Geelkromatograafia (0)

Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö nr 2.1.
Geelkromatograafia
Anastassia Fedtšenko(120821)
YAGB21
Palun teha parandused .
07.03. M.K.
Õppejõud: Malle Kreen, Priit Eek
Protokoll esitatud: 04.03.2013
Protokoll arvestatud:.........................
2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE
2. A Kromatograafilised meetodid
Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval
jaotumisel liikuva, mida nimetatakse ka mobiilseks faasiks, ja liikumatu, mida saab nimetada ka statsionaarseks, faasi vahel.
Mobiilse faasi agregaatolekust sõltuvalt eristatakse gaasi-, vedelik- ja ülekriitilise fluidumi
kromatograafiat. Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist
sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse
faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest eristatakse
järgmisi kromatograafia liike:
• jaotuskromatograafia,
• adsorptsioonkromatograafia,
• afiinsuskromatograafia,
• ioonvahetuskromatograafia,
• geelkromatograafia.
Kromatograafiat kasutatakse lipiidi, süsivesikute, valgude, aminohappete jt biomolekulide lahutamiseks.Kromatograafiat võib teha kas kinnises süsteemis – kolonnis (kolonnkromatograafia), või lahtises süsteemis – paberil või kromatograafilisel plaadil(nt. planaarkromatograafia).
Pole vaja siin korrata juhendit!
Jaotuskromatograafia aluseks on lahutuvate ainete jaotumine kahe mitteseguneva vedelikule vedelfaasil või statsionaarsel vedelfaasi ja gaasifaasi, tänu sellele, et neil on erinev lahustuvus neis faasides . Statsionaarset faasi pestakse järjest uute mobiilse
faasi kogustega, kuni lahutatavad ained jagunevad lahusti erinevatesse portsjonitesse.
Tänu segu komponentide jaotuskoefitsientide erinevusele leiabki aset nende eraldumine
üksteisest. Segu komponendi A üleminek statsionaarsest faasist mobiilsesse faasi kirjeldub
tasakaaluvōrrandiga:
CA stats ↔ CA mob, kus
CA stats – aine A tasakaalukontsentratsioon statsionaarses faasis
CA mob – aine A tasakaalukontsentratsioon mobiilses faasis
Jaotuskoefitsienti Kd võib defineerida kui selle protsessi tasakaalukonstanti, mis avaldub
ühendi A tasakaalukontsentratsioonide suhtena erinevates faasides:
CA stats Kd = CA mob
Kolonnkromatograafia võimaldab lahutada suuremaid ainehulki. Tahke materjaliga , nt. tärklis, mida kasutatakse statsionaarseks faasiks, uuritav segu sisestatakse pakitud kolonni. Kolonni voolutatakse lahustite seguga , mida nimetatakse voolutiks või eluendiks. Tavaliselt, sisalduvate ühendite lahustuvused mobiilses ja statsionaarses faasis on erinevad, sega nad liikuvad kolonnis erineva kiirusega ja väljuvad kolonnist erinevatel aegadel. Vedeliku, mis väljub kolonnist, nimetatakse eluaadiks. Seda vedelikku kogutakse ja üksikute fraktsioonidena segu komponendid lahutatakse.
Kolonnkromatograafia hōlmab ka meetodeid , mille abil uuritav segu lahutatakse
komponentideks vastavalt nende erinevale liikuvusele poorses, vees lahustumatus
keskkonnas ehk maatriksis. Tänu komponentide erinevale afiinsusele tahke maatriksi ja
mobiilse faasi (vedelik, gaas ) suhtes toimub nende lahutumine. Nähtusteks, mis kutsuvad
esile afiinsuse statsionaarse faasi suhtes, on adsorptsioon (lahutatava
segu komponentide erinevale seostumisvõimele tahke adsorbendiga (statsionaarne faas),
milleks on mõni peeneteraline materjal – alumiiniumoksiid , silikageel, tärklis, tselluloos ,
tseoliit , aktiivsüsi vmt.) ja ioonvahetus (lahutatavas segus sisalduvate ioonide pöörduval
vahetumisel statsionaarse faasina kasutatava polümeerse vaigu ( ioonvahetaja ) ioonide vastu. Selle kromatograafia meetodi aluseks on statsionaarse faasi ja lahutatava
segu ioonide elektrostaatiline vastastoime).
Geelkromatograafia meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte
meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus
olevate ainete molekulmasside erinevusele.
Afiinsuskromatograafia on kromatograafia liik, millega segu lahutamine toimub tänu
kitsalt spetsiifilistele interaktsioonidele, nagu antigeen- antikeha , ensüüm- substraat või
retseptor -ligand vastastoime. Afiinsuskromatograafiat kasutatakse mingi komponendi
väljapuhastamiseks segust puhverlahusesse ja kontsentreerimiseks, mingi komponendi sisalduse vähendamiseks segus või ligandide otsimiseks. Statsionaarse faasina
kasutatakse tavaliselt geelimaatriksit (enamasti agaroosi), kuhu on kinnitatud ligand, millele
seostub spetsiifiliselt mingi uuritava segu komponent .
Selles töös ma hakkan kasutama geelkromatograafiat, seega tahaks sellest täpsemalt kirjutada.
2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Geelkromatograafia on üks kromatograafilist meetodist, mida kasutatakse erineva molekulmassiga ainete lahutamiseks. Kuna ainetel on erinevad molekulmassid liiguvad nad läbi poorsuse geeli erineva kiirusega ning sellest põhineb geelkromatograafia meetod. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kusjuures proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.
Kuidas toimub geelkromatograafia?
Geelkromatograafiat viiakse läbi kinnises süsteemis – kolonnis. Kolonni sisse pannakse poorset geeli, mis kujutab ennast väikesed ümarad graanulid . Geelid, mida kasutatakse geelkromatograafias, koosnnevad dekstraanist (glükoosi polümeer, mida sünteesib bakter Leuconostoc mesenteroides), agaroosist (lineaarne punavetikate polüsahhariid, mis koosneb D-galaktoosist ja 3,6-anhüdro-L-galaktoosist) vōi
polüakrüülamiidist. Viimane on kopolümeer, mille akrüülamiidist (CH2=CH-CO-NH2) koosnevate lineaarsete ahelate vahele on tekitatud ristsidemed N,N'-metüleen-bisakrüülamiidi (CH2=CH-CO-HN-CH2-NH-CO-CH=CH2) abil.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

• kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv),
  
• graanulitesisese vedeliku maht (Vs),
  
• geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg),
  
• täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt).
  

Seega:
Vt = Vv + Vs + Vg
Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx,
mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva
molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne.
Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht,
mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on
maksimaalne.
Kui segus on molekulid, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis see aine väljub kolonnist esimesena ning see aine väljuvad minimaalse elueerimismahuga (Vmin), mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga.
Vx min = Vv
Aine, mis jõuab kolonnist viimasena, väljub maksimaalse elueerimismahuga(Vxmax). Selle aine molekulid on küllaltki väiksed, et täielikult difundeeruda geeli pooridess ning liiguvad aeglasem , kui teiste ainete molekulid. See maht on peaaegu võrdne kasutava kolonni kogumahuga(Vt).
Vx max ≅ Vt
Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vōib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka
arvutada.
Vxmax = Vt – Vg
Seega – kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte
olulist parameetrit:

• kolonni vaba mahtu Vv (Vx min), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis
  

antud geeli pooridesse ei mahu,

• maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad
  

need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad.
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille
elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse
liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile:
Rf = Vx – Vxmin / Vxmax – Vxmin
Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 Kromatogreerimissüsteem
Tüüpiline kromatogeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja kollektorist(fraktsioonikogur). Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgemal asetseva eluendi reservuaariga. Sellisel juhul algab kolonni väljavoolukraani avamisel kohe eluendi pealevool kolonni täidisele ja fraktsioonikoguri käivitamisel ka automaatne fraktsioonide kogumine. Sellel praktikumil aga kasutasin mitte autoaatne kromatogrageerimissüsteem.
Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis juba eelnevalt on täidetud pundunud
dekstraangeeliga Sephadex. Meie töös uuritavate ainesegude lahutamiseks sobivad
reeglina väiksema poorsusega (tihedamad) Sephadex’i margid , mis on samas ka
mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni kiiret voolutamist. Vältimaks täidise
väljavoolamist on kolonni alumine, kooniline osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatudstatiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas.
Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse
käesolevas töös spektrofotomeetrilist meetodit
Töö käik
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine
• Kontrollisin kolonni vertikaalsust.
• Märgisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda iseloomustav
tegur k, mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest ning sain teada et see on võrdne 0,1-ga.

• Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrgus L ja ja diameeter d, kasutades sobivat
  

