toimub lahtikeerdumine. Energia tuleb ATPst. ATP hüdrolüüs põhjustab konformatsioonilisi muutusi helikaasis DNA primaas seob järgnevalt helikaasi, nii et moodustub primosoom Primaas sünteesib väikese, 1012 RNA, millele DNA polümeraas hakkab sünteesima juurde nukleotiide Polümeraas III lisab nukleotiide 5' 3' suunas mõlemal ahelal, alustades RNA praimerist RNA praimer hiljem eemaldatakse ja asendatakse DNA polümeraasiga. Vahemik siilitakse ligaasi poolt. Üheahelaine DNA stabiliseeritakse kogu protsessi vältel spetsiaalse valguga Replikatsiooni mudel E. coli Replikatsioon on juhtahelal pidev, vastasahelal katkendlik Replikatsiooni kahvlis despiraliseerumine ühesuunaline Ahelad on vastaspolaarsed, DNA polümeraas töötab aga vaid 5' 3' suunas See probleem on lahendatud eri ahelatel erinevalt.
mahajäävat ahelat replikatsioonikahvli liikumise suunas pidevalt sünteesida. Mahajääv ahel sünteesitakse katkendlikult - fragmentide kaupa. * DNA fragmentide süntees mahajääval õlal Mahajääv ahel on DNA kaksikheeliksi ahel, millel replikatsioonikahvel liigub 5'-3' suunas. Selle tõttu ei saa mahajäävat ahelat replikatsioonikahvli liikumise suunas pidevalt sünteesida. Mahajääv ahel sünteesitakse fragmentide kaupa. Algsele DNA ahelale liidetakse RNA praimer ning uut ahelat sünteesitakse vastupidiselt replikatsioonikahvli liikumise suunale. Praimer eemaldatakse (prokarüootides DNA polümeraas I poolt) ning RNA molekulid asendatakse DNA molekulidega. Toimub uue RNA praimeri liitumine ning järgmise fragmendi süntees. Neid lõike nimetatakse Okazaki fragmentideks ning need liidetakse DNA ligaasi poolt, et saada terviklik DNA ahel. Algsele DNA ahelale liidetakse RNA praimer ning uut ahelat sünteesitakse
Sarnasus: nukleiinhapped, fosfaatrühm, komplementaarsusprintsiip Erinevus: erinevad suhkrujäägid, DNA molekul on pikem 3)Replikatsioon – eesmärk, - päriliku info jõudmine kõikidesse rakkudesse ja selle edasiandmine järglastele sisu, - DNA-ahela kopeerimine enne raku jagunemist. tulemus,- DNA replikatsioon on DNA süntees, mille tulemusena saadakse igast algsest DNA molekulist kaks koopiat. osalevad molekulid, - DNA polümeraas osalevad nukleotiidid, - Praimer osalevad ensüümid, - DNA helikaas, DNA ligaas toimumiskoht. - Replikatsioon toimub raku tuumas. 4)Miks peab replikatsioon algama mitmest kohast korraga? 5)Transkriptsioon – eesmärk - päriliku info avaldumine sisu, - kantakse geneetiline informatsioon DNA-lt RNA-le tulemus - Tulemuseks DNA molekuli ühe järjestusega komplementaarne RNA molekul osalevad molekulid, : DNA, RNA osalevad nukleotiidid, DNA, RNA osalevad ensüümid: RNA polümeraas toimumiskoht
Universaalne-koodoni ja aminohapete vastavus on reeglina sama kõikides organismides. Degeneratiivne- enamikel juhtudel on üks aminohape kodeeritud mitme erineva koodoniga. Hormonaalse signaali sekundaarse ülenaknda funktsioon: aktiveerib või inibeerib tsütoplasmas või tuumas kulgevaid protsesse.Translatsioon-mRNA molekuli nukleotiidi järjestuse tõlkimine polüpeptiidiahela aminohaooejärjestusse. Okazaki fragnendid-replikatsioonil mahajääva ahela lõigud, mis hiljem ühendatakse. Praimer- u 10 nukleotiidine fragment uuest DnA lõigust, millest hakatakse edasi DNA d sünteesia. RNA polümeraas-seondub DNA promootorpiirkonnaga ja sünteesib DNA-ga komplementaarse RNA molekuli. Pöördtranskriptsioon-informatsiooni liikumine vastassuunas RNAlt-Dna le.
kandjaMobiilne DNA- DNA, mis saab ringi liikuda genoomi siseselt: transposoomid (retro-, DNA transposoomid, lisajärjestused), plasmiidid, bakteriofaagid, II rühma intronid. Transkrip Faktor- tugeva seostumisvõimega valgud st järjestusspetsiifiline DNAd siduv valök . vabastavad DNA keerulisest kromatiidsest koostisest. NMD ebakorrektselt splaisitud mRNA de lagundamine(kui stop koodon asub enne viimast ekson-ekson liidest) PTC-enneagne stopp-koodon. praimer -lühike oligonukleotiid, mille külge DNA polümeraas DNA replikatsiooni ajal kinnitubHAT- histoon atsetüül tansferaasidel on võime panna atsetüülrühm histooni N terminuse külge. Vähendavad interaktsiooni DNA ja histooni vahel. Soodustavad teiste valkude DNA pol ligipääsemist. HDAK- deatsetülaasid. Lõikavad atsetüülrühmas lüsiini jääkide küljest ära ja pärsivad aktiivust, fosfolüreelivad histooni. Promootor- TATA elementi sis geeni ala. Koht kuhu seondub RNA polümeraas
ühte, see on liiderahelat, saab pikendada jätkuvalt teist, see on viivisahelat saab pikendada RNA primerite ja spetsiaalse ensüümi, praimaasi, abil Sünteesi tagajärjel tekivad viivisahelal lühikesed DNA fragmendid, mida nimetatakse Okazaki fragmentideks. Viivisahela sünteesimine DNA praimaas sünteesib DNA järjestuse pealt lühikese RNA praimeri DNA polümeraas jätkab DNA sünteesi - moodustub Okazaki fragment eesolev RNA praimer asendatakse DNA-ga Okazaki fragmentide katkekohad liidetakse DNA ligaasi abil Okazaki fragmentide sünteesiks on vajalik ensüüm- DNA praimaas, mis sünteesib nn. praimeri - lühikese RNA oligonukleotiidi. Praimaasi töö tulemusena moodustub DNA-RNA hübriidahel, kus uuesti sünteesitud RNA aluspaarid on seotud DNA aluspaaridega vesiniksideme kaudu. Praimaas jätab vaba 3’-OH otsa- see on edasiseks sünteesiks vajalik. DNA replikatsiooni protsess
