Polümeerid
Monomeerideks monosahhariidide molekulide
jäägid (vesi eraldunud)
Ühendatud glükosiidsidemetega
Rohkem kui 10 lüli
Homopolüsahhariidid ja heteropolüsahhariidid
Omadused sõltuvad keemilise koostisest molekuli
struktuurist
Bioloogiline ja majanduslik tähtsus
Annavad rakkudele tugevuse (tselluloos,
hemitselluloos, kitiin, pektiin)
Energiaallikas (tärklis, glükogeen)
Rakkude deformeerumist takistavad (dekstriinid)
Paksendajad (agaroos, pektiin)
Kütus, keemiatööstus, paber, bioetanool
Tselluloos
Looduslik kiudaine rakukestades
Levinuim orgaaniline aine Maal (33%)
Oluline taastuv loodusressurss: süsinikuringe,
energiaallikas, keemiatööstus, paber
Ahel ei hargne
(C6H10O5)n, 7000
· Polüsahhariid on näiteks toidus olev tärklis, tselluloos, inuliin ning glükogeen. · Inimtoidu põhiline polüsahhariid on tärklis (seedub peensooles). Saab jagada kolmeks: 1)Struktuursed polüsahhariidid - millest bakterid, taimed, vetikad jne. moodusavad omale rakukestad. Nt. tselluloos 2)Varupolüsahhariidid- mille varal loomad ja taimed loovad energiavarusid. Nt. tärklis ja glükogeen 3)Muud ül. Polüsahhariidid. Tarretise valmistamine- vetikatest saadav agar, agaroos või algiin. TÄRKLIS · Kasutatakse: toiduainete paksendajana, tärklisesiirupi valmistamisel, suhkru asendajana, kangaste viimistlemiseks. · Vees ei lahustu, vaid tekitab soojendamisel tärkliseklistiistri. Kõik
Inkubeeri 30 min jääl, vahete-vahel segades. (3) Teosta "heat shock", viies tuub 5 minutiks 37 oC juurde; seejärel tagasi jääle. (4) Lisa 180 l LB söödet, sega korralikult ning inkubeeri 37 oC 30 min (segamisega või ilma). Inkubeerimise ajal valmista LB-Ampitsillini Petri tassid (vt. p5 allpool) (5) Kahesajale milliliitrile LB söötmele lisa 3g Bacto-Agarit ja keeda mikrolaineahjus kuni agari täieliku sulamiseni (ettevaatust, agaroos võib kergesti üle keeda. Selleks, et seda ei juhtuks, vali sobiva suurusega klaaskolb ja ahju reziim ning sega sagedasti). Seda tööd teosta grupi (~10 üliõpilast) peale juhendaja juuresolekul. Arvuta: Kui palju on vaja võtta ampitsilliini kontsentratsiooniga 100 mg/ml 200 ml LB söötme kohta, et selle lõppkontsentratsioon oleks 100 g/ml? 200 l (100*200ml/100000ml) 5
"Heat shock" viie minuti jooksul suurendab transformeerituse taset umbes 4 korda. (4) Lisa 180 l LB söödet, sega korralikult ning inkubeeri 37 oC 30 min (segamisega või ilma). (Segamine teeme sõrmega, kuna sees on elav rakkud.) Inkubeerimise ajal valmista LB-Ampitsillini Petri tassid (vt. p5 allpool) (5) Kahesajale milliliitrile LB söötmele lisa 3g Bacto-Agarit ja keeda mikrolaineahjus kuni agari täieliku sulamiseni (ettevaatust, agaroos võib kergesti üle keeda. Selleks, et seda ei juhtuks, vali sobiva suurusega klaaskolb ja ahju reziim ning sega sagedasti). Seda tööd teosta grupi (~10 üliõpilast) peale juhendaja juuresolekul. Arvuta: Kui palju on vaja võtta ampitsilliini kontsentratsiooniga 100 mg/ml 300 ml LB söötme kohta, et selle lõppkontsentratsioon oleks 100 g/ml? 100mg/ml100000 µg/ml 4 C1· C2 V1· V2 (6) Jahuta LB-agar 50-60 oC vesivannis alla ja seejärel lisa antibiootikum (Amp, 100 mg/ml)
Plükondensatsiooni igal sammul eraldub vee molekul, ka polüsahhariidi tekkel eraldub igas astmes vesi. Polüsahhariidi hüdrolüüsil ühineb iga lüliga vee molekul ja niiviisi taastuvad monomeerid. Polüsahhariidi jaotus: Struktuursed polüsahhariidid (bakterid, taimed, vetikad, seened ehitavad oma rakukesta. nt tselluloos) Varupolüsahhariidid (energiavarud. nt tärklis, glükogeen) Muude ül polüsahhariidid (pektiinid tekitavad tarretist, agar/agaroos/algiin tarretise või marmelaadi valmistamiseks) Tselluloos on ehitatud -glükoosi jääkidest. Sirge ahel koosneb tuhandetest lülidest, polümeeri molaarmass võib ulatuda üle miljoni ühiku. Tselluloosi pikad molekulid ühinevad vesiniksidemete abil, nii moodustuvad tselluloosi kiud, mis on taimerakkude ehitusmaterjaliks. Tselluloos on paljude materjalide tootmise lähte aineks (nt paber, etanool). Hüdrofiilne. Natuke tselluloosi toidus on normaalseks seedimiseks vajalik.
