e. *transport tuumast tsütoplasmasse läbi pooride tänu mRNA polü A-sabale. 23. Nimeta keemilised reaktsioonid, mis on pre-mRNA splaisingu taga. Missugused on need 3 staadiumit, mida katalüüsib splaisosoom? a. Transesterfikatsioon - *branchpointi A 2'-OH ja introni 5'-otsa fosfaatrühma-vaheline 2'5'-fosfodiesterside*ligeeritakse 2 eksonit 3'5'-fosfodiestersidemega b. Vabaneb lasiaadistruktuuriline intron, mis lagundatakse kohe Rnaaside poolt. 24. Missugused U snRNAd osalevad pre-mRNA splaisingu regulatsioonis? a. U1, U2,U5U6U4 ja U1U4. 25. Mis on GT-AG reegel? a. Intron algab alati GT'ga ja lõppeb AG'ga. 26. Kirjelda mehanismi, mille abil tuumsest pre-mRNAst kõrvaldatakse intronid. a. Splaissingut teostab splaissosoom snRNP + pre-mRNA. b. *splaissosoom interakteerub pre-mRNA-ga ning moodustub splaissosoom c
*insuliin Energeetikas- *kütused (metaan ja etanool) *biogaas (loomasõnnik, erinevate taimede jäägid) * reovee puhastamine Antibiootikum- ained, mida toodavad ja eritavad keskkonda paljud hallitusseened ja osa baktereid, et tõrjuta konkureerivaid mikroobe. 5. Molekulaarbioloogia põhiprotsessid (replikatsioon, transkriptsioon, translatsioon), põhiprotsesside keerukus tegelikkuses: intron, ekson, RNA splaising. Valkude splaising. (Konspekt). Replikatsioon- on rakutuumas toimuv DNA süntees, mille tulemusena saadakse ühest DNA molekulist kaks ühesuguse nukleotiidse järjestusega DNA molekuli. Transkritsioon- on DNA ühe ahela alusel komplementaarse RNA molekuli süntees. Translatsioon- protsess, mille käigus sünteesitakse aminohapetest polüpeptiidahel. Translatsioon on peamine osa valgusünteesist.
Osaleb lühikeste RNAde sünteesis( U6, 7s) Poly(A) saidid- elemendid ( konkreetsed järjestused) mille peale istub RNA sünteesi lõpetav/termineeriv kompleks lisatakse u 200bp adeniini saba. Pre-mRNA- 5'müts, eksonid, intronid, kaitsev 3' saba millel Poly(A) järjestus. Pre-mRNA allutatakse splaissingule-tekib küps mRNA mille tunnuseks on 5' cap ja 3' saba. RNProteins tunnevad ja detekteerivad RNAd tekib RNParticle. AG reegel- Ülavoolu: Intron algab GUga, ekson lõppeb AGga; Alavoolu: ekson algab Gga, intron lõppeb Agga. Splaissosoom- kompleks mis peab moodustuma 5 ´3' liidesesse. Selleks on eksonitel mingid järjestused mille splaissosoomi valgud (Srvalgud) ära tunnevad. Splaissingu aktiivsust reg. Fosforüleerimine (fosfataasid-võtavad ära, kinaasid- panevad juurde). Geeni reg- kromosoomi üleminek valguks. Tsentromeer- hoiab koos kahte kromatiidi. Telomeerid-
abil. Splaisosoomid organellid raku tuumas, mis koosnevad valkudest ja snRNA-st. 1 etap introni 5' otsa lahtilõikamine, mille tagajärjel introni ees olev ekson lahutatakse ülejäänud mRNA järjestusest. Introni 5' ots keeratakse aasana tagasi ja ühendatakse introni sees olevasse kindlasse järjestusse nukleotiidiga A, mis asub 18-38 nukleotiidi introni algusest 3' suunas. 2 etap introni 3' otsa lahtilõikamine, mille tulemusena intron vabaneb pre mRNA koosseisust. 3 etap allesjäänud eksonite alad ühendatakse ligaaside abil ning tekib ainult eksonitest koosnev mRNA molekul. Intronid degradeeritakse. 36. U snRNAd osalevad pre-mRNA splaisingu regulatsioonis: 5 snRNPd: U1, U2, U4, U5, U6. 37. GT-AT reegel on selline vaatlus, et kõik intronid DNAs algavad GT nukleotiitudega (guaniin, tümiin) ja lõppevad AG nukleotiitidega (adeniin, guaniin). Kui DNA on
