ALUSELISE FOSFATAASI ENSÜÜMIKINEETIKA PROTOKOLL Koostanud: LUISE TIKS YASB61 112332 SISSEJUHATUS Aluseliseline fosfataas on laia substraatspetsiifilisusega fosfomonoesteraas, mille poolt katalüüsitavaid reaktsioone võib üldistatult esitada järgimise võrrandiga: R O PO3 2- + H2O = R- OH + HPO4 2- R tähistab mitmeid erinevaid ühendeid, nagu mono-, oligo- ja polüsaahariidid, mono-, oligo ja polünukleotiidid jt. Aluselised fosfataasid on looduses laialt levinud, kuid tavaliselt isoleeritakse seda ensüümi E.colist või veise soolestikust
Proteaas, mis lõhub valke. Seda kasutatakse liha pehmendamiseks, kala nülgimiseks, loomanahalt karvade eemaldamiseks ning pesupulbrite koostisosana. Markerensüümid Markerensüümid on olulised haiguste kindlakstegemisel. Kui markerensüüm ilmub verre, on tegu vastava koe kahjustusega, kust ensüüm pärit on. Tähtsamad markerensüümid on: kreatiini kinaas (CK), laktaadi dehüdrogenaas (LDH), aspartaadi aminotransferaas (AST), alaniini aminotransferaas (ALT), aluseline fosfataas (ALP), happeline fosfataas (ACP), plasma koliini esteraas (PChE). vm - maksimaalne substraadi kontsentratsioon reaktsiooni kiiruses. Km- michaelise konstant (mol/l) G- gibsi vabaenergia Reaktsiooni kiirust saab muuta: substraadi kontsentratsiooniga, ensüümi kontsentratsiooniga, temperatuuriga Allosteeriline ensüüm- Inhibiitorid- ained, mis võimaldavad vähendada reaktsiooni kiirust (pidurdavad reaktsiooni) · Konkureeriv inhibiitor (max kiirus jääb samaks)
4. Kirjelda järgnevate ensüümide funktsiooni: Pöördtranskriptaas:sünteesib DNA kasutades RNA ahelat Terminaalne deoksünukleotiid transferaas (TDT): Katalüüsib pöördumatu dNTP lisamine DNA 3' otsa hüdroksüül-rühma peale. Kasutatakse radioaktiivseks märgistamiseks, kloonimisel (RACE tehnika), et lisada homopolümeersed osad DNA molekuli 3' otsale kloonimiseks. Alkaalne fosfataas ,,BAP": bakteriaalne alkaalne fosfataas, mis eemaldab 3´ ja 5´ fosfaatrühmad DNAst ja RNAst. Tähtis roll kloonimisel: defosforüülib 5´-fosforüülitud otsa selleks, et takistada vektori ise-ligeerimist. BAP aktiivne 65°C juures for at least 1 h ja seda inaktiveeritakse phenol extraction. Alkaalne fosfataas ,,CIP": fosfataas, mis eemaldab 3´ ja 5´ fosfaatrühmad DNAst ja RNAst. Hüdrolüüsib NTPd ja dNTPd. Kasutatakse kloonimisel, et vältida korduvat
· Teatud kudede, organite kestev hüpoglükeemia teke · Laktoosi süntees piimanärmetes · Vastsündinute elulemus (aju/maks Glc tarbimise kõrge suhe, seoses tagasihoidliku glükogeenivaru ja ketokehade limiteeritud produktsiooniga Möödaminekud (energeetiliste takistuste kõrvaldamine ja glükoosi lõhustumise võimaldamine): Pyr muundamine PEP-ks Fru-1,6-bisP defosforüülimine Fru-6-P-ks Glc-6-P defosforüülimine Glc-ks (Glc-6-fosfataas) Biomolekulid Laktaat (Glc-laktaat ringlus maksa ja lihaste vahel) Alaniin (Glc-Ala ringlus maksa ja skeletilihaste vahel) Aspartaat (glükoneogeneesi substraat) Glükogenees- glükogeeni süntees Etapid: Glc aktiveerimine Glc-6-P-ks (UDP-glükoos) Ahelate pikendamine sidemete (1,4) abil (glükogeeni süntaas) Hargnemispunktide loomine (1,4) abil (glükosüül (4:6) transferaas) Glükogenolüüs- glükogeeni lõhustamine Ahelate lühendamine (1,4) abil (glükogeeni fosforülaas)
