (white) – moodustub küll spoorideks diferentseeruv mütseelium, kuid erinevalt metsiktüüpi bakteritest spoorid ei pigmenteeru.
    Myxococcus xanthus’e multitsellulaarne diferentseerumine
    Myxococcus xanthus on graamnegatiivne mullabakter. Tänu ekstratsellulaarsetele hüdrolüütilistele ensüümidele on ta võimeline toiduks kasutama mittelahustuvat orgaanilist materjali. Ekstratsellulaarsete ensüümide kontsentratsioon tõuseb tänu rakupopulatsiooni suurele tihedusele ning see omakorda soodustab rakkude kasvu. Sellisel kollektiivsel toitumisel hakkavad rakud diferentseeruma ning moodustavad viljakeha (fruiting body ).

  • Viljakeha teket indutseerivad signaalid


    Rakutiheduse tõusuga jääb toitaineid (eeskätt aminohappeid) väheseks ja see on signaaliks viljakeha moodustumisele. Viljakeha on enamasti 0,2 mm kõrgune ning koosneb ligikaudu 100000-st rakust. Diferentseerumise algstaadiumil (esimese 4 tunni jooksul), kui rakkude kasv aeglustub ja rakutihedus on kõrge, rakud agregeeruvad. 12 tunni pärast hakkab tekkima elliptiline või ümar kuhil. 24-ks tunniks on osa rakke kuhilas diferentseerunud spoorideks, osa aga lüüsunud. Diferentseerumise käigus sünteesitakse vähemalt 30 uut valku.
    Multitsellulaarse diferentseerumise käigus produtseerivad rakud ekstratsellulaarseid signaale. Isoleeritud on 4 mutantide klassi, mille diferentseerumine peatub erinevatel etappidel. Kõige paremini on iseloomustatud asg ja csg mutante.
    asg geenid vastutavad A-signaalmolekulide sünteesi eest. Need erinevad streptomütseetide puhul kirjeldatud A-faktorist. A-signaalmolekulid jaotuvad temperatuuristabiilseks ja temperatuuritundlikuks fraktsiooniks. Temperatuuristabiilne fraktsioon koosneb aminohapetest proliin, türosiin, fenüülalaniin, trüptofaan, leutsiin , isoleutsiin ja alaniin ning polüpeptiididest, mis koosnevad eeskätt just neist aminohapetest. Temperatuuritundlik fraktsioon sisaldab vähemalt kahte ebaspetsiifilist proteaasi. Arvatavasti on ekstratsellulaarsed aminohapped ja lühikesed peptiidid saadud just tänu nendele proteaasidele. Alates teatavast A-signaalmolekulide kontsentratsioonist on diferentseerumine pärsitud. Kui nende kontsentratsioon langeb aga alla kriitilise piiri, indutseeritakse viljakeha arenemine.
    csg geen kodeerib C-faktorit, milleks on 17 kDa-suurune valk. See valk moduleerib vähemalt 50 rakkude liikumise, agregeerumise ja morfogeneesiga seotud geeni transkriptsiooni. C-signaal on vajalik rakkude agregeerumise lõpuleviimiseks ja sporulatsiooni initsiatsiooniks.
    Diferentseerumise käigus toimuva signaalse transduktsiooni kaskaadis osalevad treoniin /seriin kinaasid , mis sarnanevad eukarüootidest leitud kinaasidele.
  • Signaaliülekande mehhanismid bakterirakus raku liikumisel kemoatraktandi kontsentratsiooni tõusu suunas.
    Enamus bakterirakke on liikumisvõimelised, nad liiguvad atraktandi suunas ja eemalduvad ebasoodsatest signaalidest. Liikumist e. taksist stimuleerivad kas teatavad lahustunud ained (kemotaksis), hapnik (aerotaksis), osmootne rõhk (osmotaksis), valgus (fototaksis), temperatuurimuutused (termotaksis), mehhaanilised stiimulid (tigmotaksis), elektrivool (galvanotaksis) või magnetväli (magnetotaksis). Bakterirakud liiguvad kas viburite abil (enamus graampositiivseid ja graamnegatiivseid baktereid) või libisevad tahkel pinnal (müksobakterid, fototroofsed tsüanobakterid).
    Viburite abil liikumisel pöörlevad viburid kas päripäeva (CW, clockwise) või vastupäeva (CCW, counter clockwise). Stiimulite puudumisel on bakteriraku liikumine kaootiline . Viburite pöörlemissuund vahetub perioodiliselt. E. coli puhul on täheldatud näiteks 1-sekundilist perioodi, kus viburid pöörlevad vastupäeva. Sel juhul liigub rakk ühes suunas 30 m edasi (see on ligikaudu 10 rakupikkust), millele järgneb viburite pöörlemine päripäeva (0,1 sekundit), kus rakk tõmbleb ühe koha peal (ingl. k. “tumbling”), kuna iga vibur lükkab rakku erinevas suunas. Tõmblemise tulemusena muutub raku ujumissuund ligikaudu 60 kraadi. Seega on raku liikumise trajektoor sik-sakiline. Kui rakkude kasvukeskkonda satub näiteks keemiline ühend, mis toimib kemoatraktandina, ujuvad bakterirakud selle kontsentratsioonigradiendi suunas. Ühesuunalise liikumise teeb võimalikuks CCW perioodide pikenemine viburite CW suunas pöörlemise blokeerimise arvelt.

