Biokeemia praktikumi arvestustöö (6)

1. Nimetage, millised toodud valkude reaktsioonidest on üld-, millised erireaktsioonid ja
põhjendage sellist jaotust.
Üldreaktsioonid ( biureedireaktsioon ) on omased kõikidele valkudele , erireaktsioonid (Mulderi, Milloni, tiooli) on iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele.
2. Kirjutage aminohappe molekuli üldistatud struktuurivalem . Kuidas aminohappeid
klassifitseeritakse radikaali keemilise ehituse järgi?
Polaarsed mitteionogeensed radikaalid, ionogeensed radikaalid ( happelised ja aluselised ), apolaarsed radikaalid.
3. Kuidas tekib peptiidside? Kirjutage reaktsioonivõrrand, kasutades vabalt valitud
aminohappeid.
4. Kirjutage 2 polüpeptiidahela fragmenti ja näidake, kuidas tekib biureetkompleks valguga.
5. Milliste aminohapete esinemist valgus näitab positiivne
a) tioolireaktsioon – Tsüsteiin - Cys
b) ksantoproteiinireaktsioon – Aromaatset tuuma omavad – Tyr, Phe, Trp
c) Milloni reaktsioon – Fenoolse rühmaga aminohape - Tyr
6. Kirjeldage ksantoproteiini- ja Milloni reaktsiooni kemismi.
7. Mis on valgu isoelektriline punkt (pI)?
Valgu pI näitab keskkonna pH väärtust, mille korral valgumolekulis on negatiivsete ja positiivsete laengute hulk võrdne ja valgu molekuli laeng on summaarselt 0.
8. Millistel juhtudel ei kaasne valgu denatureerumisega tema lahusest väljasadenemist?
Kui lahuse pH väärtus erineb oluliselt valgu pI’st.
9. Mida tähendavad mõisted
a) valkude denaturatsioon – valkude kõrgemate struktuuride lagunemine
b) valkude hüdrolüüs – peptiidsidemete lõhkumine
c) valkude väljasoolastamine – neutraalsete soolade kõrgete kontsentratsioonide korral tekkiv valkude denaturatsioon, mis põhjustab valkude väljasadestumist.
10. Loetlege valke denatureerivad tegurid ja selgitage, mis valgumolekulis nende toimel
aset leiab.
Temperatuur – lõhub nõrku sidemeid kõrgemates struktuurides
Orgaanilised solvendid – Apolaarsed radikaalid pöörduvad molekuli välispinnale, toimub dehüdratiseerimine
Alused ja happed
11. Millised vaadeldud teguritest põhjustasid valkude pöördumatut, millised pöörduvat
denaturatsiooni?
Pöörduvad – orgaanilised solvendid, alused ja happed
Pöördumatud - temperatuur
12. Millele põhineb globuliinide ja albumiinide lahusest väljasadestamine (väljasoolastamine) neutraalsete sooladega?
Globuliinid sadenevad välja poolküllastunud lahuses, albumiinide sadestamiseks on vaja küllastunud lahust.
1. Kuidas jaotatakse monosahhariide süsinikuaatomite arvu, molekuli keemilise ehituse ja
molekuli kuju järgi?
Mono -, oligo-, polüsahhariidid.
Redutseerivad ja mitteredutseerivad suhkrud .
Tsüklilised ja lineaarsed suhkrud.
2. Millise keemilise omaduse järgi klassifitseeritakse oligosahhariide? Nimetage nende
rühmade esindajaid.
Poolatsetaalse (ribopüranoos) või poolketaalse hüdroksüülrühma esinemise või mitteesinemise.
3. Millistele keemilistele omadustele (funktsionaalsetele rühmadele) baseerub enamus
süsivesikute kvalitatiivseid reaktsioone?
Karbonüülrühma esinemine
4. Millised reaktsioonid olid seotud furfuraali ja 5-hüdroksümetüülfurfuraali tekkimisega?
Molischi ja Selivanoffi test
Kirjutage nende ühendite struktuurid ja kirjeldage, millest ning mille toimel nad moodustuvad.
