Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseenes, paljud taimed, mesilased. Inimese jaoks on see oluline seedeensüüm. Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks võib kasutada mitmeid meetodeid. Selles töös kasutan komleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. See valmistatakse kõrge Na2CO3
Hüdrolüüsi käigus tekkinud glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemise meetodiks on kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kompleksi valmistatakse Na2CO3 lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja triloon B(ETDA-Na). Reaktiivi roll: · Toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümreaktsiooni · Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-trioloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonist võetud proovi(sisaldab taandavaid suhkruid) viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandaub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(i)-ks. Moodustub Cu2O ja eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B. Keetmisel 2 toimuv reaktsioon:
Glükosidaasid katalüüsivad O- glükosiidsidemete hüdrolüüsi järgmiselt: Polü- või Oligosahhariid + Monosahhariid + (lühem)Polü- või Oligosahhariid Antud töös vaadeldatakse sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon, mis kulgeb C ja pH=4,8 juures. Reaktsiooni produktideks on -D-glükoos ja -D-fruktoos. Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi, kui mittetaandava suhkru hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute summaarse kontsentratsiooni määramisel segus. Töös kasutasime kompleksomeetrilist meetodit, milles põhireaktiiviks on -triloon-B kompleks (tugevalt aluseline). Seda valmistatakse , ja triloon-B lahustest (siin kasutan eelnevalt valmistatud segu). Sellel reaktiivil on antud töös 2 rolli: · inaktiveerib invertaasi (kompleksil on kõrge pH), kuna invertaasi , · tagab taandavate suhkrute määramiseks leeliselist kekkonda ja vask()-triloon B kompleksi.
molekule: invertaas -D-fruktofuranosi id +H2O ,D-fruktoos +mono- või oligosahhariid Looduses levinuim -D-fruktofuranosiid on sahharoos, tema hüdrolüüsiproduktideks on -D- fruktoos ja -D-glükoos. Sahharoos hüdrolüüsub invertaasi toimel vastavalt reaktsioonivõrrandile: Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Tekkinud reaktsiooniproduktide (glükoosi ja fruktoosi) kindlakstegemiseks kasutatakse nn kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kompleks moodustub CuSO4 ja triloon B ekvimoraalsete hulkade ühendamisel. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline
Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutasin kompleksomeetrilist meetodit. Põhireaktiivis on selles meetodis tugevalt aluseline lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Sellel reaktiivil on käesoleva meetodi läbiviimisel kaks ülesannet: 1) ta lõpetab ensüümireaktsiooni, kuna toimub tugevalt aluseline reaktsioon, mis mõjub invertaasile inaktiveerivalt 2) ta tagab leeliselise keskkonna ja vask(II) triloon B kompleksi, mis on vajalik taandavate suhkrute määramiseks. Reaktsioonisegu, mis sisaldab taandavaid suhkruid peab kuumutama, sest siis taandub Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)- eks ning moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B-d, tänu millele saabki suhkrute kontsentratsiooni määrata. Keemisel toimuv reaktsioon: CH2N(CH2COO)2Cu R C + CH2N(CH2COO)2Cu + 4Na+ + 4OH- R C +
YAGB21 112262 ja täiendada. 09.04. M.K. 3. Biokatalüüs 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine · Töö teoreetilised alused Töö eesmärk oli määrata invertaasi aktiivsus. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhines sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Kasutasin kvantitatiivset meetodit tiitrimist. Antud töös leidis kasutamist nn kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiv sisaldas vask(II)-triloon B kompleksi ja oli tugevalt aluselise reaktsiooniga. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud taandavate suhkrutega proovi viisin komplekslahusesse. Seal olev vask(II)-triloon B kompleks laguneb
Töö käik: Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimine: pipeteerisin 100 ml katseklaasi 25 ml 7 %-list sahharoosi lahust (substraat, mille pH on atsetaatpuhvriga reguleeritud väärtusele 4,8) ja asetasin selle vesitermostaati 30C juurde soojenema (10 minutit). Valmistasin uuritava invertaasi lahuse: kasutasin tahket invertaasi (Invertaas, 3.2.1.26), valmistasin 5 ml lahust kontsentratsiooniga 2-3 mg/ml selleks võtsin 0,0140 g invertaasi ja lahustasin selle puhvris. Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute määramiseks: pipeteerisin kolme 250 ml koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust. Soojenenud sahharoosi lahusele lisasin 1 ml uuritavat lahust, loksutasin ja käivitasin stopperi. Koheselt peale ensüümi lisamist võtsin 1 ml hüdrolüüsisegu ja lisasin ühte komplekslahuse kolbi (0-proov). 10 ja 20 minuti pärast võtsin uuesti 1 ml hüdrolüüsisegu ja lisasin ülejäänud kahte komplekslahust sisaldavasse kolbi.