- annealing 15. Millist kliinilist materjali saab kasutada PCR meetodil haigustekitaja tuvastamiseks?- röga, lima, seemnevedelik (DNA) 16. Millised on etapid haigustekitaja tuvastamiseks kliinilisest materjalist PCR meetodil?-algmaterjalisd DNA eraldamine ja puhastamine; PCR reaktsioon; restriktsioon; tulemuste visualiseerimine geelelektroforeesil 17. Nimeta PCR jaoks vajalikud komponendid?- DNA->praimerid->nukleotiidid->ensüüm Taq-> puhver ja MgCl 18. Mis on praimer ja milleks seda vaja on?- 15-30 nukleotiidi pikk üheahelaline DNA lõik; vajalik komplementaarsuse tõttu saavad seonduda uuritava DNA molekulile ja selle tähistada 19. Mille poolest erineb multiplex PCR tavalisest PCR-ist?-sama PCR ajal kasutatakse mitut praimerite paari, mitme erineva mikroobi tuvastamiseks samast DNA proovist 20. Mille poolest erineb real-time PCR tavalisest PCR-ist?- võimaldab hinnata algmaterjali kogust, nt. DNA koopia arvu meid huvitavas lookuses
Didesoksüribonukleotiid – eelmisest ühe hapnikuaatomi võrra vaesem ühend. Komplementaarsus – lämmastikaluste kindel üksteisele vastavus. • Uuritav DNA • Desoksüribonukleotiidid • Didesoksüribonukleotiidid (ddA,ddT,ddC,ddG) nt fluorestseeruva värviga märgitud • DNA polümeraas jt ensüümid, nt helikaasid jm, mis tekitavad DNA üksikahelad 13. PCR (polümeraasne ahelreaktsioon) - kuidas toimub, mida tarvis? Praimer. Tuubis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat), DNA-polümeraas, oma DNA lahus, praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema “otsaga”. Tuub pannakse 3 tunniks PCR-masinasse. PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele Tulemus: uuritavaid DNA-lõike on paljundatud vähemalt 30 miljonile. Nii suurt kogust saab näha geelelektroforeesil.
punasilmsuse geen. GM taimed: kahjuritele vastuvõtmatud kultuurtaimed nt. banaan, riis, kartul. GM loomad: sead, lambad, kodulinnud, pärdikud, kalad, putukad: lehmapiima toitainetesisalduse tõstmine, kanamunades kasvajavastsed valgud, malaariatekitaja vastaseid valke tootvad putukad, tõstetud kokaiinisisaldusega kokapuu Kolumbias. 5. PCR (polümeraasne ahelreaktsioon) - kuidas protsess toimub, mida tarvis, mis on millegi ülesanne? Praimer. Vt üldist, kogu materjali esitlust ja õp lk 52-53) 6. Isiku molekulaarbioloogiline tuvastamine, DNA sõrmejälgede metoodika. Polümorfsed markerid; Tandem(kordus)järjestus (STR) ja SNP (ühenukleotiidne erisus/varieeruvus). Konspekt + Õp lk 50 - 56. Tuvastamine: vt vihikust STR, SNP jms. 7. Transgeensed organismid, GMO (geneetiliselt muundatud organismid - õp lk 38-46), positiivsed küljed ja ohud. (vt üldine, kogu materjali esitlus). Geneetiliselt muundatud
● Lehmapiima toitainesisalduse tõstmine ● Kanamunades kasvajavastased valgud ● Malaariatekitaja vastaseid valke tootvad putukad ● Probleem: tõstetud kokaiinisisalduse kokapuu Kolumbias ● Tubakataimed ‘’söövad’’ lõhkeaineid ● Valgesilmsele äädikakärbsele punasilmsuse geen ● Bioplaste lagundavad bakterid 5. PCR (polümeraasne ahelreaktsioon) - kuidas protsess toimub, mida tarvis, mis on millegi ülesanne? Praimer. Vt üldist, kogu materjali esitlust ja õp lk 52-53) POLÜMORFISM- mitmekujulisus, varieeruvus isenditi. PCR- laialdaselt kasutatav meetod mingi kindla DNA lõigu paljundamiseks. Mitmeetapiline DNA süntees, kus eelnevates etappides sünteesitud ahelad on aluseks uute ahelate tootmisele järgnevates etappides. ● Paljundamine toimub eksponentsiaalselt: 2,4,8,16,32,64,128 PCR-i VAJALIKUD KOMPONENDID: ● uuritav DNA, mille piirkonda soovitakse paljundada
võrra. Paljundatakse pikast DNA molekulist korduvalt ainult mingit konkreetset lõiku. Taoline DNA paljundamine tänu erilistele praimeritele → pikemat tüüpi DNA fragmendid. Kasutatakse kokku kahte praimerit (täpsemalt kahte eri järjestusega praimerit, mõlemat lisatakse reaktsioonisegusse väga suurtes kogustes), mille järjestus ja seondumiskohad DNA ahelale on meile teada. Nendest praimeritest üks seondub DNA kaksikheeliksi ühele ahelale ja teine praimer teisele praimerile, nõnda piiritledes ära selle DNA lõigu, mida tahad paljundada. PCR käigus viiakse DNA süntees läbi keskmiselt 20-40 korda järjest. Iga sünteesireaktsioon moodustab ühe “PCR tsükli”. Tsükkel koosneb sisuliselt kindlatest temp-muutustest, mis korduvad ja kus kindla temp. Juures leiab aset kindel osa DNA sünteesi reaktsioonist. Klassikaliselt koosneb 1 tsükkel kolmest erinevast protsessist kolmel erineval temp- il: 1
GAAGTGTAATCCTGTTTTAGTATCAGTCAGCATATGAGAAGAATGCCCATAGGATT CAAAAAACATAGCTTCCTTCCACTGATATTGCTGCCCTGAAAGTTCAAGATATATA CTTTTCTCAATCAGGTTTCTCTGGAAAGCCTCATACACGGTCAATTCTGATCCTGT TTTAGTATCTACTACAGAAATTCTATGTGTTTTCTTGACATTGAGATTGGAAAT GAA TTC AAA TCT GAA TTC GTC GAC AAGCTTCTCGAGCCTAGGCTAGCTCTAGACCACACGTGTGGGGGCCCGAGCTCGCGGCC GCTGTATTCTATAGTGTCACCTAAATGGCCGCACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTC GTGACT LEGEND Kodeeriv ala on boldis ja allajoonitud Esimene aminohape Reverse praimer Forward praimer Vektori järjestus Milliseid programme kasutasin? Bioedit näitas sekveneerimise tulemusi, leidsin sealt usaldusvahemikud ja hindasin sekventsi kvaliteeti. BLAST andis nukleotiidse järjestuse põhjas vastava geeni ja seejärel vaatasin mis pidi insert on sisenenud, kas on gapse ja mutatsioone. 15 Mis juhtub kui proovid ühes reaktsioonisegus kahe praimeriga korraga sekveneerida?
mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Näitab mis järjestus DNA-s on. DNA polümeraas pikendab olemasolevat DNA ahelat, kuid selleks et DNA polümeraas saaks DNA- le kinnituda on vaja RNA molekule (praimerid), mis on komplementaarsed DNA molekuliga. Praimeri abil toimub ka sekveneerimine, sest siis on erinevate DNA molekulide algused samad. Milline meetod on reaalaja PCR? Reaktsiooni segusse pannakse täiendav praimer, mis jääb polümeerile ette. Selle küljes on floresents. Kui polümeraas teeb praimeri katki tekib floresentsi signaal, mille järgi saab teada et toimub DNA süntees. DNA küljes on floresents, kui tuleb polümeraas lükkab ta floresentsid lahti ja tekib värv. Praimerite vahel on kolmas praimer mille otsad on keemiliselt plokeeritud, ja selle küljes on floresseeruv molekul, kui polümeraas teeb praimeri katki tekib värv.
spetsiifilise oligonukleotiid proovi a) Keskel b) 3' otsas c) Ühe koodoni kaugusel 3' otsast d) 5' otsas 17. Kui soovite sisestada DNA-sse teatud mutatsiooni PCR-i reaktsiooni käigus, siis millises PCR-i praimeri otsas võite antud muudatuse teha: a) Praimeri 5' otsas b) Praimeri 3' otsas 18. Milline järgnevatest komponentidest ei ole vajalik DNA sekveneerimiseks ensümaatilisel (Sanger'i) meetodil? a) Dideoksüterminaatorid b) Praimer c) DNA polümeraas d) Kõik siintoodud komponendid on vajalikud e) ATP, CTP, GTP ja TTP 19. Kuriteopaigalt avastatakse verine nuga, mille külge on kleepunud paar juuksekarva. Millist meetodit kasutatakse juuksekarvast pärineva DNA paljundamiseks, et saada seda uurimiseks piisavas koguses: a) Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) b) DNA kloonimist plasmiidi ja paliundamist bakterite abil c) DNA keemiline süntees d) Western blot 20
mis osalevad organismi tunnuste kujunemises Kromosoomid koosnevad DNAst ja sellega seotud valgumolekulidest Mis on replikatsioon? Replikatsioon on DNA kahekordistumine enne raku jagunemist. tulemusena saadakse ühest DNA molekulist kaks ühesuguse nukleotiidse järjestusega DNA molekuli. Replikatsiooni etapid: 1. Ensüüm helikaas lõhub vesiniksidemed lämmastikaluste vahel ja keerab kaksikspiraali lahti Praimer - lühike (DNA või RNA) järjestus, mis on komplementaarne DNA järjestusega. 2. Ensüüm DNA-polümeraas seondub DNA ahelaga (vajab töö alustamiseks praimerit, millele saab lisadavesimese nukleotiidi) -> sünteesib mõlema DNA ahelaga komplementaarsed uued DNA ahelad Okazaki fragmendid - lühikesed DNA jupid, millest pannakse kokku ahel, mis on komplementaarne DNA replikatsioonil mahajäävale ahelale DNA ligaas - ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad (Okazaki fragmendid) 3
Semikonservatiivne: moodustunud kahes DNA-s üks ahel on uus ja teine vana (leidis ka hiljem kinnitust, et see on õige). Dispersiivne: Mõlema DNA tütarahelad koosnevad uutest ja vanadest DNA segmentidest. 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. DNA helikaas katalüüsib kaksikahela eraldumist, nii et tekib üksikahel. Replikatsioon saab toimuma hakata kindlatest piirkondadest – ori-regioonid. Seejärel on vaja sünteesida praimer, mida teeb kas primaas või RNA polümeraas. Praimerit on vaja, sest DNA polümeraas saab sünteesida ainult olemasolevat ahelat - praimer on selleks algeks. Praimeri külge kinnitub DNA polümeraas. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? Pol I ja Pol II – DNA reparatsioon Pol III – põhiline süntees
bidirektsionaalselt ehk mõlemas suunas). Originid on tavaliselt A-T rikkad (sisaldavad palju adeniini- tümiini aluspaare) ja aitavad sellega lahtikeerdumisele kaasa, sest A-T aluspaaridel on kaks vesiniksidet(mitte kolm, nagu C-G paaridel). Seega on A-T sidemeid lihtsam lõhkuda, sest väikesema arvu vesiniksidemete lõhkumise jaoks kulub vähem energiat.[5] Pärast DNA ahelate eraldamist luuakse algahelatele RNA praimerid. Juhtivale DNA ahelale sünteesitakse üks RNA praimer aktiivse origini kohta, mahajäävale ahelale sünteesitakse aga mitmeid praimereid, neid nimetatakse avastaja järgi Okazaki fragmentideks. DNA polümeraas pikendab juhtivat ahelat pidevalt, mahajäävat ahelat aga fragmentide kaupa. RNaas eemaldab replikatsiooni initsiatsiooniks kasutatud RNA praimerid, ning teist sorti DNA polümeraas liitub ahelatega, et täita sünteesimata fragmente. Pärast seda liitub DNAga
REPLIKATSIOON Replikatsiooni lähtepunkt (origin) DNA piirkond, kus toimub pöördumine biheeliks mõttelise telje ümber ja ahelate lahtikeerdumine (despiraliseerumine). Eukarüootse DNA replikatsioon algab üheaegselt mitmest lähtepunktist. Replikatsiooni hark replitseeruva DNA Y- kujuline piirkond, kuhu seostuvad komplementaarsed nukleotiidid ja kus formeeruvad uued ahelad. Lähteained Nukleosiidtrifosfaadid dATP,dGTP, dTTP, dCTP, DNA sablonahel (template standart), RNA-praimer oligonukleotiid (4...60 nukleotiidi). Ensüümid ja katalüüsitavad protsessid. Helikaas DNA biheeliksi despiralisatsioon, DNA-polümeraasid polünukleotiidahelate süntees 5' 3' suunas (seotakse ühe nukleotiidi 3'-OH ja teise 5'- P). DNA-primaas oligonukleotiidse RNA-praimeri süntees. DNA-ligaas mahajääva ahela fragmentide ühendamine. Kuna uute polünukleotiidahelate süntees toimub 5' 3' suunas, siis üks ahel kasvab pidevalt juhtiv ahel (leading strand), teine
DNA replikatsioon o o Replikatsioonikahvel (DNA ahelad lahus) DNA topoisomeraasid (muudavad DNA spiralisatsiooni) DNA helikaasid (teevad ahelad lahti) SSB valgud (kaitsevad üksikahelalist DNA-d) o Ahelate eristamine Liiderahel (pidev süntees DNA püolümeraas III- abil) Mahajääv ahel (moodustub praimosoom, süntees fragmentidena) Okazaki fragmendid o RNA praimer (sünteesitakse RNA polümeraasiga) o DNA polümeraas III (viib läbi DNA matriitssünteesi) DNA fragmentide ühendamine o DNA polümeraas I (RNA lõigatakse välja ja tühik sünteesitakse täis) o DNA ligaas (ühendab fragmendid ligeerimisel) o o Esineb DNA polümeraas III kaks katalüütilist tsentrit, kus replitseeritakse DNA liiderahel ning mahajääv ahel.