  • Signaalse transduktsiooni rajad, mis kontrollivad bakterite kemotaksist


    Enterobakteritel on kirjeldatud 3 üksteisest sõltumatut signaalse transduktsiooni rada ja spetsiifilist kemosensorit:
  • metüülirühma aktsepteerivad (methyl-accepting) kemotaksise valgud e. MCP valgud;
  • fosfotransferaasi süsteemi (PTS) valgud Ensüüm I ja Hpr ning Ensüümid II;
  • hingamisahela ja elektron -aktseptorahela komponendid (tsütokroomid, tsütokroomi oksüdaasid).
    Kemotaksise suhtes defektseid mutante on võimalik isoleerida spetsiaalsetel söötmetel, kus Petri tassi valatud tardsöötme agari kontsentratsioon on madal (0,25%). Sööde sisaldab väga väikeses koguses (mikromolaarsetes kogustes ) C-allikana kasutatavat kemoatraktanti. Kui viia ühte punkti söötme pinnale väike kogus (ligikaudu 107) rakke, kasutavad need lokaalse C-allika ära ning liiguvad seejärel edasi atraktandi kõrgema kontsentratsiooni suunas. Seal rakud paljunevad, kasutavad ära C-allika ning liiguvad jälle edasi. Nii moodustuvad rakkudest söötmele kontsentrilised ringid . Mutandid, mis ei ole võimelised kas liikuma või detekteerima kemoatraktanti, jäävad söötmel algsesse inokuleerimise kohta, moodustades seal väikese, teravalt piiritletud koloonia.
  • MCP valkude kaudu kontrollitud kemotaksis enterobakteritel
    Mutante, mille viburid pöörlevad ainult ühes suunas ja ei ole mõjutatavad kemotaksise stiimulite kaudu, on hakatud tähistama Che- mutantidena (non-chemotactic mutants). Selle rühma mutandid on enamasti defektsed Che valkude CheA, CheW , CheY või CheZ suhtes. MCP-sõltuva kemotaksise response-regulaatoriks on fosforüleeritud CheY, mis seondub viburi mootorile, pannes selle pöörlema päripäeva. Selle tulemusena tõmblevad rakud ühe koha peal. Ülejäänud Che valgud osalevad kas otseselt või kaudselt signaalse transduktsiooni rajas, mis moduleerib CheY fosforüleerimist. Viburi mootor on suur makromolekulaarne kompleks, mis koosneb Mot valkude poolt ümbritsetud basaalsest struktuurist, kuhu kinnituvad flagelliini filamendid. Selle struktuuriga on perifeerselt assotsieerunud Fli valgud, mille kaudu toimub pöörlemise lülitamine CW suunalt CCW suunale ja vastupidi. Fosforüleeritud CheY interakteerub FliM-ga ning vibur hakkab pöörlema CW suunas.
  • Rakkude ärritus
    MCP retseptorvalgu C-terminaalne tsütoplasmaatiline domeen interakteerub adaptervalguga CheW, mis omakorda moduleerib histidiini proteiini kinaasi CheA. CheA fosforüleerib nii CheY kui ka CheB. CheY-l on autofosfataasi aktiivsus, mistõttu ta jääb fosforüleerituks ainult lühiajaliselt. CheY defosforüleerimist kiirendab CheZ. Kemoatraktandi seondumisel retseptorvalguga ei interakteeru retseptorvalk adaptervalguga CheW ning signaali ülekannet CheY fosforüleerimiseks ei toimu. Seega, kui kemoatraktandi kontsentratsioon tõuseb, viib see alla CheY fosforüleerimise taseme ning viburid pöörlevad vastupäeva (CCW suunas), võimaldades rakkude suunatud liikumist. Juhul, kui rakk puutub aga kokku negatiivse stiimuliga või kui positiivne kemoatraktant dissotseerub, käivitub signaalse trasduktsiooni rada, mille tulemusena CheY fosforüleeritakse ning viburite pöörlemine lülitub päripäeva suunale (CW suunale).
    MCP valkude metüleerimisega kaasneb rakkude adapteerumine. Kui MCP retseptorvalk on metüleeritud, väheneb selle afiinsus atraktandile. MCP valkude metüleerimine kutsub esile vastupidise efekti kemoatraktandi seondumisele – see soodustab CheA autofosforüleerumist ning viburite pöörlemine lülitub CCW suunalt CW suunale. Selleks, et laguneks retseptori kompleks CheW ja CheA-ga, nii et viburid hakkaksid uuesti pöörlema CCW suunas, on vaja kõrgemat atraktandi kontsentratsiooni. Seega võimaldab adapteerumine rakkudel otsustada, kas liikuda suunatult edasi või püsida paigal. Kui atraktandi kontsentratsioon keskkonnas langeb, toimub retseptorvalgu demetülatsioon fosforüleeritud CheB abil ning retseptor muutub tundlikumaks madalama atraktandi kontsentratsiooni suhtes. See omakorda võimaldab jällegi destabiliseerida retseptori kompleksi CheW ja CheA-ga, CheY-t ei fosforüleerita ning viburid pöörlevad jälle CCW suunas, võimaldades rakul edasi liikuda.
  • PTS kaudu kontrollitud kemotaksis
    PTS substraadid (näiteks glükoos) transporditakse rakku ja fosforüleeritakse Ensüüm II (EII) poolt. Selle tulemusena defosforüleeritakse Ensüüm I (EI). Defosforüleeritud EI akumuleerumine inhibeerib kinaasi CheA autofosforüleerimise, langeb fosforüleeritud CheY tase ning rakul tekib positiivne kemotaksise vastus.
  • ETA-sõltuv taksis
    Elektrontransport ahela ETA-sõltuva taksise näitena võib tuua aerotaksise hapniku suhtes. Taksis elektronaktseptorite suhtes vajab lisaks spetsiifilistele MCP valkudele ja tsentraalsetele CheA, CheW ja CheY valkudele sensorina ka hingamisahela komponente. Kui E. coli rakud kasvavad anaeroobsetes tingimustes, kasutades elektronaktseptorina nitraati , liiguvad rakud suunas, kus on nitraati ja madalas kontsentratsioonis hapnikku. Rakkude aeroobse kasvu korral kaotavad nad aga huvi nitraadi suhtes, küll aga säilub neil aerotaksis hapniku suhtes. Paljud obligatoorsed anaeroobid väldivad hapnikku-sisaldavat keskkonda. Hapniku kõrge kontsentratsioon võib eemale tõugata ka paljusid fakultatiivseid anaeroobe ja rangeid anaeroobe. Seega hoiab ETA-sõltuv taksis bakterirakke keskkonnas, mis on neile energia tootmise seisukohalt optimaalne.
