plasmiid üle kanduda teisse rakusse. 11. Mis on fagemiid? Millised eelised on antud vektoritel? Fagemiid on plasmiid, mis sisaldab f1 filomentse faagi regiooni, mis sisaldab replikatsiooni alguspunkte. Fagemiid Plasmiid M13 1.Filamentse faagi 1.toodab palju 1. ringikujuline DNA ahel kujuna või plasmiidina; rekombinantset DNAd 2.laseb eraldada kloonitud DNA võib käituda nii 2.kasutatakse cDNA fragmendid üheahelalisel kujul (võimalik plasmiidina, kui ka kloonimiseks sekveneerida) faagina 3.Konjugatiivsed ja 3.ei tapa bakterirakku 2.stabiilne mitte, runway tüüp 4.F-spetsiifiline rekombinantne DNA 3.Üheahelaline DNA 4.Sobib suuremate fragmentide sisseviimiseks 12. Kuidas on võimalik ligeerida sisend vektorisse õige suunaga? Kõige lihtsam on lideerida kleepuvate otstega DNA fragmentdid
viiruse DNA ei ole metüleeritud Inimese geenide üleviimiseks kasutatakse viirusvektoreid: 1. Retroviirused 2. Adenoviirused Viirused põhjustavad haigusi!? Ohtlikud järjestused lõigatakse viiruse genoomist välja või blokeeritakse nende geenide ekspressioon Retroviirused: * üleviidav geen liidetakse viiruse genoomiga viirusvektor * inimese rakud nakatatakse viirusega * pöördtranskriptaas sünteesib viiruse RNA pealt cDNA * cDNA liitub inimese kromosoomiga * transkribeeritakse ka üleviidud geen
Pseudogeenid ja geenifragmendid Geeniperekondadesse kuuluvad sageli defektsed geenikoopiad (pseudogeenid), sisaldades tervet kodeerivat järjestust või selle osi ehk geenifragmente (puuduvad 3` või 5`otsad). Kanal 51, inimesel 19000 pseudogeeni, arvukalt tsentromeersetes piirkondades! Protsessimata pseudogeenid on tekkinud genoomse DNA tasemel duplikatsioonide tagajärjel, fragmenteeritud geenide osad aga ebavõrdse ristsiirde või õdekromatiidide vahetuse kaudu. Protsesseeritud pseudogeenid ja retrogeenid tulenevad RNA transkriptide pöördtranskriptsioonist (LINE-1 elemendid) ja integratsioonist genoomi. Protsesseeritud pseudogeenid sisaldavad funktsionaalse geeni eksoneid ja omavad tavaliselt ühes otsas oligo (dA)/(dT) järjestusi. Tekkinud retrotranspositsiooni tagajärjel cDNA-dest (üle 2000 ribosomaalse valgu protsesseeritud pseudogeeni). Tavaliselt ei ekspresseeru. Ekspresseeritud protsesseeritud geenid ehk retrogeenid on samuti tekkin...
variant-homosügoot 24. Mida tähendab “LOD score of 3 ”? LOD score 3 või suurem näitab aheldust – kaks geeni paiknevad üksteisele lähestikku kromosoomis. 25. Mida tähendab “Linkage disequilibrium (LD)”? Kahes või rohkemas lookuses olevate alleelide mittejuhuslik assotsiatsioon. 26. Kuidas saaks higusgeeni isoleerida kui on teada selle geeni poolt kodeeritud valk? Valk isoleeritakse, puhastatakse ja aminohappelise järjestuse alusel leitakse cDNA ning raamatukogusid skriinides saab leida järjestuse. Proov peab koosnema võimalike järjestuste segust, kuna osadele aminohapetele vastab mitu koodonit. Teine võimalus on sünteesida valgu vastu antikeha. Seejärel kloonida sobivas ekspressioonivektoris ning jälle vaadata cDNA ekspressiooni raamatukogusid. 27. Mida tähendab nn. Knudsoni “Two-hit hypothesis?” vähkkasvajate tekkes (Kahe tabamuse hüpotees). Knudsoni hüpotees – Knudson on püstitanud kahe tabamuse
3. Mis on intronid ja eksonid ja kus neid esineb? Mittekodeerivad ja kodeerivad geeniosad. Esineb geenides. 4. Kui palju on looduslikke aminohappeid? 22, kuid 20 on universaalsed. 5. Mis on mutageenid? Mutageenideks nimetatakse mutatsioone põhjustavaid füüsilisi ning keemilisi mõjureid.1:18. 6. Mis on pöördtranskriptaas ja mida see teeb? 1:19. Pöördtranskriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse RNA matriitsahelalt komplementaarne DNA (cDNA) ahel. 7. Mis on cDNA ja kuidas seda toodetakse? 1:20-21. cDNA on komplimentaarne DNA ahel ning kasutatakse pöördtranskriptaasi mRNA maatritsilt komplementaarse cDNA sünteesimiseks. 8. Mis on sünteetilised nukleiinhapped? 1:22-29. Aminohappeid, mis on sünteesitud arvuti poolt kontrollitava robotiga. Saab kasutada kindlalt valku tootva geeni sünteesimisel. Kui teada on nii geneetiline kood kui ka huvipakkuva valgu aminohappeline järjestus on selle info põhjal võimalik sünteesida seda valku sünteesiv geen.
puhastamisel, kui rakk ekspresseerib väga madalal tasemel uuritavat markerit. 2. Miks kasutatakse UMI-t ning ankurdatud polü-T praimerit? UMI – unique molecular identifier – märgistatud järjestus ja 5’ positsioon mRNAl moodustavad UMI. Ehk UMId märgistavad transkriptid ning võimaldab neid kvantitatiivselt detekteerida. polüT praimereid kasutatakse polüadenüleeritud mRNA pöördtranskriptsiooniks ja cDNA sünteesiks. Sünteesitud cDNA 3’ otsa lisatakse polüA saba terminaalse desoksünukleotidüül transferaasi vahendusel, et varustada cDNA mõlemad otsad universaalse, kuid omavahel erineva ankurjärjestusega. Teise cDNA sünteesiks kasutatakse polüT praimereid, mis kinnituvad polüA pikendusele ja initsieerivad teise cDNA ahela sünteesi. 3. Kirjelda võimalikku protokolli biopsia võtmisest kuni ühe raku raamatukogu tegemiseni.
