2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil - Biokeemia labori protokoll (1)

Tallinna Tehnikaülikool
2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

Biokeemia labori protokoll

2011

Töö teoreetilised alused

Geelkromatograafia on kromatograafia meetod, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine. Ained fraktsioneeritakse nende molekulmassi järgi, see tähendab, et erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Proovi transportimine läbi kolonni toimub vesilahuse abil.
Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis – kolonnis . Kolonn on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on vastavuses lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega.
Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni kirjeldatakse järgmise mahtudefa:

kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht - Vv

graanulitesisese vedeliku maht - Vs

geelimaterjali ehk maatriksi maht - Vg

täidise kogumaht ehk üldmaht - Vt
Erineva molekulmassiga ainete segu juhtimisel läbi kolonni lahutuvad molekulid üksteisest vastavalt molekulide suurusele. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja erineva molekulmassiga aineid üksteisest eraldada, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni selleks sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati tuleb seejuures koguda kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx. Elueerimismaht sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni mõõtmetest. Uuritavas segus sisalduva aine x elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures väljub kolonnist fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Need molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, väljuvad kolonnist esimesena ja seda iseloomustatakse minimaalse elueerimismahuga Vxmin . Vxmin on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv
Ained, mis täielikult difundeeruvad geeli pooridesse (väiksema molekulmassiga), liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane suurus kolonni kogumahule Vt.
Protsessi saab lõppenuks lugeda, kui Vxmax=Vt (kolonnist väljuva eluaadi maht on ligikaudu võrdne kolonni kogumahuga).
Kui on teada geelimaatriksi maht Vg, siis saab maksimaalse elueerimismahu Vxmax arvutada nii: Vxmax=Vt-Vg.
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on vaadeldavad kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Valem on selline: Rf=Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin, kusjuures Rf väärtused peavad jääma vahemikku 0...1.
Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelise sõltuvuse graafik . Ainete väljumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerimismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem. Kromatogrammil on see „tipule“ vastav maht.
Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on juba eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Väiksema poorsusega, st tihedamad, Sephadex’i margid on mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni suhteliselt kiiret voolutamist. Kolonni alumine osa on täidetud klaasvillaga, et täidis ei saaks välja voolata. Kolonn on statiivi küljes ning selle alla peab mahtuma katseklaas. Täidise kõrgus on tavaliselt 25-30 cm ja täidise kohal on tavaliselt 3-4 cm eluendi kiht.
Ainete kontsentratsioonide kindlaks määramiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit.

Katse käik

Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine

Kolonni täidis: Sephadex G-75, mis on dekstraantäidis, fraktsioneerimispiirkonnaga 3000- 80000 daltonit.
Kolonni iseloomustav tegur k=0,1
Geelisamba kõrguseks mõõtsin: L=18 cm
Geelisamba diameetriks mõõtsin: d=2,8 cm → r=1,4 cm
Arvutan täidise kogumahu: Vt=r2*π*L → Vt=1,42*3,14*18=110,78 cm3
Arvutan geelimaatriksi mahu: Vg=k*Vt → Vg=0,1*110,78=11,08 cm3
Arvutan maksimaalse elueerimismahu: Vxmax=Vt-Vg → Vxmax=110,78-11,08=99,7 cm3
Ühe fraktsiooni maht: 2 mL
Arvutan fraktsioonide üldarvu: n=Vxmax/2 → n=99,7/2=49,85=50 fraktsiooni.
Asetasin katseklaasistatiivi vastavalt fraktsioonide üldarvule 50 katseklaasi, mis olid kalibreeritud 2 mL fraktsioonide võtmiseks.
Voolutuslahuse koostis: pH=7,5; 20mM Tris/HCl; 0,15M NaCl

Segu komponentide lahutamine

Avasin kolonni väljavooluava ja lasin täidise kohal oleval voolutuslahusel keeduklaasi tilkuda ise samal ajal jälgides, et ma ei laseks kolonni kuivaks joosta . Vedeliku nivoo ei tohtinud langeda alla geelipinda, mis oleks õhul lasknud geelikihti tungida .
Kolonni voolukiirus oli juba optimaalne, st 0,7-1,0 mL/min. Ühe 2 mL fraktsiooni kogumiseks peaks sellise kiiruse juures olema 2-3 min.
Kui vedeliku tase kolonnis oli langenud täidise pinnani, sulgesin väljavooluava. Nüüd oli kolonn valmis proovi sisestamiseks.

Proovi sisestamine

Võtsin pipetiga 1 mL uuritavat proovi ja viisin selle kolonni. Selleks juhtisin pipeti otsa vastu kolonni seina ja lasin proovil voolata geeli pinnale nii, et geel saaks võimalikult ühtlaselt kaetud.