5.Milline läbiviidud reaktsioonidest võimaldab kindlaks teha mistahes süsivesiku esinemist
lahuses?
Molischi test annab positiivse reaktsiooni kõigi sahhariididega.
6. Mis on osasoonid ? Miks saab osasoonide tekke reaktsiooni kasutada süsivesikute
kvalitatiivse reaktsioonina?
Osasoonid on süsivesikute derivaadid , mis tekivad redutseeriva suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Tekkivate osasoonide kuju on lähtesuhkrule iseloomulik.
7. Millise reaktiiviga viiakse läbi hõbepeegli reaktsiooni ja millised tegurid võivad segada
positiivse reaktsioonitulemuse saamist?
AgNO3 ja NH4OH – Tolleni reagent. Katse võib ebaõnnestuda määrdunud katseklaasi kasutamisel , ettevaatamatul soojendamisel või reaktiividega liialdamisel.
8.Valige välja reaktsioonid, millised võimaldavad eristada taandavaid ja mittetaand-avaid
suhkruid.
Hõbepeegli reaktsioon , Fehlingi reaktsioon.
9. Millist reaktsiooni kasutatakse mono- ja disahhariidide eristamiseks? Milline on selle
reaktsiooni kemism ?
Barfoed reaktsioon, sest nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske ainult monosahhariidid.
10. Iseloomustage järgmiste reaktiivide koostist:
a) Fehling ’i – CuSO4 + Seignett sool
b) Barfoed’ – vaskIIatsetaat äädikhappes
c) Molisch’i reaktiiv – a-naftooli lahus alkoholis
11. Milline süsivesik on sahharoos ja mis on tema hüdrolüüsi produktideks ? Millise
reaktsiooniga saab kindlaks teha, kas toimus sahharoosi hüdrolüüs?
Sahharoos – disahhariid , mis koosneb glükoosist ja fruktoosist.
Fehlingeni reaktsioon
12. Milline süsivesik on tärklis? Kuidas saab kindlaks teha a) tärklise esinemist lahuses b)
teralise tärklise päritolu?
Tärklis on polüsahhariid. Tärklis reageerb joodiga, andes lillaka kompleksi. Joodiga värvunud tärkliseterad on kindlaga kuju ja suurusega, seega on näha, kust need terad pärinevad.
1. Kirjutage rasva, glütserofosfolipiidi, vaha ja steroidi üldvalemid.
2. Millest on tingitud lipiidide hüdrofoobsus ja millised läbiviidud reaktsioonidest
näitasid seda?
Lipiidide hüdrofoobsus on tingitud pikkadest süsivesinikradikaalidest ja hüdrofppbsetest aatomirühmdes.
Emulsioontest
3. Mida tähendab amfifiilsus ja millised lipiidid on amfifiilsed?
Amfifiilsed molekulid on sellised molekulid, millede üks osa on hüdrofiilne ja teine osa hüdrofoobne. Amfifiilsed lipiiid on glütserofosfolipiidid.
4. Millised lipiidid kuuluvad bioloogiliste membraanide koostisse?
Glütserofosfolipiidid
5. Millise reaktsiooniga saab kindlaks teha, kas lipiid sisaldab küllastumata rasvhappeid?
Esitage reaktsiooni kemism.
Halogeenreaktsioonidega, põhiliselt Br-ga.
6. Valige lipiidid, mille lahuses Br värvus kaob: stearhape, päevalilleõli, linoleen- hape ,
palmithape, maisiõli. Põhjendus?
Kaob – päevalilleõli, linoleenhape , maisiõli
7. Millist informatsiooni lipiidi kohta annab akroleiini tekkimine ja millised lipiidid
annavad positiivse akroleiiniproovi?