vabastab superspiralisatsiooni. Initseeriv valk ja DNA helikaas seonduvad DNAga replikatsiooni kahvlis ja toimub lahtikeerdumine. Energia tuleb ATPst. ATP hüdrolüüs põhjustab konformatsioonilisi muutusi helikaasis. DNA primaas seob järgnevalt helikaasi, nii et moodustub primosoom. Primaas sünteesib väikese, 10-12 RNA, millele DNA polümeraas hakkab sünteesima juurde nukleotiide. Polümeraas III lisab nukleotiide 5' 3' suunas mõlemal ahelal, alustades RNA praimerist. RNA praimer hiljem eemaldatakse ja asendatakse DNA polümeraasiga. Vahemik säilitakse ligaasi poolt. Üheahelaine DNA stabiliseeritakse kogu protsessi vältel spetsiaalse valguga. Kui replikatsioonikahvel kogu aeg avaneb, siis ühe DNA ahela süntees on pidev ehk toimub kogu aeg. Teisel juhul läheb ta kahvlist eemale ja on teistpidi (süntees toimub väikeste fragmentidega, mis omavahel pandakse kokku). Ahelate peal DNA süntees ongi erinev oma mehhanismilt
DNA-ahelalt on sünteesitud uus DNA molekul. DNA replikatsiooni komponendid Replikatsioonikahvel (DNA ahelad lahus) DNA topoisomeraasid (muudavad DNA spiralisatsiooni) DNA helikaasid (teevad ahelad lahti) SSB valgud (kaitsevad üksikahelalist DNA-d) Ahelate eristamine Liiderahel (pidev süntees DNA püolümeraas III- abil) Mahajääv ahel (moodustub praimosoom, süntees fragmentidena) Okazaki fragmendid RNA praimer (sünteesitakse RNA polümeraasiga) DNA polümeraas III (viib läbi DNA matriitssünteesi) DNA fragmentide ühendamine DNA polümeraas I (RNA lõigatakse välja ja tühik sünteesitakse täis) DNA ligaas (ühendab fragmendid ligeerimisel) 3. Transkriptsioon RNA nukleotiidne järjestus on määratud geeni ühe DNA ahela järjestusega RNA transkript on DNA-lt maha loetud Algne mRNA on pre-mRNA. Pre-mRNA modifitseerimine (Vt geeni struktruur) mRNA-s on informatsioon polüpeptiidi sünteesiks
(vaba 3’ otsaga nukleotiidide ahelat) 4) Primaas sünteesib praimeri ahela 3’ otsale 15. Miks toimub mahajääval ahelal DNA süntees katkendlikult? Sest replikatsiooni kahvel liigub 5’ →3’ suunas, polümeraas ei oska vastupidises suunas nukleotiidahelat sünteesida. Polümeraasil on vaja vaba 3’ hüdroksüülrühma, mille külge haakuda 1) Viivisahelal on ahela ühes otsas RNA praimer ja teises otsas sünteesib DNA primaas uue RNA praimeri. 2) DNA polümeraas seondub uuele RNA praimerile ja sünteesib Okazaki fragmendile uue DNA ahela kuni vana DNA praimerini 3) Eksonukleaasidega eemaldatakse RNA praimer ja asendatakse okazaki fragmendiga 16. Imetaja DNA replikatsiooni kahvel Inimese rakutuumas sünteesitakse juhtiv ja mahajääv ahel Pol α ja Pol δ abil ning mitokondris Pol γ abil
WHO soovituste kohaselt tuleks läkaköha seroloogiliseks diagnoosimiseks kasutada ainult paaris-seerumeid. CDC seevastu aga ei tunnista seroloogilisi meetodeid läkaköha laboratoorse kinnitusena, sest need meetodid ei ole standarditud. PCR-TEST. Meetodi peamiseks eeliseks on kiirus ja kõrge tundlikkus. Enam kasutatud on IS481, läkaköha toksiini (PT) promootorpiirkonna (ptxA-Pr) ja pertaktiini geeni praimer. Proovi võtmisel PCRiks tuleb kasutada polüestertampooni, mis asetatakse pärast proovi võtmist kuiva steriilsesse proovinõusse ja säilitatakse kuni laborisse saatmiseni külmkapis +40C juures. Materjal peaks jõudma laborisse 48 tunni jooksul. 22 Corynebacterium spp. Üldiseloomustus Siia kuulub suur grupp grampositiivseid liikumatuid eosteta pulkbaktereid. Esinevad sageli inimese ja loomade organismis ning taimedel.