Tavaliselt EJC eemaldatakse ribosoomi abil esimeses mRNA translatsiooni ringis. Samas kui EJC leidub allavoolu nonsense koodonit, siis EJC on ikka mRNA küljes kui ribosoom jõuab nonsense koodonini, seega ta võib toimida NMD vallapäästjana. Allavoolu EJC olemasolu tuvastatakse kui probleem NMD faktorite poolt ja RNA degradeeritakse. NMD toimub tsütoplasmas. nonsense mediated decay ühe või enam eksoni vahele jätmine, mis põhjustab ekson- intron liidese vahetus 3' läheduses Stop koodoni sissetuleku. Kõigi korrektselt splaisitud mRNAde puhul Stop koodon on viimases eksonis. Nonsense mediated decay vahendab kiiret mRNAde lagundamist, kus Stop koodonid esinevad mRNAs enne viimast splaisiliidest. Arvatakse,et Stop koodoni sissesplaisimise korral ekson-intron liidese kompleksid RNA- lt lahti ei tule ning seda ribosoomset skanneerimist ei alustata. Capping protsess 5' cap on spetsiaalne mRNA 5' lõpu otsa pandud nukleotiidne lõpp
(Käesolevas töös seda ei kasutata kuna hüüfe moodustavate seente tuumad on samuti valdavalt haploidsed). Mitokondril arvatakse olevat eubakteriaalne päritolu (joonis 1). Kui oletada, et bakteriaalse päritoluga mitokondrid on säilitanud bakteritele omaseid paljunemisviise, siis võib neil HGT aset leida konjugatsiooni käigus heteroplasmas (piirkondades, kus peremeestaime ja seene tsütoplasmad kokku puutuvad). Õistaimel Peperoma polybotrya on mitokondri coxI geenis ekson ja intron, milledel on selgelt erinev evolutsiooniline päritolu. Eksoni DNA järjestus on lähedane teiste õistaimede sama geeni vastavatele järjestusele, intronit aga teistel soontaimedel pole leitud. Selle introni järjestus sarnaneb rohkem seente kui sammaltaime, helviku Marchantia või rohevetika Prototheca mitokondri vastavale geenijärjestusele. Arvatakse, et coxI introni doonoriks võis olla mingi sümbiontne mükoriisaseen (Voughn, et al., 1995). On leitud HGT ka seente endi vahel
7. Iseloomustage kõikide RNA liikide a) molekulide struktuuri *tRNA - lühikesed polünukleotiidahelad 73-94 jääki igas; mitmed alused on metüleeritud; 3'-terminaalne nukleotiidjärjestus on alati CCA. *rRNA kõik ribosoomid koosnevad suurtest ja väikestest subühikutest; kõrge ahelasisene järjestuste komplementaarsus põhjustab ulatuslikku aluspaaride teket ja kaheahelaliste (hairpin-struktuurid) moodustumist. *mRNA vehalduvad intronid ja eksonid, sisaldab polü-A saba; intron vahejärjestus; ekson kodeeriv järjestus; polü-A saba seotud RNA stabiilsusega. b) funktsiooni valgu sünteesi protsessis valgu sünteesi protsessis eristuvad kaks staadiumit: transkriptsioon(1) ja translatsioon(2), mis omakorda hõlmab kolme etappi: Initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon. *tRNA I ribosoomi väike subühik seostubinitsiaator tRNA-ga ning siis mRNA-ga. Seejärel seostub ribosoomi suur subühik ja formeerub algatuskompleks
G:C 3 vesiniksidet DNA struktuur DNA esineb paremalepöörduva kaksikheeliksina (B-DNA) Mis on geen? Geen Kromosoomi kindlas lookuses paiknev pärivustegur, mis määrab otse või kaudselt ühe või mitme tunnuse arengu Geen DNA molekuli funktsionaalne lõik (kindel nukleotiidne järjestus), mis sisaldab informatsiooni ühe valgu sünteesiks Inimese genoomis on umbes 30 000 geeni! ekson kodeeriv nukleotiidijärjestus Intron mittekodeeriv nukleotiidijärjestus NB: GC rikastes alades geene rohkem ja intronid lühemad! DNA kromosoomides Kromosoom Struktuurselt individuaalne element rakutuumas, mille moodustavad DNA ja temaga seonduvad valgud Kromatiin Nukleoproteiidne kompleks, mis sisaldab DNA-d, valke ja RNA-d DNA kromosoomides Igal kromosoomil on oma territoorium Ka kromosoomisisene struktuur Geenirikkad alad koondunud kokku aitab tõsta transkribeerimise efektiivsust?