Kas lipiid sisaldab glütserooli või mitte. Positiivse proovi annavad glütserofosfolipiidid ja rasvad .
8. Joonistage steroidide ehituslikuks aluseks olev steraanituum. Millega põhjendate,
et kolesterool on tsükliline alkohol ?
9. Liebermann -Burchard’i test annab kolesterooli esinemise korral tumerohelise värvuse. Kas / miks võivad ka taimeõlide lahused anda rohelise värvusega reaktsioonisegu?
Jah, sest taimeõlid võivad sisaldada ka teisi steroole peale kolesterooli, mis samuti annavad selle testiga positiivse reaktsiooni.
10. Milliseid reaktiive kasutatakse Liebermann-Burchard’i testi läbiviimiseks?
Äädikhappe anhüdriid ja väävelhape.
11. Kuidas teha kindlaks lipiidide esinemist
a) tahkes materjalis – rasvapleki proov – rasv lahustatakse orgaanilises solvendis
b) vedelikus – emulsioontest – lipiidid moodustavad mittelahustavas eskkonnas, vees, emulsiooni
12. Mis on emulsioon ja mis on emulgaator ?
Emulsioon on kahe- või enamafaasilised süsteemid, mis koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust. Emulgaator on aine, mis põhjustab emulsiooni tekke.
1. Mis on kromatograafia , millel see põhineb ja milliseid kromatograafia liike teate?
Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel.
Jaotus-, adsorptsiooni-, afiinsus -, ionnvahetus-, geelkromatograafia .
2. Selgitage geelkromatograafia meetodi põhimõtet.
Meetod põhineb ainete lahutamisel nende erinevate molekulaarmasside suuruste tõttu. Kõigepealt väljuvad kõige suurema molekulmassiga ained, mis ei mahu geeli pooridesse. Teisena need molekulid, mis osaliselt mahuvad pooridesse ning viimasena need molekulid, mis täielikult pooridesse mahuvad.
3. Milline ühine omadus iseloomustab kõiki geelkromatograafia kolonnide täidisena kasutatavaid materjale?
Kõik materjalid on polümeerid ja geeli pooridesse ei mahu ükski molekul , mis on samas suurusjärgus või suurem, kui antud geeli poor .
4. Miks ei tohi kolonnist eluaati koguda liiga kiiresti?
Kui elueerida liiga kiiresti, siis erinevad molekulid ei jõua lahutuda ning nad väljuvad seguna.
5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx.
Aine elueerimismaht on sellise eluaadi maht, milles oleva aine kontsentratsioon on kõige suurem
6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht?
Minimaalne – võrdne graanulitevahelise vedeliku mahuga ja maht, mille juures väljub esimene aine maksimaalse kontsentratsiooniga
Maksimaalne – lähedane kolonni mahule ning maht, mille juures viimane aine väljub maksimaalse kontsentratsiooniga.
7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse?
Millised on Rf piirväärtused?
Liikuvustegur näitab aine liikumist kolonnis võrreldes teiste ainete liikumiskiirustega. Piirväärtused 0 ja 1.
Rf = Vx – Vxmin / Vxmax – Vxmin
8. Mida mõistetakse neelduvuse ehk optilise tiheduse (A ehk D) all?
Optiline tihedus näitab lahuse kontsentratsiooni, sest võrdleb proovile suunatava valguse intensiivust proovi läbiva valguse intensiivsusega. Mida kontsentreeritum on uuritav lahus, seda enam valgus seal neeldub.
9. Millistest teguritest sõltub teatava lainepikkuse juures mõõdetud optilise tiheduse väärtus ( avaldis vastavalt Beer ’i seadusele)?
A = l ∙ c∙ ε (küveti pikkus, lahuse kontsentratsioon, uuritava aine ekstinktsioonitegur antud lainepikkusel)
10. Mis on kromatogramm ja millist informatsiooni see annab uuritava segu koostisekohta?
Kromatogramm on aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus. Sealt on näha iga aine elueerimismahud ning ainete kontsentratsiooniline jaotus lahuses.
