Geneetika eksam (0)

Geneetika 2 kordamisküsimused  Lisaks tekstile ja õpikule vaadake kindlasti ka materjali slaididelt.  1. Võrrelge lüütilq aaise ja mõõduka bakteriofaagi paljunemistsüklit  VIRULENTSED FAAGID – põhjustavad peremeesraku surma  MÕÕDUKAD FAAGID – võivad püsida rakus ilma seda hävitamata  o Lüütiline ja lüsogeenne fvgvb89htsükkel. Lüsogeenne tsükkel võib  keskkonnatingimuste muutudes üle minna lüütiliseks tsükliks  Lüütiline ​: kinnitub peremeesrakule antiretseptori vahendusel; genoom sisestatakse rakku,  tehakse palju DNA/RNA koopiaid, viiruspartiklid pannakse kokku, rakk lüüsitakse  Lüsogeenne ​: kinnitub peremeesrakule antiretseptori vahendusel; genoom sisestatakse  rakku, genoom integreerub peremehe genoomi ja kandub kromosoomi koostisosana 
tütarrakkudesse. Keskkonnatingimuste muutudes võib lüsogeenne faag minna üle lüütilisse 
tsüklisse, mille käigus sünteesitakse viiruse partikleid ning pannakse need kokku. Lõpuks rakk 
lüüsitakse ning uued virionid vabanevad keskkonda, kus nad on võimelised minema 
nakatama järgmisi peremeesrakke  2. Gripiviiruse muteerumine, rekombinantsed gripiviirused ja nendega seotud ohud  Gripiviirus:  o Pinnavalgud hemaglutiniin  ​(H) ​ ja neuraminidaas ​(N)​ muteeruvad kiiresti – ​RNA  polümeraas teeb palju vigu, mida ei parandata!  o Gripiviiruse genoom koosneb 8-st erinevast RNA segmendist, mis pakitakse valkkesta  viiruse assambleerimisel  o Geneetilise materjali segunemine võib toimuda siis, kui 2 sarnast viirust nakatavad  sama rakku  Rekombinantsed girpiviirused ja nendega seotud ohud:  Linnugripp  ​(H5N1) ​:  o Kandub lindudelt inimestele 
o Kardeti  ​viirustevahelist rekombineerumist – uus tüüp, mille vastu puudub täielikult  immuunsus  o Hispaania gripp 1918 – pandeemia; viirus suutis välja lülitada RIG1 geeni, mis  põhjustab immuunsüsteemi ülereageerimise  H1N1 tüvi – seaviirus, „uut tüüpi“ viirus:  o RNA segmendid on segunenud 


o Segunenud segmendid on pärit erinevatelt gripiviirustelt  ​(kahelt seaviiruselt, inimese  viiruselt ja linnuviiruselt)  o Hakkas levima Mehhikos 
o Kandub inimeselt inimesele 
o Kardeti pandeemiat    3. Selgitage retroviiruse paljunemist HIV näitel. HIV-ga nakatunute ravi  Retroviirused:  o RNA genoomilt sünteesitakse pöördtranskriptaasi  ​(revertaasi) ​ abil DNA, mis  integreerub raku genoomi  o Raku kromosomaalse DNA koostises olevalt viiruse genoomilt toimub RNA süntees:  mRNA – viiruse geenide avaldumine; genoomne RNA – viiruse genoomi paljunemine  o AIDS – haigust põhjustab HIV, mis nakatab T-abistajarakke, mis aktiveerivad teisi  immuunrakke; HIV seondub T-abistajarakkude pinnal olevatele CD4/CCR5 
retseptoritele  o Muteerub kiiresti: 1. Pöördtranskriptaas teeb DNA sünteesil palju vigu; 2. Viiruse  kapsiidi pakitakse  2 koopiat RNA molekuli → DNA sünteesil võib toimuda matriitsi 
vahetus → tekib rekombinantne viirus, kui genoomi koopiad ei ole identsed  HIV on retroviirus – tema genoomiks on ssRNA, millelt pöördtranskriptaas sünteesib DNA. 
RNA lülitub peremehe genoomi suvalisse kohta, kui on sünteesitud DNA, siis saab edasi 
sünteesida viirusvalke jms.  HIV-ga nakatunute ravi:  o Pärast nakatumist järgneb akuutne faas – palavik, peavalu, veres palju HIV partikleid.  Järgneb latentne periood (8-10 aastat) – viirus lokaliseerub lümfisüsteemi. Lõppfaas – 
T helperrakkude arv on langenud > 75%, immuunsüsteem ei toimi enam  o Ravimeid HIV-st vabanemiseks pole leitud 
o Ravi toimub iga patsiendi jaoks individuaalse raviplaani alusel 
o Raviks kasutatakse antiretroviiruseid  ​(aeglustab HIV paljunemist ning ei lase HIV-l  nakatada terveid rakke) ​ või siis HI-viiruse vastaseid ravimeid ​(viimasel juhul kestab  ravi elu lõpuni)  o Ravimid on mõeldud takistamaks HIV paljunemist, inhibeeritakse pöördtranskriptaasi  ja proteaasi tööd  Nt:  ​Epvir ​ ja ​Retrovir​ – pöördtranskriptaasi inhibiitorid; ​Crixivan​ – proteaasi inhibiitor  (primaarne translatsiooniprodukt lõigatakse proteaasi abil erinevateks viirusvalkudeks).     


4. Bakterite kaitsemehhanismid bakteriofaagide vastu  Restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem bakterites:  o Kaitseb bakterirakku bakteriofaagide eest 
o W. Arber leidis, et T4 paljunemine on osades  ​E.coli ​ tüvedes restrikteeritud ​(piiratud)  o E.coli ​ tüve B rakkudes paljundatud faagi edasine paljunemine on takistatud tüve K  rakkudes ja vastupidi  o Rakus lagundatakse võõrast DNA-d, mis ei ole antud bakteritüve restriktaasi eest  kaitstud  o CRISPR –  ​clustered, regulatory interspaced short palindromic repeats  o Segment bakteriofaagi genoomist integreerub bakteri kromosoomi spetsiifilisse  CRISPR lookusesse  o CRISPR lookus sisaldab peaaegu identseid kordusjärjestusi ja nende vahele jäävaid  vahealasid ( ​spacers ​), mis pärinevad erinevate viiruste genoomidest  o CRISPR lookuselt transkribeeritud RNA (crRNA) ja CAS geenide poolt kodeeritud  valkude vahel moodustub kompleks, mis seondub rakku nakatava viiruse genoomile 
ja lagundab selle    5. Kuidas on võimalik uurida ja kirjeldada bakteriofaagide mutante? Põhilised  avastused bakteriofaagide geenide kaardistamisest  Mutantide uurimine ja kirjeldamine:  o Teostatakse geneetiline rekombinatsioon ​ ​(ristatakse erinevaid faage)  o Mutantidel on  ​wild-type ​’ist erinev koloonia morfoloogia  o Mutantidel võib olla suurem või väiksem peremeestering 
o Arvutatakse rekombinatsioonisagedust:  ​2 x metsiktüüpi rekombinantide arv      Faagide üldarv  Faagide geenide kaardistamine:  o Faagide geneetiline kaardistamine ​ – geeni peenstruktuuri määramine Benzeri  laboris:  1) Kõige väiksemaks mutatsiooniüksuseks on üks aluspaar (bp) 
2) Rekombinatsioon võib toimuda kahe külgneva aluspaari vahel 
3) Lükati ümber varasem seisukoht nagu oleks geen jagamatu ja seega kõige väiksem  mutatsiooni ja rekombinatsiooni üksus  o Deletsioonmutantide kasutamine geneetilises analüüsis  Kui mutatsioonikohad paiknevad geneetilsel kaardil lähestikku, on rekombinatsioonisagedus 
madal:  1) Rekombinatsioonisagedusest tuleb maha arvata spontaansete revertantide  tekkesagedus 


2) Kaardistatakse deletsioonmutante, mis ei ole võimelised spontaanselt  metsiktüübiks reverteeruma    6. Plasmiidide roll bakterite keskkonnaga kohastumisel. Plasmiidide klassifitseerimise  alused  Plasmiid:  PLASMIIDID – autonoomselt replitseeruvad ekstrakromosomaalsed DNA elemendid, 
valdavalt rõngasmolekulid  o Suurus varieerub 1-200 kb ulatuses  
o Megaplasmiidid > 200 kb  EPISOOMID – plasmiid, mis võib integreeruda kromosoomi (näiteks F plasmiid)  Plasmiidides sisalduv geneetiline informatsioon võimaldab bakteritel paremini kohastuda 
keskkonnatingimustega ​ (näiteks resistentsus antibiootikumidele).  1) Resistentsus antibiootikumidele ​ – ​R-plasmiidid​. Antibiootikumi modifitseerimine  (kloroamfenikooli atsetüül transferaas); antibiootikumi degradeerimine 
(β-laktamaas degradeerib penitsilliine); antibiootikumi rakust väljapumpamine 
(resistentsus tetratsükliinile)  2) Virulentsusfaktorid, toksiinid  3) Bakteriotsiinid  ​– nt: ColE1 poolt on kodeeritud ​E. coli ​ vastased kolitsiinid E1  (permeabiliseerib tsütoplasma membraani), E2 (DNA degradatsioon) ja E3 
(ribosomaalse RNA degradatsioon)  4) Antibiootikumide produktsioon streptomütseetidel  5) Võime kasutada alternatiivseid kasvusubstraate ​ – mullabakterid kasutavad  süsinikuallikana fenoolseid ühendeid  6) Agrobacterium ​'i Ti plasmiidid indutseerivad taimedel tuumoreid  Plasmiidide klassifitseerimise alused:  1) Funktsioonide alusel  2) Sobivusgruppide ​ ​alusel​ – samasse gruppi kuuluvad plasmiidid ei püsi koos  3) Peremeesring  o Kitsa peremeesringiga plasmiidid ​ – replitseeruvad üksnes lähedases suguluses  olevates bakterites  o Replitseeruvad väga erinevates bakteriliikides ​ – võimaldavad geenide  horisontaalset ülekannet erinevate liikide vahel  4) Konjugatiivsed ja mittekonjugatiivsed plasmiidid   


7. Geneetilised elemendid, mis lisaks plasmiididele võimaldavad geenide  horisontaalset ülekannet bakteritel  Lisaks plasmiididele võimaldavad geenide horisontaalset ülekannet bakteritel:  1) Transposoonid ​ – kuna enamus transposoone kannavad antibiootikumide  resistentsusgeene, soodustab transposoonide hüppamine ühest DNA molekulist teise 
(nt: plasmiidist kromosoomi ja vastupidi) resistentsuse kiiret levikut 
bakteripopulatsioonis  Meditsiinis on suur probleem patogeensete bakteritega, kes on endale hankinud erinevaid 
resistentsusgeene, olles sel viisil resistentsed mitmele antibiootikumile korraga. 
Multiresistentsus levib näiteks R plasmiidide abil.  2) Integronid ​ – koht-spetsiifiline rekombinatsioon on vahendatud integraasi kaudu:  integraas lülitab geenikassette integroni, kasutades substraadina  ​attC ​ järjestust  3) Genoomsed saared ​ ​(GEI) ​ – horisontaalselt ülekandunud DNA regioonid; sisaldavad IS  elemente ja integraasi geene  4) Patogeensussaared ​ – sisaldavad virulentsusgeene    8. Bakterite mutandid ja nende kirjeldamine; mutantide isoleerimine  bakterigeneetikas  Bakterite mutandid ja nende kirjeldamine:  1) Antibiootikumile resistentsed mutandid ​ – võimelised kasvama ja moodustama  üksikkolooniaid söötmel, mis sisaldab teatavat antibiootikumi  2) Auksotroofsed mutandid ​ – ei kasva minimaalsöötmel, mis sisaldab ainult  süsinikuallikat ja mineraalsooli, kuna ei ole  võimelised sünteesima mõnda 
aminohapet või nukleotiidi  3) Süsinikuallika mutandid ​ – ei suuda kasvuks kasutada teatavat süsinikuallikat, näiteks  laktoosi  4) Muud tüüpi mutandid ​ – kolooniate morfoloogia; faagiresistentsus;  temperatuuritundlikkus        Mutantide isoleerimine bakterigeneetikas:  1) Lokaliseeritud mutagenees 


o Uuritavassse geeni viiakse mutatsioonid  ​(ainult mingi lõik DNA-st) ​ ning  homoloogilise rekombinatsiooni teel asendatakse bakteri genoomis algse 
geeni järjestus defektse geeni järjestusega  2) Negatiivne selektsioon  o Kasutatakse „rikastusmeetodit“, kus teatud söötmel kasvavad metsiktüüpi  rakud lüüsuvad nt penitsilliini juuresolekul  ​(algselt kasvatatakse aukso- ja  prototroofe rikkal mutageniseeritud söötmel, resuspendeeritakse söötmele, 
kus on mingi aine puudu ning lisaks on penitsilliin; prototroofid suudavad 
kasvada ning 99% neist hukkuvad penitsilliini tõttu; auksotroofid ei suuda 
kasvada ja jäävad ellu; auksotroofid külvatakse järgmisele söötmele...)  3) Transposoonmutagenees:  o Transposoon ​ ​(mobiilne DNA element) ​, mis ​kannab mingit geneetilist  markerit ​, nt resistentsust AB-le, ​inserteerub kromosoomi erinevatesse  kohtadesse ning põhjustab insertsioonikohas asuvate geenide 
inaktivatsiooni  o Paljudele bakteritele eluliselt tähtsate geenide inaktivatsioon on rakule  letaalse toimega  o Isoleeritakse ajutise fenotüübiga mutante, nt temperatuuritundlikke  ​(Ts)  mutante    9. Geneetilise informatsiooni ülekanne transformatsiooni teel: avastamine,  mehhanismid, rakkude kompetentsus. Kuidas on võimalik kindlaks teha, et DNA 
kandus üle just transformatsiooni teel?  Avastamine:  1928 – F. Griffith avastas transformatsiooni  ​S. pneumoniae’s ​. ​II R – kapslita rakud, ei ole  virulentsed, väikesed karedapinnalised kolooniad; III S – limakapsliga rakud, virulentsed, 
suured siledapinnalised kolooniad.  1944 – Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclyn McCarty näitasid, et  ​S. pneumoniae  mittevirulentsete IIR tüüpi rakkude transformeerimist IIIS tüüpi virulentseteks rakkudeks 
põhjustas DNA: ​ DNA preparaati töödeldi erinevate ensüümidega, mis lagundasid kas DNA,  RNA või valgud. Transformatsioonivõime kadus, kui preparaati töödeldi DNaasiga.  Geneetilise informatsiooni ülekanne bakteritel:  1) Transformatsioon ​ – doonori DNA satub retsipientrakku väliskeskkonnast ​(seostub  raku genoomi rekombinatsiooni teel)  2) Transduktsioon ​ – bakteri DNA kandub ühest rakust teise bakteriofaagide abil  3) Konjugatsioon ​ – DNA ülekanne doonorist retsipienti vajab rakkudevahelist kontakti;  üle võib kanduda plasmiid või ka kromosoom  ​(selleks on vaja kindlat plasmiidi, nt  F-plasmiid E.coli’l) 


Transformatsioon:  TRANSFORMATSIOON  ​– protsess, kus retsipientrakk omandab vaba DNA ümbritsevast  keskkonnast  Enne, kui DNA siseneb rakku, lagundatakse üks ahel membraanseoselise eksonukleaasiga. 
Rakku jõudnud ssDNA rekombineerub bakterikromosoomiga homoloogilise 
rekombinatsiooni teel. Kui nukleotiidid ei ole täielikult komplementaarsed, parandatakse 
vead  ​(mismatch repairation) ​ või asendatakse kas retsipient- või doonor-DNA lõik.  o DNA toiduks 
o DNA reparatsiooniks 
o DNA evolutsiooniks  Looduses kinnituvad bakterid pindadele ja moodustavad biofilmi ehk biokilet. Vaba DNA 
(eDNA) ​ aitab moodustuda biofilmi.  Kunstlik transformatsioon:  E.coli ​ ei ole looduslikult kompetentne, kuid saavutab kompetentsuse rakkude töötlemisel  CaCl ​ 2 ​ lahusega​. ​Töötluse tulemusena muutuvad rakud DNA suhtes läbilaskvaks ning  rakusisesed nukleaasid on ajutiselt inaktiveeritud. ​ Toimib efektiivselt plasmiidide korral  (dsDNA !!!!!) ​, mis on võimelised retsipientrakus iseseisvalt replitseeruma. Lineaarse DNA  puhul võib väga madala sagedusega toimuda rekombinatsioon  ​(kui esineb homoloogia  doonori ja retsipiendi DNA vahel) ​, kuid enamasti lagundatakse DNA fragment eksonukleaasi  toimel.  Transformatsiooni abil on võimalik uurida geenidevahelist distantsi:  Lähestikku asuvate geenide puhul on nende poolt kodeeritud markertunnuste 
kotransformatsiooni sagedus kõrgem kui üksteisest kaugel paiknevate geenide puhul 
(rekombinatsiooni sagedus on vastupidi) ​.  Otsesed tõendid, et DNA on geneetiline materjal:  1928 – F. Griffith avastas transformatsiooni  ​S. pneumoniae’s ​.  Streptococcus pneumoniae’ ​l on kahte sorti rakke:  1) II R – kapslita rakud, ei ole virulentsed, väikesed karedapinnalised kolooniad 
2) III S – limakapsliga rakud, virulentsed, suured siledapinnalised kolooniad  *Elus S-rakkude hiirde viies hiir sureb; elus R-rakkude hiirde viies hiir jääb ellu; kuumusega 
töödeldud S-rakkude hiirde viies hiir jääb ellu; kuumtöödeldud S-rakkud ja elus R-rakkude 
hiirde viies hiir sureb, sest on toimunud transformatsioon*  Rakkude kompetentsus: 


DNA sisenemiseks rakku peavad rakud olema eelnevalt kompetentsed.  o Loomulik kompetentsus ​ – esineb nt ​S.pneumoniae’l; B.subtilis’el  ​ja​ H.influenzae’l  (H.influenzae võtab vastu üksnes sama liigi DNA-d)  o Kunstlik kompetentsus ​ – saavutatud laboritingimustes  Kompetentsetel rakkudel on rakupinnal retseptorid, mis on vajalikud eksogeense DNA 
esmaseks seondumiseks. Ekspresseeruvad DNA rakku transportimiseks vajalikud valgud.  S.pneumoniae ​ puhul saavutab esialgu kompetentsuse üksnes väike osa rakupopulatsioonist,  mis seejärel väljutab kasvukeskkonda kompetentsusfaktoreid. Kompetentsus saavutub 
rakukultuuri teatavas vanuses, sageli eksponentsiaalses kasvufaasis.  Geneetilise info ülekandumisviisi kindlakstegemine:  U-toru katse:  Kasutatakse U-kujulist klaastoru, mille õlad on teineteisest isoleeritud klaasfiltriga. Filtrit 
läbivad DNA molekulid ja bakteriofaagid, kuid mitte bakterid. Toru erinevates õlgades on 
erineva genotüübiga bakteritüved ja jälgitakse rekombinantide teket.  1) Filti tõttu on välistatud erineva genotüübiga bakterite rakkudevaheline kontakt –  rekombinante ei saa tekkida konjugatsiooni tagajärjel  2) DNaasi lisamisel kasvukeskkonda lagundatakse rakuväline DNA – välistab  transformatsiooni toimumise  3) Rekombinantide teke DNaasi sisaldavas keskkonnas viitab transduktsioonile    10. Geneetilise informatsiooni ülekanne bakterite konjugatsiooni teel. Bakteri  kromosoomi geneetiline kaardistamine bakterite konjugatsiooni abil  Bakterite konjugatsioon:  Bakterite geneetilise informatsiooni ülekandumise rakust rakku  ​konjugatsiooni​ teel  avastasid 1946. aastal Lederberg ja Tatum.  o Konjugatsiooni toimumiseks  ​peavad rakud kontaktis olema  o Rakkudevahelist  ​kontakti aitavad saavutada doonorraku sugukiud e piilid  Bakterivaheliseks konjugatsiooniks on vajalikud  ​tra  ​geenid:  o Bakterirakkude liitumine ja DNA liikumine rakust rakku  Konjugatiivsed plasmiidid võivad mobiliseerida mittekonjugatiivsete plasmiidide ja 
kromosomaalsete geenide ülekandumist.  Bakteris  ​E.coli ​ on kirjeldatud F-plasmiid e fertiilsusfaktor, mis sisaldab ​tra​ geene. 


o DNA kandub üle doonorist retsipienti läbi konjugatsioonikanali ​ ​(konjugatsioonisilla)  F-plasmiidi ülekanne doonorilt retsipienti:  1) F-pilide kaudu luuakse kontakt ​: doonori F-pili tunneb ära retsipiendi retseptorid  2) Plasmiidi ülekanne ​: üks plasmiidi ahel doonoris ​(F ​+​) ​lõigatakse katki ning hakatakse  DNAd sünteesima veereva ratta mudelil  3) Replitseeritud DNA ahel liigub retsipienti  ​(F ​-​)​, kus sünteesitakse sellele DNA ahelale  komplementaarne ahel  4) Retsipient muutub F ​+​-ks​ ​(transkonjugant ehk rekombinant)  Hfr  ​(high frequency recombination) ​ bakteritüved: F plasmiid integreerub bakteri  kromosoomi.  E.coli ​ rakkude tähistus lähtudes F-plasmiidi olemasolust ja asukohast:  1) F-plasmiid puudub – F ​-  2) F ​+​-- F-plasmiid olemas  3) Hfr – F-plasmiid integreerunud kromosoomi  F-plasmiidi integreerumine kromosoomi:  F-plasmiidi integreerumine toimub HR-i teel. Homoloogia aluseks on IS elemendid 
(insertion sequences) ​. Hfr tüvest toimub kromosomaalsete geenide ülekanne alates  integratsioonisaidist kindlas järjekorras. Enamus F-plasmiidist kandub üle kõige viimasena.  Erinevates Hfr tüvedes on F-plasmiidid integreerunud erinevatesse kohtadesse ja erinevas 
orientatsioonis: kromosomaalsete geenide ülekanne neist tüvedest algab erinevatest 
geenidest ja toimub erinevas järjekorras.  Konjugatsiooniprotsess bakterites:  o Konjugatsiooniprotsessi käigus toimub DNA replikatsioon veereva ratta mudelil 
o Retsipientrakku kandub üle ainult ssDNA, millele komplementaarne DNA ahel  sünteesitakse retsipientrakus  o Kogu bakteri kromosomaalse DNA ülekandumiseks doonorist retsipienti kulub ~100  min  o Enamasti kaob rakkudevaheline kontakt enne protsessi lõpulejõudmist 
o Ülekandunud DNA fragment rekombineerub retsipiendi kromosoomi homoloogilise  DNA järjestusega  o Toimub paarisarv DNA ahelate vahetusi  ​(2 ristsiiret)  o Transkonjugandi  ​(ehk rekombinandi) ​ järglaskonda kandub edasi ainult  kromosomaalne DNA; kromosoomiväline DNA fragment läheb kaotsi  o Hfr tüvede avastamine võimaldas välja töötada bakterikromosoomi geneetilise  kaardistamise metoodika, mis põhineb konjugatsiooniprotsessi katkestamisel 
erinevatel ajamomentidel: vaja söödet, kus saavad kasvada ainult rekombinandid 


(rekombinandil on mingi tunnus, mida doonoril ei ole! Nt on retsipiendid 
streptomütsiin-resistentsed) ​. Kaart on jagatud 100 minutiks – 0-punkti on paigutatud  thr ​ ​(treoniini süneesi)​ lookus: asus kõige esimesena kirjeldatud F-plasmiidi  integratsioonisaidi kõrval  F’ konjugatsioon e seksduktsioon:  1) F’-plasmiidi teke: F-plasmiid võib kromosoomist välja tulla ebatäpselt, haarates kaasa  külgnevaid geene  ​(nt lac geene – laktoosi lagundamine) ​ ​​ ​lac ​geenide sage ülekanne  2) Kromosomaalsete geenide ülekannet F’-plasmiidi koostises nim seksduktsiooniks:  seksduktsiooni tulemusena on rakud F-plasmiidis ja kromosoomis samaaegselt 
asuvate geenide suhtes diploidsed.  ​Võimaldab hinnata kromosoomis ja plasmiidis  olevate alleelide dominantsust ja retsessiivsust ​. F-plasmiidi lülitunud geenid peavad  asuma lähestikku.  Genoomi kaardistamine konjugatsiooni teel:  Hfr tüvede avastamine võimaldas välja töötada bakterikromosoomi geneetilise 
kaardistamise metoodika, mis põhineb konjugatsiooniprotsessi katkestamisel erinevatel 
ajamomentidel.    11. Kuidas toimub bakteriofaagi genoomi pakkimine valkkesta? Geneetilise  informatsiooni ülekandumine üldise ja spetsialiseeritud transduktsiooni teel  Faagi genoomi pakkimiseks valkkesta on faagi genoomis kindlad järjestused, mis on 
markeriteks. Valkkesta pakitakse tavaliselt kuni 105% genoomist. Sõltuvalt sellest, kas faag 
omab lüütilist või lüsogeenset tsüklit, võidakse valkkesta pakkida ka mingi osa peremehe 
genoomist.  Üldine transduktsioon:  Üldine transduktsioon toimub  ​suvalise geneetilise markeri suhtes​, kuna faagi valkkesta  võidakse eksikombel pakkida suvaline DNA fragment bakteri genoomist. Transduktsioonil 
kasutatakse faagidest enim P1  ​(genoom: ~100 kb) ​. Toimub madala sagedusega; moodustub  1-2% faagipartikleid, mis sisaldavad bakteri DNA-d.  Spetsialiseeritud transduktsioon:  Ülekantavad geenid pärinevad kromosoomi kindlast alast, mis külgneb sinna 
inserteerunud faagi genoomiga ​. Kui faag lambda on integreerunud ​E.coli ​ kromosoomi ​gal ​ja  bio ​ geenide vahele, võib ta kromosoomist välja tulla ka ebatäpselt. Ebatäpne väljatulek  toimub sagedusega 10 ​-4​ ning sel juhul on osa faagi geenidest asendatud bakteri geenidega.  Hübriidse faagi genoom on sageli defektne ​ – kui faagi genoomi on lisandunud bakteri  geene, läheb hübriidse genoomi kapsiidi pakkimisel osa faagi geene kaotsi. 