-D-glükoos. Hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude pool t (oluline seedeensüüm!!!) toodetava invertaasi toimel vastavalt reaktsioonivõrrandile: Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi. INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMISE MEETOD: - Põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariiidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel - Vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide (glükoosi ja fruktoosi) koguse kindlakstegemiseks kasutatavad meetodid: 1. KOMPLEKSOMEETRILINE MEETOD: - Põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga
· Saharoos kõige levinum looduses -D-fruktofuranosiid. Hüdrolüüsi produktideks on -D- fruktoos ja -D-glükoos. · Invertaas on väga oluline inimese seedeensüüm. Saharoos hüdrolüüsib peensoole limaskesta rakkude poolt doodetava invertasi toimel. · Invertaasi aktiivsuse määramise meetod sahharoosi(mittetaandav suhkur) hüdrolüüsi uuritava invertaasipreparaadi timel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. · Hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide koguse kindlakstegemiseks kasutatakse erinevaid meetodid. Meie töös me kasutame kompleksomeetrilist meetod. Põhireaktiiviks on aluseline lahus , mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleks. Reaktiiv täidab 2 rolli: 1) tänu aluselisele keskonnale inaktiveerib ta invertaasi, 2) tagab taandavate suhkrute määramiseks vajalikuleeliselise
Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos, mis koosneb ,D-glükoosist ja ,D-fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed. Inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi aktiivuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus. Vastavalt toodud skeemile leiab invertaasi toimel aset sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon. Tekkinud reaktsiooniproduktide (glükoosi ja fruktoosi) kindlakstegemiseks
taandavat suhkrut (kutsub esile 1 mol sahharoosi hüdrolüüsi). Töö käik: Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võtsin 50 ml katseklaasi, kuhu pipeteeritisin 25 ml 7 % sahharoosi lahust (substraati), mille pH oli atsetaatpuhvri abil reguleeritud sobivale väärtusele. Lahuse asetasin termostaati 30°C juures soojenema kümneks minutiks. Valmistasin uuritava invertaasi lahuse: kasutasin vedelat invertaasi . Võtsin seda 0,3 ml, invertaasi lahust kokku oli 9 ml. Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteerisin kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml 10 ml komplekslahust. Substraadi lahusele lisasin 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi lahust. Loksutasin ja fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse. Kuiva pipetiga võtsin kohe pärast ensüümi lisamist 1 ml hüdrolüüsisegu ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteerisin 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ning 20 min pärast 1 ml kolmandasse
kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. 1 Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Tiitrimisel toimub reaktsioon: Tiitrimiseks kulunud CuSO4 hulga järgi leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivus avaldatakse tahke preparaadi korral mikrokatalites 1 g kohta (µkat/g). Töö käik Tahkest ensüümipreparaadist valmistati kontsentratsiooniga 4-5 mg/ml töölahus. Selleks võeti 0,0245 g tahket invertaasi preparaati, mis lahustati 5 ml atsetaatpuhvris, mille ph oli 4,8. 50 ml katseklaasi pipeteeriti 25 ml 7% sahharoosi lahust atsetaatpuhvris (ph 4,8). Katseklaas suleti
Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoosSahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel vastavalt reaktsioonivõrrandile: Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Antud töös leiab kasutamist nn kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Nimetatud kompleks valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola. Tiitrimisel toimuv reaktsioon on järgmine:
produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed ja mesilased. Inimese jaoks on invertaas oluline seedeensüüm. Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel vastavalt reaktsioonivõrrandile: Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi a fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks viiakse kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid, komplekslahusesse (triloon B). Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses
Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos, mis koosneb ,D-glükoosist ja ,D- fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed. Inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi aktiivuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus. Vastavalt toodud skeemile leiab invertaasi toimel aset sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon. Tekkinud reaktsiooniproduktide (glükoosi ja fruktoosi) kindlakstegemiseks kasutatakse siin nn kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kompleks moodustub CuSO4 ja triloon B ekvimoraalsete hulkade ühendamisel
Sahharoos on looduses levinuim -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi toodavad pärmid, hallitusseened, taimed ja mesilased. Inimesele on ta oluline seedeensüüm. Invertaasi aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina tavaliselt sahharoosi. Meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsoonisegus. Antud töös kasutatakse glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemisel kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, milles on taandavad suhkrud, viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)- ks ja Cu2O eraldub punaka sademena.
Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos, mis koosneb ,D-glükoosist ja ,D- fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed. Inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi aktiivuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse Kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Vask(II)-triloon B kompleks täidab vaadeldava meetodi puhul kahesugust rolli: · tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pHopt 4,8,
Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib beeta, D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni vastavalt skeemile: , D - fruktofuranosiid + H2O alkohol + fruktoos Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus. Vastavatalt toodud skeemile leiab invertaasi toimel aset sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon. Tekkinud reaktsiooniproduktide, glükoosi ja fruktoosi, koguse kindlaks tegemiseks kasutatakse antud töös kompleksomeetrilist meetodit, kus põhiliseks reaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi.
hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib fruktoosi sisaldavate süsivesikute hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: -D-fruktofuranosiid + H2O , D-fruktoos + mono- või oligosahhariid Invertaas on oluliseks seedeensüümiks. Teda produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed ja ka mesilased. Aktiivsuse määramisel on reeglina substraadiks sahharoos kui mittetaandatav suhkur. Selle hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus põhinebki invertaasi aktiivuse määramise meetod. Töö käik · Invertaasi preparaat, mis kaalutakse analüütilisel kaalul, lahjendatakse atsetaatpuhvriga (pH 4,8) 1 : 50. (0,02 ml preparaati ja u 10 ml atsetaatpuhvrit). Loksutatakse hoolikalt ühtlase segu tekkimiseni. · 50 ml katseklaasi pipeteeritakse 25 ml substraati ( 7 % sahharoosi lahus
ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Saadud produktide koguse kindlaks määramiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks tugevalt aluseline lahus, kus on vask(II)-triloon B kompleks. Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile muudab ta invertaasi, mille pH opt=4,8, inaktiivseks ja lõpetab ensüümireaktsiooni. Samas tagab ta ka taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldav proov viiakse komplekslahusesse ning keedetakse, mille käigus taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena sadenev Cu2O ning lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B:
kontsentratsiooni määramine tehakse kindlaks kompleksomeetrilisel meetodil, kus põhireaktiiv, mis on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, sisaldab vask(II)- triloon B kompleksi. Kompleks valmistatakse Na 2CO3 lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA-Na –d (etüleen-diamiintetraäädikhappe dinaatriumi sool). Kuna see lahus on tugevalt aluseline ning invertaasi optimaalne pH on 4,8, siis mõjub see lahus inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. Samuti on taandavate suhkrute määramiseks vajalik leeliseline keskkond ja vask(II)-triloon B kompleks. Reaktsioonisegust kindlal ajahetkel võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub kompleksis sisalduv vask(II) suhkrute toimel vask(I)-ks. Seejärel moodustub Cu 2O, seda on näha punase sademena, mis tekib sinise lahuse põhja. Ekvivalentses koguses jääb lahusesse vaba triloon B. Vabanenud triloon B tiitritakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega. Stöhhiomeetrilise
kindlakstegemiseks võib kasutada mitmeid meetodeid. Antud töös kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi (valmistatakse kõrge konsentratsiooniga lahuses, võttes üks ühele hulga ja triloon-B). Antud reaktiiv täidab kahte rolli: · Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile mille pH 4,8 inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. · Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)- triloon B kompleksi. Taandavaid suhkruid sisaldav reaktsioonisegust võetud proov viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine
Fikseerisin titrandi kulu, kui märkasin esimest värvi muutust, lõplikult määrasin titrandi kulu kindlaks sellega, kui titrandi lisamisel enam roheline toon ei kadunud, vaid jäi püsima. Tiitrimistulemused: V1 = 11,5 mL (0-proov) V2 = 24,6 mL (ensüümireaktsiooni algusest 10 min-proov) V3 = 35,8 mL (ensüümireaktsioonialgusest 20 min-proov) Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimisgraafikult taandavate suhkrute sisalduse mg-des 1 mL-s reaktsioonisegust võetud proovis. C1 = 10,2 mg/L C2 = 21,6 mg/L C3 = 31,6 mg/L Vedela invertaasi preparaadi uurmisel avaldatakse aktiivsus ensüümipreparaadi 1 mL kohta (kat/mL). Aktiivsuse arvutus: , kus C1 taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml C2 taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/mL V1 reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, mL V2 ensüümi töölahuse üldmaht, mL 103 tegur üleminekuks mikrogrammidele
Teoreerilied alused. Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib , D fruktofuranoosiide hüdrolüüsi: , D fruktofuranoosiide + H2O alkohol + fruktoos Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, aga ka paljud taimed. Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisele uuuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisele reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüs invertaasi toimel. Glükoosi ja fruktoosi koguse kinladktegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Põhireaktiiv tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II) triloon B konpleksi. Leeliseline komplekslahus toimib invertaasile inaktiveerivalt (kuna invertaasile on vaja happelist keskkonda) ja lõpetab reaktsiooni.