ensüümide abil lagundab ja teiselt poolt istuvaid näärmeid, mille ülesanne on toitaineid vastu võtta ja mis mõnel liigil ka puuduvad. Väikesed loomad, enamasti putukad, keda suhkrut sisaldav nõre ligi meelitab, jäävad seda puudutades sinna kinni, sest kleepuv lima ei võimalda neil edasi liikuda. Nad kas surevad kurnatusse või lämbuvad püdela nõre kätte, mis nõrgub õhusoontesse ja need ummistab. Samal ajal eritab taim ensüüme (näiteks esteraas, peroksidaas, fosfataas ja proteaas), mis saaklooma aeglaselt lagundavad ja temas sisalduvaid toitaineid vabastavad. Istuvad näärmed resorbeerivad need toitained ning kasutavad neid taime kasvamiseks.Kogu püügilehe liikuvus on liigiti erinev. Huulheina perekonnas on arvukalt lehekujusid, mis võivad olla väga erinevad. Lehed võivad olla leherootsuga või ilma. Kõige ebatavalisem (väga haruline) kuju on kaheldamatult liigi Drosera binata lehel. Õied,viljad ja seemned:
Koensüümid: toamiin pürofosfaat, flaviin-adeniin-dinukleotiid, nikotiinamiid adeniin-dinukleotiid (NAD), koensüüm A, püridoksaalfosfaat, biotsütiin, tetrahüdrofolaat,lipoaat. Kofaktorid- mõned ensüümid, mis sisaldavad või vajavad funktsioneerimiseks teatud aatomeid või ioone. või tsütokroomoksüdaas, katalaas, peroksüdaa. -tsütokroomoksüdaas. - süsihappe anhüdraas, alkoholdehüdrogenaas. - heksodinaas, glükoos-6-fosfataas, püruvaatkinaas. -arginaas, ribonukleotiidreduktaas. -püruvaatkinaas. -ureaas. Mo- dintrogenaas. Se- glutatioonperoksüdaas. Oligosahhariidid: maltoos, sahharoos, tsellobioos Lipiidid: mõiste ja jaotus. Lipiidid on rasvad ja rasvataolised ained, mis on lähedaste füsikokeemiliste omadustega (kuid võivad olla erineva keemilise struktuuriga). Lahustumatud vees, kuid hea lahustuvus orgaanilistes lahustites: benseenis, dietüüleetris, triklorometaanis jne. selle
Tsüstiline fibroos on kõige sagedasem eluiga lühendav geneetiline haigus. Haigus algab tavaliselt lapseeas ning raskete vormide puhul on haigete eluiga lühike. Põhjuseks on geenidefekt 7 kromosoomi pikal õlal. Kujuneb välja hingamisteede ahenemisest põhjustatud hingamishäire. Keskmine eluiga on 31 aastat. Diagnoos ja ravi Haigust saab kindlaks teha ka enne sündi: raseduse esimesel kolmandikul uuritakse lootevees spetsiaalset markerit (alkaalne fosfataas), mille sisaldus on tsüstilise fibroosi esinemise puhul vähenenud. Ravi hõlmab hingamisteede topistumise (ahenemise) vältimist ning infektsiooni ennetamist. Tõsiste kopsufunktsioonihäirete puhul on näidustatud hapnikravi. Kasutatakse ka hormoonravi, ibuprofeeni (oletatavalt aeglustab kopsude funktsiooni halvenemist) ning hingamisteede infektsioonide raviks antibiootikume. Edu on saavutatud ka südame ja kopsu või kahe kopsu siirdamisel.
Kalgend moodustub kaseiini isoelektrilises punktis (pH 4.6) (hüdrofoobsete interaktsioonide tõttu). Happekalgendis on vähe kaltsiumit jt mineraale, need vabanevad mitsellidest vesifaasi - vadakusse. Happekalgendi abil toodetakse näiteks kohupiima ja hapupiimatooteid. Põhilised vadakuvalgud piimas on β-laktoglobuliin (~50%) ja α-laktalbumiin. Väiksema osa moodustavad immunoglobuliinid, rasvagloobulite membraanivalgud ja ensüümid: hüdrolaasid (plasmiin, lipoprotein-lipaas, aluseline fosfataas, lüsotsüüm) ja oksüdaasid (laktoperoksüdaas, ksantiinoksüdaas, katalaas). Natiivses olekus ei assotsieeru vadakuvalgud omavahel ega teiste valkudega. Kuumutamisel üle 60°C vadakuvalgud denatureeruvad ja seonduvad kaseiinidega, muutes mitselli struktuuri ja suurendades tema veesidumisvõimet. See on soovitav näiteks jogurti valmistamisel (tugevam geel ja väiksem sünerees, kuid vastunäidustatud juustu tootmisel (nõrk kalgend).