Kromosoomist ebatäpselt välja tulnud faag  ​(defektne!) ​ vajab paljunemiseks helperfaagi,  mis kompenseeriks neid geene, mis on defektsel faagil puudu!!!  ​Kui hübriidne faag nakatab  uut rakku ja integreerib oma genoomi peremehe genoomi, siis sisaldab peremehe genoom 
nii bakteri enda kui ka faagi ning eelmise peremehe geneetilist materjali.  12. Bakteriaalsed IS elemendid ja transposoonid, nende koostisosad. Konservatiivse ja  replikatiivse transpositsiooni mehhanismid  Põhilised transponeeruvad elemendid bakterites – IS elemendid ja transposoonid:  1) IS elemendid ​ ​(insertion sequences) ​ – väikesed, 800-2000 bp pikkused DNA  elemendid.  ​Kodeerivad ainult transpositsiooniks vajalikke valke​. Sama IS-i võib olla  rakus mitu koopiat.  ​Kui sama IS elemendi koopia on nii plasmiidis kui ka  kromosoomis, võib plasmiid homoloogilise rekombinatsiooni teel kromosoomi 
integreeruda ​. Sel viisil toimub F-plasmiidi integreerumine kromosoomi.  IS elementide otstes on pöördkordusjärjestused, tavaliselt 16-40 nt pikkused. Mutatsioonid  IR-ides muudavad elemendi transpositsiooniliselt inaktiivseks. Mõlemale poole IS 
elemendist jäävad lühikesed, enamasti mitte üle 10 nt pikkused 
otsekordusjärjestused  ​(direct repeats, DR) ​. DR-id tekivad märklaud-DNA  duplitseerumise käigus  Otsekordusjärjestuste tekkimine transpositsiooni käigus: transpositsiooni käigus lõhutakse 
fosfodiestersidemed märklaud-DNA-s nii, et tekivad lühikesed üksikahelalised otsad. 
Mobiilne DNA element lülitub lõikekoha vahele ning üksikahelalistele märklaud-DNA 
lõikudele sünteesitakse komplementaarsed DNA ahelad.  o DR-id esinevad nii transposoonide kui ka IS elementide puhul 
2) Transposoonid  ​(Tn) ​ – IS elementidest suuremad. Kodeerivad lisaks transpositsiooniga  seotud valkudele ka teisi valke  ​(nt resistentsus AB-dele, raskemetallidele)  a) Komplekssed Tn-id ​ – sisaldavad mõlemas otsas IS elementi. Tn10 kannab endas  tetratsükliini resistentsusgeeni, sisaldab mõlemas otsas IS elementi IS10  b) Lihttransposoonid ​ – Tn3 perekonda kuuluvad Tn-id IS elemente ei sisalda.  Sarnaselt IS-idele on neil otstes lühikesed, sageli 38 bp pikkused IR-id  Konservatiivse transpositsiooni mehhanismid:  Konservatiivne e lõika ja kleebi transpositsioon  ​– Tn või IS lõigatakse doonormolekulist välja  ja viiakse märklaudmolekuli  ​(elemendi koopiaarv rakus ei suurene!) ​. Toimub osade  IS-elementide ja komplekssete Tn-ide puhul.  Replikatiivse transpositsiooni mehhanismid:  Replikatiivne ​ ​transpositsioon​ ​(nt Tn3 tüüpi elemendid) ​ – transpositsiooni käigus toimub  transponeeruva elemendi replikatsioon, nii et lõpptulemusena jääb koopia transposoonist nii 
doonori kui ka retsipiendi molekuli  ​(koopiaarv suureneb!) ​. 


Mehhanism ​:  1) Kointegraadi moodustumine transposooni ja märklaud-DNA vahel; transposaas TnpA  lõikab doonormolekuli transposooni otste kõrvalt – vabanevad transposooni DNA 
3’-OH otsad, mis atakeerivad fosfodiestersidemeid märklaud-DNA-s, tekitades 
insertsioonisaiti üksikahelalised katked. Järgnevalt viiakse kokku transposooni ja 
märklaud-DNA otsad. Tn3 replitseerub ning tekib kointegraat, kus mõlemad samas 
orientatsioonis asuvad transposooni koopiad on ühenduses nii doonori kui ka 
märklaud-DNA-ga  2) Kointegraadi lagunemine resolvaasi TnpR toimel, toimub sait-spetsiifiline  rekombinatsioon kahe Tn3 koopia vahel  ​res  ​saidis    13. Transposoonidest põhjustatud geneetilised ümberkorraldused. Millised  mutatsioonid võivad põhjustada transposoonide inaktiveerumist?  TE-d põhjustavad ümberkorraldusi kromosoomide struktuuris:  o HR kromosoomi erinevates osades paiknevate homoloogiliste elementide vahel  tekitab deletsioone, inversioone või duplikatsioone  o Kui 2 rekombineeruvat transposooni on kromosoomis samasuunaliselt, siis nende  vahele jääv ala deleteerub  o Kui 2 rekombineeruvat transposooni on kromosoomis vastupidises orientatsioonis,  siis nende vahele jääv ala inverteerub  ​(pöördub ümber)  o TE-d võivad indutseerida kromosoomidevahelisi ümberkorraldusi nii homoloogiliste  kui ka mittehomoloogiliste kromosoomide puhul. Tütarkromatiidide vahelise 
ebavõrdse ristsiirde tulemusena tekib 2 produkti: 1) kromosoom, milles 
transposoonidevaheline ala on duplitseerunud; 2) kromosoom, millest 
transposoonidevaheline ala on kaotsi läinud  o Inimesel on  ​Alu ​ järjestuste poolt põhjustatud ebavõrdse homoloogilise  rekombinatsiooniga seotud >30 päranduvat haigust ja 16 erinevat vähijuhtu  o Glycogen storage disease ​ – L1 elementide vahelt on deleteerunud 7,5 kb DNA-d;  metabolismihäired  o Geenide duplikatsioon ja pseudogeenide teke LINE elementide kaudu.  Retrotransposoonid võivad transponeerumisel kaasa haarata külgnevaid alasid      Transposoonide inaktiveerumist võivad põhjustada:  Transpositsiooni viib läbi transposaas, mis seondub spetsiifiliselt elemendi otstes olevatele 
pöördkordusjärjestustele  ​(inverted repeats IR) ​. ​Mutatsioonid IR-ides või transposaasis  inaktiveerivad elemendi. 


14. Tooge näiteid DNA transposoonidest eukarüootides. P-elementidest põhjustatud  hübriidne düsgenees, selle mehhanismid  1) RNA elemendid ​ – retrotransposoonid, transponeeruvad üle RNA vahevormi. Kui  transposoon paikneb genoomis, siis on sellel RNA vaheühend, millelt sünteesitakse 
DNA, mis seejärel lülitub mingisse genoomi piirkonda  2) DNA transposoonid  Taimedel on lisaks klass I ja klass II elementidele ka helitronid.  o Maisi Ac ja Ds elemendid 
o P elemendid äädikakärbestes  Hübriidne düsgenees: ​ ​äädikakärbse liinide M ja P ristamisel tekib järglaskond, mille puhul  ilmnevad katked kromosoomides ning on kõrgenenud mutatsioonisagedus ​. ​F1 põlvkonna  järglased ei ole elujõulised, sest neil on palju mutatsioone. ​ ​Transponeeruv element esines  ainult P tüves. ​ P elemendi transpositsiooni võimaldas M tsütotüüp (munaraku tsütoplasma).  P elemendid transponeeruvad ainult sugurakkude eellastes ​ ​– F1 põlvkond on elujõuline​.  P tsütotüüp pärsib  ​P  ​elemendi transponeerumist ja on iseloomulik liinidele, mis sisaldavad  genoomis  ​P ​ elemente​. ​M tsütotüüp võimaldab P elementide transponeerumist, kuna  puudub transpositsiooni pärssiv faktor ​. M tsütotüüp on iseloomulik liinidele, mille  kromosoomides  ​P ​ elemendid puuduvad. ​F1 põlvkonna somaatilistes rakkudes on ​P  elementide liikumine takistatud, kuna transposaasi mRNA alternatiivse splaissingu tõttu 
sünteesitakse defektne valk. Et mutatsioonid avalduda saaksid, F1 hübriide ristatakse. F1 
põlvkonna järglastes on mutantsed geenid  ​P ​ elemendi poolt märgistatud, lihtsustades  sellega nende geenide isoleerimist ja identifitseerimist ​.  15. Retroviiruse-laadsed elemendid ja retroposoonid eukarüootides. Enimlevinud  transponeerivad elemendid inimese genoomis  Retroviiruse-laadsed elemendid:  Ehitus sarnaneb retroviiruste genoomile.  ​Elementide mõlemas otsas on LTR järjestused  (long terminal repeats) ​, ​mis on orienteeritud samasuunaliselt ja mõnisada nukleotiidi  pikad ​. Elemendi ​keskel on kodeerivad järjestused, mis on homoloogilised retroviiruste​ gag  (viiruse kapsiidi struktuurvalk) ​ ja pol ​(pöörtranskriptaas/integraas)​ ​geenidele​.  Ty1 element on leitud pagaripärmist  ​(saccharomyces cerevisiae) ​; Ty element on 5,9 kb  pikkune, sisaldab 340 bp pikkuseid LTR-e. Tekitab transpositsioonil 5 bp pikkuseid 
otsekordusjärjestusi. Pärmi genoomis on leitud 35 koopiat Ty elementi. TyA ja TyB 
(pöördtranskriptaas ehk revertaas, mis sünteesib Ty elemendi RNA-lt dsDNA) ​ on ​gag​ ja ​pol  geenide homoloogid. DNA molekul inserteerub genoomi, tekitades sel viisil Ty1 elemendi 
koopia genoomi teises piirkonnas. Ty moodustab viiruselaadseid partikleid.  Retroposoonid: 


Äädikakärbses on kirjeldatud F, G ja I retrosposonid. Imetajatel on levinud  ​LINE-d​ ​(long  inserted nuclear elements, 6-7 kb) ​. ​Retroposoonide otstes pole LTR-e, kuid nende ühes  otsas on homogeenne A:T aluspaaridest koosnev järjestus ​. ​A:T järjestus liitub retroposooni  koostisesse pöördtranskriptisooni käigus, kuna revertaas kasutab matriitsina RNA 
molekuli, mille 3’-otsa on lisatud polü-A-saba ​. ​SINE​ ​(short inserted nuclear elements) ​ RNA  pealt toimub pöördtranskriptsioon L1 poolt kodeeritud ensüümi abil  ​(siia kuuluvad Alu ja  MIR elemendid) ​.  Nt: L1 inaktiveerib geene ja põhjustab ümberkorraldusi. L1 transpositsioonist teatati 1988. 
aastal, kui hemofiiliat põdeval patsiendil kirjeldati transponeeruva elemendi inserteerumist 
22. kromosoomist X kromosoomi lookusesse, mis kodeerib verehüübefaktorit VIII.  Enamlevinud transponeeruvad elemendid inimese organismis:  1) LTR elemendid ​ – HERV ​(endogenous retroviruses) ​ – 8% genoomist; lülitunud genoomi  varem kui 25 milj aastat tagasi; inaktiivsed  2) L1 elemendid ​ ​(LINE1) ​ – 17% genoomist; 500 000 koopiat genoomis; 150 milj aastat  tagasi; 100 koopiat veel aktiivsed; funktsionaalsed 6 kb pikad  3) Alu elemendid ​ – üle miljoni koopia; 65 milj aastat tagasi; 300 bp pikkused; sisaldavad  kahte 7SL RNA geeni  ​(signal recognition particle) ​, mis võivad mõjutada teiste geenide  avaldumist  4) SVA elemendid ​ – 3000 koopia; 2 kb pikkused; sisaldavad Alu-laadset ja HERV-laadset  regiooni; 25 milj aastat tagasi    16. Transponeeruvate elementide osa genoomi evolutsioonis. Tooge näiteid  TE-d võtavad enda alla märkimisväärse osa genoomist ​ – äädikakärbsel nt 15-20% kogu  genoomist. TE-del on oluline roll mutatsioonide tekitamisel. Pooled äädikakärbsel kirjeldatud 
spontaansetest mutatsioonidest on põhjustatud mobiilsete elementide poolt.  Nt: Erinevate TE-de insertisioonid geeni  ​white ​ regiooni. Paljudel äädikakärbestel on sellesse  geeni inserteerunud TE-d, mis võivad olla väga erinevad, mis põhjustavad mutatsiooni  ​white ​.  TE-d põhjustavad ümberkorraldusi kromosoomide struktuuris:  o HR kromosoomi erinevates osade ​s paiknevate homoloogiliste elementide vahel  deletsioone ​, inversioone või duplikatsioone  o Kui  ​2 rekombineeruvat transposooni on kromosoomis samasuunaliselt, siis nende  vahele jääv ala deleteerub  o Kui 2 rekombineeruvat transposooni on kromosoomis  ​vastupidises orientatsioonis,  siis nende vahele jääv ala inverteerub ​ ​(pöördub ümber)  o TE-d võivad indutseerida kromosoomidevahelisi  ​ümberkorraldusi nii homoloogiliste  kui ka mittehomoloogiliste kromosoomide puhul ​. Tütarkromatiidide vahelise  ebavõrdse  ​ristsiirde tulemusena tekib 2 produkti: 1) kromosoom, milles 


transposoonidevaheline ala on duplitseerunud; 2) kromosoom, millest 
transposoonidevaheline ala on kaotsi läinud  o Inimesel on  ​Alu ​ järjestuste poolt põhjustatud ebavõrdse homoloogilise  rekombinatsiooniga seotud >30 päranduvat haigust ja 16 erinevat vähijuhtu  o Glycogen storage disease ​ – L1 elementide vahelt on deleteerunud 7,5 kb DNA-d;  metabolismihäired  o Geenide duplikatsioon ja pseudogeenide teke LINE elementide kaudu.  Retrotransposoonid võivad transponeerumisel kaasa haarata külgnevaid alasid    17. Tooge näiteid tsütoplasmaatilisest pärilikkusest ja selgitage geneetilist tagapõhja  TSÜTOPLASMAATILINE PÄRILIKKUS – pärilikkuse ülekanne, mis sõltub tsütoplasmast või 
tsütoplasmas olevatest struktuuridest, mitte aga tuumageenidest. ​ Nimetatakse ka  kromosoomiväliseks pärilikkuseks. Näiteks  ​mitokondriaalne DNA mitokondrites ​( ​nt:  nägemisnärvi kahjustus; luuüdi-pankrease sündroom) ​ ja plastiidne DNA taimedel ​(​taimede  lehtede mosaiiksus nt sügisel, kui lehed värvuma hakkavad) ​, mis pärandub edasi sõltumatult  tuuma kromosoomide jagunemisest.  Tsütoplasmaatilise pärilikkuse geneetiline tagapõhi:  Edasi võivad kanduda haigused, mis on seotud emapoolsete rakuorganellidega ​ ​(nt  mitokondriaalsed haigused) ​.  18. Võrrelge erinevate organismide mitokondriaalset genoomi.  Mitokondriaalsete  geenide funktsioonid. Mitokondrite seos vananemisega  o mtDNA genoomi suurus varieerub organismiti:  ​selgroogsetel 16-17 kb; õistaimedel  kuni 2500 kb  o Mitokondrite genoomi koopiaarv raku kohta on kõrge: selgroogsete somaatilistes  rakkudes <1000 koopiat; ootsüütides 10 ​8​ mtDNA koopiat raku kohta​ ​(mtDNA  pärandub emaliini pidi!)  o Enamasti on  ​mtDNA molekulid tsirkulaarsed  o Pärmidel ​ on lisaks tsirkulaarsele vormilse ​ka lineaarsed vormid​ ​(replikatsiooni  vaheproduktid)  o Mitokondritel on oma replikatsiooni-, transkriptsiooni- ja translatsiooniaparaat    Mitokondriaalsete geenide funktsioonid:  Mitokondriaalsed geenid kodeerivad ribosomaalset RNAd, tRNAd ning oksüdatiivsel 
fosforüülimisel osalevaid ensüüme.  Mitokondrite seos vananemisega: 


Kalorite hulga vähendamine katseloomade toidus pikendab nende eluiga: väheneb 
elektronide pealevoog mitokondriaalsele hingamisahelale, seoses sellega tekib ka vähem 
ROS-i ja DNA kahjustusi mtDNA-s ​.  Lühenes hiirte eluiga, kus oli geneetiliselt inaktiveeritud MnSOD.  Inimese katalaasi geeni üleekspressioon hiirtes pikendas hiirte eluiga, nende loomade 
lihasrakkudes olevate mitokondrite puhul akumuleerus elu jooksul vähem DNA kahjustusi ​.  *Saadud on ka vastuolulisi tulemusi:  ​ROS-i hulga liiga tugev allasurumine antioksüdantidega  ei aktiveeri katseloomadel signaalradu, mis on vajalikud pikaealisuseks ​.  Mutatsioonid vähendavad mitokondrite energiatootlikkust, mis viib vananemiseni – 
rakkude apoptoos ​: katse hiirtega, kus mtDNA replikatsiooni läbiviival DNA polümeraasil  puudus vigu korrigeeriv aktiivsus  ​(mutatsioonisagedus suurenes erinevates kudedes 3-11X) ​.  mtDNA mutatsioonide hulga suurenemisega ei kaasnenud ROS-i hulga suurenemist.  Mitokondrite seos vananemisega:  ​mitokondriaalne ROS-i kahjustus   mtDNA  punktmutatsioonid   mtDNA mutantne amplifikatsioon   mtPTP aktiveerumine 
(mitochondrial permeabilitu transition...) ​   raku surm  19. Mitokondris ja rakutuumas asuvate geenide koostoime. Mitokondriaalse  valgusünteesi eripära  Enamus mitokondriaalsete geenide produkte toimivad mitokondris. Neist üksi mitokondrite 
elutegevuseks ei piisa:  ​mitokondrite ribosoomid koosnevad mitokondriaalse päritoluga  RNA-st ja rakutuuma poolt kodeeritud valkudest ​.  Ribosoomivalgud sünteesitakse tsütosoolis ja transporditakse mitokondritesse. Paljud 
energiatootmisega seotud polüpeptiididest on tuumavalgud. Nt ATPaasi osa subühikuid on 
kodeeritud tuumageenide, osa aga mtDNA poolt ​.  Tuumageenid kodeerivad ~1500 mitokondrites toimivaid valke.  Mitokondriaalse valgusünteesi eripära:  Translatsioonimehhanismid mitokondrites ja tsütosoolis on põhimõtteliselt sarnased. 
Erinevus on koodonkasutuses ​ ​(nt  ​AUA – üldiselt Ile koodon, aga pärmi mitokondrites  määrab ta Met ​; UGA – üldiselt stoppkoodon, taimedes nt hoopis Trp koodon; ​AGA/AGG –  üldiselt Arg, pärmil ja selgroogsetel stoppkoodon ​ jne)​.  20. Mitokondriaalsed haigused ja nende pärandumine . Inimese evolutsiooni uurimine  mtDNA järjestuste võrdluse põhjal  Mitmed inimesel kirjeldatud haigused on seotud mutatsioonidega mtDNA-s ja päranduvad 
edasi emaliini pidi ​. ​Energiatootlikkuse langus põhjustab neuronite apoptoosi ja nekroosi. 


Punktmutatsioonide ja deletsioonide akumuleerumine seoses Parkinsoni, Alzheimeri, 
Huntingtoni tõve ja ALS-iga ​ ​(amytrophic lateral sclerosis) ​.  Mitokondriaalse haiguse avaldumismäär sõltub mutantsete mitokondrite hulgast 
munarakus ​ ​(keharakkudes on tavaliselt sadu mitokondreid, neis kõigis on 2-7 mtDNA  genoomi) ​.  Haigustest saaks lapsi säästa, kui asendada ema kahjustatud mitokondrid  ​(three-parent  embryo; vajalik mitokondri doonor) ​.  Nt:  ​Nägemisnärvi kahjustus LHON – avaldub täiskasvanutel ja lõpeb haigete  pimedaksjäämisega; mutatsioonid mtDNA-s muudavad hingamises osalevate ensüümide 
AH-list järjestust. Kui mitokondrite energiatootlikkus väheneb, siis nägeminärv kärbub.        Müopaatia – lihaste degenereerumine  ​(lihaste nõrkus) ​. Kardiomüopaatia        Pearsoni luuüdi-pankrease sündroom – avaldub lastel ja on tavaliselt surmaga lõppev 
(väheneb luuüdi rakkude arv) ​. Pearsoni sündroomi põhjustab suur deletsioon mtDNA-st  Osa mitokondriaalsetest haigustest on põhjustatud mutatsioonidest tuumageenides. 
Mitokondriaalse hingamisega on seotud >70 tuumageeni, mis kodeerivad valkude 
subühikuid, mis osalevad protsessis otseselt. Lisaks on sajad geenid, mis reguleerivad 
oksüdatiivses fosforüleerimises osaleva valkkompleksi assambleerimist, funktsioneerimist ja 
degradeerimist.  ​Haiguste korral on eelkõige mutantsed geenid, mis on seotud mtDNA  replikatsiooni ja transkriptsiooniga ​.  Nt: koensüüm Q10  ​(ubikinoon) ​ defektsus – Q10 on hingamisahela lipofiilne komponent, mis  toimib ka kui antioksüdant ja membraanide stabiliseerija.  mtDNA-s tekkinud mutatsioonide analüüs võimaldab uurida inimese evolutsiooni:  o mtDNA evolutsionerub 10X kiiremini võrreldes rakutuuma DNA-ga tänu mtDNA  kõrgele koopiaarvule  o mtDNA analüüs võimaldab rekonstrueerida ka sündmusi, mis eluslooduse  evolutsiooni seisukohalt on toimunud alles suhteliselt hiljuti  Nt:  ​Leiti, et Neanderthali inimene ei ole kaasaegse inimese vahetu eellane ​– kaasaegse  inimese ja Neanderthali inimese liinide lahknemine toimus juba 550 000 – 690 000 a tagasi 
(ehk siis varem, kui kujunes kaasaegne inimene) ​.  21. Selgitage geenide kloneerimise põhimõtet (kasutatavad ensüümid,  klooneerimisvektori omadused). Rekombinantset DNA-d sisaldavate kloonide 
selekteerimine 


Geenide molekulaarseks analüüsiks kasutatakse rekombinantse DNA tehnoloogiat: DNA 
fragmentide isoleerimine genoomist ning viimine replitseeruvatesse DNA molekulidesse – 
kloneerimisvektoritesse.  Saadud rekombinantset DNA-d paljundatakse rakkudes – saadakse palju koopiaid ehk 
kloone ​. Vastavat protseduuri nimetatakse ​geenide kloneerimiseks​ ​(kloonimiseks) ​.  Kloneerimisel on mitmeid rakendusi:  o DNA primaarjärjestuse määramine 
o Geeni(de) avaldumise regulatsiooni uurimine 
o Geeniproduktide funktsioonide uurimine  
o Geenitehnoloogia  Lisaks geenide kloneerimisele on võimalik DNA-d paljundada nii  ​in vivo ​ kui ​in vitro​ – PCR.  Kasutatavad ensüümid:  o Nukleaasid – ensüümid, mis lagundavad NH-s fosfodiestersidemeid  * ​Eksonukleaasid​ – lagundavad NH ahelat kas 5’- või 3’-otsast  * ​Endonukleaasid​ – lagundavad NH-d, lõhkudes fosfodiestersidemeid ahelasiseselt ​(nt  restriktsioonilised endonukleaasid ehk restrikaasid) ​. Restriktaasid tunnevad ära  spetsiifilisi DNA järjestusi, lõikeproduktid on kas kleepuvate või tömpide otstega. 
Restriktaas2 tunneb ära palintroomseid järjestusi ja teeb katked DNA ahelatesse  o DNA ligaas – ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad, katalüüsides  fosfodiestersideme moodustumist 5’-fosfaadi ja 3’-OH vahel  o Restriktaas – ensüüm, mis lõikab DNA ahelaid katki  Rekombinantse DNA isoleerimiseks ja amplifitseerimiseks peavad kloneerimisvektoril olema 
järgmised omadused:  1) Võime iseseisvalt replitseeruda ​ ​(sisaldab ori piirkonda (DNA replikatsiooni  alguspunkt) ​ ​ja replikatsiooni initsiaatorvalgu geeni)  2) Sisaldab dominantset selektiivset markergeeni ​ ​(AB resistentsusgeen; nt ampillitsiini  resistentsusgeen amp ​r​)  3) Sisaldab unikaalseid restriktaaside lõikesaite  Rekombinantset DNA-d sisaldavate kloonide selekteerimine:    22. Tooge näiteid plasmiididel ja viirustel põhinevatest klooneerimisvektoritest ja  nende rakendusest 


