Plaanid puhkusele minna? Võta endale majutus AirBnb kaudu ja saad 37€ kontoraha Tee konto Sulge
Facebook Like

Biokeemia praktikumi juhend (0)

5 VÄGA HEA
Punktid
 
Säutsu twitteris
Tallinna Tehnikaülikool Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool
BIOKEEMIA LABORATOORSED TÖÖD
Koostajad: Malle Kreen Terje Robal Tiina Randla
Tallinn 2010 SISUKORD 1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA ........................... 4 1.1 VALKUDE REAKTSIOONID ............................................................................... 4 1.1.1 Biureedireaktsioon ....................................................................................... 9 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon ) ........................................... 10 1.1.3 Milloni reaktsioon ....................................................................................... 10 1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon ................................................................... 11 1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega............................................... 11 1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine) .......... 12 1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st ............. 12 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega ........................................... 13 Kontrollküsimused ............................................................................................... 13 1.2 SÜSIVESIKUTE REAKTSIOONID ................................................................... 15 1.2.1 Molisch'i test............................................................................................... 17 1.2.2 Osasoonide saamine ................................................................................. 18 1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon ............................................................................... 19 1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega . .................................... 20 1.2.5 Barfoed' reaktsioon .................................................................................... 21 1.2.6 Selivanoff 'i reaktsioon ................................................................................ 22 1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga ........................................................................ 23 Kontrollküsimused ............................................................................................... 23 1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID.............................................................................. 25 1.3.1 Rasvapleki proov ....................................................................................... 27 1.3.2. Emulsioonitest ........................................................................................... 28 1.3.3 Akroleiiniproov ........................................................................................... 28 1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides ......................................... 29 1.3.5 Liebermann -Burchard'i kolesterooli määramise test .................................. 29 Kontrollküsimused ............................................................................................... 30 2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE ................................... 32 2. A Kromatograafilised meetodid........................................................................... 32 2.B Spektroskoopilised meetodid ........................................................................... 38 2 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL .......... 46 Teooria ................................................................................................................ 46 Töö käik .............................................................................................................. 51 Kontrollküsimused ............................................................................................... 57 2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE ..... 58 Teooria ................................................................................................................ 58 Töö käik .............................................................................................................. 61 Kontrollküsimused ............................................................................................... 63 3.BIOKATALÜÜS ........................................................................................................... 65 3A. Ensüümide toime ja ensüümireaktsioonide kineetika alused ........................... 65 3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE........................................................ 74 Teooria ................................................................................................................ 74 Töö käik .............................................................................................................. 76 Kontrollküsimused ............................................................................................... 79 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIVSUSE MÄÄRAMINE ........................... 80 Teooria ................................................................................................................ 