o võimele difundeeruda geeli pooridesse). Et segu läbi kolonni transportida ja sisalduvaid aineid üksteisest eraldada, elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust (eluaati) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- e väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduva aine elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Lühima ajaga väljuvad kolonnist molekulid, mis on liiga suured mahtumaks pooridesse. Nad väljuvad minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv. Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
polüakrüülamiidist (kopolümeer, mis koosneb akrüülamiidi ja -metüleen-bis-akrüülamiidi molekulidest). Kolonni iseloomustavad mahud: · Granulitevahelise vedeliku maht (). · Graanulitesisese vedeliku maht (). · Geelimaterjali ehk maatriksimaht (). · Täidise kogumaht ehk üldmaht (). Kolonnist väljuvat lahust kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis sisaldub segus, iseloomustab väljumis- ehk elueerimismaht . Aine x elueerimismaht on selline eluuadi maht, mille juures kolonnist väljuvas fraktsioonis on aine x kontsentratsioon maksimaalne. Minimaalne elueerimismaht selline elueermismaht, mille juures kolonnist väljuvad kõige suuremad molekulid (=). Maksimaalne elueerimismaht selline elueerimismaht, mille juures kolonnist väljuvad ka need molekuli, mille molekulid täielikult diffundeeruvad geeli pooridesse (=). Aineid, mille molekuli suudavad täielikult diffundeerida geeli
Mina tegin antud protseduuri kolonnis mis sisaldas geeli Sefadex G-75. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Täidise maht Vt Kolonni vaba maht, st graanulitevahelise vedeliku maht Vv Graanulitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali maht Vg Vt= Vs+Vg Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse. Ainet iseloomustab elueerimismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse siis väljuvad nad kolonnist kõige esimestena ja neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga ja tähistatakse Vxmin Vxmin=Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse,
Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et
täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku üldmaht ületab kolonni
kogumahu: Vxmax Vt.
Vxmax saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu: Vxmax=Vt Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht
Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikumisteguriga f: , (0
Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine 1. Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. 2. Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda iseloomustav tegur k. 3. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. 4. Arvutatakse täidise kogumaht Vt 5. Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav 6. maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg 7. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega 8. n = Vxmax / 2. 9. Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. 10. Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. 11. Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine. 1
lahuse makromolekulide dimensioonidega. Geelkromatograafias kasutusel olevad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Selleks, et uuritav proov saaks läbi kolonni liikuda, voolutatakse kolonni pidevalt vesilahusega ning kogutakse väljuv fraktsioon kindla mahu kaupa. Kogutud fraktsioonide kindlakstegemiseks kasutatakse füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid. Igal ainel, mis uuritavas proovis sisaldub, on elueerimismaht, mis sõltub aine molekulmassist ja kolonni parameetritest. Elueerimismaht on selline eluaadi maht, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige suurem. Kõige esimesena väljuvad kolonnist need molekulid, mis on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse. Nende molekulide elueerimismaht on minimaalne ja võrdub kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Kõige viimasena väljuvad kolonnist need molekulid, mille molekulmass on väike ja mis mahuvad geeli pooridesse
Igat ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis-ehk väljumismaht Vx , millearvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse V x1,Vx2 jne. Vx- eluendi maht, mille juures väljuv fraktsioon on maximaalne. Liiga suured molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse, väljuvad kolonnist kõige kiiremini, st et neil on minimaalne elueerimismaht V x min , see on võrdne vaba vedeliku mahuga. Vx min= Vv Need ained, mis on liiga väikse molekulmassiga, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aegaselt ja väljuvad kõige hiljem, need väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Seega Vx=Vt Juhul kui Vg on teada saab leida Vxmax i Vxmax= Vt-Vg Rf = (Vx-Vx min)/(Vxmax Vx min)
Vv -kolonni vaba maht.
Vs graanulitesisese vedeliku maht
Vg geelimaterjali maht
Vt üldmaht.
Seega: Vt= Vs +Vg+ Vv
Iga aine, mis sisaldub uuritavas segus iseloomustab elueerimis maht - Vx (V1, v2, v3....) mis
sõltub molekulmassist.
Vx selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava ained
kontsentratsioon on maksimnaalne.
Kõige väiksem elueerimismaht on kõige suuremates molekulides, mis ei mahu geeli
pooridesse, ja siis väljuvad esimesena. Vxmin on võrdne kolonni granulitevahelise mahuga.