2 trüpsiin Katalaas maks 7.3 Ribonukleaas pankreas 7.8 Arginaas maks 9.7 Aluseline fosfataas E. coli 9.8 1.5 7.5 pH
Näide neli: Atrofeeruvates rakkudes lüsosomaalsed ensüümid ei seedi enam lipiide ja nende näol kuhjub lipofustsiin, mis on seedimatu materjal. Lüsosoomid on oma kuju ja suuruse poolest heterogeensed organellid. Ühes rakus on neid tüüpiliselt kuni paarsada. Neid on kerge identifitseerida tsütokeemiliselt, tuvastades neis teatud kindlate ensüümide olemasolu. Enamlevinud marker-ensüüm, mis esineb kõikides lüsosoomides on happeline fosfataas. Lüsosoomide heterogeensus peegeldab nende funktsioonide mitmekesisust, mida täidavad temas leiduvad happelised hüdrolaasid (väliskeskkonnast tulevate osakeste lagundamine, raku enda vanade komponentide lagundamine, fagotsüteeritud mikroorganismide seedimine) Hüdrolaasid, aga peavad enne kuidagi sinna lüsosoomi pääsema, et täiendama hakkata. Need pääsevad lüsosoomidesse, sest lüsosoomidesse liikuvad valgud on märgistatud sahhariidse jäägi küljes oleva Man-6-P-ga
toimuv reaktsioon, mis kulgeb rakus pöörduvates tingimustes. Sama ensüüm katalüüsib ka glükoneogeneesi pöördreaktsiooni. Fosfoglütseraadi kinaasi ja 1,3BPG-ga on erütrotsüütides assotseerunud oluline reaktsioon, mida katalüüsib bisfosfoglütseraadi mutaas. Reaktsiooni tulemusel moodustub 2,3-bisfosfoglütseraat (2,3BPG), oluline hemoglobiini ja hapniku vahelise kompleksi moodustamise allosteeriline regulaator. 2,3-bisfosfoglütseraadi fosfataas degradeerib 2,3BPG 3-fosfoglütseraadiks, mis on tavaline glükolüüsi raja vaheühend. Seega opereerib 2,3BPG shunt 1 ATP ekvivalendi kulutamise arvel ühe tsüklit läbiva trioosi kohta. Protsess ei ole füsioloogilistes tingimustes pööratav. 8, 9. Fosfoglütseraadi mutaas ja enolaas Glükolüüsi järelejäänud osas konverteeritakse suhteliselt madala energiaga 3PG kui fosfoatsüülester kõrge energiasisaldusega molekuliks ja seotakse fosfaat ATP kujul.
Co Vitamiin B12 koostises 6. Vitamiinid: A-retinool, D-kaltsiferool, E-tokoferool, B1-tiamiin, B2-riboflaviin, B5- pantoteenhape, B6-püridoksiin, B12-kobalamiin, H-biotiin, PP-nikotiinhape, C-askorbiinhape 7. Ensüümid: 1. Oksüdoreduktaasid: Laktoperoksüdaas denatureerub temperatuuril 80°C Katalaas denatureerub temperatuuril 75°C Reduktaas piimabakterite sünteesitud 2. Hüdrolaasid: Aluseline fosfataas inaktiveerub temperatuuril 71,7°C 15 sek jooksul Lipaas denatureerub temperatuuril 80°C Proteaas Lüsotsüüm 3. Laktoferriin Mikroobide kasvuinhibiitorid piimas: I. Laktoperoksüdaassüsteem (LPS) 1. Laktoperoksüdaas - glükoproteiin 2. Tiotsüanaat SCN- (ah- tiosulfaat- tiotsüanaat) 3. H2O2 Tekib piimhappebakterite toimel LPS toimimiseks vajalik kogus 8-10 mg/l LPS toimemehhanism:
Nitraadid ja nitritid tuleb eelnevalt redutseerida ja selleks kulub energiat. Ookeanide pinnavetes on ammooniumi hulk väike ja vetikad kasutavad nitraate. Merevees on nitraatide sisaldus tavaliselt 0,2-0,4 mg/l. Mõned tsüanobakterid kasutavad molekulaarset lämmastikku. 2.2 Fosfor Vetikad kasutavad peamiselt fosfaate. Ookeanide pinnakihis fosfaatide kontsentratsioon 0,001- 0,01 mg/l. Põhjalähedastes kihtides sisaldus tõuseb. Paljudel vetikatel esineb rakus ensüüm aluseline fosfataas - mis võimaldab neil kasutada ka lahustunud orgaanilisi fosforühendeid. 2.3 Räni Si esineb veekogus lahustunud ränihapete, mittelahustunud soolade, elusate ja surnud ränivetikate näol või kompleksühenditena raua ja alumiiniumhüdroksiidiga. Räni sisaldus varieerub pinnakihis: · Troopilistes vetes ca 0,15 mg/l · Vaikses ookeanis kuni 7 mg/l Põhjalähedastes kihtides räni sisaldus tõuseb Räni on eriti oluline ränivetikate arenguks 2.4 Raud
Millist meetodit kasutatakse juuksekarvast pärineva DNA paljundamiseks, et saada seda uurimiseks piisavas koguses: a) Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) b) DNA kloonimist plasmiidi ja paliundamist bakterite abil c) DNA keemiline süntees d) Western blot 20. Milline järgnevatest ensüümidest hoiab ära restriktaasiga avatud vektorplasmiidi retsirkulatsiooni kloonimise käigus: a) Veise soole fosfataas (calf intestine phosphatase-CIP) b) T4 DNA ligaas c) DNA polümeraas I Klenowi fragment d) Taq DNA polümeraas e) AMV pöördtranskriptaas Kontrolltöö 2. 1. Milliseid eelteadmisi on vaja meid huvitava ensüümi omaduste muutmiseks ratsionaalse (re)disani meetodil? a) Ensüümi aktiivtsentri ja toimemehhanismi tundmine b) Selektsioonisüsteemi olemasolu mutantide valikuks