80 Aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete neeldumisspektrid. ....................... 82 Töö käik .............................................................................................................. 82 Kontrollküsimused ............................................................................................... 84 3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL ........ 86 Teooria ................................................................................................................ 86 Töö käik .............................................................................................................. 88 Kontrollküsimused ............................................................................................... 92 Lisa 1 ............................................................................................................................. 93 Lisa 2 ............................................................................................................................. 95
3 1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA
Kvalitatiivsed reaktsioonid võimaldavad kindlaks teha mingi keemilise elemendi, funktsionaalse rühma, ühendi või ühendite rühma olemasolu või puudumist uuritavas materjalis . Saadav informatsioon on seejuures ühebitine - ei või jah, vastav reaktsioon kas toimub või ei toimu ning järelikult aine kas sisaldub või ei sisaldu uuritavas proovis. Hinnatakse
- iseloomuliku värvusreaktsiooni teket, - sademe või hägu moodustumist, - gaasi eraldumist, - muid silmaga nähtavaid muudatusi.
Nagu nimetus ütleb, ei näita need reaktsioonid uuritava komponendi kvantitatiivset sisaldust uuritavas materjalis, küll aga võivad paljud neist kombineerituna teiste uurimismeetoditega (näiteks värvusreaktsioon koos kolorimeetrilise mõõtmisega) olla aluseks kvantitatiivsete analüüside läbiviimisel. Kvalitatiivse analüüsi meetodid ei nõua reeglina reagentide täpset doseerimist (kaalumist, pipeteerimist), vaid piirduda võib silmamõõduga ning suurusjärgu arvestamisega.
Käesolevas töös kasutatakse reaktsioonianumana normaalkatseklaase, kus 1-milliliitrisele mahule vastab umbes 1 cm kõrgune vedeliku nivoo.
Järgnevalt kirjeldatakse biokeemias oluliste ainegruppide ­ valkude, süsivesikute ja lipiidide kvalitatiivse analüüsi mõningaid meetodeid .
1.1 VALKUDE REAKTSIOONID
Valgud on polüpeptiidid, milles "ehituskivideks" olevad aminohapped on omavahel seotud amiidsidemete abil, mida biokeemias tuntakse peptiidsidemete nime all. Peptiidside moodustub ühe aminohappe karboksüülrühma reageerimisel teise aminohappe aminorühmaga. Kuna peptiidsideme moodustumisel eraldub vesi, võib seda nimetada ka kondensatsioonireaktsiooniks. Peptiidside on osalise kordsuse tõttu planaarne ning enamasti trans-konformatsioonis.
4 Peptiidsideme moodustumine
Valkude koostises leidub 20 üldlevinud aminohapet, mida nimetatakse proteogeenseteks aminohapeteks. Lisaks neile sisaldavad mõningad valgud ka nn ebaharilikke aminohappeid , peamiselt üldlevinud aminohapete hüdroksü-, metüül-, fosforüül- jt derivaate. Tuntud on ka rida aminohappeid ja nende derivaate, mida ei leidu valkudes, kuid mis täidavad olulisi füsioloogilisi funktsioone (-aminobutüraat, - alaniin , ornitiin jt).
5 Proteogeensete aminohapete struktuurid ja jaotus polaarsuse järgi Polaarsete mitteionogeensete radikaalidega: Gly, Ser, Asn, Gln, Thr, Cys, Tyr Ionogeensete radikaalidega aluselised ( sinisel taustal): Arg, Lys, His
6 Apolaarsete radikaalidega: Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro
Ionogeensete radikaalidega happelised : Asp, Glu
7 Valgud, nagu teisedki biopolümeerid, täidavad oma funktsioone tänu iseloomulikele ruumilistele struktuuridele, mis tulenevad primaarsest struktuurist, st aminohapete valikust ja järjestusest polüpeptiidahelas. Ahela lokaalset korrapärastumist iseloomustab sekundaarne struktuur, kogu valgumolekuli kolmemõõtmelise struktuuri iseloomustamiseks kasutatakse tertsiaarse struktuuri mõistet. Kui valgumolekul koosneb enam kui ühest polüpeptiidahelast, st koosneb osamolekulidest e subühikutest, siis nimetatakse valku oligomeerseks ja osamolekulide omavahelist assotsieerumist iseloomustab kvaternaarne struktuur. Näiteks, hemoglobiini molekul koosneb neljast polüpeptiidahelast (osamolekulist) ja omab kvaternaarset struktuuri. Valgumolekulide ruumilised struktuurid on fikseeritud nõrkade keemiliste sidemete ja vastasmõjudega.
Valgu unikaalse ruumilise struktuuri lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks. Selle käigus grupeeruvad ümber või katkevad ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed, kuid säiluvad aminohappeid ühendavad peptiidsidemed. Valgu denatureerumine võib vähendada tema lahustuvust, mis omakorda põhjustab valgu väljasadenemise lahusest. Valgu peptiidsidemete lagunemist nimetatakse valgu hüdrolüüsiks.
Valkude detekteerimiseks (=kindlakstegemiseks) lahustes või bioloogilistes vedelikes kasutatakse mitmeid kvalitatiivse analüüsi meetodeid nagu: ¾ värvusreaktsioonid peptiidsidemete või teatavate aminohapete tuvastamiseks, ¾ väljasadestamine lahusest reagentide või temperatuuri toimel denaturatsiooni - protsessi uurimiseks või valkude eraldamiseks madalama molekulmassiga peptiididest, ¾ väljasoolastamine lahusest erinevate valgufraktsioonide lahutamiseks. Mõningad neist reaktsioonidest on kasutatavad ka valkude kvantitatiivseks määramiseks.
Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi: ¾ universaalsed e üldreaktsioonid (biureedireaktsioon), mis on omased kõikidele valkudele , ¾ spetsiifilised e erireaktsioonid (tiooli-, ksantoproteiini -, Milloni reaktsioon jt), mis on iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele. Kuna valdav osa valke sisaldab kõiki 20 aminohapet, siis on ka erireaktsioonid kasutatavad enamiku valkude tuvastamiseks, kuid vähesed nn mittetäisväärtuslikud valgud, nagu kollageen, elastiin jt ei anna mõningaid erireaktsioone.
8 1.1.1 Biureedireaktsioon
Ühendid, mis sisaldavad kaht või enamat peptiidsidet, moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi. Test on oma nimetuse saanud uurea derivaadi biureedi järgi, mis annab Cu2+-ioonidega tüüpilise positiivse reaktsiooni.
Kuna biureedireaktsioon on tingitud peptiidsidemete esinemisest, siis on ta valkude üldreaktsioon. Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu2+- ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega (valgu hüdrolüüsi produktidega) aga roosa värvusega biureetkompleksi. Kompleksi värvus on tingitud Cu2+-ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses.
Töö käik Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust. Lisatakse 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Katseklaasi sisu loksutatakse hoolikalt. Reaktsiooni kiirendamiseks võib katseklaasi vesivannil soojendada. Jälgitakse reaktsioonisegu värvuse muutumist ja selgitatakse nähtust. 9 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon)
Ksantoproteiinreaktsioon (xanthos ­ kollane, kr k) tõestab aromaatset tuuma sisalda-vate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Kontsentreeritud lämmastikhappe lisamisel denatureerib valk pöördumatult ja sadestub. Katseklaasi sisu soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend on intensiivselt kollase värvusega ja käitub hape /alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranzi värvuse.
Töö käik Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust ja lisatakse 5­6 tilka kontsentreeritud HNO3 . Reaktsioonisegu loksutatakse ja soojendatakse kuni tekkinud valge sade värvub kollaseks. Seejärel segu jahutatakse, lisatakse NH4OH lahust kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni ja loksutatakse hoolikalt. Kirjeldatakse toimuvaid muutusi.
1.1.3 Milloni reaktsioon
Reaktsiooni läbiviimiseks kasutatakse Milloni reaktiivi (nimetatud avastaja järgi), mis kujutab endast elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. Kuna türosiin esineb enamiku valkude koostises, siis suurem osa valkudest annab positiivse Milloni reaktsiooni, mille puhul valgu lahus või denatureerunud valgu sade värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)- punaseks. NB! MILLONI REAKTIIV ON TUGEVALT TOKSILISE JA KORRODEERIVA TOIMEGA!
10 Töö käik Võetakse kaks katseklaasi, ühte neist valatakse 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisatakse 5­6 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegu soojendatakse 40­50°C-ni ja jälgitakse toimuvaid muudatusi. Tehakse järeldused munavalgu ja zelatiini aminohappelise koostise erinevuste kohta.
Sic! Tuleb hoiduda Milloni reaktiivi ülemäärasest lisamisest valgule, mis võib anda ksantoproteiinreaktsioonile iseloomuliku kollase värvuse ja maskeerida Milloni reaktsiooni!
1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Positiivne sulfhüdrüülreaktsioon näitab tsüsteiini (Cys) esinemist valgus. Tsüsteiini radikaalis sisalduv sulfhüdrüül- e tioolrühm (-SH) allub hõlpsasti leeliselisele hüdrolüüsile, andes sulfiidioone, millised Pb2+-ioonide juuresolekul moodustavad musta või tumepruuni ülipeene pliisulfiidi (PbS) sademe. Katse teostatakse pliietanaadi Pb( CH3COO )2 e plii- atsetaadi lahusega, milline moodustab aluselises keskkonnas naatriumplumbaadi(II). Viimane annab valgust vabanenud sulfiidioonidega PbS, mis aeglaselt välja sadeneb.
Töö käik 2 ml Pb(CH3COO)2 0,5 %-lisele lahusele lisatakse ettevaatlikult tilgakaupa 10 %-list NaOH lahust kuni tekkiv Pb(OH)2 sade kaob ja lahuses moodustub naatriumplumbaat Na2PbO2. Seejärel lisatakse katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, loksutatakse ja reaktsioonisegu soojendatakse mõne minuti vältel, kuni algab pruunikasmusta kolloidse sademe moodus - tumine. Seejärel asetatakse katseklaas statiivi, kus sademe formeerumine jätkub.
1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhape (TKÄ) ehk trikloroetaanhape on laialdaselt levinud valke denatureeriv ja lahusest väljasadestav reagent, kuid TKÄ ei sadesta peptiide, mille molekulmass on alla 10 000. Seetõttu saab trikloroäädikhapet kasutada valkude eraldamiseks madal- molekulaarsetest lämmastikuühenditest, nagu valgu hüdrolüüsi produktid .
11 Töö käik Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust ja lisatakse mõni tilk CCl3COOH lahust. Loksutatakse hoolikalt ja jälgitakse, kas ja milline sade tekib.
1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsete soolade [(NH4) 2SO4 , MgSO4, NaCl jt.] kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni, millega kaasneb väljasadestumine lahusest. Seda nähtust tuntakse väljasoolastamise nime all. Sadestumise protsessi mõjutavad valgu hüdrofiilsus / hüdrofoobsus, laeng, molekulmass ja muud omadused. Nii sadestuvad globuliinid (NH4)2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinide sadestumiseks aga on vaja soola küllastunud lahust. Töö käik 2 ml munavalgu lahusele lisatakse võrdne maht (NH4)2SO4 küllastunud lahust, loksutatakse ja jäetakse 5 minutiks seisma. Tekkinud globuliinide sade eraldatakse filtrimise teel, milleks kasutatakse ~5 cm diameetriga filterpaberit ja sobiva suurusega klaas- või plastiklehtrit. Katse jätkamiseks piisab umbes ½ lahuse filtrimisest. Saadud filtraadile lisatakse kristalset (NH4)2SO4 kuni küllastuskontsentratsiooni saavutamiseni. Selleks lisatakse väikeste portsjonitena soola ja loksutatakse katseklaasi hoolikalt. Toimingut korratakse seni, kuni soola kristallid enam ei lahustu. Jälgitakse albumiinide sademe moodustumist. Tekkinud sademehulkade põhjal võrreldakse globuliinide ja albumiinide sisaldust munavalgus.