Mureksiid annab lahustele violetse värvuse. Kolbides olevate lahuste tiitrimine toimub 0,02 M Cu 2SO4 lahusega, kuni violetne värvus muutub püsivaks rohekaks värvuseks. Titrandi kulu fikseeritakse kohe kui värvus natukenegi muutub. Kui roheline värv kaob lisatakse titranti veel ettevaatlikult tilk haaval ja kui värvus jääb püsima fikseeritakse lõplik kulu. Tiitrimiseks kulunud 0,02M Cu2SO4 lahuse mahu järgi leitakse kaliibrimisgraafiku järgi taandavate suhkrute sisaldus proovides. Inveraati preparaadi aktsiivsus (A) arvutatakse: C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0 – proovis C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis V1 – reaktsioonisegu üldmaht V2 – ensüümi töölahuse üldmaht 103 - tegur üleminekuks mikrogrammidele T – hüdrolüüsi kestus 180 – glükoosi molekulmass V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks V4 – ensüümreaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht
hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist otsmisi fruktoosi molekule. Inimese jaoks on invertaas oluline seedeensüüm (sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskestal). Samuti kasutatakse meie töös substraadina sahharoosi, mille hüdrolüüsiproduktideks on glükoos ja fruktoos. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Töös leiab kasutamist kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon-B kompleksi. Reaktiiv lõpetab ensüümireaktsiooni ja tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena eralduv Cu2O
reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2Co3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja tekib punane Cu2O sade. Keetmisel toimub reaktsioon näeb välja nii: Sellele järgneb triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M CuSO4 lahust. Tiitrimisel komplekseerub triloon B Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimist saab
Tiitrisin seni, kuni violetne värvus asendus samblarohelisega. Tiitrimisele kulunud 0,02M CuSO4 lahuse hulga järgi leitsin kaliibrimiskõveralt taandavate suhkrute sisalduse proovis. Tiitrimisel saadud andmed: 0-proov: 1,5ml 0,02M CuSO4 lahust Suhkru kontsentratsioon: 1,3mg/ml 10min-proov: 22,4ml 0,02M CuSO4 lahust Suhkru kontsentratsioon: 19,8mg/ml Arvutused Invertiini aktiivsus arvutan valemi järgi. (C1 - C 2 ) * V1 *1000 A= T *180 * V2 * V3 Kus, C1 : Taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis: 19,8 C 2 : Taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis: 1,3 V1 : Hüdrolüüsisegu üldmaht: 26ml 1000: tegur üleminekuks mikrogrammidele T: Hüdrolüüsi kestvus: 600s 180: Glükoosi moolmass V2 : Proovi maht taandavate suhkrute määramiseks: 1ml V3 : Uurimiseks võetud invertaasi lahuse maht: 0,5ml Invertiini aktiivsuse arvutamine: (19,8 - 1,3) * 26 * 1000 A= = 8,9 µkat / ml 600 * 180 * 1 * 0,5
reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ning moodustub punane Cu2O sade. Keetmisel toimub järgnev reaktisoon: Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust. Lahusesse lisatakse ka indikaatorina mureksiidi, mis muudab värvi triloon B ja
reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO 4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ning moodustub punane Cu2O sade. Keetmisel toimub järgnev reaktisoon: Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust. Lahusesse lisatakse ka indikaatorina mureksiidi, mis muudab värvi triloon B ja Cu(II)-ioonide kompleksi taastekkimisel
