DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järj...
Tallinna Tehnikaülikool Molekulaardiagnostika õppetool Geenitehnoloogia eetilised, õiguslikud ja ärilised aspektid ,,Kas loomade kloneerimine on eetiline?" Referaat Maria Simmul YAGM-31 1. Sissejuhatus Mis on kloonimine? Teadlased on tänapäeval suutelised saama järglasi ka loomade keharakust. Seda protseduuri nimetatakse kloonimiseks. Niisugusel teel arenema hakkav organism on täiesti identne selle loomaga, kelle keharakust ta klooniti
ja organisme. Embrüonaalsed tüvirakud on kultuurina kasvatatavad rakud, mis on saadud blastotsüsti ehk lootepõiekese sisemassi rakkudest. Nende uurimine on alles alusuuringute faasis. Inimlootelt saadud embrüonaalsete tüvirakkude uurimine on eetilises mõttes vaieldav, sest tüvirakkude tüve saamiseks tuleb lõhkuda blastotsüst (loode, milles ei ole veel üle 150 raku), mida võidakse pidada inimeseks. 57. Mille poolest erineb organismide kloneerimine DNA kloneerimisest? Kloneerimine- DNA, raku või geneetiliselt ideeentse järglaskonna saamine, olemasolevate geenikoopiate tekitamine. DNA kloonimine- on teatud DNA lõigu paljunemine. St. meil on juba üks DNA lõik ja me tahame saada selle koopiad. Ja DNA kloonerimist me võime läbi viia katseklaasis. Me saame täpset DNA koopiaid. Orgaanismide kloonerimisel me peame toimima keerulisemalt: tuleb eraldada viljastatud munarakust tuum, ja viia selle tuuma asemele teise looma somatilise raku tuum. Siis seda
geenide horisontaalne ülekanne Kui võõrad geenid plasmiidi DNA-sse sisestada lähevad üle teise bakterisse koos plasmiidiga Inimese kasvuhormooni geen GH1 (growth hormone) E. coli plasmiidi Kui GH1 muteerunud, ei tooda hüpofüüs kasvuhormooni kasv peatub lapseeas täiskasvanul kääbuskasv Kasvuhormoon: 191 AH valk AH järjestus teada, geeni GH1 nukleotiidne järjestus mitte Kasvuhormooni geeni kloneerimine Plasmiidid paljunevad rakus paljundavad ka inimese geeni Geeni kloneerimine miljonid koopiad geenist Geeni defektiga lapsele süstida kasvuhormooni kääbuskasvu ei teki Kust võtta suures koguses kasvuhormooni? Laipade ajuripatsite rakkudest keeruline, patsiendile ohtlik: patsiendid said rakkudest priionid "hullu lehma tõbi" Kasvuhormooni geeni kloneerimisega bakterites võimalik toota steriilset kasvuhormooni suurtes kogustes
Rakud, mis saadakse blastotsüsti sisemisest rakumassist. Nad võivad vastavate indutseerivate ainete toimel diferentseeruda kõigiks rakutüüpideks, kuid nad ei saa areneda tervikorganismiks. Tüvirakud tagavad organismi arengu, kudede eneseuuendamise ja kahjustuste parandamise. Rakuteraapia- ravimeetodid, mille puhul organismi hävinud rakke v organite kahjustunud fn-e taastatakse tüvirakkude siirdamisega. 56. Mille poolest erineb organismide kloneerimine DNA kloneerimisest? Kloneerimine on DNA, raku või geneetiliselt identse ärglaskonna saamine, olemasolevate geenide koopiate tekitamine. DNA kloneerimine on teatud DNA lõigust koopiate tegemine, mida on võimalik teostada katseklaasis. Organismide kloneerimine on keerulisem: tuleb eraldada viljastunud munarakust tuum ja viia selle asemele teise looma somaatilise raku tuum. Seejärel viiakse munarakk asendusema emakasse ja sünnib kloneeritud järglane