Homoloogsed geenid on need, mis on omavahel sarnased. Enamasti on nad evolutsiooni käigus tekkinud ühest ja samast eellasgeenist • Kui homoloogsed geenid on sama liigi sees, siis neid nimetatakse paraloogseteks geenideks • Kui homoloogsed geenid on erinevates liikides, siis neid nimetatakse ortoloogseteks geenideks Geeni struktuur Eukarüootse geeni osad on - promootor (ja enhaanser) - ekson(id) - intron(id) - 5’ mittetransleeritav osa (5’ UTR) - 3’ mittetransleeritav osa (3’ UTR) Eksonid ja Intronid Eksonid on geenis olevad järjestused, mis moodustavad lõpliku mRNA molekuli. Intronid on vahepealsed järjestused, mis lõigatakse välja kui algne primaarne transkript (premRN, ka hnRNA) protsessitakse mRNA-ks. Inimgenoomi olulisemad parameetrid Inimese suurim geen on düstrofiin (DMD)
siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA- fragmendid. Restriktaas bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt. Ligaas ensüüm, mis ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad. Geenides on intronid ja eksonid : · Intron lõigatakse · Ekson liidetakse Bakterid toodavad inimese valke alates 1978. aastast : · Esimene oli insuliin · Inimese kasvuhormoon · Erütropoietiin aneemia raviks · Interferoon, mis reguleerib immuunsüsteemi · Verehüübimisfaktorid · Difeeria ja teetanuse vaktsiin · Pärmseened teevad B-hepatiidi vaktsiini · Putukarakud toodavad papilloomi vaktsiini Transgeensed loomad
Pseudogeen- funktsionaalse geeniga homoloogiline järjestus, mida ei transkribeerita. Evolutsiooni käigus on lisandunud neisse geenidesse geneetilise triivi (genetic drift) tulemusena rida muutusi, mis translatsiooni enneaegselt termineerivad või inhibeerivad mRNA protsessingut, nii et need alad on muutunud mittefunktsionaalseks ehkki neilt transkribeeritakse RNAd. Teine võimalus pseudogeenide tekkeks on RNA pöördtranskriptsioon cDNAks ja viimase integratsioon genoomi intron-vaba DNAna. 8. Missugused molekulaarsed mehanismid tagavad selle, et inimese genoomi 30,000-40,000 geeni kodeerivad 100,000 ndeid erinevaid valke? Alternatiivne splaissing kui tava-arusaama järgi kleebitakse küpse RNA saamiseks eksonid lihtsalt kokku, siis alternatiivse splaissingu käigus kasutab rakk erinevaid eksonite kombinatsioone, et teha erinevaid küpseid mRNA-sid ja valke. Alternatiivne splaising võib toimuda samas raku tüübis vastuseks erinevatele keskkonna-ja raku arengut
RNA protsessing algab juba RNA transkriptsiooni käigus. Müts läheb RNA 5’ otsa ja pannakse tagurpidi. Mütsiks on lämmastikaluse positsioonis 7 metüleeritud guanosiin. Side on 5’-5’ fosfaatside. Lisatakse juba kui RNA polümeraas on sünteesinud 25-30 nt. Müts kaitseb RNAd ribonukelaaside vastu. Eukarüootsel geenil on eksonid (kodeerivad) ja intronid (vahejärjestused) Geenidel esineb sageli alternatiivsed splaissingut. Eksonite splaissimiseks on ekson-intron piirides ja intronite sees spetsiifilised signaalijärjestused. Ekson splaissitakse välja lariaat-struktuuri abil. Kui RNA on protsessitud, siis ta transporditakse läbi tuuma pooride tsütoplasmsse.
dNTP ja oligonukleotiidset praimeri lisades puhvris, 37C juures ühe tunni jooksul. Seejärel toimub tavaline PCR. 22. Kirjelda meetodeid, kuidas on võimalik mõõta mRNA taset rakus? Mis on poolt ja vastu argumendid mõlema meetodi puhul? Kuidas kaardistatakse ekson-intron piire? Northern analysis: isoleeritakse vigastamata mRNA; lahutatakse RNA agarosgeelil suuruse järgi, kantakse üle membraani peale, kus RNA fikseerub, toimub hübridisatsioon huvipakkuva lõigu puhul komplimentaarsuse
Kui ensüüm kinnitunud, algab transkriptsioon. Promootorpiirkonale järgneb RNA sünteesipiirkond. See määrab ära sünteesitava RNA nukleotiidse järjestuse.Transkriptsioon lõpeb, kui RNA- polümeraas jõuab DNA järjestuseni, mida nimetatakse terminaatoriks. Seal ensüüm ja mRNA vabanevad ning DNA biheeliks keerdub kokku tagasi. PÖÖRDTRANSKRIPTAAS- revertaas, mis avastati retroviirusest. Ensüüm, mis katalüüsib DNA sünteesi RNa järgi (st RNA kopeerimine DNA-ks). INTRON- mittekodeeritav lõik, mida bakteride ‘’ei oska’’ välja lugeda EKSON- kodeeriv DNA (inimese genoomis u 2%) GENOOMIPANK- bakterikloonides säilitatav inimese genoomi DNA-fragmentide kogum; kasutatakse kindlate fragmentide (geenide) paljundamiseks, uurimiseks ja siirdusmaterjali saamiseks. RNA splaising- RNA transkriptist eemaldatakse intronid ja liidetakse eksonid PÖÖRDTRANSKRIPTSIOON- geneetilise info ülekanne RNA-lt DNA-le. DNA süntees RNA järgi, tekib cDNA.