Kloneerimisvektoritena kasutatakse plasmiidide ja viiruste genoome.  Paljudesse vektoritesse on viidud sünteetiline DNA järjestus, mis sisaldab unikaalseid 
lõikesaite erinevatele restriktaasidele – polülinker ehk multikloneerimissait  ​(MCS) ​.  Insertsioonilise inaktivatsiooniga vektorid:  Plasmiidid viiakse bakterisse transformatsiooni teel  ​(baktereid töödeldakse CaCl ​ 2 ​-ga, et  permeabiliseerida rakku) ​. Kloneerimissaidid on viidud vektoris olevasse geeni, mille  avaldumist on lihtne testida ​:  1) Ravimiresistentsusgeenid ​ – pBR322-s asuva ​tet ​ geeni inaktivatsioon  2) Värvusreaktsiooni kaudu ​ – ​sini-valge test​; testitav ​lacZ ​ geeni inaktivatsioon pUC18 ja  pUC19 vektorites. LacZ geen kodeerib beeta-galaktosidaasi  ​(lagundab laktoosi Glc-iks  ja Gal-iks) ​, mis on​ ​võimeline lagundama substraati X-gal, mille tulemusena tekib sinist  värvi produkt bromokloroindool. Aktiivset beeta-galaktosidaasi sisaldavate rakkude 
kolooniad on X-gal-i sisaldavatel söötmetel sinist värvi; rakud, milles on see ensüüm 
inaktiivne, moodustuvad X-gal-i söötmetel valged kolooniad. Valged kolooniad 
sisaldavad rekombinantset DNA-d, kus võõras DNA on inserteerunud lacZ geeni 
järjestusse  Inserdi mittetoimumise põhjused: plasmiidi otsad kleepuvad tagasi kokku; restriktaas pole 
kõiki plasmiide katki lõiganud.  Ekspressioonivektorid:  Inserteerunud DNA-s sisalduvaid geene transkribeeritakse vektoris oleva promootori alt. 
pUC18 ja pUC19 ning pBluescript vektorid sisaldavad  ​lac ​ geenide ​(laktoosi metabolism)  promootorit. Enamasti on transkriptsioon promootoritelt reguleeritav induktori lisamisega 
bakterite kasvukeskkonda.  Promootorite või transkriptsiooni terminaatorjärjestuste testimine: võimaldavad isoleerida 
DNA fragmente, mis sisaldavad promootorit või transkriptsiooni terminaatorit  ​(geeni  maksimaalseks ekspressiooniks kasutatakse tihtipeale ka faagide promootoreid, nt T7) ​.  Jälgitakse vastavalt kas testgeeni transkriptsiooni aktivatsiooni või terminatsiooni.  Kosmiidid:  KOSMIIDID – 4-6 kb suurused plasmiidid, mis sisaldavad faag lambda  ​cos ​ järjestusi.  Lisaks sellele sisaldavad nad:  1) AB resistentsusgeeni plasmiidi sisaldavate bakterirakkude selektsiooniks 
2) Järjestusi plasmiidi replikatsiooniks 
3) Unikaalseid restriktsioonisaite kloneerimiseks 


Cos ​ järjestused tuntakse ära faag lambda pakkimisaparaadi poolt​ ​(pakkimissignaal)​.  Lõikamisel  ​cos ​ saidist tekivad 12 bp ssDNA otsad.  Kosmiidid võimaldavad kloneerida suuri, kuni 45 kb pikkusi DNA fragmente ​.  Rekombinantsed DNA molekulised pakitakse  ​in vitro ​ faagi kapsiidi. Kuna pakkimisel on  olulised ainult  ​cos ​ saidid ja DNA molekuli pikkus, pakitakse ainult rekombinantsed DNA  molekulid kindla insertsiooni pikkusega ​. ​Nakatatud rakkudes replitseerub vektor nagu  plasmiid, selektsiooniks on ravimi resistentsusgeeni avaldumine ​.  Vektorid bakteriofaagide DNA-st:  M13 – filamentne faag. Filamentsed faagid nakatavad rakke F-pilide kaudu – nakatatavad 
rakud peavad olema „isased“, st. sisaldama F-plasmiidi. Filamentsete faagide genoomiks on 
ssDNA, mis on kodeeriv ahel ehk + ahel. ssDNA genoomi paljundamine toimub üle dsDNA 
vahevormi, mida nimetatakse replikatiivseks vormiks  ​(RF) ​.  M13 genoomi baasil on konstrueeritud vektorid M13mp18 ja M13mp19  ​(dsDNA!!!) ​.  Sisaldavad lisaks faagi DNA-le multikloneerimissaiti ja  ​lacZ  ​geeni järjestust. Rekombinantsete  plasmiidide teket testitakse värvusreaktsiooni kaudu  ​(sini-valge test; lacZ pole aktiveerunud,  siis sinine laik?) ​. Faagipartiklisse pakitakse alati + ahel. Sõltuvalt fragmendi orientatsioonist  vektori replikatsiooni alguspunkti suhtes on võimalik ssDNA-na amplifitseerida valikuliselt 
kas ühte või teist kloneeritud DNA ahelatest. ssDNA isoleeritakse faagipartiklitest, dsDNA 
(RF) ​ isoleerimine toimub aga rakkudest.  Fagemiidid:  Fagemiidide puhul on võimalik eraldada nii dsDNA-d kui ka ssDNA-d  ​(võimalik paljundada  nii plasmiidi kui ka faagi analoogina) ​.  Fagemiidid sisaldavad:  1) Plasmiidi replikatsiooni initsiatsiooniks vajalikke järjestusi 
2) Selektsioonimarkerit 
3) Filamentse faagi genoomi  Rakkude nakatamisel sobiva helperfaagiga toimub ümberlülitumine plasmiidi 
replikatsioonilt ssDNA replikatsioonile ​. ssDNA-d eraldatakse faagipartiklitest. ssDNA-l on  mitu kasutust:  1) DNA nukleotiidse järjestuse määramine 
2) DNA koht-suunatud mutagenees 
3) Ahela-spetsiifiliste DNA proovide valmistamine NH-de hübridisatsiooniks  Faag lambda genoomi kasutamine kloneerimisvektorina:  Faag lambda genoomil põhinevad vektorid võimaldavad kloneerida suuri DNA fragmente. 
Olemas on süsteemid, mis takistavad mitterekombinantide paljunemist. 


Infektsioonivõimelised on ainult rekombinantset DNA-d sisaldavad partiklid, mis sisaldavad 
~15 kb võõrast DNA-d.  o Kasutatakse DNA raamatukogude konstrueerimiseks ​: rekombinantsed molekulid  sisaldavad erinevaid DNA fragmente, mis katavad kogu genoomi  o Rekombinantseid DNA molekule sisaldavaid faagipartikleid sisaldavat lüsaati  säilitatakse 4⁰C juures 0,3% kloroformi juuresolekul  Bakteris ja imetaja rakkudes replitseeruv vektor:  sacB ​ – levaan sukraas, katalüüsib fruktoosi rühma ülekannet erinevatele suhkrutele, letaalne  kui sööde sisaldab 5% sahharoosi.  ​Võimaldab selekteerida inserdiga vektorit​ ​(DNA lõik  inserteerunud BamHI ​ ​saiti)​. sacB-sse viiakse replitseeruv faktor; plasmiid peab sisaldama  eukarüootse viiruse genoomi  ​(genoomi osa) ​.  Kunstlikud kromosoomid:  Plasmiidide või viiruste baasil konstrueeritud vektorid ei võimalda kloneerida üle 45 kb 
pikkuseid DNA fragmente. Suuremate DNA segmentide kloneerimiseks kasutatakse pärmi 
kunstlikke kromosoome YAC-e ​ ​(yeast artificial chromosomes) ​, mis lasevad kloneerida  200-500 kb suuruseid fragmente.  YAC-id sisaldavad:  1) Pärmi replikatsiooni  ​ori ​ piirkonda ​(ARS – autonomously replivating sequence)  2) Pärmi tsentromeeri 
3) Kahte pärmikromosoomi telomeeri molekuli mõlemas otsas 
4) Selektiivset markerit – tavaliselt metsiktüüpi geen, mis taastab peremeesraku  prototroofsuse  5) Multiklorneerimissaiti  BAC – bacterial artificial chromosome.  ​BAC-id on konstrueeritud F-plasmiidi baasil ja on  YAC-idega võrreldes vähem komplekssed ​. Replitseeruvad ​E.coli ​ rakkudes sarnaselt  plasmiididega.  23. DNA raamatukogude konstrueerimine. Võrrelge genoomset ja cDNA raamatukogu  DNA raamatukogude konstrueerimine ja analüüs:  1) Genoomse DNA raamatukogu ​ – sisaldab erinevaid DNA kloone, mis katavad  summaarselt kogu genoomi  Kasutatakse restriktaasi, mis tekitab kleepuvaid otsi ​. Tömpide otstega DNA fragmentide  kloneerimine:  ​kleepuvate otste lisamine DNA fragmentidele ja vektorile toimub  terminaalse transferaasi abil. Vektorit ja kloneeritavaid DNA fragmente töödeldakse 
esmalt faag lambda eksonukleaasiga ​ ​(DNA „süüakse“ ahelate 5’-otstest lühemaks) ​. ​Seejärel  lisatakse 3’-üksikahelalistele otstele terminaalse transferaasi abil nukleotiide – vektori 


DNA-le lisatakse polü-A sabad ja genoomse DNA fragmentidele polü-T sabad. Järgnevalt 
liidetakse vektori DNA genoomse DNA-ga.   2) cDNA raamatukogu ​ – tahetakse saada ainult ​valku kodeerivaid järjestusi​; ​rakkudest  isoleeritud mRNA-lt sünteesitakse pöördtranskriptaasiga komplementaarne DNA 
ahel cDNA  ​(complementary DNA) ​ ja kloneeritakse​. cDNA raamatukogu sisaldab  ainult ekspresseeruvate geenide kodeerivaid järjestusi  Kõrgemate loomade ja taimede genoomis on palju DNA järjestusi, mis on geneetiliselt 
inaktiivsed.  ​Funktsionaalsete DNA järjestuste kloneerimiseks on otstarbekas sünteesida  rakus eraldatud mRNA-le komplementaarne DNA – cDNA ​.  cDNA sünteesil kasutatakse  praimerina polü-T oligomeere.  ​Pöördtranskriptaas ehk revertaas sünteesib mRNA-le  komplementaarse DNA ahela. Ribonukleaas H degradeerib RNA ahela. RNA degradatsioonil 
tekkinud lühikesed fragmendid on praimeriteks DNA sünteesil. DNA teise ahela sünteesib 
DNA pol I, mis ühtlasi kõrvaldab molekulist ka RNA praimerid, asendades RNA järjestuse DNA 
järjestusega. DNA ligaas liidab DNA ahelate otsad. Kaksikahelalised cDNA molekulid 
inserteeritakse vektorisse eelpool kirjeldatud strateegia alusel ​.  DNA raamatukoguks vajalik rekombinantsete kloonide arv N: N sõltub genoomi suurusest. 
Eeldades, et kõigil DNA fragmentidel on võrdne võimalus saada inserteeritud 
kloneerimisvektorisse, saame arvutada kloonide hulga, mis on vajalik, et antud tõenäosusega 
P isoleerida meid huvitav rekombinantse DNA kloon.  N = ln(1−f) ln(1−P )   f – näitab, kui suure fraktsiooni genoomist võtab enda alla keskmise pikkusega  DNA fragment DNA raamatukogus.  24. Selgitage, mis eesmärgil rakendatakse  ​Southern ​, ​Nothern​ ja ​Western blot​ meetodit  o Southern blot: ​ kasutatakse ​DNA analüüsiks  On teada, et bakteri genoom (kromosoom või plasmiid) sisaldab mingit meid huvitavat geeni, 
kuid ei teata, kus täpselt see genoomis asub. Selleks  ​lõigatakse DNA restriktaasiga ning  teostatakse geelelektroforees. DNA fragmendid lahutatakse geelelktroforeesil ning 
voolutatakse geelist nitrotselluloosfiltrile. Geelile asetatakse nitrotselluloosfilter ja selle otsa 
virn filterpabereid, mis imavad vedelikku üles, tõmmates sellega DNA geelist filtrile. Järgneb 
filtrile kandunud DNA hübridisatsioon radioaktiivse prooviga, mis on komplementaarne 
huvipakkuva geeniga või muu uuritava DNA piirkonnaga. Kui DNA on homoloogiline, siis 
toimub hübridiseerumine proovis oleva DNA-ga ning UV-valguses muutub piirkond 
nähtavaks ​ ​(on võimalik lokaliseerida meid huvitav piirkond genoomis) ​.  Et hinnata meid huvitava DNA fragmendi suurust, kasutatakse geelelektroforeesil alati 
suurusmarkerit.  Meditsiinis: kasutatakse nt tsüstilise fibroosi molekulaarses diagnostikas!  o Northern blot: ​ kasutatakse ​RNA analüüsiks 


Meetod põhineb  ​RNA-de lahutamisel geelelektroforeesil ning nende hübridiseerimisel  radioaktiivse prooviga filtritel ​. ​Meetod on oluline selgitamaks, millistes kudedes/rakkudes  meid huvitav geen ekspresseerub. Võimalik on kindlaks teha mRNA produkti suurus. Kui 
DNA fragmentide lahutamine toimub neutraalse pH juures  ​(DNA on kaheahelaline) ​, siis  kuna RNA on üheahelaline, kasutatakse denatureerivat keskkonda ​ ​(ei lase RNA-l  kaheahelalisi struktuure tekitada) ​.  o Western blot: ​ kasutatakse ​valkude analüüsiks  Valgud kantakse geelilt membraanile. Filtrit töödeltakse lahusega, mis sisaldab analüüsitava 
valgu vastaseid antikehi. Valguga seondunud antikeha lokaliseeritakse sekundaarse 
antikehaga, mida on võimalik tuua nähtavaks nt ensümaatilise reaktsiooniga ​. ​Uuritakse  seda, kas vastav geen valgu tasemel avaldub ​ ​(Kas ja millistes kogustes on võimalik valku  detekteerida? Millise suurusega valgud tekivad?) ​.  Nt: glutamiini süntetaasi kloroplasti vormi tuvastamine taime lehtedest ja juurtest.  25. DNA nukleotiidse järjestuse määramine Sangeri meetodil ja selle edasiarendus  tänapäeval  DNA sekveneerimise ensümaatiline meetod ​ ​(Sanger et al) ​ – ​põhineb ​in vitro​ DNA sünteesil,  mis katkeb dideoksünukleotiidi lülitumise tagajärjel DNA ahelasse.  DNA ahela 
pikendamiseks on vaja vaba 3’-OH rühma, dideoksünukleotiidil  ​(ddNTP) ​ on 3’-OH asemel  3’-H ​.  Reaktsioonisegusse lisatakse:  o DNA polümeraas ​ ​(tavaliselt faagi T7 polümeraasi modifitseeritud variant, mis peab  hästi vastu  ​in vitro​ sünteesil)  o 4 erinevat deoksüribonukleotiidi 
o Radioaktiivselt märgitud ​ ​(või fluorestsentsmärkega) ​ deoksüribonukleotiid  o 4 spetsiifilist terminaatornukleotiidi  Reaktisooni tulemusena tekivad radioaktiivselt märgistatud DNA fragmendid, mis algavad 
kõik samast kohast, kuid nende süntees on statistiliselt termineerunud erinevatest 
kohtadest. Reaktsioonisegud denatureeritakse, et vabastada sünteesitud DNA fragmendid 
matriitsahelalt ja fragmendid lahutatakse polüakrüülamiidgeelis. DNA fragmendid eristuvad 
geelis üksteisest ühenukleotiidse täpsusega ​.  DNA fragmendid tuuakse nähtavale ​ ​(kuna fragmendid piisavalt väikesed, siis  etiidiumbromiid ei värvi fragmente!) ​:  1) Geelist autoradiograafia tegemisel 
2) Spetsiaalse aparatuuri abil, mis detekteerib radioaktiivset fosforit või fluorestsentsi 


*Selline meetod võimaldab määrata 300-400 nukleotiidi korraga (parematel juhtudel 
500-600 nt).  Tänapäeval on DNA sekveneerimine automatiseeritud. ​ Reaktsiooniproduktid lahutatakse  üksteisest kapillaaris. Reaktsiooniproduktid on märgistatud 4 erineva fluorestsentsvärviga. 
*96 kapillaariga masinad võimaldavad sekveneerida ~100 000 nt masina kohta päevas.  26. DNA lõikude paljundamine PCR meetodil (meetodi põhimõte ja rakendusalad)  Vaja on teada primaarjärjestust paljundatava DNA piirkonna mõlemas otsas – praimerite 
järjestused ​.  PCR toimub 3-etapiliselt:  1) Paljundatava DNA denatureerimine temperatuuril 92⁰C-95⁰C 
2) DNA renatureerimine temperatuuri langetamisel  ​(~50⁰C) ​ ülehulgas lisatud  sünteetiliste praimerite juuresolekul, millest üks on komplementaarne 
amplifitseeritava DNA ühele ahelale, teine selle vastasahelale – praimerid 
hübridiseeruvad DNA ahelatega  3) DNA replikatsioon ahelatele kinnitunud praimerite 3’-OH otstest  ​(temp tõstetakse  72⁰C juurde)  Tsüklit korratakse vähemalt 20X.  DNA sünteesil kasutatakse kõrget temp-i taluvaid DNA polümeraase ​. Nt: ​Taq polümeraas​ –  ensüümil puudub vigu korrigeeriv  ​(proofreading) ​ aktiivsus; ​Pfu ​polümeraas – omab 3’-5’ vigu  korrigeerivat aktiivsust jne;  ​Tfl ​ polümeraas – pikkade ​(kuni 35 kb)​ DNA lõikude paljundamine.  Rakendusalad:  PCR meetod on oluliselt lihtsustanud DNA kloneerimist ja DNA sekveneerimist, kuna 
algmaterjaliks piisab väga väikesest DNA hulgast ​. ​Rakendus diagnostikas ja isikute  tuvastamises, kuna võimaldab analüüsiks DNA-d amplifitseerida väga väikesest 
koematerjali hulgast; evolutsioonis; DNA sõrmejäljed ​ ​(kriminalistika) ​.  Järgmise põlvkonna sekveneerimismeetodid:  Pürosekveneerimine ​ – ​fragmenteeritud ja adapteritega liidetud DNA püütakse kerakestele.  Emulsioonis toimub PCR; DNA viiakse pikotiiterplaatide kannudesse, kus on ensüümid ja 
praimerid. Lisatakse ühekaupa nukleotiide, nukleotiidi lülituse korral eraldub pürofosfaat, 
mida detekteeritakse lutsiferaasi aktiivsuse kaudu ​.  27. Kromosoomide geneetiline ja füüsiline kaart: selgitage geenide positsioonilise  kloonimise põhimõtet  Geneetilised kaardid ​ koostatakse ​lähtuvalt rekombinatsioonisagedusest​. Kokkuleppeliselt  võetakse  ​ühikuks 1 sentimorgan (1cM), mis vastab geenidevahelisele kaugusele ühes 


põlvkonnas, mille piires on rekombinatsiooni sagedus 0,01 e. 1%. ​ Geenide molekulaarne  kaugus üksteisest ei pruugi kaugeltki kokku langeda nende geneetilise kaugusega, kuna mitte 
kõik genoomi DNA piirkonnad pole rekombinatsiooniliselt võrdväärsed.   Füüsilisel kaardil ​, milleks ​on tavaliselt restriktsioonikaardid​, ​on kauguste mõõtmise  mõõdupuuks aluspaarid, kilobaasid, megabaasid või gigabaasid ​. Füüsilisel kaardil ​eristuvad  iseloomulikud unikaalsed nukleotiidijärjestused, mida nimetatakse järjestusspetsiifilisteks 
saitieks ​ (STS). Neid lühikesi unikaalseid järjestusi nimetatakse ​ankurjärjestusteks, sest nende  kaudu ankurdatakse füüsilised kaardid geneetiliste kaartidega ja  ​vice versa. ​ Seega on  ankurmarkerid kaardistatud nii geneetiliselt kui ka füüsiliselt kaartidel ​. Teiseks  ankurmarkerite tüübiks on avaldunud järjestuste märgised e. EST-id. Need on mRNA-st 
pärinevad lühikesed cDNA koopiad, mida saab kasutada avalduvate geenide lokalisatsiooni 
määramiseks.  Geenide identifitseerimiseks ja isoleerimiseks tuleb määrata nende asukoht  ​genoomis,  täpsemalt  ​kromosoomides.​ Geeni asukoha kindlaksmääramisel kromosoomis ​lähtutakse  tänapäeval  ​molekulaarsetest markeritest, milleks on tavaliselt spetsiifiline DNA-järjestus​.  Molekulaarse markeri ülesleidmisele eelneb aga rida katseid.  ​Tavaliselt kaardistatakse geene  teatud kromosoomi piirkonna ristamiskatsete ja ​ geneetilise analüüsi alusel või lähtuvalt  inimese sugupuu analüüsist. Seejärel seostatakse uuritava geeni asukoht kindla molekulaarse 
markeriga füüsilisel kaardil ​. Selle leidmiseks on ​vaja üldjuhul isoleerida mutant, sest just  muutust saab seostada huvipakkuva geeniga. Edasi on vaja nii metsiktüüpi isendist kui ka 
mutandist isoleerida DNA-segment, mis sisaldab huvipakkuva geeniga seonduvat 
molekulaatset markerit, ning need sekveneerida ​. ​Positsioonilisel kloonimisel saab isoleerida  geeni, mille asukoht on teada, kui mille funktsioon vajab selgitamist ​.  Kui mutatsioon DNA-s on tekkinud restriktaasi lõikesaiti, siis seda järjestust restriktaas enam 
ei lõika. Mutatsioonid võivad muuta DNA järjestust ka nii, et tekivad uued restriktaaside 
lõikesaidid. Seega põhjustavad mutatsioonid DNA restriktsioonifragmentide mustris 
erinevusi, kuna võrreldes algse DNA-ga tekib mutatsioone sisaldava DNA lõikamisel mingi 
kindla restriktaasiga teistsuguse pikkusega fragmente. Nii võib erinevatest isolaatidest 
pärinev DNA olla DNA restriktsioonanalüüsi põhjal restriktsioonisaitide suhtes polümorfne – 
erinevate isolaatide puhul tekivad erineva pikkusega restriktsioonifragmendid. 
Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi RFLP-d on võimalik detekteerida näiteks 
“Southern blot” analüüsil. DNA restrikteeritakse, fragmendid lahutatakse geelelektroforeesil, 
kantakse filtrile ja hübridiseeritakse spetsiifilise radioaktiivse DNA prooviga. RFLP-d 
kasutatakse geneetilise markerina kromosoomide kaardistamisel. Samuti võimaldab RFLP 
analüüs hinnata, kas ristamisel saadud järglased on vanemtüüpi või rekombinantsed. Juhul, 
kui on tegemist rekombinantidega, saab rekombinatsioonisageduse põhjal arvutada RFLP-de 
geneetilist distantsi. Sellist analüüsi on rakendatud näiteks taime  ​Arabidopsis ​ geneetilistes  katsetes.   RFLP markereid kasutatakse ka inimese kromosoomide kaardistamisel. Sel juhul on 
vaadeldud näiteks markerite segregeerumist suguvõsas. Markerite aheldumise alusel on 


koostatud kaardid. Nii esitati 1992. aastal esimene inimese kromosoomide RFLP-de kaart, 
mis baseerus 2000-l RFLP-l.  Kui huvipakkuva geeni lähedal  ​(mille mutatsioon põhjustab näiteks mingit haigust) ​ on  identifitseeritud RFLP marker, on sellest markerist vaja liikuda edasi huvipakkuva geenini. 
Kromosoomil “jalutamine” ​: RFLP markerit sisaldava genoomse DNA raamatukogu klooni  baasil valmistatakse hübridisatsiooniproov ja identifitseeritakse sellega kloonid, mis 
sisaldavad radioaktiivselt märgitud DNA-ga  kattuvaid järjestusi. Seejärel koostatakse 
hübrisiseeruvate kloonide restriktsioonikaart ning valmistatakse järgmine 
hübridisatsiooniproov restriktsiooni-fragmendist, mille järjestus asub algse proovi 
järjestusest kõige kaugemal. Identifitseeritakse uue DNA proovi järjestustega kattuvaid 
järjestusi sisaldavad kloonid ja nii võidakse protseduuri korrata mitu korda, enne kui jõutakse 
välja huvipakkuva geeni järjestuseni. Seda, et kätte on saadud huvipakkuva geeni järjestus, 
on võimalik kontrollida mitmel viisil. Näiteks äädikakärbse puhul on näidatud metsiktüüpi 
alleeli sisaldava DNA järjestuse viimisel mutanti metsiktüüpi fenotüübi taastumist. Inimese 
geenide puhul analüüsitakse metsiktüüpi alleeli ja mutantsete alleelide nukleotiidset 
järjestust ning näidatakse, et mutantsed geenid ei kodeeri funktsionaalset geeniprodukti.   Juhul, kui huvipakkuva geeni ja molekulaarse markeri vahemaa on suur, kasutatakse 
kromosoomil “hüppamise” ​ meetodit. Iga hüpe võimaldab edasi liikuda veidi üle 100 kb  korraga. Stardipunktina lähtutakse jälle kloonist, mis sisaldab RFLP markerit ja mis isoleeriti 
hübridisatsiooni tulemusena. DNA-le tehakse restriktaasiga osaline lõikus, mille tulemusena 
saadakse suured DNA fragmendid. Fragmendi ühes otsas on algse prooviga hübridiseeruv 
DNA ja teises otsas unikaalne järjestus. Fragmendi otsad ligeeritakse, tekib liitjärjestus. 
Järgmise hübridisatsiooniproovi valmistamisel lähtutakse liitjärjestusest, märkides 
radioaktiivselt unikaalsed DNA järjestused. Kuna rõngasmolekulid tekitatakse suurtest 
restriktsioonifragmentidest, võimaldab liitjärjestuste kasutamine hübridisatsiooniproovide 
valmistamiseks kiiremini huvipakkuva geenini välja jõuda.   28. Genoomide sekveneerimisprojektid: mida oleme teada saanud bakterite  genoomide sekveneerimisest? Minimaalse genoomi projekt  o Bakteritest on genoom sekveneeritud ~44 000-l  ​(1. märts 2015 seisuga)  o Mida stabiilsem on bakteri elukeskkond, seda väiksem on genoom 
o Genoomi suurus varieerub suuresti ​: al ~580 kb – 9100 kb  o Mida parasiitsem on bakter, seda väiksem on genoom, sest on võimalik kasutada  peremehe elutegevuse saadusi  o Genoomi suurus varieerub ka liigisiseselt ​ ​(nt: E.coli laboritüvi K12 ~4,6 Mb,  mittepatogeenne; E.coli O157 ~5,5 Mb, põhjustab verist kõhulahtisust)  o Rickettsia prowasekii ​ – tüüfusetekitaja, levib täide abil; genoom 1,1 Mb. ​Kõige  lähedasem mitokondrite sugulane ​; puuduvad anaeroobse glükolüüsi geenid ja  geenid, mis on vajalikud AH-de ja nt-de sünteesiks; sisaldab ATP sünteesil osalevaid 
geene; palju pseudogeene 


o Pelagibacter ubique ​ – seni teadaolevalt kõige väiksema genoomiga väliskeskkonnas  elav bakter ​; genoom ~1,4 Mb, 1354 geeni. Elab merevees, kus on väga vähe  toitaineid ja stabiilne keskkond  o Mükoplasma ​ – inimese genitaalide ja hingamisteede epiteelrakkude parasiit. Seni  kõige väiksema genoomiga rakuväliselt elav bakter ​; genoom ~580 kb  Minimaalse genoomi projekt:  Kui palju on vaja geene, et tagada raku elutegevus? ​ Otsitakse kõige väiksema elu  võimaldava genoomiga organismi.  1) Võrdlev genoomika eesmärgiga leida ühisosa geenidest erinevatel bakteritel  o Probleemid: ​ bakterite erinev elukeskkond; samu fn-e võivad tagada  mittesuguluses olevad geenid  2) Oluliste geenide väljaselgitamine eksperimentaalselt  o Transposoonmutagenees 
o Geeniekspressiooni inhibeerimine antisense RNA abil 
o Süstemaatiline geenide inaktiveerimine  Võimalikud rakendused ​: uute ja võimendatud omadustega bakterirakkude konstrueerimine.  o Biomeditsiin ​ ​(vähendatud genoomiga mükoplasmade kasutamine vektorina haiguste  ravis)  o Bioremediatsioon 
o Bioenergeetika ​ ​(tsüanobakterid – H ​ 2 ​ produktsioon, CO​2​ kõrvaldamine)    29. Inimese genoomi uuringud: nende uuringute ajalugu ja tänapäev. Mida on teada  inimese genoomist?  Inimese genoomi projekt  ​(HGP) k ​äivitus aastal 1990.  Eesmärk:  1) Kaardistada kõik inimese geenid 
2) Koostada inimese genoomi füüsiline kaart 
3) Määrata  ​(aastaks 2005) ​ inimese kromosoomide nukleotiidne järjestus  HGP-s osalevad  ​laborid sekveneerisid eelnevalt kaardistatud genoomseid kloone​. Celeras  viidi kogu genoom väikesteks DNA fragmentideks, sekveneerides juhuslike fragmentide 
otsi ning arvutianalüüsi abil ühedati kattuvad järjestused terviklikuks DNA järjestuseks ​.  Selle strateegia rakendamisel tekitab ​ probleeme DNA kordusjärjestuste esinemine  eukarüootses DNA-s.  Võrreldes HGP projektiga võeti Celeras kasutusele uut tüüpi, võimsamad 
automaatsekvenaatorid – ööpäevaga saadi sekveneerida kokku 100 miljonit nukleotiidi. 


