Praktikumi kontrolltööks kordav ja kokkuvõttev materjal (3)

VALGUD :
Reaktsioonid:
Biureedreaktsioon: annavad kõik ained , mis sisaldavad väh 2 peptiidsidet
Mulderi(ksantoproteiinreaktsioon): tõestab aromaatset tuuma sisaldavate amhapeteolemasolu valgus
Milloni : annavad aromaatset tuuma sisaldavad amhapped
Sulfhüdrüül( tioolreaktsioon): -Sh rühmad valökudes ja aminohapetes alluvad kergesti leeliselisele hjüdrolüüsile , andes sulfiidioone. Katse viiakse läbi naatriumplumbaadi lahusega.
Valkude sadestamine TKÄ happega : TKÄ on laialdaselt levinud valke sadestav ja denatureeriv produkt , kuid ta ei sadesta valgu hüdrolüüsi produkte, mille mol masss on alla 10 000. TKÄ- d kasutatakse valkude eraldamiseks madalmolekulaarsetest lämmastikühenditest
Valkude sadestamine sooladega: neutraalsete soolade korged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denatureerimist ja sadenemist. Globuliinid sadestuvad poolküllastunud, albumiinid küllastunud soola lahuses.
Valgu termiline denatureerimine : kõik valgud denatureerivad kõrgel temp, valgi pI tunduvalt erineva pH puhul võib denatureerunud valk ka lahusesse jääda.
Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega : etanool , atsetoon jt veega segunevad solvendid põhjustavad valkude dehüdratiseerumist ja sadestavad nerid lahusest välja, sadesti konts vähenemisel lahustub tekkinud sade uuesti

• Valgud= polüpeptiidid, milles ehituskivideks olevad amonihapped on omavahel seotud amiidsidemete abil
  
• Valkudes sisalduvaid (proteogeenseid) aminohappeid on 20, nad erinevad üksteisest radikaalide struktuuri poolest
  
• Valkude üldreaktsioonid: biureedireaktsioon; Valkude spets.reaktsioonid: Mulderi( ksantoproteiinreakts) Milloni , tioolreakts(sulfhüdrüülreakts)
  
• Proteogeensete aminohapete põhistruktuur on : H2N-CH-COOH
  
• Asendamatu aminohape on selline aminohape , mida loom peab saama toiduga
  
• Valg pI(isoelektriline punkt) on selline pH väärtus, mille juures molekulil on minimaalne netolaeng . Valgumolekuli seisund, mille juures molekuli summaarne laeng on 0
  
• Peptiidside: O=C=N-H. Peptiidside tekib amiidsideme abil, ühest aminohappest võtab osa karboksüülrühm, teisest aminohappest aminorühm.
  
• Lihtvalkude põhistruktuurid: globulaarsed ja fibrillaarsed
  
• Aluselised ah-ed : histidiin , lüsiin; arginiin ; happelised : aspartaat , glütamaat; aromaatsed: fenüülalaniin; glütsiin, türosiin; hüdrofiilsed: Cys, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, glu, Lys, Arg, His; hüdrofoobsed: gly, Ala; Val, Leu, Ile; hüdroksüül: ser, Thr; tiool : cys, Met
  

