MOLEKULAARBIOLOOGIA ja RAKUBIOLOOGIA (1)

1 MOLEKULAARBIOLOOGIA . 1. Kui aatom loovutab elektroni täielikult teisele aatomile, missugused keemilise sidemega on tegemist? Ioonside, sellised ained lahustuvad hästi, kuna ioonide hüdratatsioonienergia on suurem kui kristalli võreenergia 2. Miks vesi on hea lahusti (solvent)? Vesi on hea lahusti, sest ta lahustab nii tahkeid , vedelaid kui ka gaasilisi aineid. Vee molekul moodustab dipooli ning aatomid omandavad osalise laengu. Polaarsete ühenditega moodustab vesiniksidemeid, mis tagavad stabiilsust. 3. Termodünaamika II seadus. Kõik protsessid kulgevad tasakaalu e. minimaalse potentsiaalse energia poole e. entroopia kasvu suunas. Entroopia (S) on korrastamatuse mõõt [J/mol*K], korrastatud ­ madal entroopia. Isoleeritud süsteemid püüavad korrastatud olekust korrastamata poole. Tasakaal on siis, kui entroopia on maksimaalne.Entroopia muutus on null pöörduvate protsesside ja positiivne pöördumatute protsesside korral. Metaboolsed protsessid on üldjuhul korrastavad, need saavad toimuda ainult siis, kui neid tasakaalustab keskkonna korrastamatus. 4. Mis on kiraalsus ja kuidas seda kasutab loodus? ravimitööstus? Kiraalsus on olukord, kus tetraeedriline sidemete asetus (sageli asümmeetrilise süsiniku korral) võib kolmemõõtmelises ruumis olla kaht erinevat moodi ­ tekivad peegelpildid. Selliseid molekule kutsutakse optilisteks või stereoisomeerideks. Enamik molekule rakus koosnevad vähemalt ühest asümmeetrilisest süsiniku aatomist, mida kutsutakse ka kiraalseks süsiniku aatomiks . Looduses on kõik suhkrud D-isomeerid ja kõik aminohapped L-isomeerid. D-L süsteemi aluseks on glütseeraldehüüdi paigutus (2C OH paremal/vasakul). Ravimitööstus peab õigete ravimite tootmiseks arvestama ka kiraalsusi ja kasutama looduslikke, sest muidu ravim ei toimi. 5. Eukarüootne replikatsioon . Mehanism ja läbiviivad ensüümid. Replikatsiooni mehhanism pärineb peamiselt viiruse SV40 replikatsiooni uurimisest. Replikatsioon algab järjestusest, mida kutsutakse origin'iks, igas DNA-s on neid palju. DNA polümeraasid ei saa DNA- ahelat lahti keerata. Replikatsioonis üks ahel pikeneb järjest (juhtiv ahel) ja teine pannakse kokku juppidest (mahajääv ahel), mis ühendatakse DNA- ligaasi abil. Helikaas keerab biheeliksi lahti kasutades ATP energiat. Primaas teeb lühikese RNA praimeri, mis on komplementaarnte templeit DNA-ga ja seejärejl hakkab polümeraas seda pikendama moodustades lühikese 5'RNA-3'DNA tütarahela. Seejärel võtab polümeraas üle ja jätkab ahela pikendamist. Pol on seotud templeitahelaga seotuse tõttu Rfc-valguga (replication factor C), mis pöördudes muutub PCNA-ks (proliferating cell nuclear antigen ­ trimeerne valk, mis ümbritseb tütarDNA-d). Tavaliselt on mehhanism kahesuunaline ­ replikatsioonikahvlid liiguvad kahes suunas. Regulatsioon toimub kuuest MCM valgust koosneva helikaasi aktiivsuse kontrollimisega. Ensüümid: · Helikaas ­ keerab DNA biheeliksi lahti · DNA güraas e. topoisomeraas ­ kompenseerib lahtikeerdumist (aitab struktuuri hoida) · DNA-polümeraasid ­ vastutavad polünukleotiidahelate sünteesi eest 5'->3' suunas o - 4 subühikut, polümeraasi tootlikus, pole 3' eksonukleaasi aktiivsust o - vigade parandus o - replitseeriv ensüüm mitokondrites o - peamine polümeraas! Omab 3'-eksonukleaasi aktiivsust, teeb vähem vigu · DNA-primaas ­ sünteesib oligonukleotiidse praimeri · DNA- ligaas ­ ühendab mahajääva ahela fragmente 2 6. Mis on Okazaki fragmendid ja nende rolli DNA replikatsioonil. Okazaki fragmendid on lühikesed DNA jupid, millest pannakse kokku ahel, mis on komplementaarne DNA replikatsioonil mahajäävale ahelale. RNA-praimerid, millest fragmendid alguse saavad, lõigatakse ära ja asendatakse pikeneva DNA ahelaga. Fragmendid ühendatakse DNA ligaasi poolt. 7. Kuidas tekkisid pseudogeenid ? Pseudogeen- funktsionaalse geeniga homoloogiline järjestus, mida ei transkribeerita. Evolutsiooni käigus on lisandunud neisse geenidesse geneetilise triivi (genetic drift ) tulemusena rida muutusi, mis translatsiooni enneaegselt termineerivad või inhibeerivad mRNA protsessingut, nii et need alad on muutunud mittefunktsionaalseks ehkki neilt transkribeeritakse RNAd . Teine võimalus pseudogeenide tekkeks on RNA pöördtranskriptsioon cDNAks ja viimase integratsioon genoomi intron -vaba DNAna. 8. Missugused molekulaarsed mehanismid tagavad selle, et inimese genoomi 30,000-40,000 geeni kodeerivad 100,000 ndeid erinevaid valke? Alternatiivne splaissing kui tava-arusaama järgi kleebitakse küpse RNA saamiseks eksonid lihtsalt kokku, siis alternatiivse splaissingu käigus kasutab rakk erinevaid eksonite kombinatsioone, et teha erinevaid küpseid mRNA-sid ja valke. Alternatiivne splaising võib toimuda samas raku tüübis vastuseks erinevatele keskkonna-ja raku arengut määravatele signaalidele. Post-translatoorsete modifikatsioonidega saab anda osadele valkudele erinevaid funktsioone (nii, et need näivad erinevate valkudena). 9. Missugusi geneetilise info vahetuse protsesse tähistavad a) transformatsioon , 2) transkriptsioon 3) translatsioon . · Transformatsioon ­ geneetilise informatsiooni ülekandumine ühest rakust teise rakust isoleeritud DNA abil. Pärilik muutus raku omadustes. Võõras DNA satub raku koosseisu ja sellelt hakatakse geene eksprsesseerima. Eristatakse viirusliku päritoluga DNA lisandumist (transduktsioon), bakterite vahelist kontakti (konjugatsioon). Koekultuuris eukarüootsete rakkude transformatsiooni kutsutakse transfektsiooniks. · Transkriptsioon ­ mehhanism, mille käigus toodetakse DNA-lt ensüümide abiga RNA-d (tuumas) · Translatsioon ­ mehhanism, kus ribosoomides (rRNA+valk) toodetakse mRNA pealt valku, kasutades selleks tRNA transporditud aminohappeid . 10. Mis on TBP funktsioon initisiatsiooni kompleksi tekkes ? 38kD TATAbox-siduvat valk (TBP); TBP on esimene valk, mis "istub" TATAbox promootorile. Kõik tänaseks teadaolevad eukarüootsed TBPd on väga homoloogsed C-terminuse 180AA ulatuses. Selle valguosa järjestus on 80% ulatuses identne pärmi ja inimese valkudel. TBP Nterminaalne domään on erinevatelt organismidelt pärit TBP valkudel nii pikkuselt kui järjestuselt väga varieeruv. Sellel on oluline roll RNAPolII-katalüüsitud snRNAde geenide transkriptsioonis. TBP monomeer pakkub moodustades sadul-struktuuri, kus molekuli 2 poolt omavad diaadset (polaarset, kaheli) sümmeetriat, ent pole identsed. Nagu HMGI ja teised DNAd- painutavad valgud , interakteerub TBP DNA väikese vaoga, painutades tugevasti kaksikheeliksit. DNAd-siduv valgu pind on TBP puhul konserveerunud kõigis eukarüootides, mis selgitab ka TATAbox promootorelemendi kõrget konserveerumist läbi evolutsiooni. 11. Kas transkriptsioonifaktorid ( aktivaatorid ) interakteeruvad otse(vahetult) TBPga? Jah, Kui TBP istub TATAboxil, siis saab TFIIB seonduda. TFIIB on monomeerne valk, mis on natuke väiksem TBPst. TFIIB C- terminaalne ots interakteerub kahel pool TATAboxi TBP ja DNAga, samas kui tema N- terminaalne ots stabiliseerib tekkinud interaktsiooni laiudes START-saidi poole. TFIIB sidumisele järgnevalt toimub preformeeritud tetrameerse TFIIF ja RNAPolII sidumine. Viimase tulemusena paiguldub RNAPolII START-saidile. Enamuse promootorite puhul peab kompleksile siduma veel kaks GTFi, et DNA ahelad saaks eralduda ja toimuks matriitsahel vabanemine . Esimesena seondub tetrameerne TFIIE, mis tekitab sidumisvõimaluse TFIIHle (samuti multimeerne faktor, mis koosneb 9 alaühikust). TFIIH kompleksi seondumine lõpetab transkriptsiooni preinitsiatsiooni kompleksi formeerumise in vitro. 12. Mis on transkriptsiooni aktivaatori 2 funktsionaalset domääni ja kuidas mutatsioonid ühes või teises neist mõjutavad transkriptsiooni faktori omadusi? N-terminaalne DNAd - siduv domään, mis seondub teatud DNA järjestustele, ja C-terminaalne aktivatsiooni 3 domään, mis interaktsioonis teiste valkudega aktiveerib transkriptsiooni. N-terminuses asuva domääni mutatsioon võtab ära võime DNA-le seonduda. C- terminaalse domääni muteerimine vähendab transkriptsiooni aktiivsust. On leitud, et üks või enam transkriptsiooni aktivatsiooni domääni on seotud järjestus-spetsiifilise DNAd-siduva domääniga linkeralade abil. Mõnedel juhtudel laiub aktivatsioonidomään DNAd-siduva domääni sisse. 13. Missugused TAFid on TBPga vahetus interaktsioonis? Olemas on 13 TAF-i, TAF ­ TBP associated factor. TAF-1, TAF-2, TAF-6 (nõrgalt), TAF-11, TAF-12, TAF-13 14. Missugune TFII valk hüdrolüüsib ATPd ja mis protsessiga on tegu? TFIIH helikaasne aktiivsus saab oma energia ATP hüdrolüüsilt. Selle energia abil keerataksegi START-saidi piirkonnas DNA dupleksi lahti. See võimaldab RNAPolII-l avatud kompleksi vormis istuda matriitsahela START-saidile. Kui ka rNTPd on keskkonnas, siis RNAPolII alustab matriitsahela transkribeerimist. Transkriptsiooni käigus teine TFIIH alaühik fosforüülib paljudest erinevatest positsioonidest RNAPolII CTDi. In vitro katsetest on selgunud, et TBP jääb TATAboxiga seotuks matriitsahela transkriptsiooni lõpuni, samas kui ülejaanud GTFid dissotseeruvad kompleksist. 15. Võrdle transkriptsiooni initsitatsiooni protsesse prokarüootidel ja eukarüootidel. Bakteriaalse polütsistroonse mRNA ribosoomaalsed sidumissaidid asuvad mRNA valkekodeeriva ala ehk tsistroni ees. Translatsiooni initsiatsioon võib alata ükskõik milliselt neist paljudest ribosoomi sidumissaitidest, mille tulemusena üks mRNA võib kodeerida erinevaid valke. Enamike eukarüootsete mRNAde puhul määrab 5'-cap struktuur ära ribosoomi sidumiskoha ja translatsioon algab lähimalt AUG koodonilt. Selle tulemusena translatsioon saab alata vaid ühelt saidilt. Paljudel juhtudel eukarüootsed valku-kodeerivad primaarsed transkriptid protsessitakse üht tüüpi mRNAks, millelt sünteesitakse ühte tüüpi valk. Promootorid määravad ära transkriptsiooni initsiatsiooni koha ja suunavad RNA polümeraas II sidumist. Eukarüoodi DNAs on leitud kolme tüüpi promootorjärjestusi. TATAbox, kõige sagedasem , mis esineb tavaliselt kõrge transkriptsiooni tasemega geenide promootorites. Mõnedel geenidel on Initsiaatoriga promootorid ja teistele on iseloomulikud CpG (saarekestega) promootorid. 16. Mis on sigma faktori funktsioon? Mis juhtub sigma faktoriga initsiatsiooni lõppedes? See on prokarüootne transkriptsiooni initsiatsiooni faktor, mis võimaldab RNA polümeraasi spetsiifilist kinnitumist geeni promootoritele. RNA polümeraas seob sigma faktori et moodustada RNA polümeraasi holoensüümi kompleksi. 17. Defineeri prokarüootne operon. Kirjelda geeni aktivatsiooni protsessi prokarüoodis trp või lac operoni näitel. Geenide klaster, mis moodustab bakteriaalse operoni, sisaldab ühe transkriptsiooniühiku, kuna ühelt promootorilt transkribeeritakse üks primaarne transkript . 1 geen = 1 valk, 1 operon = mitu valku. 18. Mis on peamine erinevus prokarüootse mRNA ja eukarüootse mRNA vahel? Enamus eukarüootsetest geenidest kodeerib monotsistroonseid mRNAsid sisaldades pikki introneid. Paljud bakteriaalsed mRNAd on polütsistroonsed, st et üks mRNA molekul (näit. Trp operoni kodeeriv mRNA) sisaldab kodeerivaid järjestus, mis kodeerivad mitut, samas bioloogilises protsessies osalevat valku. Eukarüootsed mRNAd on aga monotsistroonsed, st iga mRNA molekul kodeerib ühte valku. Polütsistroonsete ja monotsistroonsete mRNAde erinevus on seotud nende mRNAde translatsiooniprotsesside fundamentaalse erinevusega. 4 19. Võrdle prokarüootsete ja eukarüootsete RNA polümeraaside struktuuri ja funktsiooni. Eukarüootidel on kolme tüüpi tuumset RNA polümeraasi. Kõik kolm polümeraasikompleksi sisaldavad kahte suurt ja kahte väiksemat kompleksi valku, milledel on suur homoloogia E. coli RNA polümeraasi , ' ja alaühikutega. Lisaks sisaldavad kõik 3 kompleksi ka hulgaliselt väiksemaid alaühikuid. Mõnesid väiksemaid alaühikuid need kompleksid jagavad, mõned on unikaalsed . RNA polümeraas I sünteesib ainult pre- rRNAd . RNA polümeraas II sünteesib mRNAsid and mõnesid väikseid tuuma RNAsid, mis osalevad mRNA splaisingus. RNA polümeraas III sünteesib tRNAsid, 5S rRNAsid, and mitmeid suhteliselt lühikesi stabiilseid RNAsid (U6, splaisingus; 7S, transpordis ). Trankriptsiooni initsiatsiooni käigus fosforüülitakse RNA polümeraas II suurima alaühiku karboksüterminaalne domään (CTD), korduv heptapeptiidne järjestus, mis jääb fosforüülituks kuni matriitsilt transkriptsiooni lõpuni. Sarnaselt bakteri RNA polümeraasiga, initseerib RNA polümeraas II geeni transkriptsiooni DNA matriitsilt teatud nukleotiidipaari (lämmastikaluste) juurest või alternatiivina naabernukleotiidipaari juurest. 5' nukleotiid , mis vastab matriitsahela sellele nukleotiidile, millelt transkriptsioon algas, mRNAs cap'takse (lisatakse 7'-metüülguanolaat). 20. Joonista tüüpilise PolII promootori struktuur ja kirjelda faktoreid, mis sinna transkriptsiooni initsiatsiooni käigus seovad. Mediaator kompleks ja selle tähtsus. Promootorid on TATAbox, Initsiaator , CpG. 1 ­ TATA-binding protein seondub, väänab DNA-d 2 ­ TF II B seondub kõikides rakkudes TATA-sse ja initsiatsioonisaidi alasse (tetrameer) 3 ­ polümeraas II saab seonduda, sest TFIIB stabiliseerib tekkinud nurka Tekib preinitsiatsiooni kompleks (PIC), kuhu seondub TFIIE 4 ­ helikaasi aktiivsusega keerab THIIH (9meer) DNA ahelad lahku ja polümeraas saab mööda matriitsi RNA ahelaid sünteesida ja peale sünteesi algust fosforüülib saba 5 ­ kui saba on fosforüülitud, siis saab transkriptsioon toimuda, kui mitte, seisab paigal. 2 1 TF II D koosneb TBP-st ja 13 TAF-ist (aktiveerivad faktorid , millest paljud seovad DNA-d, tähistavad või aitavad initsiaatoril elemendile istuda). Mediaator on suur valkkompleks, mis koosneb ~30 alaühikust. Mediaator moodustab silla DNAle seondunud aktivaatori ja promootoril 3 istuva RNAPolII vahel. Lisaks sellele on leitud, et ühel mediaatori alaühikutest on histoonatsetülaasne aktiivsus ning see võib funktsioneerida kui promootori hüperatsetüleerituse hoidja. 21. PolI ja PolIII-sõltuv transkriptsioon. Mille poolest need erinevad PolII-sõltuvast transkriptsioonist. 4 Transkriptsiooni-regulaatorelemendid geenides, mida transkribeerivad RNA polümeraasid I ja III. Nende geenide initsiatsioonikomplekside kokkupanek algab teatud generaalsete transkriptsiooni faktorite sidumisega regulaatorelementidele. Transkriptsiooni-initsiatsiooni komplekside moodustumine RNAPolI ja RNAPolIII puhul on mõnes mõttes väga sarnane 5 RNAPolII-kompleksi moodustumisele. Samas aga iga kolmest RNAPol-st vajab oma polümeraas-spetsiifilisi generaalseid TF-id ning tunneb ära erinevaid DNA järjestusi. Veelgi enam, ei RNAPolI ega RNAPolIII vaja transkriptsiooni initsiatsiooniks ATP hüdrolüüsi, samas kui RNAPolII vajab. RNAPolI, mis sünteesib pre-RNAsid, ning RNAPolIII, mis sünteesib tRNAsid ning lühikesi, stabiilseid RNAsid, seoselist transkriptsiooni initsiatsiooni on hästi uuritud pärmi mudelil . On 5 selgunud, et ribosoomi osade: tRNAde ja rRNAde süntees on tihedalt seotud raku kasvu ja jagunemise mehanismidega. Kuigi palju on selles veel ebaselget. 22. Kus toimub transkriptsioon? Kus transkriptsioonifaktorid rakus paiknevad? Too näiteid, kuidas transkriptsioonifaktorite post-translatsioonilised modifikatsioonid mõjutavad nende a) DNAle sidumisevõimet ja b) nende võimet initseerida transkriptsiooni. Transkriptsioon toimub eukarüootidel tuumas, prokarüootidel tsütoplasmas. Transkriptsioonifaktorid asetsevad ka eukarüootidel tsütoplasmas, aktiivsed asuvad tuumas ja prokarüootidel tsütoplasmas. Mõnel juhul transkriptsioonifaktorite tuuma transport saavutatakse , kui neid ekspresseeritakse liitvalkudena, mis lokaliseerib nad tsütoplasmaatilises membraanis. Kindlate signaalide korral hakkavad spetsiifilised proteaasid neid lõikama ja vabastavad transkriptsioonifaktori domääni, mis imporditakse tuuma. Teistel juhtudel reguleeritakse tuuma transport post-translatsiooniliste modifikatsioonidega näiteks fosforüleerimine suurendab nende afiinsust spetsiifilisele eksportiinile. Tuuma impordi ja ekspordi reguleerimine on võimas mehhanism, millega saab kontrollida transkriptsioonifaktori aktiivsust ­ ta saab siduda geenidele ainult siis, kui on tuumas. DNAd-siduvatest valkudest näit. bHLHd ja bZip valgud võivad anda alternatiivseid heterodimeere, sõltuvalt siis nendega interakteeruvatest monomeeridest. Ka teistesse klassidesse kuuluvad transkriptsiooni faktorid võivad moodustada heterodimeerseid komplekse. Mõnedel juhtudel heterodimeeride alternatiivsed vormid ei mõjuta DNA- sidumise spetsiifikat, pigem soodustab iga monomeeriga seotud aktivatsioonidomäänide alternatiivsete kombinatsioonide teket ning seeläbi mõjutab tekkinud dimeerse transkriptsioonifaktori aktivatsiooniomadusi. Individuaalsete Tfide aktiivsust saab reguleerida mitmeti. On teada ka inhibitoorsed valgud, mis seonduvad bZip ja bHLH valkudega ega luba viimastel interakteeruda DNAga. Rakkudes, kus need inhibiitorid ekspresseeruvad, nad represseerivad nende faktorite (bZip ja bHLH) transkriptsioonilist aktiivsust. Happelised aktivatsiooni domäänid on suhteliselt struktureerimata, juhusliku keerd-(coil) konformatsiooniga. Need domäänid indutseerivad transkriptsiooni, kui nad on kompleksis valgulise ko-aktivaatoriga. Väga hästi uuritud on imetaja CREB valgu happelise aktivatsioonidomääniga interakteeruvad valgud. CREB fosoforüülitakse rakulise cAMP taseme tõustes. Seda reguleeritud fosforüülimist on vaja, et CREB seonduks oma koaktivaatori CBPga (CREB binding protein) ning aktiveeruksid nende geenide promootorid, mis sisaldavad CREBi sidumissaite. Kui fosforüülitud juhusliku keerdkonformatsiooniga CREBi aktivatsioonidomään integreerub CBPga, siis toimub konformatsiooniline muutus ja moodustuvad 2 ­heeliksit, mis keerduvad ümber CBP interaktsioonidomääni. Ligand- siduvad domäänid funktsioneerivad tuuma- retseptoritel kui aktivatsioonidomäänid, kui nad on ligandseoselises vormis. Ligandi sidumine indutseerib konformatsioonilise muutuse, mis lubab ligand-siduval domäänil ligand-seoseliselt anda interaktsioone ka tuuma-retseptorite ko-aktivaatori lühikese - heeliksi domääniga, mille tulemusena moodustub kompleks, mis aktiveerib nende geenide promootoreid, mis sisaldavad tuuma-retseptori sidumissaiti. 23. Mis on sidumissait ? ja mille poolest ta a)sarnaneb, b)erineb TATAbox-st? Sidumissait on ala DNA-l, millele transkriptsioonifaktor seondub. Mõlemad on transkriptsioonifaktorite sidumisalad. TATA-box esineb eukarüootides, sidumissait on ka prokarüootides; TATAbox-ile seondub TBP (mõni TAF ka; TFIID kompleks), konkreetne järjestus; sidumissaitidel on erinevad järjestused, mistõttu võib neile seonduda ka erinevaid transkriptsioonifaktoreid. 