Loksutatakse ja segatakse Vortexil. Iga kultuuri puhul kasutatakse uut pipetiotsikut. Rep-PCR viiakse läbi eelnevalt valmistatud Mastermixi segu kasutades. Mastermixi segu jaotatakse PCR katsutitesse. Igasse katsutisse lisatakse 1 l kultuurisuspensiooni ja kontrollproovi pipeteeritakse 1 l MilliQ vett. Proovid tsentrifuugitakse ja asetatakse termotsüklerisse PCR reaktsiooni läbiviimiseks. PCR kestab tunde, seepärast jäetakse proovid üleöö reageerima ja järgmisel päeval viiakse läbi agaroos- geelelektroforees. Selleks valmistatakse geel, mille sisse tehakse süvendid proovide ja markerite jaoks. Geeli ühte auku kantakse 5 l proovi. Markerite jaoks mõeldud pesadesse pannakse 3 l markerit. Geeli voolutatakse 60 minutit. Seejärel visualiseeritakse UV laual ja tehakse foto. Uuritakse vöötkoode: kas ja kuivõrd on vöötide mustri alusel võimalik teha järeldusi mikroorganismide suguluse kohta. Püütakse tuvastada samasse liiki kuuluvate
Loksutatakse ja segatakse Vortexil. Iga kultuuri puhul kasutatakse uut pipetiotsikut. Rep-PCR viiakse läbi eelnevalt valmistatud Mastermixi segu kasutades. Mastermixi segu jaotatakse PCR katsutitesse. Igasse katsutisse lisatakse 1 l kultuurisuspensiooni ja kontrollproovi pipeteeritakse 1 l MilliQ vett. Proovid tsentrifuugitakse ja asetatakse termotsüklerisse PCR reaktsiooni läbiviimiseks. PCR kestab tunde, seepärast jäetakse proovid üleöö reageerima ja järgmisel päeval viiakse läbi agaroos- geelelektroforees. Selleks valmistatakse geel, mille sisse tehakse süvendid proovide ja markerite jaoks. Geeli ühte auku kantakse 5 l proovi. Markerite jaoks mõeldud pesadesse pannakse 3 l markerit. Geeli voolutatakse 60 minutit. Seejärel visualiseeritakse UV laual ja tehakse foto. Uuritakse vöötkoode: kas ja kuivõrd on vöötide mustri alusel võimalik teha järeldusi mikroorganismide suguluse kohta. Püütakse tuvastada samasse liiki kuuluvate
praimerite paari, mitme erineva mikroobi tuvastamiseks samast DNA proovist 20. Mille poolest erineb real-time PCR tavalisest PCR-ist?- võimaldab hinnata algmaterjali kogust, nt. DNA koopia arvu meid huvitavas lookuses. Kasutatakse veel kolmandat praimerit, mille ühes otsas on fluorestsents märgis ja teises nn summutaja. On võimalik kasutada ka kaheahelalise DNA-ga seonduvaid värve. 21. Kuidas on võimalik PCR-iga paljundatud DNAt visualiseerida?- agaroos sulatatakse puhvris->geeli valades pannakse paika geelikamm->tardunud geeli korral kamm eemaldatakse->tekkinud süvenditesse valatakse DNA->Geel valatakse puhvriga üle->DNA koos glütserooli sisaldava värvainega pannakse süvendi põhja-> DNA on negat. Laenguga ja elektri väljas liigub pluss laengu suunas->DNA on värvitu, selle nägemiseks lisatakse sageli etiidiumbromiidi, mis seostub
Alates 2. punktist tsüklid korduvad veel 21 kord. Sellega DNA ahela paljundamine toimub ekpotentsiaalselt. 2.2 Praktikum – geeli valmimine Esialgu tuleb valida mille kontsentratsiooniga geeli on vaja valmistada. Kuna mul oli tegu lühe DNA lõiguga (335 bp), valisin PCRi produkti detekteerimiseks 1,5% geeli. Geelistavaks aineks on agaroos, mis on pärit vetikatest. Segasime kokku 100 ml 1x TAE puhvrit ja 1,5 g agaroosi. Kuna agaroos ei lahustu hästi, kuumutame segu mikrolaineahis keemiseni (mitte päris keemiseni, et ei keeks üle!) ja vahepael loksutame ringjate liigutusega kuni kõik agaroos on sulanud ja lahus on homogeenne. Pärast jätame segu jahtuma tasakesi 5