2. Osade rRNA prekursorite puhul kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt, RNA molekuli enda poolt. Splaissingureaktsioon ei vaja välist energiaallikat ega valkude aktiivsust. Kofaktorina on vaja vaba 3´-OH rühma kas GTP-lt, GDP-lt, GMP-lt või guanosiinilt (G-3 ´-OH) ning monovalentset ja divalentset katiooni. Splaissing toimub etapiviisiliselt: kõigepealt toimub fosfodiestersideme ülekanne ekson-intron ühendusalalt G-OH-le (RNA ahela katkeb eksoni ja introni ühendusalas), seejärel katkeb fosfodiesterside järgmise eksoni ja introni 3´-otsa vahel ning fosfodiesterside moodustub eksonite vahel. Väljälõigatud intron tsirkulariseerub molekulisiseselt (toimub veel üks fosfodiestersideme ülekanne). 3. Rakutuumas asuvate pre-mRNA molekulide splaissing toimub kahe-etapiliselt ribonukleoproteiin-partiklites – splaissosoomides
valguliste (8 histooni) gloobulite. - Kromatiin - DNA ja sellega seondunud valkude (histoonide) kompleks, millest moodustuvad eukarüootide ehk päristuumsete kromosoomid. - Eukromatiin - kromatiini osa. See on lõdvalt pakitud kromosoomi ala, mille pealt toimub transkriptsioon. Transkriptsiooniliselt aktiivne DNA - Heterokromatiin - Inaktiivne DNA - Aluspaar (näide) - nukleotiidipaar (np, bp, Kb); mõõdetakse DNA lõigu (ekson, intron, geen jt.) pikkust. kaks omavahel vesiniksidemetega seotud nukleotiidi, mis esinevad vastastikustes komplementaarsetes DNA või RNA ahelates. Üldjuhul moodustab guaniin (G) aluspaari tsütosiiniga (C) ja adeniin (A) aluspaari tümiiniga (T), RNA molekulis on aga adeniin paardunud uratsiiliga (U) - Genoom - ühes liigiomases kromosoomikomplektis (haploidne kromosoomistik) sisalduv geneetiline materjal
DNA sünteesi täpsused: 1) DNA sõltuv DNA süntees – E-5-E-6 2) DNA sõltuv RNA süntees – E-5 3) RNA sõltuv DNA süntees –E-3-E-4 Valgusüntees on kõige vähem täpsem. Vigade sagedus sõltub substraadi kontsentratsioonist ja reaktsioonide kiirustest Transkriptsioon eukarüootidel - tRNA transportida tuumast tsütoplasmasse - kromatiin asub tuumas - DNA nukleosoomides (histoonide oktameeri komplektina) - geenide intron-ekson struktuurid, operone pole - kolm erinevat DNA sõltuvat RNA polümeraasi (prokarüootides 1) ja neil on osaliselt kattuvad subühikud prokarüoodi polümeraasiga. - iga geen üks transkriptsiooni ühik - inimese ≈ 20 000 geenilt saab ≈ 40 000 produkti - inimesel näiteks rakku E+14 – paljurakulised organismid - erinevates rakkudes avalduvad erinevad geenid Kolm erinevat DNA sõltuvat RNA polümeraasi:
Need ensüümid tunnevad spetsiifiliselt ära tRNA prekursormolekuli kõrgemat järku struktuuri, mitte aga spetsiifilist nukleotiidset järjestust. 2) Osade rRNA prekursorite puhul kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt, RNA molekuli enda poolt. Kofaktorina on vaja vaba 3´-OH rühma kas GTP-lt, GDP-lt, GMP-lt või guanosiinilt (G-3´-OH) ning monovalentset ja divalentset katiooni. Splaissing toimub etapiviisiliselt: kõigepealt toimub fosfodiestersideme ülekanne ekson-intron ühendusalalt G-OH-le, seejärel katkeb fosfodiesterside järgmise eksoni ja introni 3´-otsa vahel ning fosfodiesterside moodustub eksonite vahel. Väljälõigatud intron tsirkulariseerub molekulisiseselt (toimub veel üks fosfodiestersideme ülekanne). 3) Rakutuumas asuvate pre-mRNA molekulide splaissing toimub kahe-etapiliselt ribonukleoproteiin-partiklites splaissosoomides. Splaissosoomid sisaldavad snRNA molekule U1- U6 (U3 asub tuumakeses) ja üle 40 erineva valgu
snRNPde vabastamiseni. Katalüütiliselt aktiivne ümberstruktureeritud splaisosoom viib läbi transesterifikatsiooni reakstiooni nii, et (1) moodustub branchpoint A 2'hüdroksüülrühma ja introni 5' otsa fosfaatrühma vaheline 2'5'-fosfodiesterside. Teise struktuurse muutuse tulemusena, teise transesterifikatsiooni reaktsiooni käigus, (2) ligeeritakse kaks eksonit omavahel 3'5'fosfodiestersideme moodustumise tulemusena, nii 7 et intron vabaneb harulise lariaat-struktuurina. Pikkade pre-mRNAde puhul osalevad eksoni äratundmisel SR valgud. SR valgud interakteeruvud eksoni järjestusega, mida nim eksoonseteks splaisingu võimendajateks (ESE). Pärast ESEga seondumist vahendavad nad U1snRNPde kooperatiivset sidumist korrektsele 5' splaissaidile ja U2snRNPde õige branch point'I äratundmist. Nende ja teiste splaisingfaktorite kompleks, mis moodustub eksoni peale nim cross-exon recognition complex. 36
spersiifiliselt ära tRNA tRNA prekursormolekuli kõrgemat järku struktuuri, mitte aga spetsiifilist nukleotiidset järjestust. 2) Osade rRNA prekursorite puhul kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt, RNA molekuli enda poolt. Kofaktorina on vaja vaba 3´-OH rühma kas GTP-lt, GDP-lt, GMP-lt või guanosiinilt (G-3´-OH) ning monovalentset ja divalentset katiooni. Splaissing toimub etapiviisiliselt: kõigepealt toimub fosfodiestersideme ülekanne ekson-intron ühendusalalt G-OH-le, seejärel katkeb fosfodiesterside järgmise eksoni ja introni 3´-otsa vahel ning fosfodiesterside moodustub eksonite vahel. Väljälõigatud intron tsirkulariseerub molekulisiseselt (toimub veel üks fosfodiestersideme ülekanne). 3) Rakutuumas asuvate pre-mRNA molekulide splaissing toimub kahe-etapiliselt ribonukleoproteiin-partiklites splaissosoomides. Splaissosoomid sisaldavad