Leiutati meetod üle genoomi juhuslike fragmentide sekveneerimiseks: kogu genoom 
fragmenteeritaks, igal fragmendil on ühisosa mõne teisega.  Inimese genoomi sekvenerimise edusammud:  o Konkurents kiirendas HGP tegevust 
o Kogu genoomi DNA järjestuse mustandvariandi valmissaamisest teatati 2001.  aastal mõlema konkureeriva projekti poolt  o Saadud andmete põhjal  ​leiti, et inimesel on vähem geene kui algul arvati – ~25 000  piires  o Valke kodeerivaid järjestusi alla 2% genoomist; vähemalt 50% geenidest toimub  mRNA alternatiivne splaissing  o Geenide paiknemine üle genoomi on ebaühtlane: GC-rikastes piirkondades rohkem  geene ja lühemad intronid; AT-rikastes alades vähem geene ja pikemad intronid  o 2003 ​ – DNA kaksikheeliksi kirjeldamise 50ndaks aastapäevaks ​esitas HGP inimese  genoomi nukleotiidse järjestuse, kus 98% geene sisaldavatest aladest oli 
sekveneeritud 99,99%-lise täpsusega  Inimese genoomi info:  o Inimese genoomis on palju kordusjärjestusi: ​ transposoonid  o Genoom 3 Gb, millest eukromatiin 2,8 Gb 
o SNiP-id; haplotüübid 
o CNV  ​(muutus koopiaarvudes) ​ – hõlmavad ~12% genoomist; enamasti segmentaalsed  duplikatsioonid  Genoomi piirkonnad, mille nukleotiidne järjestus ei ole täielik:  1) Tsentromeeride ala ​, mis sisaldab kõrgeltkorduvaid järjestusi  2) Kromosoomide otsad ​ ​(kõrgeltkorduv ala telomeeride piirkonnas)  3) Multigeensed lookused ​ ​(sama geeni peaaegu identsed koopiad)    30. Metagenoomika. Inimese mikrobioomi projekt  METAGENOOMIKA – kõigi antud keskkonnas elavate mikroobide genoomi  ​(mikrobioomi)  uurimine ​. Võib pärineda nt mereveest, inimeste soolestikust, mullast jne.  1) Funktsionaalne metagenoomika ​ – ​analüüsib metagenoomi raamatukogus esindatud  geene seoses bakterite fenotüübiga ​ ​(nt soolatolerantsus, ensüümiaktiivsus) ​ ​ja  määrab nende geenide päritolu  2) Järjestusepõhine analüüs ​ – ​raamatukogus esindatud 16S rRNA geenide analüüs  eesmärgiga selgitada mikroobipopulatsiooni liigiline koosseis uuritavas keskkonnas  Inimese mikrobioomi projekt:  o 5-aastane projekt,  ​alustati 2008. aastal 


o Inimese tervis sõltub mikroobikoosluse, peremehe ja keskkonna vahelistest  interaktsioonidest. Mikroobid mõjutavad inimese immuunsüsteemi, seedimist, 
vitamiinide tootmist jne  o Projekti  ​eesmärgiks on mikroobikoosluse kirjeldamine ja sekveneerimine  inimorganismis ​; ​leida seoseid mikoobikoosluste muutuste ja tervisliku seisundi  vahel  o 600 bakteri isolaadi sekveneerimine 
o Uuritavad  ​mikroorganismid pärinevad suust, nahalt jne  o Leiti, et inimese mikrobioomis on 8 milj unikaalset geeni, mis on inimese  elutegevuseks vajalikud; inimese mikrobioom muutub elu jooksul ​ ​(haigused,  toitumine, AB-d)  31. Funktsionaalne genoomika (eesmärgid ja põhimeetodid)  FUNKTSIONAALNE GENOOMIKA – uurib RNA ja valkude ekspressiooni ning funktsioone  Genoomi primaarjärjestuse teadasaamine aitab oluliselt kaasa genoomi funktsioonide 
uurimisele. Mis funktsioon on DNA järjestusel, selgub geneetilistest katsetest nende 
mutantidega ​.  Teades genoomi terviklikku järjestust, on võimalik uurida, millal ja kus erinevad geenid 
avalduvad ​:  o Üle genoomi transkriptsiooni uurimine ​ ​geenikiipide​ ​abil  Selleks, et uurida kogu genoomi või paljude geenide avaldumist,  ​seotakse kandjale  (nailonmembraanile või klaasile) fikseeritud asukohtadesse DNA lõigud, mis pärinevad 
organismi erinevatest geenidest ​. ​Saadakse geenikiibid,​ ​millele hübridiseeritakse rakkudest  eraldatud totaalselt mRNA-lt sünteesitud cDNA, mis on märgistatud ​ ​(tavaliselt  fluorestseeruva märgisega) ​. ​Hübridisatsioonisignaale analüüsitakse arvutis​. ​Signaali tugevus  viitab geeni avaldumismäärale rakkudes antud arenguetapil, koes või keskkonnatingimustel ​.  Transkriptoomi analüüs RNA-seq meetodil: võrreldes mikrokiipidega on taustamüra väiksem. 
Sekveneeritakse lühikesi DNA fragmente, mille külge on viidud adapterid ​. Saadakse  kvantitatiivsed tulemused eksonite kohta ja saab analüüsida  ​(SNP) ​ infot eksonite ühenduse  kohta.  o Valkude ekspressiooni uurimine, analüüsides 2D geele ​ – ​proteoomika  PROTEOOMIKA – geeniekspressiooni uurimine valkude hulga määramise teel.  Valkude hulga hindamiseks kasutatakse totaalvalgu lahutamist kahedimensionaalsel (2-D) 
polüakrüülamiid-geelelektroforeesil.  ​Igale valgule vastab geelis kindel koht. ​Mida suuremal  hulgal on teatud valku rakus, seda paremini on teda geelis näha  ​(tugevam signaal) ​.  Mass-spektromeetria võimaldab määrata valgu järjestusi ka väga väikeste valgukoguste 
korral.  o Metaboolne modelleerimine   


32. Operoni mudel. Geenide positiivne ja negatiivne regulatsioon bakterites 
o Bakterite geenid paiknevad regulatoorsetes üksustes, mida nim OPERONIDEKS. 
o Operoni mudel loodi  ​1961. aastal Francois Jakob ja Jacques Monod poolt   o Operoni mudeli põhjal toimub  ​ühe või mitme järjestikku paikneva struktuurgeeni  (kodeerivad ensüümide või struktuurvalkude järjestusi) ​ transkriptsioon kahe  kontrolliva elemendi kaudu:  1) Regulaator- või repressorgeen, mis kodeerib repressorvalku 
2) Teatud tingimustel on repressor seondunud teise elemendiga –  operaatoriga  o Promootor paikneb struktuurgeenidest eespool ​ (5´suunas). ​Operaatorala jääb  promootorist geenide poole ​. Kui repressor on seondunud operaatoralaga, takistab  see RNA polümeraasi poolt läbiviidavat transkriptsiooni  Seda, kas repressorvalk seondub operaatoriga ja pärsib struktuurgeenide transkriptsiooni, 
määrab  ​efektormolekulide​ olemasolu rakus. Efektormolekulideks on väikesed molekulid,  näiteks aminohapped või erinevad suhkrumolekulid. Indutseeritava operoni puhul 
nimetatakse efektormolekuli  ​induktoriks​, represseeritavate operonide puhul aga  korepressoriks ​. Efektormolekul seondub repressoriga, muutes tema konformatsiooni ja selle  tagajärjel muutub valgu aktiivsus. Indutseeritavaid ja represseeritavaid operone eristab see, 
kas repressori ja efektori kompleks on võimeline seonduma operaatorile või mitte:  1. ​        ​Indutseeritava operoni puhul on geenide transkriptsioon pärsitud seetõttu, et  induktoriga mitteseondunud repressor on seondunud operaatorile ​. Efektormolekuli  seondumine repressoriga muudab selle konformatsiooni nii, et repressor vabaneb 
operaatoralalt, võimaldades geenide transkriptsiooni. Seega on induktori olemasolul 
rakkudes vastavate geenide transkriptsioon indutseeritud, sest repressori ja induktori 
kompleks ei ole võimeline DNA-ga seonduma.   2. ​        ​Represseeritavate operonide puhul on vastupidi – vaba repressor ei ole võimeline  seonduma operaatoriga. Operaatoralale seondub ainult repressori ja efektori 
(korepressori) kompleks. Seega on represseeritavas operonis paiknevate struktuurgeenide 
transkriptsioon rakkudes efektormolekuli olemasolul pärsitud ​.   Kui operonis sisaldub rohkem kui üks struktuurgeen, sünteesitakse mRNA molekul, mis 
sisaldab informatsiooni kõigi nende geenide kohta ​. Samas operonis paiknevad  struktuurgeenid on koordineeritult reguleeritud ja koos transkribeeritavad. Näiteks 
trüptofaani operon sisaldab viit erinevat geeni trüptofaani biosünteesiks ja nende 
transkriptsioon rakus on represseeritud trüptofaani kaudu.  Geenide negatiivne ja positiivne kontroll:  Kuna repressor pärsib struktuurgeenide transkriptsiooni, nimetatakse repressori poolt 
vahendatud kontrollmehhanismi negatiivseks kontrollmehhanismiks. Lisaks negatiivsele 
esineb ka positiivne kontrollmehhanism, kus regulaatorvalku on vaja geenide 


transkriptsiooni aktivatsiooniks. Sellist regulaatorvalku nimetatakse transkriptsiooni 
aktivaatoriks.  Transkriptsiooni aktivaatorite ja repressorite seondumisalad on erinevad:  o Repressorite seondumisalad jäävad enamasti promootorist allapoole või kattuvad  -10 elemendiga  o Aktivaatorite seondumisalad jäävad enamasti promootorist ülespoole või kattuvad  -35 elemendiga  33. Transkriptsiooni regulatsioon  ​E. coli ​ laktoosi operoni näitel. Millistel tingimustel  avalduvad laktoosi operoni geenid?  Laktoosi operoni regulatsioon:  Laktoosi operon sisaldab promootorit P, operaatorit O ja kolme struktuurgeeni lacZ 
(beeta-galaktosidaas) ​, ​lacY ​(beeta-galaktosidaasi permeeas; võimaldab suhkru transporti  rakku) ​ ​ja lacA​ ​(beeta-galaktosiidi transatsetülaas)​.  Laktoosi operoni puhul esineb nii negatiivne kui positiivne regulatsioon:  1) Negatiivne ​ – ​transkriptsiooni pärsib LacI repressor  Geen  ​lacZ kodeerib beeta-galaktosidaasi​, millel on kaks funktsiooni:  o Lõikab laktoosi molekuli kaheks monosahhariidiks ​, Glc-iks ja Gal-iks  o Konverteerib laktoosi operoni induktoriks allolaktoosiks 
o Mutatsioonid  ​lacI ​ geenis võimaldasid ​lac​ operoni konstitutiivset transkriptsiooni:  trans-toime  ​(toime kaugelt ​; seonduvad ühendid)  o lac ​ operaatori ​O​ mõju avaldub ainult ​cis-​toimelisena​ ​(piirkond DNA-l)​, ​kuna  repressori seondumine operaatoralale peab füüsiliselt takistama struktuurgeenide 
transkriptsiooni ​. Mutatsioonid operaatoralas takistavad repressori seondumist –  operoni geene transkribeeritakse pidevalt, kui mutantne operaator paikneb geenide 
suhtes  ​cis ​-asendis ja funktsionaalne operaator ​trans​-asendis  2) Positiivne ​ – ​transkriptsiooni aktiveerib CAP (CRP) aktivaatorvalk  o Selleks, et toimuks transkriptsiooni initsiatsioon  ​lac ​ promootorilt, on vaja, et  promootoralale seonduks aktivaatorvalk CAP ​ (​catabolite activator protein ​), mida  sageli nimetatakse ka CRP-ks ( ​cyclic AMP retceptor protein ​)  o CAP valk aktiveerib transkriptsiooni  ​lac ​ promootorilt ainult siis, kui ta on  kompleksis cAMP-ga  CRP  ​(CAP) ​ valk on globaalne regulaator – kontrollib nii üksikute operonide ​(laktoosi ja  sorbitooli operonid) ​ kui ka regulonide ​(galaktoosi, glütseroolfosfaadi, maltoose regulonid)  transkriptsiooni. Kui bakterite kasvukeskkonnas on lisaks laktoosile ka glükoosi, on glükoosi 
kasutamine eelistatud ning  ​lac ​ operoni geenide transkriptsioon pole aktiveeritud. Sellist  nähtust nimetatakse katabliitseks repressiooniks. 


Kataboliitne repressioon ​:  Nähtust, kus glükoosi juuresolekul kasvukeskkonnas eelistatakse teistele substraatidele 
glükoosi, nimetatakse  ​glükoosi efektiks ​e. ​kataboliitseks repressiooniks. ​Lac ​ operoni ning ka  mitmete teiste operonide kataboliitne repressioon on vahendatud aktivaatorvalgu CAP (CRP) 
ja tema efektormolekuli tsüklilise AMP (cAMP) poolt. Selleks, et toimuks transkriptsiooni 
initsiatsioon  ​lac ​ promootorilt, peab promootoralaga seonduma CAP-cAMP kompleks.  Aktivaatorvalk seondub promootoralale dimeerina ning interakteerub otseselt RNA 
polümeraasi a-subühikuga, soodustades sel viisil RNA polümeraasi seondumist promootorile 
ning transkriptsiooni initsiatsiooni.   Rakusisene cAMP kontsentratsioon on tundlik glükoosi koguse suhtes. Kui rakus on kõrge 
glükoosi kontsentratsioon, langeb cAMP tase järsult. cAMP madala kontsentratsiooni tõttu 
pole aktivaator CAP võimeline seonduma  ​lac ​ operoni promootorile ning RNA polümeraas ei  ole võimeline transkriptsiooni initsieerima. Glükoosi olemasolul rakkudes jääb  ​lac ​ operoni  transkriptsiooni tase alla 2% tema aktiveeritud tasemest, mis ilmneb siis, kui bakterite 
kasvukeskkonnas on laktoos, kuid pole glükoosi. Kataboliitne repressioon toimib sama 
skeemi järgi ka arabinoosi ( ​ara ​) ja galaktoosi (​gal​) operonide puhul.   34. Selgitage aminohapete biosünteesi operoni regulatsiooni  ​E. coli trp ​ operoni näitel  o Bakterirakus toimub raku kasvuks vajalike komponentide nagu aminohapped,  puriinid, pürimidiinid ja vitamiinid süntees   o Juhul, kui kasvukeskkonnas on piisavalt trüptofaani, toimub trüptofaani  biosünteesis osalevate ensüümide sünteesi mahasurumine vastavate geenide 
väljalülitamise teel  o Geenide avaldumise pärssimist vastusena keskkonna signaalile nimetatakse  repressiooniks  o Geenide uuesti tööle lülitamist muutunud olukorras nimetatakse derepressiooniks 
o Erinevad biosünteetilised rajad bakterirakus on enamasti represseeritavad. Nii nagu  ka induktsiooni puhul, toimub regulatsioon transkriptsiooni tasemel  Trüptofaani biosünteesi korismahappest kodeerivad viis geeni. Trüptofaani operoni  ​trp  avaldumine on reguleeritud transkriptsiooni initsiatsiooni repressooni ja transkriptsiooni 
enneaegse terminatsiooni kaudu.   Repressioon:  Geen  ​trpR, ​ mis kodeerib ​trp​ operoni repressorit, paikneb operoni lähedal​. Operaatorala ​O  paikneb tugeva promootori  ​P ​ 1 ​ regioonis. Lisaks ​P​1​–le on operonil ka teine, nõrk promootor  P ​ 2 ​. Geeni ​trpA​ järel paiknevad kaks transkriptsiooni terminaatorjärjestust ​t​ ja ​t’​. Järjestus ​trpL  kodeerib 162-nt pikkust mRNA liiderjärjestust.  Trüptofaani ​ ​(korepressori) ​ ​puudumisel seondub RNA polümeraas promootorregiooni ja  algatab  ​trp ​ geenide transkriptsiooni​. ​Trüptofaani olemasolul rakkudes seondub trüptofaan 


repressoriga ning trüptofaan-repressor kompleks seondub promootoralaga kattuvale 
operaatorile, takistades transkriptsiooni initsiatsiooni ​.  Võrreldes transkriptsioonitasemega ​ trp ​ promootorilt trüptofaani olemasolu korral, on  operoni transkriptsioonitase sellelt promootorilt derepresseeritud olekus 70 korda kõrgem. 
TrpR mutantide korral on operoni ensüümide tase rakus trüptofaani juuresolekul aga ikkagi 
10 korda alla surutud. Põhjuseks on  ​attenuatsioon​, mis viib transkriptsiooni enneaegsele  termineerumisele.   Attenuatsioon:  Kui deleteerida  ​trp  ​operonist ​trpL​ regioon, tõuseb ​trp​ operoni ekspresioonitase. Samas  säilub operoni represseeritavus trüptofaani poolt ​. ​Trp  ​operoni  regulatsiooni järjestuse ​trpL  vahendusel nimetatakse  ​attenuatsiooniks​ ning järjestust ​trpL ​ ​attenuaatoriks​. ​Attenuatsioon  kontrollib transkriptsiooni terminatsiooni mehhanismi operoni liiderjärjestustel.  ​trp  operoni transkriptsiooni terminatsioon liiderjärjestuselt toimub siis, kui tRNA ​Trp​ on  trüptofaani poolt laetud ​. ​Sel juhul sünteesib RNA polümeraas operonilt ainult 140 nt  pikkuse RNA molekuli ​.   Attenuatsiooni piirkonnas asuvad DNA järjestused, mis sarnanevad transkriptsiooni 
terminatsiooni signaalidele bakterites. Need järjestused koosnevad G:C rikkast 
palindroomsest alast, millele järgneb A:T rikas ala. ​ Sellele piirkonnale vastav mRNA  moodustab juuksenõelastruktuuri, millega külgneb U – rikas järjestus.  ​DNA ja RNA vahelised  sidemed nõrgenevad ning RNA polümeraas dissotseerub DNA-lt. ​ ​Prokarüootses rakus  toimuvad transkriptsioon ja translatsioon samaaegselt – parasjagu sünteesitavalt mRNA-lt 
algab kohe translatsioon ​. ​trp ​ operoni liiderjärjestus on võimeline moodustama  alternatiivseid sekundaarstruktuure. Kui omavahel paarduvad nukleotiidid regioonidest 1 ja 
2 ning 3 ja 4, moodustuvad sekundaarstruktuurid, mis termineerivad transkriptsiooni, kui 
aga omavahel paarduvad nukleotiidid regioonidest 2 ja 3, on terminatsiooni põhjustavate 
juuksenõelastruktuuride moodustumine takistatud ning transkriptsioon jätkub.   Trüptofaani operoni liiderjärjestuselt toimub ka translatsioon. Liiderpeptiidis on kaks 
trüptofaani. Kaks Trp koodonit paiknevad  ​trpL ​ järjestuses kõrvuti. ​Kui rakus pole  trüptofaani, peatub valgusüntees sellel kohal ning omavahel paarduvad  nukleotiidid 
regioonidest 2 ja 3. Kuna sel juhul ei teki transkriptsiooni terminatsiooni signaali, jätkub 
operoni transkriptsioon ​. Kui aga rakkudes on trüptofaani, järgneb translatsioon Trp  koodonitelt ning ribosoom takistab regioonide 2 ja 3 omavahelist paardumist. Regioon 3 on 
nüüd vaba paarduma regiooniga 4 ning moodustub transkriptsiooni terminatsiooni 
struktuur.  ​Trüptofaani olemasolu korral rakkudes termineerub ​trp ​ operoni transkriptsioon  enneaegselt ligikaudu 90% juhtudest. Seega võib  ​trp ​ operoni avaldumistase muutuda ligi 700  korda  ​(10-kordne attenuatsiooniefekt + 70-kordne repressiooniefekt).   Regulatsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud ka treoniini, isoleutsiini, leutsiini, 
fenüülalaniini ning histidiini biosünteesi operonide puhul.  


35. Geenide ekspressiooni regulatsioon bakterites translatsiooni tasemel.  Ribosoomivalkude sünteesi regulatsioon  Operonisiseselt tranksribeeritakse kõiki geene võrdselt, kuid sageli on raku elutegevuseks 
vaja sama operoni poolt kodeeritud valke erineval hulgal. Bakteris toimuvad samaaegselt nii 
geeni transkriptsioon, translatsioon kui ka vastava mRNA degradatsioon.  Sama operoni poolt kodeeritud valkude erinev hulk raku kohta võib olla tagatud 3 erineva 
mehhanismi poolt:  1) Translatsiooni initsiatsiooni efektiivsus võib erinevate geenide puhul olla erinev 
2) Ribosoomide liikumine mRNA molekulil toimub erinevate geenide puhul erineva  kiirusega. Ribosoomide liikumist takistavad mRNA sekundaarstruktuurid  3) Erinevate geenide mRNA degradatsioonikiirus võib olla erinev  Geenide avaldumise regulatsiooni translatsiooni tasemel ​ on põhjalikult uuritud näiteks  ribosomaalsete valkude puhul.  ​Kui rakud kasvavad optimaalsetes tingimustes, toimub  nende kiire kasv ning nad vajavad valgusünteesiks rohkem ribosoome kui rakud, mis 
kasvavad kehvades tingimustes ​. ​E. coli  ​ribosoomid sisaldavad kolme erinevat rRNA molekuli  ja 52 erinevat ribosoomi valku.  ​Enamus ribosomaalsete valkude geene paiknevad  operonides ja nende valkude süntees peab olema koordineeritud kolme erineva rRNA 
sünteesiga, sest ribosoomide assambleerimiseks vajatakse neid kõiki kindlas koguses ​.  Ribosomaalse valgu S10 geenide klaster sisaldab näiteks 10 geeni. Sellise regulatoorse 
üksuse puhul on üks geenidest iseenda ja teiste negatiivseks regulaatoriks ​. Geen ​rplD  kodeerib ribosoomivalku L4 ​. Kui rakus leidub vabu rRNA molekule, seondub L4 nendega ja  assambleeritakse ribosoomi. Vaba rRNA puudumisel seondub L4 aga S10 operoni mRNA 5’ 
otsaga, takistades sellelt translatsiooni. Selline mehhanism väldib ribosoomivalkude 
asjatut sünteesi rRNA puudumisel ​. Negatiivne autoregulatsioon esineb ka teiste  ribosomaalsete valkude operonide puhul.   Ribosoomivalkude translatsiooni kontroll:  o Ribosomaalse valgu  ​S10 geeni klastris on 10 geeni  o Üks geenidest on iseenda ja teiste negatiivseks regulaatoriks 
o Geen  ​rplD ​ kodeerib ribosoomivalku L4  o Kui rakus leidub vabu rRNA molekule, seondub L4 nendega ja assambleeritakse  ribosoomi  o Vaba rRNA puudumisel seondub L4 S10 operoni mRNA 5’-otsaga, takistades sellelt  translatsiooni  o Negatiivne autoregulatsioon esineb ka teiste ribosomaalsete valkude operonide  puhul    36. Tooge välja põhilised erinevused prokarüootses ja eukarüootses  geeniregulatsioonis 