Ühest DNA molekulist kaks ühesuguse nukleotiidse järjestusega DNA molekuli. Järgnevalt sünteesitakse interfaasi ajal transkriptsiooni käigus rakutuumas olevalt DNA-lt mRNA. mRNA liigub tsütoplasmas paiknevatesse ribosoomidesse, kus translatsiooni tulemusena saadakse valgud. 8. DNA replikatsioon DNA kahekordistamine. Teostab ensüüm DNA polümeraas. Süntees toimub praimeri ja matriitsi olemasolul. Esmalt DNA helikaas lahutab kaheahelaline DNA. Praimer on vaba 3’OH rühmaga nukleotiidjärjestus, millelt alustatakse matriitsahela alusel DNA süntees. 3’OH otsa lisatakse sünteesil desoksüribonukleotiidid (5’fosfaat). 3’OH ja 5’ fosfaadi vahele tekib fosfodiesterside. Süntees toimub 5’-3’ suunas. DNA replikatsioon on kahesuunaline. Ühelt ahelalt toimub pidev süntees st juhtiv ahel (süntees toimub 5’3’ suunas, vaja ühekordselt praimerit). Mahajääv ahel sünteesitakse Okazaki
mudel). DNA replikatsiooni initsiatsioon · spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide ori regioonide olemasoluga. vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees (praimerit on vaja selleks, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide). · Vajalik ka AT-rikas regioon ja teatud DNA järjestused Replikatsioon toimub interfaasis Praimer - uue ahela algus · Lühike oligonukleotiidi (DNA või RNA) järjestus, mis on komplementaarne DNA järjestusega. · Vajalik DNA ahela sünteesi alustamiseks, sest polümeraasil on vaja vaba 3'-OH otsa. DNA helikaas - Eraldab DNA ahelad teineteisest. DNA topoisomeraasid - katalüüsivad DNA ahelatesse ajutisi katkeid, et ei tekiks super- keerde. Superkeerd takistaks replikatsiooni jätkumist. Okazaki fragment - katkendlikult, lühikeste fragmentidena sünteesitav DNA
4.5) PCR on eksponentsiaalne. Mitu DNA fragmenti on teoreetiliselt võimalik saada ühest DNA molekulist 5, 15, 30 tsükliga? 5 tsükliga-32 15- 215 30- 230 Praktikas tunduvalt vähem. 14 Töö nr 5: Rekombinantse DNA sekveneerimine ,,DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit" abil. Lähteained: Rekombinantne, inserti sisaldav DNA (~100 ng/l) T7 RNA polümeraasi promootori praimer (100 ng/l) "Sequencing reagent premix" (Amersham), sisaldab fluorestsents-märgitud nukleotiide, puhvrit ja Taq polümeraasi (hoida jääl!) vt lisa. ja www aadress: http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/us81050pl_rev_c.pdf 75% isopropanool 99% formamiidi 5 mM EDTA-Na2 lahus. Töö käik: (1) PCR tuubis sega kokku järgmine reaktsioonisegu (nn Mastermix, võib olla valmis tehtud juhendaja poolt): 1,5 l H2O 0,5 l 10x reaktsiooni-puhvrit kokku 4 l
Nukleiinhapete sünteesi suund ja nukleiinhapete sünteesi läbiviivad ensüümid. · Nukleiinhappeid sünteesitakse 5' -> 3' suunas. Fosfodiesterside moodustub ahela viimase nukleotiidi 3'-OH rühma ja lisanduva nukleotiidi 5' süsinikuga seotud fosfaadi vahele. · Ensüümid, mis viivad läbi nukleiinhapete sünteesi: DNA polümeraas sünteesib ühele DNA ahelale komplementaarse DNA ahela; vajab praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga (praimer lühike oligonukleotiid DNA või RNA ahel) RNA polümeraas sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA; seondub spets. promootorjärjestusega ; praimerit pole vaja Pöördtranskriptaas ehk revertaas sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA; vajab sünteesil praimerit · Muud ensüümid: DNA helikaas katalüüsib DNA ahelate üksteisest eraldumist
Tulemusena tekib mõlemale DNA üksikahelale komplementaarne ahel. 4) Eelpoolmainitud etappe (tsükleid) korratakse 20–30 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule. 18. Millist polümeraasi kasutatakse PCR protseduuril ja miks? Mikroorganismist Thermus aquaticus pärit DNA Taq polümeraasi, kuna see on kuumale vastupidav ning ei denatureeri 94º C juures. 19. Mis on praimerid? 15-25 nukleotiidi pikkused komplementaarsed oligonukleotiidid, mida kasutatakse PCR-is. Praimer on lühike (tavaliselt umbes kümme aluspaari pikkune) nukleiinhappe lõik, mis on DNA replikatsiooni alguskohaks. 20. Kes töötas välja PCR meetodi? 2:2-3. PCR meetodi leiutas 1983 Kary Mullis. 21. Mis on geel-elektroforees ja milleks seda kasutatakse? 2:11-15. Elektroforees on meetod mis võimaldab eri tüüpi molekule üksteisest lahutada järgnevate karakteristikute järgi: elektriline laeng, suurus, kuju. Geel-elektroforeesi kasutatakse DNA molekulide isoleerimiseks. Geeliks
4.5) PCR on eksponentsiaalne. Mitu DNA fragmenti on teoreetiliselt võimalik saada ühest DNA molekulist 5, 15, 30 tsükliga? Ühest DNA molekulist on võimalik saada 5 tsükliga 2 5 fragmenti, 15 tsükliga215 fragmenti ja 30 tsükliga 230 fragmente. 11 Töö nr 5: Rekombinantse DNA sekveneerimine ,,DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit" abil. Lähteained: Rekombinantne, inserti sisaldav DNA (~100 ng/l) T7 RNA polümeraasi promootori praimer (100 ng/l) "Sequencing reagent premix" (Amersham), sisaldab fluorestsents-märgitud nukleotiide, puhvrit ja Taq polümeraasi (hoida jääl!) vt lisa. ja www aadress: http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/us81050pl_rev_c.pdf 75% isopropanool 99% formamiidi 5 mM EDTA-Na2 lahus. Töö käik: (1) PCR tuubis sega kokku järgmine reaktsioonisegu (võib olla valmis tehtud juhendaja poolt): 1,5 l H2O 0,5 l 10x reaktsiooni-puhvrit kokku 4 l
Reaalselt on sel vähe kasutusvõimalusi. DGGE Spetspraimerid, mille otsas on GC-clamp'id, mille sulamistäpid on arvutatavad. Amplifitseeritakse kontroll- ja uuritav proov. Produkt hakkab denatureeruma (uurea vmt toimel) erinevates piirkondades sõltuvalt mutatsiooni olemasolust. Keemiline RNAas vahendatud: üks praimeripaar on biotiiniga märgistatud. Kui tekib heterodupleks ja seal on mullike (mittepaardumine)....(?) Kui on fluorestseeruv praimer, saame lisapiigi. Valgu lühenemise test: Stoppkoodonite tuvastamiseks. In vitro translokatsioon. Tohutult suure geeni korral kasutada hoopis RNAd, sest see on palju lühem. Tehakse sealt cDNA, kasutatakse praimereid, kus on promootoralad (nt sp6) sellised cDNAsid saab in vitro transleerida/transkribeerida. Multipleks PCR skriining: Näeb, kui suur ala erinevatel patsientidel geenist kadunud on. 16. Dünaamiliste mutatsioonide tuvastamine
mahajääva ahela sünteesina. 102. Replikatsioon eripära kahel erineval ahelal. Telomeeride replikatsioon. Replikatsiooni eripära kahel erineval ahelal. Ühe DNA ahela süntees on pidev, teise ahela süntees katkendlik. Ahelad peavad mõlemad sünteesima suunaga 5'-3', info loetakse aga suunas 3'-5'. Pidevalt sünteesival ahelal on lihtne protsess ja liiderahelal on see pidev. Mahajääval ahelal toimub süntees aga fragmentidena, et säilitada sünteesi suund. 1 RNA praimer on piisav liiderahela pidevaks sünteesiks. Mahajääval ahelal on RNA praimer vajalik iga Okazaki fragmendi sünteesil. 103. DNA õige lugemine (proofreading). Korrektuur. DNA info lugemine käib suunas 3'-5'. DNA õige lugemise korral on võimalik vead parandada. 3'-5' eksonukleaasne aktiivsus (sünteesimine toimub suunaga 5'-3'). 104. Replikatsiooni vereva ratta mudel. Ringikujulise DNA korral: replikatsioon algab DNA järjestusspetsiifilise endonukleaasi toimel.
