ml/min) Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, kinnitakse vooluava. NB. Mingil juhul ei tohi kolonni kuivaks lasta. 3. Proovi sisestamine. Kolonni lisatakse uuritava proovi (0,5-1,0 ml) 4. Reeglin koosnevad segud 3-4 erineva molekulmassiga komponentidest, mis on lahustunud sobivas lahuses(näitek destileeritud vesi või NaCl lahus). Meie töös ained on värvilisred ja me võime visuualselt jälgida nende lahutamist. Meie lahuse koostises: Dekstraansinine Müoglobii DNP-Aspartaat 5. Kolonni voolutamine. Kuni kollonni allaosa jõuab kõige kiiremini liikub komponent (meie juhul dekstraansinine) kogume eluaadi ühendatud fraktsiooniga ühe kolbi. Pärast esimese komponentide kolonni alla jõudmisel kogume 2 ml kaupa. 6. Fraktsioonide analüüsimine. Meie töös väljendame aine kontsentratsiooni igasfraktsioois lahuse optilise tiheduse järgi. Iga aine absorbeerib erinevatel lainepikkusel
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiks koguda iga fraktsioon ubmes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg = 75,407,54 = 67,86 ml. Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; n = V xmax/2 = 67,86/2 = 33,93. Avasin kolonni vooluava ning täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt mööda kolonni liikuma. Vedeliku tasemel lasin langeda kuni täidise pinnani, sulgesin kolonni vooluava ning panin peale uuritavat proovi, mis koosnes: dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP-aspartaadist. Dekstraansinine väljub minimaalse väljumismahuga ning tänu sellele on komponentide lahutumine paremini jälgitav. Kolonni voolutamine Võtsin uuritavat proovi 0,5 ml ning lasin sel voolata geeli pinnale võimalikult ühtlaselt. Seejärel avasin voolutusava ning kuni alaossa jõudis kõige kiiremini liikuv osa, milleks on dekstraansinine, väljus kolonnist puhas vooluti, mille kogusin ühendatud fraktsioonina (16,75 ml). Seda kogusin sinnamaani, kuni nägin kolonnis, et
Kromatografeerimissüsteemi koostamine Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiga koguda iga fraktsioon umbes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin automaatpipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
Kromatografeerimissüsteemi koostamine Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi. Mõõtsin selle, sest see moodustab osa dekstraansinise elueerimismahust Vxmin. Kolvis oli 14,5 ml. Lisasin puhverlahust mööda kolonni külge , seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid
L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. · Voolutuslahus:Dekstraansinine,Müoglobiin,DNP-Aspartaat.Kasutasin automaatpipetti mahuga 0,5 ml. · Kolonni pinnal olev eluent kogun seisukolbi. Segu komponentide lahutamine: Avan kolonni väljavooluava. Täidise lahus hakkab keeduklaasi tilkuma. Reguleerin kolonni voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava . Uuritav segu: 1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane). Proovi sisestamine:
Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi. Mõõtsin selle, sest see moodustab osa dekstraansinise elueerimismahust Vxmin. Kolvis olevat üldist fraktsiooni oli 12,5 ml. Lisasin puhverlahust mööda kolonni külge , seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2 ml peale. Nii tegin
3. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, sulgen kolonni väljavooluava. NB! Õhk ei tohi tungida geelikihti! 4. Kasutan kalibreeritud mõõtpipetti ja viin 1 ml uuritavat proovi kolonni. 5. Lasen proovil tilkuda geeli pinnale nii, et see jaotuks seal võimalikult ühtlaselt. NB! Samal ajal on väljavooluava suletud! Praktikumis uuritavas ainete segus on kõik ained värvilised ja segu komponentide lahutamine on visuaalselt jälgitav. Uuritava segu sisaldus: dekstraansinine + müoglobiin + DNP-aspartaat KOLONNI VOOLUTAMINE: 1. Avan väljavoolu kolonnist 2. Hakkan koguma eeljooksu (puhas vooluti), enne kui kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent (dekstraansinine). 3. Kui proov on täidisesse sisenenud, viin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikese koguse (0,5-1 ml) eluenti 4. Lasen eluendil täidisesse imbuda. 5. Kordan seda protsessi väikeste kogustega seni, kuni kogu uuritav proov on kolonni sisenenud 6
fraktsioon, mida kogutakse seni, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõuab kolonni alaossa). Kui proov oli liikunud täidisesse viidi kiiresti pipeti abil geeli pinnale väike kogus voolutit ja lasti sellel sisse imbuda. Seda korrati seni, kuni oldi veendunud, et kogu uuritav proov on kolonni sisenenud. Siis kanti geeli pinnale suurem kogus voolutuslahust. Ja lisati seda pidevalt vastavalt vajadusele Kui esimene värviline riba (dekstraansinine) lähenes kolvi põhjale, siis eemaldati kolb ja alustati eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Ühendatud fraktsioonis olev eluaat on osa dekstraansinise elueerimismahust, seega tuli see ära mõõta. Elueerimine lõpeteti kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektromeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus
kolbi, kuhu kogutakse nn ühendatud fraktsioon, mida kogutakse niikaua, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõuab kolonni alaossa. Ühendatud fraktsiooni maht mõõdetakse. Kui proov oli liikunud täidisesse, viiakse kiiresti pipeti abil geeli pinnale väike kogus voolutit ja lastakse sellel sisse imbuda. Seda korratakse seni, kuni ollakse veendunud, et kogu uuritav proov on kolonni sisenenud. Siis kantakse geeli pinnale suurem kogus voolutuslahust. Kui esimene värviline riba (dekstraansinine) läheneb kolvi põhjale, siis eemaldatakse kolb ja alustatakse eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Kogu voolutuse käigus tuleb jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele lisada ning vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimine lõpetatakse kui väljub viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks.
Pundumistegur k=0,1 Geelisamba kõrgus L= 29,5 cm Kolonni sisediameeter 2,1 cm ( r= 1,05 cm) Vajalikud arvutused tööks Kogumaht Vt= Sp * L Sp= r2 Vt= 3,14 * (1,05)2 * 29,5 = 102 cm3 Geelimaatriksi maht Vg= k* Vt Vg= 0,1* 102 = 10,2 cm³ Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg Vxmax= 102-10,2= 91,8 cm3 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/ 2 n= 91,8/246 katseklaasi Elueerimispuhver: 0,15 M NaCl; 20 mM Tris/HCl; pH= 7,5 Lahutatava segu koostis: dekstraansinine 3 mg/ml, müoglobiin 6 mg/ml, DNP- aspartaat 0,3 mg/ml Segu komponentide lahutamine kolonnis 1. Avasin alumise kraani ja lasin voolutil kolonnist tilkuda väiksesse keeduklaasi kuni vooluti oli mõne mm kõrgusel geeli nivoost, jälgides, et kolonn kuivaks ei jookseks. 2. Sulgesin kolonni väljavooluava ning doseerisin pipetiga geeli pinnale 1 ml uuritavat proovi. 3. Järgmiseks lisasin tilkhaaval voolutit, et proov imenduks geeli, kuid ei lahustuks voolutis. 4
