A) Viltpliiatsi värvide paberkromatograafia kollasest ja punasest. Mustas ja pruunis värvis on selgelt näha kõigi Töö eesmärk: Uurida viltpliiatsi värvainete koostist. kolme värvaine esinemist. Roheline koosneb sinisest ja kollasest Töövahendid: kromatograafiline paber (Watman), eluent ehk vooluti: värvainest. Tumesinise ja lilla vahe esineb punase ja sinise värvaine etüülatsetaat, vesi, 25% NH3 vesilahus, viltpliiatsid, niit, nõel, harilik erinevates kogustes. Lillas viltpliiatsi värvis on rohkem punast ning pliiats, joonlaud, suletav klaasinõu. tumesinises rohkem sinist. Töö käik: Kromatograafilisest paberist lõigatakse 20x20 cm suurune tükk
Lahutamise mehhanism: analüüdi ja mobiilse faasi molekulid on ineraktsioonis silikageeli hüdroksüülrühmadega ja konkureerivad omavahel adsorptsioonitsentrite hõivamisel. Analüütide elueerimise järjekord toimub polaarsuse kasvu järgi. => Esimesena väljub MITTEPOLAARNE aine. + Töötab seal kus teised lahutamise mehhanismid ei tööta, sobib preparatiivseks analüüsiks - Retsensioon võib olla liiga tugev Nõrga eluendi puhul: madala polaarsusega eluent. Tugeva eluendi puhul: keskmise polaarsusega eluent. 30. Pööratud faasi kromatograafia põhimõte Mobiilne faas on polaarne ja statsionaarne faas on mittepolaarne. (vastupidi normaalfaasi krom. põhimõttele). Lahutamise mehhanism: polaarsed molekulid lahustuvad paremini mobiilses faasis, kui statsionaarses faasis ja elueeruvad kiiremini, kui vähempolaarsed, mis lahustuvad paremini statsionaarses faasis ja viibib selles faasis pikemat aega
Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt=>7,15 ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vx max = Vt – Vg=>64.38. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2=>32,19. Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdatakse. Seejärel pandi kirja eluent=> NaCl 0,15 M. Varutakse väike keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine Kui ettevalmistused said tehtud võis avada kolonni väljavooluava. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kiiresti kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks. Proovi sisestamine Et proovi sisestada tuli võtta 1 ml mõõtpipett, millega pandi geeli
· Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. · Voolutuslahus:Dekstraansinine,Müoglobiin,DNP-Aspartaat.Kasutasin automaatpipetti mahuga 0,5 ml. · Kolonni pinnal olev eluent kogun seisukolbi. Segu komponentide lahutamine: Avan kolonni väljavooluava. Täidise lahus hakkab keeduklaasi tilkuma. Reguleerin kolonni voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava . Uuritav segu: 1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane). Proovi sisestamine: Doseerimiseks kasutan automaatpipetti mahuga 0,5 ml. Viin 0,5 ml uuritavad segu kolonni vastu seina
· Arvutatakse geeli kogumaht Vt. · Arvutatakse geelmaatriksi maht Vg ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetatakse arvule n vastav katseklaaside hulk, nummerdatakse. · Valmistatakse ette voolutuslahus ja leitakse sobiv pipett lahuse kolonni viimiseks. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu kogutakse geeli pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine · Avatakse kolonni väljavooluava ning kogutakse täidise kohal olev eluent keeduklaasi. · Reguleeritakse kolonni voolukiirus sobivaks: 0,7 1,0 ml/min. · Vedeliku tase lastakse joosta geeli pinnani ning suletakse väljavooluava. Proovi sisestamine · Pipeti abil viiakse 0,5 ml proovi kolonni. · Proov lastakse voolata ühtlaselt geeli pinnale. Kolonni voolutamine