seosed (ahelad) geenide aju ja käitumise vahel 289. Käitumisgenoomika: Ülalt-alla lähenemine- geenidelt käitumisele, selgitab kuidas kogu organism käitub 290. DNA sekveneerimine: meetod, millega määratakse nukleiinhapete nukleotiidne järjestus ja polüpeptiidide aminohappeline järjestus, A. Sama DNA-järjestuse saamine plaatgeeli autoradiograafial ja fluorestsentsmärkega automaatsekveneerimisel, B. DNA radioaktiivse või fluorestsentsmärgistuse viisid: 1) märgistatakse praimer; 2) märgistatud dNTP; märgistatud ddNTP, C. Automaatsekveneerimine. Andmete automaatsalvestus toimub skaneeriva laseri, fluorestsentsdetektori ja arvuti abil. 291. PCR reaktsioon: kindla DNA järjestse amplifikatsioon in vitro tingimustes, mis toimub paljukordse denaturatsiooni, oligonukleotiidsete praimerite hübridatsiooni ja polünukleotiidi sünttesi tsüklite tulemusel 292. Kontiigid: DNA kattuvad alad (segmendid) või kogum kattuvaid kloone, mille põhjal saab moodustada DNA
11,3 µl MQ vett 2,4 µl 2mM dNTP 2 µl polümeraasi puhvrit, mis sisaldab erinevaid sooli 2 µl 25mM MgCl2 (Mg2+ on polümeraasi kofaktoriks, samuti praimer-DNA seondamise stabilisaatoriks) 1 µl DstFlin forward praimeri 1 µl DstRlin reverse praimeri 0,2 µl template-DNAd – L-Desmo pEGFP-C2, mis on 335 bp pikk.
ning moodustub kaks Y-kujulist struktuuri e replikatsioonikahvlit - DNA topoisomeraasid (muudavad DNA spiralisatsiooni - DNA helikaasid – teevad ahela lahti - SSB valgud – kaitsevad üksikahelalist DNAd Ahelate eristamine - Liiderahel – pidev süntees DNA püollümeraas II abil - Mahajääv ahel – moodustub parimosoom, süntees fragmentidena - Okazaki fragmendid – RNA praimer, DNA polümeraas III - DNA fragmentide ühendamine – DNA polümeraas I, DNA ligaas 11.Transkriptsioon - RNA nukleotiidne järjestus on määratud geeni ühe DNA ahela järjestusega - RNA transkript on DNAlt maha loetud - Algne mRNA on pre-mRNA - Aju töötab väikeste RNAdega - mRNAs on info polüpeptiidi sünteesiks - Transkriptoom 12.Geneetiline kood
Juhtiv ahel on DNA ahel, millel replikatsioonikahvel liigub 3’-5’ suunas. See võimaldab komplementaarse ahela sünteesi 5’-3’ suunas. Juhtival ahelal "loeb" DNA polümeraas DNAd pidevalt ning liidab pidevalt ka uusi nukleotiide. Mahajääv ahel on DNA kaksikheeliksi ahel, millel replikatsioonikahvel liigub 5’-3’ suunas. (DNA polümeraas sünteesib uut ahelat ainult 5’-3’ suunas). Mahajääv ahel sünteesitakse fragmentide kaupa. Algsele DNA ahelale liidetakse RNA praimer ning uut ahelat sünteesitakse vastupidiselt replikatsioonikahvli liikumise suunale. Praimer eemaldatakse ning RNA molekulid asendatakse DNA molekulidega. Toimub uue RNA praimeri liitumine ning järgmise fragmendi süntees. Neid lõike nimetatakse Okazaki fragmentideks ning need liidetakse DNA ligaasi poolt, et saada terviklik DNA ahel. 4
Aktiveerib DNA primaasi. 2) SSBs – üheahelalise DNA-ga seostuvad valgud, kaitsevad lahtist DNA-d, et muu sinna ei seostuks ja et seda ära ei Dnaasitaks. Seondub kohe üheahelalise DNA-ga ja ei lase ahelatel kokku minna. 3) Topoisomeraasid – kompenseerivad DNA topoloogilisi pingeid, „vedru“ pingest vabaks. Eemaldab supervindid. 4) DNA primaas – ensüüm, mis sünteesib DNA replikatsiooni praimereid, DNA sünteesil on selleks RNA (esineb RNA praimer). DNA primaas toodab RNA praimerei DNA jaoks. Ajab SSBs-id ära ja sünteesib RNA praimeri replikatsiooni alguspunkti. Liitub üheahelalisele DNA-le. Sinna peab pärast DNA polümeraas II holoensüüm seonduma. Tekib nii peaaegu valmis kompleks, mis on valmis DNA-d sünteesima. Peavad veel lisanduma sliding DNA clamp (libisev klamber), mis võtab DNA ringi sisse ja moodustab DNA ringi. 5) DNA polümeraasid – DNA sünteesi läbiviiv ensüüm. Sünteesib 5’→ 3’ suunas uue
replikatsioon on blokeerunud DNA kahjustuste tõttu.Neil puudub vigu korrigeeriv aktiivsus. 52)DNA replikatsioon juhtivalt ja mahajäävalt ahelalt. Juhtiv ahel on see millel pidev DNA süntees toimub 5'->3' suunas kasvava DNA ahela puhul.Mahajääv ahel pikeneb 3'->5' suunas ,toimub tegelikult 5'->3' süntees aga katkendlikult,lühikeste fragmentidena, mida nim. Okazaki fragmentideks. Sünteesi alustamiseks on vajalik 3'OH praimer(juhtiva ahela süntees vajab praeimerit ainult replikatsiooni alguspunktis.Okazaki fragmentide initsiatsiooniks on vaja valkkompleksi praimosoom.Praimosoom koosneb DNA helikaasist ja primaasist.DNA helikaas keerab lahti DNA kaksikahela ja primaas sünteesib praimeri.Topoisomeerid teevad ahelatesse ajutisi katkeid et soodustada DNAahelate lahtikeerdumist.Replisoom on replikatsiooni aparaat, mis koosneb DNA polümeraas III
