3.2 Proteaas (0)

Tallinna Tehnikaülikool
YKL0060 Biokeemia
Töö nr 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Yasb  21
Juhendaja Tiina Randla
20.04.2012
Teooria
Proteaasid  on ensüümid, mis katalüüsivad pepti dsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes 
ja pepti dides, produtseerides madalama molekulmassiga pepti de ja vabu  aminohappeid . 
Proteaase leidub kõikides organismides, sest nende ülesanded ulatuvad alates toiduvalkude 
seedimisest kuni väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadideni nt vere 
hüübimise  kaskaad .
Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Pi ratud 
proteolüüsi esindajad lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega 
külgnevaid pepti dsidemeid, pi ramatu proteolüüsi esindajad  toimivad  kõikidele 
pepti dsidemetele. Pi ratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt trüpsiin, 
kümotrüpsiin ja pepsiin 
Kõik ülalnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside rühma, st  proteaas  toimib 
kesksetele pepti dsidemetele. Eksopeptidaaside esindajateks on karboksüpeptidaasid  ja 
aminopeptidaasid, mis lühendavad pepti de, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid 
aminohappeid. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse 
hapusid (pH =2,5), neutraalseid (pH = 7,2) ja leelisproteaase (pH = 9,0). Oluliseks 
proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on akti vtsentri aminohappeline järjestus ja sel est 
tulenev ensüümi toimemehhanism. Neli peamist rühma on seri n-, tiool-,  aspartaat - ja 
metal oproteinaasid. 
Ensüümi proteolüütilise akti vsuse ühikuks 1 μkat loetakse sel ist ensüümi hulka, mis 
põhjustab 1 μmooli pepti dsidemete hüdrolüüsi või 1 μmooli aminohapete vabanemise 1 s 
vältel 30°C juures. Proteaaside akti vsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate 
produktide, st aminohapete ja pepti dide hulga kaudu.
Neutraalsete ja aluseliste proteaaside akti vsuse määramisel kasutatakse substraadina 
reeglina kasei ni. Kasei n on pi ma põhivalk, mis koostiselt on fosfoprotei n (pi mas 
mitsel idena). Pi mast eraldatud kasei n vees praktiliselt ei lahustu, kül  aga lahustub vees 
hästi kasei ni Na-sool.  Proteaasi  akti vsuse määramise meetod põhineb kasei ni hüdrolüüsil 
uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate 
hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed pepti did, mil e Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ 
toimel, mis samas ka inaktiveerib 
ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. 
Sademe eraldamise järel jäävad 
lahusesse vabad  aminohapped  ja 
madalmolekulaarsed pepti did, mil e 
kontsentratsiooni iseloomustatakse 
kaudselt   aromaatset  tuuma sisaldavate 
aminohapete sisalduse alusel. 
Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin (Tyr), trüptofaan (Trp) ja fenüülalani n 
(Phe) omavad neeldumismaksimume UV- pi rkonnas lainepikkustel 270–280 nm ja tänu 
sel ele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. 
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse 
neelduvust  uuritavas lahuses.  Ehkki  mõõdetav absorbtsioon ( opiline tihedus, A) on tingitud 
kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse 
kasei ni hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või μmol /ml (1 
μmol = 181μg = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kali brimissirget A versus CTyr leitakse 
absorbtsiooni  väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust 
võetud proovides.
Töö käik
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
Uuritavast proteaasi preparaadist ( esperaas ) valmistatakse ensüümile sobiva pH väärtusega 
puhvris lahus, mil es ensüümi kontsentratsioon on  4 mg/ml. Puhvri ( boraatpuhver ), lahuse 
täpse mahu (5 ml) ja ensüümi kontsentratsiooni järgi arvutatakse välja ensüümipreparaadi 
kaalutise suurus (0,02 g). Analüütilistel kaaludel kaalutakse sobiva suurusega kaaluklaasi 
vajalik kogus ensüümipreparaati ja viiakse kadudeta gradueeritud katseklaasi. Lisatakse 
väike kogus puhverlahust ja segatakse klaaspulgaga u 5 min kuni ensüüm on lahustunud. 
Seejärel täidetakse klaas puhverlahusega ettenähtud mahuni (20 ml) ja loksutatakse läbi, et 
ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. 