ligaasi poolt. Pseudogeen - funktsionaalse geeniga homoloogiline järjestus, mida ei transkribeerita. Evolutsiooni käigus on lisandunud neisse geenidesse geneetilise triivi (genetic drift) tulemusena rida muutusi, mis translatsiooni enneaegselt termineerivad või inhibeerivad mRNA protsessingut, nii et need alad on muutunud mittefunktsionaalseks ehkki neilt transkribeeritakse RNAd. Teine võimalus pseudogeenide tekkeks on RNA pöördtranskriptsioon cDNAks ja viimase integratsioon genoomi intron-vaba DNAna. Transformatsioon geneetilise informatsiooni ülekandumine ühest rakust teise rakust isoleeritud DNA abil. Pärilik muutus raku omadustes. Võõras DNA satub raku koosseisu ja sellelt hakatakse geene eksprsesseerima. SEKUNDAARSED VAHENDAJAD rakusisesed molekulid, mille struktuur muutub pärast mingi kindla aine retseptorile seondumist, kutsuvad esile rea ensümaatilisi protsesse, mille tulemusena realiseerub geeniekspression; aktiveerivad spetsiifilisi proteiinkineaase.
6. Kuidas tekkisid pseudogeenid? Eellasgeeni korduvate duplikatsioonide tulemusena, samas on aga evolutsiooni käigus lisandunud neisse geenidesse geneetilise triivi tulemusena rida muutusi, mis transkriptsiooni enneaegselt termineerivad või inhibeerivad mRNA protsessingut, nii et need alad on muutunud mittefunktsionaalseks ehkki neilt transkribeeritakse RNAd. Teine võimalus pseudogeenide tekkeks on RNA pöördtranskriptsioon cDNAks ja viimase integratsioon genoomi intron-vaba DNAna. 7. Organellide DNA. Mitokondritel ja kloroplastidel on oma DNA. mtDNA: suurus 16 kb, struktuur rõngasmolekul, ei sisalda introneid, kodeeriv potentsiaal 37 geenist 13 kodeerivad valke, 22 tRNAsid ja 2 rRNAsid, geneetiline kood loomade ja pärmide puhul kodeerivad paljud koodonid alternatiivseid aminohappeid või stoppkoodoneid, mutatsioonid võivad põhjustada inimesel neuromuskulaarseid haigusi, arvatavasti vastavate kudede suurest ATP nõudlusest tingituna
Momendiks teada vähemalt 200 miRNA geeni. Ekspressioon sageli kas koe- või soospetsiifiline. Klasterdatud. Osa miRNA-sid katalüütilise aktiivsusega, telomeraasi RNA-d. Mitmed antisense RNA-d (umbes 500 geeni), mis osalevad geeniekspressiooni kontrollis (TSIX). piRNAd koos PIWI valkudega kontrollivad transposonite ekspressiooni. 14. Valke kodeerivate geenide omadused ja funktsioonid. Inimgeenide suurus on väga varieeruv. Geenide ekson-intron struktuur: Vähesed inimgeenid esinevad üheeksonilistena. Keskmine geeni pikkus 27 kb. Geenide vahe 75 kb, Keskmine eksonite suurus 200 bp. (väikseim 3 bp, pikim 10 kb). Keskmine eksonite arv 9 (suurim titiin 363), Intronite suurus sõltub osaliselt geenide suurusest (10 bp100kb), Geenides (intronites) esineb tihti kordusjärjestusi, Mõned introniteta. 15. Geenide grupeerimise alused. Üksikud samased inimgeenid kodeerivad
Tavaliselt fosforsidemeid üle kandes. DMD - 78 intronit, kana kollageen - vähemalt 50. Introneid lõigatakse välja: tRNA prekursoritest splaissingu endonukleaasiga + ligeerimine (fosfodiesteraasne, kinaasne, ligaasne aktiivsus) rRNA prekursoritest autokatalüütiliselt. pre-mRNA transkriptidest kaheetapiliselt splaissosoomide abil. 121. Autokatalüütiline splaising. Puudub trans; on ainult cis katalüütiline aktiivsus. Reaktsioon vajab guaniini vaba 3'-OH gruppi kui kofaktorit! Intron kõrvaldatakse kahe fosforsideme ülekandega. Väljalõigatud intron võib muuta ringikujuliseks teise fosforsidemete ülekandega. rRNA prekursorid. 122. Splaissosoomid. Splaissosoomides on 5 snRNPd: U1, U2, U4, U5, U6. SpRNAd - valk kompleksid. I etapis toimub 5' intron splaissingu saidis (tavaliselt GU; splice donor) katkemine, intramolekulaarsete fosfordiestersideme teke katkemispunkti G 5' süsinikku ja konserveerunud A 2?' süsinikku vahel introni 3' otsa poolt. Vaja ATP energiat
geenist koosnev klaster, mis paikneb genoomi keskosas. Lugemisraamid paiknevad lähestikku ja mõlemas ahelas. 40% PBCV-1 poolt kodeeritavatest valkudest omab homoloogiat mingite teistest organismidest pärit valkudega. 84 geeni kuulub geeniperekondadesses (26 perekonda, igas 2-6 liiget) Mõnedes geenides leidub introne, mis kuuluvad kolme erinevasse tüüpi: - isesplaiseeruvad intronid - splaisosoomi-splaiseeritavad intronid - tRNA geeni intron Sekveneeritud on ka mitmeid teisi Chlorella viiruseid, nende järjestuste sarnasus (valkude tasemel) on ca 60% Seondumine rakule. PBCV-1 seondub kiiresti ja pöördumatult Chlorella rakkudele. Seondumise saidis toimub raku seina lahustumine ja viiruse DNA tungib rakku (tühi kapsiid jääb raku pinnale). Raku seina lüüsimine toimub virionis paikneva(te) ensüümi(de) toimel, DNA sisenemiseks rakku on vaja ka peremehe funktsioone. DNA transporditakse tuuma.