;1 ;2 2 2 Mahtuvusfaktor ehk retentsioonifaktor (k’) - analüüdi viibimise aja statsionaarses faasis suhe analüüsi viibimise ajaga mobiilses faasis, tavaliselt k’=1–20. Piik mahtuvusfaktoriga 0 läbib kolonni statsionaarse faasiga interakteerumata ning väljub mobiilse faasi frondil: ' ( t R−t0 ) t 'R K= = t0 t0 Selektiivsuskoefitsent (�) - määratud faasisüsteemi (liikumatu faas/eluent) ja analüüdi omadustega, ainete lahutumiseks peab � > 1: ' k 2 ( t R 2−t 0 ) α= ' = k 1 ( t R 1−t 0 ) Töö eesmärk: Segu komponentideks lahutamine pöördfaasikromatograafia abil ning detekteerimine UV-detektoriga. Segus on järgmised ained: Süsteem: Kolonn: C18, L=150 mm, d=4,6 mm, dosake=5 μm Eluent: atsetonitriil/vesi Dosaator: 5 μl Voolu kiirus: 0,7 ml/min Detekteerimine 254 nm (UV) Töö käik:
Me teame molekulide nukleotiidide järjestust. Kui meid huvitavad järjestused hübridiseeruvad oligonukleotiididega jäävad komplementaarsed molekulid kiibi külge kinni ja meid huvitav molekul on märgistatud. Õhukese kihi kromatograafia. Ained (proov ja standardühendite lahused) kantakse väikeste täpikestena plaadi alaserva lähedale stardijoonele. Seejärel asetatakse plaat püstiselt elueerimisnõusse, mille põhjas on eluent (lahusti või lahustite segu), ja nõu suletakse. Eluent tõuseb kapillaarjõudude mõjul piki plaati ülespoole ja sellega koos hakkavad ülespoole liikuma ka stardijoonele kantud ained, kusjuures komponendid, liikudes erineva kiirusega, eralduvad üksteisest laikudena. Plaat võetakse nõust välja, kui eluendi tase on jõudnud plaadi ülaserva lähedale. Plaat kuivatatakse ja vajadusel komponentide laigud ilmutatakse näiteks joodi aurudega või fosformolübdeenhappe lahusega.
· Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Lahuse sisestamine kolonni . · lahuse kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Elueermine · Varutakse väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuleb kolonnist välja lasta. · Kui esimene vedelik hakkab jõudama kolonni põhjani, siis eemaldakse kolb ja hakatakse koguma fraktsioonen 2ml kaupa erinevatsesse katseklaasidesse · Siis mõõdetakse kõigi fraktsioonide optilised tihedused spektromeetriga. Arvutused Kõige esimesena mõõdetakse: 1) kolonni pikkus l= 22,6 cm, 2) kolonni diameeter d= 2,4 cm. 3) Seejärel arvutatakse kolonni kogumaht Vt= r2h= 3,14*(2,4/2)*22,6=85,15 cm3
kolonnist väljuvad ka need molekuli, mille molekulid täielikult diffundeeruvad geeli pooridesse (=). Aineid, mille molekuli suudavad täielikult diffundeerida geeli pooridesse ja mille antud kolonnis on teada, iseloomustatakse liikuvusteguriga : Selle värtusedjäävad vahemiku 0...1 Töö käik 1. Proovi andmed: =0.5 ml. Koostis: Dekstraansinine (6 mg/ml), Müoglobiin (6 mg/ml), DNP-aspartaat (0.3mg/ml), proovi lahusti ja eluent NaCl lahus. 2. Märgin ära kolonni andmed: geel on Sephadex G-75, koeffitsient k=0.1, geelisambla kõrgus L=27.4 cm, diameeter d=1.9 cm. 3. Arvutan vajalikud mahud: ; ; 4.Arvutan fraktsioonide üldarv: n= (tegelikult 29-s fraktsioonis oli nii vähe elueerivat ainet, et sellega ma lõpetasin fraktsioonide kogumist). 5. Asetan katseklaase statiivi ja nummerdan neid. 6. Geeli kohal olevat lahust kogun eraldi keeduklaasi (19.5 ml) 7
Kvartstoru otsa ümber on mähis, läbi mille voolab vahelduvvool Läbi kvartstoru 3-kordsete seinte suunatakse argooni voog 1. Proov suunatakse plasmasse vesi-argoon aerosoolina 2. Kõrgel temp (6000-8000K)- proovis olevad ühendid atomiseeruvad 3. Aatomid ioniseeruvad ja hakkavad footoneid kiirgama 4. Emiteeritud valgus fokusseeritakse dispergeeriva elemendi abil (MK või polükromaator) Kromatograafia. Seletage mõisted ,,elueerimine", ,,eluent", ,,eluaat", ,,statsionaarne faas", ,,mobiilne faas" Elueerimine on protseduur, mille korral rakendatakse täidiskolonnis toimuvaid sorptsiooni ja desorptsiooni protsesse kasutades eluendi (gaas, vedelik) kolonni täidisest läbivoolutamist. Eesmärgiks võib olla ainete puhastamine või kuivatamine (adsorptsiooni- ja adsorptsiooni kolonnis), ainete segu lahutamine (kromatograafilises kolonnis) täidise regenereerimine.
