Tallinna Tehnikaülikool Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Laboratoorne töö nr 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Tallinn 2013 Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Protreolüütiliste ensüümide esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele. Samas paljud bakteriaalsed proteaasid omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele sidemetele eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Lisaks eristatakse proteaase...
(piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid: · Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 Pro) · Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 Pro) · Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 Pro) Samas aga paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside rühma. Eksopeptidaaside esindajateks on karboksüpeptidaasid (R2 = C-terminaalne aminohape) ja aminopeptidaasid (R1 = N-terminaalne aminohape), mis
Töö 3.2 PROTEAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Marilin Karu 142627YAGB22 Juhendaja: Malle Kreen Töö teoreetilised alused Proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides. E + S = ES = EP -> E + P Töös kasutati proteaasi alkalaas, mis lagundab valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, saades vabu aminohappeid. Alkalaas kuulub endopeptisaaside rühma. Alkalaasi aktiivsuse määramine toimus pH=8,4 juures (boraatpuhvri pH=8,4), mis tähendas, et tegu oli leelisproteaasiga. Substraadiks kasutati kaseiini (2%). See on piima põhivalk, koostiselt fosfoproteiin. Proteaasi aktiivsust määratakse meetodiga, mis põhineb kaseiini hüdrolüüsil alkalaasi toimel ja järgneval TKÄ-ga (trikloroäädikhappega) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil
valkudes ja peptiidides Proteaaside funktsioonid: (füsioloogilised funktsioonid) · Toiduvalkude seedimine · Kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadid (vere hüübimise kaskaad) Piiratud proteolüüsi läbiviivad ensüümid: · Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 Pro · Kümotrüpsiin (R1=Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2Pro) · Pepsiin (R1=Phe, Leu jpt; R2Pro) + bakteriaalsed proteaasid (subtilisiin, savinaas, alkalaas) ENDOPEPTIDAAS ensüüm, mis toimib polüpeptiidahele kesksetele peptiidsidemetele (nt trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, alkalaas, subtilisiin, savinaas) EKSOPEPTIDAAS ensüüm, mis toimib polüpeptiidahele otsmistele peptiidsidemetele.
Osa lõhustavad eelistatult spetiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (s.o. piiratud proteolüüs) ja teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (s.o piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi puhul lõhustavad proteaasid vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, seda viivad läbi trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin. Piiramatul proteolüüsil toimivad proteaasid kõikidele peptiidsidemetele. Subtilisiin, savinaas ja alkalaas lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid. Eristatakse endo- ja eksopeptidaase sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiididele. Endopeptidaasid on trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, subtilisiin, savinaas, alkalaas. Eksopeptidaaside esindajateks on karbosküpeptidaasid ja aminopeptidaasid. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH=2,5), neutraalseid (pH=7,2) ja leelisproteaase (pH=9,0)
2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Õppejõud: Priit Eek, Kaia Kukk Tallinn 2013 Sissejuhatus Laboratoorse töö 3.2 teemaks oli proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine. Töö käigus valmistati töölahus, viidi läbi kaseiini hüdrolüüs (vajasime hüdrolüüsi produkte) ja mõõdeti seejärel reaktsiooniproduktide sisaldust spektrofotomeetril. Katses oli ensüümina kasutusel alkalaas. Teoreetiline osa Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Nad osalevad näiteks toiduvalkude seedimises ja vere hüübimise kaskaadis. Eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase.
· Aromaattuuma omavad aminohapped ( Tyr, Phe, Trp) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm, siis väljendatakse kasieiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentatsioonina mg/ml ja kasutades kaliibrimisgraafikut leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik. · Valmistame proteaasi preparaadist lahuse valmistamine.(Alkalaas) Peab olema sobiv pH (meie juhul aluliseline). Lahuse ensüümi kontsentratsioon on 1,6 mg/ml . Paneme gradueeritud katseklaasi 8 mg ensüümipreparaadi ja lisame puhverlahust 5 milliliitrini. · Võtame suur 50 ml katseklaas ja pipeteerime 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Klaas asutatkse vesitermostaati 30C juurde 10 minutiks soojenema. · Sel ajal võtame 4 katseklaasi ja pipeteerime igaühte 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
........................................................ 6 Järeldus............................................................................................................... 7 Sissejuhatus Laboratoorse töö 3.2 teemaks oli proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine. Töö käigus valmistati töölahus, viidi läbi kaseiini hüdrolüüs (vajasime hüdrolüüsi produkte) ja mõõdeti seejärel reaktsiooniproduktide sisaldust spektrofotomeetril. Katses oli ensüümina kasutusel alkalaas. Teoreetiline osa Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Nad osalevad näiteks toiduvalkude seedimises ja vere hüübimise kaskaadis. Eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase.