Vxmin = Vv
Kõige suurem elueerimismaht on ainetes, mille molekulmass nii väike, täielikult
difundeeruda geeli pooridess. Need liikuvad kolonnis kõige aeglasem. VxmaxVt
Vxmax võiks leida kui on teada Vg. Vxmax=Vt Vg
Rf liikuvstegur . Rf= Vx Vxmin / Vxmax -Vxmin
0
· Kolonni vaba maht (Vv) · Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) · Geelimaterjali maht (Vg) · Täidise kogumaht (Vt) Vt = Vv + Vs + Vg Molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurustele ( võimele difundeerida geeli pooridesse). Et ained transportisid läbi kolonni ja eraldasid üksteisest, voolutatakse kolonni vesilahus ( nt soolalahus) ja kolonnist väljuvat eluaati kogutatakse kindla arvu fraktsioonide kaupa. Iga uuritavas segus oleval ainel on oma elueerimismaht Vx. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Suured molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse, väljuvad kolonnist esimesena ja on võrdsed kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Väikese molekulmassiga ained liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax
Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja erineva molekulmassiga aineid üksteisest eraldada, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni selleks sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati tuleb seejuures koguda kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx. Elueerimismaht sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni mõõtmetest. Uuritavas segus sisalduva aine x elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures väljub kolonnist fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Need molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, väljuvad kolonnist esimesena ja seda iseloomustatakse minimaalse elueerimismahuga Vxmin. Vxmin on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv Ained, mis täielikult difundeeruvad geeli pooridesse (väiksema molekulmassiga), liiguvad
· graanulitesisese vedeliku maht VS · geelmaatriksi maht Vg · täidise kogumaht Vt Kui kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele ehk vastavalt võimele difundeeruda geeli pooridesse. Kolonni voolutatakse sobiva vesilahusega, et ainete segu läbi kolonni transportida. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimismaht V x. Kui segus leidub molekule, mis ei mahu geeli pooridesse, siis need väljuvad kolonnist esimesena, minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = VV. Geeli pooridesse difundeeruvad täielikult ained, mille molekulmass on väike, nad liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on arvuliselt lähedane kolonni kogumahule Vt. Seega võib kromatograafilise protsessi lugeda lõpetatuks, kui
Mina tegin antud protseduuri kolonnis nr 2 ja geeliks oli Sefadex G-50. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Täidise maht Vt Kolonni vaba maht, st graanilitevahelise medeliku maht Vv Graanilitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali maht Vg Seega Vt= Vs+Vg Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse. Ainet iseloomustab elueerimismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse siis väljuvad nad kolonnist kõige esimestena ja neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga ja tähistatakse Vxmin vxmin=Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse,
Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. · Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. · Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. · Arvutatakse täidise kogumaht Vt · Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax / 2. · Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. · Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine.
osale alustasin eluaati koguma valmispandud katseklasidesse. Elueerimist lõpetasin, kui väljuv eluaat on värvitu. Analüüsisin võetud proovid spekrofotomeetriga, tegin vastavaid arvutusi ja kõveraid. Mõõtmised Sephadex'i mark = G75 k = 0,1 l = 24 cm d = 2 cm Vt = r2l = 75,4 cm3 Vg = k * Vt = 7,54 cm3 Vx max = Vt - Vg = 67,86 cm3 n = Vx max / 2 = 33,93 Katseandmed Fraktsiooni Elueerimismaht Optiline Lainepikkus number (ml) tihedus (A) (nm) 1 20 0,0089 670 2 22 0,1642 670 3 24 0,3314 670 4 26 0,2637 670
voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin - ehk minimaalne elueerimismaht, mis on võrdne kolonni vaba mahuga Vv kolonni vaba maht ( kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.) Vxmax - maksimaalne elueerimismaht (aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.)Vxmax = Vt Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille
Kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht Vs Graanulitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali maht Vg Seega Vt = Vv+ Vs+ Vg Ainet iseloomustab elumineerimismaht e väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane antud kolonni kogumahule. Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab kolonni kogumahu. Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada: Vxmax = Vt - Vg
· graanulitesisese vedeliku maht (Vs), · geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg), · täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt). Seega: Vt = Vv + Vs + Vg Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus on molekulid, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis see aine väljub kolonnist esimesena ning see aine väljuvad minimaalse elueerimismahuga (Vmin), mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv
Läbi tulnud vedelik kogutakse 2ml fraktsioonidena katseklaasidesse, et neid saaks spektromeetriliselt analüüsida. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Vt täidise maht Vv kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht) Vs graanulitesisese vedeliku maht Vg geelimaatriksi maht Vt=Vv+Vs+Vg Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse
voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx – eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin - ehk minimaalne elueerimismaht, mis on võrdne kolonni vaba mahuga Vv –kolonni vaba maht ( kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.) Vxmax - maksimaalne elueerimismaht (aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.)Vxmax = Vt – Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht
Läbi tulnud vedelik kogutakse 2ml fraktsioonidena katseklaasidesse, et neid saaks spektromeetriliselt analüüsida. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Vt täidise maht Vv kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht) Vs graanulitesisese vedeliku maht Vg geelimaatriksi maht Vt=Vv+Vs+Vg Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht V x. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht V xmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse
vastavalt molekulide suurusele. Et segu läbi kolonni transportida ja sisalduvaid aineid üksteisest eraldada, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust (eluaati) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- e väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduva aine elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Lühima ajaga väljuvad kolonnist molekulid, mis on liiga suured mahtumaks pooridesse. Nad väljuvad minimaalse elueerimismahuga Vx min, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vx min=Vv. Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vx max, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Et uuritava ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse (elueeritakse) koloni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust (eluaati) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueemiris- ehk väljumismaht , mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduv aine väljumis- ehk elueerimismaht on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st minimaalse elueerimismahuga , mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeerida geeli pooridesse,
Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on kaks olulist parameetrid: 1) kolonni vaba mahtu Vv (=Vxmin) ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu. 2) maksimaalset elueerimismahtu Vxmax ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja, mille elueerimismaht on kolonnis kindlaks määratud. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus. 2. Töö käik 1.3 Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Märkisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi ja seda iseloomustava teguri k. Sephadex'i mark: G-75 k = 0,1
(Vs), · geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg), · täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt). Seega: Vt = Vv + Vs + Vg Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus on molekulid, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis see aine väljub kolonnist esimesena ning see aine väljuvad minimaalse elueerimismahuga (Vmin), mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv
.. - selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljuvas fraktsioonis on vastava aine kontsentratsioon maksimaalne MINIMAALNE ELUEERIMISMAHT (Vxmin ): - kui segus on molekule, mis on liiga suured, et mahtuda kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena ehk kõige kiiremini - võrdne graanulitevahelise vedeliku mahuga Vxmin = Vv MAKSIMAALNE ELUEERIMISMAHT (Vxmax): - Ained, mille molekulmass on väiksem, difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ning liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt
voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin ehk minimaalne elueerimismaht = Vv kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena. Vxmax ehk maksimaalne elueerimismaht = Vt - aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt. Vxmax = Vt Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse
Seda teen seni, kuni kolonnis ei esine enam ühtegi värvust ning eluaadi värvus on muutunud värvituks. Kogusin kokku 33 katseklaasi (ehk 66 ml) fraktsioone. Kokku Vkokku=86,65 ml (koos ühendatud fraktsiooniga). Seejärel mõõdan katseklaasides olevate lahuse optilised tihedused, määramaks nende kontsentratsiooni. Selleks kasutan spektrofotomeetrilist meetodit. Optiline Fraktsiooni nr Elueerimismaht V, ml tihedus, A Ühendatud fraktsioon 20,65 0,1563 1. 22,65 0,2076 2. 24,65 0,4415 3. 26,65 0,2955 4. 28,65 0,012 5
pooridesse. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Fraktsioonides sisalduvate ainete kontsentratsiooni määramiseks kasutatakse füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht V x on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist kõige kiiremini, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, Vxmin= Vv. Küllalt väikse molekulmassiga ained, mis täielikult difundeerub geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, Vxmax Vt.