24. Nimeta peamised DNAd siduvad domäänid, mis on iseloomulikud transkriptsioonifaktoritele (vähemalt 3) · Tsink -sõrm-valgud. Paljudel eukarüootsetel valkudel on struktuursed alad, mis voltuvad ümber Zn2+ iooni, nii et suhteliselt lühikesest polüpeptiidahelast tekib kompaktne domään. Seda struktuuri nim. tsink-sõrmeks. Esmalt kirjeldati seda kui DNAd-siduvat struktuuri, tänaseks on teada, et tsink-sõrmi võib esineda ka valkudel, mis otseselt DNAd ei seo. C2H2 tsink-sõrm on kõige levinum DNAd-siduv struktuur, mida inimese ja teiste hulkraksete organismide genoomis esineb suurte kordustena. See on omane ka hulkraksetele taimedele. See motiiv koosneb 23 kuni 26 AAjäägist, sisaldades kahte konserveerunud Cys ja kahte His, millede kõrvalahelad seovad Zn2+ iooni. Tsink-sõrme nimetus tuleb sellest, et struktuuri 2D kujutis meenutab sõrme. Paljud 6 transkriptsioonifaktorid sisaldavad palju tsink-sõrm motiive. Teist tüüpi tsink-sõrm motiivid on sellised, kus neli Cys koordineerivad Zn2+ ja neid nimetatatkse C4 tsinksõrmedeks. Selliseid motiive on tänaseks kirjeldatud ca 50l inimese transkriptsiooni faktoril. Esimesed valgud, millel see motiiv leiti, olid steroidhormooni retseptorid , kust tuli ka nimetus steroid -retseptorite superperekond. Kuna hiljem kirjeldati hulgaliselt sarnaseid rakusiseseid retseptoreid, aga mis ei seo steroide, siis seda perekonda hakati nimetama tuuma-reptseptorite superperekond. Need valgud sisaldavad 55 v6i 56 AAlist domääni, kus on 4 konserveerunud asetusega Cys. Peamine erinevus nende kahe tsink- sõrm valgu klassi vahel on see, et kui C2H2 valgud seovad DNAd monomeerina ning sisaldavad 2 ja enamat tsinksõrm-motiivi, siis C4 valgud on reeglina sidumiseks homo- või heterodimeerid ning ühes valgus on mitte enam kui 2 tsink-sõrm motiivi. Homodimeersed tsinksõrmed seovad DNA pööratud kordusega elemente (inverted repeats ). · Leutsiin -lukud (lZip). DNAd-siduvate domäänide hulgas on suur hulk struktuure, milledes iga seitsmes aminohappejääk on Leu. Need valgud seovad DNAd kui dimeerid ning Leu-de mutageneesi katsed on näidanud, et viimased on vajalikud just dimerisatsiooniks. Siit ka nimetus ­ Leu-lukud. Tänaseks on leitud ka transkriptsiooni faktoreid, kus 7ndas positsioonis on teised AAd. Nüüdseks kasutatakse nimetust ­ aluselised-lukud (basic-zipper). Paljud aluselisedlukud moodustavad heterodimeere. · Aluselised heeliks -ling-heeliks (bHLH) domäänid. Need struktuurid on väga sarnased aluselise-luku struktuuriga, erinevuseks on nende mittehelikaalne ling, mis eraldab kummagi monomeeri kahte - heeliksit. Nende valkude struktuuri nimetus tuletati aminohappejärjestuse põhjal, kust selgus, et N- terminaalne -heeliks sisaldab DNA sidumiseks vajalikke aluselisi AAjääke, keskmises osas on lingu ala ning Cterminuses on järgmine -heeliks. Sarnaselt aluselistele-lukkudele võivad ka bHLH valgud moodustada heterodimeere. 25. Mis roll on histoondeatsetülaasidel ( HDAC ) ja mis funktsioon on histoonatsetülaasidel (HAT)? Histooni sabad on tavaliselt positiivse laenguga tänu lüsiini ja arginiini jääkidele, mistõttu histoonid saavad hästi siduda negatiivse laenguga DNA-d. Atsetüleerimine neutraliseerib laengud ja DNA keerdub lahti, saab toimuda transkriptsioon. HDAC deatsetüleerib histoonid, mistõttu seonduvad need tagasi DNA fosfaatide külge ja tekib kondenseerunud struktuur. HAT-i roll on täpselt vastupidine ­ viib atsetüül-koensüümA-lt atsetüüli positiivsete aminohapete neutraliseerimiseks. 26. Histoonne kood. Histoonide teatud AAjääkide modifitseerimise kaudu kontrollitakse kromatiini kondensatsiooni. Kromatiini histoonseid sabasid kontrollitakse lisaks veel pöörduva fosforüülimise (Ser, Thr), pöörduva monoubikvitineerimise (Lys H2A C-terminuses) ning mittepöörduva metüleerimisega (Lys). Viimasel ajal on üha rohkem andmeid, et "histoonne kood" kontrollib kromatiini kondensatsiooni, mitte üksnes histoonide atsetüleerituse astet. "Histoonne kood" tähistab kõiki histoonide N-terminuses toimunud modifikatsioone. Näit, heterokromatiinses vormis on H3 Lys positsioonis 9 sageli metüleeritud. "Histoonset koodi" lugevad valgud 7 tunnevad neid spetsiifilisi modifikatsioone ära ja promoteerivad kromatiini kondensatsiooni (suletud) või dekondensatsiooni (avatud struktuuri teket). Imetajatel on kirjeldatud palju valke, milledel on n.ö. kromodomään, see seondub H3 N-terminaalsele sabale, kui viimane on Lys9 metüleeritud vormis.Arvatakse, et need valgud kontrollivad kromatiini kõrgemat järku struktuuriks pakkumist. Alternatiivselt on leitud bromodomääni sisaldavad valgud, mis tihti on seotud eukromatiiniga ning seonduvad histoonide N- atsetüleeritud sabadele. TFIID suurim alaühik sisaldab kaht järjestikku asuvat bromodomääni, mis aitavad moodustada aktiivse koodiga kromatiinil kompleksi, samas kui sellesama alaühiku atsetülaasne aktiivsus hoiab kromatiini hüperatsetüleeritud vormis. 27. Pärmi rakus toimub vaigistamine (silencing) telomeersetes DNA alades. Missugused biokeemilised protsessid on selle telomeerse vaigistamise taga? Pärmi telomeeride vaigistamine (silencing). ­ Mitu koopiat Rap1 seob iga telomeerialas paiknevale korduvjärjestusele ( telomeerid on nukelosoomidevabad piirkonnad) (Ülal). See initseerib multivalkse kompleksi kokkupaneku (all), kus osalevad Rap1, Sir2, Sir3, Sir4, ja lähedusesasuvate histoonide H3 ja H4 hüpoatsetüleeritud N-terminused. * tähistab hüperatsetüleeritud histooni aminoterminusi. Moodustuv heterokromatiinne struktuur ulatub Rap1-siduvate saitidega külgneva DNA ~4 kb alale , olenemata DNA järjestusest. DNA on selles konformatsioonis välistele valkude toimele (nukelaasid, transkriptsiooni regulaatorid, etc) ligipääsmatu. Kõrgemat järku heterokromatiini struktuurist palju ei teata. RAP1 seondub DNA järjestustele, mida nimetatakse vaigistajaks (silencer). SIR aga tunneb ära histoonide H3 ja H4 N-terminusi. H3 ja H4 N-terminused on SIR2 aktiivsusest tingitult deatsetüleeritud vormis. Antikehadega värvimine andis tulemuseks, et SIR valgud ja RAP1 paiknevad telomeeride piirkonnas. Nende andmete põhjal pandi kokku kromatiin -vahendatud vaigistamise mudel. Paljude RAP1 valkude sidumine nukleosoomivabadele telomeeri otsele indutseerib heterokromatiinse struktuuri tekke telomeeride piirkonnas. Valk-valk interaktsioonide võrgustik, kus on telomeeriga seotud RAP1, kolm SIR valku (2, 3, 4) ja hüpoatsetüleeritud H3 ning H4 ning mis kokku loovad väga stabiilse kõrgemat järku DNA-valk kompleksi. Viimane sisaldub mitmeid telomeere, kus DNA on välisvalkudele peaaegu kättesaamatu. Üks lisavalk, SIR1, on samuti vajalik piirkonna/geeni spetsiifiliseks vaigistamiseks, samas ei ole sellest valgust palju teada. On teada, et ta on vaigistatud alaga seotud ning arvatakse, et ta on vajalik selleks, et formeerunud multivalkset telomeerset vaigistamiskompleksi edasi struktureerida, s.t. et see struktuur laieneks väljapoole telomeerset piirkonda. 28. Mis on nukleosoom ? Kirjelda eksperimenti, mis võimaldaks teha kindlaks, et transkriptsiooniliselt aktiivne DNA on teisti pakitud, kui transkriptsiooniliselt inaktiivne DNA. = nukleosoomne tuum(147 8 bp)+ linker DNA(15-55 bp). Nukleosoom on DNA-valk(liitvalgu histooni, mis koosneb 8 valgust - H2A, H2B, H3 ja H4, kahest koopiast) kompleks, kromatiini primaarstruktuuri elemendid. Aktiivne DNA on DNaasidele kättesaadav, inaktiivne mitte. Aktiivse ja inaktiivse DNaasitud segud Southern blottitakse, ning inaktiivses on näha globiini kohal "auk". 29. Loetle DNA erineva struktureerituse astmed , mis lõpevad kromosoomi tekkega. DNA-ahel: Nukleosiid trifosfaatides on fosfaadid seotud C5'-ga. Suhkru aatomite järgi nimetatakse 5' ja 3' otsteks. Nukleiinhapped sünteesitakse 5' otsast alates 3' suunas nii, et järgmise nukleotiidi vahele tekib fosfodiester side. Polükondensatsioonireaktsioon. DNA sekundaarstruktuur: Antiparalleelne kaksikheeliks, Komplemetaarne paardumine ; erinevad vormid: B vorm (tavaline, 1 pööre 10 aluspaari , olulisim omadus on võime painduda pikki telge kui DNA komplekseerub valkudega (kromatiin)), A vorm (kompaktsem, esineb DNA-RNA interaktsioonide korral, 11 aluspaari), Z vorm (vasakukäeline heeliks, annavad lühikesed ahelad ja alternatiivsed nukleotiidid ), Kolmikahelaline struktuur (Hoogstein paardumine on komplementaarne) Bakteritel veelgi enam keerdunud (superspiraalid), seda aitavad teha topoisomeraasid. Telomeersed struktuurid: Lineaarsete kromosomide otstes telomeerid, mille funktsiooniks on lubada replitseerida ka kromosoomide 3' otsi ( telomeraas ). Samuti kaitsevad sellised struktuurid kromosoomide otsi nukleaasse lagundamise eest. Telomeerid- üksikahelalised DNA 3' otsad , mis koosnevad tuhandetest TTAGGG kordustest. (G rikkad alad); Quadrupleks struktuurid- 4 G tasapinnalised interaktsioonid alustega vesiniksidemete vahendusel, mis on tasakaalustatud metall- iooniga - G quadrupleks struktuur; T-lingud- telomeerides, stabiliseeritud telomeere siduvate valkudega; D-lingud (displacement loops) , kolmikahelalised struktuurid, mis moodustuvad telomeersete alade kombineerumisel kaksikahelalise DNAga. Kõrgem struktuur: kromosoom , aga ainult raku jagunemise hetkel ja seostunud histooniga. Lämmastikalused paarduvad omavahel vesinisidemete kaudu. Paarid moodustuvad puriinide ja pürimidiinide vahel komplementaarsusprintsiibi alusel (A=T, G=C) 30. Kuidas mõjutab kromatiini struktuur transkriptsiooni? Heterokromatiin- 10% genoomist, telomeerse ja tsentromeerse ala moodustamine Eukromatiin- vähem kondenseerunud, põhistruktuuriks 30nm fiibrid ja lingud (loops) Tasakaal eu ja heterokromatiini vahel- geenide vaigistamine. Kokkupakitud alale ei ole võimalik transkriptsioonifaktoreid siduda, mistõttu sealt ei toimu transkriptsiooni. 31. Kirjelda DNA struktuuri mõju geenide aktivatsioonile/inhibitsioonile. Eukarüootides oleneb suurte DNA osade ligipääsetavus kromatiini struktuurist, mis võib olla vahelduv histooni modifikatsioonide (DNA metülatsioon, ncRNA või DNA siduv valk) tulemusena. Keemiline struktuur ­ geenide vaigistamiseks kasutatakse DNA metülatsiooni, DNAd metüleerivad metüültransferaaside ensümiid tsütosiinide kohalt CpG dinukleotiidide järjestuses (CpG saared). Metülatsiooni mustri analüüs kindlas DNA osas saab teostada läbi bisulfiidse kaardistamise meetodi. Metüleeritud tsütosiini jäägid jäävad muutumata, kusjuures metüleerimata tsütosiinid muutuvad uratsiilideks. Ebanormaalsed metülatsioonimustrid on seotud kartsinogeneesiga. Struktuur ­ mida tihedamalt pakitud, seda vähem toimub transkriptsioon. Nukleosoomid vastutavad superspiraliseerumise eest ja sellised kompleksid võivad ajutiselt moodustada fosforülatsioonil või püsivamalt metülatsioonil. Need variatsioonid on vastutavad suuremate ja väiksemate muudatuste eest geeni ekspressiooni tasemetes. Histooni atsetüleerimine on ka oluline protsess. HAT (ja näiteks ka CREB-siduv valk) dissotsieerivad DNA histoonikompleksi küljest, aktiveerides nii transkiptsiooni. DNA metülatsioon ja HDAC aga põhjustavad geenidde vaigistamist. Nende kahe kombinatsioon tundub olevat signaal DNA-le, et see pakiks end rohkem kokku ja inhibeeriks geenide ekspressiooni. 9 32. Kirjelda kromatiini immunosadestamismeetodit. Kromatiini immunosadestamise meetod paljastab atsetüleeritud staadiumi kromatiini histoonides. Histoonid on in vivo kergelt risti DNA-sse lülitatud kasutades rakku läbistavat, pööravat, keemiliselt ristilülitavat ainet. Nukleosoomid atsetüleeritud histoonide sabadega on näidatud rohelisega. 1. Ristilülituv kromatiin isoleeritakse ja lõigatakse keskmise pikkusega kaks kuni kolm nukleosoomi. 2. Lisatakse antikeha , mis on konkreetse atsetüleeritud histooni saba järjestuse vastu ja (3.) seondunud nukleosoomid immunosadestatakse. 4. Immunosadestatud kromatiini lõikude DNA vabastatakse pöörates ristlülitust ja siis paljundatakse kasutades tundlikku PCR meetodit. Immunosadestamismeetodit kasutatakse, et uurida in vivo seostumist ükskõik, millisel valgul kindla järjestusega DNA-le, kasutades uuritava valgu antikehasid (2) 33. Mis on kromatiini metüleerimise tähtsus? Kromatiini metüleerides pakitakse see kokku ning selle lõigu pealt ei toimu geenide ekspressiooni. Aitab kaasa rakkude diferentseerumisele ja kindlustab, et rakus toodetakse vajalikke valke. Kui metüleerimist ei toimuks, ekspresseeritaks tõenäoliselt valku kõikjalt ja rakk ei oma enam funktsiooni. 34. Milleks kasutatakse FISH analüüsi? Fluorescent In Situ Hybridisation-it kasutatakse satelliit -DNA märgistamiseks, mis omakorda aitab kromosoome identifitseerida, ja kromosoomi alasid täpsemalt kirjeldada; satelliit-DNA paikneb enamjaolt telomeerides, telomeersetes osades ja ka kromosoomi õlgade teatud piirkondades. 35. Mis on MARide funktsioon? Matrix Attachment Region - kromosoom, pakituna nukleosoomideks ja keeratud 30nm kiuks, kinnitub MARide abil valgumaatriksile, mis omakorda aitavad kromosoomi pakkida tihedaks- metafaasi aegseks X-struktuuriks; kutsutakse ka SAR-ideks (scaffold-associated regions); Üldreeglina asuvad SARsid transkriptsiooniühikute vahel, s.t. geenid paiknevad peamiselt kromatiinsetel lingudel. Transgeensetel loomadel on näidatud, et SARsid on vajalikud teatud naabergeenide ekspressiooniks. Äädikakärbsel on demonstreeritud, et mõned SARsid eraldavad transkriptsiooniühikud teineteisest, nii et ühe geeni transkriptsioonis osalevad valgud ei mõjuta naabergeene, mis on eraldatud SAR-iga. 36. Kuidas tuvastada transkriptsiooniregulaatorite märklaud geene? Muteerides uuritavat transkriptsiooni regulaatorit (selle leidmiseks võib kasutada nt DNase I footprintingut, mis näitab valgu asukohta (valk DNA-l, hakatakse lõikama lühikesi juppe, märgistatud 32P-ga) ja EMSA-ga saab tuvastada (tekitatakse radioaktiivne DNA ja seotakse sellega valgulüsaat, pärast lahustatakse geelis ­ kompleks liigub aeglasemalt)) nii, et see enam ei funktsioneeri, tuleb kaardistada muutus geeniekspressioonis (DNA 10 microarray analüüsi abil). Geenid, mille ekspressioon on selle tagajärjel muutunud, ongi antud transkriptsiooniregulaatori märklaud geenid. 37. Miks kasutatakse " heat - shock " geenide promootoreid? Heat-shock geenide (näit hsp70) transkriptsioonil, peatub RNAPolII pärast esimese 25bp sünteesi, aga ei termineeri transkriptsiooni. Peatunud polümeraas jääb vastsünteesitud transkripti ja DNA matriitsiga seotuks kuni tingimuste avaldumiseni, mis indutseeruvad HSTF (heat-shock transkriptsiooni faktoreid). Aktiveeritud HTSFi sidumine proksimaalsepromootori teatud järjestustele stimuleerib peatunud RNAPolII-i jätkama ahela elongatsiooni ning indutseerib kiiret re-initsiatsiooni uute RNAPolII molekulide seondumisega. Transkriptsiooni pausimisemehanism heat-shock geenide regulatsioonis kirjeldati esmalt puuviljakärbsel. heat- shock geenide aktiivsus indutseeritakse raku-siseste tingimuste muutumisel, mille tagajärjel valgud hakkaksid denatureeruma (nagu temperatuur tõus). Mõned neist geenidest kodeerivad valke, mis on denatureerivatele tingimustele erakordselt vastupidavad, teised jälle chaperone, mis denatureeritud valke uuesti re-struktureerivad (re- fold ). Nende geenide ekspressiooni regulatsiooni mehanism on evolutsiooniliselt kujunenud selliseks , et ekstremaalsetes tingimustes on transkriptsiooniks kõik olemas, st pole vaja kromatiini lahti pakkida ega transkriptsiooni preinitsiatsiooni kompleksi kokku panna. 38. Mida tähendab väljend "kasutades lacZ reporterina" ja mis analüüsimeetodiga on tegu? Transgeenne analüüs. Reporter geen on geen, mida lisatakse teise huvipakkuva geeni uurimiseks geeni sisse (rakukultuuris, loomadesse või taimedesse). Neid lisatakse sellepärast, et tunnused, mida nad end ekspresseerivates loomades tekitavad, on kergelt äratuntavad ja mõõdetavad. Üldjuhul kasutatakse, et uurida, kas huvipakkuv geen ekspresseerub. LacZ on geen, mida ekspresseerides hakkab organism tootma laktoosi. Rekombinantse DNA meetod ­ DNA jupid saadakse restriktaasidega, mis lõikavad tömbid otsad. · Kasutatakse saamaks teada teatud geenide funktsiooni. Võetakse uuritav geen ja hakatakse mõnes rakus (nt bakter ) sellelt geenilt valku tootma ning vaadatakse, kuidas rakk reageerib · DNA kättesaamiseks lõhutakse rakk katki, lisatakse etanooli ja selle tulemusel sadenevad nukleiinhapped põhja; kromosoomi ja plasmiidi eraldamiseks töödeldakse sooladega, mille tagajärjel plasmiid lahustub ja etanooliga saadakse pärast kätte. · Pöördtranskriptaasi käigus saab küpsest mRNA-st uue DNA, mida kutsutakse cDNA -ks (complementary), nii saab bakter sealt valku tootma hakata ( bakterites puuduvad intronid ) Transgeenne analüüs ­ organismi viiakse sisse võõrgeen, mida seal hakatakse ekspresseerima, näiteks viirusvektorite abil saab; kui on vähe rakke, siis rekombinantse DNA meetod. 39. Defineeri enhancer ja loetle enhanceri omadused. Missuguseid analüüsimeetodeid kasutatakse enhanceralade tuvastamiseks? Kauguste-tagant mõjuvad regulaatorelemendid on enhancer-id, mis on eukarüootsetele genoomidele väga iseloomulikud, samas kui bakteris nad peaagu täielikult puuduvad. Asuvad sadade kuni tuhandeteid aluspaaride kaugusel start-saidist, võivad asuda nii ülavoolu, intronites kui ka allavoolu . Enhancer'id on üldreeglina 50bp kuni 200bp pikad DNA järjestused sisaldades hulgaliselt transkriptsioonifaktorite sidumissaite. Arvatakse, et need TFid, mis ühele enhacer'ile seovad, interakteeruvad ka omavahel. - interferooni (valk, mis inimesel on viirusinfektsiooni blokkijaks) ca 70bp enhancer'i uurimine on näidanud, et see koosneb 4 regulaatorelemendist, mis seovad samaaegselt nelja TFi. Väikeste HMG (kromatiini siduvad, rakus väga kõrgelt ekspresseeritud valgud) valkude juuresolekul on see TFite sidumine enhancer'ile tugevalt kooperatiivne protsess. Kooperatiivse sidumise tulemusena moodustub -interferooni enhancer'il multivalk-kompleks. Termin enhancesome (võimendi) tähistab suurt tuumset valk-kompleksi, mis assambleerub suurest hulgast transkriptsiooni faktoritest nende kooperatiivse sidumise tulemusena enhancer'il asuvatele regulaatorelementidele. 11 Heterodimeersed Jun/ATF-2, IRF-3, IRF-7, and NF-B (p50 ja p65 heterodimeer) seovad ~70-bp enhancer's neljale elemendile. TFite kooperatiivset sidumist võimendab HMGI, mis on sidunud DNA väiksesse vakku. cJun, ATF-2, p50, and p65 seovad kõik ka nende naabruses istuvat HMGd. Enhancer'i paindumine (bending), mis toimub HMGIga interaktsiooni tulemusena, on enhancesome' moodustamise eelduseks . Erinevad DNAd-painutavad (bending) valgud käituvad teistel enhancer' itel sarnaselt MGI seondub DNA väiksesse vakku sõltumata selle nukleotiidsest järjestusest ning selle tulemusena painutab (bending) DNA molekuli. See DNA enhancer' ala paindumine lubab seondunud TFidel omavahel optimaalselt interakteeruda. Algselt nõrgad, mittekovalentsed valk-valk interaktsioonid saavad kõrvalelementidele seondunud faktorite poolt oluliselt tugevdatud, mis teeb ka TFide lokaalse kontsentratsiooni hästi kõrgeks. Valmistati plasmiidid , mis koosnesid -globiini geenist koos ja ilma 366-aluspaarise lõiguga SV40 DNAst. Need plasmiidid transfekteeriti rakkude kultuuri ja iga tekkinud RNA hübridiseeriti -globiini DNA prooviks (1, 2). Rakkude poolt sünteesitud -globiini mRNA kogus transfekteeriti ühte plasmiidi või teist töödeldi S1 nukleaasi kaitse meetodiga (3). Restriktsiooni lõigu proov , mis oli saadud -globiini cDNA kloonist, oli komplementaarne 5' otsale -globiini mRNA-s. 5'ots proovis märgistati 32P (punane täpp). -globiini mRNA kaitstud proovi hübridiseeriti ~340-nukleotiidine lõik, mida oli lagundatud S1 nukleaasiga, mis lagundab üksikahelalise DNA, aga mitte RNA-DNA hübriidi. Autoradiograafia elektroforeesitud S1-kaitstud lõikudest (4) näitas, et rakud , mida oli transfekteeritud plasmiid 1-ga (1. rida) tootsid palju rohkem -globiini mRNA-d kui need, mida oli transfekteeritud plasmiid 2-ga. Tulemused näitaad, et SV40 DNA fragment plasmiidis 1 koosneb elemendist, enhancerist, mis stimuleerib -globiini mRNA sünteesi. 40. Nimeta vähemalt 3 üldist bioloogilist protsessi, kus enhancerite aktiivsusega kontrollitakse geeni ekspressiooni tasemeid? Rasvlahustuvad steroidhormoonid (östrogeen, testosteroon ) võivad difundeeruda läbi plasmamembraani ja seonududa spetsiifilistele retseptoritele tsütoplasmas või tuumas. Hormooni sidumine muudab retseptori kuju nii, et see seondub enhancerile, millega retseptor muutub transkriptsioonid aktivaatoriks. Paljud enhancerid on rakutüüp spetsiifilised, näiteks geenid, mis toodavad antikehi, omavad teises intronis enhancerit, mis soodustab kõikide promootorite transkriptsiooni, aga seda ainult B lümfotsüütides, mis tavaliselt toodavad antikehi. Enhanceri kaotamine ja muteerimine on näidanud, et need koosnevad mitmest elemendist, mis mõjutavad koguaktiivsust. HO geeni aktivatsioon algab tema sidumisest SWI5 aktivaatorile ülavoolu enhanceril. Seondunud SWI5 interakteerub SWI/SNF kromatiini uuestiehitava kompleksiga ja GCN5-koosneva histooni atsetülaasi kompleksiga. Kui kromatiin on dekondenseerunud ja hüperatsetüleeritud, saab seonduda SBF, mille mediaatoriga seondumise tulemusena moodustub transkriptsiooni preinitsiatsiooni kompleks, milles on polümeraas II ja generaalsed transkriptsioonifaktorid. 