iseloomustav tegur k. · Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. · Arvutatakse täidise kogumaht Vt · Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax / 2. · Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. · Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine. · Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus. · Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks. Proovi sisestamine
iseloomustav tegur k. 3. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. 4. Arvutatakse täidise kogumaht Vt 5. Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav 6. maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg 7. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega 8. n = Vxmax / 2. 9. Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. 10. Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. 11. Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine. 1. Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus. 2. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks.
spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A) Ühendatud fraktsioon 25 0 1 27 0,042 2 29 0,2026 3 31 0,1868 4 33 0,0674
· Arvutasin täidise kogumahu: Vt = L·r2= 32 · 0,852 = 72,63cm3 · Arvutasin geelmaatriksi mahu: Vg = k·Vt = 72,63 · 0,1 = 7,263cm3 ja maksimaalse eludeerimismahu Vxmax = Vt Vg = 72,63 7,273 =65,357 cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu teades, et ühe fraktsiooni maht on 2ml. n = Vxmax/2 = 65,357 / 2 33 · Nummerdasin katseklaasid Praktiline töö · Avasin kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt tilkuma keeduklaasi. · Reguleerisin kolonni voolutuskiiruseks ligikaudu 1ml/min · Kui vedeliku tase langes geeli pinnani sulgesin kiiresti väljavooluava. · 1ml pipetiga sisestasin ühtlaselt geeli pinnale uuritava proovi, mis koosnes: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml 2. Müoglobiinist 6mg/ml 3. ONP aspartaadist 0,3mg/ml · Kolonn oli eelnevalt täidetud elueerimislahusega mille pH = 7,5 ja koosnes:
Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Tegin vastavaid mõõtmisi (kõrgus L ja diameeter d) ja kirjutasin endale Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. Avasin kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kolonni väljavooluava (tuleb vältida, et vedeliku nivoo ei langeks geelipinnast allapoole ja õhk ei tungiks geelikihti). Sisestasin 0,5 ml uuritavat proovi «DB+Lysozyne+DnAsp» kolonni, jättes umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast. Proov lastakse tilkuda geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks
Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni maht on 2ml, seega n=Vxmax/2 =50,86/2=25,2 Katseklaasistatiivi asetasin 25 nummerdatud klaasi, kus olid eelnevalt tehtud 2ml piirid. Voolutuslahuseks ehk eluendiks oli 0,15M NaCl, eluendi kolonni viimiseks kasutasin 10ml pipetti. 50ml keeduklaasi kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi. Segu komponentideks lahutamine Avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt anumasse tilkuma. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiiruse nii, et 2ml täituks 2-3 minutiga. Vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kolonni väljavooluava ja sisestasin uuritava proovi. NB! Mingil juhul ei tohi lasta kolonni kuivaks joosta, st. tuleb vältida, et vedeliku nivoo ei langeks geelpinnast allapoole ja õhk ei tungiks geelkihti! Proovi sisestamine. Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin sobiva mahuga
k. Mõõtme kolonni raadius R ja kõrgus L. Need andmed kasutades leidme kolonni kogumaht. (Vt) Arvutame geelimatriksi maght Vg. Vg=k*Vt Arvutame kolonni elueerimismaht. Vxmax= Vt Vg Arvutakse fraktsioonide üldarv (n). n = Vxmax/2 Kolonni lähedal paigutatakse eluendi pudel. Varutakse pipett. Enne kolonni kasutamist lastakse kolonnist pinnal olev eluent. 2. Segu komponentide lahutamine. Avatakse kolonni väljavooluava ja voolutuslahus hakkab aeglaselt tilkuma.(kiirus 0,7-1,0 ml/min) Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, kinnitakse vooluava. NB. Mingil juhul ei tohi kolonni kuivaks lasta. 3. Proovi sisestamine. Kolonni lisatakse uuritava proovi (0,5-1,0 ml) 4. Reeglin koosnevad segud 3-4 erineva molekulmassiga komponentidest, mis on lahustunud sobivas lahuses(näitek destileeritud vesi või NaCl lahus). Meie töös ained on värvilisred ja me
TÖÖ KÄIK Pärast kolonni vertikaalsuse kontrollimist, märgiti üles selle mark ja tegur k. Samuti uuritava lahuse koostis ja voolutuslahuse koostis. Arvutati täidise kogumaht Vt Arvutati geelmaatrikis maht Vg=k x Vt ja anti maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt Vg. Arvutati fraktsioonide üldarv n (võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml) n= Vxmax/2. Nummerdati vajalik arv (n) kalibreeritud katseklaase. Avati ettevaatlikult koloni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus lasti voolata kolonni kuni vedeliku tase langes täidise pinnani, siis suleti väljavooluava. Samal ajal reguleeriti kolonni voolukiirus umbkaudu kiiruseni 0,7-1,0 ml/min. Pipeti ja süstla abil võeti 0,5 ml uuritavat proovi ja viidi see kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina. (väljavooluava endiselt suletud) Proov geeli pinnale viidud, avati välja vool ja vooluti suunati 100 ml kolbi (kuhu kogutakse nn ühendatud
2 2 Voolutuslahuse koostis 50 mMTris-HCl 150 nM NaCl pH = 7,5 Uuritava proovi koostis Dekstraansinine (sinine) Müoglobiin (pruun) DNP-aspartaat (kollane) Töö kolonniga Kõigepealt avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et voolutuslahuse nivoo oleks võrne täitegeeliga. Samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirus reguleerimisklambri abil õigeks (soovitav voolukiirus 0,7-1,0 ml/min, millele vastab 1 tilk nelja sekundi jooksul). Voolutuslahus kogutakse väiksesse keeduklaasi ja visatakse pärast minema. Seejärel lisatakse kolonni uuritav proov. Pipetti võetakse 0,5 ml uuritavat proovi (koostis kirjas eespool). Pipeti ots peab olema kolonni keskel, umbes poole cm kaugusel geeli pinnast. Proov kantakse geeli pinnale võimalikult ühtlaselt. Pärast proovi lisamist avatakse väljavool kolonnist ja lisatakse väike kogus voolutuslahust. Seda korratakse mõned korrad ning alles siis lisatakse voolutuslahust terve kolonni täitumiseni.