Alleel on geeni teisend, geeni esinemisvorm, üks mitmest geenivariandist, mis asuvad homoloogiliste kromosoomide samas lookuses ja toimivad sama tunnuse kujunemisele, tekitades selle eri vorme või avaldumisastmeid. Dominantne alleel alleel, mille poolt määratud tunnus alati avaldub (tähistatakse suurtähega nt A ). Retsessiivne alleel alleel, mille poolt määratud tunnus avaldub vaid dominantse alleeli puudumisel (tähistatakse väiketähega nt a). 28. Introni ja eksoni mõiste. Intron on geeni mittekodeeriv lõik, mis jääb eksonite vahele. Ekson on geeni kodeeriv lõik. 29. Mis on struktuursed geenid, mis reguleerivad geenid? Struktuursed geenid määravad raku ehituses ja ainevahetuses osalevate valkude, tRNA ja rRNA sünteesi. 8 Reguleerivad geenid kontrollivad struktuurgeenide avaldumist. 30. Mis on geeni ekspressioon e. geeni avaldumine?
Spetsiifiline proteolüütiline töötlemine- väiksemaks lõikamine Mitmeahelaliste valkude moodustamine- üks valk võib koosneda mitmest peptiidist Valkude aktiivusse kestvus on erinev- mõned lülitatakse välja, lagundatakse, tagasiside inhibatsioon- kui produkti liiga palju, siis inhibeeritakse transkriptasioon Geeni struktuur: Enhanser- võimendi Promootor- lüliti TATA box- transkriptsiooni faktorite kinnituskoht Ekson- kodeeriv ala Intron- mittekodeeriv ala, lõigatakse välja 9. Transkriptsiooni ja antibiootikumid Rifamütsiin-seostub RNA polümeraasile. Aktinomütsiin D-seostub DNA-ga ja peatab mRNA ahela pikenemise. Erütromütsiin ja spectinomütsiin-mõjutavad mRNA seostumist ribosoomidega. Kloramfenikool, linkomütsiin ja tetratsükliin seostuvad ribosoomiga ja blokeerivad elongatsiooni. Streptomütsiin inhibeerib peptiidi sünteesi initsiatsiooni ja elongatsiooni 10. Geneetiline muutlikkus e
osad on geenide vahel, tihti ka geeni sees. pre-RNA sisaldab nii eksoneid kui introneid. Splaissosoomid (spetsiaalsed RNA-valgu kompleksid). Osalevad U1, U2, U4, U5 ja U6 snRNA-d, mis moodustavad koos nendele seondunud valkudega väikesi tuuma ribonukleoproteiini komplekse snRNP (ingl small nuclear ribonucleoproteins). snRNP-d omakorda moodustavad koos teiste valkudega nn splaissosoomi, kus iga snRNP osaleb splaissingu erineval etapil. Splaissosoom vastutab ekson-intron piiride tuvastamise eest ning katalüüsivad intronite väljalõikamist pre-mRNA transkriptist. Splaissing peab olema täpne – kasvõi ühe nukleotiidse nihke korral ei moodustuks eksonitest korrektse lugemisraamiga mRNA-d. miktiivne splaissing – tekivad erinevad küpsed mRNA-d, millel erinevad eksonite kombinatsioonid (oluline mRNA poolt kodeeritavate valkude struktuuri ja funktsionaalsuse määramiseks) 46. mRNA molekuli transport läbi tuumapoori kompleksi. Millised
eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. 2. Osade rRNA prekursorite puhul (paljudes madalamates eukaüootides, samuti ka rakuorganellides) kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt, RNA molekuli enda poolt. Splaissingureaktsioon ei vaja välist energiaallikat. Kofaktorina on vaja vaba 3´-OH rühma nt GTP-lt ning monovalentset ja divalentset katiooni. Splaissing toimub etapiviisiliselt: kõigepealt toimub fosfodiestersideme ülekanne ekson-intron ühendusalalt G-OH-le (RNA ahela katkeb eksoni ja introni ühendusalas), seejärel katkeb fosfodiesterside järgmise eksoni ja introni 3´-otsa vahel ning fosfodiesterside moodustub eksonite vahel. Väljälõigatud intron tsirkulariseerub molekulisiseselt (toimub veel üks fosfodiestersideme ülekanne). 3. Rakutuumas asuvate pre-mRNA molekulide splaissing toimub kahe-etapiliselt splaissosoomides.