41. Kirjelda eukarüootse mRNA molekuliga toimuvad muutusi pärast transkriptsiooni lõppu ja translatsiooni algust. 3 peamist sündmust: 1) 5' capping 2) 3' lõikamine ja polüadenüülimine 3) RNA splaisimine. pre-mRNA protsessitakse juba tuumas transkriptsiooni ajal ning vaid funktsionaalne mRNA transporditakse tsütoplasmasse. 5' cap lisamine sünteesitud RNAdele toimub vahetult pärast transkriptsiooni initsiatsiooni 12 Kui RNAPolII on jõudnud sünteesida uuest transkriptist 25-30 nukleotiidi, siis 7- metüülguanosiin ja teised 5'cap komponendid on juba mRNAde 5' otsa küljes. Seda algset staadiumi RNA protsessingus katalüüsib dimeerne capping ensüüm, mis seostub RNAPolII fosforüülitud CTDga. Kuna capping ensüüm ei interakteeeru RNAPolI ja RNAPolIIIga, sest neil pole CTDd, siis capping on omane vaid mRNAdele. Capping ensüümi üks alaühikutest eemaldab _- fosfaadi sünteesitud RNA 5'otsast, s.o. RNAPolII kompleksist väljaulatuvast alast. Selle alaühiku teise domeeni aktiivsus lisab transkripti 5' otsa jäänud difosfaatrühmale GMP, nii et tekib unikaalne guanosiin 5'-5' trifosfaatne struktuur. Viimases staadiumis kannavad erinevad ensüümsed alaühikud üle metüülrühmad S-adenosüülmetioniinilt guaniini asendis N7 olevale lämmastikule ning sünteesitud RNA 5'otsas paiknevate ribooside 2'oksügeenidele. pre-mRNAde 3'lõikamine ja polüadenüülimine on omavahel tihedalt seotud protsessid Eukarüoodis on kõigil mRNAdel, v.a. histoonide mRNAd, 3' polü(A) saba. Primaarse transkripti 3' lõikamine eelneb polüadenüülimisele. Peaagu kõik mRNAd sisaldavad järjestust AUAAA, mis asub polü(A) sabast 10- 35bp ülavoolu. Kui see AUAAA ära muteerida (vaid AUUAAA puhul toimub ka), siis RNA transkriptide polüadenüülimist peaagu ei esine. Muteerimisel need polü(A)-sabata transkriptid kogunevad (akumuleeruvad) tuuma ning suunatakse lagundamisele. On leitud ka üks teine 3' lõikamiskohast allavoolu esinev signaal, mille intaktsus on vajalik lõikamiseks ja polüadenüülimiseks. See signaal ei ole teatud kindel järjestus, vaid pigem GU-rikas või U-rikas piirkond 3' lõikamiskohast allavoolu asuva 50bp pikkuse ala sees. Lõikamiseks ja polüadenüülimiseks vajalike valkude identifitseerimine on viinud järgmise mudeli väljatöötamiseni. 360kDa lõikamis-ja polüadenüülimis-spetsiifiline faktor (CPSF), mis koosneb neljast erinevast valgust, moodustab kõigepealt AAUAAA järjestusest ülavoolu seonduva ebastabiilse kompleksi. Seejärel seonduvad sellele CPSF-RNA kompleksile vähemalt kolm valku: 1) 200 kDA heterotrimeer, mida nim lõikamist-stimuleerivaks faktoriks (CStF), mis interakteerub G/U rikka järjestusega; 2) 150kD lõikamisfaktor I (CFI) ja halvasti kirjeldatud lõikamisfaktor II (CFII); 3) polü(A) polümeraas (PAP), mis seondub kompleksile vahetult enne lõikamist. PAPi seondumine liidab omavahel 3' lõikamise ja polüadenüülimisprotsessid, nii et lõigatud transkripti vaba 3' saba koheselt polüadenüülitakse. Suure multivalkse lõikamis/polüadenüülimiskompleksi moodustumine AU-rikka polü(A) signaali ümbruses on väga sarnane initsiatsioonikompleksi moodustumisele TATAboxil. Mõlemil juhul moodustuvad kompleksid läbi valk-valk ja valk-NH interkatsioonide järjestikuse jada. Polüadenüülimine toimub kahes etapis . Esimese 12 A lisamine toimub väga aeglaselt, sellele järgneb väga kiire 200 või enama A lisamine. Kiire faas eeldab mitme RRM motiivi omava polü(A)ga-seonduva valgu sidumist. Seda valku nim. PABPII, et eristada seda polü(A)ga-seonduvast valgust, mis asub tsütoplasmas. PABPII seondub lühikesele A sabale ning stimuleerib PAPi järgnevaid A jääke polümeriseerima. PABPII on vajalik ka PAPile signaalimaks polümerisatsiooni terminatsiooni, kui polü(A) saba pikkus on jõudnud 200-250 nukleiinhappejäägini. Küpse, funktsionaalse mRNA tekkimine hõlmab veel protsessi, mida nim. splaisinguks, mille käigus intronid lõigatakse välja ja eksonid liidetakse kokku. mRNA-d ümbritsevad valgud ja ta toimetatakse rakutuumast välja. Tsütoplasmas vahetuvad mRNAga seotud valgud (hnRNP-d tuuma tagasi). 13 Seejärel seondub ribosoomi väike subühik AUG järjestusele, liitub Met-tRNA, seejärel suur subühik ning algab translatsioon 42. Nimeta keemilised reaktsioonid, mis on pre-mRNA splaisingu taga. Missugused on need 3 staadiumit, mida katalüüsib splaisosoom? Splaisingut teostavad splaisosoomid, mis koosnevad snRNPdest ja pre-mRNAst. snRNPde (U1, U2, U4; U5 ja U6) interakteeruvad pre-mRNAga ja omavahel hierarhilises järjekorras, moodustades splaisosoomi. See suur nukleoproteiinne kompleks katalüüsib seejärel kahe transesterifikatsiooni toimumist , mille tulemusena eksonid splaisitakse ja intron lõigatakse lariaatstruktuurina välja. Kuigi ATP hüdrolüüsi transesterifikatsiooni- reaktsioonide toimumiseks vaja ei ole, saadakse splaisosoomi struktuuri ümberkorraldamiseks vajalik energia tsükli enda toimumisest. Splaisosoomi snRNP valgud on hnRNP valkudest erinevad. Kõrgematel eukarüootidel U2 snRNPde assotsatsiooni premRNAga vahendab valk U2AF, mis seondub 3'splaissaidi läheduses asuva pürimidiin-rikka alaga. U2AF interakteerub tõenäoliselt teiste splasinguks vajalike valkudega domeeni kaudu, mis sisaldab dipeptiidseid seriin -arginiin (SR-motiiv) kordusi. Katalüütiliselt aktiivne ümberstruktureeritud splaisosoom viib läbi transesterifikatsiooni reakstiooni nii, et moodustub branchpoint A 2'hüdroksüülrühma ja introni 5' otsa fosfaatrühma vaheline 2'5'-fosfodiesterside. Teise struktuurse muutuse tulemusena, teise transesterifikatsiooni reaktsiooni käigus, ligeeritakse kaks eksonit omavahel 3'5'fosfodiestersideme moodustumise tulemusena, nii et intron vabaneb harulise lariaat-- struktuurina. Eemaldatud intron lagundatakse kiiresti tuumas olemasolevate Rnaaside poolt. Splaisosoom on peaagu sama suur struktuur kui ribosoomi väike alaühik, koosnedes umbes 70 valgust, mis kõik osalevad splaisingus. Mõned splaisingfaktorid (SF) on assotseeritud snRNPdega, teised mitte. Selleks et eksport tuumast välja toimuks, peavad mRNAd olema lõplikult protsessitud. mRNAd, mis on splaisosoomi koosseisus , on reeglina ekspordi vastu "kaitstud". 43. Missugused U snRNAd osalevad pre-mRNA splaisingu regulatsioonis? Splaisingus osalevad viis väikest U- rikast tuuma RNAd ( snRNA ), mida tähistatakse U1, U2, U4, U5 ja U6. Nad on 107 kuni 210 bp pikad ning assotseeritud tuumas 6 kuni 10 väikse tuuma ribonukleopartikli valguga (snRNP). U1 snRNA 5' otsa ja pre-mRNA 5'splaissaidi paardumine on splaisingu toimumiseks hädavajalik. U2 snRNAde roll splaisingus on branchpoint'i kõrval asuva konserveerunud järjestusele komple- mentaarse pinna tekitamine. Branchpoint ise ei ole U2 snRNAga paardunud , vaid lingub välja, mis võimaldab tema 2' hüdroksüülrühmal osaleda RNA splaisingu esimeses transesterifikatsiooni reaktsioonis. Splaisosoomi kokku panemine algab snRNPde kompleksis olevate U1 ja U2 snRNAde paardumisest pre-mRNAga. Ulatuslik U4 ja U6 snRNAde omavaheline paardumine vastavates snRNP kompleksides tekitab multivalk-RNA kompleksi, mis interakteerub U5 snRNPga. U4/U5/U6 kompleks assotseerub seejärel eelnevalt moodustunud U1/U2/premRNA kompleksiga moodustades splaisosoomi. Pärast splaisosoomi moodustamist viib snRNPde ja pre-mRNA ulatuslik paardumine U1 ja U4 snRNPde vabastamiseni. 44. Mis on GT-AG reegel? Intron algab GU-ga ja lõppeb AG-ga, need on ainsad peaagu invariantsed nukleotiidid intronis. 45. Kirjelda mehanismi , mille abil tuumsest pre-mRNAst kõrvaldatakse intronid. Splaisingu vaheühendite analüüsi tulemusena on jõutud avastuseni, et eksonite splaising toimub kahe järjestikuse transesterifikatsiooni reaktsiooni tulemusena. Intronid eemaldatakse lariaadi (lasso, silmus , ling)- sarnase struktuurina, kus introni 5'otsa guanosiin (G) on ebatavalise 2'-5'fosfodiestersideme abil introni 3' otsa adenosiini (A) küljes. A nukleiinhappejääki nimetatakse hargnemispunktiks (branchpoint), sest ta moodustab 14 lariaadistruktuuris RNA haru. Kummagi transesterifikatsiooni käigus vahetatakse üks fosfodiesterside teisega välja. Kuna fosfodiestersidemete arv molekulis ei muutu, siis energiat selles reaktsioonis ei kulu. Kahe reaktsiooni summaarseks tulemiks on kahe eksoni ligatsioon ning nende vahelise-introni vabastamine lariaat- struktuurina. 46. Kirjelda protsesse, mille tulemusena tekib ühest pre-mRNAst hulgaliselt erinevaid mRNAsid. Alternatiivne splaissing - mRNA protsessingu peamiseks regulatsiooni mehanismiks, selleks on vaja vähemalt kaht intronit (kolme eksonit). Selle käigus võib eksoneid pikendada või vahele jätta, saades nii palju erinevaid mRNA-sid.
47. Too näiteid, kuidas alternatiivne splaising muudab bioloogilist funktsiooni. Äädikakärbse sugu, näit.
48. Inimese BDNFi geen on enam kui 80,000 aluspaari pikkune. BDNFi mazhoorsed transkriptid aga 1.8 ja 4.4 kb pikad. Millest selline geeni versus mRNAde pikkuse erinevus on tingitud? Kirjelda molekulaarseid protsesse, mis on selle pikkuste erinevuse taga. Mittekodeerivad RNA alad on väga suured. Inimese genoomis on eksoni keskmiseks pikkuseks 150bp, samas kui introni keskmiseks pikkuseks on ca 3500bp. Pikimad intronid on kuni 500kb pikad. Kuna 5' ja 3' splaissaitide ja branchpointi järjestused on suhteliselt kõdunud, siis pikkades intronites esineb neid järjestusi mitmete koopiatena. Järelikult on vaja veel mingit lisainformatsiooni, et eksoni piire ära tunda. Eksoni rekognitsiooni kompleksne mehanism hõlmab SR valkude aktiivsust. SR valgud interakteeruvad eksoni järjestustega, mida nim. eksoonseteks splaisingu võimendajateks (exonic splicing enhancer). SR valkudel on üks või enam RRMi ning mitu valk-valk interkatsiooni pinda, mis on suhteliselt arginiini ja seriniini rikkad. Kui SR valgud on exonic splicing enhancer'ga seotud, siis nad vahendavad U1snRNPde kooperatiivset sidumist korrektsele 5' splaissaidile ja U2 snRNPde õige branchpointi äratundmist. SR valkude, snRNPde ja teiste splaisingfaktorite (U2AF) kompleks, mis moodustub eksoni peale, kannab nimetust cross-exon recognition complex . 49. Mida näitab rakule antud ajahetkes iseloomulik mRNA tase? Rakk toodab kindlat mRNA-d ainult siis, kui tal läheb vaja selle poolt kodeerivat valku, seeläbi minimeerides raisatavat energiat. Kogu antud ajahetkel iseloomulik mRNA tase näitab, milliseid geene on antud hetkel 15 transkribeeritud. Seda saab teada, kasutades DNA microarray-d, mis koosneb paljudest geenide järjestustest, komplementaarne järjestus seostub ja saab teada, milliseid geene ekspresseeritakse. 50. Mis on RNA editing? Mis ensüümid katalüüsivad protsessi ­ RNA editing? Kuidas nimetatud regulatsioonivorm muudab valku? Too näiteid. RNA järjestuse redigeerimine (editing) on pre-mRNAde järjestuste muutmise alternatiivseks mooduseks. RNA järjestuse redigeerimine (editing) avastati 1980ndate keskel. Editing on protsess, mille tagajärjel muudetakse pre-mRNA järjestust, st küpse mRNA järjestus erineb vastavast genoomsest järjestusest. RNA editing on väga levinud ainuraksete ja taimede mitokondrite ning ka kloroplastide mRNAde puhul. Neis organellides on mõnede mRNAde puhul ligi pooled järjestustest redigeeritud. Kõrgemates eukarüootides on RNA editing suhteliselt harv nähtus ning on kirjeldatud vaid mõne üksiku nukleotiidi vahetus. Ehkki ka viimasel juhul võib sellega kaasneda suuri funktsionaalseid muutusi. Osaliselt puhastatud ensüümi, mis viib läbi C6666 deaminatsiooni U-ks, uuringud näitavad, et see tunneb ära ja sisestab 26 nukleotiidise RNA apoB primaarse transkripti C6666 ümbritseva ala järjestusse. Imetajatel esineva RNA editing'i üheks näiteks on apoB mRNA, mis kodeerib kahte alternatiivset seerumivalku apoB-100, mida ekspresseerivad maksarakud, ja apoB48, mida ekspresseerib sooleepiteel. apoB-48 vastab apoB-100 N-terminaalsele osale. Mõlemad valgud on suure lipiidse valkkompleksi komponendid ning osalevad veres lipiidide transpordis. Samas vaid need kompleksid, mis sisaldavad apoB-100 valke, osalevad kolesterooli transpordis teistesse keharakkudesse. Kahe apoB tüübi rakutüüpspetsiifiline ekspression on apoB pre-mRNA editing'i tagajärg. Nukleotiid positsioonis 6666, s.o C konverteeritakse deamiinimise tagajärjel U-ks. See muutus, mis toimub vaid soole rakkudes, muudab CAA koodoni UAA poolt kodeeritud Stop koodoniks ning lõpeb poole lühema valgu apoB-48 sünteesiga. 51. RNA-sõltuv vaigistamine. siRNA , miRNA . RISC kompleks. MikroRNAd ( miRNAd ) avastati nematoodi C. elegans geenide lin-4 ja let-7 mutatsioonide analüüsil, kus selgus, et lin-4 ja let-7 ei kodeeri valke, vaid RNAsid, mis on vaid 21 ja 22 bp pikad ning seostuvad märklaud-mRNAde 3' UTRidele. Selle interaktsiooni tulemusena nad represseerivad märklaudgeenide ekspressiooni. Arengu käigus lin-4 miRNA ekspressioon väheneb, let-7 miRNA ekspressioon on samuti arenguliselt reguleeritud. Tänaseks on leitud nematoodil ca 100 miRNAd ja vähemalt samapalju on leitud miRNAsid ka inimesel. Kõik miRNAd näivad olevat pikema ca 70bp prekursor RNA produktid . Prekursor RNA moodustab stem- struktuure, kus tüve osas on vaid üksikud mitte-paardumised. Dicer on valk, mis lõikab kaksikahelalise RNA neist
struktuuridest välja. miRNA ja märklaud- mRNA 3' otsa vaheline paardumine ei ole korrektselt komplementaarne, vaid on ka üksikuid mittepaardunud nukleotiide . See mittepaardunud nukleotiidide olemasolu eristab miRNAid siRNAdest. RNA interferents (RNAi) avastati katsetustel, kus manipuleeriti teatud geenide ekspressiooni tasemega. Süstiti nematoodi 16 rakkudesse lühikesi RNA juppe, mis pidanuksid hübridiseeruma märklaudgeeni mRNAga ning pärssima selle translatsiooni. Kontrollkatse aga, kus kasutati perfektselt paarunud mõnesaja aluspaarilist kaksikahelalist RNAd, oli oluliselt edukam selle märklaua translatsiooni inhibitsioonis, kui spetsiifiliselt disanitud antisense RNAd. Sellest tehnoloogiast on saanud geeni funktsiooni uurimise üks suuri läbimurdeid. Kaksikahelaline RNA protsessitakse esmalt väikesteks interferents RNAdeks (siRNA). siRNA ahelad, mis on 21-23 bp pikad, hübridiseeruvad üksteisega nii, et 3'otsmised 2 nukleotiidi on üksikahelalised. siRNAde tekkeks on vaja Dicer kompleksi ribonukleaasset aktiivsust. Sellest järeldati, et miRNAde ja siRNAde vahendatud protsessid on väga sarnased. Hiljutised uuringud näitasid, et kaksikahelalisi siRNAsid ja miRNAsid protsessitakse edasi multivalkkompleksis, mis sisaldab vaid üht RNA ahelat. See RNA-indutseeritud vaigistav kompleks (RISC) lõikab märklaud mRNA, mis on täpselt komplementaarne vastavale üksikahelalisele siRNAle, ahela katki. RISC kompleks funktsioneerib ka kui translatsiooni inhibiitorid. Inimese let-7 miRNA, näiteks, on leitud täiesti let-7 miRNAga komplementaarset sünteetilist märklaud RNAd lagundava RISC kompleksi koosseisust. RISC kompleksil arvatakse olevat 2 funktsiooni : 1) siRNA funktsioon (ehk RNA interferents), 2) miRNA funktsioon, mille tagajärjeks on üksikuid mitte-paardunud nukleotiide sisaldavate märklaud mRNAde translatsiooniline repressioon. RNA interferents arvatakse olevat iidne raku mehanism taimedel ja loomadel, millega rakk kaitseb end teatud viiruste ja mobiilsete geneetiliste elementide vastu. Taimed, milledes on tuvastatud Diceri või RISC kompleksi valkude mutatsioonid, on oluliselt tundlikumad RNA viiruste infektsioonile ja transposoonide liikumisele nende genoomis. Taimede kaksikahelaline RNA indutseerib ka sama järjestust sisaldava genoomse DNA metüleerimist. Viimase mehanism ei ole teada. Selline RNAivahendatud geenimetüleerimise mehanism ei esine imetajatel. RNAi ­ tsütoplasmas toimuv posttranskriptsioonilise geeniekspressiooni regulatsiooni mehhanism, mille käigus kaheahelaline RNA viib komplementaarse mRNA vaigistamiseni siRNA ­ small interfering/inhibitory RNA ­ väike kaheahelaline RNA (21-25 bp), mis saadase dsRNA lõikamisel Dicer ensüümiga ning mis viib komplementaarse mRNA degradatsioonini siRISC kompleksis miRNA ­ microRNA ­ genoomi poolt kodeeritud väikeste (21-23 bp) RNA-de tüüp, mis saadakse stem- struktuuriga prekursos RNA lõikamisel Dicer ensüümiga ning mis viib komplementaarse mRNA translatsiooni inhibitsioonini miRISC kompleksis RISC ­ RNA induced silencing compleks ­ kompleks (160kDa ­ 80S), mis viib läbi siRNA-le või miRNA-le komplementaarse mRNA vaigistamist degradatsiooni või translatsiooni ihibitsiooni teel. Põhikomponendid agronaudid (AGO), millel on 2 olulist domääni: PAZ ­ RNA-d siduv domään ja PIWI ­ Rnaas H-ga sarnanev endonukleaasset aktiivsust omav domään. Dicer ­ RNaasIII perekonda kuuluv ensüüm, mis viib läbi dsRNA või pre-miRNA lõikamist lühikesteks siRNA- deks /miRNA-deks. Drosha ­ tuumne RNaasIII perekonna ensüüm, mis viib läbi pri-miRNA lõikamise pre-miRNA-ks Pasha ­ tuumne dsRNA-d siduv valk, mis interakteerub Droshaga, stabiliseerides kompleksi. Drosha ja Pasha moodustavad mikroprotsessori RLC ­ RISC loading complex ­ RISC-ile eelnev dsRNA valk kompleks üleminekul kaheahelalise siRNA lahtikeeramine 52. Nonsense -mRNA vahendatud lagundamine. Nonsense mediated decay ­ ühe või enam eksoni vahele jätmine, mis põhjustab ekson -intron liidese vahetus 3' läheduses Stop koodoni sissetuleku. Kõigi korrektselt splaisitud mRNade puhul Stop koodon on viimases eksonis. Nonsense mediated decay vahendab kiiret mRNAde lgundamist, kus Stop koodonid esinevad mRNAs enne viimast splaisiliidest. Arvatakse, et osad ekson-intron liidese kompleksi valgud osalevad nonsense mediated decay's. Ekson-intron liidese kompleksid interakteeruvad vahetult deadenülaasi kompleksiga. Arvatakse, et Stop koodoni "sisse splaisimise" korral ekson-intron liidese kompleksid RNAlt lahti ei tule ning seega ribosoomset skaneerimist ei alustata. Nonsense mediated decay toimub tsütoplasmas. Hulgaliselt on tõendeid selle kohta, et pioneeriv ribosoom transleerib mRNAd, kui tema 5' otsaga on assotseerunud cap-siduv kompleks ning polü(A) saba on assotseerunud tuumse PABPIIga. See on tekitanud oletusi, et esimene translatsiooni tsükkel toimub tuumas kui nonsense-mediated decay järelvalve mehanismi üks komponente. 17 53. Mis vahe on inteiinil ja intronil? Inteiin ­ valgu osa, mis suudab ennast välja lõigata ja taasühendada järelejäävaid osasid peptiidsidemega (valgu intronid). Enamik inteiine sisaldab ka endonukleaasset domääni, mis osaleb inteiinide levimises. Paljudes geenides on inteiini kodeerivad osad erinevates asendites. Intron - on eukarüootse geeni mittekodeeriv piirkond, mis transkribeeritakse RNA molekuliks, ent seejärel lõigatakse sealt splaisingu tulemusena välja. 54. Mis juhtub, kui polüadenülatsiooni motiivis (AAUAAA) või RNAP II CTD alas on mutatsioon? RNA Pol II Carboks Term Domain mutatsioon võib lüüa välja sealt Ser ja Tyr jääke, mistõttu seda enam ei saa fosforüülida, ning kaob transkriptsioonivõime. Peaagu kõik mRNAd sisaldavad järjestust AUAAA, mis asub polü(A) sabast 10-35bp ülavoolu. Kui see AUAAA ära muteerida (vaid AUUAAA puhul toimub ka), siis RNA transkriptide polüadenüülimist peaagu ei esine. Muteerimisel need polü(A)-sabata transkriptid kogunevad (akumuleeruvad) tuuma ning suunatakse lagundamisele. 