molekule: Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktoduranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed, aga ka mesilased. Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüsi küigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse nn kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Nimetatud kompleks valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes
uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi (taandavad) summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Lühidalt, oma sõnadega kirjutada, millel baseerub antud katses kompleksomeetriline meetod. Põhireaktiiviks on aluseline lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi, mis toimib invertaasile inaktiveerivalt (see lõpetab ensüümireaktsiooni) ning tagab ka taandavate suhkrute määramiseks vajaliku aluselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Hiljem (keetmisel) taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks (suhkrute toimel), Cu 2O eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mille koguse saab määrata tiitrimise teel vasksulfaadi lahusega, kui vabanenud triloon B komplekseerub uuesti vasega (on märgatav mureksiidi värvuse muutuse tõttu). Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
fruktofuranosidaas, on ensüüm, mis kuulub glükoosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist -fruktoosi molekule. Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsoonisegus. Antud töös kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt
Loksutan, kuni kristallsed ained lahustuvad. Hoian reaktsioonisegu 40 minutit keevas veevannis, aeg-ajalt loksutades. Kuum reaktsioonisegu jahutan jäävannis. Järeldus: Moodustunud katseklaasis kristallide kuju tehakse kindlaks mikroskoobis. Saadud osasoonid (all) on peaaegu võrdsed osasooniga toodud juhendis. 1.2.3. Hõbepeegli reaktsioon. Aldehüüdrühm, mis sisaldub taandavate suhkrude molekulides, taandab mitmete metallide sooli. Tolli reagendist (ammoniakaalne hõbenitraadi lahus) sadestub metalliline hõbe aldehüüdide, seega ka taandavate suhkrute toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli. Töö käik: Valan katseklaasi 1 ml 1%-list AgNO3 lahust. Lisan katseklaasi 0,5 ml konts. NH4OH lahust. Loksutan. Lisan 1 ml glükoosi lahust. Loksutan hoolega ja soojendan ettevaatlikult veevannis. Järeldus:
Kõige sagedamini esineb sellistest süsivesikutest looduses sahharoosi, mille hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on E-D-fruktoos ja α-D-glükoos. Seega kasutatakse enamasti invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel substraadina just sahharoosi. Sahharoos -> glükoos + fruktoos Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määrmaisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse määramiseks võetakse põhireaktiiviks tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proovid viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub vask ja moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mille kogus
Kui segus on redutseeruv suhkur siis hõbeda ammoniakaalsest lahusest sadestub metall klaasi pinnale hõbekihina. Töö käik Valasin katseklaasi 1ml 1% AgNO3 ja 0,5ml NH4OH lahust. Seejärel lisasin 1ml glükoosi lahust ning kuumutasin vesivannil. Kuumutamisel sadestus Ag põhja ning moodustas hõbepeegli, kuna glükoos on taandav suhkur ning taandas Ag välja. Selle katsega on võimalik kindlaks teha taandavate suhkute olemasolu lahuses. Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahusega Taandavate suhkrute määramiseks kasutatakse Fehlingi reaktiivi, mis redutseeruvate suhkrute korral annab lahusesse punase sademe. Sahharoos Fehlingi reaktiiviga ei reageeri, küll aga tema hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos. Sahharoosi hüdrolüüsi saab kiirendada ensümaatiliselt või happe toimel Töö käik