1. Millistesse gruppidesse võib karotenoidid jaotada ja mille poolest need grupid erinevad?
Karoteenid – hapnikku mittesisaldavad ühendid, mis koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust
Ksantofüllid – sisaldavad hapnikku. ( Luteiin , zeaksantiin)
2. Iseloomustage karotenoidide molekuli ehitust ja sellest tulenevaid omadusi.
Molekulid on polüeenid, koosnevad 40 süsiniku aatomist, mille ühes või mõlemas otsas on tsüklid. Lahustuvad ainult apolaarsetes orgaanilistes solventides, võime neelata nähtavat valgust.
3. Millistes rakustruktuurides karotenoidid paiknevad ja milline on nende roll taimerakkudes?
Paiknevad fototsünteesivates organellides nagu kloroplastid ja kromoplastid. Rollideks on valguse absorbeerimine ja klorofüllile edastamine , kaitsevad rakke fotokahjustute ja vabade hapnikuradikaalide eest.
4. Selgitage spektrofotorimeetri tööpõhimõtet.
Spektrofotomeeter võrdleb uuritavat lahust puhta lahustiga, lastes sealt läbi valgust kindlas vahemikus (antud töös 350-650nm) ning registreeritakse erinevatel lainepikkuste uuritava lahuse optilised tihedused , millede graafilisest seosest lainepikkustega on võimalik määrata neeldumismaksimumid.
5. Millises lainepikkuste vahemikus paiknevad karotenoidide neeldumismaksimumid ja millest on see tingitud?
Neeldumismaksimumid paiknevad nähtava valguse sinises ja rohelises piirkonnas, mis tuleneb sellest, et enamus karoteene on punakad-oranžikad.
6. Mis on molaarne ekstinktsioonikoefitsient e -tegur ja millist ekstinktsioonikoefitsienti kasutasite teie antud töös?
Näitab 1%-lise lahuse absorptsiooni, antud töös kasutatud ekstinktsioonikoefitsent iseloomustab absorptsiooni kõige kõrgema A väärtusega lainepikkusel.
7. Mida tähendab termin „ekstraktsioon“ ja millega põhjendate antud töös kasutatud ekstrahendi valikut?
Tähendab, et ainest lahustatakse mingi aine välja. Antud töös oli selleks lahustiks petrooleeter , sest see on apolaarne orgaaniline solvent ja karotenoidid lahustuvad ainult sellistes solventides.
8. Millega põhjendate veevaba soola kasutamise vajadust uuritava materjali ekstraktsiooniks ettevalmistamisel?
Vesi ja petrooleeter moodustaksid emulsiooni ja segaksid neelumisspektri õiget määramist.
9. Selgitage, mida väljendab kasutatav ühik mg% ja milline seos on tal ühikuga %?
Näitab karotenoidi protsendilist sisaldust 1 grammis uuritavas aines. Mg-des on sellepärast, et erinevad toiduained sisaldavad karotenoide väga väikestes kogustes . mg% on 1000 korda väiksem kui %.
10. Millisesse vitamiinde klassi A- vitamiin kuulub?
Rasvlahustuvad vitamiinid .
1. Millist informatsiooni invertaasi kohta annab tema süstemaatiline nimetus β-D fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas?
Näitab, et ensüüm katalüüsib fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktioone, mille tulemuseks on fruktoos .
2. Kirjutage invertaasi poolt katalüüsitava reaktsiooni skeem.
3. Skitseerige sahharoosi molekul ja näidake, milline side invertaasi toimel hüdrolüüsub.
4. Mille toimel lisaks invertaasile võib aset leida sahharoosi hüdrolüüs? (Meenutage töös 1.2 läbiviidud reaktsioone!)
Hapete toimel.
5. Mis on invertsuhkur ?
Sahharoosist hüdrolüüsi käigus tekkivad glükoosi ja fruktoosi segu.