joonlauda. Sain, et L=31cm ja d=1,8 cm
• Arvutasin täidise kogumaht Vt
Selleks, et leida kogumahu, tuleb esiteks leida aluse pindala:
S = πr2 = π • 0,92 ⩰ 2,54cm2
Ning arvutasin kogumaht:
Vt = S • L = 2,54 • 31 ⩰ 78,88cm3
• Arvutasin geelimaatriksi maht Vg = k • Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav
maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt – Vg:
Vg = 0,1 • 78.88 = 7,89 cm3
Vxmax = 78,88 – 7,89 = 70,99cm3
Selline täpsus pole õigustatud!
• Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega
n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,45
• Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi
(2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin.
• Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega
voolutuslahust kolonni viia.
• Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise
pinnal olev eluent , mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta.
Segu komponentide lahutamine.
Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma. Sellel ajal reguleesin kolonni voolukiirus , et tilkus 0,7-1ml lahust minutis.
Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulesin kiiresti kolonni väljavooluava ning
kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks. Seda vedelikku ei pea mõõta ja arvutada Vt leidmisel.
Proovi sisestasmine
Ning ,kui ma reguleerisin voolukiirust, saab kolonni uuritavat lahust panna. Selleks võtan 0,5ml lahust ja ettevaatlikult, kasutades pipeti, voolan kolloni. Pipeti ots peab olema 5mm kaugusele geeli pinnast. Proov lasen voolata geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt
jaotuks. Proovi sisestamise ajal hoian kolonni väljavooluava suletuna!
Hea lahutuvuse saavutamiseks tuleb silmas pidada järgmist:
• Enne proovi pealekandmist peab kolonn olema tasakaalustatud puhvriga, milles
segu lahutamine läbi viiakse. Antud praktikumis on kolonnid eelnevalt tasakaalustatud.
• Proovi optimaalne maht on 0,5–5% täidise koguruumalast. Milline teie töös?
• Geelkromatograafia meetodi puhul proov lahjeneb lahutamise käigus.
Uuritavad segud
Reeglina koosnevad segud 3–4 erineva molekulmassiga komponendist , mis on lahustatud
destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates
segudes on kas kõik ained värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam.
Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud dekstraansinist(6mg/ml), mis
elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba
mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2•106), mille
külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi λmax
lainepikkusel 625 nm.
Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel ∼ 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga tähtis inimese kehas, kuna ta on skellet- ja südamelihase hapnik-siduv valk.
Kolmas komponent, millel on kõige väiksem molekulmass oli DNP – aspasrtaamaspartaat, so asparagiinhappe dinitrofenüülderivaat t(0,6 mg/ml)
Aspartaami kasutatakse suhkru asendajaks.
Tema molekulmass on 294,301 g/mol
Aspartaami lahusel on kollane värv.
Tema neeldusmaksimum on lainepikkusel ∼ 360 nm.
Kolonni voolutamine.
Kui kõik uuritav segu jõuab geeli sisse, saab lisada voolutit 4-5cm kõrgusega ja avata väljavooluavat. Ning mõne aega pärast, segu hakkab lahutama : allpool on dekstraansinine, keskel müoglobiin ja üleval on kollase värvusega DNP- aspartaam . See on sellepärast, et kõige suurem molekulmass on dekstraansinisel st. 2•106, ning müoglobiini molekulmass on 16800 ja aspartaami mass on kõige väiksem st 294,301. Kui dekstraansinine jõuab kolonni põhjale siis hakatakse eluaadi kogumist 2ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt
nummerdatud katseklaasidesse.
Kogu voolutamise vältel tuleb

• jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele
  

juurde lisada,

• vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml
  

fraktsioonide kaupa.
Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste
proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti maht st Vv = 23 cm3. NB! See ei ole kolonni vaba maht, vaid nn ühendatud fraktsioon, mis moodustab vaid osa Vv-st!
Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu
Fraktsioonide analüüsimine
Antud töös väljendasin aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk
optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval
lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel.
Ning alustasin mõõtmisest lainepikkusega 670nm. Esiteks mõõtsin kolbide optilist tihedust sinise värvusega, ehk dekstraansinisega. Ning kui adsorbtsiooni näitaja jäi võrdseks nulliga, siis reguleerisin spektrofotomeetri nii, et lainepikkus saaks võrdseks 410nm-ga. Kui adsorbtsiooni näitaja jälle sai võrdseks nulliga, reguleerisin lainepikkust nii, et oleks 360nm.
Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone
pole vaja mõõta.
Fraktsiooi nr
Elueerimismaht
Optiline tihedus
Ühendatud fraktsioon
23 cm3
0
1
25cm3
0,283 λ=670nm
2
27cm3
0,226
3
29cm3
0,264
4
31cm3
1,110
5
33cm3
1,790
6
35cm3
1,405 λ=420nm
7
37cm3
0,644
8
39cm3
0,225
9
41cm3
0,080
10
43cm3
0,035
11
45cm3
0 Värvitu
12
47cm3
0
13
49cm3
0
14
51cm3
0
15
53cm3
0
16
55cm3
0
17
57cm3
0,123
18
59cm3
0,579
19
61cm3
1,514
20
63cm3
2,571
21
65cm3
2,709 λ=360nm
22
67cm3
1,904
23
69cm3
0,870
24
71cm3
0,256
25
73cm3
0,059
26
75cm3
0
Viimase komponendi elueerimismaht on 65 cm3 ning arvutuslik Vxmax on võrdne 70,99 cm3-ga. Elueerimismaht on väiksem. Selle põhjuseks võib olla see, et voolukiirus oli liiga suur ning aine ei lahutanud nii hästi. Teiseks põhjuseks võib olla see, et mingid mõõtmeid tegin valesti.
Ning, kui kõik vajalikud mõõtmed on leitud, saab leida Rf, ehk liikuvusteguri väärtus segus sisaldunud valgu jaoks kasutades Rf arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust:
Rf = Vx – Vxmin / Vxmax – Vxmin = (33 – 25) /( 70,99 – 25 )= 0,17