55. Selgita lühidalt mRNA polüadenüleerimise tähtsust eukarüoodi rakus. Poly -A ­ Polüadenülatsioon on poly(A) saba süntees, RNA lõik, kus kõik alused on adeniinid RNA molekuli lõpus (ca 200 tk). See on osa teest, mille vältel eukarüoodid toodavad küpse mRNA translatsiooni jaoks. Transkriptsiooni lõpus viimane osa just tehtud RNAst lõigatakse ära valgukompleksi poolt. See kompleks sünteesib poly(A) saba RNA 3'otsa. See saba on oluline tuumaekspordi jaoks, translatsiooni ja mRNA stabiilsuse jaoks. Kui saba lühendatakse, siis varsti mRNA degradeeritakse ensümaatiliselt. 56. Seleta lühidalt attenuatsiooni mehanismi põhimõtet. Kasuta oma selgituses jooniseid. Attenuatisioon leiti kõigepealt E.coli trp operonis. Uuring oli suunatud kahele faktile ­ mutatsioonid, mis lõid välja trp repressori ei olnudki täielikult trüptofaaniga represseeritud, trp operoni alusjärjestus oli ebatavaline ORF, mis eelnes tuntud trüptofaani biosünteesivate ensüümide struktuursete geenide ORF- idele. Esmalt leiti, et ORF koosneb kahest tandem Trp koodonist, teiseks, et mRNA-l koosnes selles alas kahe grupilisest sümmeetriast, mis võimaldas moodustada tal eksklusiivseid sekundaarstruktuure, millest üks meenudas rho-sõltuvat transkriptsiooni terminatsiooni signaali ja teine kaitseks esimese formeerumise eest ja seeläbi ka terminatsiooni eest (pre-emptor struktuur) Attenuatsiooni mehhanism: · RNAP initsieerib trp promootori transkriptsiooni · RNAP teeb pausi 90nda nukleotiidi juures sekundaarstruktuuris · Ribosoomid haaravad selle vastse mRNA kaasa ja initsieerivad põhivalgu translatsioni o RNAP vabastatakse pausist ja see jätkab transkriptsiooni. · Kui RNAP jõuab potentsiaalse terminatsiooni alani, sõltub ala jätkumine või lõppemine järelelohiseva ribosoomi asendist. o Kui ribosoom jääb seisma tandem Trp koodonite juures oodates sobivat tRNA-d, ala 1 võetakse ribosoomi sisse ja seetõttu ei saa see paarduda regiooniga kaks, mis tähendab, et alad 2 ja 3 paarduvad enne, kui ala 4 transkribeeritakse. See sunnib 4. ala jääma üksikahelaliseks takistades ala ¾ terminaatorstruktuuri tekkimist. Transkriptsioon jätkub. o Kui ribosooom transleerib juhtivpeptiidi kahtlemata, katab see suurt osa 2. alast, takistades sidumist alaga 3. Kui 4. ala transkribeeritakse, see moodustab tõve ja lingu alga 3 ja transkriptsioon lõpetatakse luues umbes 140 aluseline baas-transkript. · See kontrollmehhanism mõõdab saadava laetud Trp-tRNA hulka. Ribosoomide asukoht määrab struktuuri, ka teisi operone kontrollitakse attenuatsiooni teel. Avastus viis paljude selliste operonide taasavastamiseni, mille repressoreid polnud kunagi leitud. 18 57. Seleta lühidalt antiterminatsiooni mehanismi põhimõtet. Kasuta oma selgituses jooniseid. Antiterminatsioon on prokarüootsete rakkude abistamine parandamaks varajast RNA sünteesi terminatsiooni transkriptsiooni käigus. See toimub, kui RNA polümeraas ignoreerib terminatsiooni signaali ja tekitab mehhanismi, kuis üks või enam geeni operoni lõpus võivad olla sisse või välja lülitatud, sõltuvalt sellest, kas polümeraas tundis ära terminatsiooni signaali või mitte. Kui transkriptsioon lõpetatakse varajaselt (sageli 100- 1000 aluspaari järel), antiterminaator seondub transkribeeritud RNA külge või ülavoolu DNA terminaatorist ja alustab transkriptsiooni ,,uuesti".
58. Post-transkriptsioonilise regulatsioon tsütoplasmas. miRNA-sõltuv translatsiooni repression. RNA interferents-põhjustatud mRNAde degradatsioon . Tsütoplasmaatiline polüadenüülimine. Kaks hiljuti avastatud regulatsiooni teed: 1) mikroRNAd (miRNAd) avastati nematoodi C. elegans geenide lin-4 ja let-7 mutatsioonide analüüsil, kus selgus, et lin-4 ja let-7 ei kodeeri valke, vaid RNAsid, mis on vaid 21 ja 22 bp pikad ning seostuvad märklaud- mRNAde 3' UTRidele. Selle interaktsiooni tulemusena nad represseerivad märklaudgeenide ekspressiooni. Arengu käigus lin-4 miRNA ekspressioon väheneb, let-7 miRNA ekspressioon on samuti arenguliselt reguleeritud. Tänaseks on leitud nematoodil ca 100 miRNAd ja vähemalt samapalju on leitud miRNAsid ka inimesel. Kõik miRNAd näivad olevat pikema ca 70bp prekursor RNA produktid. Prekursor RNA moodustab stem-struktuure, kus tüve osas on vaid üksikud mitte-paardumised. Dicer on valk, mis lõikab kaksikahelalise RNA neist struktuuridest välja. miRNA ja märklaud-mRNA 3' otsa vaheline paardumine ei ole korrektselt komplementaarne, vaid on ka üksikuid mittepaardunud nukleotiide. See mittepaardunud nukleotiidide olemasolu eristab miRNAid siRNAdest. RNA interferents (RNAi) avastati katsetustel, kus manipuleeriti teatud geenide ekspressiooni tasemega. Süstiti nematoodi rakkudesse lühikesi RNA juppe, mis pidanuksid hübridiseeruma märklaudgeeni mRNAga ning pärssima selle translatsiooni. Kontrollkatse aga, kus kasutati perfektselt paarunud mõnesaja aluspaarilist kaksikahelalist RNAd, oli oluliselt edukam selle märklaua translatsiooni inhibitsioonis, kui spetsiifiliselt disanitud antisense RNAd. Sellest tehnoloogiast on saanud geeni funktsiooni uurimise üks suuri läbimurdeid. Kaksikahelaline RNA protsessitakse esmalt väikesteks interferents RNAdeks (siRNA). siRNA ahelad, mis on 21-23 bp pikad, hübridiseeruvad üksteisega nii, et 3'otsmised 2 nukleotiidi on üksikahelalised. siRNAde tekkeks on vaja Dicer kompleksi ribonukleaasset aktiivsust. Sellest järeldati, et miRNAde ja siRNAde vahendatud protsessid on väga sarnased. Hiljutised uuringud näitasid, et kaksikahelalisi siRNAsid ja miRNAsid protsessitakse edasi multivalkkompleksis, mis sisaldab vaid üht RNA ahelat. See RNA-indutseeritud vaigistav kompleks (RISC) lõikab märklaud mRNA, mis on täpselt komplementaarne vastavale üksikahelalisele siRNAle, ahela katki. RISC kompleks funktsioneerib ka kui translatsiooni inhibiitorid. Inimese let-7 miRNA, näiteks, on leitud täiesti let-7 miRNAga komplementaarset sünteetilist märklaud RNAd lagundava RISC kompleksi koosseisust. RISC kompleksil arvatakse olevat 2 funktsiooni : 1) siRNA funktsioon (ehk RNA interferents), 2) miRNA funktsioon, mille tagajärjeks on üksikuid mitte-paardunud nukleotiide sisaldavate märklaud mRNAde 19 translatsiooniline repressioon. RNA interferents arvatakse olevat iidne raku mehanism taimedel ja loomadel, millega rakk kaitseb end teatud viiruste ja mobiilsete geneetiliste elementide vastu. Taimed, milledes on tuvastatud Diceri või RISC kompleksi valkude mutatsioonid, on oluliselt tundlikumad RNA viiruste infektsioonile ja transposoonide liikumisele nende genoomis. Taimede kaksikahelaline RNA indutseerib ka sama järjestust sisaldava genoomse DNA metüleerimist. Viimase mehanism ei ole teada. Selline RNAivahendatud geenimetüleerimise mehanism ei esine imetajatel.
2) tsütoplasmaatiline polüadenüülimine - Lisaks miRNA-vahendatud translatsiooni repressioonile esineb ka valkvahendatud translatsiooni regulatsiooni, mis aitab teatud geenide ekspressiooni kontrollida. mRNAdes on regulatoorsed elemendid või järjestused, mida tunnevad ära teatud valgud, mis osalevad translatsiooni regulatsioonis. Üldreeglina asuvad need järjestused UTRides. Järjestus-spetsiifilised regulaatorvalgud võivad kooperatiivselt siduda 3'UTRis asuvatele naabersaitidele, sarnaselt transkriptsiooni faktorite kooperatiivse sidumisega enhanceritele. Enamusel juhtudest see sidumine represseerib translatsiooni. Valkudel, millel selline repressioon esineb, on kirjeldatud tsütoplasmaatilist polüadenüülimist, mis peab sellisele repressiooni mehhanismile eelnema. Tsütoplasmaatiline polüadenüülimine on varases embrüos üks olulisimaid geeniregulatsiooni teid. Hulkraksete munarakud sisaldab paljude valkude mRNAsid, mida enne ei transleerita, kui alles pärast munaraku viljastamist. Mõnedel neist "ladustatud" mRNAdest on lühike polü(A) saba, koosnedes vaid 20-40 A jäägist. See tähendab, et vaid üksikud polü(A)ga-seonduvad PABPI valgud savad selliste sabadega seostuda ja neid stabiliseerida. Kuna lühikese polü(A) saba stabilisatsiooni ei toimu, siis neid mRNAsid efektiivselt ei transleerita. Teatud munaraku arengustaadiumis või koheselt pärast viljastumist, tavaliselt vastusena teatud välissignaalile, hakatakse nende mRNAde sabasid pikendama, lisades sinna kuni 150 A-d ja stimuleerides nende mRNAde translatsiooni. Sarnased mehanismid toimivad ka õppimise ja mälu protsessides. mRNAsid lagundatakse tsütoplasmas teatud mehanismide abil: mRNAde kontsentratsioon on funktsioon tema sünteesi kiirusest ja tema lagundamise kiirusest. mRNA stabiilsus määrab ka ära, kui kiiresti temalt sünteesitud valgu süntees termineeritakse. Enamus bakteriaalseid mRNAsid on väga ebastabiilsed (lagundatakse minutite jooksul), nii et nende poolt kodeeritud valkude süntees kestab oluliselt kauem pärast vastavate geenide transkriptsiooni repressiooni. See võimaldab bakteri rakul kiirelt kohaneda keskkonna muutustega . Enamus hulkraksete organismide puhul aga on mRNAde eluiga mõõdetav tundidega. Mõnede geenide regulatsioon toimub hüppeliselt, näit tsütokiinide (immuunvastusega seotud valgud) puhul on see nii. Selline regulatsioon on võimalik tänu sellele, et nende geenide transkriptsiooni reguleeritakse kiire vastustena vastavate mRNAde eluea kaudu. Tsütoplasmaatiliste mRNAde lagundamine algab polü(A) sabast, kuni see on nii lühike, et PABPi ei saa enam siduda ega stabiliseerida 5'cap-i ja initsiatsioonifaktoritega moodustunud kompleksi. Eksponeeritud 5' cap struktuuri eemaldab decapping ensüüm ning kaitsmata mRNA lagundatakse 5'3' eksonukleaaside poolt. Polü(A) saba kõrvaldamine muudab mRNA 3' otsa tundlikuks ka eksosoomide 3'5 eksonukleaaside aktiivsuse suhtes. Deadenülatsioonikiirus on pöördvõrdeline sellelt mRNAlt translatsiooni initsiatsiooni sagedusega: mida kõrgem initsiatsiooni sagedus, seda aeglasem deadenüülimise kiirus. Mõnede mRNAde lagundamine ei sõltu deadenüülimisest. Mõnikord alustatakse cap struktuuri eemaldamisest või siis mRNA sisesest lõikamisest, mida tõenäoliselt viib läbi RISC kompleksi eksonukleaas.
TRANSLATSIOON JA VALKUDE SORTEERIMINE 1. Valkude ja nukleiinhapete sünteesi sarnasused Nii valgud kui nukleiinhapped on koostatud piiratud arvust monomeeridest · Monomeere lisatakse ahelasse ükshaaval · Iga polünukleotiid ja polüpeptiid sünteesitakse kindla orientatsiooniga ja see lõpeb kindlaksmääratud kohas · Primaarne produkt modifitseeritakse 2. RNA funktsioonid valkude sünteesil RNA-l on kolm funktsiooni valgusünteesis Valgusünteesiks (translatsiooniks) vajatakse kolme komplementaarse funktsiooniga nukleiinhapet: 20 · mRNA kannab koodonitena informatsiooni valgu primaarjärjestuse kohta · tRNA identifitseerib koodi ja toob ribosoomi koodile vastava aminohappe · rRNA assotsieerub ribosoomi valkudega moodustades ensüümkompleksi, mis otseselt sünteesib peptiidsideme 3. Translatsiooniprotsess, presibosomaalne ja ribosomaalne etapp Translatsioon on kaheastmeline dekodeerimisprotsess 1. Preribosomaalne etapp: aminoatsüül tRNA süntees (ligaasid, ARS või ARL) 2. Ribosomaalne etapp: koodon- antikoodon translatsioon ja peptiidsideme süntees ribosoomil
4. tRNA struktuur, funktsionaalsed osad mRNA kood transleeritakse valguks läbi adaptermolekulide-tRNA · Sekundaarstruktuur ristikheinalehe kujuline: · Pikkus 72-94 nukleotiidi, loetakse 5' otsast · Antikoodon- 34-36 · Kolm lingu + paardumata 3'osa · 3' järjestus CCA 74-76, lisalingu nukleotiidid 47, 47:1 jne. · tRNA 3' paardumata osale järgneb aktseptoorne õlg, 7 aluspaari · Pseudouridiini õlg (T õlg) · Antikoodon õlg- 5 aluspaari, lingus alati 7 nukleotiidi · D-õlg, 4 aluspaari, dihüdrouridiin, lingu pikkus varieeruv tRNA kolmemõõtmeline struktuur on L kujuline, moodustub heeliksite liitumise teel- coaxial stacking Struktuurid sarnased, kuna liituvad ribosoomi samasse saiti- erinevused antikoodoni ja aktseptorõla osas (ka teised nukleotiidid võivad olla erinevad) 5. Mittestandartne paardumine (Wobble base pairing), milleks vajalik? Uridiin - Guaniin ; Adenosiin-Inosiin; Tsütidiin-Inosiin; Uridiin-Inosiin Vajalik selleks, et erinevaid koodoneid on 64 (aminohapetele 61) ja siis pole nii palju erinevaid tRNA-sid vaja. Põhilised ensüümid, mis peavad tRNA molekuli identifitseerima on aminoatsüül-tRNA süntetaasid e. ligaasid (ARL või ARS või ka Ala- RS, Phe-RS).tRNA identsuse elemendid- tRNA struktuuri elemendid, mis määravad ära millise aminohappega tRNA aminoatsüleeritakse. Igat aminohapet kodeerib 1-6 koodonit- mitu erinevat tRNA molekuli (isoaktseptoorset tRNA-d)- sünonüümsed koodonid. Geneetiline kood on degenerantne Igas rakus on 20 erinevat süntetaasi ja üks süntetaas peab ära tundma ja ühe ning sama spetsiifilise aminohappega aminoatsüleerima mitut erineva antikoodoniga tRNA molekuli. 21 Kõik süntetaasid tunnevad ära 4. nukleotiidi 3' otsast- isoaktseptooretel tRNA'del identsed nn. diskriminaator-aluseks. Samuti on identsuse elemente ka antikoodon lingus, nende nukleotiidide osas, mis on identsed. 6. Aminoatsüül-tRNA süntees, kirjelda protsessi ja ensüüme Aminoatsüül-tRNA süntetaas aktiveerib aminohapped ja liidab need tRNAle Iga aminohappe jaoks on oma, spetsiifiline aminoatsüül-tRNA süntetaas Need jagatakse kahte klassi (klass I ja II) kummassegi klassi kuulub 10 liiget. Jaotus põhineb ensüümide aminohappelisel järjestusel ja katalüütilise saidi ehitusel Aminohappe liitmine on kaheastmeline: 1. Liituvad süntetaasiga AH ja ATP- moodustub aminoatsüül adenülaat 2. Estersideme süntees COOH ja riboosi 2' või 3' C vahel Vigade sagedus 10-5, -spetsiifiline hüdrolüütiline aktiivtsenter · Aminoatsüleerimise suur täpsus tagatakse editeerimisaktiivsusega- hüdrolüütilist aktiivsust, mille abil välditakse vale aminohappega laetud tRNA vabanemist. · Ülekande-eelne editeerimine: kontrollitakse aminoatsüleerimisreakatsiooni esimest etappi , st välditakse vale aminoatsüüladenülaadi moodustumist (vale aminoatsüül-adenülaat lagundatakse enne selle ülekannet tRNA külge. · Ülekande-järgne editeerimine: kontrollitakse aminoatsüüladenülaadi ülekandmist tRNA-le. (hüdrolüüsitakse esterside aminoatsüül-adenülaadi ja vale tRNA vahel). 7. tRNA identsuse elemendid, diskriminaatoralused Kõik süntetaasid tunnevad ära 4. nukleotiidi 3' otsast- isoaktseptooretel tRNA'del identsed nn. diskriminaatoralused. Samuti on identsuse elemente ka antikoodon lingus, nende nukleotiidide osas, mis on identsed. 8. Ribosoomide struktuur, eukrüootne ja prokarüootne ribosoom
A, P ja E sait ribosoomil RIBOSOOMIDE FUNKTSIOON- viivad kõikides organismides läbi programmeeritud valgusünteesi kasutades aminoatsüül-tRNA'd (aa-tRNA) substraadina. Ribosomaalne RNA (rRNA) moodustab bakteriaalsetes 22 ribosoomides 66% massist ja eukarüootsetes ribosoomides 60% massist. Ribosoomid moodustavad bakterites 20-40% kuivmassist, eukarüootides tunduvalt väiksema osa Ribosoomi subühikute vahele jääb põhiline aktiivtsenter, mis moodustab tRNA'de sidumiskohad: · A-saiti seondub aminoatsüül-tRNA - paikneb nii väiksemal kui suuremal subühikul. · P-saiti seondub peptidüül-tRNA. Peale kasvava peptiidahela kandmist ribosoomis peptidüül-tRNA'lt A- saidis asuvale aa-tRNA'le jääb P-saiti deatsüleeritud tRNA · E-sait on deatsüleeritud tRNA spetsiifiline. Peale seda kui P-saidis tekkis deatsüül- tRNA liiguvad tRNA'd koos mRNA'ga ribosoomis ühe koodoni võrra edasi -asub põhiliselt ribosoomi suuremal subühikul. 9. Ribosoomi tsükkel Translatsioonil on kolm etappi: initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon. Ribosoom läbib selle käigus valgusünteesi ribosoomi tsükli Bakteriaalne mRNA on polütsistoorne. Valku kodeerivat järjestust nii mRNA'l kui DNA'l nimetatakse avatud lugemisraamiks(ORF). Avatud lugemisraam -nukleiinhappe järjestus, mis sisaldab järjestikuseid aminohappeid kodeerivaid koodoneid ja mis algab initsiaator-koodoniga ning lõpeb stop-koodoniga Initsiaator-koodonile eelneb ribosoomi sidumispiirkond RBS (ribosome binding site) ehk Shine - Dalgarno järjestus. RBS (4-7 NA) on komplementaarne ribosoomi väiksema subühiku RNA (16S rRNA) 3' otsaga. Paikenb AUG koodonist 5-7 nukleotiidi eespool 10. RBS (Shine Dalgarno järjestus vs Kozaki järjestus), translatsiooni initsiatsioon, eukarüoodi ja prokarüoodi võrdlus Initsiatsioon: Valgusünteesi initsiatsioonil osalevad lisaks ribosoomidele initsiatsioonifaktorid, initsiaator-tRNA ja GTP. Bakteriaalne initsiatsioon: · ·IF1 ja IF 3 koos ribosoomi väikese subühikuga ja fMet-tRNAi seondub mRNAle-RBSile (Shine-Dalgarno sequence) 70S initsiatsioonikompleks saavutatakse kui IF2 vahendatud GTP hüdrolüüsi energia arvelt viiakse kokku väike ja suur alaühik. Shine-Dalgarno järjestus ( Shine-Dalgarno box), on ribosomaalne seondumissait, mis paikneb 6-7 nukleotiidi ülevalpool start koodonist. See on kuue aluseline konsensusjärjestus mis aitab ribosoomi väikesel subühikul õigesti positsioneeruda, kusjuures se toimub üle anti-Shine- Dalgarno järjestuse (CCUCCU) 16S rRNA-l
Eukarüootne initsiatsioon toimub mRNA 5' otsa juures: · eIF3 ja eIF6 hoiavad ribosoomi dissotsieerunult. eIF 2, GTP ja Met-tRNA moodustava aktiivse ternaarkompleksi, selle ühinemisel 40S subühikuga (+eIF1A ja eIF3 moodustub preinitsiatsioonikompleks. · eIF3- fosforüleerimise kaudu reguleeritakse initsiatsiooni · 40S subühiku interaktsiooni mRNA 5' cap osaga vahendab 23 eIF4, mRNA-d skaneeritakse kuni AUG koodonini · Kozaki järjestus- spetsiifilised järjestuse AUG ümber, mis kergendavad äratundmist ACCAUGG · IRES - internal ribosome entry sites Eukarüootne initsiatsioon algab reeglina mRNA 5' otsa juures, osadel juhtudel aga ka sisemistel saitidel 11. Elongatsioon ja terminatsioon Elongatsiooni käigus liigub aminoatsüül-tRNA läbi kolme ribosoomaalse saidi
Valgusüntees termineeritakse mRNA stopkoodoni jõudmisel ribosoomi vastavate faktorite poolt ( release factors)
12. Transkriptsiooniline regulatsioon eukarüoodis ja prokarüoodis. Ribosoomid on võimelised samaaegselt transleerima ühelt mRNA-lt ja moodustama uusi komplekse- kiirendab valgusünteesi efektiivsust - polüsoomid Translatsiooni initsiatsiooni tasemel: negatiivne translatsiooniline kontroll · Shine Dalgarno järjestuse blokaad valguliste regulaatoritega-repressorid · Shine Dalgarno järjestuse paardumine mRNA komplementaarse osaga Nt. ribosoomaalsed valgud võimelised siduma 5' UTR juhul, kui neid ei inkorporeerita ribosoomidesse · Eukarüootidel- translatsioonilised repressorid Akonitaas- blokeerib ferritiini (rauda deponeeriv valk) biosünteesi. Vastav järjestus 5' UTR ­30bp.(iron response element). · Initsiatsioonifaktorite modifikatsioon : eIF2 eIF2B- guanosiinnukleotiidi vahetusfaktor, vabastab GDP eIF2, eIF2 fosforülatsioon deaktiveerib eIF2-G0 · Eukarüootidel- AUG kontekstist sõltuv regulatsioon- lekkiv skaneerimine (leaky scanning) · Rakutüübispetsiifiline eIF4F soodustab 5' otsale lähima AUG initsiatsiooni · uORF- ribosoomkompleks dissotsieerub enne ORF jõudmist- frosforuleeritud eIF2 · IRES- ei vaja eIF4E (cap binding protein), eIF4G proteolüüsi tagajärjel ei teki kompleksi 5' capil, eIF4G lühendatud variant ei vaja cap-i · eIF4E defosforülatsioon- inhibeerib 5' sõltuva translatsiooni- M faasis, apoptoosivalgud aga IRES-idelt (apoptootilised eIF4G fragmendid suudavad IRES-del initsieerida translatsiooni) 13. Valkude topoloogia, signaaljärjestused Valkude bioloogilise aktiivsuse avaldumine toimub kindlates kohtades, selle realiseerumiseks kasutatakse erinevaid signaaljärjestusi: 2 tüüpi: - võivad olla järjestikused 24 - moodustuda valgu eri osadest selle pakkimise tulemusena 20% juhuslikest järjestustest moodustavad erinevaid topoloogilisi signaale Organell -spetsiifilised signaaljärjestused