metoodika abil arendada embrüonaalsete tüvirakkude liine, mis on saadud erinevate geneetiliste haigustega patsientidelt ja saada seega hindamatu mudel nende haiguste uurimiseks. Tüvirakk – suudab nii ennast uuendada kui toota spetsialiseeritud tütarrakke oma järglaskonnas. Eneseuuendamine->identsed tüvirakud. Diferentseerumine e spetsialiseerumine->spetrialiseerunud rakud. 55. Mille poolest erineb organismide kloneerimine DNA kloneerimisest? Kloneerimine on DNA, raku või geneetiliselt identse järglaskonna saamine, olemasolevate geenide koopiate tekitamine. DNA kloneerimine on teatud DNA lõigust koopiate tegemine, mida on võimalik teostada katseklaasis. Organismide kloneerimine: reproduktiivne kloonimine – tehnoloogia, mida kasutatakse loomade genereerimiseks, kelle on samasugune DNA juba olemasoleva/olnud loomaga (lammas Dolly, esimene imetaja, kes klooniti
24. das Antigen, -e - antigeen 25. der Startcodon- startkoodon 26. der Stopcodon- stoppkoodon 27. der Klonierungsverktor, -en - kloneerimisvektor 28. der Transformation, -en - transformatsioon 29. die Sequenzierung, -en - sekveneerimine 30. die Synthese- süntees 31. die Labormethod, -en laborimeetod 32. tierische Zelle- loomarakk 33. die Ribosomen- ribosoomid 34. die Morphologie, -n morfoloogia 35. der Embryo- embrüo 36. die Mutagen, -e - mutageen 37. die Klonierung, - en - kloneerimine 38. das Protein- valk 39. abschalten- vigastama 40. die Genome, -en - genoom 41. die Infektionskrankheit, -en - infektsioonihaigus 42. die Hybridisierungsprobe, -en - hübriidproov 43. der Wirkstoff- e - toimeaine 44. die Bioinformatik- bioinformaatika 45. der Stoffwechsel,-e - ainevahetus 46. der Antibiotika, -en - antibiootika 47. der Struktur, -en - struktuur 48. der Wirkungsmechanismus, -en - toimemehhanism 49. der Peptid, -e - peptiid 50. die Mutasynthese,-en - mutasüntees 51
Siduvate otsadega fragmente vôib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. (vt. ka fail) 42. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2013 a) Nimi: YAGB41 Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal.
Mõned restriktaasid tekitavad 5' (EcoRI), teised 3' (PstI) üleulatuva otsaga fragmente. On ka restriktaase, mis tekitavad tömpotsalisi fragmente (SmaI). 44. DNA kloneerimise etapid. bläblä 45. DNA sekveneerimise põhimõte. Erinevad DNA molekulid liiguvad erineva kiirusega ja siis mingi lahe süsteem oli. http://www.biotech.ebc.ee/praktikum/juhend3.html 46. Polümeraasi ahelreaktsioon. Äö, praimerid ja värk! Pannakse vajalik(?) jama lahusesse ja imeväel toimub DNA kloneerimine. 47. Kromatograafia. Kromatograafiline meetod põhineb erinevate keemiliste ühendite erinevale tasakaalule kromatograafilise kolonni materjali (sorbendi) pinnale adsorbeerunud ja liikuvas kandevkeskonnas (vedelik või gaas) lahustunud molekulide vahel. Tulemusena liiguvad erinevad molekulid kandevkeskonna voos erineva kiirusega ja lahutuvad seetõttu ruumiliselt. 48. Elektroforees. 49. Nukleiinhapete hübridiseerimine.