  • Bakterite suhtlemisel kasutatavad signaalid.
    Selleks, et sellises keerukas olukorras hakkama saada on bakteritel välja kujunenud erinevad signallisatsiooni- ehk suhtlus-süsteemid. Et suurem osa neist süsteemidest sõltuvad signaali kontsentratsioonist, mis omakorda sõltub signaali tootjate hulgast, siis nimetatakse neid ka hulgatunnetuse e. QS (ingl. k. quorum sensing) süsteemideks.
    Kõige paremini on uuritud bakterite omavahelist signalisatsiooni ühe liigi siseselt. Erinevate QS süsteemide puhul on ühiseks omaduseks see, et QS molekul on rakust sisse ja välja vabalt diffundeeruv. Teiseks toimub QS molekulide poolt reguleeritud geenide aktivatsioon alates mingist kindlast kontsentratsioonitasemest. QS süsteemide poolt on reguleeritud sellised rakulised protsessid nagu liikumine, biofilmi moodutamine, sekundaarsete metaboliitide produktsioon, konjugatsioon ja virulentsus. Paljudel bakteritel on kirjeldatud korraga mitut erinevat QS süsteemi, mis on enamasti hierarhiliselt reguleeritud. Kui üheks QS eesmärgiks on reguleerida kollektiivselt mingite geenide ekspressiooni kogu populatsioonis, siis teiseks eesmärgiks on ka suhtlus teiste liikidega.
    Nähtus, mida on hakatud nimetama kvoorumi tunnetamiseks (quorum sensing; QS) või ka rakk-rakk (cell-to-cell) kommunikatsiooniks, põhineb bakterite võimel sünteesida, sekreteerida ja ära tunda teatud kindla struktuuriga madalmolekulaarseid ühendeid, mida on hakatud nimetama autoinduktoriteks (AI). Kui autoinduktori ekstratsellulaarne kontsentratsioon on saavutanud teatud kindla “kriitilise” väärtuse, indutseeritakse rakus signaali ülekande kaskaad , mis käivitab rakus mitmesugused füsioloogilised protsessid. Nende hulka kuuluvad näiteks virulentsusfaktorite produksioon, plasmiidi ülekanne konjugatsiooni protsessis. Gram(-) bakteritel on QS signaalmolekuliks tavaliselt atsüleeritud homoseriinlaktooni molekul (AHL). QS protsesis osalevad valgud, mis kuuluvad LuxI-LuxR valkude perekonda
  • Kirjeldage biofilmi moodustumise etappe . Biofilmi positiivsed ja negatiivsed mõjud inimese tervisele.
    Biofilmi moodustumises eristatakse 5 etappi:
    1. Pöörduv kinnitumine – niiskele pinnale kinnitunud bakterirakud on võimelised kas piilide või viburite vahendusel mööda pinda liikuma, kuid enamik selles etapis olevatest rakkudest pole veel otsustanud biofilmiks diferentseeruda ja võib pinnalt taas suunduda vabalt ujuva e. planktonraku elustiili juurde. Pinnaga esmase kontakti loomisel toimuvad geeniekspressioonis ulatuslikud muutused, mis kajastuvad ka bakteri fenotüübis. Näiteks Proteus mirabilis tunnetab pinnale kinnitumist sellega, et viburi pöörlemine on füüsiliselt takistatud (vibur on mehhanosensoriks) ning seeläbi vallandub rakus signaalikaskaad, mille tulemusena lühikesest, väheste viburitega liikuvast peritrihhist areneb 20-40 korda pikem, mitmete kromosoomidega ning enam kui 50 korda viburirikkam P. mirabilise voogav rakk.
    2. Pöördumatu kinnitumine – vastusena keskkonnast tulevale signaalile pärsitakse osadel voogajatel liikumine ja indutseeritakse eksopolüsahhariidide süntees, mis omakorda aitab tugevamalt pinnale kinnituda. Paljudes bakteriliikides on rakusisese signaalmolekuli tsüklilise di-GMP (c-di-GMP) tase oluliseks lülitiks 2 erineva eluviisi vahel. Suurem rakusisese c-di-GMP tase pärsib liikuvust ja virulentsust ning soodustab biofilmi teket. c-di-GMP sünteesitakse diguanülaattsüklaaside poolt (GGDEF domääniga valgud) ning lagundajateks on spetsiifilised fosfodiesteraasid (enamasti EAL-domääniga valgud). Paljudel neist valkudest on ka periplasmaatiline või tsütoplasmaatiline sensormoodul, mille vahendusel füsioloogilised ja/või keskkonna signaalid mõjutavad c-di-GMP kas üldist või lokaalset taset rakus.
    3. Mikrokoloonia moodustumine– pinnale kinnitunud ning eksopolüsahhariide tootva raku klonaalse paljunemise tulemusena tekib mikrokoloonia.
    4. Küps biofilm – mikrokoloonia areneb biofilmiks, mille polümeerses limamaatriksis paiknevad nii rakud kui ka avatud veekanalid struktureeritult. Mikrokolooniast biofilmi moodustumisel on oluline osa bakterirakkude hulga tunnetamisel (quorum sensing). Näiteks ramnolipiidide ajaliselt reguleeritud ekspressioon P. aeruginosas. Suuremas kui 20 µm-s P. aeruginosa mikrokoloonias lülitatakse hulga tunnetuse vahendusel sisse ramnolipiidide süntees, mis soodustab nii mikrokoloonia arengut, seenekujuliste struktuuride teket biofilmis, veekanalite püsimist avatuna biofilmi maatriksi küpsemise käigus, kui ka P. aeruginosa irdumist biofilmist.