RAKENDUSBIOLOOGIA Biotehnoloogia mõiste ja biotehnoloogia kasutavad organismid. Bioloogia on paasteadus, nagu matemaatika, keemia, füüsika. küberneetika Keemi Füüsika Matemaatik a a bioonika biokeemi biofüüsik statistika a a a BIOLOOGIA geenitehnoloogi a Meditsiin Veterinaar Põllumajandus Selektsioon Metsamajandu s biotehnoloogia Rake...
2.Uurimaks genoomi SNP-de osas tuvastamaks aheldatust 3.Uurimaks toiduaineid potensiaalsete patogeenide tuvastamiseks 4. Transkripti olemasolu ja koopianumbrite leidmiseks kas genoomses DNA-s või transkribeeritud RNA Mikrokiipide tehnoloogiad: Esineb kaks põhilist mikrokiibi valmistamise tehnoloogiat mis mõnevõrra kattuvad: 1. Oligonukleotiidide süntees in situ kiibil endal: n. Affymetrix® Gene Chips (oligo- v6i geenifragmendid "ESTd", n.n. cDNA kiibid) Affymetrix Gene Chip TM: -Valmistatakse tuhandete lühikeste oligonukletiidide in situ sünteesi teel klaasmaatriksil -Kiibil vastab 16-20 nukleotiidine ahel ühele kindlale geenile -Igale oligole kiibil vastab veel teine, mis erineb vaid ühe nukleotiidasenduse poolest -Võrreldakse proovi intensiivsust kahe partneroligo vahel -Mõõdetakse geeniekspressiooni absoluutset taset 2. Otsene DNA deposeerimine (spottimine): Spotitud cDNA mikrokiibid: Plussid
TRANSGEENSED MIKROORGANISMID - transgeensete organismide loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada niisugusesse DNA- või RNA-kompleksi, mis saab siseneda rakku või integreeruda sele genoomi. Selliseid DNA- konstrukte nim. geenivektoriteks ehk -siirdajates. Eesimesed rekombinantsed viirused ja plasmiidid loodu 1973. aasta. BAKTERITEL ei ole tuuma; seda asendab tumapirkond, milles paikenb üks rõngasjas kromosoom. Lisaks leidub bakterirakus väiksemaid DNA rõngaid- plasmiide, mida kasutatase geenivektorite loomisel. Rakendusbioloogilises suunas hakati otsima võimalusi kasutada transgeenseid baktereid meditsiiniliselt oluliste inimese valkude tootmiseks. Inimese rakkudest eraldatakse huvipakkuva geeni mRNA ja pöördtranskribteeritakse selle järgi vastav komplementaarne DNA(cDNA). See ühendatatkse plasmiidiga ning saadud geenivektor lülitub bakteriraku koosseisu(peamiseks bakteriks on inimese soolekepike). S...
palindroomsed). Järjestused, mis on ühesugused 5' 3' suunas lugedes Otsekordusjärjestused (DR järjestused, nt IS elemendil) - IS-elemendi insertsioonil tekivad elemendi otstes 2 13 bp pikad DR- (direct repeat) ehk otsekordusjärjestused (vt. AH lk. 591, joon19.2) Palindroomne järjestus ehk vastassuunaline järjestus Transpositsiooniimmuunsus - nähtus, kus transpositsioon muutub harvemaks, kui sama TE on juba DNA -s cDNA dna molekult, missünteesitakse rna-lt ning siseneb uude kohta genoomis. 11. liigiti konserveerunud järjestused - Genoomides erinevatel liikidel sarnased piirkonnad, mis sisaldavad tavaliselt elutähtsaid geene. Nende alade vahele jäävad suhteliselt muutlikud genoomi regioonid. Muutuvas alas on iseloomulikud nn. "hüppavad geenid" ehk transponeeruvad geneetilised elemendid, mis liiguvad iseseisvalt genoomi ühest piirkonnast teise. Endogeenne-kehasisene päritolu?