(esimene oli lammas Dolly) 53. Mis on embrüonaalsed tüvirakud? Embrüonaalsed tüvirakud pärinevad blastotsüsti (etapp varajases embrüonaalses arengus) sisemisest rakumassist ning on võimelised arenema ükskõik milliseks keha koe rakutüübiks. Selline pluripotentsus eristab embrüonaalseid tüvirakke hilisemas arengus esinevatest multipotentsetest tüvirakkudest, mis suudavad moodustada vaid piiratud valiku rakutüüpe. 54. Mille poolest erineb organismide kloneerimine DNA kloneerimisest? Organsimide kloonimisel on vaja kahte organismi- ühte, kellelt võetakse embrüo rakud või rakutuum ja teist, kellesse see siirdatakse. DNA kloneerimine toimub aga nn mehaaniliselt PCR meetodiga, mille abil DNA-d kuumutatakse erinevatel temperatuuridel ja vaja läheb ainult nn ühte organisi, kellelt võetake DNA. Organismi kloonimine on palju keerukam protsess ja tulemuseks ei ole 100% ema koopia, vaid väga sarnane loom. 55
Kordamisküsimused Geenitehnoloogia I Restriktaasid. Restriktaasid on ensüümid, mis lõikavad DNA-d spetsiifilise nukleotiidse järjestuse järgi. Nad teevad seda kõikide DNA’de puhul samamoodi. Neid spetsiifilisi järjestusi nimetatakse restriktsiooni aladeks. Selliseid ensüüme on leitud bakteritest kaitsmaks neid kahjulike viiruste eest. DNA kloneerimine baseerub restriktaaside avastamisel. DNA järjestuse äratundmine varieerub erinevate restriktaaside vahel, lõigates tekivad eri pikkusega “kleepuvad” üleulatuvad osad. “Kleepuvad” üleulatuvad osad võivad olla nii peaahelal kui “komplementaarsel” ahelal. Selliste otstega DNA ahelaid on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita, tekib rekombinantne DNA. Restriktaasid on ensüümid, mis katkestavad hüdrolüüsi fosfordiester sidemel,
Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2012 a) Nimi: Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal.
nende toime vältimiseks Plasmiidid sisaldavad geene, mille põhjal sünteesitud valgud aitavad bakteritel antibiootikumi keskkonnas ellu jääda. Rekombinantse DNA puhul peab plasmiidil olema replikatsiooni origin, resistentsusmarkergeen (et oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 40. DNA kloneerimine DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
CAAGATGTCCAAGTAAGCTGGCTCATTGTCAATCCTGACCTGGGTCTTATAAGCATCTTCTATA GTAGGGTCATGATAATCAGGGAACTGATGACTAATAAACTGCATTGTCATTGCGCTTTTACCAA CTCCCCCTGCTCCCAGCATTACCACCTTGTACTCTCTGGACCCGCCTGATGCGCTGCCCGGGG AGCAGCTGGCTTCATTTTCTACCTCGGATCC 70. 71. 72. 73. Plasmiidse DNA edasine kasutus 74. Olenevalt sellest, millisteks katseteks uuritavat järjestust vaja on, toimub edasine kloneerimine. Kui tegu on valku kodeeriva DNA järjestusega, mida soovitakse ekspresseerida mõnes eukarüootses rakus või rakuliinis, siis tõstetakse lihtsasse bakteriaalsesse kloneerimisvektorisse sisestatud järjestus edasi mõnda ekspressiooni vektorisse. Selline vektor sisaldab vajalikke järjestusi valgu ekspressiooniks rakkudes, aga ka bakteris paljundamist võimaldavaid elemente, kuid millesse kloneerimine otse PCR-ist oleks liiga tülikas