    5. Biofilmist irdumine – Arvatakse, et tegemist on reguleeritud levimisstrateegiaga, mis võimaldab uute niššide koloniseerimist alustada varem kui toitained biofilmis limiteerivaks muutuvad. Näiteks on täheldatud, et mikroobide kasvamise käigus ärakasutatud söötmed indutseerivad rakkude irdumist samaliigilisest biofilmist (näidatud nii P. flurescensi kui P. aeruginosa puhul). Perioodiline biofilmist irdumine võib olla: 1) aktiivne protsess, mille käigus rakud vabanevad biofilmist üksikute planktonrakkudena ümbritsevasse keskkonda. Osadel bakteriliikidel (P. aeruginosa, Staphylococcus epidermidis jne.) on täheldatud biofilmi keskse osa muutumist vedelaks ja liikuvate planktonrakkude lahkumist sealt, jättes endast maha haigutava augu biofilmis. Biofilmi keskse osa vedeldumise põhjuseks arvatakse olevat profaagi aktivatsioonist põhjustatud osaline rakupopulatsiooni lüüs. 2) passiivne protsess, mille käigus biofilmist vabanevad EPS-ga ümbritsetud rakkude agregaadid. Rakuklompide vabanemise põhjusteks võivad olla nii muutused keskkonnategurites (nt. veekogu voolutugevuse muutus) kui ka biofilmisisestes protsessides, nt. EPS-i lagundavate ensüümide vabastamine biofilmi rakkude poolt. Nii biofilmist vabanenud üksikrakud kui ka rakuklombid võivad uutes toitaineterikastes kohtades taas pindadele kinnituda ja alustada uut biofilmi moodustumise protsessi.
  • Milleks on vajalikud ja kuidas mõjutavad inimest tema soolestikus elavad bakterid?
    Inimese immuunsüsteemi sõltuvus soolestiku mikrofloorast. Inimesel on 1013 oma rakku ja 1014 bakterirakku . Inimesed ja teised imetajad sünnivad küll bakteri-vabana kuid koloniseeritakse bakterite ja teiste mikroorganismide poolt kohe peale sündi. Bakteritele pakub inimese soleestik head elukeskonda, mis on stabiilse temperatuuriga ja toitaineterikas.
    Inimesel aga soodustab normaalne soolestiku mikrofloora seedekulgla epiteeli arengut, angiogeneesi (uute veresoonte tekkimist) ning kaitseb ka koekahjustuste eest. Soolestiku bakterid soodustavad toidu, eriti taimsete polüsahhariidide omastamist. Lisaks aitab seedekulgla koloniseerimine kasulike (kahjutute) bakterite poolt vältida koloniseerimist patogeensete bakterite poolt. Ka bakterite poolt sekreteeritavad antimikroobsed peptiidid võivad kaitsta inimeste patogeensete mikroorganismine eest. On nädatud et lisaks on bakterite olemasolu vajalik ka tasakaalustatud immunsüsteemi arenguks. On tõendeid, et normaalse sooletiku mikrofloora muutmine võib soodustada kindlate haiguste teket nagu näiteks soolevähk.
    Inimese soolestikus elavaid baktereid nimetatakse enamasti kommensiaalseteks (st. et sümbiootiline suhe on kindlasti kasulik bakterile kuid peremeesorganism ei pruugi kõigist nendest bakteritest kasu olla). Samas on paljud seni kirjeldatud suhted inimese ja tema soolestiku mikrofloora vahel mutualistlikkud. Probiootikumideks nimetatakse just neid baktereid, kes mõjuvad inimese tervisele positiivseid – suudavad takistada inimese nakatumist patogeensete bakteritega ning mõjutada immunsüsteemi.
    Kui suuresti toimub bakterite äratundmine inimese rakkude poolt bakterirakku pinnamarkerite (nagu lipopolüsahhariidid) poolt, siis teiseks oluliseks tunnuseks on ka bakteri poolt sekreteeritavad ühendid.
    Bakterite ja inimese (nagu ka teiste eukarüootide) vaheline suhtlus toimub ka hormoonide ja hormooni sarnaste keemiliste ühendite kaudu . Signaalmolekulide kaudu ei toimu suhtlus mitte ainult eukarüoodi ja mutualistlikke bakterite vahel vaid on näidatud, et ka patogeensed liigid suudavad neid signaale ära kasutada.
  • Kirjeldage erinevaid mutualistlikke suhteid eukarüootide ja bakterite vahel.
    Sümbioos on lai mõiste, mis tähistab erinevaid suhteid eri organismide vahel. Sageli peetakse sümbioosi all silmas vaid mutualismi – kahe erinevast liigist organismi kooselu, mis on mõlemale poolele kasulik. Tegelikult hõlmab sümbioosi mõiste suhteid, mis võival olla kummalegi osapoolele kahjulikud, kasulikud või neutraalsed ja mis võivad lisaks ka ajas muutuda. Interaktsioonid , mis on pikaajalised ja erinevad üksteisest selle poolest, et on eukarüoodile kas kasulikud või kahjulikud:
  • Prasitism – suhe, mis on bakterile kasulik ja peremeesorganismile kahjulik
  • Mutualism – suhe, mis on mõlemale interaktsioonipartnerile kasulik
    Sümbioos bakteritega esineb eukarüootidel erinevatest fülogeneetilistest gruppidest.
    Sümbioos peremeesorganismi ja ühe bakteriliigi vahe – need on lihtsamad ja seetõttu ka paremini uuritud.
    Sõltumata sellest, kas tegemist on horisontaalse või vertikaalse sümbiondi ülekandega, on sümbioos, kui ta on juba tekkinud, enamasti jääv (kestab kuni eukarüootse organismi surmani). Tavalised on interaktsioonid, kus bakter elab peremehe soolestikus ja viib läbi toidu lagundamist.
    Lisaks esineb aga teisigi huvitavaid mutualistlikke süsteeme:
    Kemosüntees. Kemoautolitotroofne bakter & Riftia pachyptila (rõnguss; hulkharjasuss) Ilma soole ja suuta hulkharjasuss Riftia pachyptila kirjeldati 1970 aastal Galapaagose riftil (rift – maakoore laamade piir; murranguvöönd) hürdotermaalsete lõõride läheduses (2,6 km sügavusel). Taolisi ilma soole ja suuta usse oli kirjeldatud juba varemgi, kuid ei seni ei olnud teada kuidas nad võiksid toitu omastada. R. pachyptila lähemal uurimisel selgus, et nad omastavad toitaineid endosümbiootilistelt bakteritelt. Histoloogiliste ja ensümaatiliste analüüside tulemusena selgus, et endosümbiontideks on väävlit oksüdeerivad kemolitoautotroofid. Endosümbiondid kasutavad redutseeritud väävliühendeid, mida on palju hüdrotermaalsete lõõride läheduses, CO2 fikseerimiseks, millest sünteesitud orgaanilisi ühendeid kasutab toiduks ka R. pachyptila.
    Bioluminessents. Vibrio fischeri & Euprymna scolopes (pisiseepia). Paljud meres elavad loomad omavad biolumisessentsi võimet ja vähemasti pooled neist toodavad valgust tänu sümbioosile bakteritega perekonnast Vibrio või Photobacterium. Kõige paremini uuritud sümbioos on bakteri Vibrio fischeri ja pisiseepia Euprymna scolopes vahel. Peremeesorganism E. scolopes on öise eluviisiga ja kasutab bakterite poolt toodetud valgust, selleks et kaitsta end kiskjate eest. Nimelt asub valgusorgan pisiseepia kõhupoolel ja helendus ei võimalda teda vastu kuuvalgust näha ja ähmastab tema varju. Koloniseerimise käigus toimub väga tihe suhtlus bakterite ja peremeesorganismi vahel mis võimaldab selekteerida meres olevate bakterite seast just V. ficheri kelle arvukus merevees on alla 0.1% kogu bakteriplanktonist.
    Aminohapete produtseerimine. Buchnera aphidicola & lehetäi. Eukarüootide metaboolne võimekus (erinevaid ühendeid lagundada või sünteesida) on enamasti tunduvalt madalam kui bakteritel. Arvatakse, et vähemasi 15-20% putukatest on metabolismil põhinevas sümbioosis bakteritega, ning see võimaldab neil kasutusele võtta ökoloogilisi nišše, mis on toitainete poolest väga ühekülgsed. Enamasti elavad endosümbionid spetsiifilises putuka rakkudes – bakteriotsüütides. Lisaks on sümbioos sageli obligatoorne mõlema partneri jaoks. Lehetäid toituvad taime floeemist, mis ei sisalda eluks vajalikke aminohappeid – neid toodavad aga endosümbiontsed bakterid. Sümbioos B. aphidicola ja lehetäi vahel on tekkinud 84-164 miljonit aastat tagasi, ning erinevad lehetäi liigid kannavad sama endosümbiondi liiki. Endosümbiont kandub järglastele edasi emaliini pidi nakatunud munade kaudu. Selle koevolutsiooni tulemusena on endosümbiondi (enterobakterite) genoom äärmiselt redutseerunud (keskmiselt 640 000 ap /600 geeni samas kui enim-uuritud enterobakteri E. coli genoom on umbes 10 korda suurem).
    Tselluloosi lagundamine. Protistidest ja bakteritest koosnev mikrofloora ja alamad termiidid . Termiidid on võimelised lagundama lignotselluloosi ( tselluloos , hemitselluloos, ligniin ), kuid seda vaid tänu nende soolestiku mikrofloorale. Ka termiidid ise produtseerivad tsellulaasi kuid lõplikuks lagundamiseks on vaja kogu soole mikrofloorat, kellest protistid (ainuraksed eukarüoodid) toodavad erinevaid tsellulolüütilisi ensüüme. Lisaks esineb termiidi sooles aga ka baktereid, kellest osad elavad vabalt ja osad on seotud protistidega. Protistidel esineb nii endo kui ektosümbionte, kes täidavad erinevaid funktsioone. Protisti pinnale kinnitunud spiroheedid on võimelised protisti liigutama kuid ei ole selge, kas protistid suudavad seda liikumist ka kontrollida (seega võib tegemist olla ka liikumis -sümbioosida).
    Lämmastiku sidumine- rhizobium ja mingi taim
    • .DOC Laadi alla originaalfail 37 lk · .doc · 150 allalaadimist
    Vasakule Paremale
    Eksam molekulaarbioloogia #1 Eksam molekulaarbioloogia #2 Eksam molekulaarbioloogia #3 Eksam molekulaarbioloogia #4 Eksam molekulaarbioloogia #5 Eksam molekulaarbioloogia #6 Eksam molekulaarbioloogia #7 Eksam molekulaarbioloogia #8 Eksam molekulaarbioloogia #9 Eksam molekulaarbioloogia #10 Eksam molekulaarbioloogia #11 Eksam molekulaarbioloogia #12 Eksam molekulaarbioloogia #13 Eksam molekulaarbioloogia #14 Eksam molekulaarbioloogia #15 Eksam molekulaarbioloogia #16 Eksam molekulaarbioloogia #17 Eksam molekulaarbioloogia #18 Eksam molekulaarbioloogia #19 Eksam molekulaarbioloogia #20 Eksam molekulaarbioloogia #21 Eksam molekulaarbioloogia #22 Eksam molekulaarbioloogia #23 Eksam molekulaarbioloogia #24 Eksam molekulaarbioloogia #25 Eksam molekulaarbioloogia #26 Eksam molekulaarbioloogia #27 Eksam molekulaarbioloogia #28 Eksam molekulaarbioloogia #29 Eksam molekulaarbioloogia #30 Eksam molekulaarbioloogia #31 Eksam molekulaarbioloogia #32 Eksam molekulaarbioloogia #33 Eksam molekulaarbioloogia #34 Eksam molekulaarbioloogia #35 Eksam molekulaarbioloogia #36 Eksam molekulaarbioloogia #37
    Punktid 5 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 5 punkti.
    Leheküljed ~ 37 lehte Lehekülgede arv dokumendis
    Aeg2014-01-14 Kuupäev, millal dokument üles laeti
    Allalaadimisi 150 laadimist Kokku alla laetud
    Kommentaarid 0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid
    Autor kj666 Õppematerjali autor
    Kontrollitud
    PDF TXT
    trans sünt transkriptsioon rakk geenid translatsioon regulatsioon ribosoom promootor polümeraas regulaator sekundaarstruktuur degradatsioon