· geelimaatriksi maht Vg = 0,1 63 = 6,3 ml · maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 63 6,3 = 56,7 ml · fraktsioonide üldarv n = 56,7 / 2 = 29 · statiivi võetakse vastav arv katseklaase · eluendi koostis: 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 7,5 · uuritav segu: o dekstraansinine (6mg/ml) o müoglobiin (6mg/ml) o 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml) · kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja · kolonni voolukiirus reguleeritakse piiridesse 0,7 1,0 ml/min · kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava · kolonni pipeteeritakse 0,5 ml uuritavat proovi, lastes proovil geelile mõne millimeetri kõrguselt tilkuda nii, et proov jaotuks geelis ühtlaselt · avatakse väljalaskeava ja jälgitakse, et eluenti oleks alati geeli kohal kui proov on
· Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax / 2. · Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. · Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine. · Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus. · Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks. Proovi sisestamine · Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda.
ekstraktsiooni ja vastavalt sellele ei teki aine kadusid. Vedelikkromatograafias puuduvad piirangud aine molekulmassile ja on võimalik lahutada ka kõrgmolekulaarsete ainete segusid. Kromatograaf: kõrgsurvevedelikkromatograaf CLAS MPm (Labio) Detektori tüüp: SAPHIRE UV/VIS detektor Kolonn: MAG 0 (1,6 mm sissediameeter x 150 mm pikkus) Kolonni täidis: Biospher PSI 100 C18, 5m Proovi maht: 20 l Proovi süstimiseks vajalikud parameetrid: Eluent: 30% atsetonitriili, 70% vett ja 0,1% äädikhape vesilahus Standardne voolukiirus: 70 l/min Lainepikkus: 280 nm Saasteainete identifitseerimine: Orgaaniliste ainete identifitseerimine vees on keeruline protseduur. Konkreetset ainet on väga lihtne identifitseerida, kui on olemas autentne võrdlusaine ehk standardaine. Selleks süstitakse vedelikkromatograafi uuritav proov ning standardlahused. Edasi võrreldakse kromatogrammil proovi ja standardlahuste retentsiooniaegu
Märgitam eüles kolonni kolonni täidiseks oleva Shephadexi mark ja seda iseloomustv tegur k. Mõõtme kolonni raadius R ja kõrgus L. Need andmed kasutades leidme kolonni kogumaht. (Vt) Arvutame geelimatriksi maght Vg. Vg=k*Vt Arvutame kolonni elueerimismaht. Vxmax= Vt Vg Arvutakse fraktsioonide üldarv (n). n = Vxmax/2 Kolonni lähedal paigutatakse eluendi pudel. Varutakse pipett. Enne kolonni kasutamist lastakse kolonnist pinnal olev eluent. 2. Segu komponentide lahutamine. Avatakse kolonni väljavooluava ja voolutuslahus hakkab aeglaselt tilkuma.(kiirus 0,7-1,0 ml/min) Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, kinnitakse vooluava. NB. Mingil juhul ei tohi kolonni kuivaks lasta. 3. Proovi sisestamine. Kolonni lisatakse uuritava proovi (0,5-1,0 ml) 4. Reeglin koosnevad segud 3-4 erineva molekulmassiga komponentidest, mis on lahustunud