abil. Need molekulid tunnevad spetsiifiliselt ära RNA prekursormolekuli kõrgemat järku struktuuri, mitte aga nukleotiidset järjestust Osade rRNA prekursorite puhul toimub splaissing autokatalüütiliselt RNA molekuli enda poolt. Kofaktorina vajatakse kas GTP, GDP, GMP või guanosiooni vaba -OH rühma ja mono- või divalentset katiooni. Fosfodiesterside kandub üle ekson-intron üleminekualalt G-OH'le, seejärel katkeb fosfodiesterside järgmise eksoni ja introni 3'- otsa vahelt ning moodustub eksonite vahele. Rakutuumas asuvate pre-mRNA molekulide splaissing toimub kaheetapiliselt ribonukleoproteiin-partiklites splaissosoomides (sisaldavad snRNA ja palju valke). Toimub estersidemete katkemise ja tekke põhjal ning intronite eemaldamise kaudu. 62
Eukarüootide geenid on enamasti katkendlikud, sisaldavad introne ja eksone. Geeni primaarne produkt mRNA, läbib splaissingu, mille käigus osa RNA järjestusest eemaldatakse. Intronid eemaldatakse. Eksonid jäävad alles ja nende ühendamise (splaissingu) tulemusel tekib küps mRNA. (Inton-ekson skeem) Ka küpses mRNA's on mittekodeerivad järjestused, nn liider ja treiler vastavalt mRNA alguses (5' osas) ja lõpus (3' osas). Ka ühe geeni intronid võivad kodeerida produkte, nn. intron kodeeritud produktid. Siia kuuluvad mitmed väikesed RNA molekulid (snoRNA). Imetajate geenides on paljude eksonite ühendamine võimalik mitmel erineval viisil, mõned intronid on võimalik välja jätta. See protsess on alternatiivne splaissing, mille 4 puhul on ühel geenil mitu võimalikku produkti. Seega geenid ei ole alati ühetähenduslikud.
täpselt. Struktuurvalke kodeerivates, rakutuumas asuvates geenides paiknevate intronite otstes on lühikesed konserveerunud alad. 100%-liselt on konserveerunud dinukleotiidid GT intronist 5´ suunda jääva eksoni kõrval ja AG intronist 3´ suunda jääva eksoni kõrval. Nendest intronisse sissepoole jäävad vähemkonserveerunud alad. Üks neist on TACTAAC element, mis jääb introni 3´ splaissingu saidist 30 nukleotiidi ülepoole. Ekson-intron ühendusalade järjestus tRNA-de geenides ning struktuurgeenide puhul mitokondrites ja kloroplastides erineb eelpoolkäsitletust. Nende puhul on ka splaissingumehhanism teistsugune. Intronite väljalõikamine võib toimuda kolme erineva mehhanismi alusel: (1) tRNA prekursorite puhul teeb katked RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. Need ensüümid tunnevad
täpselt. Struktuurvalke kodeerivates, rakutuumas asuvates geenides paiknevate intronite otstes on lühikesed konserveerunud alad. 100%-liselt on konserveerunud dinukleotiidid GT intronist 5´ suunda jääva eksoni kõrval ja AG intronist 3´ suunda jääva eksoni kõrval. Nendest intronisse sissepoole jäävad vähemkonserveerunud alad. Üks neist on TACTAAC element, mis jääb introni 3´ splaissingu saidist 30 nukleotiidi ülepoole. Ekson-intron ühendusalade järjestus tRNA-de geenides ning struktuurgeenide puhul mitokondrites ja kloroplastides erineb eelpoolkäsitletust. Nende puhul on ka splaissingumehhanism teistsugune. Intronite väljalõikamine võib toimuda kolme erineva mehhanismi alusel: (1) tRNA prekursorite puhul teeb katked RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. Need ensüümid tunnevad
moodustavad DNA-ahelaga kolmikahela, DNA denatureerimine pole vajalik. LT edasiarendus; kasutatakse lühikesi oligonukleotiide, mis mahuvad DNA ahela pöörde (groove'i) vahele pole vaja räiget DNA töötlust ja denaturatsiooni. Fiber-FISH: Lahutusvõime paar kb (väga hea!); kasutatakse interfaasi kromosoome (väljavenitatud kromosoomikiud) DNA on fiibritena, katkeb kergesti. Näha on intron-ekson struktuur. SKY-FISH: FACSis sorteeritud kromosoomid (terve karüotüüp) on eraldi purkides, neid saab värvida erinevate värvidega. Segu hübridiseerime meid huvitava karüotüübi vastu. Kadunud regioonis ei anna signaali ja näha on kõik suuremad kromosomaalsed ümberkorraldused, mida vähirakkude puhul on kõvasti. Saab kiiresti täielikult ülevaatliku pildi situatsioonist. m-FISH: tulemus umbes sama, mis SKY'l, muidu natuke erinev (näiteks eksitatsioon). Tehakse