    Sarnased õppematerjalid

    Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid
    91
    doc

    Bakterirakkude kasv ja seda mõjutavad tegurid

    1. Sissejuhatus Metaboolne ja geneetiline regulatsioon bakterites Bakterirakkude efektiivseks kasvuks on vaja, et kõiki raku põhilisi ehitusblokke ja nendeks vajalikke makromolekule produtseeritaks õiges vahekorras. Selleks, et sünteesi lõpp-produktide kontsentratsioon rakus liiga kõrgele ei tõuseks, on rakus välja kujunenud kaks kontrollmehhanismi: 1. Ensüümiaktiivsuse tagasisidestuslik inhibitsioon (feedback inhibition) ­ metaboolne regulatsioon 2. Ensüümi sünteesi repressioon ­ geneetiline regulatsioon Tagasisidestusliku inhibitsiooni tulemusena inhibeeritakse rakus juba olemasoleva ensüümi aktiivsus reaktsiooni lõpp-produkti poolt. Inhibitsiooni võib esile kutsuda ka teatav metabolismiraja vaheprodukt. Geneetilise repressiooni korral inhibeerib tavaliselt lõpp-produkt metabolismiraja esimese ensüümi sünteesi vastava geeni avaldumise pärssimise kaudu. Metaboolne regulatsioon tagasisidestusliku inhibitsiooni kaudu ja geneetiline regulatsioon ensüümi s