Selliste otstega DNA lõike on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? - üle viidavale geenile on markergeen külge pandud (GFP-geen). Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meis on intronid ja eksonid, kuid bakteris neid ei ole. Kui tahame bakterisse geeni via, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA, seda protsessi, pöördtranskriptsiooni viib läbi PÖÖRDTRANSKRIPTAAS. Edasi saab cDNA juba liita bakteri DNA-ga ning ta hakkab tootma inimese organismis esinevat valku. Kui kasutame baktereid sel viisil mõne teise liigi geenide säilitamiseks, same genoomipanga. Mudelorganismid geneetikas: kiire põlvkondade vahetus, suhteliselt vähe geneetilist materjali, sarnasus inimorganismiga, odav pidamine, varasem hea läbiuurituse tase. Transgeensete bakterite produktide näited: - esimene oli insulin - inimese kasvuhormoon - erütropoietiin aneemia raviks
INTRON- mittekodeeritav lõik, mida bakteride ‘’ei oska’’ välja lugeda EKSON- kodeeriv DNA (inimese genoomis u 2%) GENOOMIPANK- bakterikloonides säilitatav inimese genoomi DNA-fragmentide kogum; kasutatakse kindlate fragmentide (geenide) paljundamiseks, uurimiseks ja siirdusmaterjali saamiseks. RNA splaising- RNA transkriptist eemaldatakse intronid ja liidetakse eksonid PÖÖRDTRANSKRIPTSIOON- geneetilise info ülekanne RNA-lt DNA-le. DNA süntees RNA järgi, tekib cDNA. DNA sekveneerimine- protsess, mille käigus selgitatakse DNA nukleotiidne järjestus 3. Geenivektor, selle loomise protsess, ligaas, restriktaas (ja tekkivad „kleepuvad otsad"), rekombinantne DNA. Õp lk 37 – 39. Plasmiid. Viirusvektor, plasmiidne geenivektor. - õp lk 38. Rekombinantne DNA- DNA molekul, milles ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid. RESTRIKTAAS- ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt
o Mittepaardunud proov pestakse maha ja NA asukoht tuvastatakse märgise järgi · Sekveneerimine järjestuse määramine o Praegu kasutusel ensümaatiline meetod, kus DNA polümeraas lisab vahel ahela sünteesi käigus dNTP asemel didesoksünukleotiidi, mis lõpetab antud ahela pikenemise. Märgistatud DNA ahelda geel-elektrofreesis pikkuse järgi. Geenikogud 1. Genoomse DNA kogud 2. cDNA kogud (eri liigid ja koed) ainult eksoneid sisaldav, annab infot geenide avaldumise kohta. PCR(polümeraasi ahelreaktsioon Võimaldab eksponentsiaalselt paljundada uuritavat DNAd (miljardid molekulid 1-2 tunniga) Põhineb termostabiilsel DNA polümeraasil, kus luuakse komplementaarsed praimerid meid huvitavale järjestusele ja siis tsükleeritakse (ahelate lahtisulatus, praimerite paardumine, ahelate sünteesimine kokku 30-40 korda)
Loetakse fluorestsentsanduritega. Affymetrix Gene ChipTM: Klaasil kovalentse linkeri abil fotoaktiivsed järjestused, mask ees. Vahel avatakse teatud positsioonid maskis ja lisatakse mingi nukleotiid, mis ühineb -> protekteeritakse -> mask ette tagasi -> avatakse järgmised positsioonid. Nii sünnibki jupphaaval oligonukleotiid. Oligokiibid: Uuritakse absoluutset geeniekspressiooni taset kui palju saab sekveneerida (?) SNPde genotüpiseerimine Spotitud cDNA mikrokiibid: DNA kloonid klaasile, kuhu hübridiseeritakse RNA, millest tehtud cDNA, mis värvitakse ja hübridiseeritakse microarrayga. Kahe laseriga (punane, roheline) mõõdetakse tulemit. Arvuti arvutab välja ekspressioonitasemete pildi: midagi on tõusnud, midagi langenud, midagi samaks jäänud. Näiteks anname rakukle kuumasoki ja siis analüüsime 2000 geeni reaktsiooni. plussid: odavamad, paidlikumad, võrreldakse paralleelseid proove; miinused:
Genoomika kursuse kordamispunktid 1. Mis on ja mida uurib genoomika? Genoomika - teadus genoomide ehitusest. Genoomika uurib põhjusi, miks konkreetne DNA järjestus on evolutsioonis välja valitud (säilunud). Genoomika ülesandeks on mitte ainult teada konkreetse geeni ja selle produkti funktsiooni organismis, vaid ka kõikide geenide, nende produktide, funktsioonide ja regulatsiooni seoseid, mis viivad organismi tekkeni. GENes and chromosOMEs (kromosoomide täielik kogu koos neis sisalduvate geenidega). Genoomika on geneetika edasiarendus tegeledes: Genoomikaartide ja ülesehitusega, DNA sekveneerimisprobleemidega, Andmete säilitamise ja töötlemisega (bioinformaatika), Geenide identifitseerimisega, Funktsionaalse analüüsiga (funktsionaalne genoomika), Genoomide evolutsiooniga, Farmakogeneetiliste probleemidega jne. 3. Genoomika suundumused ja probleemid. Post-genoomika e. modulaarne bioloogia: Genoomide tasemel - Molek...
PEI polüetüleenimiin pakib DNA kokku ja interakteerub membraaniga ja difundeerub läbi membraani. 3. Millised elemendid peavad olema eukarüootses ekspressioonivektoris? Loomarakkudele mõeldud ekspressioonivektor (plasmiid) sisaldab: 1.komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (prokarüootset replikatsiooni alguspunkti, antibiootikumi resistentsusgeeni); 2.kloneerimisala (MCS) erinevate restriktaaside lõikekohad; 3.uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul); 4.reportergeeni (GFP, lutsiferaas, lacZ jt.) või märgise (tag; FLAG, myc, V5, GFP) järjestust. 5.eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust (SV40); 6.selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti. Praktiline töö III Immuunotsütokeemia 1. Mille poolest on erinevad monoklonaalsed ja polüklonaalsed antikehad? Mka reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis, on väga spetsiifilised 2. Mis on epitoop
Nad tunnevad ära lühikesi spetsiifilisi DNA-järjestusi ja lõikavad molekuli katki. On olulised geenide kloonimise seisukohalt. Nende avastamise eest said Hamilton Smith ja Daniel Nathans 1978 Nobeli preemia. 41. DNA kloonimise etapid Uuritava geeni isoleerimine Viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi Amplifikatsoon ehk molekulide paljundamine Uuritava geeniga rekombinantsete kloonide selektsioon. 42. Mis on cDNA? cDNA ehk komplementaarrne DNA on RNA matriitsilt in vitro (katseliselt läbi viidud või katseklaasis toimunud) sünteesitud DNA-molekul. 43. Millised on kloonitud DNA-de kasutusalad tänapäeval? Geenide kloonimise abil saab luua suurt hulka geenide või DNA lõikude koopiaid. Seda kasutatakse Geenianalüüsiks a)geeni funktsiooni välja selgitamine b)geeni omaduste hindamine (nt suurus, kudede jaotus), c) jälgida mutatsioonide toimet geeni toimimisele
Etapp 3. Vektor sisestatakse peremeesrakku, sageli bakterisse või pärmi. Peremeesrakud kopeerivad vektori DNA koos oma DNA-ga, luues sisestatud DNA-st mitu eksemplari/koopiat. Etapp 4. Vektor-DNA eraldatakse peremeesraku DNA-st ja puhastatakse. Mis on rekombinantne valk, selle tootmise võimalused? Rekombinantne valk on valk, mida kodeerib rekombinantne DNA. On DNA kloneerimise teel saadud valk. Selliseid valke saab toota nt bakterite abil või transgeensete loomade abil. Mis on cDNA? cDNA (komplimentaarne DNA) on pöördtranskriptsiooniga saadud DNA koopia. Pöörd-transkriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse mRNA’lt cDNA’d. cDNA’d kasutatakse eukarüootsete geenide kloonimiseks prokarüootsetes organismides. Bakteri rakkudesse geenide viimisel peame me mRNA alusel tegema DNA. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Rekombinantsed valgud on meile väga praktilised, kuna saame neist toota erinevaid ravimeid nt. insuliini.