Geneetilise info realiseerumise erinevus prokarüootidel ja eukarüootidel:  o Hulkraksete  ​eukarüootide puhul​ toimub ​geneetilise programmi realiseerumine​ –  hulkrakse organismi areng ja elutegevuse tagamine  o Bakterid ​ – ​kohanemine keskkonnatingimustega, individualism    Erinevalt bakterirakust toimuvad  ​eukarüootides transkriptsioon ja translatsioon nii ajaliselt  kui ka ruumiliselt lahus ​.  Eukarüootsete geenide regulatsioon on võrreldes bakterigeenidega komplekssem:   1) Geenid paiknevad tuumas ​ – ​signaalid peavad esmalt jõudma raku pinnalt  tsütoplasmasse ja sealt läbi tuuma membraani kromosoomideni ​. Eukarüootsed  rakud vajavad  ​transkriptsiooni regulatsiooniks sisemist signaalsüsteemi  2) Eukarüootsete organismide  ​hulkrakulisus​ – ​signaalid peavad liikuma läbi paljude  rakukihtide, enne kui nad jõuavad spetsiifilise koeni, kus konkreetsete geenide 
avaldumist kontrollitakse ​. Eukarüootse transkriptsiooni seisukohalt on ​väga oluline  rakkudevaheline kommunikatsioon  3) Eukarüootide geenide regulatsiooni komplitseerib ​ alternatiivne splaissing:​ ​kui geenis  sisaldub palju introneid, võidakse introneid RNA molekulist kõrvaldada kas eraldi 
või kombineeritult  ALTERNATIIVNE SPLAISSING – ​ ​koos intronitega võidakse kõrvaldada ka nendevehelisi  eksoneid. Moodustuvad erinevad mRNA molekulid, mis kodeerivad erinevaid polüpeptiide   o Regulatsioon väikeste mittekodeerivate RNA-de (ncRNA) kaudu:  Eukarüootidel:  1) mikroRNA ​– ​algne suurem juuksenõelastruktuur eksporditakse tuumast ja  protsessitakse 22-nt dsRNA molekuliks  2) siRNA ​ – ​dsRNA ahelad pärinevad kahest komplementaarsest transkriptist  Nii microRNA kui ka siRNA puhul seondub üks ahelatest RISC valkude vahendusel märklaud 
mRNA-ga 3´UTR regioonis.  Prokarüootidel:   1) Ei allu protsessingule ​, seonduvad märklaud-mRNA-le Hfq vahendusel ja enamasti  mRNA 5´otsale ​, mis sisaldab translatsiooni initsiatsiooni saiti    37. Transkriptsiooni aktivatsioon eukarüoodi rakkudes: eukarüootsete geenide  regulatoorsed alad, transkriptsioonifaktorite osa transkriptsiooni aktivatsioonil  Eukarüootset transkriptsiooni mõjutavad: 


1) Intronid – transkriptsiooni produktid ei avaldu translatsioonil. Intronid mõjutavad ka  nukleosoomi struktuuri. Immunoglobuliinide geenidel asuvad transkriptsiooni 
regulaatorite seondumissaidid intronites. RNA editing on mõjutatud intronite poolt  2) Geenide avaldumist mõjutab ka DNA kondensatsiooniaste: Transkriptsiooni  initsiatsiooniks peab DNA olema kättesaadav RNA polümeraasile ja 
transkriptsioonifaktoritele. DNA liiga tugev seondumine histoonidega ja teiste 
struktuursete valkudega pärsib transkriptsiooni  3) Geenide avaldumises mängib olulist rolli geeni paiknemine kromosoomis 
4) Histoonide atsetüleerimine/deatsetüleerimine – histoonide atsetüleerimine muudab  kromatiini avatumaks – võimaldab transkriptsiooni initsiatsioonil osalevate valkude 
juurdepääsu DNA-le. Histoonide deatsetüleerimine suleb kromatiini – transkriptsioon 
on pärsitud  Regulaatorvalgud interakteeruvad koaktivaatoritega ja korepressoritega:  o Korepressorid ​ – histoonide deatsetülaasi kompleksid  o Koaktivaatorid:  1) Histoonide atsetülaasi kompleksid  2) SWI/SNF kromatiini remodelleerivad faktorid – dissotseerivad DNA ajutiselt histoonidelt,  võimaldamaks transkriptsiooni initsiatsiooniks vajaliku kompleksi seondumist DNA-le  3) Mediaatorkompleksid – vahendavad transkriptsiooni aktivaatorite mõju  initsiatsioonikompleksile  Transkriptsiooni aktivatsioon eukarüootses rakus:  Esmalt on vajalik nukleosoomi struktuuri muutus – DNA histoonide ümbert lahtiharutamine, 
et sellele pääseksid ligi polümeraasid.  o RNA polümeraas I – tuumakeses, viib läbi ribosomaalse rRNA (va. 5S rRNA) sünteesi 
o RNA polümeraas II – rakutuumas,  katalüüsib kõigi pre-mRNA-de sünteesi 
o RNA polümeraas III – rakutuumas,  katalüüsib 5S rRNA, tRNA-de ja snRNA-de sünteesi   Geenide aktiveerumine toimub mingitele signaalidele vastusena  ​(nt hormoonid,  väliskeskkonna stiimulid – nt valgus, temperatuuri muutused jne) ​.  Erinevad transkriptsiooni aktivaatorid võivad seonduda promootorist erinevale kaugusele. 
Kaugemale seondunud valgud tuuakse initsiatsioonikompleksi DNA lingu abil.  Osa transkriptsioonifaktoreid seonduvad geenist eemal asuvatele DNA järjestustele – 
transkriptsiooni võimendajatele. Enamus transkriptsioonivõimendajaid toimivad 
koespetsiifiliselt.  Transkriptsioonifaktorite osa trankriptsiooni aktivatsioonil: 


Enamus TF-e sisaldab vähemalt kahte olulist domääni – DNA-ga seonduvat domääni ja 
transkriptsiooni aktivatsiooni domääni.  o Tsink-sõrmed ​ – ​lühikesed lingud, mis moodustuvad siis, kui kaks tsüsteiini ühest  polüpeptiidi osast ja kaks histidiini teisest osast seovad koos tsingi iooni ​ – ​olulised  valgud DNA-ga seondumisel  o Heeliks-pööre-heeliks motiiv ​ – ​3 lühikest AH-de heeliksit on üksteise suhtes  pööratud. C-terminaalsem kolmest heeliksist vastutab DNA-ga seondumise eest, 
ülejäänud kaks aga valgu dimeriseerumise eest ​. ​Olulisimad ​Homeobox ​ valgud –  määravad ära tulevase organismi kudede orienteerumise ​ ​(?)  o Leutsiini lukud ​ – ​rida AH-sid Leu-ga igas seitsmendas positsioonis ühest  polüpeptiidist dimeriseerub teise polüpeptiidiga samasuguse motiivi kaudu. 
Polüpeptiidide interaktsioon toimub Leu-de kaudu.  ​Paiknevad positiivselt laetud  AH-de kõrval, mis dimeriseerumise järel pääsevad esile ja seonduvad negatiivselt 
laetud DNA-ga  o Heeliks-ling-heeliks motiiv ​ – ​2 helikaalset AH-de regiooni on teineteisest eraldatud  mittehelikaalse linguga ​.​ ​Helikaalsed regioonid võimaldavad dimeriseerumist teise  polüpeptiidi samasuguse regiooniga. Motiivid külgnevad positiivselt laetud 
aminohapetega – dimeriseerumine soodustab dimeeri seondumist DNA-le     38. Eukarüootsete geenide transkriptsiooni vaigistamise molekulaarsed mehhanismid  DNA metüleerimise kaudu. Imprinting  Kui DNA on metüleeritud, siis on geenide transkriptsioon rohkem mahasurutud  ​(halvemini  kättesaadav) ​. DNA metülatsioon soodustab histoonide deatsetüleerimist.  Imetajate genoomis on keskmiselt 40% G:C paare ja neist 2-7%-l on C metüleeritud. C 
metüleeritud piirkondi nim CpG saarekesteks  ​(1-2 kb pikkused) ​, kus DNA on G:C rikkam.  Inimese genoomis on leitud 45 000 CpG saarekest. Enamus neist asuvad transkritpsiooni 
alguspunktide läheduses.  Kui DNA on metüleeritud, viib see transkriptsiooni repressioonile.  ​CpG metülatsioon  indutseerib histoonide H3 ja H4 deatsetüleerimist. ​ Deatsetüleerimist ​soodustab  metüülrühmaga seonduv valk MeCP2 ​, mis moodustab multiproteiinse repressorkompleksi  koos deatsetülaasidega HDAC1 ja HDAC2. Repressorkompleks muudab kromatiini struktuuri. 
DNA metülatsioonist tingitud geenide repressioon on stabiilne ning seda muudab ainult 
kas DNA demetülatsioon või tugev transkriptsiooni aktivaator, mis suudab DNA-ga 
seonduda, hoolimata selle metülatsioonist. ​ Kõige ulatuslikumalt on geenide transkriptsioon  DNA metülatsiooni kaudu pärsitud  ​imetajate X kromosoomi inaktivatsiooni puhul​.  IMPRINTING ​ ehk vermimine:  o Imetjate  ​DNA metülatsiooniga seotud nähtus, kus teatavate geenide avaldumine on  kontrollitud selle kaudu, kummalt vanemalt geen on päritud 


o Hüpermetülatsiooni tõttu avaldub vaid üks paar geenidest  Nt: hiire embrüos avaldub ainult isalt päritud kasvufaktorit kodeeriv  ​Igf2 ​. Emalt päritud geeni  ei transkribeerita, sest seda pärsivad Cpg saarekesed. Heterosügootsete hiirte kasv sõltub 
sellest, kas normaalne Igf2 alleel on pärit isalt või emalt  ​(kui emalt, siis on normaalne kasv;  kui isalt, siis kääbuskasv) ​.         Inimestel on samuti imprintingut kirjeldatud – nt PW-sündroom  ​(mõjutab lapse  rasvumist, hormoone, hingamise ja veresoonkonna arengut, neuroloogilised efektid) ​, kus  mõjutatud on piirkond 15. kromosoomis  ​(emalt pärit kromosoomis on see piirkond alati  metüleeritud ja geenid ei avaldu) ​.  39. Kromatiini struktuuri mõju geenide avaldumisele. Kromatiini remodelleerimine  Kromosoomidega seotud DNA pole transkriptsiooniks tavaliselt valmis.  ​Nukleosoomse  struktuuri muutuseid, mis toimuvad selleks, et geen transkribeeruks, nimetatakse 
kromatiini modifitseerimiseks ​. Kromatiini modifikatsioonilisi komplekse on kahte tüüpi:  1) Histoonide modifitseerimine ​. Kompleksis on ensüümid histooni  atsetüültransferaasid (HAT), mis  ​atsetüülivad histoonid kindlates punktides  aminohappe lüsiini atsetüülgruppide ülekandega sama nukleosoomi piires ​.  Kompleksis osalevad ensüümid  ​kinaasid, mis kannavad üle fosfaatgruppe, tehes  fosforüülimst ​. Toimub ka teisi keemilisi modifikatsioone  2) Histoonide remodelleerimine e. ümberkujundamine ​. On kirjeldatud mõnikümmend  eritüübilist kompleksi. Näiteks  ​SWI/SNF koosneb vähemalt kaheksast erinevast  valgust. Komlpeks reguleerib transkriptsiooni, liigutades histooni oktameere 
assotsieerunud DNA suhtes. Sellega vabastatakse vastav DNA piirkond 
transkriptsioonifaktorite seondumiseks ​. Seesuguseid protsesse nimetatakse ka  nukleosoomide nihutamiseks.  Teisalt  ​aktiivset kromatiini saab muuta ka inaktiivseks kromatiiniks. Selline kromatiini  tagurpidi ümbermodelleerimine toimub läbi kahe nukleosoomi tänu histoonide 
biokeemilisele modifikatsioonile ​: deatsetüülimine histooni deatsetülaaside toimel ja  metüülimine histooni metüültransferaaside toimel.  Eu- ja heterokromatiin:  Enamik aktiivseid geene paikneb eukromatiinis.  ​Eukromatiinis on DNA vähem kokkupakitud  olekus. ​ Ligi 30% ​Drosophila  ​DNA-d on heterokromatiinne. ​Enamik ​Drosophila  heterokromatiinseid piirkondi sisaldab kordus-DNA-järjestusi, kus eristatakse nii 
mõõdukalt kui ka sageli korduvaid järjestusi ​. Teisalt, ​Drosophila ​ genoomis ​on teada ka ligi  20 valku määravat geeni, mis paiknevad heterokromatiinsetes osades, ning mitusada 
rRNA-geeni, mis piknevad X- ja Y-kromosoomi tsentromeerses heterokromatiinses 
piirkonnas ​. Seega, ​mitte kogu heterokromatiin pole geneetiliselt inaktiivne​. ​Kromosoomsete  ümberkorralduste tagajärjel, kui heterokromatiinse ala geenid liiguvad eukromatiinsesse 


piirkonda, võib nende avaldumine muutuda ​. Muutusi suurendavad supermutatsioonid, mis  pidurdavad samuti eukromatiinsete geenide avaldumist heterokromatiinses alas. Neil 
geenidel ongi tendents avalduda ebanormaalselt. Erinevalt eukromatiinsetest geenidest on 
heterokromatiinsete geenide avaldumisel asendiefekt. Seepärast võib samal organismil 
tekkida segu normaalsetest ja mutantsetest tunnustest. Seda nähtust nimetatakse geeni 
asendiefekti mitmekesisuseks.  40. X kromosoomi inaktivatsioon imetajatel. Miks erinevad 45, X genotüübiga naised  normaalsetest naistest?   o X kromosoomi inaktivatsioon algab kindlast kohast, mida nimetatakse X  inaktivatsiooni keskuseks XIC ( ​X inactivation center ​) ning levib seejärel mõlemas  suunas  o Geen  ​XIST ​ (​X inactive specific transcript​), mis paikneb XIC regioonis, jääb  transkriptsiooniliselt aktiivseks  o Geenilt  ​XIST ​ sünteesitakse RNA molekulid on assotsieerunud inaktiivse X  kromosoomiga, takistades sealt transkriptsiooni  o Aktiivses X kromosoomis on geeni  ​XIST ​ transkriptsioon pärsitud  o Aktiivsete kromosoomide puhul on histoon H4 atsetüleeritud 
o Inaktiivse X kromosoomi puhul on atsetüleeritud H4 leitud ainult vähestes  regioonides  o Inaktiveerunud X kromosoom on interfaasis nähtav Barri kehakesena 
o Kumb X kromosoomidest inaktiveerub, on juhuslik  45, X genotüübiga naised erinevad normaalsetest naistest:  Turneri sündroomiga sünnib lapsi sagedusega 1:3000. Sellise kromosoomianomaaliaga 
indiviididel ilmneb kasvupeetus, viljatus, kerged anatoomilised kõrvalekalded. Kui tervetel 
naistel on erinevates rakkudes juhuslikult inaktiveeritud kas isalt või emalt pärti X 
kromosoom, on siiski üksikuid geene, mis peavad olema aktiivsed mõlemas X kromosoomis. 
Leitud on >20 geeni, mis on aktiivsed mõlemas X kromosoomis. Osa neist kodeerivad 
transkriptsioonifaktoreid, mõned neist on olemas ka Y kromosoomis. See seletab, miks 
Turneri sündroomiga (genotüüp 45, X) enamus embrüoid hukkub ning miks  ​45, X naised on  viljatud ​. Neil puudub Barri kehake.  41. Selgitage DNA „sõrmejälgede“ meetodit ja selle rakendusi  DNA polümorfism võimaldab tuua esile indiviidile omapärase DNA fragmentide mustri, 
mida nim DNA sõrmejälgedeks.  Testi läbiviimisel võrreldakse DNA piirkondi, mis sisaldavad kordusjärjestusi VTNR-id 
(variable number tandem repeats) ​. Erinevate indiviidide DNA töötlemisel restriktaasidega  saadakse erinev fragmentide muster  ​(kasutatakse Southern Bloti meetodit) ​. Mida rohkem  erinevaid hübridisatsiooniproove kasutatakse, seda suuremat osa genoomist võrreldakse – 
saadakse usaldusväärsemad tulemused. 


Võimalik lähtuda väga väikesest bioloogilise materjali kogusest ja amplifitseerida sealt PCR 
meetodil DNA järjestused, mida edaspidi analüüsitakse.  Rakendusi:  o Kohtumeditsiin ​ – isikute tuvastamine  o Isikute tuvastamine pärast katastroofi ​ – nt suured lennuõnnetused  o Ajalugu ​ – isikute tuvastamine matmispaikades jms  o Isadustestid ​ – isaduse tuvastamisel tuleb arvestada seda, et homoloogilistest  kromosoomidest pooled on pärit isalt, pooled emalt. Lapse DNA fragmentide mustris 
sisaldub nii isale kui ka emale iseloomulikke fragmente    42. Tooge näiteid geneetilisi haigusi põhjustavatest mutatsioonidest  ja selgitage  haiguste molekulaarset diagnostikat  Haiguste molekulaarne diagnostika:  Haiguste molekulaarne diagnostika eeldab konkreetse haigusega seotud geenide 
nukleotiidse järjestuse ja haigust põhjustavate mutatisoonide teadmist ​. ​Kui mutatsioonide  kohad on lokaliseeritud, saab vastavat DNA regiooni uuritavate indiviidide genoomist 
PCR-i teel amplifitseerida ja seejärel juba täpsemalt analüüsida. ​ Võimalik on teostada ka  sünnieelset diagnostikat ja testida kromosoomide anomaaliaid.  PDG-d  ​(pre-implantation genetic diagnosis) ​ rakendatakse kunstlikul viljastamisel enne  embrüo viimist emakasse. Eraldatakse rakk 3-päevasest embrüost  ​(8-10 raku staadium) ​.  Geneetilisi haigusi põhjustavaid mutatsioone:  1) Kolmenukleotiidse järjestuse liigne kordumine ​ – nt: Huntingtoni tõbi, fragiilne X,  müotoonne düstroofia jt  Huntingtoni tõbi:  Tegemist on dominantselt avalduva haigusega  ​(mutatsioon 4. kromosoomis paiknevas  geenis, mis kodeerib valku huntingtiini) ​. ​Avaldub tavaliselt 30-50. eluaasta vahel tsentraalse  närvisüsteemi progresseeruva degeneratsiooni näol ​ ​(võnkuvad liigutused; dementsus) ​ ja  lõpeb 10-15 aastat hiljem patsiendi surmaga ​. Varases staadiumis on võimalik kontrollida  motoorikat.  Huntingtoni tõbe on  ​võimalik diagnoosida, kui ülesamplifitseerida CAG järjestus​.  Diagnostika on võimalik ka sünnieelselt.  Müotoonne düstroofia:  Tegemist on ühe lihasdüstroofia vormiga. See on  ​dominantne mutatsioon 19. kromosoomis  (DM1, CTG järjestuse kordistumine väljaspool DMPK geeni; häiritud on RNA protsessimine – 


muudab kromatiini struktuuri ja mõjutab läheduses olevate geenide avaldumist)  ​või 3.  kromosoomis ​ ​(DM2, CCTG järjestuse kordistumine ZNF9 geeni intronis)  o Lihastegevus tugevalt häiritud ​ ​(avaldub nt näolihastes – nagu oleks mask ees; mõjub  südamelihasele jne)  Fragiilne X:  o Põhjustab vaimset alaarengut 
o Haiged on heterosügootsed naised ja hemisügootsed mehed 
o CGG järjestuse kordistumine ​ kuni 1000X  o Pärsib ​ FMR1 ​geeni avaldumise, mis mõjutab aju arengut juba sünnieelselt  o Premutatsioonilise  ​FMR1 ​ alleeli puhul võib DNA polümeraas libiseda DNA-l tagasi ja  hakata sünteesima uuesti sama regiooni    2) Mutatsioonid ioonkanalites, 3-nukleotiidse järjestuse deletsioon  Tsüstiline fibroos:  o Autosomaalne retsessiivne mutatsioon 
o Mutatsioonid geenis, mis kodeerib transmembraanset regulaatorit CFTR, mis asub  ioonkanalites, osaledes soolade transpordis rakust sisse ja välja ​ – häiritud on  klooriioonide transport hingamiselundites, pankreases, soolestikus ja teistes 
organites  o Haigetel on  ​kõrge risk surra kopsupõletikku juba imikueas  o Diagnostika Southern Bloti meetodil –  ​potentsiaalset deletsiooni sisaldava DNA  piirkond amplifitseeritakse PCR teel. Amplifitseeritud DNA hübridiseeritakse 
erinevate radioaktiivselt märgistatud oligonukleotiididega. 
Hübridisatsioonitingimused on selektiivsed ​: üks oligotest hübridiseerub ainult  algtüüpi DNA järjestusele, teine aga deletsiooni sisaldavale  o Mutantse  ​CF ​ lookuse isoleerimisel kasutati positsioonilist kloneerimist    3) Punktmutatsioonid  Retinitis pigmentosa – kanapimedus; pimedaks jäämine:  o Võrkkesta pigmendi kadumine ​; lõppeb pimedaks jämisega  o Mutatsioonid rodopsiini geenis  Sirprakuline aneemia:  o Diagnoosimine DNA southern bloti meetodil 
o Mutatsiooni tagajärjel on ära kadunud üks restriktaasi lõikesait beeta-globiini  geenist  4) Ühenukleotiidne polümorfism ​ – nt ​hemofiilia​; kõrgenenud risk südame- ja  versoonkonna haigustele; muutused ravimi metabolismis 


  43. Selgitage geeniteraapia meetodeid ja rakendusi  GEENITERAAPIA – seisneb normaalse geeni viimises indiviidi genoomi, mis sisaldab defektset 
geeni.  Juhul kui geeniteraapia on olnud edukas, sünteesib transgeenne organism varem puudunud 
geeniprodukti ja selle tulemusena taastub tal normaalne fenotüüp.  Eristatakse 2 tüüpi geeniteraapiat:  1) Somaatiliste rakkude mittepäritav geeniteraapia  2) Sugurakkude geeniteraapia ehk päritav geeniteraapia  Inimese puhul on kasutatud ainult somaatiliste rakkude geeniteraapiat.  Geeniteraapias kasutatavad vektorid:  1) Retroviirustel põhinevad vektorid ​: ​+ Transgeen integreerub koos retroviiruse  DNA-ga raku genoomi ja kandub edasi rakuliini pidi; -  Integratsioon võib 
põhjustada kahjulikke mutatsioone  2) Adenoviirustel põhinevad vektorid: +  Viiruse genoom koos transgeeniga  replitseerub autonoomselt ja püsib rakkudes seni, kuni immuunsüsteem selle 
elimineerib; - Transgeen püsib rakkudes lühiajaliselt  Rakendusi:  Kasutatakse geneetiliste defektide parandamisega juhtudel, kus mõlemad geenikoopiad on 
defektsed.  44. Geeniteraapia rakendamisega seotud riskid  Riskid:  o Translokatsioon ​ – põhjustatud retroviirustest  o Mõnede geenide üleekspressioon, mis võib viia mutatsioonideni ​ vms  o Liiga tugev immuunvastus ​ – viiruse genoomil põhinevate vektorite kasutamine  transgeeni rakku viimiseks võib põhjustada väga tugeva immuunvastuse viiruse 
valkude vastu   
 
 
  45. Transgeensed organismid, nende konstrueerimise eesmärgid 


TRANSGEEN – ühest organismist isoleeritud geen, mis on viidud teise organismi rakkudesse.  TRANSGEENNE ORGANISM – organismi, kuhu on viidud talle võõras geen  Eesmärgid:  1) Soovitavate tunnuste lisamine või võimendamine kultuurtaimedel ja koduloomadel  – nt suurem piimaand lehmal  2) Huvipakkuva produkti tootmine taimes või loomas ​ – nt ravimid  3) Transgeensete organismide konstrueerimine eesmärgiga  ​uurida bioloogiliste  protsesside toimumise molekulaarseid mehhanisme  Transgeeni rakku viimiseks on erinevaid võimalusi:  o Transformatsioon 
o Rakku tulistamine volframi kuulikeste koostises 
o Süstimine 
o Viirused    46. Eukarüootsete valkude  bakterites tootmiseks vajalikud geenimanipulatsioonid 
o Bakterid on pandud  sünteesima inimese insuliini, kasvuhormooni ja interferooni 
o Tuleb lähtuda cDNA-st, kust on intronid kõrvaldatud. Geeni liidetakse ala, mis  omab translatsiooni initsiatsiooni signaali. Piirkond viiakse bakteri regulatoorsete 
elementide kontrolli alla. Bakterisse viiakse see plasmiidi koosseisus või viiruste 
abil. Valku on võimalik toota nii rakku sisse, kui ka rakust välja ​ ​(nt: somatotropiini  tootmine)  o Inimese kasvuhormooni ekspressioonikonstrukt bakteris  ​E. coli   o Ensüümide tootmine bakterites – nt: juustu valmistamisel vajalik renniin 
o Võõrvalgu ekspressioon võib erineda erineva koodonkasutuse tõttu: ekspressioon  võib täiesti puududa või olle üleekspresseeritud    47. Transgeensete loomade ja taimede saamine. Tooge mõned näited  Transgeensete loomade saamine:  1) Embrüode nakatamine retroviiruste baasil konstrueeritud rekombinantsete DNA  molekulidega  2) Enamasti  ​süstitakse rekombinantne DNA viljastatud munarakku  Süstitav DNA võib olla kas lineaarne või rõngasmolekul ​. ​Lineaarne DNA integreerub  genoomi ligi 5 korda efektiivsemalt kui tsirkulaarne DNA. ​ ​Ühte munarakku süstitakse sadu  kuni tuhandeid rekombinantse DNA molekule. Sisseviidud DNA  ​(transgeen) ​ integreerub  genoomi suvalistesse kohtadesse. 