Võrrelge fosfoglükomutaasi ja fosfoglütseromutaasi reaktsioonide mehhanisme. Fosforülaasi toimel tekkinud glükoos-1-fosfaat konverteeritakse glükoos-6-fosfaadiks fosfoglükomutaasi reaktsioonis. See ensüüm nagu ka fosfoglütseraadi mutaas sisaldab fosforüülitud aminohappe jääki aktiivtsentris. Fosfoglükomutaasil on fosforüülitud jäägiks Ser. Fosfoglükomutaasi protsess on täielikult pöörduv. 6. Selgitage millise olulise funktsiooniga on maksas glükoos 6-fosfataas ning millised tagajärjed on meie organismi metabolismile selle ensüümi puudumine lihastes ja ajus. Eemaldab fosfaadi. Sellega on võimalik tekkinud glükoosi transport vere kaudu teistesse kudedesse. Lihaskoes puudub glükoos-6-fosfataas, seega on glükoos-6-fosfaat lihasrakkudes kinni ja glükoosi verre ei saadeta. 7. Võrrelge erinevusi glükogeeni lagundamisel ja sünteesil. Kujutage UDP-glükoosi struktuur ja selgitage mis on selle ühendi funktsioon.
Nende seerumtase tõused tugevasti akuutse pankreatiidi puhul, sooleinfarkti ja soolemulgustuse puhul. Aspartaadi aminotransferaas (AST) ja alaniini aminotransferaas (ALT) Nad on aminorühma ülekannet katalüüsivad AH metabolismi võtmeensüümid. Aminorühma ülekanne on mahukam maksas -> AST ja ALT on maksakahjustuse markerid. Neid on ka skeletilihastes, südamelihastes ja neerudes -> meakeriteks ka lihaskahjustustele. Aluseline fosfolaas (ALP) ja happeline fosfataas (ACP) ALP lõhustab fosfomonoestrid aluselises kkonnas. Kofaktroiks on Zn ja Mg. Kuna põhikoguse moodustavad maksa ja luu isoensüüm, on need ensüümid vastava koekahjustuse markeriteks. Luu isoensüüm on osteoblast-aktiivsete haiguste marker. Maksaensüümi tõus sapitede sulgus või maksakasvaja ACP lõhustab fosfomonoestreid happelises kkonnas. Kofaktoriks on Zn ja Mg. Pankreasevähi diagnostika
surma. Spetsiifiliselt nikli homöostaasiks loodud valku ei tunta ühesgi imetajas, ei oodata nikli spetsiifilist muutust geeni ekspressioonis ja metabolismis. Paljud kahjulikud nikli toimed aktiveeruvad mitte-spetsiifiliste interaktsioonidega nikli ja makromolekulide vahel, mis tekitavad rakkudele kahjustusi. Raku käitub nikliga nii nagu teistegi metalli-ioonidega tekitades singaaliülekande kaskaadi nagu sekundaarne ülekanne, valgu kinaas, fosfataas või transkriptsioon. Nikli poolt modifitseeritud geeni transkriptsiooni seoses hapniku puudusega on uuritud palju „in vitro“ , et paremini mõista niklit kui kantserogeeni. Põletikulisi allergia ja astma sümptomeid mida tekitavad nikli ühendid on uuritud laialdaselt „in vivo“ ja on leitud üksikuid valke millel on nikliga põimumiseks soodsaid omadusi. Nikliga töötavatel isikutel tihtipeale tekivad hingamisteedega probleemid või vähk, mida pandi juba tähele 1933. aastal
Näiteks sulfaniilamiid, mis inhibeerib foolhappe sünteesi. Foolhape on vajalik mõningate mikroobide kasvuks. · Nad on konkureerivad inhibiitorid ja seostuvad mittekovalentselt · Vähem kõrvaltoimeid kuid nende toime on lühiajalisem Ensüüm Patoloogiline seisund Alaniini aminotransferaas Hepatiit Aspartaadi aminotransferaas Infarkt ja hepatiit Alkaalne fosfataas Maksa- ja luuhaigused Kreatiini kinaas Südame infarkt Amülaas Kõhunäärmehaigused Happeline fosfataas Eesnäärmevähk · tööstuslikud kasutusalad · Proteaasid - Esinevad naturaalselt kõikides organismides. Katalüüsivad peptiidide ja valkude peptiidsidemete hüdrolüüsi. Seetõttu kutsutakse neid ka proteaasideks
Pleura ja seerumi kolesterooli suhe üle 0,3 oleks iseloomulik eksudaatidele. Biokeemilised parameetrid eksudaadi jaoks Eksudaat võib tekkida mitmete erinevate haiguste tagajärjena. Efusioonivedeliku lisauuringud aitavad hinnata efusiooni koostist ja koostises esinevaid muutusi, mis omakorda võimaldavad välja selgitada võimalike efusioooni tekke põhjuseid. Biokeemilised näitajad, mida võidaks veel hinnata, on glükoos, amülaas, alkaalne fosfataas, triglütseriidid, kasvaja-markerid ja laktaat. Iga konkreetese näitaja kõrvalekalle normist võib olla viide võimalikul tekke põhjusele. Näiteks glükoosi kontsentratsioon peaks efusioonis olema seerumi väärtusega sama, kuid madalama väärtus võib viidata infektsioonile, kuid ka sellele, et patsient võib põdeda reumatoidartriiti. Laktaadi tase tõuseb infektsioosse pleuriidi või tuberkuloosi korral.