seisukohalt esmane või eelneb sellele teisi muutusi DNA tasemel, pole veel päris selge.) Protoonkogeenide aktivatsioon võib toimuda punktmutatsiooni, kromosoomiaberratsiooni või amplifikatsiooni läbi. Proto-onkogeen võib konverteeruda onkogeeniks translokatsiooni, deletsiooni, inversiooni või duplikatsiooni läbi. Senini on kasvajates kirjeldatud üle saja erineva retsiprookse translokatsiooni, millede murrukohtade geenide kloneerimine on paljudel juhtudel viinud vähi tekkel osalevate geenide identifitseerimisele. Translokatsiooni või inversiooni tagajärjel võivad proto- onkogeenid aktiveeruda tänu asetumisele antud rakus aktiivse promootori või enhanseri kõrvale. Nii tsütogeneetilised kui ka molekulaargeneetilised uuringud on näidanud, et mõned protoonkogeenid on kasvajakoes esindatud paljude koopiatena. · Madalatasemeline (low-level) amplifikatsioon, mis on tingitud ühe,
coli. Rakenduslik bakteriaalne geneetika meditsiinis Mikrobiaalsed (mitte ainult!) nukleiinhapped leiavad kasutamist 4 suuremas valdkonnas: § Nukleiinhapeta alusel haigusetekitaja või teatud omadustega mikroobi (näiteks - mecA > MRSA) avastamine ja samastamine uuritavas materjalis. § Nukeiinhapete alusel sarnasuse leidmine ajas ja ruumis koos esinevate isolaatide vahel - epidemioloogiline uuring puhangu, hospitaalinfektsiooni jne. selgitamiseks. § Mokekulaarne kloneerimine (kloonimine) - insenergeneetika, mille abil muuta bakterite omadusi. § DNA vaktsiinid Kloneerimine § Molekulaarne kloneerimine - raku DNA isoleerimine, identifitseerimine, muutmine ja viimine mistahes elusraku kromosoomi (DNA- sse). § Peamiseks molekulaarse kloneerimise objektiks on bakterid, seened. § Raskeim etapp on DNA-s oleva vajaliku geneetilise info desifreerimine, bakteriaalsesse DNA-ss viimine on "suhteliselt" standardne - kloneerimine § Spetsiaalsed bakterid, sagedamini E
põhjustatakse katked samas DNA puntkis või kleepuvate otstega DNA lõigus, kui katkemised toimuvad erinevates ahelates teineteise suhtes nihkes, DNA ligaas sünteesib nende vahele fosfordiestersideme, moodustuvad rekombinantsed DNA- molekulid. 41. DNA kloneerimise etapid. Et töötada spetsiifiliste geenidega, tehakse DNA-st `geeni-suurused' koopiad niisugune DNA molekulide/molekuli osade kopeerimine ongi DNA kloneerimine. DNA kloonimiseks kasutatakse kõige enam baktereid ja plasmiide. Plasmiidid on väiksed rõngasjad bakteriaalsed DNA molekulid, mis replitseeruvad bakterikromosoomist eraldi. Etapid: Uuritava geeni isoleerimine, fragmentatsioon- valitud lõigu eraldamine DNAst Viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi (kloonimisvektor), ligeerimine Amplifikatsioon- DNA molekulide paljundamine
· Ajavõit 5 (loeng 7) Geenitehnoloogia meetod - Esimene samm: DNA või RNA eraldamine ja geeni isoleerimine Alternatiiv geeni disain ja süntees (Venter, mükoplasma järgmine slaid). Oluline, et usaldusväärsed meetodid DNA eraldamine: Purusta rakud Lisa soolalahus, et DNA viia lahusesse Lisa orgaaniline lahus (kloroform), et valgud ja rasvad eralduks Lisa alkohol ja DNA sadestub välja Kloneerimine Vektor - DNA molekul mida kasutatakse geneetlise materjali kandjana (viib DNA teise rakku) Neli tüüpi: Plasmiid Bakteri või viiruse faag Kosmiidid Kunstlikud kromosoomid BAC, YAC) Sisaldab: OriC (Origin of replication) multikloneerimise koht (multiple cloning site) Marker geen Restriktsiooni ensüümid - Nö. ,,DNA käärid". Tunnevad ära teatud DNA järjestuse ja katkestavad ahela ( Eco Ri). Bakterid produtseerivad ensüüme nimega restriktsioonilised endonukleaasid.