    Mikrobioloogia
    Mikroobifusioloogia
    147
    docx

    Mikroobifusioloogia

    4Mikroobifüsioloogia LOMR.03.022 Riho Teras Sisukord 1. Bakterite kasv ja toitumine................................................................................ 4 1.1. Bakterite kasvatamine laboritingimustes.....................................................4 1.2. Elutegevuseks vajalikud elemendid.............................................................7 1.3. Söötmed bakterite kasvatamiseks laboris....................................................9 1.4. Füüsikalis-keemilised tegurid, mis mõjutavad bakterite kasvu...................10 2. Bakterite ehitus ja rakustruktuuride funktisoonid.............................................15 2.1. Tsütoplasma komponendid.........................................................................16 2.1.1. Nukleoid............................................................................................... 16 2.1.2. Tsütoplasma ja inklusioonkehad...........................................................19

    Mikroobifüsioloogia
    Nimetu
    23
    docx

    Nimetu

    viimane veel eriti kondenseerunud vormiks ning lõpptulemus on metastaasi kromosoom. Kromatiini pakkimine: nukleosoomid koosnevad valgulisest tüvest, millele DNA on keermeliselt ümber keeratud, oktameerne tüvi koosneb iga histooni (H2A, H2B, H3 ja H4) kahest koopiast, 30-nm fiibrid, neis on nukleosoomid pakitud irregulaarse struktuurina või solenoidi struktuuri, H1, viies histoon, on solenoidi sisemuses otseses kontaktis DNAga, nii et iga H1 molekul on assotsieeritud ühe nukleosoomiga. Eu- ja heterokromatiin. Eukromatiin on ala, kus kromatiin on vähem kondenseerunud, annab värvimisel heledaid vööte, suurem osa transkriptsioonist toimub eukromatiini piirkondades. Heterokromatiin on ala, kus kromatiin on rohkem kondenseerunud, annab värvimisel tumedaid vööte, esineb sagedamini tsentromeeride piirkonnas ja telomeeride aladel. Kromatiid. Iga metafaasi kromosoom koosneb kahest tsentromeerile kinnitunud tütarkromatiidist. 9

    Kategoriseerimata
    Rakubioloogia II
    94
    docx

    Rakubioloogia II

    Valgusünteesi etapid eukarüoodi rakus. Transkriptsiooni algatamine, Cap-struktuuri lisamine,mRNA ahela pikendamine, splaissing, mRNA lõikamine, polüadenüleerimine, mRNA sünteesi lõpetamine, mRNA tuumast välja eksport, mRNA lagundamine, Valgusünteesi algatamine, Valgusünteesi lõpetamine, valkude kokkupakkimine, Valkude lagundamine Signaalide ülekanne rakkudes. Rakku saabuvate ja rakus levivate signaalide integreeritus. Intratsellulaarne retseptro molekul kinnitub retseptor valgule, edasi toimub signaali edasikanne intratsellulaarsete signaalvalkude kaudu, kuni signaal jõuab märklaud valguni ning toimub muutus metabolisimis, geeni ekspressioonis või raku kuju muutus ning liikumine Rakkude reageerimine väljast tulevatele signaalidele. Rakk jääb ellu,jaguneb, differentseerub või sureb Rakkudevahelise signaali ülekande viisid. Endokriinne signaliseerimine (hormooni sekreteerimine verre)Parakriinne signaliseerimine-

    Rakubioloogia
    Molekulaarbioloogia teise KT vastused
    8
    doc

    Molekulaarbioloogia teise KT vastused

    ­ introni 5' otsa lahtilõikamine, mille tagajärjel introni ees olev ekson lahutatakse ülejäänud mRNA järjestusest. Introni 5' ots keeratakse aasana tagasi ja ühendatakse introni sees olevasse kindlasse järjestusse nukleotiidiga A, mis asub 18-38 nukleotiidi introni algusest 3' suunas. 2 etap ­ introni 3' otsa lahtilõikamine, mille tulemusena intron vabaneb pre mRNA koosseisust. 3 etap ­ allesjäänud eksonite alad ühendatakse ligaaside abil ning tekib ainult eksonitest koosnev mRNA molekul. Intronid degradeeritakse. 36. U snRNAd osalevad pre-mRNA splaisingu regulatsioonis: 5 snRNPd: U1, U2, U4, U5, U6. 37. GT-AT reegel ­ on selline vaatlus, et kõik intronid DNAs algavad GT nukleotiitudega (guaniin, tümiin) ja lõppevad AG nukleotiitidega (adeniin, guaniin). Kui DNA on transkribeeritud RNAsse, intronid on eemaldatud RNAst mehaniismi abil, mis tunneb ära neid nukleotiitide alguseid ja lõppe ­ RNAs nad oleksid CU (tsütosiin, uratsiil) ja AC (adeniin, tsütosiin). 39