1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril pöördumatult, kuna ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed katkevad. Denatureerumise temperatuur sõltub valgu loomusest ja keskkonna koostisest. Tavaliselt kaasneb denatureerumisega valgu väljasadestumine lahusest. Kui aga keskkonna pH väärtus erineb tunduvalt valgu isoelektrilise täpi (pI) väärtusest, siis ei pruugi denatureerunud valk lahusest välja ei sadestuda.
Valgu pI näitab keskkonna pH väärtust, mille juures valgumolekulis on positiivsete ja negatiivsete laengute hulk võrdne, seega molekuli summaarne laeng võrdub 0-ga. Sellest tingituna valgumolekulid agregeeruvad hõlpsasti ning sadestuvad lahusest välja. Seevastu pI-st oluliselt erineva pH väärtusega keskkonnas omandavad kõik valgumolekulid ühesuguse laengu (,,+" või ,,-"), valk-valk interaktsioonid lakkavad, agregatsiooni ja väljasadestumist ei toimu.
12 Töö käik Kahte katseklaasi valatakse kummassegi 2 ml munavalgu lahust. Ühte katseklaasi lisatakse 1 ml kontsentreeritud etaan- e äädikhapet. Mõlemaid katseklaase kuumutatakse keeval vesivannil. Jälgitakse sademe tekkimist katseklaasides ja põhjendatakse täheldatud erinevust.
1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega
Etanool , atsetoon jt. veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete (= füdrofoobsete) radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada , denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Orgaanilise solvendi lisamine ettevaatamatult kiiresti või suures koguses tekitab solvendi kõrge lokaalse kontsentratsiooni, võib toimuda valgu pöördumatu denaturatsioon ja sade ei lahustu enam täielikult.
Töö käik Katseklaasi valatakse 2 ml munavalgu lahust. Tilgakaupa ja segu pidevalt loksutades lisatakse orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni, millest annab tunnistust lahuse hägustumine. Seejärel lahjendatakse katseklaasi sisu veega ja jälgitakse, kas tekkinud sade lahustub või mitte. Tehakse järeldus, millist tüüpi denaturatsioon ­ pöörduv või pöördumatu ­ toimus ja viimasel juhul selgitatakse, milles oli põhjus.
Kontrollküsimused
1. Nimetage, millised toodud valkude reaktsioonidest on üld-, millised erireaktsioonid ja põhjendage sellist jaotust. 2. Kirjutage aminohappe molekuli üldistatud struktuurivalem . Kuidas aminohappeid klassifitseeritakse radikaali keemilise ehituse järgi? 3. Kuidas tekib peptiidside? Kirjutage reaktsioonivõrrand, kasutades vabalt valitud aminohappeid. 4. Kirjutage 2 polüpeptiidahela fragmenti ja näidake, kuidas tekib biureetkompleks valguga. 5. Milliste aminohapete esinemist valgus näitab positiivne a) tioolireaktsioon b) ksanto- proteiinireaktsioon c) Milloni reaktsioon? 6. Kirjeldage ksantoproteiini- ja Milloni reaktsiooni kemismi. 7. Mis on valgu isoelektriline punkt (pI)? 8. Millistel juhtudel ei kaasne valgu denatureerumisega tema lahusest väljasadenemist?
13 9. Mida tähendavad mõisted a) valkude denaturatsioon, b) valkude hüdrolüüs, c) valkude väljasoolastamine? 10. Loetlege valke denatureerivad tegurid ja selgitage, mis valgumolekulis nende toimel aset leiab. 11. Millised vaadeldud teguritest põhjustasid valkude pöördumatut, millised pöörduvat denaturatsiooni? 12. Millele põhineb globuliinide ja albumiinide lahusest väljasadestamine (väljasoolas- tamine) neutraalsete sooladega?
14 1.2 SÜSIVESIKUTE REAKTSIOONID
Süsivesikud on arvukas bioloogiliste ühendite rühm, mis koosnevad ainult süsinikust, vesinikust ja hapnikust. Vastavalt struktuurile jaotatakse neid mono - , oligo - ja polüsahhariidideks. Lisaks sellele, et monosahhariidid ehk monoosid (= lihtsuhkrud ) täidavad organismides olulist energeetilist rolli ja kuuluvad koensüümide ning nukleiinhapete koostisse, on nad ka oligo- ja polüsahhariidide ,,ehituskivideks". Kuigi paljude monosahhariidide molekuli üldvalem on ühesugune, Cx(H2O)y, erinevad nad stereostruktuurilt (funktsionaalsete rühmade ruumilise paigutuse poolest) ja seetõttu võivad nende omadused oluliselt erineda. Molekuli keemiliselt ehituselt on nad kas lineaarsed polühüdroksüaldehüüdid või polühüdroksüketoonid või molekulisisese tsüklisatsiooni tulemusel tekkivad tsüklilised poolatsetaalid või poolketaalid. Tänu aldehüüd- või ketorühma esinemisele omavad kõik monoosid redutseerimisvõimet.
Oligosahhariidide molekulid koosnevad mõnest (2­10) monosahhariidi molekuli jäägist ( sahharoos , laktoos , maltoos , maltotrioos, tsellobioos jt), polüsahhariidides ehk polüoosides on aga sajad või tuhanded lihtsuhkru molekulid ühinenud pikkadeks sirgeteks või hargnenud struktuuriga ahelateks (tärklis, glükogeen, tselluloos jt). Oligosahhariidide oluliseks klassifitseerimise tunnuseks on vaba hemi- e poolatsetaalse või hemi- e poolketaalse hüdroksüülrühma esinemine või puudumine molekulis, mille järgi neid jaotatakse redutseerivateks (= taandavateks) ja mitteredutseerivateks (= mittetaanda-
15 vateks). Polüsahhariidide molekulides on vaba poolatsetaalse hüdroksüülrühma osatähtsus marginaalne, sest see esineb vaid iga polüsahhariidi ahela ühes otsas.