lahutada järgnevate karakteristikute järgi: elektriline laeng, suurus, kuju. Geel-elektroforeesi kasutatakse DNA molekulide isoleerimiseks. Geeliks kasutatakse agarist puhastatud suhkrut agaroosi. Agaroosil on poorjas struktuur mis takistab DNA fragmentide vaba liikumist ja seega lahutab DNA fragmendid vastavalt nende suurusele, st väiksemad molekulid liiguvad kiiremini ja jõuavad kaugemale kui suuremad. Pärast geel eletroforeesi kasutamist saab dna fragmente: PCR-iga paljundamine, kloneerimine vektoritesse, geeni-raamatukogus säilitamine, mikrokiibi analüüs, järjestamine ehk sekveneerimine 22. Mis on Southern, Western, Northern, Eastern Blot ja Dotplot? Milleks neid kasutatakse ja millised on meetodite erinevused? Ühe molekuliga tuvastatakse teist, molekul kantakse üle kandjale. Southern DNA geenivariandi tuvastamine ja pikkuse määramine. Western spetsiifiliste valkude tuvastamine kompleksproovides. Northern kindla RNA järjestuse tuvastamiseks kompleksproovides
kokkupakkida, on terved piirkonnad valgus, mis koosnevad eelkõige hüdrofoobsetest aminohappejääkidest. Neid ei õnnestu sisse pakkida. Sellised valgud paigutatakse sellisesse keskkonda, kus hüdrofoobsed aminohappejäägid satuvad veevabasse keskkonda membraani. Võib olla nii, et muidu hüdrofoobse piirkonna sisse tekkib kanal. Läbi selle kanali saavad liikuda hüdriilsed ained. Valgu molekulid tagavad niisiis iga konkreetse membraani spetsiifilisuse. KLONEERIMINE 15/10/09 Restriktaasid on ühed valgulised ensüümid, sellised ensüümid, mis lõikavad katki DNA'd. Nukleiin happeid lagundavad üldiselt sellised ensüümid nagu nukleaasid. Rakkudes on palju erinevaid nukleaase, mis lõhuvad fosfodiestersidemeid. RNA'd lõhub ribonukleaas ja DNA'd desoksüribonukleaas ja on olemas ebaspetsiifilisi nukleaase, mis lõhuvad nii RNA, kui ka DNA ahelaid. Kõikidel tuntud nukleaasidel oli üks
Loomsetes organismides on ~300 erinevat rakutüüpi, taimedes ~80. Diferentseerumisel erinevates suundades ei kao osa DNA-st genoomi koostisest vaid erinevates rakkudes ekspresseeruvad erinevad geenide valikud. Seda tõestavad hulgalised näited selle kohta, et nii loomades kui ka taimedes on üksikutest diferentseerunud rakkudest võimalik saada tervikorganism. Eriti kerge on see taimede puhul praktiliselt igast taime osast saab vegetatiivsel paljundamisel uue taime. Loomade kloneerimine tõestab sama. Geeni ekspresseerumise all mõistetakse tema poolt kodeeritud valgu sünteesi. Inimese rakus ekspresseerub keskmiselt ~10000-20000 tema ~30000 geenist. Geeni ekspresseerumise regulatsioon saab toimuda erinevatel valgu sünteesi etappidel mRNA süntees (transkriptsioon), pre mRNA protsessing, mRNA transport tuumast ribosoomidele, mRNA lagunemine, translatsioon, translatsioonijärgsed muutused valgus. Enam levinud on transkriptsionaalne kontroll.
kasvatamisel. Kui diferentseeerunud taimekude viia kunstlikesse kasvutingimustesse, steriilsesse koekultuuri ja kasvatada rakke 2,4-diklorofenoksüäädikhappe 2,4-D juuresolekul, mis on üks taimehormoone, taime koerakud dediferentseeruvad, moodustades kalluse. Seejärel viiakse kalluskultuuri rakud 2,4-D-vabale söötmele, mis sisaldab kasvuhormooni kinetiin, ning taimerakud hakkavad jälle diferentseeruma. 54. Mille poolest erineb organismide kloneerimine DNA kloneerimisest? DNA´d saab kloneerida katseklaasis vajalike komponentide juuresolekul, Organismi kloneerimiseks, tuleb kõigepealt võtta kloneeritava organismi mingi rakku tuum ja siis see naise munarakku sisestada (eelnevalt on sealt tuum eemaldatud) ja siis see peremees organismi panna (naise vagiinasse) kus see uueks organismiks areneb. 55. Miks on oluline teada organismide genoomide täispikki järjestusi?