· kolonni täidis: Sephadex G-75, tegur k = 0,1 · geelisamba kõrgus l = 31,4 cm · diameeter d = 1,6 cm · täidise kogumaht Vt = 63 ml · geelimaatriksi maht Vg = 0,1 63 = 6,3 ml · maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 63 6,3 = 56,7 ml · fraktsioonide üldarv n = 56,7 / 2 = 29 · statiivi võetakse vastav arv katseklaase · eluendi koostis: 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 7,5 · uuritav segu: o dekstraansinine (6mg/ml) o müoglobiin (6mg/ml) o 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml) · kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja · kolonni voolukiirus reguleeritakse piiridesse 0,7 1,0 ml/min · kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava · kolonni pipeteeritakse 0,5 ml uuritavat proovi, lastes proovil geelile mõne millimeetri kõrguselt tilkuda nii, et proov jaotuks geelis ühtlaselt
kolonnis langeb täidise piirini. Pean silmas, et vedelikunivoo alla täidise piiri ei langeks, muidu satub geelikihti õhk, mis võib katsetulemusi mõjutada. Hoides kolonni väljavooluava suletuna, pipeteerin 0,5 ml uuritavat ainet ühtlaselt geeli pinnale ning lasen sellel valguda läbi geeli. Uuritav lahus sisaldab dekstraansinist, müoglobiini ja DNP-aspartaati (vedelik on algul rohelist värvi). Seni, kuni dekstraansinine (mis on kõige kiiremini liikuv aine) jõuab kolonni alaossa, kogun vooluti (seda pidevalt lisades) ühendatud fraktsioonina keeduklaasi. Mõõdan selle koguse sobiva mõõtsilindriga ära ning saan tulemuseks Vüf=20,65 ml. Kui sinise värvusega dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, võtan ühendatud fraktsioonina kogutud keeduklaasi alt ning hakkan fraktsioone 2 ml kaupa katseklaasidesse koguma. Seda teen seni, kuni kolonnis ei esine enam
proovi ja viiakse kolonni · proov lastakse voolata geeli pinnale nii, et see võimalikult ühtlaselt jaotuks Kolonni voolutamine: · kui proov on sisestatud, avatakse väljavooluava ning lisatakse vähehaaval eluenti, kuni proov on täidisesse imbunud · pärast seda võib kolonni lisada juba suurema koguse eluenti · puhtasse kuiva kolbi hakatakse koguma ühendatud fraktsiooni · kui dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, eemaldatakse kolb ja hakatakse katseklaasidesse koguma fraktsioone 2 ml kaupa · elueerimise võib lõpetada, kui eluaat on muutunud värvituks Fraktsioonide analüüsimine: · aine kontsentratsiooni väljendatakse igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel
V x - v xmin R f = max V x - V xmin Fraktsioonide arvutamine: r = 2,2/2=1,1 cm h = 31,5 cm Geeli maht: Vt = Sp*h = r2*h = *(1,1)2*31,5 =119,68 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*119,68 = 11,9 cm3 Vxmax = Vt Vg = 119,68 11,9 = 107,7 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =107,7/2 = 53 Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu: Vv = 34 ml Uuritav segu koosneb kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin ja DNA- aspartaat, elueerimispuhvriks oli pH=7,5 0,05M Tris/HCl. Kolonn sisaldab: Sefadex G-50 Lainepikkus Fraktsiooni Eluaadi Optiline (nm) nr maht (ml) tihedus 1 36 0,037 2 38 0,169 670 3 40 0,248 4 42 0,189 5 44 0,095 6 46 0,039