Oligo- ja polüsahhaariidides on monomeerid omavahel seotud O-glükosiidsidemega (vt joonist). Levinumad oligosahhariidid , nagu sahharoos, laktoos, maltoos jt omavad ener- geetilist rolli. Oligosahhariidi lisamisel valgule post-translatoorse modifitseerimise käigus tekivad glükoproteiinid. Samuti kuuluvad oligosahhariidid glükolipiidide koosseisu, osaledes rakk - rakk äratundmises, nt ABO veregrupid eristuvad erütrotsüütide memb- raanis olevate oligosahhariide sisaldavate glükolipiidide järgi.
Polüsahhariidid, nagu tärklis ja glükogeen (glükoosi polümeerid), on energeetiliseks varu- aineks, taimedes on polüsahhariidid ka rakukesta ehitusmaterjaliks (tselluloos, pektiin ).
Enamus süsivesikute kvalitatiivseks (aga ka kvantitatiivseks) määramiseks kasutatavaid reaktsioone baseerub karbonüülrühma esinemisele molekulis (hõbepeegli reaktsioon, reaktsioon Fehlingi lahustega jt). Reaktsioonitingimustest sõltuvalt oksüdeeruvad suhkrud seejuures erinevateks produktideks . Leeliselises keskkonnas redutseerivad suhkrud metallide ioone (Ag+, Cu2+, Fe3+) ning teisi oksüdeerijaid, kusjuures suhkrumolekuli süsinikuahel reaktsiooni käigus reeglina laguneb ning tekib mitmete oksüdatsiooniproduktide segu. Neutraalses või happelises keskkonnas toimub suhkrute oksüdatsioon ilma molekuli destruktsioonita ja produktideks on mitmesugused happed (aldoonhapped, uroonhapped).
Teine osa analüüsi meetoditest põhineb heterotsükliliste aldehüüdide furfuraali (pentoosidest) või 5-hüdroksümetüülfurfuraali (heksoosidest) moodustumisele süsivesikute kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul. Mõlemad aldehüüdid moodustavad kondenseerumisel fenoolidega (-naftool, resortsinool jt) värvilisi ühendeid (Molisch'i test, Selivanoff'i reaktsioon).
16 1.2.1 Molisch'i test
Molisch'i testi võib lugeda süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitestiks, kuna positiivse reaktsiooni annavad nii mono-, oligo- kui polüsahhariidid. Isegi nukleiinhapped ja glükoproteiinid annavad positiivse Molischi reaktsiooni, kuna tugevas happelises keskkonnas toimub pikapeale monosahhariidide vabanemine . Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad, moodustades kas furfuraale või 5-hürdoksümetüülfurfuraale. Tekkinud produktid reageerivad edasi -naftooliga(C10H7OH), moodustades purpurse kihi uuritava lahuse ja happe piirpinnale. Töö käik Võetakse kaks katseklaasi ja neisse valatakse 2 ml erinevate süsivesikute lahust (glükoos, fruktoos , sahharoos, maltoos, laktoos, tärklis vm). Mõlemasse katseklaasi lisatakse 5­6 tilka Molisch'i reaktiivi, mis kujutab endast -naftooli lahust alkoholis. Katseklaaside sisu loksutatakse hoolikalt. Seejuures võib -naftool osaliselt lahusest välja sadestuda, kuna tema lahustuvus vees on väga madal, kuid katse käiku see ei mõjuta. Hoides katseklaasi kaldasendis lisatakse ettevaatlikult tilkhaaval 1 ml kontsentreeritud väävelhapet. Hape peab voolama mööda katseklaasi külge selle põhja uuritava lahuse alla.
NB! Happe ja proovi segunemist tuleb hoolikalt vältida, st katseklaasi ei tohi loksutada!
Süsivesikute esinemise korral uuritavas lahuses tekib happe ja lahuse piirpinnale purpurne või violetne reaktsiooniprodukt, mille värvus sõltub teatud määral ka süsivesiku liigist. Võrdluseks võib katse läbi viia ka munavalgu lahusega. Kirjeldatakse katse tulemust erinevate süsivesikute ja valgu lahuse puhul.
17 1.2.2 Osasoonide saamine
Osasoonid on süsivesikute derivaadid, mis tekivad redutseeriva ehk taandava suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Kõrvuti monoosidega moodustavad osasoone ka taandavad oligosahhariidid. Osasoonid kristalluvad lahustest hõlpsasti välja, kusjuures tekkivate kristallide kuju ja sulamistemperatuur on lähtesuhkrule iseloomulikud. Osasooni kristallide kuju järgi on võimalik eristada ka neid suhkruid, mille stereostruktuurid erinevad vaid ühe kiraalse tsentri konfiguratsiooni poolest. Ajalooliselt on osasoone suhkrute identifitseerimiseks kasutatud väga laialdaselt, kuid tänapäeval on sel otstarbel enamlevinud kromatograafilised meetodid. Osasoonide moodustumise reaktsioon on kaheetapiline ­ esmalt toimub reaktsioon C-1 paikneva aldehüüdrühma kaudu ja formeerub hüdrasoon C-1 positsioonis. Teine etapp hõlmab C-2 asendis oleva hüdroksüülrühma oksüdeerumist karbonüüliks ja selle kaudu ka C-2 asendis hüdrasooni formeerumist. Reaktsioon vajab fenüülhüdrasiini liiga ja pikemaajalist kuumutamist.
18 Töö käik Kahte katseklaasi valatakse 2 ml erineva taandava suhkru (glükoos, arabinoos, galaktoos , maltoos, laktoos jne) lahust. Mõlemasse lisatakse ~0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja ~0,2 g kristallilist naatriumatsetaati (NB! Juhinduda näidiskaalutistest!) ning loksutatakse kuni tahked ained on lahustunud. Reaktsioonisegu hoitakse 40 minutit keevas veevannis, aeg- ajalt loksutades ja jahutatakse seejärel jäävannis. Kui osasoonid on hakanud juba moodustuma, pole vaja segu enam loksutada. Katse korrektsel läbiviimisel moodustuvad katseklaasides vastavate suhkrute osasoonid, mis lahusest välja kristalluvad. Moodustunud osasoonide kristallide kuju tehakse kindlaks mikroskoobis. Selleks kantakse preparaadiklaasile üks tilk osasooni suspensiooni, liigne vedelik eemaldatakse filterpaberi tükikese abil ja kristallid kaetakse ettevaatlikult (mitte tugevalt surudes!) katteklaasiga. Valmistatud osasooni preparaate vaadeldakse suurendusega 15 x 8 või 15 x 20 ja joonistatakse üles kristallide kuju. Kirjeldatakse uuritud suhkrute osasoonide erinevusi kristallide kuju, suuruse ja orientatsiooni aspektist . Saadud tulemust võrreldakse kirjanduses toodud erinevate suhkrute osasoonide kristallide kujuga.
