Biokeemia praktikumi K.T vastused (5)

1.1 VALKUDE REAKTSIOONID
1. Nimetage, millised toodud valkude reaktsioonidest on üld-, millised erireaktsioonid ja
põhjendage sellist jaotust.
Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi:
-universaalsed e üldreaktsioonid (biureedireaktsioon-on tingitud peptiidsidemete esinemisest), mis on omased kõikidele
valkudele ,
- spetsiifilised e erireaktsioonid (tiooli-, ksantoproteiini -, Milloni reaktsioon jt), mis on
iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele.
2. Kirjutage aminohappe molekuli üldistatud struktuurivalem . Kuidas aminohappeid
klassifitseeritakse radikaali keemilise ehituse järgi?
Valkude koostises leidub 20 proteogeenseteks aminohapeteks.
Mõningad valgud sisaldavad ka nn ebaharilikke aminohappeid, peamiselt üldlevinud aminohapete hüdroksü-, metüül-, fosforüül- jt derivaate.
Polaarsete mitteionogeensete radikaalidega: Gly, Ser, Asn, Gln, Thr, Cys, Tyr
Ionogeensete radikaalidega aluselised Arg, Lys, His
Apolaarsete radikaalidega: Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro
Ionogeensete radikaalidega happelised : Asp, Glu
3. Kuidas tekib peptiidside? Kirjutage reaktsioonivõrrand, kasutades vabalt valitud
aminohappeid.
Peptiidsideme moodustumine
4. Kirjutage 2 polüpeptiidahela fragmenti ja näidake, kuidas tekib biureetkompleks valguga.
5. Milliste aminohapete esinemist valgus näitab positiivne
a) Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon -Positiivne reaktsioon näitab tsüsteiini (Cys) esinemist valgus
b) Ksantoproteiinreaktsioon (xanthos – kollane) tõestab aromaatset tuuma sisalda-vate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus
c) Milloni reaktsioon - Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega
valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid.
6. Kirjeldage ksantoproteiini- ja Milloni reaktsiooni kemismi.
ksantoproteiini : Konts.lämmastikhappe lisamisel denatureerib valk pöördumatult ja sadestub. Katseklaasi sisu soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend on intensiivselt kollase värvusega ja käitub hape /alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas
oranži värvuse.
Milloni reaktsioon: Milloni reaktiiv -elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga.
Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. Kuna türosiin esineb enamiku valkude koostises, siis suurem osa valkudest annab positiivse Milloni reaktsiooni, mille puhul valgu lahus või denatureerunud valgu sade värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)- punaseks.
7. Mis on valgu isoelektriline punkt (pI)?
Valgu pI näitab keskkonna pH väärtust, mille juures valgumolekulis on positiivsete ja negatiivsete laengute hulk võrdne, seega molekuli summaarne laeng võrdub 0-ga.
Sellest tingituna valgumolekulid agregeeruvad hõlpsasti ning sadestuvad lahusest välja. Seevastu pI-st oluliselt erineva pH väärtusega keskkonnas omandavad kõik valgumolekulid ühesuguse laengu („+“ või „-“), valk-valk interaktsioonid lakkavad, agregatsiooni ja väljasadestumist ei toimu.
8. Millistel juhtudel ei kaasne valgu denatureerumisega tema lahusest väljasadenemist?
Denatureerumise temperatuur sõltub valgu loomusest ja keskkonna koostisest. Tavaliselt kaasneb denatureerumisega valgu väljasadestumine lahusest. Kui aga keskkonna pH väärtus erineb tunduvalt valgu isoelektrilise täpi (pI) väärtusest, siis ei pruugi denatureerunud valk lahusest välja ei
sadestuda.
9. Mida tähendavad mõisted
a) valkude denaturatsioon - valgu unikaalse ruumilise struktuuri lagunemine , selle käigus grupeeruvad ümber või katkevad ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed, kuid säiluvad aminohappeid ühendavad peptiidsidemed.
b) valkude hüdrolüüs - valgu peptiidsidemete lagunemine
c) valkude väljasoolastamine
- Neutraalsete soolade [(NH4) 2SO4 , MgSO4, NaCl jt.] kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni , millega kaasneb väljasadestumine lahusest.
- Valkude detekteerimiseks (kindlakstegemiseks) lahustes või kasutatav kvalitatiivse analüüsi meetod. Toimub väljasoolastamine lahusest erinevate valgufraktsioonide lahutamiseks.