piirkonnas. Mõõtsin vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võis silma järgi täheldada vähimatki värvust. Koostasin 3-veerulise katseandmete tabeli. Mõõtmistulemused kandisn tabelisse, fikseerides ka värvusetute fraktsioonide numbrid ja elueerimismahud, märkides nende optiliste tiheduste väärtuseks 0. Katseandmete tabel Fraktsiooni nr. Elueerimismaht Optiline tihedus, A V, mL Ühendatud fraktsioon 18 0 1 20 0,141 2 22 0,388 3 24 0,064 4 26 1,984
On arvväärtuselt lähedane maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Töö käik Kolonni iseloomustamine Kasutusel on geelkromatograafia kolonn nr 3 (aknast kõige kaugemal). Kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark G-75 k = 0,1 Fraktsioneerimispiirkond: 3000 80000 D Materjal: dekstraan Täidise kõrgus L = 33 cm Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm Täidise kogumaht Vt = r 2 L = 0,9 2 33 = 83,98cm3 Geelmaatriksi maht Vg = k Vt = 0,1 83,98 = 8, 40cm3 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt - Vg = 83,98 - 8, 40 = 75,58cm3 Fraktsioonide üldarv V max 75,58 n= x = = 37, 78 38 2 2 Voolutuslahuse koostis 50 mMTris-HCl 150 nM NaCl pH = 7,5 Uuritava proovi koostis Dekstraansinine (sinine) Müoglobiin (pruun) DNP-aspartaat (kollane) Töö kolonniga Kõigepealt avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et voolutuslahuse nivoo oleks võrne täitegeeliga
soolalahus vm) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Ainet iseloomustab elumineerimismaht e väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni kolonnist. Kui segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vx min, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin= Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vx max, mis on lähedane antud kolonni kogumahule. Vxmax= Vt Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab kolonni kogumahu. Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada: Vxmax= Vt-Vg
Kolonni vaba maht (graanulitevahelise Vv vedeliku maht) Graanulitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali (maatriksi) maht Vg Vt=Vv+Vs+Vg Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin ehk minimaalne elueerimismaht = Vv kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena. Vxmax ehk maksimaalne elueerimismaht = Vt - aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt. Vxmax = Vt Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse
Geeli poori suurust ületavate mõõtmetega molekulide tungimine terakestesse on välistatud. Geelkromatograafia kolonni iseloomustasid järgmised mahud: · Täidise maht (Vt) · Kolonni vaba maht (Vv) · Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) · Geelimaterjali maht (Vg) Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele). Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx (eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.) Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Neil on minimaalne elueerimismaht (Vxmin = kolonni vaba maht). Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeerude täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga (Vxmax = Vt- Vg).
koguma fraktsioonen 2ml kaupa erinevatsesse katseklaasidesse · Siis mõõdetakse kõigi fraktsioonide optilised tihedused spektromeetriga. Arvutused Kõige esimesena mõõdetakse: 1) kolonni pikkus l= 22,6 cm, 2) kolonni diameeter d= 2,4 cm. 3) Seejärel arvutatakse kolonni kogumaht Vt= r2h= 3,14*(2,4/2)*22,6=85,15 cm3 4) k=0,1 5) Seejärel arvutatakse geelmaatrikis maht Vg=k*Vt = 85,15*0,1=8,51cm3 6) Vg lähtuvalt arvutatakse max elueerimismaht Vx max=Vt-Vg=85,15-8,51=76,64 cm3 7) Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml, seega n= Vx max /2= 76 /2=38 Esimese elueerimismaht oli 15 ml Optilise tiheduse table Dekstraansinine Müoglobiin DNP-aspartaat 670nm 410 nm 360nm 0,011 0,129 0,166
Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele). Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx (eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.) Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Neil on minimaalne elueerimismaht (Vxmin = kolonni vaba maht). Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeerude täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga (Vxmax = Vt-Vg). Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf: V x - v xmin R f = max V x - V xmin TÖÖ KÄIK, ARVUTUSED, TABELID, GRAAFIKUD Fraktsioonide arvutamine: r = 2,3/2=1,15 cm h = 29,5 cm Geeli maht:
molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse (elueeritakse) kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus vm) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht V x. Aine x väljumis- ehk elueerimismaht on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga Vv. Vxmin = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse,
Siniseid fraktsioone mõõtsin lainepikkusel 670 nm, pruune lainepikkusel 410 nm ja kollaseid lainepikkusel 360 nm. Tulemused ja nende interpreteerimine A. Kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid: ·Täidise materjal: Dekstraan ·Täidise mark: Sephadex G75 ·Täidist iseloomustav pundumistegur k=0.1 ·Täidise kõrgus: 28cm ·Kolonni sisediameeter:2.2 cm ·Arvutatud täidise kogumaht Vt=106 ·Arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vx;max=106-0.1*106=95.4 ·Arvutuslik fraktsioonide üldarv n=Vx;max/2= 95.4/2=47.7 B. Mõõtmistulemuste tabel ja kromatogramm. Fraktsiooni nr. Elueerimismaht V;ml Optiline tihedus,A 0 26 ml 0.000 1 2 0.002 2 2 0.065 3 2 0.366 4 2 0.307