1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon
Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm (tsüklilise vormi puhul pool- atsetaalne hüdroksüülrühm) taandab mitmete metallide sooli . Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest (uurija nime järgi Tolleni regent) sadestub metalliline hõbe aldehüüdide, seega ka taandavate suhkrute toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli. Tolleni reaktiivis on aktiivseks komponendiks AgNO3 ja NH3 baasil tekkiv diammiinhõbe(I) [Ag(NH3)2]+. NB! Ajalooliselt nimetatakse koordinatsioonikomplekside koostises olevat NH3 ammiiniks!
NB! Jälgi oksüdatsiooniastmete (märgitud punasega ) muutumist reaktsiooni käigus!
19 Töö käik Hoolikalt pestud katseklaasi valatakse 1ml 1%-list AgNO3 lahust, lisatakse 0,5 ml kontsent- reeritud NH4OH lahust ja loksutatakse. Seejärel lisatakse 1 ml glükoosi lahust, segu loksutatakse hoolikalt ja soojendatakse ettevaatlikult veevannis. Positiivse reaktsiooni puhul sadestub taandunud hõbe katseklaasi seintele peeglina. NB! Määrdunud katseklaasi kasutamisel , ettevaatamatul soojendamisel või reaktiivide kogustega liialdamisel tekib tumehall või must sade ja peeglit ei teki. Sellisel juhul tuleb katset korrata.
1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega.
Taandavate suhkrute määramisel on üheks levinumaks reaktiiviks leeliseline vask(II)- tartraatkompleks ehk Fehlingi reaktiiv, mis saadakse Fehlingi I lahuse (CuSO4 vesilahus ) ja Fehlingi II lahuse (leeliseline K,Na-tartraadi e Seignett'i soola vesilahus) kokkusegamisel.
Tekkiv vask(II)-tartraatkompleks reageerib aldooside või ketoosidega alltoodud reaktsiooni kohaselt. Vaba aldehüüd- või ketorühma (poolatsetaalse või -ketaalse hüdroksüülrühma) toimel vask taandub, andes vask(I)oksiidi, mis punase sademena lahusest välja sadestub. Suhkur ise aga oksüdeerub reaktsiooni käigus vastavaks happeks .
Kuna positiivse reaktsiooni annavad ainult taandavad suhkrud, siis sahharoos Fehlingi reaktiiviga ei reageeri, küll aga reageerivad tema hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos. Sahharoosi hüdrolüüsi saab kiirendada kas ensümaatiliselt või happe toimel kõrgel temperatuuril. Sahharoosi hüdrolüüsi protsessi nimetatakse inversiooniks ja tekkivat glükoosi ja fruktoosi ekvimolaarset (moolide suhe 1:1) segu tuntakse invertsuhkru nime all.
20 Need on ajalooliselt väljakujunenud terminid (invert ­ ümber pöörama), viidates suhkrute kui optiliselt aktiivsete ainete eripöörangu märgi muutumisele hüdrolüüsi käigus: sahharoos (,,+") glükoosi ja fruktoosi segu suhtes 1:1 (,,-").
Töö käik Kahte katseklaasi valatakse 1ml sahharoosi lahust, ühte neist lisatakse 1 tilk kontsentreeritud HCl. Loksutatakse ja sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks hoitakse mõlemat lahust 5 minutit veevannis 80...85°C juures. Seejärel lisatakse mõlemasse katseklaasi 1 ml Fehlingi I ja 1 ml Fehlingi II lahust ja loksutatakse hoolikalt. Katseklaasides olev lahus omandab intensiivse sinise värvuse. Katseklaase soojendatakse uuesti veevannil kuni ühes katseklaasis (kummas?) tekib tugev punane sade. Kirjeldatakse ja põhjendatakse, mis toimus katse erinevatel etappidel.
1.2.5 Barfoed' reaktsioon
Suhkrute reaktsioon Barfoed' reaktiiviga [vask(II)atsetaadi Cu(CH3COO)2 lahus äädik- happes ] võimaldab eristada taandavaid monosahhariide oligosahhariididest, kuna nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske üksnes monosahhariidid. Reaktsioon Barfoed' reaktiiviga, nii nagu Fehlingi reaktiivigagi, annab punase vask(I)oksiidi Cu2O sademe.
21 Töö käik Võetakse kaks katseklaasi ning ühte valatakse 1 ml monosahhariidi lahust (glükoos, fruktoos vm) ja teise taandava oligosahhariidi (laktoos, maltoos) lahust. Mõlemale lisatakse 3 ml Barfoed' reaktiivi, segatakse hoolikalt ning hoitakse kuumal veevannil maksimaalselt 5 minutit. Jälgitakse Cu2O sademe moodustumist. Monosahhariidide korral peab sade moodustuma 2­3 minuti jooksul. NB! Kui proove kuumutada liiga kaua, tekib sade ka oligosahhariidi sisaldavas katseklaasis, kuna oligosahhariidis toimub glükosiidsideme hüdrolüüs ja vabanevad monosahhariidid taandavad vaske.
1.2.6 Selivanoff'i reaktsioon
Suhkrute kuumutamisel tugevate mineraalhapete juuresolekul moodustub pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfuraal, heksoosidest 5-hüdroksümetüülfurfuraal.
Tekkivad ühendid reageerivad (polükondenseeruvad) mitmealuseliste fenoolidega, andes värvilisi produkte, mida sageli kasutatakse ka suhkrute kvantitatiivseks määramiseks.
Üks selleks otstarbeks kasutatavaid reaktiive on tuntud Selivanoff'i reaktiivina. See sisaldab soolhapet, kondenseeriva agendina resortsinooli e benseen -1,3-diooli [C6H4(OH)2] ja katalü-saatorina FeCl3. Reaktsiooni tulemusena tekkiva ühendi värvus varieerub punakaspruunist tumepruunini. Reaktsioon toimub ketoosidega kiiremini kui aldoosidega.
22 Töö käik Võetakse 2 katseklaasi, ühte valatakse 1 ml fruktoosi lahust, teise sama hulk glükoosi lahust. Lisatakse 2 ml Selivanoff'i reaktiivi, loksutatakse ja soojendatakse 4...5 minutit keeval veevannil. Jälgitakse värvilise ühendi tekkimise kiirust ja värvuse intensiivsust glükoosi ja fruktoosi puhul. NB! Kui katseklaase kuumutada kauem, siis värvuste erinevus väheneb või kaob hoopis.
1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga
Tärklistele iseloomulik omadus moodustada joodiga intensiivselt lillakas -siniseid komplekse on tingitud polüsahhariidi ahelate keerdumisest joodi molekulide ümber. Tekkinud kompleks laguneb kõrgemal temperatuuril ja kaotab värvuse (pöörduv reaktsioon). Joodiga värvuvad ka taimsest materjalist (kartulist, teraviljadest) eraldatud natiivsed tärkliseterakesed ning värvununa on nende suurus ja kuju mikroskoobis hõlpsamini vaadeldavad, võimaldades kindlaks teha, millisest taimest tärklis pärineb.
Töö käik A. Katseklaasi valatakse 4­5 ml tärkliselahust ja lisatakse 1 tilk joodilahust. Segu loksutatakse ja kuumutatakse keemiseni. Seejärel katseklaasi alumine pool jahutatakse jäävee vannil või veejoa all. Kirjeldatakse ja põhjendatakse lahuse värvusega toimuvaid muutusi. NB! Vältida tuleb liigset joodi lisamist tärkliselahusele, kuna sel juhul ei pruugi värvus kaduda!
B. Mikroskoobi alusklaasile kantakse erinevate tärkliste või tärkliserikka materjali (jahu) proovid . Lisatakse 1 tilk lahjendatud (helekollast) joodilahust, mille liig kõrvaldatakse filterpaberi tükikesega. Preparaadid kaetakse katteklaasidega nii, et õhumullid klaasi alla ei jääks ja vaadeldakse mikroskoobis suurendusega 15 x 8. Joonistatakse üles erinevate tärkliseliikide terade kuju ja võrreldakse omavahel nende suurust.
Kontrollküsimused
1. Kuidas jaotatakse monosahhariide süsinikuaatomite arvu, molekuli keemilise ehituse ja molekuli kuju järgi? 2. Millise keemilise omaduse järgi klassifitseeritakse oligosahhariide? Nimetage nende rühmade esindajaid. 3. Millistele keemilistele omadustele (funktsionaalsetele rühmadele) baseerub enamus süsivesikute kvalitatiivseid reaktsioone? 23 4. Millised reaktsioonid olid seotud furfuraali ja 5-hüdroksümetüülfurfuraali tekkimisega? Kirjutage nende ühendite struktuurid ja kirjeldage, millest ning mille toimel nad moodus- tuvad. 5.Milline läbiviidud reaktsioonidest võimaldab kindlaks teha mistahes süsivesiku esinemist lahuses? 6.
80% sisust ei kuvatud. Kogu dokumendi sisu näed kui laed faili alla
Vasakule Paremale
Biokeemia praktikumi juhend #1 Biokeemia praktikumi juhend #2 Biokeemia praktikumi juhend #3 Biokeemia praktikumi juhend #4 Biokeemia praktikumi juhend #5 Biokeemia praktikumi juhend #6 Biokeemia praktikumi juhend #7 Biokeemia praktikumi juhend #8 Biokeemia praktikumi juhend #9 Biokeemia praktikumi juhend #10 Biokeemia praktikumi juhend #11 Biokeemia praktikumi juhend #12 Biokeemia praktikumi juhend #13 Biokeemia praktikumi juhend #14 Biokeemia praktikumi juhend #15 Biokeemia praktikumi juhend #16 Biokeemia praktikumi juhend #17 Biokeemia praktikumi juhend #18 Biokeemia praktikumi juhend #19 Biokeemia praktikumi juhend #20 Biokeemia praktikumi juhend #21 Biokeemia praktikumi juhend #22 Biokeemia praktikumi juhend #23 Biokeemia praktikumi juhend #24 Biokeemia praktikumi juhend #25 Biokeemia praktikumi juhend #26 Biokeemia praktikumi juhend #27 Biokeemia praktikumi juhend #28 Biokeemia praktikumi juhend #29 Biokeemia praktikumi juhend #30 Biokeemia praktikumi juhend #31 Biokeemia praktikumi juhend #32 Biokeemia praktikumi juhend #33 Biokeemia praktikumi juhend #34 Biokeemia praktikumi juhend #35 Biokeemia praktikumi juhend #36 Biokeemia praktikumi juhend #37 Biokeemia praktikumi juhend #38 Biokeemia praktikumi juhend #39 Biokeemia praktikumi juhend #40 Biokeemia praktikumi juhend #41 Biokeemia praktikumi juhend #42 Biokeemia praktikumi juhend #43 Biokeemia praktikumi juhend #44 Biokeemia praktikumi juhend #45 Biokeemia praktikumi juhend #46 Biokeemia praktikumi juhend #47 Biokeemia praktikumi juhend #48 Biokeemia praktikumi juhend #49 Biokeemia praktikumi juhend #50 Biokeemia praktikumi juhend #51 Biokeemia praktikumi juhend #52 Biokeemia praktikumi juhend #53 Biokeemia praktikumi juhend #54 Biokeemia praktikumi juhend #55 Biokeemia praktikumi juhend #56 Biokeemia praktikumi juhend #57 Biokeemia praktikumi juhend #58 Biokeemia praktikumi juhend #59 Biokeemia praktikumi juhend #60 Biokeemia praktikumi juhend #61 Biokeemia praktikumi juhend #62 Biokeemia praktikumi juhend #63 Biokeemia praktikumi juhend #64 Biokeemia praktikumi juhend #65 Biokeemia praktikumi juhend #66 Biokeemia praktikumi juhend #67 Biokeemia praktikumi juhend #68 Biokeemia praktikumi juhend #69 Biokeemia praktikumi juhend #70 Biokeemia praktikumi juhend #71 Biokeemia praktikumi juhend #72 Biokeemia praktikumi juhend #73 Biokeemia praktikumi juhend #74 Biokeemia praktikumi juhend #75 Biokeemia praktikumi juhend #76 Biokeemia praktikumi juhend #77 Biokeemia praktikumi juhend #78 Biokeemia praktikumi juhend #79 Biokeemia praktikumi juhend #80 Biokeemia praktikumi juhend #81 Biokeemia praktikumi juhend #82 Biokeemia praktikumi juhend #83 Biokeemia praktikumi juhend #84 Biokeemia praktikumi juhend #85 Biokeemia praktikumi juhend #86 Biokeemia praktikumi juhend #87 Biokeemia praktikumi juhend #88 Biokeemia praktikumi juhend #89 Biokeemia praktikumi juhend #90 Biokeemia praktikumi juhend #91 Biokeemia praktikumi juhend #92 Biokeemia praktikumi juhend #93 Biokeemia praktikumi juhend #94 Biokeemia praktikumi juhend #95 Biokeemia praktikumi juhend #96 Biokeemia praktikumi juhend #97
Punktid 50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.
Leheküljed ~ 97 lehte Lehekülgede arv dokumendis
Aeg2011-02-24 Kuupäev, millal dokument üles laeti
Allalaadimisi 44 laadimist Kokku alla laetud
Kommentaarid 0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid
Autor I_Jocker_I Õppematerjali autor