6. Joonistage Michaelis-Menten’i kineetikaga kirjeldatavale ensüümireaktsioonile graafiline sõltuvus v versus [S]. Näidake, millises graafiku piirkonnas toimus invertaasi aktiivsuse (reaktsiooni kiiruse) mõõtmine meie töös, kui on teada, et [S] >> Km . Millist kiirust me mõõtsime?
Kui tegemist on olukorraga, kui [S] >> Km, siis arvutatud kiirust on ligikaudu võrdne maksimaalse kiirusega.
7. Kirjutage Cu(II)-triloon B kompleksi struktuur. Nimetage kaks põhjust selle, tugevalt aluselise reaktsiooniga lahuse kasutamiseks invertaasi aktiivsuse määramisel.
Kuna on aluseline, siis lõpetab invertaasi töö, mille optimaalne pH on happeline. Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaiku leeliselise keskkonna.
8. Selgitage, mida tähendab invertaasi preparaadi aktiivsus 85 μkat/ml sisuliselt?
See näitab, et 1 sekundi jooksul produktseeritakse 1 ml ensüümilahuse poolt 85 mikromooli produkti teke.
9. Kuidas tuleb toimida, et valmistada tahkest invertaasi preparaadist 5,0 ml lahust, milles ensüümi kontsentratsioon on 4,0 mg/ml?
20 mg tahket invertaasi tuleb lahustada 5ml lahustis .
10. Kasutasite töös 7%-list sahharoosi lahust. Milline on sellise sahharoosi lahuse molaarnekontsentratsioon (Mr = 342)? Millises suhtes (suurem/ väiksem/võrdne) on see invertaasi K m väärtusega, kui on teada, et sahharoosi hüdrolüüsil Km = 26 mM?
0,2 M
1. Kirjutage lõik valgu polüpeptiidahelast ja näidake, millistele sidemetele toimivad proteaasid.
2. Mida mõistetakse ensüümide spetsiifilisuse all ja milliseid proteaaside spetsiifilisuse aspekte eristatakse?
See tähendab, et ensüümid katalüüsivad ainult teatud aminohapete vahelisi peptiidsidemeid. Nad võivad katalüüsida kas teatud aminohapete vahelisi sidemeid või sidemeid, mis asuvad peptiidahelas teatud kohalt (näiteks ainult äärmisi peptiidsidemeid või ainult keskmisi peptiidsidemeid)
3. Kuidas klassifitseeritakse proteaase optimaalse pH väärtuse järgi ja millisesse rühma kuulus teie uuritud ensüüm?
Eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase. Savinase kuulub leelisproteaaside rühma
4. Palun iseloomustage proteaasi substraadina kasutatavat ainet kaseiini . Millised reaktsiooniproduktid tekivad kaseiini hüdrolüüsi käigus?
Kaseiin on piima põhivalk, mis on koostiselt fosfoproteiin. Molekulid on hüdrofoobsed ja seega esinevad piimas mitsellidena. Kaseiin ei lahustu vees. Hüdrolüüsi käigus tekivad vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid.
5. Kirjutage TKÄ struktuurivalem ja põhjendage TKÄ kasutamise eesmärke antud töös.
TKÄ on happeline ja seega inaktiveerib ensüümi töö. Ta sadestab tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid ehk peptiid , mida proteaas ei ole veel suutnud katalüüsida madalmolekulaarseteks peptiidideks või aminohapeteks.
6. Skitseerige graafilised sõltuvused
a) ensüümi aktiivsus-temperatuur;
b) ensüümi aktiivsus-keskkonna pH.
7. Millisel temperatuuril toimus proteaasi aktiivsuse määramine? Kuidas mõjutanuks tulemust temperatuuri tõus termostaadis 25 Co võrra?
Määramine toimus temperatuuril 30 kraadi. Temperatuuri tõus mõjutanuks Savinase katalüüsi kiirust, sest Savinase optimaalne temperatuur on 55 kraadi.