Segu kuumutati ~40 min keeval veevannil kuni osasoonide moodustumiseni. Osasoonide kuju vaadeldi mikroskoobis. Tulemus: Glükoosi lahuses tekkisid osasoonid kiiresti, laktoosi lahusest osasoone saada ei õnnestunud. 4 1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli. Ammoniakaalsest AgNO3 lahusest sadestub metalliline hõbe taandavate suhkrute toimel välja ning katseklaasi seinale moodustub peegel. Töö käik: 1 ml 1% AgNO3 lahusele lisati 0,5 ml NH4OH lahust, loksutati. Lisati 1 ml glükoosi lahust ning segu soojendati veevannis. Tulemus: Taandunud hõbe sadestus õrnalt katseklaasi seintele Järeldus: Glükoosis sisaldub aldehüüdrühm, mis redutseeris metalli AgNO3 lahusest AgNO3 ja NH3 baasil tekkiv [Ag(NH3)2]+ (diammiinhõbe) 1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega
uuritava lahuse piirpinnale purpurne vahekiht. Osasoonide saamine: Osasoonideks nim redutseeriva e taandava suhkru ja kahe kolekuli fenüülhüdrasiini liitumise produkti. Osasoone annavad kõrvuti monoosidega ka taandavad oligosahhariidid. Osasoonid kristalluvad lahustes kergesti , kristallide kuju ja sulamistemp on lähtesuhkrule iseloomulikud ja võimaldavad seda idenfitseerida. Tänapäeval kas suhkrute eristamiseks kromotograafilisi meetodeid. Hõbepeegli reaktsioon: taandavate suhkrite molekulides sisalduv aldehüüdrühm redutseerib ( taandab) mitmete metallide sooli. Hõbeda ammoniakaalsest lahusest sadestub metall klaasi pinnale peeglina. Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahusega: taandavate suhkrute määramisel on üheks tavalisemaks reaktiiviks fehlingi reaktiiv, mis saadakse CuSO4vesilahuse ja leeliselise kaalium.naatriumtartraadi kokkusegamisel ( Fehlingi i ja F II lahuse kokkusegamisel. Tekkiv
ei suutnud tilkhaaval korrektselt väävelhapet lisada või segunesid hape ja proov omavahel. 1.2.2 Osasoonide saamine Osasoonid süsivesikute derivaadid, mis tekivad taandava suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Osasoonid kristalluvad lahustest hästi välja, tekkivate kristallide kuju ja sulamistemperatuur on lähtesuhkrule iseloomulikud. Reaktsioon vajab fenüülhürdasiini liiga ja pikemaajalist kuumutamist. Töö käik: Kahte katseklaasi valada 2 ml erinevate taandavate suhkrute lahust, lisada 0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ning 0,2 g kristallilist naatriumatsetaati. Loksutada, kuni tahked ained on lahustunud. Hoida reaktsioonisegu 40 minutit keevas vesivannis, aeg-ajalt loksutada ning lõpuks jahutada jäävannis. Katseklaasidesse moodustuvad osasoonid, mis lahusest välja kristalluvad, vaja kindlaks teha osasoonide kristallide kuju mikroskoobis. Tulemus: Kasutasin taandavate suhkrutena oma katses fruktoosi ja glükoosi. Fruktoosiga tuli
violetse tooni. 7. Alustada tiitrimist 0,02M CuSO4 lahusega kuni violetset tooni asendab rohekas toon. Kui rohekas toon on ilmunud kohe kirja panna vasksulfaadi lahuse ruumala mis kulus tiitrimiseks. Pärast lisada paar tilka vasksulfaadi lahust juurde, et kindlas teha õige ruumala. 7 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Martin Tamm (121006YASB) Biokeemia protokoll 8. Ära määrata taandavate suhkrute sisaldus lahustes kasutades kalibreerimissirget mida saab juhendaja käest. 9. Arvutada ära invertaasi aktiivsus kasutades järgmist valemit: A= [(C2-C1) x V1 x V2 x 103] / (T x 180 x V3 x V4 x g) Kus, C2 taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml C1 taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml V1 reaktsioonisegu üldmaht, ml V2 ensüümi töölahuse üldmaht, ml 103 tegur üleminekuks mikrogrammidele