10. Loetlege valke denatureerivad tegurid ja selgitage, mis valgumolekulis nende toimel aset leiab.
Практически любое заметное изменение внешних условий, например, нагревание или обработка белка кислотой приводит к последовательному нарушению четвертичной, третичной и вторичной структур белка. Обычно денатурация вызывается повышением температуры, действием сильных кислот и щелочей, солей тяжелых металлов, некоторых растворителей (спирт), радиации и др.
Денатурация часто приводит к тому, что в коллоидном растворе белковых молекул происходит процесс агрегации частиц белка в более крупные. Визуально это выглядит, например, как образование «белка» при жарке яиц.
11. Millised vaadeldud teguritest põhjustasid valkude pöördumatut, millised pöörduvat
denaturatsiooni?
- Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril pöördumatult, kuna ruumilist struktuuri
fikseerivad nõrgad sidemed katkevad. Denatureerumise temperatuur sõltub valgu loomusest ja keskkonna koostisest.
- Etanool , atsetoon jt. veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete (= füdrofoobsete) radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada , denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada.
12. Millele põhineb globuliinide ja albumiinide lahusest väljasadestamine (väljasoolastamine)
neutraalsete sooladega?
Sadestumise protsessi mõjutavad valgu hüdrofiilsus / hüdrofoobsus, laeng, molekulmass ja muud omadused. Nii sadestuvad globuliinid (NH4)2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinide sadestumiseks aga on vaja
soola küllastunud lahust.
1.2 SÜSIVESIKUTE REAKTSIOONID
1. Kuidas jaotatakse monosahhariide süsinikuaatomite arvu, molekuli keemilise ehituse ja molekuli kuju järgi?
Vastavalt struktuurile: mono - , oligo- ja polüsahhariidideks.
Monosahhariidid/ monoosid (= lihtsuhkrud) täidavad organismides energeetilist rolli, kuuluvad koensüümide ja nukleiinhapete koostisse, on oligo- ja polüsahhariidide „ehituskivideks“. Üldvalem on Cx(H2O)y, erinevad nad stereostruktuurilt (funktsionaalsete rühmade ruumilise paigutuse poolest)
Molekuli keemiliselt ehituselt on nad kas lineaarsed polühüdroksüaldehüüdid või polühüdroksüketoonid või molekulisisese tsüklisatsiooni tulemusel tekkivad tsüklilised poolatsetaalid või poolketaalid.
2. Millise keemilise omaduse järgi klassifitseeritakse oligosahhariide? Nimetage nende
rühmade esindajaid.
Oligosahhariidide oluliseks klassifitseerimise tunnuseks on vaba hemi- e poolatsetaalse või hemi- e poolketaalse hüdroksüülrühma esinemine või puudumine molekulis, mille järgi neid jaotatakse redutseerivateks (= taandavateks) ja mitteredutseerivateks (= mittetaanda vateks).
3. Millistele keemilistele omadustele (funktsionaalsetele rühmadele) baseerub enamus süsivesikute kvalitatiivseid reaktsioone?
Baseerub karbonüülrühma esinemisele molekulis (hõbepeegli reaktsioon, reaktsioon Fehlingi lahustega jt). Reaktsioonitingimustest sõltuvalt oksüdeeruvad suhkrud seejuures erinevateks produktideks . Leeliselises keskkonnas redutseerivad suhkrud metallide ioone (Ag+, Cu2+, Fe3+) ning teisi oksüdeerijaid, kusjuures suhkrumolekuli süsinikuahel reaktsiooni käigus reeglina laguneb ning tekib mitmete oksüdatsiooniproduktide segu. Neutraalses või happelises keskkonnas toimub suhkrute oksüdatsioon ilma molekuli destruktsioonita ja produktideks on mitmesugused happed (aldoonhapped, uroonhapped).
4. Millised reaktsioonid olid seotud furfuraali ja 5-hüdroksümetüülfurfuraali tekkimisega?
Kirjutage nende ühendite struktuurid ja kirjeldage, millest ning mille toimel nad moodustuvad.
Mõlemad aldehüüdid moodustavad kondenseerumisel fenoolidega (α-naftool, resortsinool jt) värvilisi ühendeid (Molisch’i test, Selivanoff'i reaktsioon).
Suhkrute kuumutamisel tugevate mineraalhapete juuresolekul moodustub pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfuraal, heksoosidest 5-hüdroksümetüülfurfuraal.
Tekkivad ühendid reageerivad (polükondenseeruvad) mitmealuseliste fenoolidega, andes värvilisi produkte, mida sageli kasutatakse ka suhkrute kvantitatiivseks määramiseks.
5.Milline läbiviidud reaktsioonidest võimaldab kindlaks teha mistahes süsivesiku esinemist lahuses?