6. Mida väljendab suurus Rf? Rf on kromatograafia kõige olulisem parameeter, mis sõltub aine jaotumisest liikuva ja liikumatu faasi vahel ehk jaotuskoefitsiendist. See näitab kromatograafilisel plaadil liikuva faasi ja uuritavate ainete läbitud teepikkuse suhet, kindlates tingimustes saab selle abil tuvastada, mis ainetega on tegu, Kuna Rf näitab kui polaarne on aine. Meil hoidis polaarne silikageel rohkem polaarseid aineid plaadi alumises osas ja mittepolaarne eluent viis vähem polaarsed ained plaadi ülemisse ossa ehk Rf‘i suurus näitab kui polaarne on aine.
iseloomustav 6. maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg 7. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega 8. n = Vxmax / 2. 9. Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. 10. Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. 11. Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine. 1. Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus. 2. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks. Proovi sisestamine 1. Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda. 2
· arvutatakse geelmaatriksi maht Vg = k*Vt ja maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg · arvutatakse fraktsioonide arv n, kui ühe fraktsiooni mahuks võetakse 2 ml, n = Vxmax / 2 · võetakse vastav hulk 2 ml-ga märgistatud ja nummerdatud katseklaase · läheduses hoitakse voolutuslahuse pudel koos sobiva pipetiga, märgitakse üles voolutuslahuse koostis · varutakse väike keeduklaas, kuhu kogutakse täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist väljutatakse kolonnist Segu komponentide lahutamine: · avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirust · kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava · kogutud lahust pole vaja säilitada Proovi sisestamine: · pipeti või süstlaga võetakse juhendaja poolt soovitud kogus uuritavat proovi ja viiakse kolonni
ainete erinevale neelduvusele on võimalik neid detekteerida. Fluoresentsdetektor- detekteeritakse aineid, mis fluoretseeruvad. Kui aine ei fluoretseeru lisatakse talle fluoretseeruvat märgist. Massispektromeetriline detekor- mõõdetakse analüüsitava aine massi- laengu suhet. 6 Koduktomeetriline detektor- mõõdetakse eluendi elektrijuhtivust. Mitteselektiivne massitundlik detektor; tundlikus kahaneb, kui eluent juhib voolu; temperatuuritundlik. Praktiline töö: Seadmed: kapillaarelektroforees LED fluorestsentsdetektoriga Valguse allikas: LED (light emitting diode) Ergastamine (Ex): 280 nm Emissioon (Em): 307 nm Temperatuur: toatemperatuur Pinge: 16.3 kV Vool: 6.3 A Kapillaar: kvarstkapillaar, sisediameetriga 75 m, 50/62 cm Uuritav proov: Eri sorti kanepitaimede leotised Analüüdid ekstraktis: THC, CBD Standardis: THC 10 ppm; CBD 10 ppm
Vxmax = 78,74 7,87 = 70,87cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,44 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma. Sellel ajal reguleesin kolonni voolukiirus, et tilkus 0,7-1ml lahust minutis. Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulesin kiiresti kolonni väljavooluava ning kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks
ioonvahetusrühmad Katioonvahetuskolonn Anioonvahetuskolonn · Nõuded eluendile: o Peab lahustama proovi o Peab analüüte läbi kolonni kandma o Ei tohi olla viskoosne o Pöördfaas sageli puhverlahuse segu mõne orgaanilise lahustiga (metanool, atseetonitriil) o Ioonkromatograafias hape, alus või karbonaat. · Eluent on pidevas voolamises ja spetsiaalse kraani abil sisestatakse eluendi voolu uuritavat lahust. · Proovi sisestatakse tavaliselt mõnikümmend mikroliitrit. · Eelised: võimaldab analüüsida aineid mis ei lendu ega ole temperatuuristabiilsed. · Puudused: o vajadus kasutada kõrget rõhku o aparatuur kapriisne Proov süstitakse sisesti ehk injektori kaudu kromatograafilisse süsteemi, ning viiakse eluendivoolus analüütilisse kolonni.