1) kolonni pikkus l= 22,6 cm, 2) kolonni diameeter d= 2,4 cm. 3) Seejärel arvutatakse kolonni kogumaht Vt= r2h= 3,14*(2,4/2)*22,6=85,15 cm3 4) k=0,1 5) Seejärel arvutatakse geelmaatrikis maht Vg=k*Vt = 85,15*0,1=8,51cm3 6) Vg lähtuvalt arvutatakse max elueerimismaht Vx max=Vt-Vg=85,15-8,51=76,64 cm3 7) Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml, seega n= Vx max /2= 76 /2=38 Esimese elueerimismaht oli 15 ml Optilise tiheduse table Dekstraansinine Müoglobiin DNP-aspartaat 670nm 410 nm 360nm 0,011 0,129 0,166 0,335 0,612 0,542 0,484 1,683 1,555 0,329 1,999 2,636
V x - V xmin TÖÖ KÄIK, ARVUTUSED, TABELID, GRAAFIKUD Fraktsioonide arvutamine: r = 2,3/2=1,15 cm h = 29,5 cm Geeli maht: Vt = Sp*h = r2*h = *(1,15)2*29,5 =122,56 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*122,56 = 12,256 cm3 Vxmax = Vt Vg = 122,56 12,256 = 110,30 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =110,3/2 = 55,15 Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu: Vv = 27 ml Uuritav segu koosneb kolmest komponendist: dekstraansinine 3mg/ml, müoglobiin 6mg/ml ja DNA-aspartaat 0,3mg/ml, elueerimispuhvriks oli pH=7,4 20mM Tris 0,15M NaCl Kolonn sisaldab: Sephadex G-75 Lainepikku Fraktsiooni Eluaadi Optiline s (nm) nr maht tihedus (ml) 1 36 0,007 2 38 0,067 670 3 40 0,160 4 42 0,248 5 0,180
kolonnist väljuvad kõige suuremad molekulid (=). Maksimaalne elueerimismaht selline elueerimismaht, mille juures kolonnist väljuvad ka need molekuli, mille molekulid täielikult diffundeeruvad geeli pooridesse (=). Aineid, mille molekuli suudavad täielikult diffundeerida geeli pooridesse ja mille antud kolonnis on teada, iseloomustatakse liikuvusteguriga : Selle värtusedjäävad vahemiku 0...1 Töö käik 1. Proovi andmed: =0.5 ml. Koostis: Dekstraansinine (6 mg/ml), Müoglobiin (6 mg/ml), DNP-aspartaat (0.3mg/ml), proovi lahusti ja eluent NaCl lahus. 2. Märgin ära kolonni andmed: geel on Sephadex G-75, koeffitsient k=0.1, geelisambla kõrgus L=27.4 cm, diameeter d=1.9 cm. 3. Arvutan vajalikud mahud: ; ; 4.Arvutan fraktsioonide üldarv: n= (tegelikult 29-s fraktsioonis oli nii vähe elueerivat ainet, et sellega ma lõpetasin fraktsioonide kogumist). 5
koguse (0,5 1 ml) voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. · Sama kordasin teisegi korra. · Kui kogu uuritav proov oli kolonni sisenenud, kandsin geeli pinnale suurema hulga voolutit, et moodustuks 4 5 cm kõrgune vedeliku kiht. Elueerimislahus: 20 nM Tris/HCl 0,15 M NaCl pH 7,5 · Samal ajal jälgisin, kuidas liikus kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine). · Kui see lähenes kolonni põhjale, siis eemaldasin kolonni alt kolbi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritd ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. · Elueerimise lõpetasin, kui eluaat muutub värvituks. Fraktsioonide analüüsimine. · Aine kontsentratsiooni väljendasin igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel.
Kui vedeliku tase langes kolonnis täidise pinnani, sulgesin kolonni väljavooluava ja kolonn sai valmis proovi sisetamiseks. 1.4 Proovi sisestamine Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin pipetti. Viisin 0,5 ml uuritavat proovi kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina. Proovil lasksin voolata geeli pinnale nii, et see jaotuks võimalikult ühtlaselt. 1.5 Uuritavad segud Uuritav segu koosnes järgnevatest ainetest: Dekstraansinine ( 6 mg/ml ) Müoglobiin ( 6 mg/ml ) DNP aspartaat ( 0,6 mg/ml ) 2.4 Kolonni voolutamine Kui proov on täidisesse sisenenud, viin pipetiga geeli pinnale väikse koguse voolutuslahust ja lasen täidisesse imbuda. Kordan seda nii kaua, kuni kogu uuritava proov on kolonni sisenenud ja siis võib geeli pinnale kanda suurema hulga voolutit. Kui esimene värviline riba ( dekstraansinine ) läheneb kolonni põhjale, siis eemaldab