SÜSIVESIKUD:
Molischi test: kvalitatiivse analüüsi põhitest. Süsivesikute olemasolul tekib nende segus α-naftooliga , konts väävelhappe lisamisel , happe ja uuritava lahuse piirpinnale purpurne vahekiht .
Osasoonide saamine: Osasoonideks nim redutseeriva e taandava suhkru ja kahe kolekuli fenüülhüdrasiini liitumise produkti . Osasoone annavad kõrvuti monoosidega ka taandavad oligosahhariidid . Osasoonid kristalluvad lahustes kergesti , kristallide kuju ja sulamistemp on lähtesuhkrule iseloomulikud ja võimaldavad seda idenfitseerida. Tänapäeval kas suhkrute eristamiseks kromotograafilisi meetodeid .
Hõbepeegli reaktsioon : taandavate suhkrite molekulides sisalduv aldehüüdrühm redutseerib ( taandab) mitmete metallide sooli. Hõbeda ammoniakaalsest lahusest sadestub metall klaasi pinnale peeglina.
Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahusega: taandavate suhkrute määramisel on üheks tavalisemaks reaktiiviks fehlingi reaktiiv , mis saadakse CuSO4vesilahuse ja leeliselise kaalium .naatriumtartraadi kokkusegamisel ( Fehlingi i ja F II lahuse kokkusegamisel. Tekkiv vask(II)-tartraatkompleks reageerib aldooside või ketoosidega. Vaba poolatsetaalse hüdroksüülrühma toimel vask taandub, andes vask(I)oksiidi, suhkur ie aga oksüdeerub reaktsiooni käigus vastavaks happeks . Kuna reaktsiooni annavad ainult taanadavad suhkrud , siis seega sahharoos fehlingi reaktiiviga ei reageeri, küll ga reageerivad tema hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos . Sahharoosi hüdrolüüsi saab kiirendada kas ensümaatiliselt või happe toimel. Hüdrolüüsi protsessi nim inversiooniks , glükoosi ja fruktoosi ekvimolaarset segu nim invertsuhkruks
Barfoed reakts : see reakts võimaldab eristada tandavaid mono - ja disahhariide, kuna happelises kk taandavad vaske üksnes monosahhariidid. Monosahhariidide reakts Cu( CH3COO )2 ga tekib tumepunane vaskoksiidi sade.
Selivanoff´i reakts: suhkrute kuumutamisel, eriti hapete juuresolekul, mood pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfurool, heksoosidest hüdroksümetüülfurfurool. Tekkivad ühendid reageerivad mitmealuseliste fenoolidega, andes värvilisi produkte, mida sageli kas ka suhkrute kvantitatiivsel määramisel
Suhkrute kvantitatiivseks määramiseks kas Selivanoffi reaktiivi, see sisaldab HCl, resortsinooli ja FeCl3 katalüsaatorina.
Tärklise reaktsioon joodiga : Tärklistele iseloomulik omadus mood joodiga intensiivselt lillakssiniseid komplekse on tingitud polüsahhariidiahelate keerdumisest joodi molekulide ümber. Kõrgemal temperatuuril kompleksid lagunevad ja kaotavad värvuse. Joodiga värvuvad ka natiivsed tärkliseterakesed ning on hõlpsamini mikroskoobis vaadeldavad.
Monosahhariidid: 6 Cheksoosid, 5- C pentoosid; kiraalse aatomi konfiguratsiooni järgi: fruktoos v glükoos; molekuli keemilise ehituse järgi: polühüdroksüaldehuüüdid või ketoonid , lineaarsed või tsüklilised
Enantiomeerid: teineteise peegelpildid
Diastereoisomeerid: erinevus mitmes kiraaltsentris
Anomeer: Anomeerideks nimetatakse suhkrute vorme, kus suhkru 1'-süsiniku juures paiknevate –H- ja –OH-rühmade paigutus on erinev. Beeta-anomeeril on –OH-rühm pealpool tsükli tasandit ja alfa-anomeeril allpool.
LIPIIDID :
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, kuhu kuuluvad ained on oma keemiliselt ehituselt enamasti estrid. Reeglina lipiidid vees ei lahustu, kuid lahustuvad orgaanilistes solventides, teistes lipiidides ning leelismetallide soolade lahustes. Lipiidide vees lahustumatus on põhjustatud hüdrofoobsete aatomirühmade ja radikaalide sisaldusest. Lipiidid kuuluivad rakumembraanide koostisse, on loomsetes organismid4es energeetiliseks varuaineks ning täidavad mitmesuguseid kaitse- ja regulatoorseid funktsioone. Seebistuvad lipiidid: rasvad, fosfoglütseriidid, stingolipiidid, vahad, mitteseebistuvad: steroidid , prostaglandiinid, isporenoidid
