Loomarakkudele mõeldud ekspressioonivektor (plasmiid) sisaldab: 1.komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (prokarüootset replikatsiooni alguspunkti, antibiootikumi resistentsusgeeni); 2.kloneerimisala (MCS) erinevate restriktaaside lõikekohad; 3.uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul); 4.reportergeeni (GFP, lutsiferaas, lacZ jt.) või märgise (tag; FLAG, myc, V5, GFP) järjestust. 5.eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust (SV40); 6.selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti. Praktiline töö III Immuunotsütokeemia 1. Mille poolest on erinevad monoklonaalsed ja polüklonaalsed antikehad? Mka reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis, on väga spetsiifilised 2. Mis on epitoop? Too välja kaks erinevat tüüpi epitoopide rühma ja kirjelda mille poolest need erinevad. Antigeeni osa, mis seostub spetsiifiliselt antikeha retseptorile.
Peamiseks erinevuseks on vastava taksoni monofüleetilisuse nõude puudumine, välja arvatud tüvede puhul. Viiruste taksonitele omistatakse ladinakeelsed nimetused, kusjuures seltside nimed saavad lõpu -virales, sugukondade nimed lõpu -viridae, ja perekonnad lõpu -virus. Liikide puhul ei rakendata ladinakeelset binaarset nomenklatuuri (liigi nime, mis koosneb perekonna nimest ja liigiepiteedist), nimedes võib kasutada ka kreeka tähti ja numbreid (nt faag, SV40). Viiruste ehitus Viiruste osakesed - virionid - omavad hoolimata oma erinevast päritolust mõningast ehituslikku sarnasust. Enamasti sisaldab virion valkudest koosnevas kestas (nukleokapsiidis) ühe või mitu molekuli nukleiinhapet. Nukleokapsiid võinb koosneda ühesugustest valgu molekulidest, või olla üsna keerulise ehitusega. Mõnikord ümbritseb nukleokapsiidi veel peremeesraku rakumembraanist lipiidkest. Mõnede viiruste pinnavalkude või
lange kokku mujal bioloogias kasutatavatega · Viiruste taksonitele omistatakse ladinakeelsed nimetused, kusjuures seltside nimed saavad lõpu -virales, sugukondade nimed lõpu -viridae, ja perekonnad lõpu virus · Liikide puhul ei rakendata ladinakeelset binaarset nomenklatuuri (liigi nime, mis koosneb perekonnanimest ja liigiepiteedist) ning nimedes võib kasutada ka kreeka tähti ja numbreid (nt faag, SV40) · Et paljud viiruste osad meenutavad elusorganismide rakkude osi, on levinud oletus, et viirused on tekkinud mingi DNA või RNA "iseseisvumisel" ja arenenud järgneval evolutsioonil peremeesrakust sõltumatult, kasutades ära peremeesraku "molekulaarset masinavärki". · Tõendid nende teooriate kinnituseks seni puuduvad. Viiruste levik: · Viirused on looduses laialt levinud ja nad on äärmiselt olulised ökosüsteemi regulaatorid:
DNA (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) G0= +25 + (31) = 6 kJ/mol Rakkudes toimub lisaks pürofosfaadi hüdrolüüs: PPi + H2O = 2Pi (G0= 31 kJ/mol). Summaarne G0=6 + (31) = 37 kJ/mol DNA molekuli suurus varieerub erinevates organismides Lihtsamates organismides on kogu genoomne DNA üks lineaarne või tsirkulaarne molekul Eukarüootsetel organismidel on mitu kromosoomi DNA moodustab kogu raku massist ligikaudu 1% Organism DNA (bp kokku) konformatsioon Viirused SV40 5,100 tsirkulaarne Adenoviirus 36,000 lineaarne faag 48,600 tsirkulaarne Bakterid E. coli 4,700,000 tsirkulaarne Eukarüoodid S. Cerevisiae 13,500,500 lineaarsed D
muude meetoditega hästi ei taha transfekteeruda. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: • komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (origini- prokarüootset replikatsiooni alguspunkt, antibiootikumi resistentsusgeeni) • kloneerimisala (MCS) – sisaldab paljude erinevate restriktaaside lõikekohti • uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) • eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust(SV40) Sageli ka: • reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus • märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP) • selektsioonimarkeri ekspressioonikasset Praktikumis on kasutusel pEGFP (enhanced green flourescent protein) ekspressioonivektor, mis: • võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes • võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud
Sugukonna tasandini määramisel kasutatakse laialdaselt Baltimore'i klassifikatsiooni. Viiruste taksonitele omistatakse ladinakeelsed nimetused, kusjuures seltside nimed saavad lõpu - virales, sugukondade nimed lõpu -viridae, ja perekonnad lõpu -virus. Liikide puhul ei rakendata ladinakeelset binaarset nomenklatuuri (liigi nime, mis koosneb perekonna nimest ja liigiepiteedist), nimedes võib kasutada ka kreeka tähti ja numbreid (nt faag, SV40). Viiruste ehitus: Viiruste osakesed - virionid - omavad hoolimata oma erinevast päritolust mõningast ehituslikku sarnasust. Enamasti sisaldab virion valkudest koosnevas kestas (nukleokapsiidis) ühe või mitu molekuli nukleiinhapet. Nukleokapsiid võib koosneda ühesugustest valgu molekulidest, või olla üsna keerulise ehitusega. Mõnikord ümbritseb nukleokapsiidi veel peremeesraku rakumembraanist lipiidkest. Mõnede viiruste pinnavalkude
· Viiruste taksonitele omistatakse ladinakeelsed nimetused, kusjuures seltside nimed saavad lõpu -virales, sugukondade nimed lõpu -viridae, ja perekonnad lõpu virus · Liikide puhul ei rakendata ladinakeelset binaarset nomenklatuuri (liigi nime, mis koosneb perekonnanimest ja liigiepiteedist) ning nimedes võib kasutada ka kreeka tähti ja numbreid (nt faag, SV40) · Et paljud viiruste osad meenutavad elusorganismide rakkude osi, on levinud oletus, et viirused on tekkinud mingi DNA või RNA "iseseisvumisel" ja arenenud järgneval evolutsioonil peremeesrakust sõltumatult, kasutades ära peremeesraku "molekulaarset masinavärki". · Tõendid nende teooriate kinnituseks seni puuduvad. Viiruste levik: · Viirused on looduses laialt levinud ja nad on äärmiselt olulised ökosüsteemi regulaatorid:
eukarüootset promootorit ja polüadenüleerimisjärjestust selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti 122. 123. pEGFP : võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus replitseerub episomaalsena rakuliinides, kus on ekspresseeritud SV40 viiruse large T-antigen (Cos1, Cos7), mis tähendab tugevamat ekspressiooni 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. Esimene päev – rakkude transfekteerimine PEI-ga 132. Esmalt tuleb vaadelda rakkud mikroskoobis ja hinnata nende seisukorra. Rakud ei ole saastanud ega surnud. Rakkude tihedus on umbes 95%. 1. Transfektsioonisegu ettevalmistamine. Võta 3 1,5 ml epsi. Esimeses segada 25 μl DMEMi ja 2 μl pEGFPd.
aatomist, mida kutsutakse ka kiraalseks süsiniku aatomiks. Looduses on kõik suhkrud D-isomeerid ja kõik aminohapped L-isomeerid. D-L süsteemi aluseks on glütseeraldehüüdi paigutus (2C OH paremal/vasakul). Ravimitööstus peab õigete ravimite tootmiseks arvestama ka kiraalsusi ja kasutama looduslikke, sest muidu ravim ei toimi. 5. Eukarüootne replikatsioon. Mehanism ja läbiviivad ensüümid. Replikatsiooni mehhanism pärineb peamiselt viiruse SV40 replikatsiooni uurimisest. Replikatsioon algab järjestusest, mida kutsutakse origin'iks, igas DNA-s on neid palju. DNA polümeraasid ei saa DNA-ahelat lahti keerata. Replikatsioonis üks ahel pikeneb järjest (juhtiv
HPV-infitseeritud rakke. On valmimas uus vaktsiin, mis sisaldab kapsiidivalku viiruslaadsetes partiklites. Praegu profülaktikas parim otsese kontakti vältimine infitseeritud koega. Viirused mõmm :) 05/06 Polüomaviirus Struktuur. Väike ikosaeedriline viirus. Kaheahelaline DNA. Replikatsioon ja montaaž tuumas. Olulisemad tüübid SV40, JC, BK. Väiksemad kui papilloomiviirused (45 nm, 5000 aluspaari), vähem komplekssed. Ümbriseta – inaktivatsioonile resistentne. Epidemioloogia. Üldlevinud (BK, JC), aga ei põhjusta tavaliselt haigust. Tavaliselt ollakse infitseeritud 15 eluaastaks. Levik ilmselt respiratoorselt. Latentne infektsioon reaktiveerub immuunsupressioonil: AIDS, transplantatsioon, rasedus. 10% AIDSi-patsientidest saab PML-i, see on fataalne 90% juhtudest. Ülemaailmne, sesoonsuseta. Replikatsioon.
annaabi.ee 