wall appositions at attack sites of non-adapted powdery mildews, suggesting that AtSYP121 contributes to the timely establishment of pathogen-triggered cell wall reinforcements (Assaad et al., 2004). Besides playing a role during fungal · penetration, SNAREs are also involved in regulation of post invasive de- · fense layers (Zhang et 5. Kokkuvõte · Me oleme klooninud kolme täielikku open reading frame containing cDNA sequences of SNARE genes and analyzed their predicted proteins. · Taken together, this study represents the first systematic analysis of SNARE genes in wheat that provides early evidence of three wheat SNARE homologues to have a vital role in vesicle- mediated plant immunity. · For an understanding of the detailed molecular mechanisms and their exact role in wheat defense to leaf rust more detailed studies are needed.
c) Isokaudomeerid 15. Leidke iga järgneva eksperimendi jaoks allpool toodud meetoditest sobiv a) Mutatsiooni analüüsimiseks uuritavas DNA-s - kasutatakse alleelspetsiifilist PCR-i b) Teatud geeni ekspressioonitaseme hindamiseks - eraldatakse mRNA ja tehakse Northern blot c) Ekspressiooni klonoteegi (raamatukogu) analüüsiks, et leida meid huvitavat valku kodeeriv kloon - tehakse nailonfiltrile kantud bakterikolooniate Western blot d) cDNA klonoteegi (raamatukogu) valmistamiseks - sünteesitakse mRNA pealt DNA ja sisestatakse vektorisse 16. Mutatsioonanalüüsil allele-spetsiifilise hübridisatsiooni abil asub alleeli eristav nukleotiid alleel- spetsiifilise oligonukleotiid proovi a) Keskel b) 3' otsas c) Ühe koodoni kaugusel 3' otsast d) 5' otsas 17. Kui soovite sisestada DNA-sse teatud mutatsiooni PCR-i reaktsiooni käigus, siis millises PCR-i praimeri otsas võite antud muudatuse teha:
Plasmiidid on väiksed rõngasjad bakteriaalsed DNA molekulid, mis replitseeruvad bakterikromosoomist eraldi. Etapid: Uuritava geeni isoleerimine, fragmentatsioon- valitud lõigu eraldamine DNAst Viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi (kloonimisvektor), ligeerimine Amplifikatsioon- DNA molekulide paljundamine Uuritava geeniga rekombinantsete kloonide selektsioon 42. Mis on cDNA? cDNA ehk komplementaarne DNA on RNA matriitsilt in vitro sünteesitud DNA molekul. In vitro on bioloogilise protsessi katseline läbiviimine või vaatlus organismiväliselt, katseklaasis. Isoleeritakse avalduvate geenid mRNA ning sünteesitakse pöördtranskriptaasiga komplementaarne DNA koopia ehk cDNA, selle kogu sisaldab vaid funktsioneerivate geenide kodeerivaid järjestusi. Viiakse läbi enne kloneerimist. 43
puhvrit EDTA-ga. 99. DNAd saab edasi kasutada genotüüpiseerimiseks, mingite lõikude amplifitseerimiseks, kloneerimiseks jne. 100. 101. RNA eraldamine imetajarakkudest 102. RNA eraldamiseks kasutatakse tänapäeval enamasti spetsiaalseid komplekte ehk kitte. Kasutatakse ka vedelat lämmastikku. RNA eraldamisel on väga oluline hoida puhtust, sest RNAaase on peaaegu igal pool ja RNA laguneb suhteliselt kergesti. 103. RNAd kasutatakse enamasti cDNA sünteesiks ja seda omakorda amplifitseeritakse, et määrata erinevate mRNA-de ekspressioonitasemeid rakkudes. 104. 105. Valkude eraldamine imetajarakkudest 106. Valkude eraldamiseks lüüsitakse rakud pehmemates tingimustes kui DNA eraldamisel. Lüüsipuhver peab sisaldama puhverdavaid aineid, mis hoiavad pH enam-vähem neutraalse (Tris-HCl, HEPES-NaOH), NaCl osmootse tasakaalu säilitamiseks (100-500 mM), detergenti