Lisainfo

Koostajad: Malle Kreen
Terje Robal
Tiina Randla

biokeemia praktikumi juhend , biokeemia

Mõisted

4 sulfhüdrüüli, 5 liebermann, saadav informatsioon, valgud, kvalitatiivseid reaktsioone, kompleksi värvus, soojendatakse 40, kirjeldage ksantoproteiini, süsivesikud, tänu aldehüüd, polüoosides, polüsahhariidide molekulides, oligo, osaledes rakk, osasoonid, kaheetapiline, tahked ained, tolleni reaktiivis, vaba aldehüüd, lipiidid, lipiidid, lihtlipiidid, rasvad, steroolide, üksteisest c, rasvaplekk, paberi läbipaistvus, emulsioonid, toimuva liitumis, kollakas, 5 liebermann, reaktsiooni sinakas, metüleenkloriidis, liebermann, kromatograafia, castats, aine kd, adsorptsioonkromatograafia, tüüpilisteks voolutiteks, kationiidid, analüsaatorid, geelkromatograafia meetoditest, afiinsuskromatograafia, immuunoafiinsuskromatograafia puhul, metallkelaat, statsionaarseks faasiks, kapillaarkolonn, adsorptsioon, eluaat, kromatografeerimine, kromatograafiline kolonn, kromatogramm, liikumatu faas, retentsiooniaeg, tuumamagnetresonants, ultraviolett, miinimumolekust, võrdub normaal, nõuab s, võrrandite kombineerimisel, karakteristikuks, erinevates osades, kahekiirelistel riistadel, kahekiirelised seadmed, spektrofotomeetria, aine kontsent, graanulitesse, väljavoolamist, kolonn, kolonn, antud praktikumis, segudes, dekstraansinine, dekstraansinine, variant b, koostatakse 3, eksperimentaalne vxmax, karotenoidid, karoteenid, klorofüllile edastamisele, vitamiin a, 183, 103, ensüümid, viimaseid, biokatalüüs, ensüümireaktsiooni üldskeem, kineetika, kiiruskonstant k, vmax, michaelis, michaelis, michaelis, substraadi suhtes, michaeli, michaelis, michaelis, mitmetel põhjustel, si süsteemis, 1 katal, oligo, sahharoos, katseklaas varusta, 1 ml, proteolüütilised ensüümid, eksopeptidaaside esindajateks, millist subst, kaseiin, mõõdetav absorptsioon, tkä, tänu gox, gox, reaktsiooniproduktideks, gox, pox, pox, uuritavaks lahuseks, veel 15, graafiku x, graafiku x, niiskusesisaldus, kirjeldage gox, spektrofotomeetri uv, ekraanil, photometric, neelduvust, indikaator, ekraanil, spektrofotomeetri uvmini, initialize, spektrofoto

Meedia

Kommentaarid (0)

Kommentaarid sellele materjalile puuduvad. Ole esimene ja kommenteeri


Sarnased materjalid

30
doc
Biokeemia praktikumi K T vastused
12
docx
Biokeemia protokoll
16
docx
Biokeemia kordamine
13
docx
Biokeemia praktikumi arvestustöö
48
pdf
Biokeemia I test
29
doc
Biokeemia kordamine
18
docx
Biokeemia eksami variandid
15
docx
Valkude ja süsivesikute reaktsioonid



Faili allalaadimiseks, pead sisse logima
Kasutajanimi / Email
Parool

Unustasid parooli?

UUTELE LIITUJATELE KONTO MOBIILIGA AKTIVEERIMISEL +50 PUNKTI !
Pole kasutajat?

Tee tasuta konto

Sellel veebilehel kasutatakse küpsiseid. Kasutamist jätkates nõustute küpsiste ja veebilehe üldtingimustega Nõustun