Siduvate otsadega fragmente võib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. 37. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
mis on vajalikud bakteri kasvukeskkkona eripärast tulenevate ensüümide sünteesiks. need aitavad lagunadada ümbritsevas keskkonnas leiduvaid orgaanilisi aineid. See on vajalik bakteri toitumiseks, aga ka elutegevusele kahjulike ainete lagundamiseks või nende toime vältimiseks. Nii näiteks sisaldavad plasmiidid geene, mille põhjal sünteesitud valgud võimaldavad bakteritel elada antibiootikumide keskkonnas. DNA kloneerimise etapid. DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
Siduvate otsadega fragmente võib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. 37. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
ellu jääda. Ühes rakus sisalduvate plasmiidide koguarv ja neis sisalduvate geenide arv ei ole püsiva suurusega, geenid liiguvad rõngaskromosoomist plasmiididesse ja tagasi. Rekombinantse DNA puhul peab plasmiidil olema replikatsiooni origin, resistentsusmarkergeen (et oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 41. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
ellu jääda. Ühes rakus sisalduvate plasmiidide koguarv ja neis sisalduvate geenide arv ei ole püsiva suurusega, geenid liiguvad rõngaskromosoomist plasmiididesse ja tagasi. Rekombinantse DNA puhul peab plasmiidil olema replikatsiooni origin, resistentsusmarkergeen (et oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 41. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
· Rinnajuha inimkeha suurim lümfisoon, kogub lümfi alakehast ja vasakust ülemisest poolest. · Parem lümfijuha suubub paremasse venoosnurka, kogub lümfi paremast ülemisest kehapoolest. Lümfikude on üks retikulaarse sidekoe liik. Lümfikoe moodustavad kollageenkiudude võrgustik, seda tootvad fibrotsüüdid ja osalt kiududele kinnitunud, osalt vabad lümfotsüüdid, makrofaagid ja teised rakud. Lümfikoes toimub lümfotsüütide kloneerimine. Lümfikude esineb kas difuusse lümfikoena elundite seintes või koondunud lümfifolliikuliteks. Lümfifolliikulid on siseelundite seinte limaskestas ja lümfisüsteemi elundites asuvad lümfikoe kogumikud. Tonsillid e mandlid on suurte lümfifolliikulite ja difuusse lümfikoe kogumikud. Lümfisõlmede ülesandeks on neist läbi voolava lümfi filtreerimine ja puhastamine. Kui lümfisõlme
Markerid peavad olema ühes lookuses (ainult ühes kohas genoomis). Markerid on neutraalsed ehk ei ole seotud valiku või adaptatsiooniga. Markerid peaks olema eri kromosoomides, et nad oleks üksteisest sõltumatud. Mikrosatelliidid on väga head markerid tüpiseerimiseks, sest: Polümorfsed (kiiresti tekivad ja muteeruvad); Ühes lookuses; Neutraalsed, sest ei kodeeri midagi; Sarnased praktiliselt kõikides oragnismides. DNA Kloneerimine - Eesmärk on saada piisaval hulgal analüüsimiseks spetsiifilist ja puhast DNAd. Kloneerimise etapid: Isoleerida ja puhastada DNA organismist või rakkudest. Lõigata DNA sobiva suurusega tükkideks kasutadas restriktsiooni ensüüme. Viia need DNA tükid kloneerimis vektorisse luues rekombinantse DNA molekuli. Kloneerimise vektor kunstlik DNA molekul, mis on võimeline mingis organismis paljunema (tavaliselt vektor plasmiid, organism aga mikroob)