    Molekulaar - ja rakubioloogia loengud
    MOLEKULAARBIOLOOGIA-ja RAKUBIOLOOGIA
    54
    pdf

    MOLEKULAARBIOLOOGIA ja RAKUBIOLOOGIA

    1 MOLEKULAARBIOLOOGIA. 1. Kui aatom loovutab elektroni täielikult teisele aatomile, missugused keemilise sidemega on tegemist? Ioonside, sellised ained lahustuvad hästi, kuna ioonide hüdratatsioonienergia on suurem kui kristalli võreenergia 2. Miks vesi on hea lahusti (solvent)? Vesi on hea lahusti, sest ta lahustab nii tahkeid, vedelaid kui ka gaasilisi aineid. Vee molekul moodustab dipooli ning aatomid omandavad osalise laengu. Polaarsete ühenditega moodustab vesiniksidemeid, mis tagavad stabiilsust. 3. Termodünaamika II seadus. Kõik protsessid kulgevad tasakaalu e. minimaalse potentsiaalse energia poole e. entroopia kasvu suunas. Entroopia (S) on korrastamatuse mõõt [J/mol*K], korrastatud ­ madal entroopia. Isoleeritud süsteemid püüavad korrastatud olekust korrastamata poole. Tasakaal on siis, kui entroopia on maksimaalne.Entroopia muutus on

    Molekulaar - ja rakubioloogia loengud
    Molekulaarbioloogia
    194
    docx

    Molekulaarbioloogia

    2) RNA protsessimine ja transport. Aktiivne protsess ja väga täpselt kontrollitud 3) mRNA lagundamine - mRNA eluiga on oluline. Kui seda ei lagundata, siis saab tema arvelt sünteesida palju komponente. Valk titiin (kõikidel selgroogsetel olemas) – vajatakse varajases embrüonaalses arengus, esimest korda vajatakse blastulas. Sünkroonjagunemine toimub kiiremini (valk valgus sünteesitakse), mRNA jõutakse valmis sünteesida ja rakku transportida, aga ei jõuta lõpuni transleerida. Titiini molekul ise on väga pikk (mitukümmend AH pikk) - jääb titiin poolikuks, sest mRNA 3 lagundatakse enne mitoosi käigus. Kui rakutsükkel pikeneb, saavad titiini molekulid valmis. 4) translatsioon – mRNA struktuur ja regulaatorvalgud ja RNA-d 5) valgu modifitseerimine ja lokalisatsioon – erinevatel modifitseerivatel valkudel eri roll 6) valgu eluiga (N-terminaalne reegel) – valke sünteesitakse tohutult palju, aga kui

    Bioloogia
    Geneetika eksam
    69
    pdf

    Geneetika eksam

    (viiruse kapsiidi struktuurvalk)​ ja pol ​(pöörtranskriptaas/integraas)​ ​geenidele​. Ty1 element on leitud pagaripärmist ​(saccharomyces cerevisiae);​ Ty element on 5,9 kb pikkune, sisaldab 340 bp pikkuseid LTR-e. Tekitab transpositsioonil 5 bp pikkuseid otsekordusjärjestusi. Pärmi genoomis on leitud 35 koopiat Ty elementi. TyA ja TyB (pöördtranskriptaas ehk revertaas, mis sünteesib Ty elemendi RNA-lt dsDNA)​ on ​gag​ ja ​pol geenide homoloogid. DNA molekul inserteerub genoomi, tekitades sel viisil Ty1 elemendi koopia genoomi teises piirkonnas. Ty moodustab viiruselaadseid partikleid. Retroposoonid: Äädikakärbses on kirjeldatud F, G ja I retrosposonid. Imetajatel on levinud ​LINE-d​ ​(long inserted nuclear elements, 6-7 kb).​ ​Retroposoonide otstes pole LTR-e, kuid nende ühes otsas on homogeenne A:T aluspaaridest koosnev järjestus​. ​A:T järjestus liitub retroposooni

    Kategoriseerimata


    Rohkem sarnaseid



    Meedia

    Vasakule Paremale

    Kommentaarid (0)

    Kommentaarid sellele materjalile puuduvad. Ole esimene ja kommenteeri



    Kõik kommentaarid



    Info
    K & V
    Mäng
    Eraõpetajad
    Meist
    Kuidas saada punkte?
    KKK
    Reklaam
    Uudistevoog
    Sitemap
    Kontakt
    Saada kiri
    kiri@annaabi.ee
    Telefon: +372-569-80010
    Aadress: Tiskrevälja 33, Tallinn
    OÜ LOLSOL. Registrikood: 11450433
    Kasutustingimused
    Privaatsustingimused
    Sõnastikud
    Inglise Soome Saksa Vene Hispaania Prantsuse Rootsi Itaalia Ladina Taani Esperanto
    Püsiühendus(es)
    Facebook Instagram Twitter Reddit
    Sellel veebilehel kasutatakse küpsiseid. Kasutamist jätkates nõustute küpsiste ja veebilehe üldtingimustega Nõustun