Molisch'i testi võib lugeda süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitestiks, kuna positiivse reaktsiooni annavad nii mono-, oligo- kui polüsahhariidid. Isegi nukleiinhapped ja glükoproteiinid annavad positiivse Molischi reaktsiooni, kuna tugevas happelises keskkonnas toimub pikapeale monosahhariidide vabanemine . Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad, moodustades kas furfuraale või 5-hürdoksümetüülfurfuraale. Tekkinud produktid reageerivad edasi α-naftooliga(C10H7OH), moodustades purpurse kihi uuritava
lahuse ja happe piirpinnale.
6. Mis on osasoonid ? Miks saab osasoonide tekke reaktsiooni kasutada süsivesikute kvalitatiivse reaktsioonina?
Osasoonid on süsivesikute derivaadid , mis tekivad redutseeriva ehk taandava suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga.
Kõrvuti monoosidega moodustavad osasoone ka taandavad oligosahhariidid . Osasoonid kristalluvad lahustest hõlpsasti välja, kusjuures tekkivate kristallide kuju ja sulamistemperatuur on lähtesuhkrule iseloomulikud. Osasooni kristallide kuju järgi on võimalik eristada ka neid suhkruid, mille stereostruktuurid erinevad
vaid ühe kiraalse tsentri konfiguratsiooni poolest.
7. Millise reaktiiviga viiakse läbi hõbepeegli reaktsiooni ja millised tegurid võivad segada positiivse reaktsioonitulemuse saamist?
Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest (Tolleni regent ) sadestub metalliline hõbe aldehüüdide, seega ka taandavate suhkrute toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli. Tolleni reaktiivis on aktiivseks komponendiks AgNO3 ja NH3 baasil tekkiv diammiinhõbe(I) [Ag(NH3)2]+.
Määrdunud katseklaasi kasutamisel , ettevaatamatul soojendamisel või reaktiivide kogustega liialdamisel tekib
tumehall või must sade ja peeglit ei teki.
8.Valige välja reaktsioonid, millised võimaldavad eristada taandavaid ja mittetaand-avaid suhkruid.
-Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega (annavad taandavad suhkrud)
- Hõbepeegli reaktsioon (annavad taandavad suhkrud)
9. Millist reaktsiooni kasutatakse mono- ja disahhariidide eristamiseks? Milline on selle reaktsiooni kemism ?
Barfoed' reaktsioon võimaldab eristada taandavaid monosahhariide oligosahhariididest, kuna nõrgas
happelises keskkonnas taandavad vaske üksnes monosahhariidid.
Reaktsioon Barfoed'
reaktiiviga, nii nagu Fehlingi reaktiivigagi, annab punase vask(I)oksiidi Cu2O sademe
10. Iseloomustage järgmiste reaktiivide koostist:
a) Fehling’i reaktiiv - leeliseline vask(II)-tartraatkompleks, mis saadakse Fehlingi I lahuse ( CuSO4 vesilahus ) ja Fehlingi II lahuse (leeliseline K,Na-tartraadi e Seignett'i soola vesilahus) kokkusegamisel
b) Barfoed’ reaktiiv - [vask(II) atsetaadi Cu(CH3COO)2 lahus äädikhappes]
c) Molisch’I reaktiiv- α-naftooli (C10H7OH) lahus alkoholis
11. Milline süsivesik on sahharoos ja mis on tema hüdrolüüsi produktideks? Millise reaktsiooniga saab kindlaks teha, kas toimus sahharoosi hüdrolüüs?
Sahharoos ( lauasuhkur )on glükoosist ja fruktoosist koosnev disahhariid keemilise valemiga C12H22O11
Kuna positiivse reaktsiooni (Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega) annavad ainult taandavad suhkrud, siis sahharoos Fehlingi reaktiiviga ei reageeri, küll aga reageerivad tema hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos .
Sahharoosi hüdrolüüsi saab kiirendada kas ensümaatiliselt või happe toimel kõrgel
temperatuuril. Sahharoosi hüdrolüüsi protsessi nimetatakse inversiooniks ja tekkivat glükoosi ja fruktoosi ekvimolaarset (moolide suhe 1:1) segu tuntakse invertsuhkru nime all.
12. Milline süsivesik on tärklis?
Tärklis on taimedes olev polüsahhariid, (C6H10O5)n, on puhtal kujul vees lahustumatu, lõhnatu ja maitsetu valge pulber, koosneb kahest glükoosi polümeerist: amüloosist ja amülopektiinist (nende suhe 20:80, 30:70).