Suurim inimese geen on düstrofiini (lihasrakkude valk) geen, sisaldab 2,4 milj aluspaari. Geenide arv genoomis Arabidopsis'el on ~20 000, inimesel 27000-32000. 1 Need arvud näitavad, et enamik DNA-st tuumas ei ole transkribeeritav (vastavat mRNA-d ei sünteesita). Näiteks taimede Arabidopsis thaliana genoomi suurus on ~7x107 aluspaari, Fritillaria assyriaca 1011 bp, aga cDNA (mRNA-lt pöördtranskriptaasiga saadud DNA) suurus on peaaegu ühesugune. See näitab, et mõlemad genoomid kodeerivad sama arvu geene kuigi genoomi suurus erineb neli suurusjärku. Järelikult erinevus genoomi suuruses põhineb mittekodeerivatel korduvatel DNA järjestustel. (50% maisi genoomist on retrotransposoonid). Inimese haploidne genoom sisaldab ~3,2x109 aluspaari, mis on jaotatud 23 kromosoomi vahel. Keskmine kromosoomi pikkus ~108 bp. Suurem osa tuuma DNA-st on vajalik
kloneerimiseks jne. RNA eraldamine imetajarakkudest RNA eraldamiseks kasutatakse tänapäeval enamasti spetsiaalseid komplekte ehk kitte. Võib kasutada ka Trizol vms. reagenti, mille põhimõte on RNA ekstraheerimine guanidiin- isotiotsüanaadi ja fenool-kloroformiga. Kasutatakse ka vedelat lämmastikku. RNA eraldamisel on väga oluline hoida puhtust, sest RNAaase on peaaegu igal pool ja RNA laguneb suhteliselt kergesti. RNAd kasutatakse enamasti cDNA sünteesiks ja seda omakorda amplifitseeritakse, et määrata erinevate mRNA-de ekspressioonitasemeid rakkudes (qPCR). Valkude eraldamine imetajarakkudest Valkude eraldamiseks lüüsitakse rakud pehmemates tingimustes kui DNA eraldamisel. Lüüsipuhver peab sisaldama puhverdavaid aineid, mis hoiavad pH enam-vähem neutraalse (Tris-HCl, HEPES-NaOH), NaCl osmootse tasakaalu säilitamiseks (100-500 mM), detergenti
46. DNA kloneerimise etapid. 1)DNA lõigatakse restriktaasi abil fragmentideks ja segatakse bakterite plasmiididega, mis on lahti lõigatud sama restriktaasiga 2)Iga plasmiid ühineb võõra fragmendiga. Ligaasi toimel ühinevad ahelate otsad 3)Bakterid võtavad rekombinantsed plasmiidid endasse, saadakse kloonbakterite kogumid 4)Kolooniad eraldatakse. Siiratud fragment(DNA) paljuneb koos bakteritega, saadakse DNA-pank. 47. Mis on cDNA? Kodeeriv DNA e eksonid. Paiknevad eukarüootide geenis vaheldumisis intronite e mittekodeerivate aladega. Neis oleva nukleotiidijärjestuse alusel järjestat ribosoomis aminohapped sünteesitavasse valgumolekuli. In genoomis on cDNAd ainult 2%. 48. DNA sekveneerimise põhimõte. Sekveneerimine on DNA nukleotiidse järjestuse kindlakstegemine. 49. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest? 50. Polümeraasi ahelreaktsioon
See protsess toodab integreerimiseks vajalikud enhancer- ja promootorjärjestused transkriptsioooni reguleerimiseks. DNA-koopia genoomist on seega suurem kui algupärane RNA. RT on vigadealdis. HIVi RT teeb ühe vea 2000 bp kohta, 5 viga genoomi kohta (9000 bp). Selline geneetiline tasakaalutus vastutab uute tüvede tekke eest ühe inimese haiguse jooksul ja võib muuta patogeensust, päästa immuunvastuse eest. Kaheahelaline cDNA kantakse tuuma, splaissib peremehe kromosoomi viirus-kodeeritud virioni pakitav ensüüm integraas. Integratsiooniks on vaja, et rakk kasvaks, aga HIVi ja teiste lentiviiruste cDNA võib tuuma ja tsütoplasmasse integreerimata rõngas-DNAna jääda, kuni rakk aktiveerub. Pärast integreerumist transkribeeritakse viiruse DNAlt kui raku geenilt peremehe RNA polümeraas II poolt, tekib täispikkusega RNA, milles lihtsatel retroviirustel on gag, gag-pol või env geenijärjestused
BIOKEEMIA III TESTIKS | Mihkel Heinmaa YAGB22 | TTÜ kevad 2010 XX FOTOSÜNTEES 1. Kloroplasti ehitus. Tülakoidid on volditud struktuurid, nn lamellid, mis kokku pakituna moodustavad graani. Lahustuv on kloroplastist on strooma. Tülakoidvesiikulite sisu nim tülakoidruumiks või luumeniks. Valgusreaktsioonid toimuvad tülakoidmembraanis. Pimedusreaktsioonid stroomas. 2. Valguseaktsioonides püüavad fotosünteesivad rakud päikese valgusenergiat ja muudavad selle keemiliste sidemete energiaks NADPH kui redutseerija ja ATP kui energiakandja vormis, eraldub hapnik. + + 2 H2O + 2 NADP + x ADP + Xpi O2 + 2 NADPH + 2 H + x ATP + x H2O Pimereaktsioonides e süsinikufikseerimise reaktsioonides kasutatakse NADPH kui redutseerijat...