DNA süstimisel viljastatud munarakku toimub transgeeni integreerumine genoomi enamasti 
embrüo arengu varajastel etappidel ​. G​ 0 ​ generatsioon on geneetilised mosaiigid. ​Et saada  transgeenseid loomi, kus tunnus on kinnistunud, ristatakse G0 generatsiooni isendeid ​. G​ 1  generatsioonis on transgeensed need, kelle vanematel oli transgeen integreerunud 
sugurakkudesse.  Nt:  ​Transgeense hiire saamine​ – ​embrüonaalsed tüvirakud ES isoleeritakse blastulast. Pärast  võõr-DNA sisestamist viiakse ES rakud mõnda teise arenevasse embrüosse. Osa neist on 
aluseks organismi kudede moodustumisel. Sel viisil saadud organismid on kimäärsed, 
sisaldades nii normaalseid kui ka mutantseid rakke ​. Juhul kui mõni mutantne rakk on olnud  aluseks sugurakkudele kujunemisele, kandub mutatsioon ka järglastele.  Transgeensete hiirte kasutamine:  1)   Imetajate geeniekspressiooni uurimine  2) Geenide ülekandevektorite ja meetodite katsetamine, et neid hiljem kasutada  inimese puhul  Lisaks on konstrueeritud veel transgeenseid sigu, kitsi, kanu, kalu.  Transgeensed taimed:  1) DNA tulistatakse volframi või kullapartiklite koosseisus taimerakku 
2) DNA sisestamine elektrivoolu abil (elektroporatsioon) 
3) Taimerakke transformeeritakse taimerakke  ​Agrobacterium tumefaciens ​ Ti  plasmiidide põhjal konstrueeritud rekombinantsete plasmiididega  Taimede geneetilisel manipuleerimisel on  ​suureks abiks taimerakkude totipotentsus – iga  üksiku taimeraku võime dediferentseeruda embrüonaalseks rakuks, millest seejärel 
kasvatatakse uus taim ​.  Nt ​: herbitsiidide-resistentsed taimed​, ​külmatolerantsed taimed​, ​kahjurite-resistentsed  taimed, köögiviljade säilivustähtaja pikendamine, transgeenne riis ​ ​(vähendavad raua ja  vitamiin A defitsiiti) ​.  48. Mille poolest erinevad vähirakud normaalsetest keharakkudest?  Tooge tõendeid  vähi geneetiliste aluste kohta  o Vähirakkude ​ puhul toimub ​rakkude kasv ja jagunemine kontrollimatult​. ​Normaalsed  keharakud  ​jagunevad harva ning kontrollitult  o Rakud jagunevad, kuhjudes üksteise otsa ning moodustavad tuumori ​: healoomuline  kasvaja  ​(tuumori rakud ei levi ümbritsevatesse kudedesse) ​; pahaloomuline kasvaja  (kasvaja levib teistesse kehapiirkondadesse, moodustades sekundaarseid tuumoreid – 
metastaas) ​. ​Keharakud jagunedes kuhilaid ei moodusta  o Vähirakud on surematud ​. ​Normaalsed rakud ei suuda jaguneda rohkem kui 60-70  korda 


o Vähirakkudes on aktiveerunud telomeraas ​.​ Normaalsetes rakkudes on telomeraas  inaktiivne  o DNA kahjustusi ei parandata 
o Vähirakud ei allu teiste rakkude signaalidele  *Vähirakke on võimalik saada normaalsete rakkude kultuurist, kui neid rakke töödelda 
kartsinogeenidega  ​(teatud viirused, kiirgus või mutageensed kemikaalid) ​.  Geneetilised alused:  o Vähirakkude kasv ja jagunemine ei allu teistelt rakkudelt saadetud signaalidele 
o Nõrgema immunsusega organismidel võib kergemini tekkida vähkkasvaja 
o Kontrollimatut jagunemist põhjustavad muutused geenide avaldumises 
o Üleminek ühest rakutsükli faasist teise toimub rakuväliste ja siseste keemiliste  signaalide koostöös. Kui kontrollpunkt ei reageeri õigesti, võib DNA replikatsioon 
toimuda ka DNA kahjustuste korral – suureneb mutatsioonide hulk, millest osa 
võivad põhjustada vähki  Tõendid vähi geneetilistele alustele:  o Vähirakkude fenotüüp ilmneb ka tütarrakkudel 
o Vähiteket võivad indutseerida teatud viirused 
o Vähki indutseerivad kartsinogeenid põhjustavad DNA-s mutatsioone 
o Mõnedes suguvõsades on vähk päritav 
o Teatud verevähi vormid  ​(leukeemia, lümfooma) ​ on seotud kindlate kromosoomide  aberratsioonidega  Vähki põhjustavad mutantsed geenid jaotuvad kahte klassi:  o Onkogeenid ​ – geenid, mille mutantsed alleelid stimuleerivad rakkude jagunemist  o Tuumori supressorgeenid ​ – mutantsete geenide puhul ei suudeta pärssida raku  jagunemist. Mutatsiooni toime ilmneb juhul, kui mõlemad alleelid on mutantsed!    49. Võrrelge viiruslikke onkogeene ja nende rakulisi homolooge. Selgitage  mehhanisme, kus need geenid stimuleerivad vähki  Viiruslikud onkogeenid  ​(v-src) ​:  o Tuumoreid indutseerivate retroviiruste puhul on kirjeldatud üle 20 viiruse onkogeeni 
o Kodeerivad kasvufaktoritele ja nende retseptoritele sarnaseid valke, proteiini  kinaase, transkriptsioonifaktoreid  o Inimesel võivad vähki tekitada: HPV, adenoviirus, herpes, hepatiit B, hepatiit C,  inimese T-raku leukeemiaviirus 1 jt  o Puuduvad intronid ​ ​(c-onc geenilt transkribeeritud ja protsessitud RNA on lisandunud  retroviiruse genoomi) 


o Retroviiruste onkogeenid on rakuliste geenide muteerunud variandid, mille  ekspressioon aktiveerub pärast viirusinfektsiooni. Need onkogeenid on rakud 
omandanud eelmisest nakatunud rakust. Selline onkogeenide kaasavõtmine raku 
jagunemisel on juhuslik ja seotud viiruse elutsükliga  o Onkogeenide aktivatsiooni mehhanismid:  ​onkogeeni kandva retroviiruse  transduktsioon; onkogeene mittekandva retroviiruse insertsioon raku genoomi ​ ​(kui  LTR inserteerub proto-onkogeeni lähedusse, siis määrab ta selle transkriptsiooni ning 
rakulise onkovalgu ümberproduktsiooni) ​;  ​viiruse DNA genoomi replikatsiooniks  vajalike onkovalkude ekspressioon; viiruseline transkaktivatsioon retroviiruse 
puhul  Rakulised homoloogid viiruslikele onkogeenidele – protoonkogeenid:  Viiruslike onkogeenide rakulisi homolooge nim protoonkogeenideks või normaalseteks 
rakulisteks onkogeenideks.  o Rakuline homoloog geenile v-src on c-src ​. Kodeerivad järjestused on mõlemal geenil  sarnased, erinedes teineteisest ainult 18 nt poolest  o c-ong geenide poolt kodeeritud valgud on olulised rakutsükli regulatsioonis.  Mutatsioonide tõttu nendes geenides on valgud kas üleekspresseeritud või pidevalt 
aktiivses vormis: rakkude kontrollimatu jagunemine, vähi teke  o Olemas intronid  Rakuliste onkogeenide aktivatsioonimehhanisme on nelja tüüpi:  1. Punktmutatsioonid rakulistes proto-onkogeenides 
2. Rakuliste proto-onkogeenide amplifikatsioon 
3. Rakuliste proto-onkogeende translokatsioon aktiivse promootori/enhanseri alla. 
4. Liit-onkovalkude teke translokatsioonil  Miks v-onc geenid indutseerivad tuumoreid, c-onc geenid aga mitte?  1) Viiruslike geenide ekspressioonitase on võrreldes rakuliste homoloogidega oluliselt  kõrgem  2) Viiruslikud onkogeenid võivad avalduda rakutsükli valel etapil 
3) Viirusliku onkogeeni produkt võib olla rakulise homoloogi mutantne versioon ning  seetõttu on uute omadustega  Mutatsioonid, mis muudavad protoonkogeeni vähki stimuleerivaks:  o Geeni  ​translokatsioon või transpositsioon  o Geeni ​ ​amplifikatsioon​ ​(geeni koopiaarv suureneb)  o Mutatsioonid geeni regulatoorses alas 
o Mutatsioon geenis 


50. Tuumori supressorgeenide funktsioonid rakus. Selgitage rakutsükli  regulatsioonimehhanisme, mis käivituvad DNA kahjustuste korral  Tuumori supressorgeenid ​ – mutantsete geenide puhul ei suudeta pärssida raku jagunemist.  Mutatsiooni toime ilmneb juhul, kui mõlemad alleelid on mutantsed!  pRB kontrollib rakutsükli geenide transkriptsioonifaktoreit E2F-i:  Normaalse rakutsükli puhul, kui kontrollpunkti on jõudnud positiivsed signaalid selle kohta, 
et rakk võiks jaguneda, seonduvad tsükliinid tsükliinidest sõltuvate proteiinikinaasidega ning 
seejärel Rb fosforüülitakse. E2F-pRB kompleks dissotseerub ning E2F aktiveerib nende 
geenide transkriptsiooni, mis on vajalikud raku jagunemiseks.  p53:  Üle 50% inimese vähijuhtudest on leitud mutatsioone tuumori supressorgeenis, mis kodeerib 
tranksriptsiooni aktivaatorit p53.  ​p53 toimib transkriptsiooni-faktorina, indutseerides p21  sünteesi. p21 inhibeerib CDK-de fosforüleeriva aktiivsuse. pRB jääb E2F-ga kompleksi.  p53 roll rakutsükli regulatsioonis: 1) rakutsükli peatamine; 2) DNA 
reparatsioonisüsteemide aktivatsioon; 3) apoptoos  Regulatsioonimehhanisme, mis käivituvad DNA kahjustuste korral:  o BRCA1 ja BRCA2 valgud osalevad DNA reparatsioonis, homoloogilises  rekombinatsioonis ja transkriptsiooni regulatsioonis  o Nad seonduvad transkriptsioonifaktoritega, osalevad kromatiini remodelleerimises.  Nende puudumisel akumuleeruvad rakkudes kromosoomide katked  o BRCA1 seondub dsDNA katketega ja initsieerib koos histoonilaadse valguga H2AX  reparatsiooni, modifitseerides lokaalselt kromatiini struktuuri  o DNA valepaardumisi kõrvaldav  ​mismatch ​ reparatsioon​ MMR  o Nukleotiidi väljalõike reparatsioon NER ​ – tuntakse ära piirkonnad DNA-s, mis on  kahjustunud  ​(nt: tümiini dimeerid) ​; sinna tehakse katke ning kahjustunud koht  lõigatakse välja. DNA-le sünteesitakse vastu uus komplementaarne ahel    51. Selgitage geneetilist tagapõhja, miks on vähiteke astmeline protsess ning  geneetilist eelsoodumust vähitekkeks  Osa vähitüüpe areneb välja siis, kui teatav geen ei avaldu enam. Nt: retinoblastoomi 
(võrkkesta vähks) ​ põhjustab mutatsiooni RB geenis.  Knudsoni kahe tabamuse hüpotees – vähi teke eeldab, et defektsed on mõlemad tuumori 
supressorgeeni alleelid.  Vähiteke on astmeline protsess ​, mille käigus akumuleeruvad somaatilised mutatsioonid  geenidesse, mis kontrollivad raku jagunemist. Nt: soolevähi kujunemiseks on vaja vähemalt 7 


sõltumatut mutatsiooni: Esmalt tekib mutatsioon teises  ​APC ​ geeni alleelis, siis mutatsioonid  K-ras  ​proto-onkogeeni alleelides, 18-nda kromosoomi tuumori supressorgeenide alleelides ja  TP53 ​ alleelides.  Kuna mutatsioonid peavad tekkima mõlemasse geeni alleeli, siis võib elu jooksul 
muteeruda üks alleel, hiljem ka teine. Tavaliselt on vajalik veel mõne rakutsüklit 
reguleeriva geeni muteerumine ​.  Samuti ei pruugi alati välja areneda kohe pahaloomuline kasvaja.  ​Soolevähi eellaseks on  healoomuline kasvaja sooles, mis elu jooksul ning mutatsioonide kuhjumise tulemusena 
võib välja kujuneda pahaloomuliseks. Pahaloomuline kasvaja hakkab levima ka teistesse 
kudedesse – tekivad metastaasid ​.    Päritavate vähihaiguste puhul ​ on ​laps vanematelt saanud enamasti ühe mutantse alleeli.  Rakupopulatsioonis tekib varem või hiljem spontaanne mutatsioon ka geeni teise alleeli 
ning sellest rakust, milles on mutatisooni tagajärjel geeni mõlemad alleelid defektsed, 
arenebki tuumor.  ​Päritavate vähivormide puhul on enamasti tegemist ​mutatsioonidega kas  tuumori supressorgeenides või DNA reparatsiooniensüüme kodeerivates geenides ​.  52. Milline roll on emapoolse mõjuga geenidel hulkrakse organismi arengus? Selgitage  seda äädikakärbse mudeli näitel  Drosophila ​ munarakk on ellipsoidne, 1 mm pikkkune. Iga munarakk on ümbritsetud  spetsiaalse kihiga – koorioniga. Esimeses otsas on kaks filamenti, mis aitavad raku sisemusse 
tuua hapnikku. Seemnerakk siseneb läbi teise esiosas paikneva struktuuri, mida nimetatakse 
mikropüüliks. Vahetult peale viljastamist on sügoodi jagunemine nii kiire, et tütarrakkude 
vahele ei jõua membraani moodustuda ja tekib sünsüütsium. Pärast 9-ndat jagunemist 
sisaldab sünsüütsium 512 tuuma, mis seejärel liiguvad embrüo äärealadesse ja jagunevad 
veel neli korda. Osa rakke liigub veel spetsiaalselt embrüo tagumisele poolusele. Pärast 
13-ndat jagunemist eralduvad rakud tsütoplasmaatiliste membraanidega ning tekib rakuline 
blastoderm, kus on üle 4000 raku. Blastodermi tagumisele poolele liikunud tuumadest 


moodustuvad pooluse rakud, mis on aluseks sugurakkudele. Seega toimub somaatiliste ja 
sugurakkude liinide eristumine juba väga varakult, blastula staadiumis.   Umbes päevaga areneb äädikakärbse embrüost vastne. Vastne kasvab väga kiiresti, vahetab 
2 korda kesta ning moodustab viie päeva pärast nuku. Nukustaadiumis (neli päeva) hävivad 
paljud vastsespetsiifilised koed ning moodustuvad täiskasvanud kärbsele iseloomulikud 
organid nagu tundlad, silmad, tiivad ja jalad. Kuna täiskasvanud isendit nimetatakse 
valmikuks, imaagoks (ingl. k.  ​imago ​), nimetatakse vastse erinevates osades paiknevaid  rakukogumikke, millest arenevad organid, immaginaaldiskideks ( ​imaginal discs ​).  Munaraku kasvamiseks ja valmimiseks ning viljastumisjärgseks embrüo arenguks 
transporditakse munarakku teda ümbritsevatest rakkudest toitaineid ja komponente, mis on 
olulised embrüo arenguks. Mõnede liikide puhul määravad need komponendid embrüo 
põhiplaani, pea-saba ning kõht-selg eristumise.  Mutatsioone ema geenides, mis ei mõjuta ema enda eluvõimelisust ega munarakkude 
valmimist, kuid mõjutavad järglaste arengut, nimetatakse emapoolse mõjuga 
mutatsioonideks. Geene, mille muteerumine sellist efekti põhjustab, nimetatakse 
emapoolse mõjuga geenideks.  Retsessiivne mutatsioon geenis  ​dorsal  ​(​dl​) ei võimalda eluvõimelisi järglasi saada siis, kui  ristata mutantseid homosügootseid emaseid metsiktüüpi homosügootsete isastega ​. ​Dl  määrab selle, kuhu tekib embrüo kõhtmine ja kuhu selgmine pool. Mutatsiooni korral 
kõhtmist poolt ei arene ja embrüo on kahe selgmise poolega. ​ Isapoolne metsiktüüpi alleel  embrüos ei avaldu.  Oogeneesi ajal sünteesitakse produkte, mis on folliikulirakkudele diferentseerumise 
signaaliks – folliikulid diferentseeruvad dorsaalseks ja ventraalseks tüübiks. 
Geeniproduktid ventraalsetest folliikulitest annavad signaali üle ootsüüdi ventraalsele 
(kõhtmisele) ​ küljele​. ​Signaal kandub membraanseoselisele retseptorvalgule (geeni ​toll  produkt), mis selle tagajärjel aktiveerub ning stimuleerib transkriptsioonifaktori sisenemist ​.  Drosophila ​ embrüo arenemise kõige varajasemad etapid on kontrollitud ema poolt  sünteesitud faktorite kaudu. Hiljem aktiveeruvad selektiivselt embrüo geenid ​ - sügootiliste  geenide aktivatsioon.  Emapoolsete geenide  ​bicoid ​ ja ​nanos​ kontrolli all on ka embrüi ​gap ​geenid, mis määravad  segmentide piirkonna embrüos.  53. Organismi arengus osalevate geenide molekulaarne analüüs. Selgitage, milliste  meetoditega on võimalik tuvastada uuritava geeni rolli organismi arengus?    1) Drosophila ​ puhul on ​võimalik lokaliseerida kloneeritud geene, kasutades ​in situ  hübridiseerimist polüteenkromosoomidele  2) Spetsiifiliste RNA-de asukoha tuvastamine embrüo erinevatel arengujärkudel 
3) Valkude lokaliseerimine huvipakkuvas kohas immunoloogilise reaktsiooniga 


4) Geenide muteerimine  ​in vitro ​ ja nende mõju uurimine arenevas embrüos    54.  Homeootilised geenid äädikakärbsel ja nende homoloogid eukarüootidel. Milliseid  väärarenguid põhjustavad mutatsioonid homeootilistes geenides?    HOMEOOTILISED GEENID – määravad selle, millised kehasegmendid arenevad, vallandades 
nende poolt kontrollitavate geenide kaskaadse avaldumise ​. Homeootilised geenid  kodeerivad heeliks-pööre-heeliks tüüpi transkriptsioonifaktoreid konserveerunud regiooniga 
60 aminohappe ulatuses ​.  Homeootilised geenid moodustavad ühes autosoomis kaks suurt klastrit:  1) Bithorax Complex ​ ​BX-C​ – 3 geeni. ​Mutatsioon​: ​kärbse 3. rinnaku segment on  muutunud 2. segmendi sarnaseks – ilmneb teine paar tiivalaadseid moodustusi  2) Antennapedia Complex ​ ​ANT-C​ – 5 geeni. ​Mutatsioon:​ ​tundlad vahetuvad jalgadega  Kui diferentseerunud rakud on organiseerunud kindlal viisil, moodustavad nad organi. 
Organite moodustumine õigetesse kehapiirkondadesse on väga täpselt geneetiliselt 
kontrollitud. Nt: geen  ​eyeless ​ kodeerib homeodomääni sisaldavat transkriptsioonifaktorit,  mis lülitab tööle tuhandeid geene, et toimuks silma areng.  Äädikakärbse homeootiliste geenide homoloogid  ​(​Hox ​ geenid) imetajatel​:  Asuvad neljas erinevas klastris  ​HoxA, HoxB, HoxC  ​ja ​HoxD​, mis paiknevad erinevates  kromosoomides. DNA järjestuse analüüs viitab sellele, et  ​4 ​Hox ​ geenide klastrit on tekkinud  algse klastri neljakordistumise tulemusena 500 – 600 miljonit aastat tagasi ​.  Mutatsioonid  ​hox ​ geenides põhjustavad ​knock-out​ organismide arengut​ ​(tekivad kimäärid)​.  Nt: hox1b mutantidel ei ole närve, mis on vajalikud näoilmete väljendamise jaoks.  55. Mudelorganismid selgroogsete arengu uurimiseks. Selgitage hiire  ​knockout  mutantide konstrueerimist  Selgroogsete arengu geneetilist kontrolli aitab mõista selgrootute teadaolevate geenide 
homoloogide isoleerimine ja iseloomustamine selgroogsetel organismidel. ​ Kui teatavat  arenguprotsessi mõjutav geen selgrootust organismist on identifitseeritud ja isoleeritud, 
saab seda kasutada sondina tema homoloogide leidmiseks teistest organismidest.  Mudelorganismid:  o Hiir ​, rott  o Konn 
o Kana 
o Sebrakala  Hiire  ​knockout ​ mutantide konstrueerimine: 


o Huvipakkuva geeni funktsioon rikutakse ja viiakse inaktiveeritud geen hiire  genoomi normaalse geeni asemele  o DNA sisestatakse embrüonaalsetesse tüvirakkudesse ja kultuuris kasvatatud ES  rakud viiakse mõnda teise arenevasse embrüosse  o Sel viisil  ​saadud organismid on kimäärsed, sisaldades nii normaalseid kui ka  mutantseid rakke  o Seejärel  ​isoleeritakse järglased, kellel on mutatsioon kinnistunud  Kloneeritud  ​(uuritava organismi genoomist isoleeritud) ​ geenide abil on võimalik  konstrueerida  ​knockout ​ mutante. Sel juhul rikutakse kloneeritud geeni funktsioon ja  asendatakse normaalne geen hiire organismis rikutuga. DNA viimine hiire rakkudesse toimub 
samal viisil nagu juba eelpool kirjeldatud. Defektse geeni asendumine normaalsega toimub 
homoloogilise rekombinatsiooni teel. Heterosügootseid  ​knockout ​ mutatsiooni kandvaid hiiri  ristates saame homosügootsed järglased, kelle arengut jälgides on võimalik uurida mutantse 
geeni mõju organismi arenguprotsessile.  56. Selgitage loomade kloonimise põhimõtet lammas Dolly näitel. Reproduktiivse ja  terapeutilise kloonimise eesmärgid  Organismi kloonimise tulemusena saadakse kaks või enam geneetiliselt identset isendit. 
Sisuliselt on kloonid ka ühemunakaksikud, sest nad arenevad ühest viljastatud munarakust.  o Embrüokloonimine ​: koduloomade puhul rakendatud ​varajase embrüo​ (2-8 raku  staadium ​) rakkude lahutamist ning nendest identsete järglaste saamist  o Kloonimine lähtudes imetajate somaatilistest rakkudest  Lammas Dolly:  Kloonimisel lähtuti  ​doonori udararakust, kust võeti rakutuum​. ​Teiselt utelt​ oli pärit  munarakk ​, kust oli vaja kõrvaldada munaraku tuum ning asendada see doonorlamba  keharaku tuumaga.  ​Edasi stimuleeriti rakujagunemist ja arenes embrüo, mis viidi  kolmandasse lambasse ​ ​(asendusema) ​. Sündis lammas Dolly, kes oli geneetiliselt identne  doonoriga, kellelt pärines tema DNA.  Reproduktiivne kloonimine:  Somaatilise raku tuum ühendatakse munarakuga, kust eelnevalt on tuum eemaldatud ​,  kuid siin on  ​eesmärgiks saada arenevast diploidsest embrüost ​in vivo ​ täiskasvanud  organism, mis on doonori geneetiliselt identne koopia  Nt: väljasurevate või väljasurnud liikide kloonimine  Terapeutiline kloonimine:  Kasutatakse  ​peremehe somaatilisi rakke ES-rakkude populatsiooni moodustamiseks  kunstlikes tingimustes. ​ ​Somaatilise raku tuuma saab viia emasorganismi kui 


doonorimunarakku, kust tuum on eelnevalt kõrvaldatud ​. Ühendrakk on diploidne ning ​kui  ta areneb embrüoks, siis saab eraldada tüvirakke ja moodustada  ​in vitro ​ ES-rakkude liine,  et kasutada neid siis juba geneetiliselt identse materjalina tagasiviimisel ​ e.  transplantatsioonil  ​peremeesorganismi kudedesse või organitesse.  Nt: kudede regenereerimine, organite asendamine; aju või seljaaju kahjustuste 
korrigeerimine; biokeemiliste defektide korrigeerimine  ​(diabeet) ​.  57. Reproduktiivse kloonimisega kaasnevad probleemid. Kas teie arvates on mõtet  kloonida inimest?  Probleemid:  o Geneetilised ja epigeneetilised efektid kloonimisel ​: ​kromosoomide aberratsioonid;  muutused geenide avaldumise mustris, mida mõjutab DNA metülatsioon ja 
histoonide atsetülatsioon  o Kloonimisel ilmnevad arenguhäired ​ ​(hiire, sea ja kitse kloonidel vähem kui lamba ja  veise kloonidel) ​: ​südame-veresoonkonna häired; organite patoloogia;  ebanormaalselt suur kasv sünnimomendil; kehaehituslikud defektid  o Erinevalt taimerakkudest tekivad  ​diferentseerunud imetajarakkude puhul probleemid  geenide avaldumise reprogrammeerimisega   o Pärast somaatilise raku geneetilise materjali ülekannet munarakku avalduvad  geenid, mis olid vaigistatud somaatilise raku tuumas; vaigistatakse geenid, mis olid 
seotud raku diferentseerumisega  o Mittetäielik reprogrammeerimine viib embrüo arenguhäiretele 
o Reprogrammeerimise efektiivsus varieerub sõltuvalt rakutüübist   Kas kloonida inimest?  Ei, sest liialt palju on defekte ning mutatsioone, mis võivad tekkida. Inimene ei pruugi üldse 
eluvõimelisena sündida. See aitaks küll kindlasti uurida täpsemalt inimese geene, geenide 
regulatsiooni, haiguste molekulaarseid tagamaid jne, kuid riskid kaaluvad üle õnnestumise 
võimalikkuse.  Rahvastiku arv on maailmas ka juba piisavalt suur..  58. Selgitage antikehade spetsiifika geneetilist tagapõhja  Iga B rakk sünteesib ainult ühte spetsiifilist antikeha. Antikeha seondumine antigeeniga 
stimuleerib B raku kiiret jagunemist, mille tulemusena tekib igast B rakust hulga sama 
antikeha tootvaid plasmarakke. Maksimaalne antikehade produktsioon saavutatakse 2-3 
nädala pärast. Antigeeni piirkonda, mida antikeha spetsiifiliselt ära tunneb ja seob, 
nimetatakse epitoobiks. Antigeen-antikeha kompleksid degradeeritakse fagotsüütide poolt. 
IgG ja IgM antikehad kutsuvad kohale komplemendivalke, mis degradeerivad võõrvalke 


proteolüütiliselt ning hävitavad seente ja bakterite rakke nende lüüsimise teel. Kui võõras 
antigeen on organismi kehast kõrvaldatud, pärsivad supressor T rakud antikehade tootmise.  Immuunsüsteemi iseloomustab tema spetsiifilisus.  ​Spetsiifilisus on tagatud tänu kolmele  põhikomponendile:  1) Koordineeritult töötavad spetsialiseerunud rakud 
2) Antikehad ja T rakkude retseptorid, mis tunnevad ära võõraid substantse 
3) Spetsiaalsed koesobivusantigeenid ​, mis ​hõlbustavad rakkudevahelist  kommunikeerumist, võimaldavad immuunsüsteemi rakkudel ära tunda võõraid 
substantse ning eristada organismile võõraid rakke omadest  Täiskasvanud inimese immuunsüsteemis osaleb ligi 10 ​12​ valget vererakku ning 10​15  spetsiaalset valgumolekuli ​. Kui näiteks viirus või bakter satub inimese kehasse, tuntakse see  ära immuunsüsteemi rakkude poolt, mille tulemusena produtseeritakse kahte tüüpi valke – 
antikehasid ning T rakkude retseptoreid, mis seonduvad spetsiifiliselt võõra substantsiga. 
Antikehaga või T rakkude retseptoriga seondunud substantsi nimetatakse antigeeniks, 
ning antigeeni, mis kutsub esile immuunvastuse, nimetatakse immunogeeniks ​. Peaaegu  kõik bioloogilised makromolekulid (polüpeptiidid, polüsahhariidid, nukleiinhapped) on 
võimelised toimima antigeenidena ning enamus neist käituma immunogeenidena.   Imetajate immuunvastust võib käsitleda kahekomponentsena:  1) Antikehade poolt vahendatud ehk humoraalne vastus  Humoraalse immuunvastuse korral  ​sekreteeritakse produtseeritud antikehad kehavedelike  ringlussüsteemi, kus nad seonduvad antigeenidega. Antikeha-antigeenkompleksid 
haaratakse spetsiaalsete valgete vererakkude poolt ning hävitatakse ​. Humoraalne  immuunsüsteem  ​kaitseb peamiselt organismi rakke võõraste rakkude (bakterid, seened) ja  vabade viiruspartiklite infektsiooni eest.  2) T rakkude poolt vahendatud ehk rakuline vastus  Rakulise immuunvastuse  ​korral sünteesitakse spetsiaalsete valgete vererakkude pinnale T  rakkude retseptoreid. Need retseptorid võimaldavad valgetel vererakkudel ära tunda ja 
hävitada peremeesorganismi võõrmaterjaliga nakatanud rakke ​. Seega ​kaitseb rakuline  immuunsüsteem organismi peamiselt viirusinfektsiooni vastu.  Spetsiaalsed rakud, mis osalevad immuunvastuses:  Immuunvastuses võõra substantsi vastu osalevad koordineeritult kõrgelt spetsialiseerunud 
rakud ​. Kõik need pärinevad mittediferentseerunud eellasrakkudest, mida nimetatakse  tüvirakkudeks ( ​stem cells ​) ja mis asuvad luuüdis. Eristatakse kahte põhilist rühma:  1) B-lümfotsüüdid ​, mida kutsutakse ka B rakkudeks, kuna nad valmivad luuüdis 