Uuritav segu

Uuritav segu koosnes kolmest erineva molekulmassiga komponendist.
Uuritava segu koostisosad:

Dekstraansinine , 3 mg/mL

Müoglobiin, 6 mg/mL

DNP- aspartaat , 0,3 mg/mL

Kolonni voolutamine

Kui olin proovi viinud geeli pinnale, siis avasin väljavoolutoru ja hakkasin eluaati koguma alguses ühendatud fraktsioonina kuiva kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. Kordasin sama asja väikese eluendi kogusega veel teinegi kord ja siis viisin juba geeli pinnale nii palju eluenti, et moodustus u 5 cm kõrgune kiht.
Kuna minul oli kolonn ühendatud eluendi pudeliga, siis rohkem enam käsitsi ma eluenti kolonni kandma ei pidanud.
Kolonnis tekkis kolm värvilist riba – sinine, pruun ja kollane. Kui sinine riba jõudis kolonni alla äärde, siis eemaldasin ühendatud fraktsiooni kogumise jaoks mõeldud kolvi ning edasi kogusin eluaati juba 2 mL fraktsioonidena.
Lõpetasin elueerimise kui eluaat oli pärast kollase riba kogumist muutunud uuesti värvituks ning ka eluaadi summaarne maht oli enam-vähem võrdne arvutatud kogumahuga Vt. Samuti vastas kogutud fraktsioonide üldarv varem väljaarvutatule, kui võtsin arvessse seejuures ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu.
Ühendatud fraktsiooni mahuks oli: 26 mL

Fraktsioonide analüüsimine

Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel.
Iga segus sisalduva aine optilise tiheduse väärtust mõõtsin ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel λmax. Spektrofotomeetri reguleerisin järgmisele aine üleminekul vastavale lainepikkusele. Mõõtsin lainepikkustel 670 nm, 410 nm ja 360 nm (vastavalt sinine – dekstraansinine, pruun – müoglobiin ja kollane – DNP-aspartaat).
Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetril.
Andmetest koostasin tabeli, mille alusel joonestasin kromatogrammi Excelis.
Fraktsiooni number
Elueerimismaht V, mL
Optiline tihedus, A
670 nm/410 nm/360 nm
Ühendatud fraktsioon
26
0
1
28
0,039
2
30
0,225
3
32
0,101
4
34
0,028
5
36
0,010
6
38
0,005/0,067
7
39,5
0,005/0,456
8
42
1,621
9
44
2,635
10
46
2,533
11
48
1,454
12
50,5
0,549
13
52
0,214
14
54
0,102
15
56
0,046
16
58
0,021
17
60
0,012
18
61
0,043
19
64
0,006
20
67
0,005
21
69
0,004
22
71
0,004
23
74
0,004
24
76
0,004
25
78
0,006/0,012
26
80
0,041/0,088
27
82
0,226/0,479
28
84
0,917
29
86
1,050
30
88
0,961
31
90
0,769
32
92
0,539
33
94
0,316
34
96
0,170
35
98
0,084
36
100
0,041
Tabel 1. Katseandmete tabel
Joonis 1. Kromatogramm
Kolonnist väljus esimesena dekstraansinine, mis tähendab, et see on kõige suurema molekulmassiga aine. See oli sinise värvusega. Teisena väljus pruunika värvusega müoglobiin (keskmise molekulmassiga aine) ja viimasena väljus DNP-aspartaat, mis oli kollane. See, et ta viimasena väljus näitab seda, et ta on nendest kõige väiksema molekulmassiga aine.
Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni on esimesele „kõrgeimale tipule“ vastav elueerimismaht kromatogrammil ja see on: Vxmin=30 mL
Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vx= 44 mL
Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi (DNP-aspartaat) kõrgeima kontsentratsiooniga fratsiooni väljumiseni: Vxmax=86 mL
Liikuvustegur: , kusjuures kasutama peab kolonni arvutuslikku Vxmaxväärtust.

Järeldus

Arvutuslikult sain maksimaalseks elueerimismahuks Vxmax =99,7 cm3. Katse tegemisel selgus, et tegelik maksimaalne elueerimismaht oli hoopis Vxmax=86 mL.
Katse viga tuleb: . See on küllatki suur erinevus, mis võis tulla näiteks sellest, et mõõtsin geelisamba kõrguse või kolonni diameetri ebatäpselt. Erinevus võib tulla sisse ka sellest, et mõni 2 mL fraktsioon sai pisut suuremaks ja teine jälle jäi väiksemaks kui 2 mL.
Liikuvusteguri väärtus peab olema 0