otsekui mõni suur puu või kirikutorn maastikupildis. Külvandu poole kõnnin juba õige kergel sammul. Teispool seljandikke kuuldub veel üht händkakku, taevas siravad loendamatud tähed. Aeg-ajalt seisatan kuulama vaikust ja ses vaikuses oleks nagu kevadeöö hingus kuuldamatu ja ometi siinsamas, nii vahetu. MU 1985. AASTA märkmikus leidub punasega tehtud ülestähendus: 13.-14. mail heliplaatide kokkumäng. Need olid kolm LPd, mille koondvariant ilmus CDna möödunud aasta jõulude eel, seega tosin aastat hiljem. Heliplaadid olid koostatud, kaks neis metsalindude häältest, kolmas ja minu arust huvitav ning terviklik kogu Eesti konnade ja kärnkonnade häälitsustest, ainult et... ilma mudakonnata. Tuli kõne alla üksainus võimalus: minna kohe Piirissaarele, kus see liik teadaolevalt kindlasti olemas oli. Sõitsin oma varustusega Tartusse, sealt lendasime juba üheskoos huvitavast
Dominantsus - domineerimine ehk ühe tunnuse prevaleerumine tunnusepaaris teise üle · Näide: silmade värv Retsessiivsus - ühe tunnuse varjuvus tunnusepaaris heterosügootse genotüübi puhul; tunnuse avaldumine ainult homosügootsuse (aa) korral. Fenotüüp - indiviidi (morfoloogiliste, füsioloogiliste, keemiliste, etoloogiliste, arenguliste) tunnuste kogum Genotüüp - indiviidi kogu geneetiline informatsioon, mis koostoimes keskkonnatingimustega määrab tema fenotüübi Homosügoot - lookustes on identsed alleelid · Homosügoot retsessiivse tunnuse osas (aa) · Homosügoot dominantse tunnuse osas (AA) Heterosügoot - diploidse või polüploidse indiviidi genotüübi seisund, kus homoloogiliste kromosoomide samas lookuses asuvad erinevad alleelid (nt. Aa). Kromosoom - eukarüootse organismi genoomi struktuurselt individuaalne element, milles asuvad lineaarses järgnevuses ja kindla paiknevusega geenid ning mitmesugused mittegeensed nukleotiidijärjestus...
Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud (muundatud) rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 1012 identset viiruse või plasmiidi DNA molekuli. Sama koefitsendiga paljundatakse ka rekombinantset DNAd. 4.Rekombinantsete DNA kloonide eraldamine. Selektiivsöötmel kasvatatud kloonidest eraldatakse rekombinantne (milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA fragmendid) DNA. 41. Mis on cDNA? RNA matriitsilt in vitro (katseklaasis kunstlikult loodud ja kindlalt määratletud tingimustes) sünteesitud DNA-molekul. 42. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Luuakse mudelhiired, et nende peal katsetades leida ravimeid erinevatele haigustele, võimalik on säilitada hävimisohus olevaid liike, toodetakse valke, uuritakse geeni struktuuri, huvipakkuvaid DNA fragmente saab uurimiseks lõputult paljundada,
7. Rekombinantide analüüsimine Rekombinantne DNA – DNA molekul, mis on kunstlikult kokku pandud mitest erinevast DNA fragmendist, mis pärinevad sageli erinevatest organismides. Selle DNA tegemise eesmärgiks luua DNA molekul, mida vabas looduses ei leidu ja millel on mingid uued omadused. Selle kombineerumine on võimalik, kuna kõikidel organismidel on DNA keemiline struktuur täpselt sama ja nende DNA erineb vaid nukleotiidse järjestuse poolest. 42. Mis on cDNA? Ehk komplementaarne DNA, mis on sünteesitud üheaheliselt RNA-lt (pöördtranskriptaas). Selle süntees on oluline etapp eukarüootsete geenide kloonimisel. 43. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? 1. Saab uurida mingi geeni tegelikku funktsiooni e saab näha, millised muudatused kutsutakse rakus esile, kui sisseviidud geeni pealt hakatakse sünteesima valku. 2. Rakendusliku poole pealt on võimalik panna rakke sünteesima kloonitud geeni poolt
BIOKEEMIA KONSPEKT I ATP (adenosiintrifosfaat) ja NADPH (taandatud nikotiinmiidadeniindinukleotiid- fosfaat) on energiarikkad e. makroergilised ühendid. Makroergiliste molekulide reageerimisel teiste biomolekulidega vabaneb energia, mille arvelt toimuvad mitmed energeetiliselt ebasoodsad protsessid (biosüntees, liikumine, osmoos). MOLEKULAARNE HIERARHIA: Anorgaanilised eellased CO2, H2O, NH3, N2. Metaboliidid püruvaat,tsitraat, suktsinaat Monomeersed ehituskivid aminohapped, nukleotiidid, monosahhariidid, rasvhapped, glütserool Makromolekulid valgud, nukleiinhapped, polüsahhariidid, lipiidid. Supramolekulaarsed kompleksid ribosoomid, tsütoskelett Organellid tuum, mitokondrid, kloroplastid. ELUSLOODUSE HIERARHIA: Molekul väikseim iseseisev osake Makromolekul kovalentsete sidemete abil lihtsatest molekulidest konstrueeritud biomolekul. Organell re...