Ensüümireaktsiooni (kasei ni hüdrolüüsi) läbiviimine
• Võetakse 50 ml mahuga suur  katseklaas , kuhu pipeteeritakse 25 ml 2%-list kasei n lahust. 
Klaas kaetakse korgiga ja asetatakse vesitermostaati 30 °C juurde umbes 7 minutiks 
soojenema.
• Võetakse 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdatakse. Igaühte 
pipeteeritakse     3 ml 5%-list TKÄ lahust.
• Kui kasei ni lahus on 30 °C-ni soojenenud, alustatakse ensüümireaktsiooni  kasei ni 
hüdrolüüsi. Sel eks pipeteeritakse kasei nile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust, 
reaktsioonisegu loksutatakse kiiresti läbi ja asetatakse termostaati tagasi. Samas 
fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg kel a järgi või käivitatakse stopper.
• Peale ensüümi lisamist võetakse puhta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml 
reaktsioonisegu, viiakse esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0- proov ) ja klaasi sisu 
loksutades hoolega. Peale proovi võtmist asetatakse reaktsiooniseguga katseklaas kiiresti 
tagasi termostaati.
• Täpselt 5 minuti pärast võetakse sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja 
klaasi sisu loksutatakse hoolega läbi. Sama operatsiooni korratakse veel  10-ndal ja 15-ndal 
minutil.
Peale viimase proovi võtmist võib reaktsiooniseguga katseklaasi võtta termostaadist välja.
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
• Proovidega katseklaasid jäetakse täielikuks sademe formeerumiseks 15 minutiks seisma. 
Sel ajal pannakse valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustatakse need sobivate 
väikeste klaas- või plastlehtrite ning paberfiltritega. 
• Proovid, mil es sade on põhja settinud, filtritakse kuivadesse katseklaasidesse. Filtrile 
jäänud sade pole vajalik. Saadud filtraadid peavad olema täiesti selged ja kui mõni neist 
seda pole, siis tuleb seda lahust uuesti filtrida.
• Spektrofotomeetril määratakse nelja,  erineval  ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise 
tiheduse väärtused lainepikkusel λ = 280 nm (D280), kasutades 1 cm läbimõõduga 
kvartsküvette.
• Praktikumi juhendajalt saadud kali brimisgraafikult leitakse vastavalt proovide optilise 
tiheduse väärtustele D280 neis sisalduva türosiini kontsentratsioon (mg/ml).
• Saadud katseandmete alusel koostatakse  graafik , mis väljendab türosiini kontsentratsiooni 
ja reaktsiooni  kestvuse  vahelist sõltuvust CTyr = f(t). Kuna proovid on reaktsioonisegust 
võetud kasei ni hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel 
valitseb lineaarne sõltuvus, siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul 
langema  sirgele.
NB! Sirge ei läbi koordinaatide alguspunkti, kuna kasei nis sisaldub vähesel määral TKÄ-ga 
mittesadenevaid komponente ja seetõttu ka 0-proov sisaldab veidi türosiini. Katsepunktide 
hajumise korral viiakse neist läbi kõiki katsepunkte arvestav sirge. Sel e järgi leitakse türosiini 
juurdekasv ΔCTyr valitud ajavahemikus Δt. Ensüümipreparaadi proteolüütiline akti vsus A 
(μkat/g) arvutatakse vastavalt valemile:
 
Katse tulemused
Aeg
Optiline tihedus 
Türusiini 
λ=280 nm
kontsentratsioon
0-proov
 15 sek
0,144
0,023 mg/ml
1-proov
349 sek
0,260
0,042 mg/ml
2-proov
610 sek
0,330
0,053 mg/ml
3-proov
904 sek
0,463
0,073 mg/ml
ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus      ΔCTy r= 0,073–
0,023=0,050 mg/ml
Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s),
      Δt = 904 sek
V1 – reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml),       V1 = 26 ml
V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml),
      V2 = 5 ml
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml → 6 ml, seega L = 2),
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml),
     V3 = 1 ml
g – proteaasi preparaadi kaalutis (g),
     g = 0,02 g
181 – türosiini molekulmass.
Järeldus 
Esperaasi proteolüütiline akti vsus on 3,97 μkat/g, see tähendab, et 30°C juures  1 sekundi 
jooksul vabastab ensüüm 3,97  μmooli aminohapet.

Document Outline

• Tallinna Tehnikaülikool
• YKL0060 Biokeemia
• Töö nr 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
  • Yasb 21
  • Juhendaja Tiina Randla
  • 20.04.2012
• Teooria
• Töö käik
• Katse tulemused
• Järeldus