Korduste arv sõltub sellest, kui palju on vaja DNA-d saada, samas liiga palju tsükleid suurendab vigade tõenäosust. c) Geelipildilt on näha, et PCR on tõenäoliselt ebaõnnestunud, kuna bändi pole näha (peaks olema noolega märgitud kohas). Põhjuseks võib olla ebatäpsus. Edasiseks tööks sain L-Envo pEGFP-C2. 2. PCR-i produkti puhastamine a) Kaalusime 1,5g agaroosi, viisime mahu TAE puhvriga 100ml-ni ja kuumutasime segu mikrolaineahjus, kuni agaroos täielikult lahustus. Seejärel jahutasime lahust ringjate liigutustega loksutades. Jahtunud segule lisasime 0,5l EtBr, loksutasime ning valasime lahuse geelialusele. Lasime geelil tarduda. b) Kuna produktide pikkus varieerus 300-2000 bp vahel, siis valmistasime 1,5% agaroos geeli. Mida pikemad produktid, seda lahjem peab olema geel, ning vastupidi. c) Kontrollgeeli valasime selleks, et hinnata, kas puhastamine on olnud efektiivne. Kui segusse
elektroforeesi. Elektroforees DNA ja RNA on negatiivse laenguga ja seetõttu liiguvad elektriväljas negatiivse elektroodi katoodi poolt positiivse elektroodi anoodi suunas. Nukleiinhapete elektroforeesil lahutatakse erineva suurusega DNA fragmentide segu vastavalt fragmentide suurustele ja võrreldakse neid mingi standardiga e. markeriga. Elektroforeesil liiguvad nukleiinhapped elektrivälja mõjul spetsiaalses keskkonnas geelis. Kaks tüüpilist foreesikeskkonda on: 1. Polüakrüülamiid 2. Agaroos Polüakrüülamiid on sünteetiline polümeer, mis moodustab poorse struktuuriga erineva läbimõõduga tunnelite labürindi. Kasutatakse lühikeste DNA/RNA fragmentide (5-500 bp) lahutamiseks. Polüakrüülamiidgeel elektroforees võib olla: • Vertikaalne ühedimensiooniline • Vertikaalne kahedimensiooniline • Horisontaalne Agaroos on lineaarne polümeer, mis koosneb D- ja L-galaktoosi jääkidest. Agaroosi ahelad
TTÜ | MIHKEL HEINMAA | MMIX SÜGIS Enamus tänapäeva punavetikaid on hulkraksed. Punavetikad on eelkõige merevee liigid ja magevees leidub harva. Sugulise paljunemisega. Värvus on tingitud fükobiliinidest, mis annab roosaka mustja tooni. Nad on väga olulised elupaikade loojad ookeanide põhjas. Sisaladavad sellist polüsahhariidi nagu agaroos, mida kasutatakse marmelaadi valmistamiseks aga ka tardsöötmete valmistamisel igasuguste bakterite jaoks. Rohevetikad. Jaotatakse kolmeks rühmaks. Väga laialt levinud. Nende hulgas on üherakulis liike, koloniaalseid ja hulkrakseid. Tõnäoliselt esineb nende hulgas sekundaarset üherakulisust: liike, mille esivanemad olid hulkraksed, kuid tänapäevaks evolutsioneerunud üherakuliseks. Ikkesvetikate hõimkond oleks polüfeneetiline hõimkond erinevate