Epitope tagging – märgitud liitvalkude (fusion proteins) tehnoloogia. Liidesega valk ehk liitvalk (näiteks lisatakse uuritvale valgule – täpsemalt seda kodeerivale dna-le fluorestseeruva valku nagu green fluorscent protein - gfp kodeeriv dna või peptiide järjestuse (kuni 8-12 aminohapet, nt flag, muc, v5, e2 (tartus välja töötatud!) Dna, nende tag’ide äratundmiseks on olemas kommertsiaalselt saadaval antikehad. Niisugust ‘’tägitud’’ valku kodeeriv cdna viiakse tootmiseksbakteri- või eukarüootsetesse rakkudesse. Epitoop –immunoloogias see osa (uuritavast) valgust, mida (spetsiaalselt katseloomas toodetud) spetsiifiline antikeha (ka valk) ära tunneb. Transgeensete/ geneetiliselt muundatud organismide tootmine ja kasutamisvõimalusi. Transgeensed organismid ehk GMO-d ehk geneetiliselt muundatud organismid on elusolendid, sh. taimed ja ka nendest saadud tooted, nt. loomasööt, kelle pärilikkuse ainele
Veidi täpsemalt: HIV kinnitumine ja rakku tungimine toimub gp120 ja gp41 abil ning märklaudraku pinnal asuvate CD4 ja kemokiini retseptorite kaudu. HIV infitseerib T-rakke, makrofaage ja dendriitrakke. Viiruse partikkel seostub CD4 ja koretseptoriga T-rakul Viiruse ümbris sulandub rakumembraaniga, lastes viiruse genoomil rakku siseneda Pöördtranskriptsioon kopeerib viiruse RNA genoomi topeltahelaliseks cDNA-ks Viiruse cDNA siseneb raku tuuma ja integreerub peremeesraku DNA-ga T-raku aktivatsioon indutseerib madalatasemelist proviiruse transkriptsiooni RNA transkriptid paljundatakse ja seotakse, saab toimuda varajaste geenide tat ja rev translatsioon Tat amplifitseerib viiruse RNA sünteesi, rev indutseerib üksikult seotud või mitteseotud viiruse RNA transporti tsütoplasmasse
kontsentratsiooni hästi kõrgeks. Valmistati plasmiidid, mis koosnesid -globiini geenist koos ja ilma 366-aluspaarise lõiguga SV40 DNAst. Need plasmiidid transfekteeriti rakkude kultuuri ja iga tekkinud RNA hübridiseeriti -globiini DNA prooviks (1, 2). Rakkude poolt sünteesitud -globiini mRNA kogus transfekteeriti ühte plasmiidi või teist töödeldi S1 nukleaasi kaitse meetodiga (3). Restriktsiooni lõigu proov, mis oli saadud -globiini cDNA kloonist, oli komplementaarne 5' otsale -globiini mRNA-s. 5'ots proovis märgistati 32P (punane täpp). -globiini mRNA kaitstud proovi hübridiseeriti ~340-nukleotiidine lõik, mida oli lagundatud S1 nukleaasiga, mis lagundab üksikahelalise DNA, aga mitte RNA-DNA hübriidi. Autoradiograafia elektroforeesitud S1-kaitstud lõikudest (4) näitas, et rakud, mida oli transfekteeritud plasmiid 1-ga (1. rida) tootsid palju rohkem -globiini mRNA-d kui need, mida oli transfekteeritud plasmiid 2-ga.
1. PPT 1. Geeniused ja geenid geen (ingl. Gene): Spetsiifilise bioloogilise funktsiooniga geneetiline determinant. Pärilikkuse ühik, mis asub kromosoomi kindlas punktis (lookuses). DNA segment, mis kodeerib mingit kindlat RNA-d ja mRNA kaudu kindlat polüpeptiidi ning mida saab eksperimentaalselt eristada cis- trans- või komplementatsioonitestiga. Geenius: harukordselt andekas inimene, suurvaim. Geenius on see, kes on suutnud oma päriliku potentsiaali ideaalselt hästi realiseerida. 2. Autismi geneetiline alus autism (ingl. Autism) Endassesulgumus, lapsepõlves ilmnev psüühikahäire, esineb ka täiskasvanuil. Põhjuseid otsitakse geenidest, sünniprotsessist, loote- kui ka beebieast. Milles ollakse kindlad on see, et antud häiretel on bioloogiline alus ning et lastevanemate kasvatusmeetodid ei põhjusta lapsel seda häiret. Erinevate uuringu...
HIV infektsioon nõrgendab ka humoraalset immuunsust ja immunoloogilist mälu. Mikroobid ei vallanda organismis adekvaatset immuunreaktsiooni. AIDS on omandatud immuunpuudulikkuse sündroom. AIDS ehk HIV-tõbi on HIV-nakkuse lõppfaas. AIDSi väljakujunemisel on inimese kaitsesüsteemi töö tugevasti häiritud ning organism muutub väga vastuvõtlikuks kõikvõimalikele haigustekitajatele. HIV-1 väliskeskonnas ebastabiilne. Kandub üle: verega otse. Proviiruse cDNA integreerub tuuma ja võib jääda pikaks ajaks latentsesse seisu. AIDS areneb välja siis kui CD4 T-rakke on jäänud 10 korda vähem algsest. Päris nakatumise algul toimub viiruse kiire paljunemine. Viirust aktiveerivad kõik aktivaatorid, mis aktiveerivad CD4 T-rakke: 1)seondumine AG-le; 2)tsütokiinid; 3)PAB aktivaatorid. Algul sünteesitakse põhiliselt regulatoorseid valke, alles lõpus tehakse pakkimiseks vajalikud valgud ja peremeesrakk lüüsitakse
genoomist. • Transponeerivad elemendid on DNA järjestused, mis suudavad ühe raku piires genoomis ümber paigutuda ehk transponeeruda. Jagunevad retrotransposoonideks ja DNA transposoonideks. DNA transposoonid moodustavad u 3% inimese genoomist. Töötavad cut and paste mehhanismil, ehk ühest piirkonnast lõigatakse välja ja liiguvad teise piirkonda. Retrotransposoonid töötavad copy and paste mehanismil, kus pöördtranskribeeritakse RNA ja selle cDNA koopia inserteerub uude saiti genoomis. Esmalt transkribeeritakse DNAlt RNA, saadud vahevormi kasutatakse koopiaaru suurendamiseks. Seejärel moodustatakse pöördtranskriptaasiga RNAst tagasi DNA ning see siseneb uude positsiooni genoomis. Retrotransposoone on kahe tüüpi: pikkade otsmiste kordusjärjestustega (LTR) ja LTR puuduvad. LTR puudulikud jaotatakse LINEdeks ehk pikkadeks genoomi sisenenud elementideks ja SINEdeks ehk lühikesteks genoomi sisenenud