8. Millise reaktsiooniprodukti kontsentratsiooni suurenemise järgi arvutasite proteaasi aktiivsuse? Kirjutage selle aine struktuurivalem.
Türosiini kontsentratsioon.
9. Mida spektroskoopias mõistetakse neelduvuse (lahuse optilise tiheduse) all ja millised tegurid seda mõjutavad (Beer-Lambert’i seadus)?
A = l ∙ c∙ ε (küveti pikkus, lahuse kontsentratsioon, uuritava aine ekstinktsioonitegur antud lainepikkusel)
10. Oletagem, et teil tuleb valmistada tahkest ensüümipreparaadist 10 ml lahust kontsentratsiooniga 4,5 mg /ml. Kuidas toimite?
1.Millisesse ensüümide klassi kuuluvad GOx ja POx?
Kuuluvad oksüdaaside rühma ehk katalüseerivad oksüdatsioonireaktsioone.
2.Kirjeldage GOx-i ja POx-i poolt katalüüsitavaid reaktsioone.
GOx katalüüsib glükoosi oksüdatsiooni hapniku juuresolekul ning produktideks on glükoonhape ja peroksiid . POx katalüseerib raud(II) oksüdatsiooni peroksiidi abil raud(III)’ks, mis on värvline ühend ning mida on võimalik optiliselt määrata.
3. Millist koensüümi vajab GOx ja milles seisneb koesüümi roll?
Sisaldab koensüümi FAD, mis aitab glükoosi molekulilt oksüdeerumise käigus eralduvad vesiniku aatomid kanda üle molekulaarsele hapnikule, et saaks tekkida vesinikperoksiid .
4. Kuidas avaldub ensüümi substraadispetsiifilisus antud töö puhul?
GOx on spetsiifiline ensüüm, mis katalüüsib ainult glükoosi oksüdatsiooni ja võimaldab määrata glükoosi sisaldust teiste suhkrute juuresolekul.
5. Selgitage lahuse lahjendamise põhimõtet ja kirjeldage, kuidas tuleb toimida, et lahusest, mis sisaldab 1,5 g/l glükoosi valmistada 25 ml lahust kontsentratsiooniga 0,3 g/l?
5ml lahust tuleb lahjedada 20ml dest veega.
6. Milline on töös kasutatava tööreaktiivi koostis?
Glükoosi oksüdaas, peroksüdaas, fosfaatpulber(ph reguleerimiseks), kollase veresoola 1%-line lahus
7. Milline roll on K4Fe(CN)6 tööreaktiivis? Kas ja millega võinuks teda asendada ?
Tema oksüdatrsiooni käigus tekkiv ühend on värviline (kollane) ja see võimaldab määrata optilist tihedust. Oleks võinud asendada ka mõnda bensidiini derivaadiga.
8. Milline keskkonna pH väärtus on sobiv GOx-i ja POx-i toimimiseks ja kuidas see tagati ?
Optimaalne ph on 6.0, mis tagati fosfaatpuhvri abil, mida kasutati tööreaktiivi valmistamisel.
9. Milleks oli antud töös vaja kaliibrimissirget ja kuidas toimisite, et kaliibrimissirget koostada?
Kalibreerimisgraafik oli vajalik, et määrata glükoosisisaldus uuritavas lahuses. Selleks tehti kindla glükoosisisaldusega lahused, lasti ensüümil neid oksüdeerida ja määrati vastavad optilised tihedused.
10. Oletagem, et glükoosi kontsentratsioon 200 korda lahjendatud viinamarjamahlas on 0,5 mg/ml. Mitu massi% glükoosi sisaldub selles mahlas ? Eeldagem, et mahla tihedus d =1,0 g/cm3?
X = C ⋅ L⋅ 10-3 ⋅ d ⋅ 100
X= 0,5 ∙ 200 ∙ 10-3 ∙ 1 ∙ 100 = 10%