koos vanad ja teises uued ahelad. Semikonservatiivne matriitsiks on mlemad DNA ahelad; mõlemas DNA molekulis on üks ahel uus ja teine vana. Dispersiivne mõlemas DNA molekulis sisaldavad DNA ahelad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest. Kinnitust leidis semikonservatiivne mudel. 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. DNA repl algab ori järjestuselt, kus toimub DNA ahelate lahtikeerdumine ja praimeri süntees. Praimer (võib olla nii DNA kui RNA) on vajalik selleks, et DNA polümeraasil oleks vaba 3' ots, kuhu nukleotiide liitma hakata. DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni teoimel või spetsiifiliste initsiaatorvalkude toimel. Kuna AT vahel on üks vesinikside, on neid piirkondi lihtsam avada ning ori-regioonid on alati AT-rikkad. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus?
Eemaldab fosfaadi. Sellega on võimalik tekkinud glükoosi transport vere kaudu teistesse kudedesse. Lihaskoes puudub glükoos-6-fosfataas, seega on glükoos-6-fosfaat lihasrakkudes kinni ja glükoosi verre ei saadeta. 7. Võrrelge erinevusi glükogeeni lagundamisel ja sünteesil. Kujutage UDP-glükoosi struktuur ja selgitage mis on selle ühendi funktsioon. UDP-glükoosi süntees UDP-glükoosi fosforülaasi reaktsioonis. Glükogeeni sünteesiks on vajalik praimer (glükogeniin või glükogeeni fragment). C-4 on ahela mitteredutseeriv ots, kuhu uued glükoosi jäägid alati lisatakse. Reguleeritud ensüüm: glükogeeni süntaas. (UDP-glükoos substraadiks). Lagundamine ei ole lihtsalt sünteesi pöördprotsess. Glükogeen G1P. Degradeeritakse glükoosi ahelaid mitteredutseerivast otsast kuni igale ahelale jääb enne hargnemist 4 glükoosi jääki. Hargnemised
mõlemas suunas). Originid on tavaliselt A-T rikkad (sisaldavad palju adeniini-tümiini aluspaare) ja aitavad sellega lahtikeerdumisele kaasa, sest A-T aluspaaridel on kaks vesiniksidet (mitte kolm, nagu C-G paaridel). Seega on A-T sidemeid lihtsam lõhkuda, sest väiksema arvu vesiniksidemete lõhkumise jaoks kulub vähem energiat. Pärast DNA ahelate eraldamist luuakse algahelatele RNA praimerid. Juhtivale DNA ahelale sünteesitakse üks RNA praimer aktiivse origini kohta, mahajäävale ahelale sünteesitakse aga mitmeid praimereid, neid nimetatakse avastaja järgi Okazaki fragmentideks. DNA polümeraas pikendab juhtivat ahelat pidevalt, mahajäävat ahelat aga fragmentide kaupa. RNaas eemaldab replikatsiooni initsiatsiooniks kasutatud RNA praimerid, ning teist sorti DNA polümeraas liitub ahelatega, et täita sünteesimata fragmente. Pärast seda liitub DNAga ligaas, mis
kahes suunas, moodustub kaks Y-kujulist struktuuri. Osalevad ensüüm helikaas ja ensüüm DNA-polümeraas. 12. Okazaki fragmendid, fragmentide ühendamine Okazaki fragment (ingl. Okazaki fgragment)- DNA-sünteesil DNA-viivisahelal sünteesitud fragment (prokarüootidel 1000–2000 ja eukarüootidel 100–200 bp), mis koosneb lühikesest RNA praimerist ja järgnevast DNA-polünukleotiidist. Okazaki fragmendid: RNA praimer (sünteesitakse RNA polümeraasiga) ja DNA polümeraas III (viib läbi DNA maatritssünteesi) DNA fragmentide ühendamine: DNA polümeraas I (RNA lõigatakse välja ja tühik sünteesitakse täis) ja DNA ligaas (ühendab fragmendid ligeerimisel) 13. Histoonide tüübid Histoonid on väiksed aluselised valgud (koosnevad 102–135 aminohappest), mida leidub eukarüootide tuumas.[1] Need on põhilised kromatiini valgud, mille ümber keerdub DNA ja need
Eksonukleaasid- lagundavad RNApraimeri DNA topoisomeraasid- keerab DNA ahela replikatsiooniks lahti DNA liider- ja viivisahela sünteesi erinevus. DNA polümeraasi liikumise suund. Okazaki fragmentide olemus ja funktsioon- Kuna viivisahela suund on 3´5´ suunaga,siis DNA polümeraas ei saa sinna koheselt uut ahelt sünteesida. DNA praimaas sünteesib RNA praimeri 5´3´ suunaga,sinna kinnitub DNA polümeraas ja sünteesib Okazaki fragmendi. Sünteesitud RNA praimer lagundatakse eksonukleaaside poolt ja Okazaki fragmendid seotakse ligaasi poolt. DNA liider- ja viivisahela sünteesi alustamine. Prereplikatiivses kompleksis asuvate alguspunkti äratundva kompleksi ja helikaaside fosforüülimine kui replikatsiooni algatamise eeltingimus eukarüootides. Raku G1 faasis tekib prereplikatiivne kompleks replikatsiooni origin punkti.See tagab selle, et igat replikatsiooni alguspunkti aktiveeritakse ainult üks kord rakutsükli jooksul. Uut