Akroleiinproov: glütserooli kuumutamisel, tekib terava lõhnaga küllastumata aldehüüd propenaal ( akroleiin). Sama reaktsiooni annavad rasvad ja glütserofosfaadid, kuid ei anna gllütserooli mittesisaldavad lipiidid. Seega võimaldab akroleiini moodustumine otsustada, kas tegemist on glütserooli sisaldava või mittesisaldava lipiidiga.
Küllastumata rasvhappete tuvastamine lipiidides: Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus lahjeneb, küllastumata rasvhapete puhul aga muutub lahus toimuva liitumisreaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks. Real juhtudel võib lahus värvituks muutuda ka küllastunud süsinikuahelate esinemise korral – toimub asendusreaktsioon , mida küllastumata sidemetaga toimuvast liitumisreaktsioonist võimaldab eristada eralduva vesinikkloriidi lendumine .
Liebermann- Burchard´i kolesterooli määramise test: Heppelises keskkkonnas moodustub kolesterooli reaktsioonil happe anhüdriidiga iseloomu7lik rohelise värvusega reaktsiooniprodukt. Olenevalt kolesterooli sisaldusest proovis võib roheline värv tekkida ka üle punase ja sinise vaheühendi.
Ainete idenfitseerimine õhukese kihi kromotograafia teel
ÕK kromotograafia on üks kiiremaid jaotuskromotograafia liike, mis võimaldab Idenfitseerida segus olevaid komponente väga väikese proovi mahu juures. ÕK kromotograafias viiakse protsess läbi plaatidel, mis on saadud sorbendikihi kandmisel klaas- alumiinium ,- või mõnest muust lahustit mitteimavast materjalist lehele. Mida väiksem on sorbendiosakese läbimõõtsed lihtsam on aine tuvastamine. Voolutitena kas puhtaid lahusteid või nende segusid. Polaarsete ainete lahutamiseks sobivad polaarsed , apolaarsete ainete lahutramiseks sobivad apolaarsed voolutid. Normaalfaaskromotograafia – polaarne adsorbent ja apolaarne vooluti . Pöördfaaskromotograafia- apolaarne adsorbent ja polaarne vooluti
Kui lahutatavad kombonendid ei ole värvilised võib kasutda UV- kiirgust v mõünda muud ilmutusreagenti. Rf= ühendi kaugus stardijoonest/ lahustifrondikaugus stardijoonest.Meie töös uuriti aminohapete lahutamist tõusva vooluga vertikaalse ÕK kromotograafia abil. Meetod põhineb aminohapete erineval lahustruvusel kahes, teineteisega osaliselt segunevas vedelikus , millest üks on vesi, teine veega küllastatud orgaaniline lahusti. Mida hüdrofoobsem on aminohape, seda paremini lahustub ta apolaarses lahustis ja seda suurem a kiirusega ta lähtepunktist eemaldub.
Geelkromotograafia
Baseerub lahuses sisalduvate erineva molekulmassiga eainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise , võimalikult ühesuiguse poorsusega geeli. Geelid, mida kas , koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Geelkromotograafia kolonni iseloom järgmised mahud: täidise maht, kolonni vaba maht, graanulitesisese vedeliku maht, geelimaterjali maht. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromotograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse, st vastavalt molekuli suurusele.Ainet iseloomustan elueerimismaht . See on eluaadi maht , mis on kogutud kuni aine maks kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siois väljuvad nad kollonnist esimestena, st neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Ained, mille molekulmass son küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljubad maks elueerimismahuga , mis on lähedane kolonni kogumahule. Mistahes GK kolonni iseloom kaks olulist suurust: vaba maht Vv( Vx min) ja maks elueerimismaht ( Vx max). Erineva molekulmassiga ainete üksteisest eraldamise eesmärgil kogutakse kolonnist väljuvat lahust kindla mahuga fraktsioonidena. Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist aõltuvust nim kromotogrammiks.
Karatenoidide idenfitseerimine ja sisalduse määramine