14. Sekretoorne rada, eksotsütoos ja endotsütoos · Valkude süntees toimub karedapinnalisel ER-l, kust vastsünteesitud valgud suunatakse läbi Golgi kompleksi erinevatesse lokalisatsioonidesse rakus või sellest väljaspool- sekretoorne rada- lüsosomaalsed valgud, Golgi valgud, integraalsed, membraansed ja sekreteeritavad valgud · Ülejäänud valgud sünteesitakse vabadel, tsütosoolsetel ribosoomidel- jäävadki sinna, kui ei sisalda signaaljärjestusi ( mitokondriaalne , peroksüsomaalsed, tuumavalgud · SRP- Signaali äratundev kompleks ( signal recognition particle) interakteerub N terminaalse signaaliga · Valkude suunamine ER toimub sünteesi käigus- kotranslatsiooniline translokalisatsioon Selle kaudu sorteeritakse ER, Golgi kompleksi, lüsosomaalsed ja sekreteeritavad valgud Cis-ternaalne progressioon - Golgi kompleksis viiakse läbi valkude protsessimine: Erinevad glükosüülimisreaktsioonid valkude liikumise vältel Cis-golgist trans-Golgisse Konstitutiivne sekretsioon , väikesed, vähem pakitud vesiiklid Reguleeritud sekretsioon- tihedamini pakitud, suuremad vesiiklid- vabanevad mingi signaali tulemusena Endotsütoos- retseptorvahendatud vs. Pinotsütoos- vesiiklid liiguvad lüsosoomi, ained rakku sisse Eksotsütoos ­ ained rakust välja 15. Kaetud vesiiklite tüübid Erinevat tüüpi vesiiklite tekke mehhanism sarnane · Initsieeritakse GTP-d siduvate valkude viimisega tekkiva vesiikli juurde · Kattevalkude sidumine transmembraansete retseptorite tsütosoolsesse ossa · Osa sellistest valkudest on ka retseptorid,mis sorteerivad valke (ligande), mida moodustuv vesiikel transpordib Valkude transpordil läbi sekretoorse raja osalevad kolme põhitüüpi vesiiklid · COPII- vesiiklid transpordivad valke ER-st Golgisse 25 · COPII vesiiklite teket intsieerib Sar1 · GTP seondumine võimaldab kattevalkude soendumise tekkivale vesiiklile · COPI - vesiiklid viivad läbi retrograadset transporti Golgis · COPI kaetud vesiiklid transpordivad valke retrograadselt, vesiiklite teke initsieeritakse ARF valkude (GTP-d siduv valk) seondumisega retseptoritele · Transporditavad valgud interakteeruvad samuti kattevalkudega · Vesiikli moodustumine põhjustab ARF-l GTP hüdrolüüsi · Kuidas sorteeritakse transporditavad valgud? - Sorteerimissignaalid transmembraansetel retseptoritel · Klatriinkaetud vesiiklid transpordivad valke trans-Golgist ja membraanist endosoomidesse · Koosneb kolmest raskest (Mw 180 kDa) ja kolmest kergest 35-40 kDa) ahelast , fibroosne triskelion on 36 korduses, sisekiht sisaldab adaptervalgu komplekse (AP, 350 kDa) · AP valgud on transporditava retseptori spetsiifilised, see on tagatud erineva valgulise koostisega · AP kompleksi teke trasporditava valguga kutsub esile ARF seondumise · GTP hüdrolüüs muudab dünamiini konformatsiooni ja on vajalik klatriin-kaetud vesiiklite eraldumiseks membraanist · COP tüüpi vesiiklid ei vaja sellist GTPaasset energiat
· Ilmselt olemas ka spetsiifilised kattevalgud, mis moodustavad eksotsütootilise ja sekretoorseid vesiikleid Konstitutiivne sekretsioon, väikesed, vähem pakitud vesiiklid Reguleeritud sekretsioon- tihedamini pakitud, suuremad vesiiklid- vabanevad mingi signaali tulemusena 16. ER signaaljärjestus, kus paikneb ja millised seaduspärasused Laetud N terminaalne signaal (Met + 2-5 laetud AHd) -6-12 hüdrofoobset Ah-d sisaldav regioon -5 polaarset Ah-t sisaldav N-terminus -Preproteiin ja preproproteiin Sellise struktuuriga järjestus määrab ära tema äratundmise SRPde poolt ja selline polüpeptiid suunatakse ERi. Pärast seda lõigatakse signaal ära vastavate signaalpeptidaaaside poolt. SRPga inteaktsioon on adaperiks ribosoomide ja ER vahel (1000x afiinsuse erinevus) Erandjuhtudel võib selline signaal olla ka polüpeptiidi sees nt ovalbumiin (22-41) Polüpeptiidid, millel selline signaal puudub suunatakse tsütosooli 17. Valkude suunamine ER-I, SRP ja translokoon, energeetilised aspektid Sekretoorsete valkude signaaljärjestus suunab need ER-i, seejärel lõigatakse selline järjestus kui funktsionaalselt mittevajalik 26 Sekretoorsed valgud sisenevad ER luumenisse Signaali äratundmise partikli (SRP) struktuur vahetult peale sünteesi algust- kotranslatoorselt
Signaaljärjestuse interaktsiooniks ER membraaniga on vaja kahte valku: SRP ja SRP retseptor
Polüpeptiid liigub ER luumenisse läbi translokoni TRAM ­ Transport Associated Membrane ­ kui seal on mutatsioon, ei suunata ER-i GTP hüdrolüüsil saadav energia tagab valkude liikumiseks ER-i vajaliku energia 27 18. Signaaljärjestuse lõikamine ja valkude pakkimine ER valkudel
Karedapinnalisel ER-l sünteesitud integraalsete membraanivalkude topoloogia Tüüp I - N terminaalne signaaljärjestus, N terminus eksoplasmaatiline Tüüp II - signaaljärjestus puudub, N terminus tsütosoolis Tüüp III - signaaljärjestus puudub, N terminus eksoplasmaatiline Tüüp IV - mitu korda membraani läbivad. A klass- N terminus tsütosoolne, B klass- eksoplamaatiline
19. Transmembraansete valkude membraani suunamine signaalankurjärjestus ja "stop-transfer" ankurjärjestus. Tüüp I ­ ,,stop transfer" ankurjärjestus Tüübid II ja III ­ sisemine signaaljärjestus Tüüp IV ­ mitu sisemist signaali Üks kord membraani läbivad valgud sisaldavad ühte sisemist topogeenset järjestust
Mitu korda membraani läbivad (multipass transmembrane) valgud sisaldavad vastava arvu topogeenseid järjestusi 28
20. Kuidas viiakse membraani intra - ja ekstratsellulaarse N terminusega valke? Signaal- ankur järjestused: seondub translokoniga, kuid süntees jätkub. Stop-transfer-ankur järjestused: seondub translokoniga, aga inhibeerivad sünteesi (arestitakse valgu süntees) Vt ka 20ndat! 21. Mitokondriaalsed signaaljärjestused, kuidas toimub valkude suunamine erinevatesse lokalisatsioonidesse mitokondris( matriks , membraan , membraanidevaheline ruum)? Mitokondriaalsed valgud sünteesitakse eelasvalkudena, mis sisaldavad signaaljärjestusi. Sellised järjestused vastutavad nii suunamise kui organell- spetsiifilisuse signaali (uptake- targeting sequences)
Mitokondriaalsete valkude suunamine · Mitokondriaalse ja kloroplastide DNA poolt kodeeritud valgud sünteesitakse nendes organellides ja inkorporeeritakse otseselt nendesse · Suurem osa nende organellide valkudest sünteesitakse tsütosoolis ribosoomidel · Mitokondriaalsed valgud sisaldavad spetsiifilisi järjestusi, nn "uptake-targeting" järjestusi · Sellised järjestused on signaaliks vastavatele retseptorvalkudele, mis translokeerivad vastavad valgud läbi organelli membraani · Mitokondriaalne signaal sisaldab 3-5 positiivselt laetud AH-t, mis on vaheldumisi hüdroksüleeritud AH- ga (Ser või Thr) 29 22. Mitokondriaalne membraanitransport Transporditavad valgud peavad olema lahti pakitud. Tsütosoolsed chaperonid transpordivad mitokondriaalsed valgud kanal -seotud retseptoriteni. Mitokondriaalsed valgud seotakse kas mitokondriaalset importi stimuleeriva faktori (MSF) või Hsc70 valkudega- hoiab ära agregatsiooni Mitokondriaalsete valkude membraanist läbiviimine kasutab energiat · ATP energiat tsütosoolis · Prootonite gradienti (proton- motive force ) sisemembraanist läbiviimisel · ATP energiat maatriksis Erinevad mitokondriaalsed valgud kasutavad transprodiks submitokondriaalsetesse struktuuridesse erinevaid radu . Selleks on neil erinevad signaalid Membraanidevahelised valgud: · konservatiivne mehanism- viiakse maatriksisse ja seejärel seob sekundaarne signaal vastavat valku sisemembraanis (Cyt c1) · mittekonservatiivne mehanism- valk sisaldab nn "stop-transfer" järjestust (Cyt b2) · Cyt C liigub vabalt läbi välismembraani läbi P70 poori , kui lisatakse heem, ei saa enam välja Membraanivalgud- sisaldavad ka hüdrofoobset ala, mis jääb membraani kinni- stop transfer signaal 23. Mitokondriaalsete valkude pakkimine. Kui valgud sisenevad mitokondri maatriksisse, seondub nende külge maatriks Hsc70, mis on tsütosoolse Hsc 70 tsaperoni analoog ( struktuurilt ja funktsioonilt). Maatriks Hsc70 on seotud maatriksis mitokondri sisemembraani pinnale, transpordikanalite lähedusse. See seondub pakkimata valgu külge kohe siis, kui see maatriksisse siseneb, kaitstes valku liitmise või sadestamise ja varajase pakkimise eest. See on eriti oluline valkkomplekside alaühikute korral, kuna ükskõik millise alaühiku korrektne pakkimine nõuab kõikide teiste alaühikute olemasolu. Peale seda, kui valk jõuab mitokondri maatriksisse, proteaas eemaldab selle N-terminaalse maatriksi märklauaga järjestus. Mõned imporditud valgud võivad oma lõplikkusse aktiivsesse konformatsiooni pakkuda kõrvalise abita. Siiski paljude maatriksi valkude puhul on vaja kasutada Hsc60 (suguluses bakteriaalse GroEL -iga). Kui selles tsaperonis on mutatsioon, siis pärmi puhul näidati, et import ja lõikamine toimuvad normaalselt, aga see ei suuda täita oma rolli multivalk kompleksis (pakkimises vead). 30 24. Peroksüsomaalne transport, erinevused ja sarnasused mitokondriaalsest transpordiga C- and N-terminaalsed signaaljärjestused suunavad valke peroksüsoomiaalsesse maatriksisse Peroksüsomaalsed valgud pakitakse tsütosoolis Signaaljärjestus katalaasil: SKL või sarnane signaal C terminuses Transport nõuab ATP energiat kuid mitte elektrokeemilist gradienti Katalaas seob tsütosoolset retseptorit PTS1R, see kompleks omakorda seondub Pex14P retseptorile N-terminaalne signaal tiolaasil: 26 aminohapet, seda tunneb ära PTS2R, pärast internalisatsiooni see signaal lõigatakse ära 25. Millised valgud on võimelised tuuma sisenema passiivse transpordiga? Tuumapoorikompleks- koosneb rohkem kui 50 valgust nukeloporiinidest- 3000-4000 poori Madalmolekulaarsed lähevad läbi Kuni 17 000Da ­ suhteliselt kiire diffusioon 26. NLS, ja NES, tuumatranspordi mehhanism ja energeetilised aspektid. Suuremad kui 60 000Da ei läbi- peab olema aktiivne transport-NLS NLS- 4-8 AH järjestused, Lys Arg rikkad NLS tunneb ära tuumaimpordi retseptori NLS ­ nuclear localisation signal , NES ­ nuclear export signal. Energeetiline aspekt on see, et nad on GTPaasse aktiivsusega. Ran-GEF interakteerub ja fosforüleerib Ran-GDP-d, tõrjub valgu küljest ära, aitab valku vabastada. Ran-GAP interakteerub Ran-GDP-ga ehk siis defosforüleerib.
27. Ran valkude tsükkel, nende osa transpordil. Ran'id seonduvad valkudega, millel on tuumalokalisatsiooni signaal ning aitavad nad tuuma transportida ning tuumast välja transportida. 31 SIGNAALIÜLEKANNE 1. Rakkudevaheline kommunikatsioon, milliseid protsesse sisaldab? Ekstratselulaarne signaaliülekanne e. transmissioon sisaldab signaali teket ja selle liikumist signaali vastuvõtva rakuni (1) signaalmolekuli sünteesimine signaliseerivas rakus (2) signaalmolekuli vabanemine signaliseerivast rakust (3) signaalmolekuli transport märklaudrakuni Rakusisene signaaliülekanne e. transduktsioon on protsess mille käigus toimub signaali vastuvõtmine, rakusisene edaskandumine ja primaarne vastus sellele signaalile (signaali konversioon rakuliseks vastuseks) Tinglikult võib jagada kolme etappi: 1. Signaali vastuvõtmine raku pinnal spetsiifiliste retseptorite poolt; 2. Signaali edasikandumine tsütoplasmas, mille käigustoimuvad rea valkude aktiivsuse muutused ja/või madalamolekulaarsete sekundaarsete vahendusmolekulide (second messengers) kontsentratsiooni muutused; muutus raku metabolismis, funktsioonis või arengus, mille on esile kutsunud signaalmolekuli ja retseptori komplekseerumine; 3. tuumasisene etapp, mis sisuliselt seisneb geeniekspresioonimuutmises transkriptsiooni faktorite aktivatsiooni või inaktivatsiooni kaudu Signaali eemaldamine ja rakulise vastuse kadumine Kõik kirjeldatud etapid pole alati vajalikud! 2. Signaalmolekulide klassifikatsioon vastavalt toime ulatusele, endokriinsed, parakriinsed ja autokriinnsed signaalmolekulid Oma olemuselt võib signaalikandjaid jagada kolme rühma: Füüsikalised signaali kandjad . 9 Valguskiirgus 9 Elektriline pinge ja membraanipotsentsiaal ja selle muutus ioonide kontsentratsiooni muutuste kaudu Keemilised signaali kandjad. 9 feromoonid . 9 Neurotransmitterid , klassikalised neurotransmitterid neuropeptiidid 9 steroidhormoonid ja muud rasvlahustuvad molekulid (östradiool, testosteroon, progesteroon, kortisool , A ja D vitamiinid ), 9 Gaasid (NO, CO) 9 Peptiid - ja valgulised hormoonid (nt. insuliin ja kasvufaktorid). Bioloogilised signaalikandjad 9 Viirused , bakterid 9 Rakk-rakk interaktsioonid 1. Endokriinne- signaalmolekulid(hormoonid) toimivad oma sünteesikohast eemal. Tavaliselt imetajates kantakse hormoone edasi vereringe kaudu 2. Parakriinne- signaalmolekulid (neurotransmitterid) toimivad sünteesikoha vahetus läheduses 3. Autokiinne- signaalmolekul toimib samale rakule, kus sünteesiti, parakriinse erijuht 4. Signalisatsioon valk-valk kontaktide kaudu (adesiooon, k.a. Jukstakriinne toime) ~parakriinne, aga veidi pikema toimega 32
3. Hormoonide klassifikatsioon Klassifitseeritakse vastavalt nende lahustuvusele ja retseptori lokalisatsioonile: · Väikesed lipofiilsed molekulid- võimelised läbima plasmamembraane ( steroidid , türoksiin, retionoolhape) seonduvad tsütosoolsetele retseptoritele · Hüdrofiilsed molekulid, mis seonduvad rakupinna retseptoritele (peptiidhormoonid) · Lipofiilsed molekulid, mis seonduvad rakupinna retseptoritele (prostaglandiinid)
Rakupinna retseptorid võib jaotada nelja suurde klassi 33 4. Sekundaarsed vahendajad Suurema osa hormoonide efektid vahendatakse efektormolekulideni sekundaarsete vahendajate (second messenger) abil
Adaptervalgud, mis osalevad signaali transduktsioonil, on konserveerunud molekulid GTPaasse aktiivsusega lülitid ja proteiinkinaasid
Erinevate hormoonide süntees, vabanemine depoodest ja degradatsioon toimub erineva kiirusega ja on täpselt reguleeritud Rakupinna retseptorite KD (dissotsiatsiooni konstant) väärtused näitavad ligandide ligikaudset kontsentratsiooni ­ mida väiksem on KD, seda suurem on tasakaal retseptor-ligand kompleksi suhtes. KD ­ umbes 50% ligandist on valgule seostunud. Agonistid- molekulid, mis seonduvad retseptorile ja aktiveerivad signaaliülekande ka ligandid ise Antagonistid- molekulid, mis seonduvad, kuid signaaliülekannet ei tekita, blokeerivad retseptori G-valkude korral: Retseptorvahendatud Gs- valkude stimulatsioon viib adenülattsüklaasi aktivatsioonini ja sekundaarse vahendaja cAMP sünteesini cAMP ei funktsioneeri RTKde vahendatud signaaliülekandes, nii RTKd kui GPRCd võivad initsieerida teiste sekundaarsete vahendajate sünteesi cAMP ja teised sekundaarsed vahendajad aktiveerivad spetsiifilisi proteiinkinaase cAMP aktiveerib spetsiifiliselt cAMP sõltuvaid (cAMP- dependent ) proteiinkinaase (cAPKs) Fosfolipiidide ensümaatilisel modifitseerimisel moodustuvad erinevad sekundaarsed vahendajad: diatsüülglütserooli (DAG) ja inositooltrifosfaadi (IP3) süntees 34 IP3 vahendab hormoonide poolt indutseeritud Ca2+ cGMP vahendab NO signaliseerimist vabanemist ERist
5. G-valk seoselised retseptorid ja nende effektorid. Suurte G valkude klassifikatsioon · Suurem osa imetajate rakupinnaretseptoritest on G-valguga seotud retseptorid (GPRCd). Sellised retseptorid on funktsionaalselt kompleksis trimeersete GTPaasse aktiivsusega valkudega · Ligandi seondumine retseptoriga aktiveerib G valgu, see omakorda aktiveerib effektorensüümi, mis sünteesib sekundaarse vahendaja · Kõik GPCRd on väga sarnase struktuuriga, koosnedes 7 transmembraanses domääniga monomeersest valgust, kusjuures N- terminus on rakust väljas ja C-terminus raku sees · GPCRd vahendavad väga erinevaid signaale, nt. nägemine, lõhnad, (peptiid)hormoonid, neurotransmitterid jne. GPRC stimuleerimine spetsiifilise ligandiga aktiveerib adenülaaditsüklaasi aktivatsiooni (-andrenergilise retseptori näide) Trimeersed Gs- valgud seovad -adrenergilised retseptorid ja adenülaattsüklaasi
Läkaköhatoksiin ja kooleratoksiin modifitseerivad pöördumatult G-valke
CREB valgud seovad cAMP signaali transkriptsiooniga 35 GPRC signaali kustutamine: · Ga eemaldumine kompleksilt kutsub esile retseptori afiinsuse languse · cAMP eluiga reguleeritud cAMP fosfodiesteraasse aktiivsusega- AMP Pikemaajalisel stimulatsioonil toimub retseptorite desentsitiseerimine (positivne tagasiside): · Homoloogne desentsitiseerimne: retseptori tsütosoolse osa forforüülimine spetsiifiliste kinaasidega ( BARK ­ adrenergic receptor kinase) · Heteroloogne desentsitiseerimine: Retseptori tsütosoolse osa fosforüülimine PKA poolt, fosforüülib kõik sobivad retseptorid Arrestiinid: - blokeerivad spetsiifiliselt fosforüleeritud retseptorid - takistavad G seondumist - vahendavad AP2 ja klatriini seondumist- coated pits
6. Retseptor türosiinkinaasid (RTK) ja Ras valgud · RTKd seovad lahustunud või membraaniseoselisi peptiidhormoone, mis toivad tavaliselt kasvufaktoritena · Ligandi seondumine kutsub esile retseptori türosiinkinaasse aktiivsuse, fosforülatsiooni tagajärjel retseptor aktiveerub ja see omakorda käivitab signaaliülekande rakus · RTKd on tavaliselt aktiveeritud olekus dimeersed, kusjuures alati ei ole tegemist homodimeerse interaktsiooniga · RTK rajad on olulised rakkude prolifereerumise 36 regulatsioonis, rakkude vananemise signaalide vahendamisel ja metabolismi moduleerimisel · RTKd transmiteerivad signaali Ras-valkudeni. · Ras valgud on GTPaasse aktiivsusega lülitid, Ligandi seondumine viib RTKde autofosforülatsioonile ja nende aktiveerumisele Ras-valgu tsükkel: toimub üleminek GEF-valk on adaptermolekuliks, mis ühendab aktiveeritud RTK aktiivse ja inaktiivse vormi vahel Ras- valkudega
7. MAP kinaaside rada aktiveeritud Ras indutseerib kinaasse signaalikaskaadi, mis omakorda kulmineerub MAP kinaasi aktivatsiooniga MAP kinaas on seriini /treoniini kinaas, mida iseloomustab võime translokeeruda tuuma ja fosforüleerida erinevaid valke (nt. transkriptsioonifaktorid) Aktiveeritud Ras signaal liigub edasi läbi proteiinkinaaside Eukarüootsetes rakkudes on rida erinevaid kaskaadi MAP kinaaside radasid
GPCRs ja RTKs aktiveerumine on keerulisem protsess kui lihtne järkjärguliste interaktsioonide jada GPCRs või RTKs aktivatsioon viib sageli paljude erinevate sekundaarsete messengeride tekkeni Sarnane rakuline vastus võib tekkida erinevate signaalradade kaudu Erinevate signaalradade omavahelised interaktsioonid lubavad äärmise täpsusega reguleerida rakulist aktiivsust Suur osa rakulistest vastustest hormoonidele, kasvufaktoritele ja neurotransmitteritele realiseeruvad effektides geeniekspressioonile Selline efekt saavutatakse läbi proteiinkinaaside, mis otseselt või kaudselt fosforüleerivad spetsiifilisi transkriptsioonifaktoreid Heteroloogne ja homoloogne desensitiseerimine, PKA, BARK ja arrestiinid 37 8. Retseptorite desentsitiseerimine ja retsükleerimine Retseptorite tundlikkuse vähendamine ja taaskasutamine. Tähtis mehhanism kindlate rakuliste vastuste saamiseks on retseptori tundlikkuse vähendamine kõrgete signaali kontsentratsioonide või peale signaali pikendatud mõju. Raku tundlikkust kindlale signaali molekulile saab alla reguleerida molekuli retseptorite endotsütoosi teel, seeläbi vähendades nende arvu raku pinnal või muutes nende aktiivsust nii, et retseptorid kas ei saa ligandile seonduda või moodustavad retseptor-ligand kompleksi, mis ei anna normaalset rakulist vastust. Sellist retseptorite aktiivsuse moduleerimist viiakse läbi retseptorid fosforüleerides, sidudes selle külge teisi valke või tehakse mõlemat korraga. Homoloogiline desnsitiseerimine ­ täiendavad jäägid - adrenergilise retseptori tsütosoolses domäänis fosforüleeritakse retseptorspetsiifilise ensüümiga (-adrenergilise retseptori kinaas ­ BARK), aga ainult siis, kui epinefriin või agonist seondub retseptorile. Kuna BARK fosofrüleerib ainult aktiivseid -adrenergilisi retseptoreid, ongi see homoloogiline. Heteroloogiline desnsitiseerimine ­ risti reguleerimine; PKA aktiivsust võimendab kõrge cAMP-i tase, mida toodab ükskõik milline hormoon, mis aktiveerib Gs, sellise hormooni (nt epinefriini) pikendatud mõju põhjustab tundlikkuse vähenemist nii -adrenergilisel retseptoril kui ka Gs valguga seondunud retseptoritel, mis seovad erinevaid ligande (nt glükagoon). Kui endotsütoosi käigus viidi retseptor vesiikuliga rakku sisse, siis sama vesiikul võib eksotsütoosi teel jälle raku pinnale minna.