kinaasi, näiteks CycE1/CDK2, valgukompleksi ning tsükliinisõltuva kinaasi inhibiitori, näiteks p57 aktiivsustest ja omavahelistest mõjudest. G2-faasi kontrollpunktis on olulised mitoosile suunav faktor MPF (ingl. mitosis promoting factor), tsükliin A, tsükliinisõltuv kinaas Cdk2, fosfataas Cdc25 jt. M-faasi kontrollpunktis on olulised mitoosi anafaasi suunav kompleks APC (ingl. anaphase promoting complex), mis kontrollib, et metafaas oleks toimunud korrektselt ning lubab kromosoomidel liikuda raku pooluste suunas, aga ka tsükliin B, tsükliinisõltuvad kinaasid ja mitmed valgud. M – mitoos; I – interfaas; G1 – mitoosijärgne (sünteesieelne) faas; S –
gammaglutamüültransferaas- (gamma-glutamyl transpeptidase- GGT)- dimeerne (oligomeer, mis sisaldab kahte sarnast monomeeri), karboksüpeptidaas, mis lõhustab C- terminali glutamüüli gruppidest sünteetilised substraadid ja transfeerib need peptiidideks ja teisteks sobivateks aktseptoriteks nagu näiteks glütsüülglütsiiniks. arginaas- (arginase- ARG)- uriini tsükli viimane ensüüm, sisaldab mangaani. Selle ensüümi katalüüsitud reaktsioon: arginiin+ H2O ornitiin + uurea aluseline fosfataas- (Alkaline Phospahatase) ALP või AP (SAP- seerumi aluseline fosfataas) on kasutatud maksakahjustuse näitajana juba 1920ndatest. Hüdrolüüsib mitmeid fosfaadi estreid. AP on glükoproteiin. Võib leiduda eelkõige maksas, soolestikus, neerudes, luudes. kreatiini kinaas- (creatine kinase- CK) katalüüsib pöörduvat kreatiini fosforüülimist, et moodustada kreatiini fosfaate. bilirubiin- omab suhteliselt väikest diagnostilist tähtsust. Kõrge bilirubiini tase veres võib viia kolaltõveni
Piima koostis Vesi- 87,3 % (85,5- 88,7%) Rasv- 3,9 % (2,4-5,5%) Rasvata kuivaine 8,8% (7,9%- 10,0%): *Valk- 3,25% *Laktoos- 4,6% *Mineraalained- 0,65 % (Ca, P, Mg, K, Na, Zn, Cl, Fe, Cu) *Vitamiinid (A, C, D jne), ensüümid (peroksidaas, katalaas, fosfataas, lipaas) Piimarasv piima kõige kõikuvam koostisosa. Et rasv piima veefaasis ei lahustu, võtavad rasvaosakesed juba epiteelirakkudes keraja kuju (rasvakuulike). Lüpsisoojas piimas on rasv emulsioonina. Piimarasva sünteesil on olulisteks lähteaineteks vatsast pärinevad lenduvad rasvhapped. Glütseriin kui rasva lähteaine pärineb osaliselt verest, osalt moodustub glükoosist. Piimavalkudest sünteesitakse piimanäärmeis kaseiin, albumiin ja globuliin. Nende sünteesi
mis on asendatud võrreldes glükolüüsiga. Katalüüsiv bisfosfataas on allosteeriline ensüüm. 3. Vaba glükoosi süntees Enamikes kudedes vaba glükoosi ei sünteesita. Eelmises reaktsioonis tekkinud fruktoos-6P muutub glükoos-6P ning see kasutatakse glükogeeni sünteesiks. Vaba glükoos sünteesitakse peamiselt maksas, kuna maks hoiab vere glükoositaset ning viib tekkinud vaba glükoosi rakust välja, verre. Glu-6P hüdrolüüsitakse ER luumenis, kus glükoos-6-fosfataas seda reaktsiooni läbi viib. Glükoneogeneesi ja glükolüüsi reguleerimine Kui üks rada on suhteliselt inaktiivne, on teine aktiivne. Cori tsükkel Lihasrakkudes toodetud laktaat viiakse maksa ümbertöötlemiseks.
