Geelkromatograafia (0)

1 Hindamata

Töö teoreetilised alused
Geelkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest , mille põhimõte seisneb lahuses sisalduvate ainete lahutamises (ehk fraktsioneerimises) nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvad erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise poorse geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafia meetodit kasutatakse makromolekulide (biopolümeeride) lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.
Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis – kolonnis, mis on täidetud pundunud geelgraanulitega, mille poorid on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide mõõtmetega.
Geelkromatograafias kasutatakse geele, mis koosnevad dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad mahud:

kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht) VV
graanulitesisese vedeliku maht VS
geelmaatriksi maht Vg
täidise kogumaht Vt

Kui kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele ehk vastavalt võimele difundeeruda geeli pooridesse. Kolonni voolutatakse sobiva vesilahusega, et ainete segu läbi kolonni transportida. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimismaht Vx. Kui segus leidub molekule, mis ei mahu geeli pooridesse, siis need väljuvad kolonnist esimesena, minimaalse elueerimismahuga Vxmin , mis on võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = VV. Geeli pooridesse difundeeruvad täielikult ained, mille molekulmass on väike, nad liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on arvuliselt lähedane kolonni kogumahule Vt. Seega võib kromatograafilise protsessi lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud vedeliku üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.
Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust.
Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraktsioonikogurist. Selles praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge nii, et selle alla mahuks katseklaas . Täidise kõrgus on tavaliselt 25-30 cm, täidise kohal umbes 3-4 cm kõrgune vaba eluendi kiht. Eluendi lisamine ja fraktsioonide kogumine toimub käsitsi.
Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit.

Töö käik
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine:

kontrollitakse ja vajadusel korrigeeritakse kolonni asendit
märgitakse üles Sephadex täidise mark ja pundumistegur k
mõõdetakse geelsamba kõrgus L ja diameeter d
arvutatakse täidise kogumaht Vt
arvutatakse geelmaatriksi maht Vg = k*Vt ja maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt – Vg
arvutatakse fraktsioonide arv n, kui ühe fraktsiooni mahuks võetakse 2 ml, n = Vxmax / 2
võetakse vastav hulk 2 ml-ga märgistatud ja nummerdatud katseklaase
läheduses hoitakse voolutuslahuse pudel koos sobiva pipetiga, märgitakse üles voolutuslahuse koostis
varutakse väike keeduklaas , kuhu kogutakse täidise pinnal olev eluent , mis enne uuritava segu sisestamist väljutatakse kolonnist

Segu komponentide lahutamine:

avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirust
kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava
kogutud lahust pole vaja säilitada

Proovi sisestamine :

pipeti või süstlaga võetakse juhendaja poolt soovitud kogus uuritavat proovi ja viiakse kolonni
proov lastakse voolata geeli pinnale nii, et see võimalikult ühtlaselt jaotuks

Kolonni voolutamine:

kui proov on sisestatud, avatakse väljavooluava ning lisatakse vähehaaval eluenti, kuni proov on täidisesse imbunud
pärast seda võib kolonni lisada juba suurema koguse eluenti
puhtasse kuiva kolbi hakatakse koguma ühendatud fraktsiooni
kui dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, eemaldatakse kolb ja hakatakse katseklaasidesse koguma fraktsioone 2 ml kaupa
elueerimise võib lõpetada, kui eluaat on muutunud värvituks

Fraktsioonide analüüsimine:

aine kontsentratsiooni väljendatakse igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel
absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetril
värviliste segude puhu mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorptsiooni, milles võib täheldada vähimatki värvust
koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mille alusel tehakse kromatogramm

Tulemused

kolonni iseloomustavad parameetrid
Täidise materjal ja mark: Dekstraan, Sephadex G-75
Pundumistegur: k = 0,1
Täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L = 26,3; d = 1,8
Täidise kogumaht: Vt = 66,93
Geelmaatriksi maht: Vg = k*Vt = 0,1*66,93 = 6,69
Arvutatud maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = Vt – Vg = 66,93 – 6,69 = 60,24
Arvutatud fraktsioonide üldarv: n = Vxmax / 2 = 60,24 / 2 = 30,12 (30 fraktsiooni)

Mõõtmistulemuste tabel ja kromatogramm
Fraktsiooni nr
Elueerimismaht
V, ml
Optiline tihedus, A
Lainepikkus
nm
Ühendatud fraktsioon
19,5
1
21,5
0,058
670
2
23,5
0,371
670
3
25,5
0,400
670
4
27,5
0,102
670
5
29,5
1,679
410
6
31,5
3,0
410
7
33,5
3,0
410
8
35,5
2,753
410
9
37,5
1,546
410
10
39,5
0,599
410
11
41,5
0,178
410
12
43,5
0,051
410
13
45.5
0,024
410
14
47,5
0,001
410
15
49,5
0
360
16
51,5
0
360
17
53,5
0
360
18
55,5
0,023
360
19
57,5
0,094
360
20
59,5
0,383
360
21
61,5
0,851
360
22
63,5
1,308
360
23
65,5
1,364
360
24
67,5
0,975
360
25
69,5
0,484
360
26
71,5
0,186
360
27
73,5
0,056
360
28
75,5
0,033
360