RAKUBIOLOOGIA. 1. Nimeta rakuorganellid ja kirjelda lühidalt nende olulisi funktsioone. mitokonder ­ 2 membraani (sisemembraani sopistised ­ kristad), oma DNA (väike, sageli muutuv, pärandub emaliini pidi) Seal toimuvad tsitraadi tsükkel, elektrontransport, oksüdeeriv fosforüülimine, rasvhapete ja püruvaadi oksüdatsioon ja aminohapete katabolism (kogu aeroobne energiavarustus). Raku hingamine, toitainete lagundamine (ensüümide ja hapniku abil), moodustub vesi, süsihappegaas, energia). ATP süntees. rakusein ( rakukest ) ­ eraldab väliskeskkonnast endoplasmaatiline võrgustik ­ Karedapinnaline ­ sellel paiknevad ribosoomid, Valkude süntees, talletamine ja bioühendite suunamine ,,koju". Siledapinnaline ­ süsivesikute ja lipiidide süntees (lihasrakkudes kaltsiumi säilitamine); osade mürgiste ühendite lagundamine. Siledapinnalisest ER-ist tekib karedapinnaline kui sellele moodustuvad ribosoomid. Raku kuju säilitamine. vakuool - vee reservuaar , kindlustab raku turgori, toitainete varu/jääkinete varu ja kus toimuvad lõhustumisprotsessid. plasmamembraan ­ eraldab väliskeskkonnast Golgi kompleks ­ Glükoproteiinide jm membraanikomponentide valmimine, uute valgumolekulide süntees. Materjal tuleb ER-ist, see sorteeritakse, muudetakse ( lihtvalk -> liitvalk), tihendatakse, pakendatakse membraanstruktuuridesse. Seal on membraanstruktuuride varu, taimedes toodab lima ja seedeensüüme, loomarakkudes on spermide puhul seal lõhustava toimega ensüümid, mis aitavad läbi munaraku kesta tungida. tuum ­ DNA replikatsioon, tRNA, mRNA ja tuumavalkude süntees kloroplast - 2 membraani, sisemembraan hästi liigendatud. Sisemust täidab valguline vesilahus strooma; oma DNA (määrab teatud kloroplasti valke); neil on ka tülakoid, kus paiknevad fotosünteetiline valguse absorbeerimise süsteem, elektrontransportahel ja ATP süntetaasi kompleks. Fotosüntees ( valgusstaadium sisemembraanistikul, kus asub ka klorofüll, pimedusstaadium ensüümide vahendusel stroomas ATP energia abil). 38 lüsosoom ­ Sisaldavad lõhustava toimega ensüüme ja lagundavat materjali. Hüdrolaaside eraldamine, hüdrolüütiline lõhustamine. Autofaagia ­ iseenese seedimine (lagundatakse rasv- ja lihaskudet). Heterofaagia ­ kehavõõrate ühendite lagundamine (ainuraksete toitumine). · tsütoskelett ­ Tsütoskelett on eukarüootsetel rakkudel, see koosneb tuubulitest ( mikro ) ja filamentidest (vahe, mikro), valgud: aktiin , tubuliin, müosiin. Funktsioonid: struktuurne raku kuju formeerimine, säilitamine, muutmine; sideme loomine rakuorganellide vahel; transport. Tagab raku ja tsütoplasma liikumisvõime. · peroksüsoom ­ aminohapete oksüdeerimine, Peroksisoomid sisaldavad ensüüme, mis kasutavad orgaaniliste molekulide oksüdeerimiseks molekulaarset hapnikku. Osa neist ensüümidest toodavad keemiliste reaktsioonidega vesinikperoksiidi, mis on väga tugev oksüdeerija, teised jälle lagundavad seda. · ribosoom ­ Koosnevad kahest rRNA molekulist ja 34 valgumolekulist (rRNA-d rohkem kui valku). Valgumolekulid asuvad pinnal. Jagunevad suureks (50S/60S) ja väikseks (30S/40S) subühikuks. Ribosoomid (70S/80S) moodustavad tuumakestes. Seal toimub valkude süntees (asuvad tsütoplasmas, karedapinnalisel ER-il, mitokondrites, kloroplastides) Kristalliseeriti esimest korda 1999/2000, elektronmikroskoobiga nähti, et valkude sünteesi katalüüsivad rRNA-d 2. Missugused organellid on omased nii bakteritele kui eukarüootidele? Missugused vaid bakteritele? Eukarüootidele? Bakteritel pole organelle, struktuurilt on mõlemal olemas tsütoplasma, ribosoomid, plasmamembraan ja kromosoom(id). Bakteritel on olemas veel vibur (mõnel), piil , võrreldes loomarakuga ka rakukest. Eukarüootidel on palju erinevaid organeid. 3. Nimeta erinevaid raku transpordi tüüpe ja kirjelda, kuidas nad erinevad, on sarnased ning missugused protsessid nendega kaasuvad ja miks. Passiivne transport Difusioon Saab toimuda, kui kontsentratsiooni gradient on erinev, osakesed liiguvad tihedamast keskkonnast hõredamasse. Saavad: hüdrofoobsed ja mittepolaarsed molekulid (O2, CO2, N2, benseen ), väiksed laenguta polaarsed molekulid (vesi, uurea , glütserool) o Osaliselt läbilaskev membraan o Osmoos o Kaasaaidatud osmoos Aktiivne transport Membraanipumbad - Transmembraansed valgud, mis viivad erinevaid ioone vastu nende kontsentratsioonigradiente; ATP- aasid - kasutavad transpordiks ATP energiat; Ei moodusta poore vaid ioonide liikumine läbi konfomatsiooniliste muutuste; 4 klassi; Vastutavad membraanipotentsiaali tekke eest koos ioonkanalitega. Klassid : P ­ loomarakkudest, vastu gradienti (2x, 2x); F ­ keerulisem, asub mitokondris, V ­ keerulisem, levinud prokarüootides, prootonid vastu gradienti, ABC perekond ­ muud molekulid nt flipaase (2x transmembraanne, 2x ATP siduv) Endotsütoos o Fagotsütoos -suurte partiklite (mikroorganismid, surnud rakkude osad jne.) sissevõtmine (·makrofaagid ja neutrofiilid ·amööb) o Pinotsütoos (= endotsütoos) - lahustunud makromolekulide sissevõtmine väikeste (kanaleid . Niisugused ained võivad plasmamembraane läbida vesiikulite 39 sisaldisena endo- või eksotsütoosi teel. · Ekso - ja endotsütoos tähendab membraaniga ümbritsetud transportvesiikulite teket ja nende ühinemist kas välismembraaniga (eksotsütoos) või endosoomi membraaniga (endotsütoos). Ühinemine toimub kahes etapis: 1. bilipiidkihid lähenevad üksteisele 2. seejärel toimub ühinemine. ·Mõlemat etappi aitavad läbida teatud membraanvalgud, nn. fusogeensed valgud, milliseid pole õnnestunud identifitseerida. ·Ekso- ja endotsütoosi puhul vastavad makromolekulid eraldatakse vesiikulisse ning nad ei segune teiste tsütoplasmas olevate makromolekulidega. ·Iga vesiikul on määratud ühinema ainult kindla membraaniga.Tulemuseks on makromolekulide suunatud liikumine raku sise- ja väliskeskkonna vahel. 4. Kuidas rakk reguleerib valgu funktsiooni? Too 3 näidet ja kirjelda neid põhjalikumalt. a) Rakk hakkab valku tootma alles siis, kui selleks tekib vajadus. Näiteks kui E.Coli keskkonda ilmub laktoos , hakkab ta tootma laktoosi lõhustavaid valke. b) Rakk jaotab erinevate ülesannetega valgud eri organellide vahel. Niimoodi ei lähe substraadid ja produktid segi, ning vastupidised protsessid saavad korraga toimuda raku eri osades. c) Rakk saab kontrollida valkude aktiivsust erinevate lülititega: 1) Allosteeria ehk ligandi sidumisest põhjustatud tertsiaar-või kvarternaarstruktuuri muutus. Näiteks Proteiin Kinaas A cAMP puudumisel keskkonnast ei toimi. cAMP-i ilmumisel PKA tetrameer laguneb kaheks monomeerseks katalüütiliseks ja üheks dimeerseks regulatoorseks alaühikuks. Lisanäitena hemoglobiini ligand on O2, mille esialgne vähene sidumine viib hemoglobiini konformatsiooni, kus ta saab rohkem siduda.
2) GTPaaside superperekond. Siia alla kuulub näiteks RAS. GTPaas on aktiivne, kui talle on seotud GTP, inaktiivne, kui on seotud GDP. 3) Seriini, Treoniini, Türosiini fosforüleerimine mõjutab valgu aktiivsust. Kinaasid fosforüleerivad, fosfataasid defosforüleerivad. Need mõlemad muudavad valgu laengut ja seeläbi ka konformatsiooni, ning aktiivsust. 4) Proteolüütiline lõikamine in/aktiveerib pöördumatult. Pankreasest tulebad trüpsinogeen ja kümotrüpsinogeen. Peensool eritab Enterokinaasi, mis lõikab trüpsinogeeni trüpsiiniks, mis omakorda kümotrüpsinogeeni kümotrüpsiiniks. Hiline aktiveerumine on vajalik, et keharakke ei hävitataks. fosforüleerimine - valkude pööratav fosforüleerimine on tähtis regulatoorne mehhanism, mis toimib nii prokarüootsetes kui ka eukarüootsetes organismides. Ensüümid, mida kutsutakse kinaasideks (+P) ja fosfataasideks (-P) on sellesse protsessi haaratud. Paljud ensüümid ja retseptorid lülitatakse "sisse" ja "välja" fosforüleerimise ja defosforüleerimise kaudu. Pööratava fosforüleerimise tulemus on konformatsiooni muutus paljude ensüümide ja retseptorite struktuurides, mis põjustab nende aktiveerumist või deaktiveerumist. Fosforüleeritakse tavaliselt seriini, treoniini ja türosiini jääke eukarüootsetes valkudes. Lisaks toimub fosforüleerimine põhilistes aminohappe jääkides histidiinis, arginiis või lüsiinis prokarüootsetes valkudes. Fosfaadi molekuli lisamine polaarsele R rühmale aminohappes võib muuta hüdrofoobse osa polaarseks ja väga hüdrofiilseks, mistõttu toimubki konformatsiooni muutus. Nt p53 tuumorsuppressor valk ­ aktiveerides võib viia apoptoosini. metüleerimine - valgu metüleerimine toimub tavaliselt arginiini või lüsiini jäägi juures. Arginiini saab metüleerida 1 või 2 korda või ühe metüülrühmaga mõlemasse lämmastikku, läbi viivad peptidüülarginiin metüültransferaasid. Lüsiini saab metüleerida 1-3 korda lüsiini metüültransferaaside poolt. Valkude metüleerimist on enim uuritud histoonides, kus seda viivad läbi histoon metüültransferaasid (Met kohal?). 40 Metüleeritud histoonid võivad epigeneetiliselt represseerida või aktiveerida geeni ekspressiooni teatud tingimustel. ubikvitineerimine ­ ubikvitiini aktiveerimine (2-astmeline reaktsioon E1 ubikvitiin-aktiveeriv ensüüm viib läbi, vajab ATP energiat; 1 samm hõlmab ubikvitiin-adenülaadi intermediaadi tootmist ja teine samm viib ubikvitiini E1 aktiivtsentri tsüsteiini jääki, vabastades AMP, tekib tioester side C-terminaalse ubikvitiini karboksüülrühma ja E1 tsüsteiini sulfhüdrüülrühma vahel). Ubikvitiini viimine E1-st ubikvitiini konjugeeriva ensüümi E2 aktiivtsentrisse käi trans(tio)esterifikatsiooni reaktsiooni kaudu. Viimane samm ubikvitülatsiooni kaskaadis loob isopeptiidi silla sihtmärkvalgu lüsiini ja C-terminaalse ubikvitiini glütsiini vahel. See vajab sadade E3 ubikvitiin-valk ligaaside aktiivsust. E3 ensüümid suudavad seonduda nii E2-le kui ka substraadile. 5. Mis on homeostaas , diferentseerumine , apoptoos ? Homeostaas kui organismi omadus luua sisekeskkonna püsiv tasakaal. Homeostaas saavutatakse koordineerides füsioloogiliste reaktsioonide kompleksi kudede vahel keemiliste või elektriliste signaalide abil. Selle kommunikatsiooni juures mängivad keskset osa hormoonid ja on seetõttu tähtsad homeostaasi säilitamisel Diferentseerumine protsess, mille jooksul rakk kujuneb spetsialiseeritud rakuks Apoptoos raku programmeeritud surm, ebavajalike rakkude eemaldamine Apoptoosi kutsuvad esile füsioloogilised (surmaretseptorite aktiveerimine) ja patoloogilised stiimulid (mutatsioonid, nakkused). Apoptoosi teel surevad tavalised , terved rakud, mida pole enam vaja või siis haiged ja stressis rakud, mida on küll vaja, aga mis muutuvad kahjulikuks või mittefunktsionaalseks. Apoptoosil on kaks varianti (rohkem uuritud) ­ sisemine (intrinsic - otsus surra tuleb raku seest, mitokondrid asjaga seotud) ja välimine (extrinsic - rakusurm aktiveeritakse rakupinnal teiste rakkude poolt) 6. Mis on kaspaasi funktsioon ja mis juhtub pro-kaspaasi aktiveerumisel? Kaspaas: tsüsteinüül aspartaat -spetsiifilised proteaasid, mis aktiveeritakse ainult apoptootilistes rakkudes. Aktiivtsentris on kriitiline tsüsteiini jääk konserveerunud pentapeptiidis (QACXG), lõikab substraati aspartaadi järel peaaegu absoluutse spetsiifilisusega. Apoptoos on pöördumatu, kui kaspaase on aktiveeritud üle kriitilise taseme. Kaspaaside blokeerimine peatab apoptoosi. Inimesel on 11 kaspaasi, osad osalevad põletikes, mõned alustajad, mõned teostajad . Kaspaasi aktiveerimiseks tuleb esmalt pro-kaspaas katki lõigata ­ esimeste aktiveerimiseks kogutakse need hästi lähedale, edasi aktiveerivad üksteist. Aktiivne kaspaas koosneb kahest lõigatud prokaspaasist (2 suurt + 2 väikest alaühikut) Kaspaasidel on 2 rada, surma retseptori rada DISC (koosseisus surmadomään + adaptorid + pro-kaspaas-8) ja mitokondriline rada apoptosoom (koosseisus Apaf1 (adaptervalk) + dATP + tsütokroom c + pro-kaspaas-9). Mõlemad aktiveerivad kaspaas-3-e, mis hakkab teostama lagundamist. 7. Nimeta apoptoosiga kaasnevad kolm degradatsiooni protsessi. Apoptoosiga kaasneb tsütoskeleti purunemine , mille tõttu rakk omandab ümara kuju, membraani asümmeetria ja lisandid kaovad, rakk tõmbub kokku, tuum laguneb, kromatiin kondenseerub ja kromosomaalne DNA lõhutakse. 1. Rakk tõmbub kokku ja ümbrust on näha, sest kaspaaside poolt on lõhutud valguline tsütoskelett. 2. Tsütoplasma on tihe ja organellid kõvasti pakitud. 3. Kromatiin kondenseerub kompaktsetesse kogumitesse (püknoos) tuuma ümbrikusse 4. Tuuma ümbrik muutub katkendlikuks ja selles olev DNA tükeldatakse, tuum puruneb mitmeks eraldi kromatiini kehaks või nukleosomaalseks üksuseks. 5. Membraanile tekivad kühmud 6. Rakk puruneb mitmeks vesiikliks (apoptootilised kehad), mida fagotsüüdid söövad. 8. Mida reguleerib "nonsense-mediated decay pathway"? Nonsense-mediated decay ­ ühe või enam eksoni vahele jätmine, mis põhjustab ekson-intron liidese vahetus 3' läheduses Stop koodoni sissetuleku. Nonsense mediated decay vahendab kiiret mRNAde lgundamist, kus Stop koodonid esinevad mRNAs enne viimast splaisiliidest. Arvatakse, et osad ekson-intron liidese kompleksi valgud osalevad nonsense mediated decay's. Ekson-intron liidese kompleksid interakteeruvad vahetult deadenülaasi 41 kompleksiga. Arvatakse, et Stop koodoni "sisse splaisimise" korral ekson-intron liidese kompleksid RNAlt lahti ei tule ning seega ribosoomset skaneerimist ei alustata. Nonsense mediated decay toimub tsütoplasmas. Hulgaliselt on tõendeid selle kohta, et pioneeriv ribosoom transleerib mRNAd, kui tema 5' otsaga on assotseerunud cap-siduv kompleks ning polü(A) saba on assotseerunud tuumse PABPIIga. See on tekitanud oletusi, et esimene translatsiooni tsükkel toimub tuumas kui nonsense-mediated decay järelvalve mehanismi üks komponente. 9. Mis on tagasisidestusmehanism? ja too mõni näide. See on mehhanism, mille alusel rakk ,,otsustab", kas ekspresseerida mingit geeni või mitte. Sõltub ümbritsevatest tingimustest nt kui valku palju, siis ei sünteesita, kui vähe, siis sünteesitakse. 10. Too näiteid positiivsest ja negatiivsest geeni ekspressiooni regulatsioonist. Positiivseid: Histoonide atsetüleerimine Aktivaatori seondumine Negatiivseid: Histoonide deatsetüleerimine Repressori seondumine DNA metüleerimine Up- regulation -protsess mis toimub raku sees, mis on signaalipoolt esile kutsutud, resulteerub ühe või rohkema geeni suurenenud ekspressioonis, seega ka valgu tootmises. Down-regulation- protsess, mille tulemusena geen on represseeritud ja toodetakse vähem valku. Up-regulation toimub näiteks kui rakul on mingit tüüpi retseptorist puudus, sellisel juhul sünteesitakse rohkem retseptor-valku ja transporditakse raku membraani ja seega raku homeostaas taastatakse. down-regulation toimub näiteks, kui rakk on neurotransmitteri hormooni või ravimi poolt üle-stimuleeritud pikka aega ning retseptorvalgu ekspressiooni vähendatakse et rakku kaitsta. Nt. seda protsessi illustreerivad insuliini retseptor saidid tüüp2 diabeediga inimese rakkudes.Ülekaalulise inimese veresuhkru kõrgendatud taseme tõttu peavad beeta lehed pankreases vabastama rohkem insuliini kui on normaalne, et tagada piisavalt insuliini ja seeläbi viia veri homeostaatilistele tasemetele tagasi. see pidev vere insuliini tasemete tõus resulteerub katsega suurendada veresuhkurt mis põhjustab retseptor saitide ala- regulatsiooni inimese rakus. See vähendab insuliini retseptorite arvu. Inimene muutub resistentsemaks seetõttu, et hormooni tundlikkust vähendatakse. Nt2. ala-regulatsioon samal juhtumil. Tüüp2 diabeediga inimene saab suurendada oma tundlikkust insuliinile läbi korraliku dieedi ja regulaarse trenniga, seega kaotades kaalu; mõned võivad isegi naaseda oma diabeedi eelsesse olekusse jälgides sellist reziimi. 11. Kuidas väliskeskkonnast tulnud signaal amplifitseeritakse rakus vastusena üles? Väliskeskkonnast tulnud signaal käivitab rakus esialgse vastuse- geeni ekspressiooni. Ekspresseeritud geenide hulgas aga võib olla ensüüme ja transkriptsioonifaktoreid, mis omakorda aktiveerivad teisi geene. Tekib aktivatsiooni- kaskaad , mille tagajärjel hakatakse mingit valku tootma (vastuseks väliskeskkonna signaalile). 12. Miks on vaja rakusisest kompartmentaliseeritust ja signaali ülekannet? Too näiteid, mis rakuga juhtub vastavate protsesside/struktuuride puudumisel või vigasuse korral. Kompartmentaliseeritus on vajalik, et eri protsessid ei hakkaks üksteist segama. Et rakust välja eritamiseks mõeldud ainet ei satuks raku sisse, ning ei looks seal metaboolset vastust. Ilma membraanideta ei saa luua membraanipotentsiaali. 42 13. Aktiivsed filamendid ja mikrotorukesed osalevad eukarüootsete rakkudele iseloomuliku kuju tekitamises ja hoidmises, ometi ei ole need permanentsed struktuurid. Põhjenda, miks dünaamiline tsütoskelett on raku normaalseks funktsioneerimiseks oluline. Oma argumentide tugevdamiseks, too näiteid (kokku 4 näidet)olukordadest, kus on oluline eri tüüpi filamentide stabiilsuse säilitamine ja vastupidi. Tsütoskelett osaleb mitmetes erinevates rakulistes protsessides: diferentseerumine, signaalülekanne, muude ainete transport, raku kinnitumine( adhesioon ), raku liikumine, apoptoos. Häired tsütoskeleti dünaamikas võivad viia raku liigse liikuvuseni(vähk), liiga madala liikuvuseni (inaktiivsed leukotsüüdid-makrofaagid), probleemid raku jagunemisel, rakusiseste signaalide ja muude ainete ringluse häired. Eukarüoodi suhteliselt suures rakus oleks keemiliste reaktsioonide kiirus limiteeritud substraatide difusiooni kiirusega. 