(nt vere hüübimise kaskaad). Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi ka produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid: · Trüpsiin · Kümotrüpsiin · Pepsiin Paljud bakteriaalsed proteaasid (nt subtilisiin, savinaas, alkalaas) omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Eristatakse endo ja eksopeptidaase, vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele. Kõik üleval pool nimetatud proteaasid on endopeptidaasid. Eksopeptidaasid on karboksüpeptidaasid ja aminopeptidaasid, mis lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid.
Proteiini kõrge tase uriinis Röntgen - takistused kuseteedes, neerude suurus ja struktuur Väiksem neer - krooniline neeruhaigus Suurem neer - akuutne neerupuudulikkus või obstruktsioon Koeproov neerust, et diagnoosida neeruhaigust, elimineerida teisi akuutseid/kroonilisi neeruhaiguseid Iseärasused Hobusel ja veisel on renaalse asoteemia korral uurea hulga suurenemine minimaalne Kreatiniini hulga suurenemine glomerulaarfiltratsiooni vähenemine Veisel: Metaboolne alkalaas NaCl vähenemine Polüuurilise neerupuudulikkuse puhul hüpokaleemia Oliguurilise neerupuudulikkuse puhul hüperkaleemia Hobune NaCl tõuseb Akuutse neerupuuduse korral - kaltsium madal, fosfaat kõrge Krooniline neerupuudulikkus - hüperkaltseemia ja hüpofosfateemia Renaalne asoteemia võib põhjustada ka mitteregeneratiivset aneemiat erütropoetiini puuduse tõttu Postrenaalse asoteemia indikaatoriks on kliinilised sümptomid ja diagnostilised testid
proteaasi toimel ja sellele järgneval hüdrolüüsiproduktide sisaldus spektofotomeetrilisel määramisel. Töövahendid: Analüütiline kaal, 5 ml mõõtekolb, 50 ml katseklaas, 4 kuiva katseklaasi, kell, pipetid, lehtrid, paberfiltrid, spektromeeter, vesitermostaat, kvartskvürett. Töö käik: Valmistatakse uuritava proteaasi lahus ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris. Selleks kaalutakse analüütilisel kaalul 0,0051 g ensüümipreparaati, milleks oli alkalaas, ja seejärel viiakse kvantitatiivselt 5 ml mõõtekolbi. Lisatakse väike kogus boraatpuhvrit ja loksutatakse, kuni ensüüm on lahustunud. Seejärel täidetakse kolb puhverlahusega märgini. Võetakse 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml sobiva pH väärtusega 2% kaseiini lahust ja asetatakse vesitermostaati 30 oC juures umbes 5-10 minutiks soojenema. Siis võetakse 4 kuiva katseklaasi pipeteeritakse igaühte 3 ml 5% TKÄ lahust. TKÄ-d kasutan,
aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, mis produtseerivad enamasti peptiide. Subtilisiin, savinaas ja alkalaas on bakteriaalsed proteaasid, mis lagundavad praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud on endopeptidaasid. Ensüümi toimimise optimaalse keskkonna järgi eristatakse hapusid (pH ~2,5), neutraalseid (pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0).