7. Asetasin statiivi umbes 35 katseklaasi (kuigi arvutused näitasid, et vaja oleks 45) 2 ml mahu järgi kalibreeritud katseklaase ja nummerdasin need. 8. Paigutasin kolonni lähedusse eluendi pudeli ja võtsin 25 ml mahuga pipeti ning 50 ml mahuga keeduklaasi. Eluendi koostis: 50 mM tris-HCl + 150 mM NaCl (pH = 7,5) SEGU KOMPONENTIDE LAHUTAMINE JA PROOVI SISESTAMINE 1. Avan ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et täidise kohal olev voolutuslahus (eluent) hakkaks aeglaselt kolonni alla asetatud keeduklaasi tilkuma. 2. Reguleerin kolonni voolukiiruse reguleerimisklambri abil piiridesse 0,7-1,0 ml/min. 3. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, sulgen kolonni väljavooluava. NB! Õhk ei tohi tungida geelikihti! 4. Kasutan kalibreeritud mõõtpipetti ja viin 1 ml uuritavat proovi kolonni. 5. Lasen proovil tilkuda geeli pinnale nii, et see jaotuks seal võimalikult ühtlaselt. NB!
Selline täpsus pole õigustatud! · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,45 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma. Sellel ajal reguleesin kolonni voolukiirus, et tilkus 0,7-1ml lahust minutis. Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulesin kiiresti kolonni väljavooluava ning kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks
Samuti võib ained kindlaks teha visuaalse vaatluse teel. 1.4. Töö käik 1.4.1.Aniliini süntees Sünteesikolbi asetatakse 35 g raualaaste, valatakse juurde 75 ml 6%-list soolhapet. (Aparatuur peab olema kokku pandud ja avad suletud, et vältida vesiniku lendumist.) Segu soojendatakse mehaaniliselt segades veevannis ja soojale segule lisatakse tilklehtrist nitrobenseen ning jätkatakse soojendamist. Reaktsiooni lõpp määratakse õhukese kihi kromatograafiaga (eluent tolueen:etüületamaat 95:5). Reaktsiooniks kulub umbes 2,5 tundi. Reaktsioonisegu valatakse kolbi, mida kasutatakse veeaurudestillatsiooni aparatuuris, ja lisatakse umbes 40 ml 10%-list NaOH (püsiva leeliselise reaktsioonini). Aniliin destilleeritakse veeauruga, kuni destillaat muutub läbipaistvaks. Aniliinikiht eraldatakse jaotuslehtris ja veekiht küllastatakse NaCl-ga (100 ml lahusele umbes 35 g soola) ning ekstraheeritakse kaks korda eetriga (~35 ml)
kolonni täidised on poorsed materjalid: silikageel, poorne klaas, stüreendivinüül polümeer, kolonni täidise poorsus varieerub suurtes piirides (4 m 250 m) , väga suured molekulid ei sisene pooridesse elueeruvad kiiresti, väikesed molekulid jäävad kinni paljudesse pooridesse ja elueeruvad aeglaselt , vahepealse suurusega molekulid sisenevad osadesse pooridesse ja osadesse nad ei mahu ning nende retentsiooniaeg on suurte ja väikeste molekulide vahepealne eluent: pH < 9, peab lahustama analüüsitavaid aineid, detektor: HPLC detektorid Lahutamine põhineb molekulide suurusel; Statsionaarsel faasil on kontrollitud pooride suurus. Suuremad molekulid elueeruvadvarem, nad ei mahu täidise pooridesse; Kasutatakse valkude ja polümeeride molekulmasside määramisel. Geelfiltratsioonkromatograafia- liikuv faas vesi. Geelpermeatsioonkromatograafia- liikuv faas orgaaniline solvent