· Kolonni täidise mark ja seda iseloomustav tegur k märgitakse üles. · Mõõdetakse geeli kõrgus L ja diameeter d. · Arvutatakse geeli kogumaht Vt. · Arvutatakse geelmaatriksi maht Vg ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetatakse arvule n vastav katseklaaside hulk, nummerdatakse. · Valmistatakse ette voolutuslahus ja leitakse sobiv pipett lahuse kolonni viimiseks. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu kogutakse geeli pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine · Avatakse kolonni väljavooluava ning kogutakse täidise kohal olev eluent keeduklaasi. · Reguleeritakse kolonni voolukiirus sobivaks: 0,7 1,0 ml/min. · Vedeliku tase lastakse joosta geeli pinnani ning suletakse väljavooluava. Proovi sisestamine · Pipeti abil viiakse 0,5 ml proovi kolonni.
tegur k ning uuritava lahuse ja voolutuslahuse koostis. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja diameeter d. Arvutatakse täidise kogumaht Vt, geelmaatrikis maht Vg = k·Vt ning maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt Vg. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n (võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml) n = Vxmax/2. Nummerdatakse vajalik arv (n) kalibreeritud katseklaase. Avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus lastakse voolata kolonni kuni vedeliku tase langeb täidise pinnani, siis suletakse väljavooluava. Voolukiiruse reguleerimiseks kulus minul 2 min. Pipeti abil võetakse 0,5 ml uuritavat proovi ja viiakse see kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina. Proov geeli pinnale viidud, avatakse väljavool ja vooluti suunatakse 100 ml kolbi, kuhu kogutakse nn ühendatud fraktsioon, mida kogutakse niikaua, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõuab kolonni alaossa
kolonni täidis Sephadex G75, k=0,1 Geelisamba täidise kõrgus L=24 cm, diameeter d=2 cm Täidise kogumaht Vt = ·(d:2)2·L = 3,14· (2:1)2·24 = 75,40 cm3 = 75,40 ml Geelimaatriksi maht Vg = k·Vt = 0,1·75,40 = 7,54 ml, kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg = 75,407,54 = 67,86 ml. Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; n = V xmax/2 = 67,86/2 = 33,93. Avasin kolonni vooluava ning täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt mööda kolonni liikuma. Vedeliku tasemel lasin langeda kuni täidise pinnani, sulgesin kolonni vooluava ning panin peale uuritavat proovi, mis koosnes: dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP-aspartaadist. Dekstraansinine väljub minimaalse väljumismahuga ning tänu sellele on komponentide lahutumine paremini jälgitav. Kolonni voolutamine Võtsin uuritavat proovi 0,5 ml ning lasin sel voolata geeli pinnale võimalikult ühtlaselt.
kaliibritud katseklaase ja nummerasin. · Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles eluendi koostise. Varusin 25 ml pipeti, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väikese (50 ml) keeduklaasi, kuhu kogusid kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin. Segu komponentide lahutamine. · Avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. · Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kiiresti kolonni väljavooluava ja kolonn oli valmis uuritava proovi sisestamiseks. Vedeliku nivoo ei tohtinud langeda geelipinnast allapoole. Proovi sisestamine. · Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin sobiva mahuga (1 ml) mõõtpipetti, mille otsas on tükike peenikest voolikut.