Vastava signaali saabumisel  ​diferentseeruvad B lümfotsüüdid​ ​plasmarakkudeks​, ​mis  produtseerivad antigeenidega seonduvaid valke ​ ​(antikehi) ​ ja ​B mälurakkudeks​, ​mis on  sama antigeeniga uuesti kunagi hiljem kokkupuutudes võimelised väga kiiresti antikehi 
produtseerima.  2) T-lümfotsüüdid ​, mida kutsutakse ka T rakkudeks, kuna nende diferentseerumine  toimub tüümuses  Eraldi grupi moodustavad veel  ​fagotsüüdid​ (siia kuuluvad ka makrofaagid).  T-lümfotsüüdid diferentseeruvad nelja tüüpi rakkudeks:  1) Tsütotoksilised e.  ​tapjad T rakud​ (​killer T cells ​) – ​kannavad raku pinnal paiknevaid  antikehadega seonduvaid T rakkude retseptoreid ning hävitavad vastavaid 
antigeene eksponeerivaid rakke  2) Abistavad T rakud ​ (​helper T cells ​) – ​stimuleerivad B- ja T-lümfotsüütide  diferentseerumist antikehasid tootvateks plasmarakkudeks ja tapjateks T 
rakkudeks  3) Supressor T rakud ​ (​supressor T cells ​) ​– suruvad alla plasmarakkude tapjate T  rakkude aktiivsuse  4) T mälurakud ​ (​memory T cells ​) – ​„mäletavad“ antigeeni ning nende uuel kokkupuutel  sama antigeeniga moodustuvad kiiresti tapjad T rakud  Põhilised koesobivusantigeenid aitavad eristada võõrast omadest:  Omavahel mittesuguluses olevate indiviidide puhul ühelt teisele organi transplanteerimine 
või naha ülekanne tavaliselt ebaõnnestub, kuna immuunsüsteem tõrjub transplanteeritud 
koed kõrvale. Samas identsete kaksikute puhul transplantatsioon üldjuhul õnnestub. Samuti 
võib samal indiviidil nahka ühest kohast teise istutada.  ​Võõraste kudede eristamine  organismi enda kudedest toimub tänu koesobivusantigeenidele ​. ​Võtmeroll selles protsessis  on põhilise koesobivuskompleksi ​ ​(MHC) ​ ​valkudel​. Inimesel nimetatakse MHC valke HLA  antigeenideks, kuna nad  ​avastati leukotsüütide pinnal​. HLA antigeenid on kodeeritud suure  geenide klastri poolt, mida nimetatakse  ​HLA ​ lookuseks ja mis paikneb 6-ndas kromosoomis.  HLA ​ lookuse geenide polümorfism on väga suur​, mis väljendub selles, et ​mõnel geenil on  kirjeldatud kuni sada või enam alleeli ​. ​Seega on tõenäosus, et kaks omavahel  mittesuguluses olevat indiviidi kannaksid kõigi  ​HLA ​ geenide samu alleele, ülimalt väike ja  sobivate organidoonorite leidmine komplitseeritud ​.  HLA  ​geenid kodeerivad kolme erinevat klassi valke:  1) Klassi I kuuluvad  ​HLA ​ geenid kodeerivad transplantatsiooni antigeene​. Nimetus  tuleneb sellest, et just need valgud vastutavad transplanteeritud kudede 
tagasitõrjumise eest. Neid nimetatakse  ​ka MHC klass I valkudeks​. Need valgud on  oma  ​olemuselt glükoproteiinid, mis on ankurdunud rakumembraanile, nii et  antigeenne determinant ulatub rakust välja ​. Transplantatsiooniantigeenid ​esinevad 


praktiliselt kõigil rakkudel ning aitavad killer-rakkudel (tapjad T rakud) eristada 
võõraid rakke omadest ​. Sellesse klassi kuuluvad valgud võivad seonduda küllaltki  erinevate antigeenidega teiste rakkude pinnal ja esitada võõraid antigeene 
eksponeerivaid rakke killeritele  2) Klassi II kuuluvad  ​HLA ​ geenid kodeerivad valke, mis asuvad peamiselt  B-lümfotsüütide ja makrofaagide pinnal ​ (need on rakud, mis interakteeruvad helper  T rakkudega). Need on heterodimeersed valgud, mis koosnevad kahest 
polüpeptiidist. Polüpeptiidide polümorfsed N-terminaalsed domeenid  ​rakupinnal  moodustavad vao, kuhu võib seonduda küllaltki lai valik erinevaid antigeene  3) Klassi III kuuluvad  ​HLA ​ geenid kodeerivad komplement-valke​, mis ​interakteeruvad  antikeha-antigeen kompleksidega ning aitavad neid proteolüütiliselt degradeerida ​.  Komplement-valgud tapavad ka võõra bioloogilise materjaliga nakatunud rakke, 
lõhkudes nende rakkude membraane  59. Antikehade klassi ümberlülitumise ja alleelse välistamise molekulaarsed  mehhanismid. Monokloonsete antikehade saamine  Antikehad grupeeruvad viide klassi: IgA, IgD, IgE, IgG ja IgM ​. ​Antikeha funktsiooni ning  kuuluvuse ühte neist klassidest määrab ära raskete ahelate konstantsete regioonide 
struktuur e. antikeha efektori funktsiooniga domääni struktuur ​.  o Kui arenevates B-lümfotsüütides algab antikehade süntees, on kõik raske ahela  konstantse ala geenisegmendid  ​C ​ H ​ olemas – sünteesitakse IgM tüüpi raske ahelaga  antikehasid ​, mis sisaldavad konstantse regioonina ​CH ​ µ ​ geeniprodukti  o Mõne aja pärast hakkavad osa plasmarakke tootma ka teistesse klassidesse  kuuluvaid antikehi, mis sisaldavad rasket ahelat IgA, IgD, IgE või IgG – 
ümberlülitumine  o IgM ja IgG tootvates rakkudes toimub nii geeni  ​CH ​ µ ​ kui ka geeni ​CH​δ  transkriptsioon ning RNA splaissingu käigus kõrvaldatakse üks järjestustest    o Üleminekul teistesse klassidesse kuuluvate antikehade tootmisele toimuvad  ümberkorraldused genoomis, mille käigus osa  ​C ​ H ​ segmentidest deleteeruvad ning  avaldub see raske ahela konstantset regiooni kodeeriv järjestus, mis külgneb vahetult 
geeniga   Alleelne välistamine:  Iga plasmarakk toodab ainult ühte tüüpi antikeha ​. Kuigi raku genoom on diploidne,  toimuvad  ​geneetilised ümberkorraldused ainult ühe alleeli ulatuses – alleelne välistamine​.  Alleelne välistamine  ​toimub raskete ning kergete ahelate geenisegmentide puhul  üksteisest sõltumatult ​. Kuna iga rakk produtseerib ainult ühte kindlat antikeha, mis seondub  ainult ühe epitoobiga, võimaldab see toota monoklonaalseid antikehi. Monoklonaalseid 
antikehi kasutatakse valkude tuvastamiseks ja lokaliseerimiseks. 


Monokloonsete AK-de saamine:  MONOKLOONSED ANTIKEHAD – kasvajaraku ja B-lümfotsüüdi hübriidimisel saadakse 
sellised hübriidsed immortaliseeritud rakukloonid, mis on  ​in vitro ​ tingimustes võimelised  tootma vaid üht kindlat tüüpi antikeha, mis on ülimalt spetsiifiline mingi kindla aine suhtes 
ja mis seondub vaid ühe epitoobiga – sellega, mille vastu ta on saadud ​.  1) Katselooma  ​(hiir) ​ immuniseerimine meid huvitava antigeeniga​ ​(mingi valk,  hormoon, ensüüm; immuniseerida vôib ka tervete rakkudega, näit kasvajarakkudega, 
et saada kasvajarakule iseloomulike antigeenide vastu antikehi jne)  2) Immuniseeritud hiire põrnarakud  ​(B-lümfotsüüdid) ​ liidetakse ​(hübridiseeritakse)  kasvajarakkudega  3) Hübridoomrakkude selektsioon HAT-selektiivsöötmel ​. Selektiivsöötme põhimõte:  kasvajarakud, mis ei hübridiseerunud põrnarakuga, surevad, sest nad on defektsed 
DNA sünteesi varutee eest vastutava ensüümi - HPGRT - suhtes ​.  ​DNA sünteesi peatee  ( ​de novo ​süntees)​ ​on aga blokeeritud selektiivsöötmes oleva aminopteriini poolt.  Seetõttu antud söötmes saavad ellu jääda ainult hübridoomrakud, mille üks vanem 
oli põrnarakk ​ ​( ​sealt tuleb hübridoomile puuduv ensüüm HPGRT​, ning ta kasutab DNA  sünteesiks varuteed, milleks vajalikud ained - hüpoksantiin ja tümidiin, on söötmesse 
juurde lisatud)  4) Antikehade sünteesi testimine ​ – ​tuleb üles leida see rakukloon, mis sünteesib  tõepoolest teid huvitavaid antikehi  5) Soovitud antikehasünteesiga rakuklooni rekloneerimine, osa materjali  külmutamine  6) Hübridoomi kasvatamine masskultuuris või hiire kõhuõõnes  ​astsiitkasvajana  7) Antikeha puhastamine, kasutamine soovitud otstarbeks    60. Päritavad ja omandatud immuunsüsteemi haigused.  ​Selgitage, kas ja kuidas on neid  võimalik ravida?   Päritavad immuunsüsteemi haigused:  o Autoimmuunhaiguste puhul toodab indiviidi organism antikehi tema enda  antigeenide vastu ​ – ​kahjustavad organismi enda kudesid ja organeid  Nt:  ​Juveniilne diabeet​ – ​antikehad ründavad pankreases insuliini tootvaid beetarakke​.  Insuliini puudumine põhjustab  ​pimedaks jäämist, haigestuvad ka süda ja neerud​. Juveniilset  diabeeti ehk tüüp I diabeeti pole täielikult võimalik ravida, kuid on võimalik sümptomeid 
leevendada. Selleks manustatakse haigele insuliini, pankrease transplantatsioon, neerude 
transplantatsioon.    o Kombineeritud immuundefektsuse sündroom  Nt:  ​ADA-defektsuse tagajärjel akumuleerub organismi desoksü-ATP ning tema liigkõrge  kontsentratsioon on T helper-rakkudele toksiline ​. ​Ilma T helper-rakkudeta ei toimu B- ja T- 


lümfotsüütide diferentseerumist antikehi tootvateks plasmarakkudeks ega T 
killer-rakkudeks. ​ Haigust on võimalik ravida, kasutades geeniteraapiat või luuüdi siirdamist  o X-liitelise agammaglobulineemia ​ puhul ​pole indiviidi organism võimeline sünteesima  antikehi ​. X-liiteline haigus, kus ​B rakkude diferentseerumist ei toimu​. Haigetel toimib  T rakkude poolt vahendatud immuunvastus normaalselt,  ​nad on kaitstud  viirusinfektsioonide vastu, kuid väga tundlikud bakteriaalsete ja seeninfektsioonide 
suhtes ​. ​Tänu​ ​luuüdi transplantatsioonidele​ ​(doonori luuüdi sisaldab normaalseid  tüvirakke, mis on võimelised diferentseeruma ja tootma antikehi) ​ ​on​ tänapäeval  võimalik seda haigust ravida  Omandatud immuunsüsteemi haigused:  Immunodefektsus võib kujuneda välja ka loote arengu käigus või sünnijärgselt toksiliste 
kemikaalide või patogeensete mikroorganismide toimel.  Nt:  ​DiGeorge sündroomi​ puhul ei ole organismi loote arengu käigus saadud kahjustuste  tulemusena arenenud normaalselt funktsioneerivat tüümust, mistõttu  ​haige organismis ei  moodustu T rakke ​. Haigust pole võimalik ravida, kuid haigel peab silma peal hoidma, et oleks  võimalik kiiresti ravida kaasuvaid defekte  ​(nt bakteriaalsed infektsioonid, südame  abnormaalsused jne) ​.        Omandatud immunodefektsuse sündroom ( ​acquired immunodefeciency syndrome ​) ​AIDS  on põhjustatud HIV ( ​human immunodeficiency virus ​) poolt​. ​HIV nakatab ja hävitab T  helperrakke – organismis väheneb T ja B lümfotsüütide diferentseerumine killer T rakkudeks 
ja plasmarakkudeks.  Immuunvastus nõrgeneb järk-järgult, kuni organism ei suuda enam 
toime tulla infektsioonidega ja seejärel haige sureb ​. Haigusele täielik ravi puudub, kuid on  olemas erinevaid ravimeid, mis leevendavad sümptomeid ja võimaldavad patsiendil elada 
täisväärtuslikku elu. Ravi kestab terve elu.  61. Biorütmide uurimine ja biorütme mõjutavad geenid  Biorütmid ehk bioloogilised rütmid on organismide füsioloogiliste, emotsionaalsete, 
intellektuaalsete ja sotsiaalsete omaduste ja võimete korrapärane perioodiline korduvus 
mingis ajaühikus.  Biorütmide geenid  o Tsirkaadirütmid (ööpäevarütmid) seentel ja bakteritel ​ – bakteritest on  tsirkaadirütme kirjeldatud  ​tsüanobakteritel lämmastiku fikseerimist ja fotosünteesi  määravate geenide avaldumisel ​.  Tsüanobakterite  ​bioloogilise kella toimimise mudel põhineb keskkonnainformatsiooni  ülekandel ööpäevaselt histidiini proteiinikinaasilt CikA signaali ülekandeahela väljundahela 
kaudu tsüanobakterite adaptiivsele sensorile SasR ​. Selles ​protsessis stimuleerivad teatud  valgud SasA-valgu autofosforüülimist. Viimane kannab fosforüülgrupi üle 


regulaatorvalgule SasR, millega see regulaator mõjub omakorda kogu genoomi 
avaldumisele. Õhtupimedas hakkab toimima valk KaiB, mis seondudes KaiC-ga, põhjustab 
SasA toime blokeerimise ja hiljem kompleksi dissotseerumise algkomponentideks ​.   Seentel avalduvad tsirkaadirütmid nt  ​filamentse seene ​Neurospora sp. a ​seksuaalsete  spooride rütmilise moodustumise käigus ​. Nimetatud nähtust kontrollib geen ​frq ​.  o Äädikakärbse perioodilisuse geenid – ​ ​Drosophila ​ X kromosoomis paikneb geen ​per  ( ​period ​)​, mis on funktsionaalselt ekvivalentne ​Neurospora​ geenile ​frq​. Äädikakärbse  käitumises täheldatakse 24-tunnist rütmi, mida nimetatakse  ​tsirkaadseks rütmiks​.  Tsirkaadne rütm kajastub näiteks kärbse valmikute nukust koorumisel.  ​Äädikakärbsed  on kõige aktiivsemad koiduajal ​. ​Kärbeste aktiivsust saab mõõdeta nende  liikumisaktiivsuse kaudu klaastorus. Klaastoru on pimedas, ning ühest kohast läbib 
teda kitsas punane valguskiir, mida kärbsed ei näe. Iga kord, kui kärbsed valguskiire 
läbivad, see registreeritakse ​. Geenil ​per  ​on kirjeldatud mitu alleeli: ​alleeli ​per​0​ ​puhul  on isendite käitumine arütmiline, alleeli  ​per ​S​ ​puhul lüheneb tsükkel 19 tunnile ning  alleeli  ​per ​L​ ​puhul pikeneb 29 tunnile. ​per​ lookus kontrollib nukkude koorumise aega.  Tavaliselt toimub see hommikul (päikesevalguse käes kuivavad valmiku tiivad 
kiiremini ning ta saab varem lendama hakata).  ​per ​0​ ​mutantide​ ​puhul toimub  valmikute nukust koorumine suvalisel ajal ning alleelide  ​per ​S​ ​ja ​per​L​ ​puhul muutub  tsükkel vastavalt eelpoolkirjeldatule ​. ​Geen ​per ​ kontrollib ka kärbeste  paaritumisrituaali ​. Isased kärbsed esitavad pulmatantsu, mille võib jagada mitmeks  etapiks. Liigiti on tants erinev. Põhimomendid on aga järgmised: isane läheneb 
emasele nurga all ning liigub emase tagakeha suunas; ta tõstab oma tiivad 90° üles ja 
vibreerib nendega, tekitades tiibadega heli, mis peaks emast stimuleerima; seejärel 
puudutab ta emase genitaale ja üritab emast viljastada. Alati ei pruugi ta eesmärki 
saavutada ning siis tuleb rituaali korrata. Tiibade vibratsiooni teel tekitatud “laul” on 
liigiti erinev, erinedes pulsside intervalli poolest (15 kuni 100 millisekundit). Tiibade 
vibreerumises on teatav rütm – ääikakärbsel toimub see 60-sekundiliste perioodide 
tagant ning vibratsioonikiirus on erinevatel etappidel erinev (algab ühtlase suminaga, 
siis järgneb kiirem vibreerimine, seejärel on pulsside vaheaeg pikem, siis aga jälle 
kiirem). Geen  ​per ​ kontrollib perioodide pikkust. Alleeli ​per​S​ ​puhul väheneb see 40  sekundini ning alleeli  ​per ​L​ ​puhul pikeneb 90 sekundini. Nende alleelide osalust  vibratsiooniperioodide pikkuse kontrollil on näidatud ka, kasutades molekulaarseid 
meetodeid. Geen  ​per ​ kodeerib transkriptsioonifaktorit nimetusega ​PER​. See valk  transporditakse rakutuuma ning nii  ​per ​ geeni mRNA kui ka PER valgu enda tase rakus  kõiguvad rütmiliselt. PER valku on leitud eeskätt aju rakkudes, kuid ka teistes 
rakkudes. Kuna PER valgul pole DNA-ga seondumise domääni, mõjutab ta 
transkriptsiooni kaudselt, interakteerudes teiste transkriptsioonifaktoritega. PER 
valgu puhul esineb autoregulatsioon. PER represseerib teda kodeeriva geeni 
transkriptsiooni. Selle tulemusena väheneb rakkudes vastava mRNA hulk ning 
seejärel ka valgu hulk. Kui PER valgu hulk väheneb, toimub geeni derepressioon ning 
mRNA süntees algab uuesti (tavaliselt toimub see koiduajal). PER valk toimib 


repressorina, komplekseerudes valguga  ​TIM​ (​timeless ​), mille tase on samuti kõrge öö  saabudes ja langeb hommikuks. Leiti, et valgus inaktiveerib valgu TIM ning see 
põhjustab ka TIM-PER kompleksi lagunemist. Kui kärbseid öösel perioodiliselt 
valgustada, läheb nende elurütm sassi.   o Biorütmid taimedel ​ – taimede vegetatiivsetel osadel on ainuvalitsevad arusaadavalt  tsirkadiaansed rütmigeenid, mis avalduvad päeval ja on välja lülitatud öösel. See rütm 
säilib ka siis, kui hoida taimi pikemalt pimedas.  ​Taimede biorütmi uurimise  mudelorganismiks on olnud müürlook ​. ​Transgeensetes taimedes, kuhu on viidud  näiteks helendumist määrav lutsiferaasigeen, on näidatud biorütmide toimumist 
koos taime lehtede orientatsiooniga maksimaalse valguse suunas ​. Üheks  võtmegeeniks on klorofülliga seonduvat valku kodeeriv geen ​. ​Taimsed  regulaatorained fütokroomid aktiveeritakse punase lainepikkusega valguse poolt. 
Aktiveeritud fütokroomid lülitavad sisse biorütmide toimimise eest vastutavad 
geenid, milleks on tavalislet transkriptsioonifaktorieid määravad geenid. 
Moodustunud transkriptsioonifaktorid seonduvad omakorda märklaudgeenide 
regulatoorsetesse piirkondadesse, muutes vastavate geenide avaldumist. 
Valgusega seotud taimevalkude füsioloogiliseks vastuseks on taime 
fotomorfogenees ​ (lehtede ja varte areng ning kolroplastide moodustumine)  o Bioloogilised rütmid loomadel ​ – hiirte puhul on uuritud tsirkaadset rütmi üsna  täpselt.  ​Kui hoida hiiri pimedas, jälgivad nad seda rütmi veidi üle 23 tunni pikkuste  intervallide kaupa. Mutatsiooni  ​clock ​ puhul pikeneb rütm homosügootidel 27-28  tunnini, heterosügootidel 25 tunnini. Pärast kahenädalalist pimedas hoidmist kaob 
homosügootsetel mutantidel rütm täiesti ​. Vastavat mutatsiooni sisaldav geen on  lokaliseeritud 5-ndasse kromosoomi    62. Tooge näiteid ühe geeni mutatsioonidest, mis mõjutavad äädikakärbse käitumist  Geeni  ​per (period) ​ mutatsiooni puhul muutub äädikakärbse tsirkaadne tsükkel  arütmiliseks ​: alleeli ​per ​S ​puhul lüheneb tsükkel 19 tunnile, alleeli ​per​L​ ​puhul pikeneb tsükkel  29 tunnile.  per ​ lookus kontrollib nukkude koorumisaega​ – tavaliselt kooruvad valmikud hommikul. ​Per​0  mutantide puhul toimub valmikute nukust koorumine suvalisel ajal. Alleelide  ​per ​S​ ​ja ​per​L  puhul tsükkel vastavalt kas lüheneb või pikeneb.  Tiibade vibratsiooni teel tekitatakse pulmalaul ​: alleeli ​per ​S​ ​puhul lüheneb periood 40  sekundini ning alleeli  ​per ​L​ ​puhul pikeneb 90 sekundini. Tavaliselt on see 60-sekundilise  perioodi tagant.  Mutatsioonid geenis  ​fru ​ põhjustavad homoseksuaalsust​. ​Fru​ geeni isaste splaissinguvariant  muudab emased kärbsed homoseksuaalseks.  63. Neuroloogilised haigused inimesel, mis on seotud ühe geeni mutatsiooniga 
o Alkoholism – mutatsioonid alkoholi dehüdrogenaasi geeni alleelis 


o Fenüülketonuuria – autosoomne retsessiivne tunnus, põhjustatud fenüülalaniini  hüdroksülaasi (PAH) defektsusest  o Huntingtoni tõbi – mutantset  ​HD ​ alleeli kandvatel haigetel hävivad järk-järgult  peamiselt aju keskosas asuvad neuronid, mis paiknevad ajutuumades. Need 
piirkonnad kontrollivad liikumise koordinatsiooni  o Jne    64. Käitumuslikud geenidoosimutandid: kõrvalekalded inimese kromosoomide arvus 
o Downi sündroom ​ – 21. kromosoomi trisoomia; madal IQ, ahvivagu, mongoliidsed  silmad, väike kasv  o Klinefelteri sündroom ​ – ​XXY mehed​; raskusi eneseväljenduses, keelte omandamises,  düsleksia, depressioon, ei suuda toimida stressisituatsioonis  o XYY mehed ​ – kontrollimatum demperament, agressiivsus, hüperaktiivsus  o XXX naised ​ – käitumuslikult üsna sarnased normaalsete XX naistega, nende  verbaalne IQ on keskmisest veidi madalam, suhtlemisraskused  o Turneri sündroom ​ – X0 naised; kuulmishäired, kehv ruumitaju, raskused täpseid  liigutusi nõudvate töödega, raskusi matemaatikaga     65. Kvantitatiivsete käitumistunnuste uurimine katseloomadel  Kvantitatiivsed tunnused  ​on need, mida saab kaaluda ja mõõta. Nad ​on määratud paljude  geenide üheaegse mõjuga või koostoimega. ​ Kui tunnust määravad paljud geenid, siis on ka  keskkonnategurite toime vastava tunnuse avaldumisele suurem ​. Enamik organismide  füüsilisi, aga ka käitumistunnuseid on komplekssed. Erit just komplekssete tunnuste puhul on 
võimalik, et suur osa organismi geneetiliste faktorite avaldumisest jääb kasutamata. 
Seepärast sõltub organismi geneetilise potentsiaali avaldumise ulatus mõnes osas indiviidide 
elukeskkonnast.  o Uuritakse hiire jooksmist rattal ​. Hiir jälgib ööpäevast rütmi veidi üle 23 h pikkuste  intervallide kaupa  o Süüria hamstril kirjeldati mutatsiooni geenis  ​tau ​: homosügootidel lühenes 24h-ne  tsükkel 20h-seks; muutus hormoonide sekretsiooni rütm; paljunemistsükkel ei 
sõltunud enam aastaajast  o fosB mutantsed hiired ei imeta oma järglasi 
o Rottide õppimisvõime uurimine labürintides, vesivannis platvormi leidmisel 
o Ristates erinevaid koeratõuge, on võimalik jälgida, millised käitumisjooned on  dominantsed, millised retsessiivsed  o Erinevatel koeratõugudel esinevad erinevad haigused  ​(narkolepsia, pimedaks  jäämine) ​ – võimaldab uurida haiguste geneetilist tausta ka inimesel    66. Intelligentsuse ja isiksuse omaduste geneetilise faktori osakaalu uurimine inimesel 