vljendab ka nende evolutsioonilist vahekorda. Eeldades, et enamik looduses eksisteerivatest bakterirakkudest pole kultiveerimise teel kttesaadavad, on viimastel aastatel ha enam kasutusele vetud molekulaarseid meetodeid, mille abil on vimalik uurida otse keskkonnast eraldatud bakterikoosluste DNA-d ja vltida kultiveerimise selektiivsusest tulenevaid probleeme. Sellised molekulaarbioloogilised meetodid nagu nukleiinhapete ekstraheerimine, polmeraasi ahelreaktsioon (PCR), DNA kloneerimine ja sekveneerimine on teinud vimalikuks uute meetodite arengu, mis on suuresti muutnud meie arusaamist bakterikooslustest ja mikroobide mitmekesisustest looduses. Mitmekesisus: feneetiline ssteem, numbriline taksonoomia- bakterite liikideks rhmitamine phineb morfoloogilistel ja biokeemilistel tunnustel Molekulaarsetest markeritest kasutatakse mikroobide mitmekesisuse uurimisel kige rohkem ribosomaalse operoni geene (16S rDNA, 5S rDNA), samuti ribosomaalsete geenide vahelist
Aheldusrühma skeemi, millele on kantud lookuste nimed ja nendevahelised geneetilised kaugused sentimorganites (cM), nimetatakse geneetiliseks kaardiks. Liitelised geenid-- 22.Geenide lokalisatsioon ,lookused,kromosoomide geneetilised kaardid . · Geneetiline lokalisatsioon - Klassikalise geneetika reeglite järgi peaks iga valku- kodeeriv DNA segment olema haploidses tuumas ühekordselt. Tegelikult on aga taimede ja loomade erinevate geenide kloneerimine näidanud, et vaid 25-50% valku-kodeerivatest geenidest on hulkraksete organismide genoomis esindatud üksikuna; ülejäänud on duplitseerunud. Duplitseerunud geenid kodeerivad mitteidentseid sugulasvalke (näiteks beeta-globiinid, tubuliinid). Duplitseerunud geenid pole enamasti identsed, vaid koosnevad väga sarnastest järjestustest, mis kodeerivad sarnaseid valke. Mõned geeniperekonnad võivad aga sisaldada sadu
Võib koguni öelda, et geenide ja valkude primaarstruktuuri andmestik on muutunud absoluutselt domineerivaks. Eelkõige just andmestik geenide tasemel, sest valkude primaarstruktuuri selgitamine on valdavalt tuletis geeni struktuurist - teades geneetilist koodi (ja splaissingu reegleid seal, kus on tegemist intronitega). Mis siis tingis sellise pöörde? Palju asjaolusid. Esiteks muidugi meetodite kättesaadavus, õigemini nende avastamine (loomine): geenide sekveneerimine, kloneerimine ja amplifitseerimine. Kuidas suhtuvad omavahel klassikalised morfoloogilised meetodid ja molekulaarsed? Mingil metatasemel ei ole vahet, kuid prakrtilised erinevused on arvukad ja üsna suured. Esiteks - primaarstruktuurist tulenevate vahetult kvantitatiivselt hinnatavate tunnuste koguarv on väga palju suurem, kui suvaline morfoloogiliste tunnuste hulk. Vahe on “astronoomiline”: tavalises morfoloogilises võrdluses opereeritakse tosina-paari tunnusega ja harva on neid üle saja
stabiliseerib mRNA-d. Selle järjestuse effekt sõltub ka rakkude kasvukiirusest. E. coli rakkude pooldumisel 40 minuti tagant on ompA mRNA poolestusaeg 17 minutit, UTR puudumisel 3 - 4 minutit. Rakkude kasvu aeglustumisel väheneb ompA mRNA poolestusaeg 5 minutile ka UTR-i olemasolul. UTR moodustab 3 juuksenõelastruktuuri. Stabiliseeriva toime seisukohalt on oluline, et nende ette ei jääks üksikahelalist ala. Katseliselt on näidatud, et ompA UTR-i kloneerimine teiste mRNA-de ette tõstab ka nende stabiilsust. Näiteks bla mRNA (kodeerib -laktamaasi) poolestusaeg tõuseb 3 minutilt 18 minutini. E. coli, Serratia marrescenc'i ja Enterobacter aerogenes'e ompA geenide 5`otste UTR-de võrdlemisel ilmnes, et nende järjestus on erinev, kuid sekundaarstruktuur sarnane. Kõik nad stabiliseerivad E. coli's mRNA-d. mRNA-d stabiliseerivad ka molekuli 3' otsas mittetransleeritavasse alasse jäävad juuksenõelastruktuurid.
annaabi.ee 