Kompleksi 3 ensüümi ja 5 koenüüsmi kontakteeruvad vaid füüsiliselt ja seetõttu vahepeal vaheühendeid ei vabane. PyrDH ekspresseerub väga suurel kõrges hulgas südamelihastes, neerudes ja maksas. Biokeemiline sisu: Häireteta funktsioneerimine peab alati olema tagatud Vajab vitamiinide(tiamiin, riboflaviin, pantoteenhape, nikotiinhape, lipoehape) pidevat piisavat taset rakkudes PyrDH aktiveerib fosfataas ja inaktiveerib kinaas Insuliin aktiveerib PyrDH-si Shoki puhul tekkiv hapniku defitsiit pärsib PyrDH Trikarboksüülhappe tsükkel e TKT e tsitraaditsükkel e Krebsi tsükkel on inimkeha keskne metaboolne rada, mis seostab süsivesikute, lipiidide, aminohapete metabolismi. Kataboolses mõttes on TKT põhiroll süsivesikute, lipiidide valkude eelneva lõhustumise käigus tekkinud keskse metaboliiidi(atsetüül-COA) täielik lõhustumine
G(+) stafülokokk (värvub lillakassiniseks) G(-) Escherichia coli (värvub punaseks) G(+) bakteril katab rakumembraani paks peptidoglükaankiht. G(-) bakteri peptidoglükaankiht on õhuke. Selle peal paikneb täiendav kesta kiht välismembraan, mille ehitus meenutab rakumembraani. Ruumi, mis g(-) bakteritel paikneb rakumembraani ja välismembraani vahel, nimetatakse periplasmaks. Periplasma pole tühi ruum. [Periplasmas on näiteks ribonukleaas, aluseline fosfataas, penitsillinaas, transporterite seostusvalgud, formiaat-vesinik lüaas, tsütokroom C, osa rakukesta sünteesi ensüüme jne.] G(+) bakterite rakukest koosneb: 1) paksust (20-80 nm) peptidoglükaankihist, mis moodustab kuni 80% rakukesta massist, 2) Kestateihhuuhapetest, mis läbistavad peptidoglükaankihti, 3) Lipoteihhuuhapetest, mis seostuvad ka membraani lipiidkihiga. 4) Vahel rüügitakse ka G(+) rakukesta puhul rakukesta periplasmast (ruum membraani ja
9.Immunohistokeemilise värvingu meetodil võib esineda mittespetsiifiline tausta värving: nimeta põhjus, kuidas vältida -Prim või sek ak mitte-spetsiifiline seondumine -Pesu pole korralikult tehtud -Endogeensed ensüümid 10.Millised kontrollvärvingud on vajalikud teostada immunohistokeemias 11.Nimeta peamised immunohistokeemilised meetodid -Immunofluorestsents meetod -PAP - peroksidaas-antiperoksidaas meetod -APAAP meetod alkaalne fosfataasantialkaalne fosfataas meetod -Avidiin biotiin meetod 12.Mis on kaksikvärving -Vaja ak-produtseeritud erinevates loomades/rabbit, goat/ -Kui erinevates loomadest võib kasutada nende mikstuuri (hoiad aeg kokku) -sek ak valik -Vastava substraadi valik 13.Immunohistokeemilisel värvingul tekkis väga nõrk signaal. Nimeta 5 peamist põhjust. -Ak lahjendus liiga nõrk -Ak ei seondu (ei tunne ära) proteiini 34 -Ak vana, valesti käsitletud
renaturatsiooni puhul see lühike sond seondub eelistatult DNA ahelaga, sest alati lühike nukleotiidi järjestus seondub pika ahelaga paremini kui kaks pikka ahelat omavahel. INNO-LIPA hübriidimise meetod: amplifitseeritakse DNA, kasutades biotiin-märget (biotinoleeritud nukleotiidid), mis seob streptavidiini tekkiv kompleks on üks tugevamaid bioloogilisi interaktsioone. Streptavidiini küljes on veel fosfataas värvireaktsiooni läbi viimiseks. Peale amplifikatsiooni viiakse see kõik testribale, kus iga triip vastab ühele järjestusele. Hübridisatsiooni korral tekib värvireaktsioon. *Sondi pikkus (mida lühem sond, seda suurem võimalus leida temale vastavaid sama lühikesi järjestusi erineva järjestusega pikemate järjestuste seast). *Nukleiinhape puhtus *Nukleiinhappe kogus * 6