2 V g = k * Vt = 7,986 V x max = 79,86 - 7,986 = 71,874 71,874 n= = 35,957 36 2 Sain siis, et fraktsioonide üldarvuks tuleb 36. Seejärel eemaldasin kolonni ülaosast üleliigse vedeliku lastes sel voolata mööda kolonni väiksesse keeduklaasi. Kui vedeliku nivoo oli geelisambaga peaaegu samal kõrgusel ( umbes 2mm kõrgemal) siis sulgesin kraani ja doseerisin pipetiga geelisamba pinnale 0,5ml uuritavat proovi. Proov koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin ja DNA-aspartaat. Seejärel keerasin kraani vaikselt tilkuma ja panin sinna alla kolvi. Kui uuritav proov oli geeli imendunud, lisasin natuke juurde puhvrit, seejärel uuesti väikese koguse ja lõpuks lisasin rohkem, et puhvri maht ulatuse kolonni ääreni. Lasin eluaadil kolbi tilkuda seni, kuni esimene värviline riba ( sinine) jõudis kolonni põhjani ja eemaldasin siis kolbi ja kogusin edasi vedelikku fraktsioonidena nummerdatud ja kaliibritud(2ml) katseklaasidesse
tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A) Ühendatud fraktsioon 25 0 1 27 0,042 2 29 0,2026 3 31 0,1868
Kui vedeliku tase kolonnis oli langenud täidise pinnani, sulgesin väljavooluava. Nüüd oli kolonn valmis proovi sisestamiseks. Proovi sisestamine Võtsin pipetiga 1 mL uuritavat proovi ja viisin selle kolonni. Selleks juhtisin pipeti otsa vastu kolonni seina ja lasin proovil voolata geeli pinnale nii, et geel saaks võimalikult ühtlaselt kaetud. Uuritav segu Uuritav segu koosnes kolmest erineva molekulmassiga komponendist. Uuritava segu koostisosad: 1) Dekstraansinine, 3 mg/mL 2) Müoglobiin, 6 mg/mL 3) DNP-aspartaat, 0,3 mg/mL Kolonni voolutamine Kui olin proovi viinud geeli pinnale, siis avasin väljavoolutoru ja hakkasin eluaati koguma alguses ühendatud fraktsioonina kuiva kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. Kordasin sama asja väikese eluendi kogusega veel teinegi kord ja siis viisin juba geeli pinnale
34 86 0,0402 360 35 88 0,0251 360 0.6 0.5 0.4 0.3 Optiline tihedus (A) 0.2 0.1 0 Elueerimismaht (ml) Elueeritud segus oli: 1. Dekstraansinine - absorbeerib lainepikkusel 670 nm. Sinise värvusega aine, mis väljub esimesena, sest dekstraansinine on kõrgmolekulaarne (suured molekulid), mille tulemusena molekulid ei mahu geeligranulite pooridesse ja liikuvad kiiresti nende vahel. Kromatogrammi järgi elueerimismaht on Vx min = 24 ml 2. Teisena väljus Lysozyme, mis absorbeerib lainepikkusel 280 nm Vx = 48 ml 3. DNP - Aspartaat - absorbeerib lainepikkusel 360 nm. Kollase värvusega aine väljub
kogumise lõpetada. Tulemused ja nende interpreteerimine A. Täidise mark ja materjal=> Sephadex, 675 Täidist iseloomustav pundumistegur=> 0,1 Täidise kõrgus=> 12,5 cm Täidise sisediameeter=> 2,7 cm Täidise kogumaht=> 71.53 cm3 Maksimaalne elueerimismaht=> 64,38 cm3 Fraktsioonide üldarv=> 32,19 B. Kromatogramm A- Müoglobiin B- D-aspartaat C- dekstraansinine V A B C 15,45 0 0 0 17,45 -0,0251 -0,0313 -0,0139 19,45 -0,0271 -0,033 -0,0164 21,45 -0,0168 -0,0225 -0,0055 23,45 0,0718 0,061 0,0783 25,45 0,03087 0,2615 0,2761 27,45 0,03448 0,2845 0,299 29,45 0,1667 0,1349 0,1509 31,45 0,0651 0,0401 0,0522 33,45 0,0773 0,021 0,0143