( 2ml ) kalibriitud katseklaase ja numereerisin need. Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahutuse ehk eluendi pudeli ja märkisin üles voolutuslahuse koostise: 50 mM Tris HCl 150mM NaCl pH = 7,5 Varusin väikse keedkulaasi, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin. 2.2. Segu komponentide lahutamine Avasin ettevaatlikult kolonni väjavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonnist välja tilkuma. Reguleerisin kolonni voolukiiruse optimaalseks. Kui vedeliku tase langes kolonnis täidise pinnani, sulgesin kolonni väljavooluava ja kolonn sai valmis proovi sisetamiseks. 1.4 Proovi sisestamine Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin pipetti. Viisin 0,5 ml uuritavat proovi kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina. Proovil lasksin voolata geeli pinnale nii, et see jaotuks võimalikult ühtlaselt. 1
maksimaalne elueerimistmaht Vx;max=Vt-Vg=106-10.6=95.4 ·Arvutasin fraktsioonide üldarvu, arvestan kindlaks mahuks 2ml. n=Vx;max/2=95.4/2=47.7. (Kuigi selline arvutus, läks mul vaja 36 katseklaasi). ·Asetasin katseklaasistatiivi fraktsiooni arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. ·Paigutasin kolonni lähedusse voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles selle koostise. Varusin sobiva mahuga (20ml,25ml) pipeti, millega voolutuslahus kolonni viia. ·Varusin väikese (50ml)seisukolvi, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine Kui ettevalmistused tehtud, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolulahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiirust reguleerimisklambri abil piiridesse 0.7-1.0ml/min
ülesse voolutuslahuse koositse tris HCl, 0,15 M NaCl, pH=7,5. Varusin sobiva mahuga pipeti (20 ml, 25 ml), millega voolutuslahust kolonni viia. o Varusin väikse keedukolvi (50 ml) enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lastava kolonni pinnal oleva eluendi jaoks. Lahutasin segu komponendid. Pärast ülalkirjeldatud ettevalmistuste tegemist avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja kolonni kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiiruse reguleerimisklambi abil piiridesse 0,7 1 mL minutis, mis tähendab, et iga 2-milliliitrise fraktsiooni kogunemise ajaks kujunes 2-3 minutit. Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kiiresti kolonni väljavooluava. Proovi sisestamine Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin sobiva mahuga (1 ml) mõõtpipetti
(2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma. Sellel ajal reguleesin kolonni voolukiirus, et tilkus 0,7-1ml lahust minutis. Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulesin kiiresti kolonni väljavooluava ning kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks. Seda vedelikku ei pea mõõta ja arvutada Vt leidmisel. Proovi sisestasmine Ning ,kui ma reguleerisin voolukiirust, saab kolonni uuritavat lahust panna. Selleks võtan 0,5ml lahust ja ettevaatlikult, kasutades pipeti, voolan kolloni
7. Asetasin statiivi umbes 35 katseklaasi (kuigi arvutused näitasid, et vaja oleks 45) 2 ml mahu järgi kalibreeritud katseklaase ja nummerdasin need. 8. Paigutasin kolonni lähedusse eluendi pudeli ja võtsin 25 ml mahuga pipeti ning 50 ml mahuga keeduklaasi. Eluendi koostis: 50 mM tris-HCl + 150 mM NaCl (pH = 7,5) SEGU KOMPONENTIDE LAHUTAMINE JA PROOVI SISESTAMINE 1. Avan ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et täidise kohal olev voolutuslahus (eluent) hakkaks aeglaselt kolonni alla asetatud keeduklaasi tilkuma. 2. Reguleerin kolonni voolukiiruse reguleerimisklambri abil piiridesse 0,7-1,0 ml/min. 3. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, sulgen kolonni väljavooluava. NB! Õhk ei tohi tungida geelikihti! 4. Kasutan kalibreeritud mõõtpipetti ja viin 1 ml uuritavat proovi kolonni. 5. Lasen proovil tilkuda geeli pinnale nii, et see jaotuks seal võimalikult ühtlaselt. NB!
(2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma. Sellel ajal reguleesin kolonni voolukiirus, et tilkus 0,7-1ml lahust minutis. Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulesin kiiresti kolonni väljavooluava ning kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks. Seda vedelikku ei pea mõõta ja arvutada Vt leidmisel. Proovi sisestasmine Ning ,kui ma reguleerisin voolukiirust, saab kolonni uuritavat lahust panna. Selleks võtan 0,5ml lahust ja ettevaatlikult, kasutades pipeti, voolan kolloni
voolutuslahuse koostis. Varutakse sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varutakse väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuleb kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui ülalkirjeldatud ettevalmistused on tehtud, avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkab aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. Samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirus reguleerimisklambri abil piiridesse 0,71,0 ml/min, mis tähendab, et iga 2-milliliitrise fraktsiooni kogumise ajaks peaks kujunema 23 minutit. NB! Voolukiirus peab olema optimaalne, et tsooni laienemist põhjustava massiülekande ja difusiooni mõju lahutuvusele oleks võimalikult väike. 51
annaabi.ee 