• miRNA transkriptsiooni viib läbi enamasti RNAP II, kuid harvemini ka RNAP III. • • MikroRNAde seondumiskohad – paiknemine, omadused, ennustamine • Paiknevad praktiliselt alati valku kodeerivate geenide mittekodeerivates alades, 3’-UTR-des, võivad asuda ka nt kodeerivas alas, aga see on väga erandlik. Võivad paikneda ka mittekodeerivate geenide transkriptides, pseudogeenide või lncRNAde järjestustes. miRNAde seondumiskohad on peamiselt intron kodeeritavas alas, kuna degradatsioon takistab miRNAde seondumist mRNAl, sp on need seondumiskohad 3’UTR, kuna ribosoom ei läbi seda. Küpse miRNA järjestuse nukleotiidid 2-7 moodustavad seed regiooni, mis paarduvad komplementaarsuse alusel sihtmärk mRNA 3’UTR-ga ning selle piirkonnaga on määratud mRNAde seondumise spetsiifilisus. Kui seed ja 3’UTR vaheline seondumine on täielikult komplementaarne, toimub mRNA lagundamine, kui aga osaliselt
Hiljem valkude eraldamine. Eukarüoodid : Esmalt pre-mRNA st. ta ei ole kohe valmis transleeruma, teda tuleb töödelda. Transkriptsioon ja translatsioon ei toimu samaaegselt(transporditakse enne tuumast tsütoplasmasse). Eukarüootne mRNA on monotsistroonne, vaid ühe geeni produkt. Vahe on selles, et eukarüootidel peab mrna tulema tuulmast välja, tuuakse aminohappe molekule sinna jne. Eukarüootne pre-mRNA sisaldab mittekodeerivaid osasid, mis eemaldatakse protsessingu käigus. intron = mitte kodeeriv DNA järjestus eksonite vahel, ekson = kodeerivad osad geenis. mRNA eksonite splaissing ja intronite eemaldamine: Intronite otsad spetsiifilised 5'-GT(U) algus ja AG-3' lõpp. Splaissing splaissosoomide abil, mis on snRNA ja valgu kompleks, mis lõikab läbi 3' otsa ja seob eksonid. Intronid degradeeritakse raku poolt. Selline transkriptsioon võimaldab alternatiivset splaissingut. Post-transkiptoorne mRNA modifitseerimine:
mitokondri) DNA nukleotiidne järjestus, mis on vajalik: a) valgu polüpeptiidi sünteesiks b) RNA molekulide (nagu tRNA ja rRNA) sünteesiks Eukarüootse genoomi geenid on sagedasti ümbritsetud mittekodeerivate aladega. Eukarüootse geeni osad on: - promootor - määrab, kui palju tehakse transkriptsiooni (ja enhaanser - peab tulema promootori juurde, et valk hakkaks tööle) - ekson(id) - moodustavad lõpliku mRNA molekuli - kodeeritav osa. - intron(id) - mittekodeeritav osa - 5’ mittetransleeritav osa (5’ UTR) - 3’ mittetransleeritav osa (3’ UTR) - terminaatorala 42. Nimeta geeni ekspressiooni regulatsiooni tasemeid Eukarüootide geeni ekspressiooni reguleeritakse 3 tasandil: transkriptsioonil, selle järgsel protsessingul ja translatsioonil. Geenide ekspressiooni reguleeritakse ka mitmel muul tasandil – Genoomse DNA avatus – RNA protsessing – mRNA transleeritavus valguks –
Erinevaid geene aktiveerivad kõige mitmekesisemad väljastpoolt rakku tulevad signaalid. Igas rakus (mõne üksiku erandiga) on olemas rakutuum, rakutuumas asub genoom - organismi DNA täielik komplekt, mis on koondatud kromosoomidesse lineaarses järjestuses. Geeni võib defineeridakui funktsionaalselt piiritletud lõiku DNA molekulist.. Inimesel on 23 paari kromosoome, kusjuures igas paaris on üks kromosoom pärit emalt ja teine isalt. INTRON--- geenisisesed mittekodeerivad lõigud,(järjestused) EKSONID--geenisisesed kodeerivad lõigu(,järjestused) 42. GENEETILINE KOOD, VALGU SÜNTEES. Geneetiline kood lämmastikaluste ehk nukleotiide (adeniin, guaniin, tsütosiin, tümiin) järjestus DNA molekulis. DNA molekulides talletatud geneetiline informatsioon realiseerub valgusünteesil. Valgud koosnevad aminohapetest. Erinevaid aminohappeid on 20. Seega erinevad valgud teineteisest aminohapete kombinatsioonide ja nende järjestuse
, cryIA(b), lectin, ivr 1999 Lectin, ivr, EPSPS, cryIA(b) cPCR Tengel et al., 2001 P-35S and T-nos cPCR Mao et al., 2002 Lectin, lipid transfer protein RTi-PCR Alary et al., 2002 (ltp) maize y P-35S Maize MON810 P-35S/HSP70 intron nested PCR Zimmermann et al., 1998c 5′ junction RTi-PCR Holck et al., 2002 3′ junction RTi-PCR Hernandez et al., 2003a
annaabi.ee 