Kuidas saab kindlaks teha
a) tärklise esinemist lahuses
Tärklistele iseloomulik omadus moodustada joodiga intensiivselt lillakas -siniseid komplekse on tingitud polüsahhariidi ahelate keerdumisest joodi molekulide ümber. Tekkinud kompleks laguneb kõrgemal temperatuuril ja kaotab värvuse (pöörduv reaktsioon).
b)teralise tärklise päritolu
Joodiga värvuvad ka taimsest materjalist (kartulist, teraviljadest) eraldatud natiivsed tärkliseterakesed ning värvununa on nende suurus ja kuju mikroskoobis hõlpsamini vaadeldavad, võimaldades kindlaks teha, millisest taimest tärklis pärineb.
1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID
1. Kirjutage rasva, glütserofosfolipiidi, vaha ja steroidi üldvalemid.
Rasvad e. triatsüülglütseroolid (nimetatakse ka neutraalrasvadeks, samuti triglütseriidideks)
on keemiliselt ehituselt rasvhapete glütserüülestrid.
Glütserofosfolipiid
Vahad on aineklass estrite rühmast, kõik kõrgemate rasvhapete estrid kõrgemate alkoholidega (va glütserooliga).Vahad tekivad kõrgemate rasvhapete esterifitseerumisel
Steroidide puhul kuuluvad rasva koostisse aromaatsed ühendid.
kolesterool
2. Millest on tingitud lipiidide hüdrofoobsus ja millised läbiviidud reaktsioonidest näitasid seda?
Lipiidide lahustumatus vees ja vesilahustes on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikkade süsivesinikradikaalide sisaldusest molekulis.
3. Mida tähendab amfifiilsus ja millised lipiidid on amfifiilsed?
Glütserofosfolipiidid kujutavad endast amfifiilseid (= amfipaatseid) molekule, sest lisaks kahele rasvhappe radikaalile, mis annavad molekulile hüdrofoobsuse, sisaldavad nad fosforhappe jääki, mille kaudu seonduvad erinevad aminoalkoholid ja mille tulemusena moodustub molekulis polaarne tsenter. Just amfipaatsuse tõttu saavad need lipiidid moodustada vesikeskkonnas struktuure, nagu membraanid, vesiikulid või liposoomid.
4. Millised lipiidid kuuluvad bioloogiliste membraanide koostisse?
Levinuim loomne sterool on kolesterool, mida leidub pea kõikide loomsete rakumembraanide koostises ja mis tagab membraanide läbitavuse ja liikuvuse/voolavuse.
Taimerakkude membraanides sarnast funktsiooni täitvate steroolide ehk fütosteroolide
esindajad ergosterool , stigmasterool, kampesterool jt erinevad kolesteroolist ja ka
üksteisest C-17 asendusrühma ehituse poolest.
5. Millise reaktsiooniga saab kindlaks teha, kas lipiid sisaldab küllastumata rasvhappeid ? Esitage reaktsiooni kemism.
Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse
uurimisega reaktsiooni halogeenidega.
6. Valige lipiidid, mille lahuses Br värvus kaob: stearhape , päevalilleõli, linoleen-hape, palmithape , maisiõli. Põhjendus?
Küllastatud, küllastamata
7. Millist informatsiooni lipiidi kohta annab akroleiini tekkimine ja millised lipiidid annavad positiivse akroleiiniproovi?
Glütserooli (propaantriooli) kuumutamisel, eriti vett siduvate ainete juuresolekul, tekib
terava lõhnaga küllastamata aldehüüd propenaal ehk akroleiin . Sama reaktsiooni annavad
rasvad ja glütserofosfolipiidid, kuid ei anna glütserooli mittesisaldavad lipiidid (vahad,
sfingolipiidid jt). Seega võimaldab akroleiini moodustumine otsustada, kas tegemist on
glütserooli sisaldava või mittesisaldava lipiidiga.
8. Joonistage steroidide ehituslikuks aluseks olev steraanituum. Millega põhjendate, et kolesterool on tsükliline alkohol ?
9. Liebermann -Burchard’i test annab kolesterooli esinemise korral tumerohelise värvuse. Kas / miks võivad ka taimeõlide lahused anda rohelise värvusega reaktsioonisegu?
10. Milliseid reaktiive kasutatakse Liebermann-Burchard’i testi läbiviimiseks?
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu.
11. Kuidas teha kindlaks lipiidide esinemist
a) tahkes materjalis - Rasvapleki proov (Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk, millest paberi läbipaistvus suureneb)
b) vedelikus – Emulsioonitest (Rasvad lahustuvad orgaanilistes solventides, nagu
kloroform, benseen , aga ka atsetoon, metanool jt. Kui taolises solvendis valmistatud
rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt segada või loksutada,
siis moodustub õli-vees tüüpi emulsioon .)