Replikatsioon. B19 replitseerub mitootiliselt aktiivsetes rakkudes, eelistab erütroidse raja rakke (luuüdi, lootemaks, leukeemia). Seostub erütrotsüüdi P-grupi antigeeniga, internaliseerub, uncoating, üheahelaline DNA tuuma. Komplementaarse ahela tekitamiseks on vajalikud faktorid, mida leidub ainult mitoosi S-faasis, ning raku DNA polümeraasid. Kummaski nüüdseks kaheahelalise DNA otsas paiknevad kordusjärjestused voltuvad tagasi, hübridiseeruvad genoomiga. Tekib praimer raku DNA polümeraasi jaoks, DNA replitseerub. Viirusvalgud sünteesitakse tsütoplasmas, liiguvad sealt tuuma, kus virion kokku pakitakse. Tuuma- ja tsütoplasmamembraan degenereerub, viirus vabaneb raku lüüsil. Patogenees. Levib hingamis- või suusekreetidega. Infitseerib mitootiliselt aktiivseid erütroidprekursoreid luuüdis, põhjustab lüütilist infektsiooni. Tekitab ulatusliku vireemia, võib läbida platsentat. Profülaktikaks ja haiguse paranemiseks vajalikud antikehad
saab pikendada RNA praimerite ja spetsiaalse ensüümi praimaasi abil. Süntees toimub 3’-5’ suunas (fragmendid sünteesitakse 5’ - 3’ suunas). 18. Kuidas sünteesitakse liiderahel ja viivisahel Liiderahela sünteesimine - katkematult 1 praimeriga Viivisahela sünteesimine - DNA praimaas sünteesib DNA järjestuse pealt lühikese RNA praimeri. - DNA polümeraas jätkab DNA sünteesi- moodustub Okazaki fragment. - Eesolev RNA praimer asendatakse DNA-ga. - Okazaki fragmentide katkekohad liidetakse DNA ligaasi abil. 19. Mis on Okazaki fragment ja millest ta koosneb? Okazaki fragmendid on lühikesed DNA fragmendid, mis tekivad sünteesi tagajärjel viivisahelal. Koosneb RNA praimerist ning järgnevast DNA polünukleotiidist. Need lõigud liidetakse DNA ligaasi poolt ja saadakse teine DNA ahel. 20. Milline ülesanne on DNA praimaas ensüümil? Mida teeb replikatsioonis DNA ligaas?
Ka RecA enda tase tõuseb rakus 50 korda. SOS vastusena käivitub DNA reparatsioon (rekombinatsiooniline reparatsioon), SOS mutagenees (Pol V poolt läbiviidav) ning alternatiivne DNA replikatsioon. SOS vastuse käigus indutseeritakse E. coli rakkudes DNA polümeraasid Pol II, Pol IV ja Pol V. Pol IV ja Pol V viivad DNA sünteesi läbi vigaderohkelt. DinB e. DNA polümeraas IV Pol IV-l puudub "proofreading" aktiivsus ning ta on võimeline jätkama DNA replikatsiooni olukorras, kus praimer ei ole DNA-ga täies ulatuses paardunud (misaligned primer/template structures). Kui matriitsahel on näiteks järjestusega 3´CAAGGGCCCAA ja DNA süntees lähtub sellega komplementaarselt praimerilt 5 ´GTTCCG, kus üks komplementaarne C nukleotiid praimeri 3´otsas on puudu, tekib sünteesitavasse DNA ahelasse 1-nukleotiidne deletsioon. Pol IV bioloogiliseks funktsiooniks on jätkata DNA replikatsiooni kohalt, kus DNA polümeraas III kompleks on peatunud
mitokondriaalse DNA replikatsiooniga. ja osalevad tuuma DNA reparatsioonil. E. coli DNA polümeraas I Esimene DNA in vitro süntees viidi läbi 1957. a. Arthur Kornbergi laboris, kasutades E. coli DNA polümeraasi I. DNA polümeraasi I (Pol I) on seetõttu nimetatud ka Kornbergi ensüümiks. DNA replikatsioon toimus keskkonnas, kuhu olid lisatud desoksüribonukleosiid trifosfaadid, Mg 2+ ioonid, paljundatav DNA ja vaba 3'-OH otsaga oligonukleotiid - praimer, mis oli komplementaarne piirkonnaga matriitsina kasutavast DNA ahelast. DNA polümeraas I katalüüsis fosfodiestersideme moodustumise praimeri 3'-OH rühma ja DNA ahelasse lülitatava nukleotiidi 5'-fosfaadi vahel. Nukleotiidide lülitumist 62 DNA ahelasse testiti sel viisil, et kasutati 32P-ga märgistatud nukleotiide ja pärast reaktsioonisegu
mitokondriaalse DNA replikatsiooniga. ja osalevad tuuma DNA reparatsioonil. E. coli DNA polümeraas I Esimene DNA in vitro süntees viidi läbi 1957. a. Arthur Kornbergi laboris, kasutades E. coli DNA polümeraasi I. DNA polümeraasi I (Pol I) on seetõttu nimetatud ka Kornbergi ensüümiks. DNA replikatsioon toimus keskkonnas, kuhu olid lisatud desoksüribonukleosiid trifosfaadid, Mg2+ ioonid, paljundatav DNA ja vaba 3'-OH otsaga oligonukleotiid - praimer, mis oli komplementaarne piirkonnaga matriitsina kasutavast DNA ahelast. DNA polümeraas I katalüüsis fosfodiestersideme moodustumise praimeri 3'-OH rühma ja DNA ahelasse lülitatava nukleotiidi 5'-fosfaadi vahel. Nukleotiidide lülitumist DNA ahelasse testiti sel viisil, et kasutati 32P-ga märgistatud nukleotiide ja pärast reaktsioonisegu inkubeerimist 30 minutit 37°C juures sadestati nukleiinhape happelises keskkonnas, (mis saavutati
annaabi.ee 