14. Organelli membraani koostis on selle organelli ja raku kui terviku normaalseks funktsioneerimiseks elulise tähtsusega. Loetle organelli membraanide üldised omadused ja kirjelda, kuidas need omadused võimaldavad antud organellil täita oma funktsiooni. Sealhulgas too näiteid organelli membraani integraalsetest komponentidest, nende paiknemisest ja kuidas see (asukoht) on seotud antud organelli funktsiooniga. Endosoom- endotsütoosi käigus rakumembraani sissepungumisest tekkinud organell. Membraanis väliskeskkonna molekulide retseptorid ja teised rakumembraani osad. Funktsiooniks ainete toimetamine lüsosoomi lagundamisele. Lüsosoom- loomaraku organell (jääk)ainete lagundamiseks. Membraan väga tihe, ja omab H+ pumpasid, et organelli sise pH saaks olla palju happelisem kui tsütosoolil. Peroksüsoom- fosfolipiidne kaksikkiht , milles on mõned valgulised retseptorid importimaks aineid sisse lagundamisele. Sile ER- fosfolipiidne kaksikkiht, milles on mõned valgulised ensüümid lipiidide tootmiseks ja glükoos-6- fosfatass glükoneogeneesiks Kare Er- membraanile kinnituvad ribosoomid, mis toodavad membraanseid valke. Et toodetav valk saaks läbi membraani, on vaja membraanis ees olevaid abivalke. Golgi kompleks- Vakuool- Membraanis erinevad valgud ainete transpordiks, samuti H+ pumbad madala pH hoidmiseks. Tuum- kaks lipiidset kaksikkihti, välimist jagab ta kareda ERiga, sisemine defineerib tuuma ennast. Mõlemal kihil on erinev valguline koostis. Tuuma poorid on vallgud, mis läbivad mõlemat kihti korraga, ühendades nii tsütosooli otse tuumaga . Sisemembraani siseküljel on lamiinide võrgustik, mis annab tuumale tema kuju, ja ühtlasi seob ka DNA-d Tuumake - membraan puudub Mitokonder- kaks membraani. Välimine 50% lipiidne, 50% valguline. Välimine sisaldab Poriine- kanaleid, mis lubavad ka suurtel(kaal kuni 10'000) molekulidel vabalt liikuda läbi membraani. Sisemine membraan on palju tihedam(ei lase isegi H+ läbi), ja sisaldab u. 20% lipiide , 80% valke. Valgud seal on näiteks ATP-süntetaas, H+ pumbad, lipiidide ja suhkrute lõplikud oksüdeerijad. . Osad vajalikud valgud on sünteeritud mitokondri enda DNA-st. Kloroplastid - kaks membraani. Sisemisele tülakodi-membraanile on kinnitunud kloroplastid. Osad vajalikud valgud on sünteeritud kloroplasti enda DNA-st. 15. Nimeta lisaks fosfolipiididele veel vähemalt 3 membraani komponenti. Glükolipiidid, steroidid ( kolesterool ) (Membraanide assümeetria realiseerub mikrodomäänide moodustumisega- lipiidide parved (lipid rafts)- suure kolesterooli , sfingolipiidide sisaldusega piirkonnad. Lipiidide parved moodustavad jäike struktuure, millele kinnituvad valgud); membraanivalgud (25-75% membraani massist (hästi palju mitokondrites, sest seal on ATP süsteem ja palju pumpasid, hästi vähe müeliinis, sest see on metaboolselt väheaktiivne ning isoleerib närvirakku)). 16. Valgu struktuurne intaktsus on vajalik selle valgu normaalseks funktsioneerimiseks. Too 2 näidet, kuidas valgu struktuuri muutus põhjustab muutuse selle valgu rakulises funktsioonis. Kui hemoglobiinile seondub -subühikule hapnik, toimub konformatsiooni muutus ja seejärel saab hapniku liita ka -subühikule ning seejärel kannab seda kopsudest teistesse kudedesse. 43 Trüpsinogeen on tavaolukorras pankrease ensüümi trüpsiini prekursor, millel on leitud madal aktiivsus ja mille taset mõõdetakse vereproovides. Kui enteropeptidaas seda lõikab, muutub see aktiivseks trüpsiiniks, trüpsiin omakorda hakkab ise trüpsinogeene lõikama. 17. Neuronil on 4 morfoloogiliselt eristatavat piirkonda (dendriidid, rakukeha, akson , sünaps). Missuguste protsesside abil tagatakse valkude õigeaegne olemasolu "õiges piirkonas" ja miks see on vajalik? Valdav osa valke sünteesitakse rakukehas, väike hulk ka dendriidides. Signaaliülekandega määratakse ära, millal millist valku toota ning kuhu see transportida. Selle tulemusena saabki õigesse piirkonda õigeaegselt õige valk. 18. Mis molekul on signaaliks, mis suunab valgu proteosoomsele lagundamisele? Ubikvitiin 19. Fagotsütoos? Pinotsütoos? Endotsütoos? Eksotsütoos? Endotsütoos ­ aubete transport rakku sel teel, et rakumembraan koos ainega sopistub sisse ning moodustab seal membraaniga ümbritsetud vesiikuli Retseptorvahendatud endotsütoos- spetsiifiline · Toimub AP2/klatriin seoseliste vesiiklite kaudu · Alati viiakse transporditav molekul endosoomidesse · Initsieeritakse klatriin-kaetud aladel,kuhu on juba viidud retseptorid Fagotsütoos ­ tahke aine sisse Pinotsütoos ­ vedelik sisse Eksotsütoos ­ põhiline eukarüootse raku sekretsioonimehhanism. Molekulid pakitakse membraaniga ümbritsetud vesiikulitesse, mis sulavad ühte raku välismembraaniga, vabastades oma sisu väliskeskkonda. Kaks teed: Pidev eksotsütoos toimub kõigis eukarüootsetes rakkudes ­ transportvesiikulid kannavad pidevalt uusi membraanikomponente Golgi kompleksist välismembraani. Eksotsütoosi teel toimub pidev plasmamembraani uuendamine. Pidevalt eksotsüteeritakse valke, mida antud rakk ise ei vaja, kuid mida on organismil kui tervikul tarvis. Reguleeeritud eksotsütoosi puhul kogutakse vastavad ained sekretoorsetesse vesiikulitesse, mis ühinevad raku välismembraaniga pärast keskkonnast tulevat kindlat signaali. Reguleeritud eksotsütoos esineb neis rakkudes, mis on spetsialiseerunud oma produkti kiirele ja vastavalt vajadusele sekreteerimisele. Sekretoorsetes vesiikulites ei ole alati valgumolekulid, vaid võivad olla ka madalmolekulaarsed ühendid. Madalmolekulaarsed (mittevalgulised) ühendid satuvad sekretoorsetesse vesiikulitesse tsütoplasmast, mitte Golgi kompleksist. Madalmolekulaarsed ühendid seotakse vesiikulis kindlate kõrgmolekulaarsete ühenditega, et vältida osmootse gradiendi teket. Signaaliks reguleeritud eksotsütoosile on kas mingi keemilise aine (hormoon, glükoos, elektriline signaal ehk aktsiooni potentsiaal). Signaali äratundmise tagajärjel genereeritakse membraani retseptorite poolt üks või mitu rakusisest signaali, millega kaasneb rakusisese Ca2+-ioonide kontsentratsiooni ajutine tõus, see käivitabki reguleeritud eksotsütoosi. 20. Kirjelda tuuma lamiine. Mille poolest erinevad tuuma lamiinid teistest intermediaarsetest filamentidest? Kuidas mõjutab fosforüleermine tuuma lamiinide assotsatsiooni? Lamiinid moodustavad tuumaümbrise sisemisel pinnal filamentse võrgustiku. Tsütoplasmaatilised filamendid ulatuvad NPCde tsütoplasmaatilisse ossa. Ioonid , väiksemad metaboliidid ja globulaarsed valgud suurusega kuni 60kDa võivad vabalt läbi veega- täidetud tuumapoorikompleksi kanali difundeeruda. See kanal käitub nagu ta oleks 0.9 m lai. Tegelikult 44 suured valgud ja RNP kompleksid tuuma ja tuumast välja difundeeruda niisama lihtsalt ei saa. Neid aitavad transportida läbi tuumapooride lahustuvad transportervalgud, mis seovad transporditavaid valke ja ühtlasi interakteeruvad nukleoporiinidega. Koosneb intermediaarsetest filamentidest ja nendega seostunud valkudest, annavad tuumale tugevuse Kui neid fosforüleerida (tsükliin B/Cdk1-ga) tuuma lamiinid depolümeriseeruvad ja B-tüüpi lamiinid jäävad seotuks tuuma ümbriku fragmentidega, A-tüüpi lamiinid on mitoosis lahustunud. 21. Mis on iseloomulik intermediaarsetele filamentidele? Läbimõõt on 10-12 nm, koespetsiifilised, loomarakkudes nt keratiin . Need annavad mehaanilise tugevuse. Asetsevad enamast tsütoplasmas. Peamine struktuur on konserveerunud, igal valgul on globulaarsed tuumad N- ja C-terminuses, mille vahele jääb alfa-helikaalne varras . Peamine ehitus on anti-paralleelne (pole laengut) ja dimeerne. Dimeerid tulevad varda osa interaktsioonidest, mis moodustavad keritud spiraali . Neil pole sidumissaiti NTP-dele. 22. Kuidas mõjutab fosforüleerimine intermediaarsete filamentide struktuurseid omadusi? Toimuvad sarnased asjad nagu tuuma lamiinidega ­ fosforüleerides laguneb osadeks , fosforit eemaldades saab jälle kokku. 23. Millel põhineb mikrotorukeste stabiilse struktuuri säilimine? Treadmill efekti olemus. Stabiilne struktuur koosneb tsentraalsest mikrotuubulite kimbust ripsmetes ja viburites, mis on plasmamembraanist väljaulatuvad osad, mis töötavad rütmiliselt, et liikuda (spermi ujumine , munaraku liikumine). Nad moodustavad sisemise tuuma näiteks ka närvirakkudes. Mikrotuubulid on polaarsed ­ liitumine toimub ka alati + otsa ja tubuliinid tulevad ära ­ otsast. Treadmill ­ ku ­tubuliini kontsentratsioon on kõrgem kui Cc + otsas, aga madalam kui Cc ­otsas, saavad mikrotuubulid kohapeal ,,liikuda" lisades alaühikuid ühte otsa ja dissotsieerides neid teisest otsast. 24. Joonista mikrotorukese struktuur ja tähista valgulised alaühikud. Läbimõõt 25nm, koosneb tubuliinist. Tubuliinide sõlm on MTOC- microtubul organizing center. Moodustab ja -dimeere; duplette, triplette.
25. Loetle keemilisi ühendeid, mis inhibeerivad mikrotorukeste struktuurset dünaamilisust. Too välja ka nende ühendite toimekoht. Mikrotuubulite dünaamikat saab muuta ravimitega. Näiteks taksaanide (C47H51NO14, C43H53NO14) ravimite klass, mida kasutatakse vähi ravimiseks, blokeerib dünaamilist aktiivsust stabiliseerides GDP seondunud tubuliini mikrotuubulis. Seetõttu isegi kui GTP hüdrolüüs jõuab lõppu, ei toimu depolümerisatsiooni ja mikrotuubul ei tõmbu tagasi. Nocodazole ja Colchicine omavad vastupidist efekti blokeerides tubuliini polümerisatsiooni mikrotuubuliteks. 26. Missugustes pankrease B-raku organellis toimub pro-insuliinist insuliini tootmine? Pro-insuliini sünteesitakse ER-is, siis saadetakse Golgoisse. Pro-insuliinist tehakse lõplik insuliin sekretoorses vesiikulis proteaaside abil, pärast Golgi kompleksist lahkumist. 27. Mis on SNARE valkude funktsioon? (SNARE valkude perekond koosneb üle 60 liikmest) Peamine roll on transportvesiiklite fusiooni vahendamine läbi rakumembraani porosoomi või suure vesiikli korral. Jaotatakse kaheks: v-SNARE-d on transpordivesiiklite hulgas ja t-SNARE-d asuvad sihtmärkide membraanides. NSF- heksameerne valk, mis seotuna SNARE-le lõhub viimatinimetatud kompleksi 28. Millised valgud osalevad RNA ekspordis? RNA-l puudub valguline Nuclear Export Signal (NES), seega ta ei saa iseseisvalt tuumast välja. Tuumast väljumiseks peab ta seonduma valguga, mis omab NES-i. Näiteks Ran-GTP ja eksportiin. 45 29. Loetle kõik tuumakeses sünteesitavad RNA tüübid. Missugused ensüümid neid RNAsid transkribeerivad? Tuumakeses sünteesitakse rRNA-sid- RNA pol 1; snRNA- RNA pol 3, osad ka pol 2 poolt 30. Mis vahe on miRNAl ja siRNAl? MikroRNAd (miRNA; 21-22 nukleotiidi) on leitud eukarüootidest ja on aktiivsed RNA interferentsis, kus efektor kompleks miRNA-st ja RNA ensüümidest võib lõhkuda mRNA, millele miRNA on komplementaarne, takistada mRNA transleerimist või kiirendada selle lõhkumist. Small interfering RNAd (siRNA; 20-25 nukleotiidi) saadakse sageli viiruslike RNA-de lõhkumisest. siRNA käitub RNAi-s sarnaselt miRNA-le. 31. Kirjelda hnRNP A1 tuumast ekspordi protsessi. Missugused valgud selles osalevad? Kuidas rakk kontrollib, et see protsess on ühesuunaline? Missugune tsütoplasmaatiline valk on selle protsessi toimumiseks oluline ja miks? Heterogeensete ribonukleovalkpartiklite (hnRNP), mis sisaldavad heterogeenset tuuma RNAd (hnRNA), mazhoorsed valgulised alaühikud on pre-mRNA-d, mis ei ole rakus vaba nukleiinhappena, vaid on kaetud tuuma valkudega. hnRNP-d kasutatakse tähistamaks pre-mRNA ja teiste, erineva suurusega tuuma RNAde komplekse. hnRNP valgud on väga heterogeensed suurusega 34 kuni 120 kD. Nagu TFid, on ka enamus hnRNP valke modulaarse struktuuriga. Neil on üks või enam RNAgaseostumise domeeni ning üks valkudega interakteerumise domeen . Tänaseks on teada palju erinevaid RNAga-seostumise motiive. pre-mRNAde kompleks hnRNP valkudega takistab lühikeste sekundaarstruktuursete alade moodustumist, mis teeksid pre- RNA teistele RNAdele või valkudele äratundmismärklauaks. Erinevad hnRNP valgud (A1, C, D) tunnevad ära erinevaid järjestusi, näit. hnRNP valgud A1, C, ja D tunnevad ära RNA pürimidiinirikkaid alasid. Lõplikult protsessitud mRNA-5' ots ning hnRNP valk-kompleks (mRNP) assotseerub "cap"-siduva kompleksiga (CBC), mis läbib esmalt NPC. Kui mRNPsid transporditakse läbi NPC, siis tuumas lokaliseeruvad hnRNPd eemaldatakse; need valgud, milledel pole NESi (nuclear export signal, tuumaekspordi signaali), hoiavad mRNAd tuumas. NES-sisaldavad hnRNPd, nagu hnRNP A1, transporditakse läbi NPC ning nad kannavad assotseeritud RNA tsütoplasmasse. Tsütoplasmaatiline RanGAP stimuleerib Rani GTPd hüdrolüüsima. Shuttle 'vad hnRNP valgud dissotseeruvad retseptorvalkudelt (leutsiin-rikaste NESide puhul eksportiinilt) ning nad transporditakse tagasi tuuma. mRNA seondub nüüd tsütosoolis asuvate mRNP valkudega, nende hulgas polü(A)ga-seonduva valgu PABPga, mis interakteerub mRNA 3' otsaga. 32. Mis on rakulise diferentseerumise molekulaarseks aluseks? Ulatuslik rakkude eristumine sõltub geeni ekspressiooni kvantitatiivsetest ja kvalitatiivsetest muutustest, mida reguleeritakse suures osas transkriptsiooni tasemel ­ mõnes organism muutub transkriptsioon iga vähimagi muutuse peale. Seda tehakse näiteks erinevate signaaliradadega (põhilised on Notch, Wnt), mis määravad transkriptsiooni- faktorite tootmise. Differentseerumine toimub raku sugupuu alusel. Transkriptsiooni faktorid koordineerivad diferentseerumist aktiveerides või represseerides transkriptsiooni. Rakuvälised kasvufaktorid tsütokiinid reguleerivad diferentseerumist andes signaalirajale signaali. Lihasraku moodustamises on väga oluline roll HDAC-itel (inhibeerib) ja HAT-idel (aktiveerib). Kui HDAC on fosforüleeritud, asetseb see tsütoplasmas ja ei saa inhibeerida. Kui DNA-d metüleerida, siis ei saa sealt ka transkriptsiooni teostada. Põhimehhanism ­ ühe raku poolt toodetud ligand seondub teise raku ekstratsellulaarses regioonis asuva retseptori külge, muutes retseptori struktuuri. Tsütoplasmaatilise domääni kuju muutub ja retseptor omandab ensümaatilise aktiivsuse ja katalüüsib reaktsioone, mis fosforüleerivad teisi valke, aktiveerides neid. Fosforüleerimisreaktsioonide järgnevus aktiveerib transkriptsioonifaktori või tsütoskeleti valgu, mis viib raku diferentseerumiseni. 33. Kas diferentseerunud rakk võib valida mõne muu arengusuuna? Üldjuhul seda enamasti ei toimu, aga vahel võib. Varem arvati, et raku diferentseerumine on pöördumatu protsess. Katseliselt näidati esmalt, et hiire luuüdirakkudest võivad areneda skeletilihased. Ajaliselt võttis see nädalaid, seega võib eeldada, et metaplaasia on mitmeastmeline protsess. Näiteks luuüdi päritoluga rakust on siiani saadud vöötlihas, endoteeli, südamelihas, purkinje neuron (suurimad neuronid inimese ajus=, hepatotsüüte. Vöötlihasest aga luuüdi. Närvkoest vererakke, vöötlihasrakke, lootekudesid. Vähirakk võib diferentseerunud rakust tagasi vähitüvirakuks muutuda. 46 34. Miks erinevate regulaatorvalkude ekspressioon viib erinevate rakutüüpide tekkele? Sellepärast, et erinevad regulaatorvalgud on omased erinevatele rakkudele. Regulaatorvalgud on ka transkriptsioonifaktorid ning need hakkavad läbi viima edasist geeniekspressiooni. Aktivaatorid ja repressorid seonduvad spetsiifilistesse kohtadesse DNA-l ja reguleeruvad sarnaste valku kodeerivate geenide ekspressioni. Nad toimivad kas koos teise valkudega muutes kromatiini struktuuri ja mõjutades generaalsete transkriptsioonifaktorite seondumist või toimivad ise transkriptsioonifaktoritena läbi mediaatori. 35. Miks on geeni ekspressiooni arenguline regulatsioon oluline? Too üks näide, kuidas see toimub (väliskeskkonnast tuumani). Hulkraksetel peab arenevas lootes olemasolevast mitmesajast erinevast rakutüübist igat tüüpi loodama õigel hulgal õiges ajaaknas/ hetkes ja asukohas nii, et see integreeruks ümbritsevate rakkude ja kudedega. Eristunud/diferentseerunud rakkudel on tihti oma kindel/äratuntav morfoloogia ja neis ekspresseeruvad valgud on spetsifitseerunud teatud kindlate bioloogiliste funktsioonide täitmisele, mis on siis omased vaid sellele rakutüübile. Loomade ja taimede arengus toimuv ulatuslik rakkude eristumine sõltub geeni ekspressiooni kvantitatiivsetest ja kvalitatiivsetest muutustest, mida reguleeritakse suures osas transkriptsiooni tasemel. Sellise rajaga tekivad näiteks vere-, epiteel - ja soolerakud. 36. Loetle vähemalt 4 erinevat rakupinna retseptori perekonda, mis on olulised kõigi hulkraksete varaseks arenguks, ja kirjelda nendega seotud signaaliülekande raja komponente? Wnt rada ­ Wnt, retseptor -Frizzled 1 -10 (vere, epiteeli ja soole rakud) SHH rada ­ SHH, IHH, DHH, retseptor - patched1, 2 (vere, närvi ja sugurakud ) Notch rada ­ Delta , Jagged, Serrate, retseptor - Notch 1,2,3 (vere, närvi ja sugurakud) RTK ­ EGF, retseptor ­ EGFR; FGF ­ retseptor FGFR, NTs retseptor ­TRKs Mehhanismid allpool. 37. Tuues näiteid, kirjelda, kuidas polüpeptiidsed hormoonid (k.a. neurotrofiinid) võivad reguleerida geeni ekspressiooni. Nerve growth factor (NGF) kuulub neurotrofiinide perekonda, mille liikmed osalevad rakkude elus hoidmises ja jagunemises. NGF on oluline ka neuronite regeneratsioonil ning on potentsiaalseks Alzheimer'i tõve ravimiks. NGF arvatakse olevat ka teisi füsioloogilisi funktsioone, eeskätt immuunsüsteemis. NGFil on kaks retseptorit TrkA ja p75(NTR). NGFi signaali edastav retseptor on türosiinkinaasne TrkA ja mõnedes rakkudes indutseerib p75 programeeritud rakusurma (apoptoosi). NGFi kõrge afiinsusega sidumiseks on vaja mõlemat retseptorit.Sidumise tulemusena, retseptori türosiinkinaas aktiveerub ja indutseerib signaalsete kaskaadide tekke. Üheks signaali rajaks on, phospholipase C aktiveerumine, kusjuures vabaneb DAG ja IP3ning aktiveeritakse assotseeritud rajad, nagu näiteks protein kinase C rada. Teiseks NGF-aktiveeritud rajaks on rasseoseline MAP kinaaside kaskaad. See rada aktiveerib TFi AP-1. Lisaks sellele TFile i on NGFi radade märklaudadeks ka Egr ja CREB. Egr perekonnaliikmed nagu ka Mek/Erk rada osalevad NGFseoselises neuriitide väljakasvus. CREB perekonnaliikmed on olulised sünpaatiliste neuronite elus hoidmises. Maksarakkudes , hormoon- ajendatud fosfolipaas C aktivatsioon reguleerib glükogeeni lagundamist ning sünteesi inositol-lipiidi kaheharulist signaalrada pidi. Fosfolipaas C genereerib kaht second messenger'i, diatsüülglütserooli (DAG) ning inositol-1,4,5-tri- fosfaat 'i (IP3). DAG aktiveerib proteiin kinaas C, mis fosforüülib glükogeeni süntetaasi andes fosforüülitud inaktiivse vormi, seega inhibeerides glükogeeni sünteesi. IP3 põhjustab tsütosoolsete Ca2+ ioonide tõusu, mis aktiveerib glükogeen fosforülaas kinaasi, just nagu lihasrakkudeski, alandades glükogeeni. Antud juhul on erinevate rakusiseste signaal-transduction radade aktiveerijaks üks ja sama signaal. Maksarakkudes epinefriini poolt ajendatud glükogenolüüsi suurenemine stressiperioodil viib veresuhkru taseme kõrgenemiseni. Argise elurütmi ajal on veresuhkru tase insuliini ning glukagooni dünaamilise kontrolli all. 47 38. TGFb/BMP signaalirada, Notchi signaalirada, WNT signaalirada, türosiinkinaaside signaalirada, SHH signaalirada. Põhilised aktiivsusekandjad ­ väliskeskkonnast tuuma ja märklaud geenid. TGFb/BMP signaalirada