12. Mis on emulsioon ja mis on emulgaator ?
Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide
nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks
(dispergeerunud faas) on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus (pidevas
faasis).
An emulsifier (emulgent) is a substance that stabilizes an emulsion by increasing its kinetic stability. One class of emulsifiers is known as surface active substances, or surfactants. Eg. egg yolk,honey, and mustard , Soy lecithin is another emulsifier and thickener. Both mayonnaise and Hollandaise sauce are oil-in-water emulsions that are stabilized with egg yolk lecithin or other types of food additives such as sodium stearoyl lactylate.
2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
1. Mis on kromatograafia , millel see põhineb ja milliseid kromatograafia liike teate?
Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval
jaotumisel liikuva (= mobiilse) ja liikumatu (= statsionaarse ) faasi vahel.
Mobiilse faasi agregaatolekust sõltuvalt eristatakse gaasi-, vedelik- ja ülekriitilise fluidumi
kromatograafiat.
Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest eristatakse järgmisi kromatograafia liike: jaotuskromatograafia, adsorptsioonkromatograafia, afiinsuskromatograafia, ioonvahetuskromatograafia, geelkromatograafia.
2. Selgitage geelkromatograafia meetodi põhimõtet.
Geelkromatograafia e geelfiltratsioonkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest,
mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine e fraktsioneerimine nende
molekulmassi suuruse järgi. Meetodit tuntakse ka molekulaarsōelte, aga samuti
eksklusioonkromatograafia nime all.
Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide (bio- või tehispolümeerid) lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kusjuures proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.
3. Milline ühine omadus iseloomustab kõiki geelkromatograafia kolonnide täidisena
kasutatavaid materjale?
Kolonn on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega
Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist (glükoosi polümeer), agaroosist (lineaarne punavetikatepolüsahhariid, vōi polüakrüülamiidist.
4. Miks ei tohi kolonnist eluaati koguda liiga kiiresti?
Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda
Voolukiirus peab olema optimaalne, et tsooni laienemist põhjustava massiülekande ja difusiooni mõju lahutuvusele oleks võimalikult väike.
5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx.
Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx,
mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva
molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne.
Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht,
mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on
maksimaalne.
6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht?
Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse,
siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga
Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga.
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse,
liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax,
milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt.
7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse?
Millised on Rf piirväärtused?
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille
elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse
liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile:
Rf = Vx – Vxmin / Vxmax – Vxmin
Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 8. Mida mõistetakse neelduvuse ehk optilise tiheduse (A ehk D) all?
Spektroskoopia meetodeid , mis baseeruvad elektromagnetilise kiirguse neeldumisele ehk
absorptsioonile uuritavas aines tuntakse absorptsioonspektroskoopia nime all. Mõõdetavaks
parameetriks on absorptsioonspektroskoopia puhul aines absorbeerunud energia
intensiivsus (= tugevus).
(Väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse) absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval
lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine läbi viiakse, sõltuvad uuritavate ainesegude
koostisest
9. Millistest teguritest sõltub teatava lainepikkuse juures mõõdetud optilise tiheduse väärtus
(avaldis vastavalt Beer ’i seadusele)?
Absorptsioonspektroskoopia baseerub Lambert’i ja Beer’i seadustele , mida kirjeldavate
võrrandite kombineerimisel on saadud järgmine võrrand:
I = Io ⋅10 - ε⋅c⋅l , kus
I – proovi läbinud valguse intensiivsus,
Io – langeva valguse intensiivsus.
Selle võrrandi teisendamise ja logaritmimise teel on saadud Lambert-Beer’i võrrand
üldtuntud kujul:
A = log Io / I = l ⋅ c⋅ ελ
10. Mis on kromatogramm ja millist informatsiooni see annab uuritava segu koostise
kohta?
Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist
sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks
2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE
MÄÄRAMINE
1. Millistesse gruppidesse võib karotenoidid jaotada ja mille poolest need grupid
erinevad?
Karoteenid - hapnikku mittesisaldavad molekulid, koosnevad süsinikust ja vesinikust; esindajateks on karoteeni α -, β -, γ-, δ-, ζ- jt isomeerid, samuti lükopeen,
Ksantofüllid – hapnikku sisaldavad molekulid; esindajateks luteiin , zeaksantiin jt.
2. Iseloomustage karotenoidide molekuli ehitust ja sellest tulenevaid omadusi.
Karotenoidid keemilise ehituse poolest klassifitseeritakse kui tetraterpenoide (sisaldavad 40 süsiniku aatomit). Struktuurilt on nad polüeensed ahelad , mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid.