Proovil lasin voolata (tilkuda) geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. Uuritavad segud Koosnes 3-st erineva molekulmassiga komponendist. Segus olid kõik ained värvilised, et komponentide lahutumine oleks kolonnis ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldas praktikas uuritav segu dekstraansinist (3mg/ml), mis elueerus minimaalse väljumismahuga ja mille järgi sain teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2*106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Lisaks sisaldas uuritav segu Müoglobiini (6mg/ml), mille molekulmass on 16800 Da ja DNP- aspartaati (0,3 mg/ml). Kolonni voolutamine Enne kõige kiiremini liikuvat komponenti (dekstraansinist) kolonnis väljuva puhta vooluti kogun ühendatud fraktsioonina, milleks asetan enne voolutamise algust kolonni väljalaskeava
Vx Vxmin=Vv=24 ml. Eluaadi kogumaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga Vxmax fraktsiooni väljumiseni. Vxmin Dekstraansinise elueerumismaht on võrdne kolonni vaba mahuga, kuna tema molekulmass on 200 kDa ning ta ei mahu geeli pooridesse ja liigub pooridevahelisel alal, kuivõrd antud geeli lahutuspiirkond on .... 3000-80000 Da. Dekstraansinine väljus esimesena, kuna tema molekulaarmass on suurim ja ta ei mahtunud geeli pooridesse. DNP-aspartaat on väikseima molekulaarmassiga ning ta difundeerus täielikult pooridesse ja läbis seetõttu kolonni kõige aeglasemalt. Kuna geelkromatograafia põhimõtte on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi, siis järeldan ka, et ma ei tegelenud praktikumis mustkunstiga ning sain ootuspärased tulemused,
destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates segudes on kas kõik ained värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud dekstraansinist(6mg/ml), mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga tähtis inimese kehas, kuna ta on skellet- ja südamelihase hapnik-siduv valk.
Materjal: dekstraan Täidise kõrgus L = 33 cm Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm Täidise kogumaht Vt = r 2 L = 0,9 2 33 = 83,98cm3 Geelmaatriksi maht Vg = k Vt = 0,1 83,98 = 8, 40cm3 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt - Vg = 83,98 - 8, 40 = 75,58cm3 Fraktsioonide üldarv V max 75,58 n= x = = 37, 78 38 2 2 Voolutuslahuse koostis 50 mMTris-HCl 150 nM NaCl pH = 7,5 Uuritava proovi koostis Dekstraansinine (sinine) Müoglobiin (pruun) DNP-aspartaat (kollane) Töö kolonniga Kõigepealt avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et voolutuslahuse nivoo oleks võrne täitegeeliga. Samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirus reguleerimisklambri abil õigeks (soovitav voolukiirus 0,7-1,0 ml/min, millele vastab 1 tilk nelja sekundi jooksul). Voolutuslahus kogutakse väiksesse keeduklaasi ja visatakse pärast minema. Seejärel lisatakse kolonni uuritav proov.
destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates segudes on kas kõik ained värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud dekstraansinist(6mg/ml), mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga tähtis inimese kehas, kuna ta on skellet- ja südamelihase hapnik-siduv valk.
Reguleerida tuli ka voolukiirus 0,5-0,8 ml/min. Hiljem, kui siniselt värvunud molekulid olid geelist läbi tulnud, võis kiirust lisada. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 0,5ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Lisasin puhverlahust, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga.