Moodustunud osasoonide kristallide kuju tehakse kindlaks mikroskoobis. Järeldus: Nii Laktoosi kui ka maltoosi ossasoonide kristallide kuju sarnaesid piltidel olevatele näidetele. Maltoosi puhul tekkis erinevus sellega, et kristallid olid rohkem omavahel reas. 1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide soolasid. Ammoniakaalsest AgNo3 lahusest sadestub metalliline hõbe taandavate suhkrute toimel välja ning katseklaasi seinale moodustub peegel. 8 Töö käik: Katseklaasi valatame 1ml 1%-list AgNO3 lahust, lisatame 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH lahust ja loksutatakse. Seejärel lisame 1 ml glükoosi lahust, segu loksutatakse ja soojendame veevannis. Tulemus: Esimese korraga tekkis tumehall sade ja väga vähe peeglit, seega kordasin katset uuesti
Lisasin mõlemasse ~0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja ~0,2 g kristallilist naatriumatsetaati, loksutasin, kuni tahked ained lahustusid. Hoidsin segusid 40 minutit keevas veevannis, loksutasin aeg-ajalt, seejärel jahutasin jäävannis. Katseklaasi moodustusid suhkrute kollased kristallid. Järeldus: kuna osasoone moodustuvavad monoosid ja taandavad oligosahhariidid, siis kinnitas osasoonide moodustumine, et glükoos ja arabinoos kuuluvad glükooside ja taandavate oligosahhariidide hulka. Fruktoos Glükoos Maltoos Laktoos Kõige tihedamalt paiknesid koos laktoosi kristallid, mis koosnesid lühikestest üksteise kõrval asuvatest kristallidest. Kõige pikemad kristallid olid glükoosil, mis olid koondunud puntidesse. Fruktoosi kristallid paiknesid üsna hõredalt puntides. Maltoosi kristallid olid erineva pikkusega ning paiknesid preparaadiklaasil laiali.
ning vaadatakse mikroskoobis kristallide kuju. ning vaadatakse mikroskoobis kristallide kuju. Tulemus: Tekkisid küll õrnad kristallid, kuid mikroskoobi all neid näha ei olnud võimalik. Näiteid osasoonide kristallidest: glükoos 1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli. Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest(Tolleni reagent) sadestub metalliline hõbe taandavate suhkrute toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli. Töö käik: Katseklaasi valatakse 1 ml 1%-list AgNO3 lahust, lisatakse 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH lahust. Seejärel lisatakse 1 ml glükoosi lahust. Loksutatakse hoolikalt ning soojendatakse veevannis. Tulemus: Katse ebaõnnestus. Klaasi tekkis hall hägu. See oli arvatavasti tingitud katseklaasi mustusest. Õnnestunud katse korral oleks taandunud hõbe sadestanud klaasi seintele peeglina ning näinud välja järgmine:
TÖÖ 1: AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA Juhendajad: Kaia Kukk Priit Eek 1.1. Valkude reaktsioonid 1.1.1. Biureedireaktsioon Ühendid, mis sisaldavad kaht või enamat peptiidsidet, moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+ ioonidega violetse kompleksi. Kuna biureedireaktsioon on tingitud peptiidsidemete esinemisest, siis on ta valkude üldreaktsioon. Leeliselises keskkonnas moodustub valgumolekuliga sinakasvioletne biureetkompleks. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses. Töö käik Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust. Lisatakse 1 ml 10% NaOH lahust ja mõni tilk 1% CuSO4 lahust. Loksutatakse. Reaktsioonisegu muutub lillakaks, mille põhjustavad biureetkompleksid. Järeldus Lillakas (violetne) värvus kinnitab pika...