Kromatogrammilt:
Komponentide elueerumisprofiilid:
Dekstraansinine (: A = 0,400; eluaadi maht V = 25,5 ml
Müoglobiin (: A = 3,0; eluaadi maht V = 33,5 ml
DNP- aspartaat (: A = 1,364; eluaadi maht V = 65,5 ml
Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, mis tõestab, et sellel on kõige suurem molekulmass. Tänu sellele ei difundeerunud ta geeli pooridesse, vaid väljus kolonnist graanulite vahelt minimaalse elueerimismahuga, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni:
Vxmin = 25,5 ml.
Järgmisena väljus kolonnist müoglobiin, mis on molekulmassi suuruselt teine pärast dekstraansinist. Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vx = 33,5 ml.
Viimasena väljus kolonnist DNP-aspartaat, mis näitab seda, et selle aine molekulmass on kõige väiksem, st küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse. Seetõttu liigub ta kolonnis kõige aeglasemalt ja väljub maksimaalse elueerimismahuga. Eluaadi maht kuni kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vxmax = 65,5 ml.

Viimasena väljunud komponendi elueerimismahu võrdlemine arvutusliku Vxmax-ga
Viimasena väljunud komponendi elueerimismaht on V = 65,5 ml, arvutuslikult tuli Vxmax = 60,24. Erinevus on ~5 ml, mis võis tingitud olla näiteks geeli või täidise mahtude arvutamisel tekkinud ebatäpsustest, kuna joonlauaga ei pruukinud geeli samba kõrguse ja diameetri mõõtmistulemused olla väga täpsed.

Liikuvusteguri Rf väärtuse leidmine segus sisaldunud valgu jaoks
Rf = (Vx – Vxmin)/(Vxmax – Vxmin) = (33,5 – 25,5)/(60,24 – 25,5) = 8/34,74 = 0,23

.DOCX Laadi alla originaalfail 5 lk · .docx · 4 allalaadimist

10 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 10 punkti.

~ 5 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2014-05-12 Kuupäev, millal dokument üles laeti

4 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

mellu5 Õppematerjali autor

Biokeemia praktikumi protokoll 2.1. Arvestatud esimese korraga.

molekulmass proov elueerimismaht kromatograafia geelkromatograafia

Sarnased õppematerjalid

pdf

2.1 Geelkromatograafia

YKL0060 Biokeemia Töö nr 2.1 Ainete lahutamine geelkromatograafia meetodil Yasb 21 Juhendaja Tiina Randla 17.02.2012 Teooria Geelkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine ehk fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Erineva molekulaarmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Meetodit kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite ja soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kus proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis kolonnis, mis on täidetud pundunud

rekursiooni- ja keerukusteooria

pdf

AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL

TTÜ keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool YKL0060 Biokeemia Laboratoorne töö nr: Töö pealkiri: 2.2 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Õpperühm: Töö teostaja: YAGB22 MIHKEL HEINMAA Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: MALLE KREEN 1/03/2010 15/03/2010 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL (2.2) TEOORIA

Biokeemia

docx

2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil - Biokeemia labori protokoll

Tallinna Tehnikaülikool 2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Geelkromatograafia on kromatograafia meetod, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine. Ained fraktsioneeritakse nende molekulmassi järgi, see tähendab, et erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Proovi transportimine läbi kolonni toimub vesilahuse abil. Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis kolonnis. Kolonn on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on vastavuses lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega

Biokeemia

docx

Geelkromatograafia

- Vedelikkromatograafiat - Ioniiti - Ülekriitilise fluidumi kromatograafiat - Biospetsiifilist sorbenti - Poorset geeli - Kandja pooridesse seotud vedelikku Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest, kasutatakse erinevaid kromatograafia liike: Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse aminohapete, valkude, süsivesikute, lipiidide jt biomolekulide segude lahutamisel. Kromatograafilist protsessi võib läbi viia nii kinnises süsteemis kolonnis (kolonnkromatograafia) kui ka lahtises süsteemis: paberil või kromatograafilisel plaadil (planaarkromatograafia). KOLONNKROMATOGRAAFIA: Kolonnkromatograafia võimaldab lahutada suuremaid ainehulki kui planaarkromatograafia.

Keemia

docx

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

TTÜ Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool YKL0061 Biokeemia I Laboratoorne töö Töö pealkiri: nr. 2 2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Õpperühm: Töö teostaja: YAFB21 Jana Sarnavskaja(YAFB163900) Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: Protokoll Tiina Randla 20.02.2017 05.03.2017 arvestatud: 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Kromatograadia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel.

Keemia

odt

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

2.1Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil. Sissejuhatus Geelkromatograafia põhimõtteks on lahuse sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Protsess viiakse läbi kolonnis, mis on täidetud pundunud geelikraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega. Geelikraanuli pooride suurust ületavate mõõtmetega molekulid ei saa graanulitesse tungida. Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad mahud -kolonni vaba

Biokeemia

docx

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

Tallinna Tehnikaülikool Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Laboratoorne töö 2.1 Üliõpilane: Rühm: Juhendaja: Tallinn Teooria Geelkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine e fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega.

Biokeemia

doc

Geelkromatograafia

TTÜ Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool YKL0060 Laboratoorne töö: nr. 4 Töö pealkiri: 2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Õpperühm: YAGB22 Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: 12.04.2010 Protokoll esitatud: 16.05.2010 2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Töö teoreetilised alused: Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on segu komponentide lahutamise ehk fraktsioneerimise meetod, mis põhineb aine molekulmassidel ja nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise , võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub

Biokeemia

Rohkem sarnaseid