elueerimismaht Vx on kindlaks määratus, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik · Kontrollitakse kolonni vertikaalsust · kolonni täidis: Sephadex G-75, tegur k = 0,1 · geelisamba kõrgus l = 31,4 cm · diameeter d = 1,6 cm · täidise kogumaht Vt = 63 ml · geelimaatriksi maht Vg = 0,1 63 = 6,3 ml · maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 63 6,3 = 56,7 ml · fraktsioonide üldarv n = 56,7 / 2 = 29 · statiivi võetakse vastav arv katseklaase · eluendi koostis: 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 7,5 · uuritav segu: o dekstraansinine (6mg/ml) o müoglobiin (6mg/ml) o 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml) · kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja · kolonni voolukiirus reguleeritakse piiridesse 0,7 1,0 ml/min
maksimaalne. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Esmalt märkisime üles Sephadex’i margi=> 675 ja seda iseloomustava teguri k=>0,1. Seejärel mõõdetakse geelisamba kõrgus L=>12,5 cm ja ja diameeter d=>2,7 cm. Arvutatakse täidise kogumaht Vt=>71,53 Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt=>7,15 ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vx max = Vt – Vg=>64.38. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2=>32,19. Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdatakse. Seejärel pandi kirja eluent=> NaCl 0,15 M. Varutakse väike keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine
Vx min = Vv Vastupidises olukorras, kui molekulmass on piisavalt väike täielikult geeli pooridesse difundeerumiseks, siis need molekulid liiguvad kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga, mis vastab peaaegu kasutatava kolonni kogumahule. Vx max = Vt Maksimaalse elueerimismahu saab arvutada, kui geelimaatriks on teada: Vx max = Vt - Vg Liikuvustegurit Rf kasutatakse nende ainete iseloomustamiseks, mis suudavad geeli pooridesse difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja:
liikuvusel läbi peeneteralise , võimalikult ühesuiguse poorsusega geeli. Geelid, mida kas , koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Geelkromotograafia kolonni iseloom järgmised mahud: täidise maht, kolonni vaba maht, graanulitesisese vedeliku maht, geelimaterjali maht. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromotograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse, st vastavalt molekuli suurusele.Ainet iseloomustan elueerimismaht. See on eluaadi maht , mis on kogutud kuni aine maks kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siois väljuvad nad kollonnist esimestena, st neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Ained, mille molekulmass son küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljubad maks
TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL KEEMIAINSTITUUT Bioorgaanilise keemia õppetool YKL3312 Biokeemia praktikum Laboratoorne töö 2. Segude lahutamine ja ainete identifitseerimine 2.2. Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil TALLINN 2010 2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE 2.2 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Geelkromatograafia on meetod, mis tugineb lahuses sisalduva erineva molekulmassiga ainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Selle meetodi puhul kasutatakse pundunud geeligraanulitega täidetud kolonne ja geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Ainete...
20 57,5 1,0875 21 59,5 0,9052 22 61,5 0,4464 23 63,5 0,1631 24 65,5 0,0533 25 67,5 0 Tulemused Kolonni parameetrid · Täidis: Sephadex G-75 · Pundumistegur: k = 0,1 · Täidise kõrgus: L = 32cm ja diameeter: d = 1,7cm · Täidise kogumaht: Vt = 72,63cm3 · Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 65,357cm3 · Fraktsioonide arv n = 25 Kromatogramm · Teades, et komponentideks olid: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml, Mr = 2 · 106 2. Müoglobiinist 6mg/ml, Mr = 1,7 · 104 3. DNP aspartaadist 0,3mg/ml Kuna sinine desktraansinine voolas läbi kolonni kõige kiiremini võib järeldada, et tema molekulmass on suurim. Kahjuks ma DNP aspartaadi molekulmassi ei tea, mistõttu on keeruline oletada, kumb väljus kolonnist enne, kes
difusiooni mõju lahutuvusele oleks võimalikult väike. 5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. 6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht? Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga.
3. Milline ühine omadus iseloomustab kõiki geelkromatograafia kolonnide täidisena kasutatavaid materjale? Kõik materjalid on polümeerid ja geeli pooridesse ei mahu ükski molekul, mis on samas suurusjärgus või suurem, kui antud geeli poor. 4. Miks ei tohi kolonnist eluaati koguda liiga kiiresti? Kui elueerida liiga kiiresti, siis erinevad molekulid ei jõua lahutuda ning nad väljuvad seguna. 5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx. Aine elueerimismaht on sellise eluaadi maht, milles oleva aine kontsentratsioon on kõige suurem 6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht? Minimaalne võrdne graanulitevahelise vedeliku mahuga ja maht, mille juures väljub esimene aine maksimaalse kontsentratsiooniga Maksimaalne lähedane kolonni mahule ning maht, mille juures viimane aine väljub maksimaalse kontsentratsiooniga. 7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse?
Fraktsioonides sisalduvate ainete kontsentratsiooni kindlakstegemiseks kasutatakse mitmeid füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv
annaabi.ee 
Sisene Facebook'ga
Sisene Google'ga
Sisene LinkedIn'ga