Moodsad seadmed lisaks eraldamise ka detekteerivad eraldatud ained ja mõõdavad nende sisalduse proovis, seega on tegemist mitte lihtsalt eraldamise vaid täieliku määramise meetodiga. See on enam-vähem kõige võimsam segued lahustamise analüüsimise vahend, mis olemas on. Statsionaarne faas e sorbent e täidis – kromatograafia kolonnis paiknev aine, milles kolonnist läbi liikuvad molekulid absorbeeruvad-desorbeeruvad või adsorbeeruvad- desorbeeruvad. Mobiilne faas – vedelik (eluent) või gaas (kandegaas), mis läbi kolonni voolates uuritavaid aineid edasi kannab. Retentsiooniaeg – aeg, mis kulub aine sisestamisest tema piigi maksimumi väljumiseni kromatogrammil Kui kolonni otsa ühendatud detector, mis on tundlik lahustatavate ainete suhtes, siis saab detektori signaali ajas registreerida: saadakse kromatogramm. Igale individuaalsele ainele vastab maksimum – piik. Õnnestunud kromatografeerimise korral on kõikide analüütide piigid üksteisest lahus. Meetodid:
FID), elektronhaardedetektor (ECD) ja mass-- spektromeetriline määramine(MS). määramine 5.2 Vedelikkromatograafia Vedelikkromatograafias võib ainete a eraldamine toimuda : polaarsuse alusel - vedelik-kromatograafia, HPLC iooni laengu ja suuruse alusel - ioon(vahetus)kromatograafia, IC Vedelikkromatograafias on liikuvaks l faasiks (eluent) vedelik.. Kasutatakse täidiskolonne osakeste diam.-ga diam. 3-10 µm, sisemine diam.-ga 1-5 mm ja pikkusega 5- 30 cm. HPLC ehk kõrgefektiivne vedelikkromatograafia - efektiivsekss eraldamiseks peab kolonn olema stats. faasiga tihedalt täidetud, seetõttu vajalik eluendi läbisurumiseks kõrge rõhk. Kaks variatsiooni: · Polaarne liikuv faas, vähe-(mitte-)polaarne vähe statsionaarne faas
capillary is absent. This effect explain a very slight broadening of the bands observed in the CE (Fig. 4). Separation process Band separation in zone electrophoresis is based on a combination of electrophoretic mobility and electroosmotic flow of ions. In electroosmosis effect voltage value, ionic strength, viscosity of a buffer, additives in eluent and different coatings of the capillary walls. Electrophoretic mobility of positive, neutral and negative sample molecules is different, but all of the particles under the effect of electroosmotic flow migrate towards the cathode. The rate of migration of the particle is the sum of its own electrophoretic mobility and electroosmotic flow rate.
Jaotuskoefitsient, Rf (retention factor) jaotuskoefitsient (retentsiooni koefitsient), aine poolt kromatograafilisel plaadil läbitud tee pikkuse ja vooluti frondi poolt läbitud tee pikkuse suhe. Võimaldab väljendada individuaalse aine liikumist. Rf on standardtingimustes konstantne kindla aine ning voolutisüsteemi jaoks ja iseloomustab aine jaotuvust statsionaarse faasi ja liikuva faasi (vooluti) vahel. Jaotuskoefitsiendi konstantsuse tagab ühesugune: · liikuv faas (vooluti, eluent), · statsionaarne faas (sorbent), · statsionaarse faasi kihi paksus, · uuritava aine kogus, · temperatuur. Ainete Rf väärtused kindlates voolutisüsteemides on esitatud vastavates käsiraamatutes, kuid tavaliselt kantakse ainete segu identifitseerimisel samale kromatogrammile ka oletatavad testained. 10) Aspiriini saamine (lähteained, saadused) Atsetüülsalitsüülhapet on võimalik kergesti saada salitsüülhappe ja etaananhüdriidi reaktsioonil.