jaotumises kahefaasilises süsteemis. Kromatograafiat kasutatakse, et eraldada segunenud ained üksteisest. Siinkohal siis on vaja valgud eemaldada lahusest e rakuekstraktist. Ioonvahetuskromatograafia, õhukese kihi kromatograafia, pöördfaaskromatograafia, geelfiltratsioonkromatograafia. Geelelektroforeesi põhimõte – lahutamine poorses keskkonnas elektrivälja toimel. Kasutatavad polüakrüülamiid geel ja agaroos. Isoelektriline fokuseerimine. Biomolekulide detekteerimise meetodid geelis. Geel värvitakse valgu spetsiifilise värviga/spets antikehad. 11. Nukleotiidid Nukleiinhapped on biomakromolekulid, milles nukleotiidijäägid on seostunud fosfodiestersidemega. Inimkehas on kaks nukleiinhapet – DNA ja RNA. Nukleotiidid on nukleiinhapete monomeerid, rakus esinevad anioonidena, on happed. Nukleotiid koosneb lämmastikalusest (N-alustest, pentoosist ja ühest või enamast
Kromatograafiat kasutatakse, et eraldada segunenud ained üksteisest. Siinkohal siis on vaja valgud eemaldada lahusest e rakuekstraktist. Ioonvahetuskromatograafia (laeng), õhukese kihi kromatograafia, pöördfaaskromatograafia, geelfiltratsioonkromatograafia (valkude sadestumine suuruse järgi. Geelelektroforeesi põhimõte lahutamine poorses keskkonnas elektrivälja toimel. (1 aine liigub teiste suhtes, liikuma panev jõud- elekter). Kasutatavad polüakrüülamiid geel ja agaroos. Isoelektriline fokuseerimine. Biomolekulide detekteerimise meetodid geelis. Geel värvitakse valgu spetsiifilise värviga/spets antikehad. Geeli sisu peab olema aluseline, kõik valgud aluselises KK on neg. laenguga- ioonid liiguvad 11. Nukleotiidid Nukleiinhapped on biomakromolekulid, milles nukleotiidijäägid on seostunud fosfodiestersidemega. Inimkehas on kaks nukleiinhapet DNA ja RNA. Nukleotiid koosneb lämmastikalusest (N-alustest, pentoosist ja ühest või
Toiduks : loomadele & inimestele, paljudes rahvusköökides (supid, salatid, sushi) Sisaldab vitamiine, mineraalaineid ja mikrotoitaineid. Väetiseks põldudel. Suurim hapnikutootja. Pruunvetikad-ainult hulkraksed, kasvult kõige suuremad. Elavad enamasti jahedates meredes, kuni 15 m sügavusel. Nt põisadru, lehtadru. Kasut. Söödajahu valmistamisel, väetisena, meditsiinis, toiduks. Punavetikad-enamus troopilistes meredes, hulkraksed, magevees pole. Kasvavad kuni 60 m sügavusel. N: agarik-agaroos-marmelaad. Orgaanilise aine tootja, toiduks, vee looduslik isepuhastumine, meditsiinis, mikrobioloogias, toiduainete-, tsulluloosi- ja tekstiilitööstuses, valmistatakse vetikajahu, väetisena. Ainurakseid vetikaid on kõige rohkem. Osa moodustavad kolooniaid, mida on võimalik näha palja silmaga. Tähtsus looduses-fotosünteesides rikastavad vett hapnikuga, toodavad o2 ka atmosfääri, kõik toiduahelad vees algavad vetikaga, esmase orgaanilise aine tootja vees. 2
tüpiseerimisel. 40. Elektroforees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10 ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 40. Nukleiinhapete hübridiseerimine NH hübridiseerimine pôhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerumise fenomenil, mis seisneb selles, et teatud tingimustel denatureeritud NH ahelad on vôimelised uuesti renatureeruma ja moodustama ka vabade komplementaarsete NH ahelatega topeltahelaid.