3. Millistes rakustruktuurides karotenoidid paiknevad ja milline on nende roll
taimerakkudes?
Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides, aga ka mõningates teistes fotosünteesivates
organismides (vetikates, mõnedes seentes ja bakterites ) sisalduvad fotosünteesi abipigmentidena karotenoidid. Viimased absorbeerivad valgust klorofüllist mõnevõrra erinevatel lainepikkustel ja on seega täiendavateks kiirguse retseptoriteks.
4. Selgitage spektrofotorimeetri tööpõhimõtet.
Spektrofotomeetrite oluliseks karakteristikuks on mõõtmiseks kasutatava kiirguse lainepikkuste intervall (riba laius) ja absorbtsiooni mõõtmise lineaarne piirkond (ulatus).
Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350–650 nm, kasutades võrdluslahusena puhast lahustit (ekstrahenti). Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega näidatakse ära ja märgitakse protokollivihikusse need lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid (λmax) ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused.
5. Millises lainepikkuste vahemikus paiknevad karotenoidide neeldumismaksimumid ja
millest on see tingitud?
Karotenoidide võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas (~400...~700 nm) tuleneb nende molekuli ehitusest, mida iseloomustab polüeensus, st molekul koosneb pikast, konjugeeritud kaksiksidemeid sisaldavast süsivesinikahelast
6. Mis on molaarne ekstinktsioonikoefitsient e -tegur ja millist ekstinktsioonikoefitsienti
kasutasite teie antud töös?
Teatmekirjanduses leiduvad andmed väga paljude karotenoidide ekstinktsioonikoefitsientide
(Ε1cm1%) väärtuste kohta, st karotenoidide 1%-liste lahuste absorptsiooni väärtuste kohta.
7. Mida tähendab termin „ekstraktsioon“ ja millega põhjendate antud töös kasutatud ekstrahendi valikut?
karotenoidide ekstraktsioon (=väljalahustamine) proovist sobiva orgaanilise lahustiga (ekstrahendiga) ja ekstrakti filtrimine .
- ekstraktsioon - vedelate või tahkete ainete segust teatud komponentide väljalahustamise protsess, milleks kasutatakse selektiivseid lahusteid - ekstrahente.
β- karoteen ei lahustu vees ja vesilahustes, ka etanoolis kui polaarses lahustis on karoteeni lahustuvus küllaltki piiratud, kuid apolaarsetes orgaanilistes lahustites, nagu alifaatsed ja tsüklilised süsivesinikud või nende segud ( petrooleeter , bensiin), dietüüleeter jt lahustub β-karoteen hästi. Optilist aktiivsust β-karoteen ei oma.
8. Millega põhjendate veevaba soola kasutamise vajadust uuritava materjali ekstraktsiooniks ettevalmistamisel?
…veevaba Na2SO4, et taimses materjalis sisalduvat vett siduda, jätkates samal
ajal massi hõõrumist
9. Selgitage, mida väljendab kasutatav ühik mg% ja milline seos on tal ühikuga %?
Karotenoidi sisaldus (K, mg %) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt siintoodud valemile:
K = A ⋅ V ⋅ d ⋅ 103/ Ε1%1cm ⋅g = mg%,
Ε1cm1% – vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse
absorptsioon) sama λmax juures,
10. Millisesse vitamiinde klassi A- vitamiin kuulub?
β-karoteenist tekib kaks, α- ja γ- karoteenist ning β-krüptoksantiinist üks retinaali molekul.
Vitamiin A-aktiivsust omavad lisaks retinaalile ka retinool , retineenhape ja retinooli estrid
Vitamiin A(retinool)
A-vitamiin (ehk enimkasutatava komponendi järgi retinool) on rasvlahustuv vitamiin, mis on tähtis luu kasvuks ja nägemisteravuse hoidmiseks.
3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
1. Millist informatsiooni invertaasi kohta annab tema süstemaatiline nimetus β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas?