Tulemused ja nende intepreteerimine A. Täidis SpatelG75 Pundumis tegur 0,1 Täidise kõrgus 22,2 ja sisediameeter 1,8 Arvutatud täidise kogumaht 56,46 Arvutatud maksimaalne elueerimismaht 50,89 Arvutuslik fraktsioonide üldarv 25 B. C. Graafikult on näha kolme tõusu ja langust, mis näitavad, et aine konts. kolonnist väljumisel tõuseb, saavutab haripunkti ja langeb, kuni lõpuks on kogu aine kolonnist väljunud. Ained jagunesid geelis vastavalt molaarmassile. Dekstraansinine, mille molaarmass on tunduvalt suurem, kui müoglobiinil ja DNP-Aspartaadil, väljus kolonnist esimesena. Kolmandana elueerus DNA-Aspartaat, mille molekulid on piisavalt väikesed, et täielikult geeli pooridesse siseneda ning on seetõttu maksimaalse elueerimismahuga. D. E.Rf= Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin=
Oluline oli mitte kolonni lasta kuivaks joosta, sest muidu tungib õhk geelikihti. Kasutatud kolonnil oli automaatselt reguleeritud kiirus. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 1ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Kogusin eelfraktsiooni mõõtkolbi, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogutud eelfraktsiooni mahu mõõtsin mõõtsilindri abil. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende
19 52 0,155 20 54 0,055 KROMATOGRAMM Miks komponendid väljusid just niisuguses järjekorras? Kõige enne väljub kõige suurema molekulmassiga aine, kõige hiljem aga kõige väiksema molekulmassiga aine. Ained väljusid sellised järjekorras: sinine (dekstraansinine), pruun (müoglobiin), kollane (DNP- aspartaat). Sellest saab järeldada, et kõige suurem molekulmass on dekstraansinisel, kõige väiksem DNP-aspartaadil ning müoglobiini molekulmass jääb nende ainete vahele. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx min = Vv = 17,5 ml Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 23,5 ml
x-teljel elueerimimaht V (ml), y-teljel optiline tihedus A, maksimumpunktid A=0,972 (24 ml), A=3,436 (36 ml) ja A=3,135 (74 ml). 0-18 ml on ühendatud fraktsioon. Vxmin = 24 ml Vx = 36 ml Vxmax = 74 ml Rf väärtus: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin = 36-24 / 74-24 = 0,24 Arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vmax=55,89 cm3 ≈56 cm3, määratud Vmax=74 cm3 Arvutatud ja määratud maksimaalsed elueerimismahud ei klapi. Järeldus: Dekstraansinine väljus esimesena, kuna tema molekulmass on neist suurim ja ta ei mahtunud geeli pooridesse. DNS- aspartaat, kui väikseima molekulaarmassiga, difundeerus täielikult pooridesse ja läbis seetõttu kolonni kõige aeglasemalt. Arvutsulik ja reaalne elueerimismaht erinesid üksteisest, kuigi ei tohiks. Mõõtmisvead võisid tulla kolonni mahu mõõtmisel või fraktsioonide mõõtmisel. Ideaalis ei tohi teoreetiline ja reaalne maksimaalne elueerimismaht üksteisest erineda.
6 0.5 Optiline tihedus (A) 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Eluaadi maht (V,ml) Graafik 1. Kromatogramm Järeldus Kromatogrammi pealt on näha kolm tippu, mis seletab ainete kolonnist väljumise järjekorda. Esimesena väljus kõige suurema molekulmassiga aine – dekstraansinine, seejärel müoglobiin ning siis väikseima molekulmassiga aine – DNP-aspartaat. Dekstraansinise molekulid ei mahtunud kolonni täitva geeli pooridesse. Müoglobiini molekulid difuneerusid geeli pooridesse rohkem ning DNP-aspartaadi molekulid difundeerusid geeli pooridesse täielikult. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni – Vxmin = Vv = 31ml Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 39 ml
destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates segudes on kas kõik või enamik aineid värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud alati dekstraansinist, mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Allpool on toodud mõned uuritavate segude näidisvariandid. NB! Teile uurimiseks antud segu koostis ei pruugi vastata siintoodutele. Selle leiate proovi sisaldava kolvi etiketilt ja see tuleb kindlasti üles märkida. 52 Variant A kolmekomponentne suure tihedusega proov. 1
annaabi.ee 