Taimede fotosünteesivate kudede rakud sisaldavad fotosünteesi põhipigmente- krolofülle, mis annavad neile rohelise värvuse ja abipigmente- karatenoide ja fikobiliine, mis on kas kollased , punased või purpursed. Kuna viimased absorbeerivad valgust klorofüllist mõnevõrra erinevatel lainepikkustel, siis on nad täiendavateks kiirguse retseptoriteks. Karatenoidid on loomsetes organismides a vitamiini eelühendiks.Karoteeni sisaldust uuritavas materjalis saab objeltiivselt iseloomustada neeldumisspektri järgi. Antud töö eesmärgiks on taimsetest materjalidest eraldatud karatenoidide segu v karotenoidide ja klorofülli segu neeldumisspektri määramine spektofotomeetril ja selle aluse4l uuritava materjali karotenoidse koostise iseloomustamine ; β- karoteeni sisalduse määramine uuritavas proovis; klorofülli olemasolu kondlakstegemine.
Karatenoidid- terpeenide ainete grupp
Invertaasi aktiivsuse määramine
Invertaas e sahharaas on ensuum, mis katalüüsib β, D- fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni vastavalt skeemile: β, D- fruktofuranosiid + vesi alkohol + fruktoos Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos, mis koosneb α, D- glükoosist ja β, D-fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid , hallitusseened aga ka paljud taimed. Inimeste seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimiselreaktioonisegus.Tekkinud reaktsiooniproduktide koguse kindlakstegemiseks kas nn kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus , mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline komplekslahus oinvertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu (II) Cu(I) –ks , mood CU2O , mis eraldub reaktioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B.Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades inikaatorina mureksiidi vesilahust. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta (µkat/ml)
Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Proteaasid on arvukas rühm ensüüme , mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides. Reaktsiooniproduktideks on erineva molekulmassiga peptiidid ja vabad aminohapped . Valkudes hüdrolüüs kannab proteolüüsi nimetust . Proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 µkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 µmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 s vältel 30 C juures.Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemeye hulk ei ole otseselt mõõdetav , siis on üldlevinud proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse avaldamine valgu hüdrolüüsi produktide( aminohapped, peptiidid) hulga kaudu. Antud töös kas substraadina kaseiini . Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestatakse lahusest TKÄ , mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab hüdrolüüsireaktsiooni. Siinkasutatav aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja sellele järgneval hüdrolüüsiproduktide sisalduse spektrofotomeetrilisel määramisel.Aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete neeldumismaks lainepikkus λ=280 nm piirkonnas. Vagu hüdrolüüsi produktide sisaldus avaldatakse türosiini mikromoolidena ( 1µmol= 0,181 mg) aktiivsus väljendatskse 1 g ensüümi v 1 ml ensümilahuse kohta.
Mee analüüs
Mesi koosneb glükoosist ja fruktoosist, liskaks vähesel määral ka maltoosist ja sahharoosist. Sammuti sisaldab mesi mitmeid mikroelemente , vähesel määral vitamiine, aga ka ensüüme.Niiskusesisalduse määramine võib toimuda kahel viisil : kuivainesisalduse kaudu ja refraktomeetrilisel meetodil, antud töös määratakse meeproovi kuivainesisaldus . Taanduvate suhkrute ja sahharoosi sisalduse määramisel lähtutakse ühest ja samast mee lahusest. Teatud osas sellest siiakse läbi sahharoosi inversiooni happe toimel. Mee lähtetõmmise ja inverteeritud proovi taandavate suhkrute sisalduste vahest arvutatakse sahharoosi sisaldus.