Notchi signaalirada
türosiinkinaaside signaalirada 48
WNT signaalirada SHH signaalirada
peale SHH veel IHH ja DHH
39. Kirjelda neurogeneesi ja müogeneesi protsesside molekulaarset sarnasust bHLHde võrgustiku (signaalikaskaadide) näitel. Neurogeneesi regulaatorite sarnasus müogeensete bHLH valkudega · Selgroogstetel on kirjeldatud valkude olemasolu, mis on Drosophila bHLH valkude Achaete ja Scute sugulased. Nendeks on neurogeniinid ja NeuroDd. neurogeniin ekspresseerub väga varases arengus, on vajalik NeuroD indukstiooniks ning funktsioneerib kui neuraalsete prekursorrakkude determinatsiooni faktor. · neurogeniin-1 deletsiooni kandvatel hiirtel puuduvad trigemiinsed ganglionid, muud närvisüsteemi struktuurid on aga normaalsed, mis viitab , et neurogeniin-1 ja neurogeniin-2 on vastastikku funktsionaalselt kõdunud. Imetajate skeletilihaste müogenees jaguneb kolmeks põhistaadiumiks: · lihasrakkude prekursorite (eelasrakkude) e. müoblastide determinatsioon · müoblastide aktiivne jagunemine ( proliferatsioon ) ja mõnigail juhtudel ka migratsioon · ja sellele järgnev müoblastide eristumine (diferentseerumine) küpseteks lihasrakkudeks. 49
40. Mis vahe on totipotentsel, pluripotentsel ja multipotentsel rakul? Totipotentne ­võib olla eellaseks kõikidele rakkudele. Viljastatud munarakk on totipotentne, st ta sisaldab geneetilist infot, et areneda igaks keharakuks ja ka platsentaks ning embrüovälisteks rakkudeks, seega arenema terviklikuks inimorganismiks. Inimese arengu 4.-5. päevaks on see totipotentne rakk 3-4 jagunemise tulemusena andnud järglastena hulgaliselt omasuguseid. Pluripotentne ­ on arenenud totipotentsest rakust, võib olla eellaseks peaaegu kõikidele rakkudele, määravaks on looteleht . (Embrüonaalne tüvirakk (ES)): Umbes 5ndal arengupäeval hakkavad need totipotentsed rakud diferensteeruma (e. spetsialiseeruma) ja moodustavad seest tühja rakukogumi, mida nim. blastotsüstiks. Blastotsüsti välimine rakukiht areneb platsentaks ja sisemisest rakukihist arenevad edasise arengu käigu kõik keha rakud. Sisemine rakukiht on pluripotentsete rakkude kogum, st et neil rakkudel on võime areneda igaks keha rakutüübiks va platsenta ja looteväliste kudede rakud ega seega ole võimelised arenema terviklikuks organismiks. Pluripotentseid rakke saab eraldada blastostüstist ja loote sugurakkudest Multipotentne ­ võib areneda mitmeks rakutüübiks, tingimuseks on sama kude (sama rakutüüp). Pluripotentsed rakud spetsialiseeruvad/ diferentseeruvad edasi multipotentseteks rakkudeks, mida tihti nim. ka somaatilisteks tüvirakkudeks. Multipotentsiaalsed tüvirakud on eritüübilised tüvirakud, mis on võimelised arenema vaid kindlateks kudedeks : veretüvirakud vereks, nahatüvirakud nahaks jne. Multipotentsed rakud on olemas nii varases arengus ka täiskasvanud organismis. Senini on suudetud identifitseerida umbes 60 erinevat tüvirakku, st ei ole teada, kas kõigi erinevate rakutüüpide jaoks on oma tüvirakud. 41. Loetle tüviraku omadusi. Tüvirakk on selline jagunemisvõimeline rakk, mille järglasteks võivad olla kas teda ennast asendavad tüvirakud (taastootmine) või diferentseeruvad rakud (naha tüvirakud jms) 42. Mis on somaatilised ja mis on embrüonaalsed tüvirakud? Somaatilised on multipotentsed rakud (keha kudedest) ja embrüonaalsed on pluripotentsed rakud (embrüotest). 43. Millised on tüvirakkudega seotud rakuteraapia peamised probleemid (takistused)? Tüvirakkude viimisel inimkehasse võib alguses saada küllalt häid tulemusi, aga paari kuu mööduddes on ~90% sisse viidud rakkudest surnud. Samuti tihti ei hakka tüvirakud täitma rolli, mida me soovime , et nad täidaks, näiteks ei taasta funktsioneerivat närvkudet. Lisaks suremusele kipuvad sisse toodud tüvirakud ka rändama minema, võib tekkida vähk. 44. Missugused on inimteraapias kasutatavad potentsiaalsed tüvirakkude allikad? 1) võtta inimeselt endalt tüvirakke, näiteks luuüdist, ning anda neid talle mujale tagasi. 2) Võtta lootelt. 3) võtta viljastatud munaraku blastotsüstist. 4) Võtta kloneeritud munaraku blastotsüstist 5) võtta lähedaselt sugulaselt? * loomadelt, hiired, sead ­ aga see pole siis tüviraku tasemel, see on see, et võtad hiirelt tüviraku (või võtad hoopis koe), kasvatad neeru ning siis siirdad inimesele ­ tegelikult siiski teed temast veidi GMO, lased tal enda sees kasvatada organi, opereerid välja ja siirdad inimesele (loom võib surra!) 45. Misugused onkogeeni kromosomaalse translokatsiooni molekulaarsed tagajärjed? Onkogeen - Valku kodeeriv geen, mille regulatsiooni vead tekitavad vähi. Kromosomaalse translokatsiooni tagajärjel suureneb geeni ekspressioon valel ajal ja vales rakutüübis; võivad tekkida hübriidsed valgud, mis on kogu aeg aktiivsed. 46. Selgita vähi tekkes tüviraku- kontseptsiooni . Mutatsioonid rakkudes on küllalt tavalised, aga igast muteerunud rakust ei tule veel vähk. Vähi risk on palju suurem, kui muteerub tüvirakk, kuna tüvirakk on oma olemuselt paljunemisvõimeline, seega kui tema puhul on muteeritud nii onkogeen, tuumporsupressor (apoptoosi rada ei käivitu) kui ka geen, mis koordineerib liikumist, saab temast vähirakk, mis on samas väga jagunemisvõimeline. Vähi tüvirakk võib tekkida samas ka juba osaliselt diferentseerunud rakust. Täiskasvanutel on haruldased lihas- ja närvikoekasvajad, sest seal enamasti lõplikult diferentseerunud rakud. 47. Mis on proto -onkogeeni funktsioon rakus ja kuidas selle muutumine onkogeeniks mõjub raku jagunemisele? eluspüsimisele? diferentseerumisele? surmale? genoomile? Proto- Onkogeenid kodeerivad valke, mis reguleerivad raku kasvu ja diferentseerumist. Onkogeeniks muutudes hakkab rakk rohkem paljunema, vältima surma ja diferentseerumist, raku genoom võib hakata suure kiirusega muteeruma. 50 48. Mis on genoom? proteoom? transkriptoom? reguloom ? tselloom (cellome)? metaboloom ? interaktoom? metüloom? morfoom? nukleoom? operoom? ORFeoom? translatoom? transportoom? unknome? Selle küsimuse vastuse leiad http://www.geocities.com/pribond/bioinfo/glossary/omes.ht m Genoom on ühes liigiomases kromosoomikomplektis (haploidne kromosoomistik) sisalduv geneetiline materjal. Proteoom on organismis sisalduvate valkude kogum, mis on erinev organismi erinevates rakkudes ja muutub pidevalt Transkriptoom kõikide mRNA molekulide või transkriptide kogum, mis on olemas ühes rakus või rakkude kogumis. Seda võib kasutada kõikide transkriptide kohta organismis või ka kindlas rakutüübis. Reguloom regulatoorsete komponentide (geenid, mRNAd, valgud, metaboliidid) kogum rakus. See hõlmab ka regulatoorseid efekte nende komponentide vahel ja nende sõltuvust muutujatest. Tselloom rakkude ja nende interaktsioonide bioloogiliste olemuste ning bioloogiliste rakkude terviklikkuse kogum, mille põhiliseks moodustajaks on valgud. Metaboloom on inimese ainevahetusprotsessi ehk metabolismi väikesemolekuliliste vahe- või lõppsaaduste ­ metaboliitide - kogum. Metaboliitide hulka kuuluvad nt aminohapped, suhkrud, rasvad ja kolesterool. Interaktoom molekulaarsete vastasmõjude kogum, mida enamasti näidatakse graafikuga. Metüloom metüleeritud DNA saitide ja genoomi mustrite kogum. Morfoom morfoloogiliste tunnuste või liikide kaart ja klassifikatsioon. Nukleoom kõikide nukleiinhapete kogum rakus Operoom bakteris sisalduvate operonide kogum ORFeoom is the totality of open reading frames(ORF) in biology Translatoom kõikide valkude või nende järjestuste kogum, mis on ühes rakus või rakkude kogumis Transportoom rakus sisalduvate transportvalkude ja süsteemide kogum (peamiselt membraanikanalid) Unknome suur geenide hulk, mille kohta pole hetkel funktsionaalset informatsiooni
RAKKUDE MANIPULEERIMINE JA KASUTAMINE EKSPERIMENTAALSES TÖÖS 1. Rakukultuuride eelised ja puudused võrreldes in vivo mudelitega. Eelised: · Homogeensed võrreldes koerakkudega · Eksperimenditingimused on selgelt defineeritud · Rakukultuuris saab isoleerida huvipakkuva raku ja sellest kasvatada geneetiliselt homogeense koloonia- rakkude kloonimine · Geneetiliselt homogeenne rakutüvi - kloon Puudused: ei saa jälgida organismi kui tervikut . Eritüübilised rakud on erinevad: · väljanägemiselt ja suuruselt · kaalult · laengult · tiheduselt · antigeensuselt jne. Osa erinevusi on võimalik kasutada teatud tüüpi rakkude eraldamiseks teistest rakkudest. Rakkude eraldamise enamlevinud meetodid: · tsentrifuugimine ; tsentrifuugimine gradiendis · afiinsusel põhinevad meetodid; magnet · FACS 2. Mikroorganismide kasvatamine kultuuris. · Escherichea coli, Saccaromyces cerevisiae · Kiire kasv ja väga lihtne kasvukeskkond · süsiniku allikas: glükoos või glütserool · lämmastiku allikas: NH4+ · soolad : Na+, K+, Mg2+, Ca2+, SO42 -, Cl-, PO43- 51
3. Mikroorganismide kasvukeskkond kultuuris. · Rikkamas söötmes ka osaliselt hüdrolüüsitud loom- või taimkudet, pärmiekstrakti. · Pooltahke keskkond - agar vs. suspensioon . Tingimused: · Optimaalne temperatuur · Niiskus · Õige pH · Lahustunud toitained · Hapniku olemasolu/puudumine · Fotosünteesivatel valgus · Vähe jääkaineid 4. Auksotrioofid, kuidas neid selekteerida? Replikajäljendite meetod. Auksotroofid - mikroorganismide tüvi, mis kasvavad mingi spetsiifilise toitaine olemasolu korral, selekteerida saab neid tõstes teise toitainesse replikajäljendite meetodit kasutades. Replikate/jäljendite tegemist kasutatakse muteerunud tüvede tuvastamiseks (tõstetakse templiga). Selliste auksotroofsete tüvede hoidmiseks tuleb nad pidada selektsiooni all! Minimalsele söötmele tuleb lisada minimeerivat ainet. E.Colil tekib mutatsioon106 -107 aluspaari kohta 5. Loomsed rakukultuurid, nende erinevus mikroorganismide kultuurist. · Loomsed rakud vajavad rikastatud söödet. · AA: his, leu, ile, lys, met, phe, thr, trp, val + cys, glu, tyr · Seerum on vere mitterakuline osa. · Vitamiinid, kasvufaktorid (nt NGF, EGF, IL) insuliini, transferriini · Tavaliselt kasvavad tasapinnal , mis on kaetud spetsiaalse maatriksiga. Selline maatriks on kinnituskohaks ECMile-hüaluroonhape, kollageen ja teised ECM valgud · antibiootikumid · Konfluentne (samasuunaline, koos kulgev) kultuur · Osad kasvavad ka suspensioonis ja 3D-geelis Rakkude kasvatamiseks on vaja: · Tagada kontrollitud keskkond (inkubaatorkapid) · Tagada steriilsus (vertikaalne laminaarne õhuvool) · Tagada töötaja turvalisus patogeensete mikroorganismide või rakukultuuride korral (horisontaalne õhukardin) · Steriilsed töövahendid 6. Defineeri primaarne rakukultuur ja rakuliin. · Primaarsed rakukultuurid on saadud loomsetest kudedest · Suurem osa loomsest koest eraldatud rakke jaguneb piiratud kordi piiratud aja jooksul (keskmiselt 50 jagunemist), pärast seda rakud surevad · Nn. "transformeeritud rakud" jagunevad lõpmatult ja selliseid ühest rakust alguse saanud immortaliseeritud kloone nimetatakse rakuliiniks · Rakuliinid sageli aneuploidsed- kromosoomide arv erinev normaalsest · Rakuliinid pole tavaliselt differentsieerunud, osadel siiski algse koe funktsioonid 52
Jagunemised päevad 7. Mis on rakkude transformatsioon, transformatsiooni erinevad viisid? · Nn. "transformeeritud rakud" jagunevad lõpmatult ja selliseid ühest rakust alguse saanud immortaliseeritud kloone nimetatakse rakuliiniks · Rakkude transformatsioon võib tekkida iseeneslikult mutatsioonide tagajärjel, selliseid rakke saab eraldada ka nt kasvajakoest või tekitada nt. telomeraasi kodeeriva geeni sisseviimisega rakku · Erinevad rakutüübid transformeeruvad erineva sagedusega, väga suured on ka liikidevahelised erinevused Mõned kultuuri viidud rakud differentsieeruvad ja võivad moodustada koesarnaseid struktuure
8. Rakkude fusioonid, milleks kasutatakse. · Rakud võivad teatud tingimustel liituda- rakkude fusioon . Kui liituvad kaks erinevat rakku, tekib hübriidrakk, mida nimetatakse heterokarüooniks (heterokaryon). Selliste rakkude tuumad ühinevad rakkude jagunemisel. · Fusioonid tekivad iseeneslikult väga harva, selle nähtuse suurendamiseks: PEG, elektriimpulss · Eri liikide rakkude fusioonid- geenide kaardistamine · Monokloonsete antikehade saamiseks tekitatakse rakkude fusiooni teel hübriidrakud (hübridoomid) · Monokloonne ­ üks primaarstruktuur IG nt hiired · Polükloonne ­ primaarjärjestus erinev (ükskõik, mis loom nt küülik/lammas) 53 9. Mis on hübridoom, millised on selektsiooni tingimused? Hübridoom on hübriidrakk, mis on saadud rakkude fusioonist (monokloonsete antikehade saamiseks)
10. Viiruste kasutamine rakubioloogias . · Viirus on väike parasiitorganism, kes ei reprodutseeru ise, vaid kasutab selleks peremees -rakku. Bakteriofaag/ faag . Looma- ja taimeviirused . · Liigispetsiifilisus · Viiruste pärilikkuse materjaliks on kas DNA või RNA, mis võib olla nii ühe kui ka kaheahelaline. · Virion on viiruspartikkel tervikuna, st. et ta koosneb nukleiinhappest ja välimisest valgukoorest ja on võimeline infitseerima rakku. (Lihtsaimad viirused kodeerivad 4 valku, keerulisemad umbes 200.) · Viraalne transduktsioon- võimaldab viia peremeesrakku uuritavaid geene · Viiruseid kasutatakse transkriptsiooni, rekombinatsiooni uurimiseks · Retroviirused - onkogeenide uurimiseks 11. Läbivoolu tsütomeetria ja FACS, põhimõte ja kasutusvaldkonnad. Läbivoolu tsütomeetria - Flow cytometry; See identifitseerib rakud, mõõtes valgust, mida need hajutavad ja fluoressentsi, mida need eritavad, kui nad läbivad laseri kiirt . Sellega saab sorteerida rakke välja kindlast segu tüübist. FACS - Fluorescence activated cell sorting= rakkude sorteerimine; Seade, mis põhineb läbivoolu tsütomeetrial ja suudab leida ühe raku tuhandete teiste seast. Näiteks kui antikeha spetsiifilisele kindlale rakupinna molekulile ühendatakse fluorestsents värv, siis iga rakk, mis seda molekuli kannab, seondub antikehale ja eraldatakse teistest rakkudest, kui see fluorestseerub. Peale sorteerimist saab eraldatud rakku kasvatada kultuuris. FACS-i kasutatakse tavaliselt, et puhastada erinevat tüüpi valgeid vererakke, millest igaüks kannab oma pinnal üht või enamat eristuvad valku ja seetõttu seob monoklonaalseid antikehasid, mis on sellele spetsiifiliselt. Ainult T rakud immuunnsüsteemis omavad nii CD3 kui ka Thyl2 valke. Nende olemasolu muudab T-rakud teistest vererakkudest või põrnarakkudest kergesti eristatavaks. Varieerides monoklonaalsete antikehade kasutamist rakkude eristamisel, kaetakse väikesed magnetilised tilgad 54 monoklonaalsete antikehadega, mis on spetsiifilised pinnavalkudele nagu CD3 ja Thyl 2. Nii kinnituvad sinna ainult need rakud, millel on mõlemad valgud olemas ja neid saab taastada ettevalmistamisest adhesiooniga väikesele magnetile katseklaasi küljel. Veel saab läbivoolu tsütomeetriaga mõõta raku DNA ja RNA sisu ja määratleda selle üldist kuju ja suurust. FACS-iga saab samaaegselt teha raku suuruse (hajuv valgus) ja DNA koguse (fluorestsentsi eraldamine DNA- siduva värvi korral) mõõtmisi. Analüüsi käik ­ kontsentreeritud märgistatud rakkude lahus segatakse puhvriga nii, et rakud läbiksid laserkiirt ükshaaval. Mõõdetakse nii fluorestseeruva valguse eraldamist kui valguse hajutamist (suurus ja kuju). Lahus viiakse läbi tila , kus moodustavad pisikesed tilgad, kus on enamasti ainult 1 rakk. Moodustumise ajal antakse igale tilgale negatiivne elektriline laeng, mis on võrdeline selle eraldatud fluorestsentsiga. Ilma laenguta tilgad ja erinevate laengutega tilgad eraldatakse elektrivälja abil ja kogutakse. (ühe tilga sorteerimine toimub millisekunditega). Tunnis läbib masinat kuni 10 miljonit rakku, mistõttu saabki erinevate omadustega rakke eraldada ja siis kasvatada.