Gradientfuugimine – teostatakse sahharoosis või soolagradiendis. (Sedimentatsioonikoefitsent S = 10-13 sek. 2. Ioonvahetuskromatograagia, hüdrofoobsuskromatograafia,geelfiltratsioon-kromatograafia, afiinsuskromatograafia Kromatograafia on laboritehnika molekulide eraldamiseks. Eraldab molekule nt valke, mis on jaotunud mobiilse ja stratsionaalse faasi vahel. Eluaat on mobiilne faas, mis liigub mingis kindlas suunas. Eulaat, mis sisalad analüüsitavat ainet on eluent. Mobiilne faas võib olla gaas või vedelik. Eraldamine toimub valgu erinevaid omadusi kasutades: a) ioonvahetuskromatograagia- vastavalt valkude laengule b) hüdrofoobsuskromatograafia- vastavalt valkude hüdrofoobsusele c) geelfiltratsioon-kromatograafia-vastavalt valgumolekuli suurusele d) afiinsuskromatograafia-vastavalt valkude interaktsioonidele 3. Elektroforees, SDS-PAGE põhimõte, isoelektriline fokuseerimine, 2D elektroforees, valgu sõrmejälg
graafilisel plaadil, kasutades vastavaid seadmeid, ¾ elueerida ühendi laigu kromatograafiliselt plaadilt või paberilt ja analüüsida seda mistahes sobival meetodil. Valik kromatograafiaalaseid mõisteid · Adsorptsioon pinnanähtus, mille puhul aine molekulid kogunevad nõrkade van der Waalsi jõudude toimel tahke aine (adsorbendi) pinnale; vastupidine protsess on desorptsioon. · Eluent ehk vooluti lahusti või lahustite segu lahutatavate ainete proovi kolonnist läbivoolutamiseks. · Eluaat kolonnist väljuv vedelik, reeglina kogutakse fraktsioonidena. · Kromatograaf kompleksne seade, mida kasutatakse ainete segu kromatograafiliseks lahutamiseks koos tulemuste registreerimisega. · Kromatografeerimine ainete lahutamise protsess mingi kromatograafilise meetodi abil.
valdavalt deprotoneerunud kujul ning retentsiooniaeg on lühem. 125. Detektorid vedelik-kromatograafias. UV-Vis spektrofotomeetriline, fluorestsents, elektrokeemiline, massispektromeetriline detektor. "Tavalises" vedelik-kromatograafias: UV-Vis spektrofotomeetriline; Fluorestsents; Elektrokeemiline; Massispektromeetriline. Ioonkromatograafias: Konduktomeetriline ( Lihtne ja küllalt odav; Vajab temperatuuri kontrolli; Puudus: ka eluent juhib, see vähendab tundlikkust, Lahendus: Kasutada supressorit (supressor sisuliselt eemaldab eluendi ioonid, kuid jätab alles uuritavad ioonid)).. 126. GC ja HPLC proovisisestussüsteemide erinevused? GC puhul peab lahuse aurustama, LC puhul mitte. 127. Millistes olukordades eelistada HPLC-d GC-le? GC: kõrgem efektiivsus, lenduvad ja termiliselt püsivad analüüdid, odavam, ennustamine- kirjeldamine lihtsam. HPLC: pole peaaegu piire analüüdi omadustele, madalam efektiivsus, muudetavaid
annaabi.ee 