Comparing these profiles can help us informative allelic variants and the misleading single mutated to assess which specimens are similar enough on a genetic level to copies, to achieve reproducible findings. For this reason, a small be used together for one analysis e.g. for separating an enzyme of number of cloned sequences may not suffice to describe the whole interest or compiling a cDNA library. complement of the genome and there is no guarantee that these few sequences are actually the most prominent and true Materials and Methods descriptors for the individual studied. To overcome this problem, the allelic variants obtained should be quantified (either in the Sample collection and gemmule culture
immuunreaktsiooni. AIDS on omandatud immuunpuudulikkuse sündroom. AIDS ehk HIV-tõbi on HIV- nakkuse lõppfaas. AIDSi väljakujunemisel on inimese kaitsesüsteemi töö tugevasti häiritud ning organism muutub väga vastuvõtlikuks kõikvõimalikele haigustekitajatele (ka sellistele, mida terve kaitsesüsteemiga inimesed haruharva põevad ja mille põhjustajateks on suhteliselt ohutud bakterid, seened jm). HIV-1 väliskeskonnas ebastabiilne. Kandub üle: v erega otse. Proviiruse cDNA integreerub tuuma ja võib jääda pikaks ajaks latentsesse seisu. AIDS areneb välja siis kui CD4 T-rakke on jäänud 10 korda vähem algsest. Päris nakatumise algul toimub viiruse kiire paljunemine. Viirust aktiveerivad kõik aktivaatorid, mis aktiveerivad CD4 T-rakke: 1)seondumine AG-le; 2)tsütokiinid; 3)PAB aktivaatorid. Algul sünteesitakse põhiliselt regulatoorseid valke, alles lõpus tehakse pakkimiseks vajalikud valgud ja peremeesrakk lüüsitakse
mikroobe nendest, millel plasmiide ei ole (tavaliselt mingi antibiootikumi suhtes resistentsuse geen, nii et saame antibiootikumiga söötmel kasvatada vaid plasmiidiga mikroobe). Unikaalne restriktsiooni sait, see tähendab, et ei tohi olla rohkem kui üks koht, mis lõigatakse läbi restriktsiooni ensüümiga. Siis saab sinna panna sama ensüümiga läbi lõigataud DNA lõigu. Mingi marker, millega saab eristada inserdiga plasmiide, mitte rekombinantsetest (näit. lacZ geen). Milleks cDNA raamatukogu kasutatakse: 1. Isoleerida ja järjestada geene, mis kodeerivad valku 2. Võrrelda eri organismide homoloogseid järjestusi 3. Määrata mRNA hulka ja geeni ekspressiooni taset rakus Restriktsioon analüüs: Geeni struktuuri määramiseks; piiranguks on restriktsiooni saitide olemasolu ja restriktaaside valik. RFLPs on väga oluline analüüs nii kriminalistikas kui
stressifaktoritele. Kromosomaalsete liitjärjestuste tekkimine võib viia märklaudgeeni aktiivsuse pärssimisele. Reportergeeni poolt kodeeritud valk võib rakus ka ise stressi indutseerida. 3. Geenikiibid (gene chips, microarrays). Tahkele kandjale viidud DNA järjestused pärinevad organismi erinevatest geenidest ning neile hübridiseeritakse rakkudest eraldatud totaalsele mRNA-le sünteesitud cDNA proov. Sel viisil võrreldakse erinevate mRNA-de ekspressioonitaset bakterirakus nii erinevate stressitingimuste korral kui ka teatava regulaatori olemasolu või puudumise või üleekspressiooni korral. Seda meetodit on hea rakendada organismide puhul, kelle genoomi primaarjärjestus on teada. 4. Translatsiooni liitjärjestused. Bakterirakus mõõdetud mRNA hulk ja sellelt sünteesitud valgu hulk ei ole üks-üheses vastavuses
1 Escherichia coli ; A E. coli genetic engineering 3 max 2 amino acid sequence (of HGH), known / analysed ; 3 gene coding for HGH synthesised ; 4 using, triplet code / genetic code ; OR 5 mRNA (coding for insulin) from beta cells ; 6 use reverse transcriptase ; 7 synthesise cDNA ; 5 plasmid (vector) ; 6 cut using restriction (endonuclease) enzyme ; 7 ref to gene and plasmid mixed with (DNA) ligase ; 8 (recombinant) plasmid introduced into, bacterium / bacteria ; AW large scale production 4 max 9 genetically engineered / recombinant bacteria ; 10 grown in fermenter / fermentation, qualified ;
Reportergeeni poolt kodeeritud valk võib rakus ka ise stressi indutseerida. Näiteks, kui kasutada reporterina GFP-d (green fluorescent protein) kodeerivat geeni, võivad rakus indutseeruda kuumashoki geenid. Kuumashoki vastuse kutsub esile GFP aeglane voltumine rakus. 3. Geenikiibid (gene chips, microarrays). Tahkele kandjale viidud DNA järjestused pärinevad organismi erinevatest geenidest ning neile hübridiseeritakse rakkudest eraldatud totaalsele mRNA-le sünteesitud cDNA proov. Sel viisil võrreldakse erinevate mRNA-de ekspressioonitaset bakterirakus nii erinevate stressitingimuste korral kui ka teatava regulaatori olemasolu või puudumise või üleekspressiooni korral. Seda meetodit on hea rakendada organismide puhul, kelle genoomi primaarjärjestus on teada. Praegu rakendatakse seda meetodit paljudes suurtes uurimiskeskustes, et luua infobaas erinevatel tingimustel üles või alla reguleeritavatest geenidest. 4. Translatsiooni liitjärjestused
annaabi.ee 
Sisene Facebook'ga
Sisene Google'ga
Sisene LinkedIn'ga