Ka tsütosoolne ensüüm ZAP70 mängib olulist rolli T-raku aktivatsioonis Signaali transduktsioon: TCR variaabelsed domeenid (α ja β ahel) seostuvad vastava MHC klassi molekuliga (see sõltub sellest, millist koretseptorit T-rakk kannab) ning sellega seostunud peptiidiga. Intratsellulaarsed Src perekonna türosiin kinaasid – nagu näiteks Fyn – aktiveeritakse CD45 abil, milleks türosiin fosfataas eemaldab nende Fyn ensüümide inhibiitoraladest fosfaatgruppe, mistõttu Fyn saab aktiveeruda. Seejärel aktiveeritud Fyn fosforüleerib TCR kompleksi ITAM aladel türosiini jäägid. Fosforüleeritud ITAMid on seostumiskohtadeks kinaas ZAP70-le. ZAP70 seostub ζ ahela ITAM aladele. Koretseptori ekstatsellulaarosa (kas CD4 või CD8) seostub samuti MHC klassi molekuliga. Selle
retseptoritele. Raku pinnapealsed retseptorid-hüdrofiilne signaalmolekul Rakusisesed retseptorid- väikehüdrofoobne signaalmolekul kandja valgul liigub rakku ja seal tuuma,kus on intratsellulaarne retseptor. Nt steroidhormoonid Proteiinkinaaside ja -fosfataaside ning GTP seostumise ja hüdrolüüsi osa signaalide sisse ja väljalülitamises. Proteiin kinaasi poolt lisatakse fosfaat valgus oleva aminohappe hüdroksüülrühmale ning aktiveeritakse. Proteiin fosfataas eemaldab fosfori valgul ja inaktiveeritakse Valgul on endal GTPaasne aktiivsus –Valgul on GDP,kui sinna seondub GTP, sktiveerub valk. GTP hürolüüs inaktiveerib valgu GTP-d siduvate valkude e. GTPaaside toimemehhanism. GTPaas katalüüsib GTP hüdrolüüsi,mis inaktiveerib valgu. GTPaasi aktiveeriva valgu ja guaniin nukleotiidi vahetava faktori toimemehhanism. GAP – GTPaasi aktiveeriv valk suurendab GTPaasi hüdrolüütilist aktiivsust seega tekib GDP ning valk inaktiveerub
tsükliiniga. Fosforüülimist teostab proteiini kinaas (CAK). Katalüütiline aktiivsus kasvab 100 300 korda. CDK aktiivsus lisaks tsükliinidele on reguleeritud kinaaside, fosfataaside ja spetsiifiliste inhibiitorite (CKI) poolt. DNA vigastusel rakutsükkel peatatakse CKI-de poolt. Kui on fosforüülitud lisaks Thr 161-le ka Tyr 15, siis kompleks on inhibeeritud, sest on takistatud seostumine ATP-ga. Fosfataas, mis eemaldab fosforhappe jäägi Tyr 15 küljest, aktiveerib kompleksi, mis muutub võimeliseks seostuma substraadiga. Erinevad CDKd tagavad erinevate rakutsükli faaside läbimise: CDK-1 üleminek G2 faasist mitoosifaasi CDK-2 üleminek S faasist G2 faasi CDK-4 ja 6 üleminek G1 faasist S faasi jne 4.)Nimetage tsükliinidest sõltuvate kinaaside substraate rakutsüklis. ??????? See baseerub
Tekkinud N-alus annab vale paardumise (8-oxoG paardub adeniiniga). Ka selle muutunud struktuuriga N-aluse kõrvaldamiseks DNA ahelast on olemas oma spetsiifiline reparatsiooni süsteem. Siia kuuluvad kolm geeni mutM, mutT ja mutY. mutM N-glükosülaas + AP- endonukleaas, kõrvaldab valesti lülitunud A jäägi asendades selle Cga. mutY N-glükosülaas, mis spetsiifiliselt püüab kõrvaldada 8-oxoG=A paarist sinna valesti lülitunud A mutT fosfataas; 8-oxoGTP8-oxoGMP 2.3. Raaminihke mutatsioonid. Põhjuseks on ühe N-aluste paari kadumine või lisandumine. See võib toimuda nii spontaanselt kui ka mõnede mutageenide toimel. Selliste ühendite hulka kuuluvad 9-aminoakridiin, proflaviin, EtBr jt. Need nn. interkaleeruvadühendid paigutuvad ahelas kahe kõrvutioleva nukleotiidi vahele ja põhjustavad ahelate libisemist teineteise suhtes. Seda juhtub kõige sagedamini DNA piirkondades kus esinevad AT või GC kordused. 2.4
koekahjustust ROSide kaudu • Eksotoksiin A – inhibeerib valgusünteesi, põhjustab koe (naha, kornea) kahjustust, immuunsupressiivne • Eksotoksiin S – inhibeerib valgusünteesi, immuunsupressiivne • Leukotsidiin (tsütotoksiin) – eukarüoodi membraanidele tsütotoksiline (leukotsüüdid, põhjustab ka pulmonaalset mikrovaskulaarset kahjustust) • Elastaas – elastiini sisaldavate kudede, kollageeni, immuunglobuliinide, komplemendi faktorite hävitamine • Aluseline fosfataas – koe hävitamine, INF ja TNFα inaktiveerimine • Fosfolipaas C – termolabiilne hemolüsiin, vahendab koekahjustust, stimuleerib põletikulist vastust • Rhamnolipiid – termostabiilne hemolüsiin, häirib letsitiini sisaldavate kudede terviklikkust, pärsib ripsmete aktiivsust • Antibiootikumresistentsus haigused. • Kopsuinfektsioonid: kergest bronhide ärritusest (trahheobronhiidist) kopsuparenhüümi nekroosini (nekrotiseeriv bronhopneumoonia