(ehk β-fruktofuranosidaas) on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi
2. Kirjutage invertaasi poolt katalüüsitava reaktsiooni skeem.
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide (süsivesikud, mis sisaldavad fruktoosi molekuli
jääki furanoosi vormis) hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule:
β-D-fruktofuranosiid + H2O -(invertaas) → β, D-fruktoos + mono- või oligosahhariid
3. Skitseerige sahharoosi molekul ja näidake, milline side invertaasi toimel hüdrolüüsub.
Sahharoos on looduses kõige levinum β-D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos
4. Mille toimel lisaks invertaasile võib aset leida sahharoosi hüdrolüüs? (Meenutage töös 1.2 läbiviidud reaktsioone!)
Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega
5. Mis on invertsuhkur ?
Sahharoosi hüdrolüüsi protsessi nimetatakse inversiooniks ja tekkivat glükoosi ja fruktoosi ekvimolaarset (moolide suhe 1:1) segu tuntakse invertsuhkru nime all
6. Joonistage Michaelis-Menten’i kineetikaga kirjeldatavale ensüümireaktsioonile graafiline sõltuvus v versus [S]. Näidake, millises graafiku piirkonnas toimus invertaasi aktiivsuse (reaktsiooni kiiruse) mõõtmine meie töös, kui on teada, et [S]>> Km . Millist kiirust me mõõtsime?
7. Kirjutage Cu(II)-triloon B kompleksi struktuur. Nimetage kaks põhjust selle, tugevalt aluselise reaktsiooniga lahuse kasutamiseks invertaasi aktiivsuse määramisel.
Antud töös kasutatakse kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Nimetatud kompleks valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola (EDTA-Na, tuntud kui triloon B). See reaktiiv täidab vaadeldava meetodi puhul kahesugust rolli:
• tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pHopt ≅ 4,8, inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni,
• tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)- triloon B kompleksi.
8. Selgitage, mida tähendab invertaasi preparaadi aktiivsus 85 μkat/ml sisuliselt?
1 mikrokatal (1 μkat) on ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jooksul 30 ºC juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (1 μmol/s), st antud juhul 1 μmol taandavat suhkrut.
9. Kuidas tuleb toimida, et valmistada tahkest invertaasi preparaadist 5,0 ml lahust, milles ensüümi kontsentratsioon on 4,0 mg/ml?
10. Kasutasite töös 7%-list sahharoosi lahust. Milline on sellise sahharoosi lahuse molaarne kontsentratsioon (Mr = 342)? Millises suhtes (suurem/ väiksem/võrdne)on see invertaasi Km väärtusega, kui on teada, et sahharoosi hüdrolüüsil Km =26 mM?
3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIVSUSE MÄÄRAMINE
1. Kirjutage lõik valgu polüpeptiidahelast ja näidake, millistele sidemetele toimivad proteaasid.
Vt.lk80
2. Mida mõistetakse ensüümide spetsiifilisuse all ja milliseid proteaaside spetsiifilisuse
aspekte eristatakse?
Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned
lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid
(piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs).
Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase.
Eksopeptidaaside esindajateks on karboksüpeptidaasid (R2 = Cterminaalne aminohape ) ja aminopeptidaasid (R1 = N- terminaalne aminohape), mis lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid.
3. Kuidas klassifitseeritakse proteaase optimaalse pH väärtuse järgi ja millisesse rühma
kuulus teie uuritud ensüüm?
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH ≅
2,5), neutraalseid (pH ≅ 7,2) ja leelisproteaase (pH ≅ 9,0).
4. Palun iseloomustage proteaasi substraadina kasutatavat ainet kaseiini . Millised reaktsiooniproduktid tekivad kaseiini hüdrolüüsi käigus?
Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on fosfoproteiin (смесь неск. фосфопротеидов (осн. компоненты - as, b- и (-казеины) сходной структуры). Tänu kaseiini molekulide kõrgele hüdrofoobsusele esineb ta piimas mitsellidena. Piimast eraldatud kaseiin vees praktiliselt ei lahustu, küll aga lahustub vees hästi kaseiini Na-sool (Na-kaseinaat). Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini. hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. Selles etapis sisaldab reaktsioonisegu peamiselt pika ahelaga peptiide,märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata ja on tekkinud ainult vähesel määral vabu aminohappeid ning madalmolekulaarseid peptiide.
5. Kirjutage TKÄ struktuurivalem ja põhjendage TKÄ kasutamise eesmärke antud töös.
Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid , mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe
eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille
kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi
toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide
sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
6. Skitseerige graafilised sõltuvused
a) ensüümi aktiivsus-temperatuur;
b) ensüümi aktiivsus-keskkonna pH.
7. Millisel temperatuuril toimus proteaasi aktiivsuse määramine? Kuidas mõjutanuks
tulemust temperatuuri tõus termostaadis 25 Co võrra?
Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 μkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis
põhjustab 1 μmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 μmooli aminohapete vabanemise1 s
vältel 30°C juures.
8. Millise reaktsiooniprodukti kontsentratsiooni suurenemise järgi arvutasite proteaasi
aktiivsuse? Kirjutage selle aine struktuurivalem
aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse järgi
aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või μmol /ml (1 μmol = 181μg = 0,181 mg).