ainete koguseid (enamasti mikrogrammides) ja eesmärk on määrata komponentide suhteline sisaldus segus. 49. Elektroforees. Geelelektroforees on tänapäeval võimas rutiinne meetod erineva suuruse ja laenguga makromolekulide eraldamiseks. DNA molekulid on negatiivselt laetud ja liiguvad geelelektroforeesil elektroodilt + elektroodile. Kuivõrd DNA molekulidel on massist otsesõltuv laeng, siis sõltub nukleiinhapete liikuvus agaroos- ja polüamiidgeelis eelkõige nende suurusest. Need gelid on molekulaarseks sõelaks, kus suuremad fragmendid liiguvad aeglasemalt ja väiksemad kiiremini. Agaroosgeele on parem kasutada suuremate DNA fragmentide eraldamiseks, polüakrüülamiidgeele aga väikeste DNA lõikude ja valkude puhul. Polüakrüülamiidgeelis on nukleiinhappel laengu esinemise tõttu väikseimaks
tüpiseerimisel. 40. Elektroforees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10 ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 40. Nukleiinhapete hübridiseerimine NH hübridiseerimine pôhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerumise fenomenil, mis seisneb selles, et teatud tingimustel denatureeritud NH ahelad on vôimelised uuesti renatureeruma ja moodustama ka vabade komplementaarsete NH ahelatega topeltahelaid.
44. Elektroforees – selle kohta ka Pata slaidides Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10– ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 45. Nukleiinhapete hübridiseerimine Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutates komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist. - Geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon)membraanile, nii et nad oleksid üksikahelad
44. Elektroforees selle kohta ka Pata slaidides Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10 ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 45. Nukleiinhapete hübridiseerimine Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutates komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist. - Geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon)membraanile, nii et nad oleksid üksikahelad
toestuskomponente puudel ja teistel rohelistel taimedel Kitiin eksoskelett koorikloomadel ja putukatel rakusein seentel Agar ehituslik punavetikates Agaroos Agaropektiin Pektiin ehituslik, tugevdav taimedes Alginaat ehituslik komponent pruunvetikate rakuseintes Peptidoglükaanid ehituslik bakterirakuseintes Mannaan esineb seene rakukestades Galaktaan esineb taime rakukestades
Akrüülamiid P-10 150020000 P-30 240040000 P-100 5000100000 P-300 60000400000 Sepharose 6B 10 0004 · 106 Agaroos 4B 60 00020 · 106 2B 70 00040 · 106 47 Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad mahud Kui läbi geelkromatograafia kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele, st vastavalt molekulide võimele difundeeruda geeli pooridesse
võimalik retentsiooniaeg (olenevalt sellest, kas osakesed läbivad kõikvõimalikud sorbendi poorid või liiguvad ümber sorbendiosakeste). 115. Afiinsuskromatograafia põhimõte. Tahke kandjaga on seotud kovalentselt afiinsusligand (biokeemiline ühend), mis selektiivselt seob teatud proovi komponendid. Ülejäänud proov elueerub kolonnis sorbeerumata. Väga suur selektiivsus, mis on kasulik preparatiivseks tööks. Tahked kandjad on hüdrofoobsed: agaroos, tselluloos, polüakrüülamiid. Ligandid: ensüümid, antikeha. Seotud ühendite elueerimine: ligandi lahuse abil. Kasutatakse biokeemilistes rakendustes, kus analüüt seostub statsionaarse faasiga, kõik muu ei seostu. Valides sobiva eluendi saame analüüdi statsionaarse faasi küljest lahti VEDELIKKROMATOGRAAFIA 116. Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC), selle aparatuur. Ainete eraldamine võib toimuda mitmete erinevate omaduste järgi. Tavalisim: Polaarsus
annaabi.ee 