Intelligentsust mõjutavad nii indiviidi genotüüp kui ka keskkonnategurid ​. Intelligentsust  kirjeldab erinevate vaimsete võimete kogum:  1) Sõnade defineerimine ning mõistmine 
2) Verbaalse mõtlemise kiirus 
3) Matemaatiline mõtlemine 
4) Ruumiline mõtlemine 
5) Meeldejätmine ning informatsiooni taastamine 
6) Objektidevahelise sarnasuse ja erinevuse hindamine 
7) Seaduste, põhimõtete või kontseptsioonide formuleerimine probleemide  lahendamiseks ning erinevate olukordade hindamiseks  Keskmine IQ ​ (​intelligence quotient ​) – ​keskmine intelligentsuse kvoot on 100. IQ arvutatakse  sel viisil, et jagatakse indiviidi vaimne iga tema tegeliku vanusega ning korrutatakse 
100-ga. Kui näiteks 10-aastase lapse testi tulemused vastavad 12-aastase keskmistele testi 
tulemustele, on selle lapse IQ 120.    Lihtsam on identifitseerida ühe geeni mutatsioone, mis põhjustavad silmatorkavaid 
neuroloogilisi kahjustusi ning sellega kaasnevaid muutusi käitumises.  Paljud neuroloogilised haigused on komplekssed:  o Sümptomite väljakujunemises osalevad korraga mitmed erinevad geenid ning  erinevad keskkonnategurid  o Näiteks võib tuua skisofreenia ning maniakaalse depressiooni, millele on küll  geneetiline soodumus, kuid haigus avaldub teatavate keskkonna mõjutuste toimel, 
näiteks väga tugeva stressi korral    67. Evolutsiooniteooria kujunemine. Selgitage Darwini evolutsiooniteooriat  1859 ​ – Darwini “​The Origin of Species...“ ​  ​(“Liikide tekkimine”)  Idee eluslooduse evolutsioonist pakuti välja sadakond aastat enne Darwini teose 
avaldamist ​. Tekkis tugev vastasseis teoloogilise maailmapildi näol:  o Katstrofismi doktriin 
o Tüpoloogiline mõtlemine e. essentsialism  Viiskümmend aastat enne Darwinit avaldas  ​Lamarck teooria​ liikide tekkest: ​Liikide areng  uuteks liikideks toimus graduaalselt, organismide elu jooksul omandatud tunnuste 
kumuleerumise tagajärjel ​. ​Lamarck ei arvestanud looduslikku valikut, mis viib  vähemkohastunute hukkumisele ​.  Darwini evolutsiooniteooria: 


Aastatel 1831-1836 sooritas Darwin reisi Lõuna-Ameerikasse, kus ta kogus põhilised 
andmed, mis said aluseks evolutsiooniteooriale ​:  1) Darwin kirjeldas Lõuna-Ameerikas väljasurnud organismide luid, mis sarnanesid  kaasajal elanud organismide luustikega  2) Looduslikud tingimused Maal on olnud pidevas muutumises – Darwin leidis  Andidest kunagi meres elanud organismide jäänuseid  3) Darwin kirjeldas Galapagose saartel 13 vindi liiki, mis olid sarnased Lõuna-Ameerika  läänerannikul elavate vintidega  Vindid erinesid keha suuruselt ja noka kujult ning asustasid ökoloogiliselt erinevaid piirkondi. 
Darwin oletas, et vindid tulid Galapagose saartele mandrilt ning seejärel populatsioon 
mitmekesistus, asustades erinevate looduslike tingimustega piirkondi ​.  Evolutsiooniteooria väljaarendamiseks  ​sai Darwin inspiratsiooni​ ​Malthuse ideedest:  toiduressursid on limiteeritud, samas suureneks inimpopulatsioon geomeetriliselt, kui 
seda ei piiraks konkurents ​.  Darwin: ​ ​organismide paljunemine populatsioonisiseselt toimuks eksponentsiaalselt, kui  seda ei piiraks ressursside vähesus. Konkurentsi tingimustes jäävad ellu vaid vähesed.   Darwini loodusliku valiku teooria järgi tekib populatsiooni paljunemise käigus uusi 
variante ning edukamad variandid asendavad vähem edukamad variandid.  Darwini evolutsiooniteooria muutis oluliselt seni lääne ühiskonnas valitsenud mõttemaailma. 
See tõrjus kõrvale katastrofismi idee ning liikide loomise idee. Darwini teooria lükkas kõrvale 
antropotsentristliku mõttemalli nagu oleks inimliik universumi keskpunkt. Ka osutus Maa 
palju vanemaks kui piibliõpetuse järgi pakutud 4000 kuni 6000 aastat. Tüpoloogiline 
mõtlemine asendus populatsioonide tasemel mõtlemisega ning enam ei käsitletud 
organismide arengut eesmärgipärasena.   Darwini teooria ei käsitlenud mehhanisme, kuidas kujuneb geneetiline variantsus, mil viisil 
päranduvad tunnused järglastele ning kuidas populatsiooni geneetiline koostis aja jooksul 
muutub. Kuigi Darwini evolutsiooniõpetus käsitles pärilikkuseühikute – gemmulate – 
kandumist järglaskonda, sarnanes ettekujutus gemmulate muutlikkusest Lamarcki poolt 
esitatud organismi elu jooksul omandatud tunnuste ideele. Alles Darwini õpetuse 
kombineerimine Mendeli pärilikkuse teooriaga võimaldas luua kaasaegse pildi looduslikes 
populatsioonides toimuvast evolutsiooniprotsessist.  68. Selgitage Hardy-Weinbergi populatsiooni geneetilise tasakaalu seadust. Millisel  juhul see rakendub?  POPULATSIOONIGENEETIKA – uurib alleelide sagedusi populatsioonides  Hardy-Weinbergi populatsiooni geneetilise tasakaalu seadus: 


Hardy ja Weinberg leidsid seaduspärasuse, kuidas  ​alleelide sagedus populatsioonis  võimaldab ennustada genotüüpide sagedust juhuslikult ristuvas populatsioonis ​.  Kui oletada, et populatsioonis on kaks alleeli  ​A ​ ja ​a​ ning alleel ​A​ esineb sagedusega ​p​ ja  alleel  ​a ​ sagedusega ​q​, siis saab nende alusel arvutada genotüüpide sagedused.  Genotüüpide sageduse arvutamine:  AA ​ genotüübi tõenäosus populatsioonis on alleeli ​A​ sageduse korrutis  ​p​ x ​p​ = ​p​2​. Samal  põhimõttel arvutatakse ka genotüübi  ​aa ​ tõenäosus populatsioonis (​q​ x ​q​ = ​q​2​).  Heterosügootide  ​Aa ​ moodustumise tõenäosus on 2​pq​, sest on võimalik, et alleel ​A  munarakust kombineerub alleeliga  ​a ​ seemnerakust ja vastupidi.  Genotüüpide sagedust populatsioonis saab esitada valemi näol: ( ​p ​ + ​q​)​2​ = ​p​2​ + 2​pq​ + ​q​2​ = 1  H-W seaduspärasus kehtib suurte populatsioonide puhul, kus populatsioonisiseselt toimub 
vaba ristumine ​ – panmiktiline populatsioon. ​Panmiktilises populatsioonis ei toimi  evolutsioonitegurid ​ (mutatsioonid, valik, migratsioon) ​ning tasakaalulised alleeli- ja  genotüübisagedused säilivad muutumatuna põlvkonnast põlvkonda ​.  69. Populatsioonis esinevate alleeli- ja genotüübisageduste muutuste  põhjused  Alleeli- ja genotüübisageduste muutuste põhjused:  1) Ristumine pole juhuslik   o Omavahel ristuvad sugulased või fenotüübilt sarnased isendid – selle  tulemusena kasvab homosügootide arv populatsioonis  2) Erineva genotüübiga isendite edukus järglaste saamisel on erinev 
3) Toimub populatsioonisisene eraldumine  ​(näiteks geograafiline isolatsioon)  4) Migratsioon – osa populatsioonist liigub uude elukohta    70. Genotüüpidele rakenduv suhteline kohasus ja selektiivne surve populatsioonis.  Millisel juhul on selektiivne surve genotüübile maksimaalse väärtusega? Tooge 
näide  Organismi kohasuse puhul näitab  ​w ​ = 1, et antud isend on andnud ühe järglase; ​w​ = 2, kui on  kaks järglast ​ jne. Enamasti kasutatakse matemaatilist mõistet ​suhteline kohasus, kus  kohasuse maksimaalne väärtus  ​w ​ = 1,0.  w ​ = 1 – ​s​; ​w​– suhteline kohasus, ​s​ – selektiivne surve  Erinevatele genotüüpidele rakendub erinev selektiivne surve  ​s ​. Kohasuse ja selektiivse surve  väärtused on vastandlikud.  ​Mida tugevam selektiivne surve rakendub antud genotüübile,  seda väiksem on kohasuse väärtus. Äärmuslik olukord, kus genotüübi kohasuse väärtus  ​w  on null  ​(steriilsus) ​ ning selektiivne surve ​s​ väärtus üks: teatava genotüübiga indiviidid ei ela 


nii kaua, et jõuaksid paljunemisikka. ​ Nt: Tay-Sachs tõbi, Lesch-Nyhani sündroom, Duchenne  lihasdüstroofia.  71. Miks on mõne kahjuliku alleeli sagedus populatsioonis oodatust kõrgem? Selgitage  mehhanisme ja tooge näide  Mõne kahjuliku alleeli sagedus populatsioonis on oodatust kõrgem juhul, kui valik toimub 
retsessiivse alleeli vastu ​. Kui selektsioon toimub retsessiivse alleeli vastu, hakkab selle alleeli  sagedus populatsioonis langema.  ​Valik retsessiivse alleeli vastu toimub homosügootses  olekus. Kui retsessiivne alleel osutub võrreldes dominantsega kasulikumaks, hakkab selle 
sagedus populatsioonis suurenema. Võrreldes vastuselektsiooniga retsessiivsele alleelile 
toimib positiivne selektsioon retsessiivsele alleelile oluliselt kiiremini, kuna sel juhul 
kõrvaldatakse dominantne alleel.  Nt:  ​pöidlaküüdi efekt​ – kuna erinevate geenide ​erinevate alleelide puhul on neile rakenduv  selektiivne surve erinev, siis nende geenide aheldumise korral ei pruugi kahjulik alleel 
populatsioonist elimineeruda ​. ​Tsüstilist fibroosi ​(CF) ​ põhjustav alleel püsib valge rassi  populatsioonis heterosügootses kõrge sagedusega ​ ​(üks indiviid 25-st on CF-i suhtes  heterosügootne) ​. Eeldatavast kõrgemat sagedust aitab selgitada nn. “pöidlaküüdi efekt”  (“ ​hitchhiker effect ​”), kus ​jälgitav alleel on tugevalt aheldunud teise geeni alleeliga, mis  suurendab indiviidi kohasust populatsioonis ​. Pöidlaküüdi efekti põhjustab CF alleeli kandvate  indiviidide kõrgem vastupanu tüüfusele  ​(tüüfusetekitaja nakatab heterosügootide rakke  väiksema edukusega) ​.  72. Loodusliku valiku kolm viisi: stabiliseeriv, suunav ja lõhestav valik. Tooge näiteid  Stabiliseeriv ehk tasakaalustav valik:  Selektsiooni kaudu on eelistatud optimaalne fenotüüp, kõik äärmused elimineeritakse ​.  Homosügootidel on võrreldes heterosügootidega väiksem kohasuse väärtus, kuid samas 
säilivad  populatsioonis mõlemad alleelid tänu heterosügootide suuremale kohasusele.  Nt:  ​Punaste vererakkude sirprakset aneemiat põhjustava alleeli püsimine malaaria  levikuga piirkondi asustavas inimpopulatsioonis ​. ​Heterosügoodid, kes kannavad ühte  normaalset β globiini alleeli ja teist mutantset, ei haigestu malaariasse – eelisolukord 
võrreldes ainult normaalseid alleele kandvate homosügootsete indiviididega, kes on 
malaariaparasiidile vastuvõtlikud.        Näiteks, kui vastsündinud beebide kaal erineb oluliselt optimaalsest väärtusest, 
vähenevad nende võimalused ellu jääda.  Suunav valik:  Selektsiooni kaudu on eelistatud üks äärmuslik fenotüüp ning selle tulemusena muutub 
populatsiooni keskmine kindlas suunas ​. 


Leiab aset siis, kui keskkonnas toimuvad pidevad muutused.  Nt:  ​hobuse kehaehituse ja suuruse muutumine võrreldes tema eellastega​; suunav valik  rakendub populatsioonile ka  ​tõu- või sordiaretuse käigus​ ​(nt: kultuurtaimed) ​.  Lõhestav valik:  Eelistatud on äärmused ning lõpptulemusena jaotub populatsioon kaheks või enamaks 
alampopulatsiooniks, mis erinevad üksteisest teatava tunnuse suhtes oluliselt.  Ristumine toimub eelistatult liinisiseselt, mis erinevad üksteisest teatava tunnuse suhtes 
oluliselt  ja nii muutuvad kaks alampopulatsiooni teineteisest isoleerituks ​.  Nt: Ameerikas elav grisli ning Euroopas elav pruunkaru on isoleeritud ning arenenud nii, et 
nad vabalt ristuda enam ei saa.  Lõhestavat valikut tõestati ka katseliselt:  ​Drosophila ​ populatsioonist valiti välja isendid,  kellel oli keskmistega võrreldes kas oluliselt rohkem või vähem harjaseid ning lasti neil 
omavahel ristuda. Populatsioon lahknes kaheks alampopulatsiooniks, kus olid kas väheste 
harjastega isendid või paljude harjastega isendid. Katsetulemused näitasid, et ristumine 
toimus eelistatult liinisiseselt ja nii muutusid kaks alampopulatsiooni teineteisest 
isoleerituks ​.  73. Selgitage inbriidingu mõju populatsioonile. Tooge näiteid ja selgitage geneetiliselt  inbriidingu kahjulikku mõju  Populatsioonisisese vaba ristumise piirangud võivad viia inbriidingule, mille kõige 
äärmuslikum võimalus on iseviljastumine taimedel.  ​Inbriidingu tulemusena jääb alleelide  sagedus populatsioonis küll samaks, kuid muutub genotüüpide sagedus: tõuseb 
homosügootsuse aste ja väheneb heterosügootsuses aste. Inbriidingu tulemusena võivad 
homosügootsesse olekusse sattuda ka muidu harva esinevad geneetilisi haigusi 
põhjustavad retsessiivsed alleelid.  Nt:  ​Albinismi​ sagedus varieerub 1:10000 Põhja-Euroopas kuni 1:30000 Lõuna-Euroopas, kuid  USA-s Arizona osariigis elavatel Hopi indiaanlastel esineb albinism sagedusega 1:200. Hopi 
indiaanlaste populatsioon on suhteliselt isoleeritud ning seal on sageli sugulastevahelisi 
abielusid. Albiinod ei talu palju päikest, mistõttu pole neist põllu- ja muudel välitöödel suurt 
kasu.  74. Selgitage alleelisageduste juhuslikku muutust populatsioonis geenitriivi tagajärjel.  Tooge näiteid geenitriivist inimpopulatsioonide näitel  GEENITRIIV – populatsiooni paljunemise käigus võib alleelide sagedus muutuda juhuslike 
sündmuste tulemusena ​. Geenitriiv leiab aset ​väikeste populatsioonide puhul​.  Heterosügootide sagedus populatsioonis väheneb geenitriivi tulemusena seda kiiremini, 
mida väiksem on populatsioon. 


Geenitriiv  ​sõltub sellest, milliseid alleele sisaldavad gameedid järglaste saamisel osalevad.  Alleelide sagedust võib mõjutada ka see, et osadel vanematel on tunduvalt rohkem järglasi 
kui teistel, kuid see ei pruugi olla seotud nende parema kohastumusega. Teiste vanemate 
järglaskonda võivad vähendada näiteks õnnetusjuhtumid, ootamatu surm 
keskkonnakatastroofide tõttu, halvad ilmastikutingimused.  Olukorras, kus populatsioonist on ainult väga vähesed ellu jäänud ja järglasi andnud, 
räägitakse pudelikaela efektist.  ​Inimpopulatsioonide puhul on järgnevate põlvkondade  genofondi oluliselt muutnud näiteks suured epideemiad ja vallutussõjad ​.  Geenitriivi üks mehhanisme on rajaja ehk asutaja efekt: emapopulatsioonist irdunud üksikud 
isendid panevad aluse uuele  populatsioonile, mille geneetiline struktuur erineb oluliselt 
lähtepopulatsiooni omast.  Geenitriivi on kirjeldatud ka inimpopulatsioonide puhul: ​ ​18. sajandi algul rändas Saksamaalt  Ameerikasse rühm inimesi, kes kuulusid saksa baptistide usulahku, mille liikmeid nimetati 
dunkeriteks. Kuni tänaseni elavad dunkerid USA-s isoleerituna. Kuna dunkerite 
populatsioon on väike, on seal AB0 vererühmasid määravate alleelide sagedus võrreldes 
ülejäänud USA elanikkonnaga ning Saksamaa populatsiooniga, millest nad pärit olid, 
silmatorkavalt erinev ​. Nt: vererühm B või AB esineb neil sagedusega 5%, teistel on vastavate  vererühmade sagedus 15%; vererühma A esineb dunkeritel sagedusega 60%, teiste 40-45%.  75. DNA ja valkude polümorfism populatsioonis. Miks võimaldab DNA järjestuse  analüüs võrreldes valkude järjestuse analüüsiga tuvastada rohkem mutatsioone?  Valkude aminohappelise järjestuse ja DNA nukleotiidse järjestuse võrdlustest saadud 
andmete põhjal on selgunud, et organismide liigisisene alleelne varieeruvus on suur ​.  Geneetilise muutlikkuse säilimise eest populatsioonis vastutavad nii stabiliseeriv valik kui 
ka neutraalsete või peaaegu neutraalsete mutatsioonide korduv tekkimine.  Looduslikes populatsioonides esinev fenotüübiline muutlikkus ei kajasta alati 
populatsioonides esinevat geneetilist muutlikkust. Selleks, et määrata geneetilise 
muutlikkuse osa kogu muutlikkuses, analüüsitakse juhuslikult valitud geenide alleelset 
varieeruvust molekulaarsel tasemel. Mutatsioonid konkreetses geenis ning sellest tulenevad 
muudatused polüpeptiidi aminohappelises järjestuses on tuvastatavad mutantsete 
polüpeptiidide erineva liikuvuse kaudu geelelektroforeesil.  Polümorfismi uurimine DNA järjestuse tasemel:  Valkude analüüs geelelektroforeesil ei võimalda tuvastada kõiki mutatsioone:  1) Mõnede alleelide puhul võivad mutatsioonid olla toimunud väljapool polüpeptiidi  kodeerivat ala, nt: intronis, promootoralas või kodeerivatest järjestustest 
tahapoole jäävates alades 


2) Mutatsioon kodeerivas järjestuses võib muuta koodoni viimast nukleotiidi, kuid  mõlemal juhul kodeerivad koodonid sama aminohapet ​ ​(nt: UUA ja UUG kodeerivad  mõlemad leutsiini)  3) Toimub ühe aminohappe asendumine teisega, millel on eelmisega võrreldes sama  laeng ​ ​(nt: valiini asendumine alaniiniga)    76. Liigi fenotüübiline ja bioloogiline kontseptsioon. Millal ei saa liiki defineerida,  lähtudes liigi bioloogilisest kontseptsioonist?  Liigi fenotüübiline kontseptsioon:  Käsitleb liiki organismide fenotüübiliste omaduste kaudu. Selle kontseptsiooni põhjal on 
ühte liiki kuuluvate isendite fenotüübilised omadused sarnased ​. Fossiilide  süstematiseerimise puhul ainuvõimalik meetod.  Liigi bioloogiline kontseptsioon:  Defineerib liike kui erinevaid organismide gruppe, populatsioone, kus ristumine toimub 
ainult nende gruppide siseselt, gruppide vahel esinevad aga ristumisbarjäärid. Geenide 
ülekannet erinevatesse liikidesse kuuluvate populatsioonidesse üldjuhul ei toimu.  Liiki ei saa liigi bioloogilisest kontseptsioonist lähtuvalt defineerida, kui liikide vahel 
puudub ristumisbarjäär ​. Nt: ​Bakterite puhul toimub geneetilise info ülekanne nii  erinevatesse liikidesse kui ka erinevatesse perekondadesse ​. Geenide horisontaalne levik  erinevate bakteriliikide vahel toimub kas konjugatsiooni, transformatsiooni või 
transduktsiooni teel, ähmastades oluliselt liikidevahelisi piire.  77. Tooge näiteid liikidevahelistest ristumisbarjääridest?  Presügootiline isolatsioon ​ –  takistatud on erinevatesse liikidesse kuuluvate isendite  paaritumine  1) Ökoloogiline isolatsioon ​ – ​populatsioonid asustavad erinevaid elukeskkondi ega  puutu kokku ​. Nt: ​lõvi ja tiiger​ asustavad ökoloogiliselt erinevaid piirkondi  2) Ajaline isolatsioon ​ – ​loomade paaritumise või taimede õitsemise ajad on erinevad​.  Nt:  ​konnade paaritumisajad on liigiti erinevad; ahvenate kudemisajad on liigiti  erinevad ​ ​(ühtedel kevadel, teistel talvel?)  3) Käitumuslik isolatsioon ​ – ​erinevatesse liikidesse kuuluvate isendite vahel puudub  külgetõmme, pulmarituaalid on erinevad ​. Nt: ​erinevad pulmarituaalid Hawaiil  elavatel äädikakärbestel  4) Isolatsioon erinevate tolmuterade edasikandjate tõttu – esineb taimedel ​. Nt:  mõndasid taimi suudavad tolmeldada kimalased, kuid mitte tavalised mesilased  5) Isolatsioon sugurakkude sobimatuse tõttu 


Postsügootiline isolatsioon ​ – ​hübriidne järglaskond on vähese eluvõimega või steriilne  takistades sellega hübriidide paljunemist ​. Nt: leopardkonnade hübriidide embrüotel tekivad  väärarengud; hobuse ja sebra hübriidid on tihti steriilsed.  78. Liigitekke mehhanismid  (allopatriline ja sümpatriline liigiteke)  Allopatriline liigiteke:  Populatsioonisisene diferentseerumine leiab aset siis, kui muutuvad elukeskkonna 
füüsikalised või biootilised faktorid ​. ​Populatsiooni alaosades akumuleeruvad erinevad  mutatsioonid, tekivad rassid, mis on kohastunud erinevate keskkonnatingimustega ​. ​Kui  populatsioonidevahelised geneetilised erinevused suurenevad veelgi, tekib 
ristumisbarjäär. Isegi siis, kui populatsioone varem eraldanud geograafilised barjäärid 
edaspidi kaovad, jäävad need populatsioonid  ​(liigid) ​ paljunemise seisukohalt isoleerituks.  Sümpatriline liigiteke:  Populatsiooni ühes osas tekkinud unikaalsed mutatsioonid levivad teatavat ökoloogilist 
keskkonda asustavate isendite vahel ​. ​Geneetiliste erinevuste suurenemisel selles  ökoloogilises tsoonis väheneb ristumine teisi elupaiku asustavate isenditega, mis 
soodustab geneetilist divergeerumist, kuni moodustub uus liik, mis on paljunemise 
seisukohalt emapopulatsioonist täielikult isoleeritud ​.  79. Evolutsiooni uurimine molekulaarsel tasemel. Mis on molekulaarne kell?   Motoo Kimura neutralistliku teooria põhjal on muudatused polüpeptiidide 
aminohappelises järjestuses leidnud aset neutraalsete või peaaegu ​ ​neutraalsete  mutatsioonide juhusliku fikseerumise tulemusena erinevate liikide genoomi.  Erinevatesse liikidesse kuuluvate isendite polüpeptiidides toimunud muutuste analüüs 
võimaldab hinnata evolutsioonilisi sündmusi. Mida kaugemad liigid, seda enam on muutusi 
DNA-s ​ – ​molekulaarne kell​.  Molekulaarse evolutsiooni neutralistlik teooria ei arvesta seda, et mõned mutatsioonid 
võivad olla organismile kasulikud: neutralistliku teooria põhjal saab valik toimida ainult 
kahjulike variantide kõrvaldamise kaudu ​ – erinevalt sünteetilisest evolutsiooniteooriast on  kõrvale jäetud darvinistlik positiivne valik ​.  DNA järjestuse võrdluse põhjal on võimalik joonistada fülogeneesipuu. ​ Juureta puu –  näitab ainult erinevate liikide sugulusastet. Juurega puu – näitab lisaks sugulusele ka nende 
liikide pärinemist ühest eellasest ja lahknemisaega  ​(mitu aminohappe asendust on  toimunud) ​.  80. Inimese evolutsiooni uuringud DNA järjestuste analüüsi põhjal  Inimese lähievolutsiooni kohta on kogutud hulgaliselt andmeid tänu mitokondriaalse DNA 
analüüsile ​. Mitokondriaalse DNA analüüsi tulemusena pärineb ​meie kõigi esiema Aafrikast​. 


Ainult poegi sünnitanud naiste mitokondrid ei kandu järglastele ​: arvutused taandusid  lõpuks ühele liinile, mille alguses olevat naist hakati nimetama Aafrika Evaks.  Tänapäeval Aafrikat asustav inimpopulatsioon on mitokondriaalse DNA suhtes kõige 
heterogeensem – see populatsioon on kõige vanem.