9. Mida spektroskoopias mõistetakse neelduvuse (lahuse optilise tiheduse) all ja millised
tegurid seda mõjutavad (Beer-Lambert’i seadus)?
Valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D)
Beeri seadus on empiiriliselt tuletatud optika seadus, mis seob omavahel valguse neeldumise lahuses ja lahuse omadused
I0 — интенсивность входящего пучка,
l — толщина слоя вещества, через которое проходит свет,
kλ — коэффициент поглощения
10. Oletagem, et teil tuleb valmistada tahkest ensüümipreparaadist 10 ml lahust kontsentratsiooniga 4,5 mg /ml. Kuidas toimite?
3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
1.Millisesse ensüümide klassi kuuluvad GOx ja POx?
glükoosi oksüdaas (GOx) ja peroksüdaas (POx)
GOx endast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina.
POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo - ehk kromoproteiin
2.Kirjeldage GOx-i ja POx-i poolt katalüüsitavaid reaktsioone.
GOx ( β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas), ta katalüüsib β,Dglükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja δ,Dglükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe.
POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide (elektronide doonorite) oksüdeerumist (= dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O.
Peroksüdaas
Oksüdeeritud substraat + H2O2 → Taandatud substraat + 2 H2O
3. Millist koensüümi vajab GOx ja milles seisneb koesüümi roll?
FAD mis toimib koensüümina.
FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas.
4. Kuidas avaldub ensüümi substraadispetsiifilisus antud töö puhul?
Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele β,D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata
glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul
5. Selgitage lahuse lahjendamise põhimõtet ja kirjeldage, kuidas tuleb toimida, et lahusest,
mis sisaldab 1,5 g/l glükoosi valmistada 25 ml lahust kontsentratsiooniga 0,3 g/l?
Lahjendamise põhimõte: lahjendamiseks võetud lahuse (standardlahuse) mahus ja lahjendatud lahuse lõppmahus sisaldub üks ja sama ainehulk , st kehtib võrrand
Cst ⋅ Vst = Clahj ⋅ Vlahj , kus
Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud
lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid.
6. Milline on töös kasutatava tööreaktiivi koostis?
25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse:
2,5 mg glükoosi oksüdaasi;
1,5 mg peroksüdaasi;
16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0;
K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni.
7. Milline roll on K4Fe(CN)6 tööreaktiivis? Kas ja millega võinuks teda asendada ?
Võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll), K4[Fe(CN)6] (kollane veresool ). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks . Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ( punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm.
POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini
derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt
8. Milline keskkonna pH väärtus on sobiv GOx-i ja POx-i toimimiseks ja kuidas see tagati ?
fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0
9. Milleks oli antud töös vaja kaliibrimissirget ja kuidas toimisite, et kaliibrimissirget koostada?
Kaliibrimisgraafiku koostamine on vaja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemiseks
Kaliibrimisgraafik koostatakse standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosi
kontsentratsiooniga proovide (katseklaasid 4, 5, 6) absorbtsiooni (optilise tiheduse)
väärtuste alusel. Graafiku x- telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg /ml) ja y-telg
proovi absorptsiooni väärtust (A).
Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses leitakse kaliibrimisgraafiku abil paralleelproovide (katseklaasid 2 ja 3) keskmise optilise tiheduse väärtuse järgi.
10. Oletagem, et glükoosi kontsentratsioon 200 korda lahjendatud viinamarjamahlas on 0,5
mg/ml. Mitu massi% glükoosi sisaldub selles mahlas ? Eeldagem, et mahla tihedus d =1,0
g/cm3?
glükoosisisaldus massiprotsentides (X,%) naturaalse mahla suhtes :
X = C ⋅ L⋅ 10-3 ⋅ d ⋅ 100 , kus
C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg /ml),
L – mahla lahjendustegur
d – mahla tihedus (g /cm3).
-------
X = C ⋅ V1 ⋅ L ⋅ 10-3 ⋅ 100/ V2 ⋅ G ⋅ (1 – W) , kus
C – glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses kaliibrimissirge järgi (mg /ml),
V1 – uuritava lahuse üldmaht (ml)
L – lahjendustegur,
10-3 – tegur üleminekuks grammidele,
V2 – värvusreaktsiooni läbiviimiseks võetud uuritava lahuse maht (ml),
G – uuritava materjali (mesi vm) kaalutis (g),
W – uuritava materjali niiskusesisaldus massiosana (leitakse teatmekirjandusest).
21