Mõne aja pärast hõbeda kiht hakkas tuhmuma ja kadus uuesti. Järeldus: Taandunud hõbeda sadenemine näitab, et glükoosi molekulides sisaldub aldehüüdrühm, mille toimel sadestub ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest metalliline hõbe välja. 1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega Fehlingi reaktiivi ehk leeliselist vask(II) tartraatkompleksi, mis saadakse Fehlingi I ja Fehlingi II lahuse kokkusegamisel, kasutatakse taandavate suhkrute määramiseks. Tekib vask(II)-tartaatkompleks, mis reageerib aldooside või ketoosidega. Vaba aldehüüd- või ketorühma toimel vask taansub ja tekib vask(I)oksiid, mis on punase värvusega ja sadeneb lahusest välja. Sahharoos ei reageeri Fehlingi reaktiiviga, kuna ta pole taandav suhkur, küll aga reageerivad sahharoosi hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos. Sahharoosi hüdrolüüsi nimetatakse inversiooniks ja glükoosi ja fruktoosi ekvimolaarset segu
kogustega liialdamine. 1.2.4.Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahusega 8 Eda Türi 142281 YAGB21 Teoreetilised alused Fehlingi reaktiivi ehk leeliselist vask(II)tartraatkompleksi, mis saadakse Fehlingi I ja Fehlingi II lahuse kokku segamisel, kasutatakse taandavate suhkrute määramiseks. Tekib vask(II)tartaatkompleks, mis reageerib aldooside või ketoosidega. Vaba aldehüüd-või ketorühma toimel vask taandub ja tekib vask(I)oksiid, mis on punase värvusega ja sadeneb lahusest välja. Reaktsioonivõrrandist pilt biokeemia laboratoorsete tööde juhendist Saharoos ei reageeri Fehlingi reaktiiviga, kuna ta pole taandav suhkur, küll aga reageerivad saharoosi hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos
Reaktsioonisegu hoitame 40 minutit keevas veevannis, aegajalt loksutades ja jahutatakse jäävannis. Moodustunud osasoonide kristallide kuju tehakse kindlaks mikroskoobis. Tulemus: Laktoosi lahusest saadud kristallid olid terava otsaga ja pikad. Reeglina mitte! Eksisin, see käib pigem glükoosi kristallide kohta.Laktoosi omad on ovaalse kujuga. Keskel olid nad tihedalt kokku põimunud ning meenutasid siili okkaid. Galaktoosi lahuse kristallid olid gruppideks koondunud. Tegemist on taandavate suhkrutega. Kristallide pildid? 1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli. Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest sadestub metalliline hõbe aldehüüdide taandavate suhkrute toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli. Tolleni reaktiivis on aktiivseks komponendiks AgNO3 ja NH3 baasil tekkiv diammiinhõbe(I) [Ag(NH3)2]+.
3. Biokatalüüs 3.5. Glükoosi sisalduse määramine ensümaatilisel meetodil. Tallinn 2010 3. BIOKATALÜÜS 3.5 GLÜKOOSI SISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL Glükoosi sisalduse määramiseks kasutatakse meetodit, mis põhineb kahe ensüümi glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel. GODi spetsiifilisus substraadi suhtes annab võimaluse määrata glükoosisisaldust ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul. GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. See ensüüm sisaldab endas prosteetilise grupina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koeensüüm. Selle kaasabil kantakse glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit hapnikule. Toimub glükoosi oksüdeerumine glükoonhappeks ja tekib vesinikperoksiid. Seejärel osaleb POD, katalüüsides spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist
Teooria. Glukoosisisalduse kvantitatiivseks maaramiseks bioloogilistes vedelikes kasutatakse laialdaselt ensumaatilist meetodit, mis pohineb kahe ensuumiglukoosi oksudaasi (GOD) ja peroksudaasi (POD) kasutamisel. Tanu GOD-i substraadispetsiifilisele b, D-glukoosi suhtes voimaldab see meetod maarata glukoosisisaldust ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul. GOD kujutab endast liitvalku- flavoproteiini, sisaldades proteetilise grupina FAD, mis toimub kui koensuum. Ta oksudeerib glukoos glukoonhappeks ja tekib viimasega ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. +O2 (GOD FAD->FADH2) +H2O COOH-(HCOH)4-CH2OH +H2O2 POD on koostiselt liitvalk kromoproteiin, mis sisaldab prosteetilise ruhma heemi. POD kataluusib spetsiifiliste substraatide oksudeerumist. Reaktsiooni pohimotteline skeem on
Glükoosi osasoonid meenutasid mikroskoobi all pikki ja teravaid oksakimpe ning neid oli võrreldes arabinoosi osasoonidega väga hästi näha. Arabinoosi osasoonid olid läbi mikroskoobi vaadates tunduvalt heledamad ning teistsuguse kujuga, koondunud kollakate täpikestena. 1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli. Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest sadestub metalliline hõbe aldehüüdide, seega ka taandavate suhkrute toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli. Reaktiivis on aktiivseks komponendiks AgNO3 ja NH3 baasil tekkiv diammiinhõbe(I). Töö käik: · pestud katseklaasi valasin 1 ml 1%-list AgNO3 lahust · lisasin 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH lahust ning loksutasin · lisasin 1 ml glükoosi lahust ning loksutasin uuesti · soojendasin veevannis Tulemused ja järeldused:
annaabi.ee 
Sisene Facebook'ga
Sisene Google'ga
Sisene LinkedIn'ga