Biokeemia Laboratoorne töö "Protelüütilise ensüümi ehk proteaasi aktiivuse määramine" Nimi Grupp 1. Töö eesmärk: Määrata antud protelüütilise ensüümi aktiivsust ja teha vastavad arvutused. Ensüüm: Alkalaas 2. Teooria Proteoluutilised ensuumid ehk proteaasid (EC 3.4.4., peptiid - peptiidhudrolaasid) on arvukas ruhm ensuume, mis kataluusivad peptiidsidemete hudroluusi valkudes ja peptiidides.
aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, mis produtseerivad enamasti peptiide. Subtilisiin, savinaas ja alkalaas on bakteriaalsed proteaasid, mis lagundavad praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud on endopeptidaasid. Ensüümi toimimise optimaalse keskkonna järgi eristatakse hapusid (pH ~2,5), neutraalseid (pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0).
ja aminohapped. Kuna proteaas täidab väga paljusid füsioloogilisi funktsioone, leidub seda kõikides organismides. Mõned protelüütilised ensüümid lõhustavad spetsiifilisi peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), mida viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin, ja mõned lõhustavad kõiki peptiidsidemeid (piiramatu proteolüüs), milleks on näiteks paljud bakteriaalsed proteaasid nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt. Proteaase jagatakse ka selle alusel, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele – endo-ja eksopeptidaasid. Ensüümi toimimise järgi jaotuvad need hapudeks (pH=2,5), neutraalseteks (pH=7,2) ja leelisproteaasideks (pH=9,0). Aktiivtsentri ehitusest tuleneb ensüümi toimemehhanism. Neli peamist rühma on seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasid. Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 µkat loetakse sellist ensüümi hulka,
on nad kergesti tuvastatavad spektrofotomeetriliselt. Antud katses väljendatakse kaseiini hüdrolüüsiproduktide sisaldus türosiini kontsentratsiooniga. Kasutades kaliibrimissirget, leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon. Töö käik Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine Valmistada proteaasi preparaadist sobiva pH väärtusega puhvris lahus, ensüümi (antud juhul alkalaas) kontsentratsioon peaks olema lahuses 1-5 mg/ml, antud katses oli ensüümi kontsentratsiooniks 1,56 mg/ml (kaalutis 7,8mg). Kui ensüümpreparaadile on väike kogus puhverlahust lisatud, segada lahust klaaspulgaga u 5 min, kuni ensüüm lahustub. Seejärel täita klaas puhverlahusega ettenähtud mahuni ja loksutada kõik läbi. Ensüümireaktsiooni läbiviimine Võtta 50 ml katseklaas ning pipeteerida sinna 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Sulgeda klaas
peptiide või vabu aminohappeid. Proteaasid on väga levinud kõikides organismides, kuna nad osalevad paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises. Proteolüütilistel ensüümidel on erinevad toimespetsiifikad, osad lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele. Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin, praktiliselt kõiki peptiidsidemeid valkudes lagundavad subtilisiin, savinaas ja alkalaas ning produtseerivad sellega ka vabu aminohappeid. Eristatakse endo- ja eksopeptidaase vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase. Oluliseks proteaaside kvalifikatsiooni aspektiks on aktiivtsentri ehitus ning sellest tulenevalt ka ensüümi toimemehhanism.
peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Erinevad proteaasid omavad ka erinevat toimespetsiifikat. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs). Sellised on näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin, mis produtseerivad põhiliselt peptiide. Samas paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu näiteks subtilisiin, savinaas, alkalaas, omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid ning produtseerides vabu aminohappeid (piiramatu proteolüüs). Olenevalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse vastavalt endo- ja eksopeptidaase. Kõik eelnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside hulka. Eksopeptidaasid on karboksüpeptidaasid ja
(piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid: · Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 Pro) · Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 Pro) · Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 Pro) Samas aga paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Proteaas Endopeptidaas-toimib polüpeptiidahela Eksopeptidaas-toimib polüpeptiidahela kesksetele peptiidsidemele. otsmisele peptiidsidemele. karboksüpeptidaasid (R2 = Cterminaalne
(piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid: · Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 Pro) · Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 Pro) · Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 Pro) Samas aga paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiid- sidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside rühma. Eksopeptidaaside esindajateks on karboksüpeptidaasid (R2 = C- terminaalne aminohape) ja aminopeptidaasid (R1 = N-terminaalne aminohape), mis
annaabi.ee 