TCA või glüoksülaadi raja kaudu. TCA tsüklis oksüdeeritakse isotsitraat IDH toimel - ketoglutaraadiks. Kui E. coli rakud kasvavad atsetaadil või rasvhapetel, on IDH fosforüleerimise tulemusena inhibeeritud. Sel juhul viiakse isotsitraat isotsitraadi lüaasi abil glüoksalaadiks. Vastasel juhul konverteeritaks kogu atsetaat CO2-ks ning rakkude kasvuks vajalikke metaboolseid vaheühendeid ei tekiks. IDH fosforüleerimist viib läbi IDH kinaas/fosfataas, mis on kodeeritud aceK geeni poolt. aceK mutandid ei ole võimelised atsetaadil kui ainsal C-allikal kasvama. AceK kinaasi aktiivsus avaldub siis, kui metabolismi vaheühendite kontsentratsioon rakus on madal (see olukord tekib siis, kui rakud atsetaadil kasvavad). Isotsitraat ja 3-fosfoglütseraat aktiveerivad AceK fosfataasse aktiivsuse ja IDH defosforüleerimise, soodustades sel viisil isotsitraadi metaboliseerimist TCA tsükli kaudu. Valkude metülatsioon
kas isotsitraat metaboliseeritakse TCA või glüoksülaadi raja kaudu. TCA tsüklis oksüdeeritakse isotsitraat IDH toimel -ketoglutaraadiks. Kui E. coli rakud kasvavad atsetaadil või rasvhapetel, on IDH fosforüleerimise tulemusena inhibeeritud. Sel juhul viiakse isotsitraat isotsitraadi lüaasi abil glüoksalaadiks. Vastasel juhul konverteeritaks kogu atsetaat CO 2-ks ning rakkude kasvuks vajalikke metaboolseid vaheühendeid ei tekiks. IDH fosforüleerimist viib läbi IDH kinaas/fosfataas, mis on kodeeritud aceK geeni poolt. aceK mutandid ei ole võimelised atsetaadil kui ainsal C-allikal kasvama. AceK kinaasi aktiivsus avaldub siis, kui metabolismi vaheühendite kontsentratsioon rakus on madal (see olukord tekib siis, kui rakud atsetaadil kasvavad). Isotsitraat ja 3-fosfoglütseraat aktiveerivad AceK fosfataasse aktiivsuse ja IDH defosforüleerimise, soodustades sel viisil isotsitraadi metaboliseerimist TCA tsükli kaudu. Valkude metülatsioon ja atsetüleerimine
aminohapete liikumist, mis viib valgu konformatsioonilisele muutusele. Signaali vastuvõtval regulaatorvalgul on tavaliselt DNA-d siduv domeen, mille aktiivsus sõltub valgu fosforüleeritusest. Selle abil reguleeritakse geenide transkriptsiooni. Samas, mitte alati ei pea olema signaali vastuvõtval regulaatoril väljundiks DNAga seondumine. Regulaator võib olla ensümaatilise aktiivsusega, see võib olla metüültransferaas, diguanülaat tsüklaas (alarmooni süntaas), fosfataas, adenülaat tsüklaas. Regulaator ei pruugi olla ka ensümaatilise aktiivsusega, vaid valgu fosforüleerimisega reguleeritakse valk-valk interaktsioone, mis näib olevat just eriti oluline kemotaksise signaali ülekandmisel liikumiseks ning viburite asukoha muutmiseks. Näiteks CheY seondub fosforüleerimise järel flagella FliM valguga ning mõjutab liikumist. Samuti võib fosforüleerimine mõjutada transkriptsiooni regulaatori aktiviseerimisel. Näiteks mittefosforüleeritud NarL
Allosteerilised efektorid suurendavad või vähendavad ensüümi aktiivsust. Kovalentse mod puhul on sisse ja väljalülitamine. Modifikatsioon võib ensüümi muuta inaktiivseks ja vastupidi. Selles suhtes pole tasakaalu. 55 Kõige enam levinud modifitseerimine on fosforüleerimine. Mingi artikkel: W (modifitseerimata), W* (modifitseeritud) WW* (E1, kinaas paneb külge) W*W (E2, fosfataas võtab ära) (kinaasi reaktsioon) (fosfataasi reaktsioon) Statsionaarses faasis on tasakaalus need kaks reaktsiooni. Kontrollmehhanismi hoidmiseks on hinnaks ATP kulutamine. Mõlemad protsessid peavad käima, hinnaks on energia kulutamine, aga regulatsioon nõuabki oma hinda. Võime leida fosforüleeritud valgu osakaalu: y-teljel l, x-teljel Vmax1=E1totk1
annaabi.ee 
