LIISI KINK 1 VIROLOOGIA Grupp III dsRNA viirused Ehkki kõik need viirused erinevad, lisaks erinevate peremeesorganismide kasutamisele, teineteisest oluliselt ka genoomide ning virionide organisatsiooni poolest, leidub nende elutsüklites küllalt palju ühiseid jooni. 1. SUGUKOND BIRNAVIRIDAE Birnaviirustel on kahest segmendist koosnev dsRNA genoom, mille ahelate 5'-otstes asub kovalentselt kinnitunud genoomiga seotud valk (VPg, terminaalne valk) ning seetõttu
BAKTERIOFAAGID ssRNA bakteriofaagid Ph. Leviviridae G. Levivirus MS2 G.Allolevivirus Qbeeta dsRNA bakteriofaagid Ph. Cystoviridae phi6 Isomeetrilised ssDNA bakteriofaagid Ph. Microviridae G. Microvirus phiX174 Niidikujulised ssDNA bakteriofaagid Ph. Inoviridae G. Inovirus Ff faagid Lüütilised dsDNA bakteriofaagid Ph. Podoviridae T7 (T7-sarnased faagid) Ph
Fire ja Mello avastasid RNA interferentsi. RNA interferentsis on kahte tüüpi RNA molekule – mikroRNA ja siRNA . Need eelnimetatud väiksed RNA-d võivad seonduda teistele RNA-dele , tõstes või alandades nende aktiivsust, näiteks seondudes mRNA-le, takistavad nad sellelt toimuva translatsiooni ehk valgusünteesi. RNAi rada leidub paljudes eukarüootides, kaasa arvatud kõrgemates hulkraksetes loomades , ning mida alustab ensüüm Dicer. Dicer lõikab pika kaheahelalise RNA ehk dsRNA molekulid väiksemateks umbes 20 nukleotiidi pikkusteks fragmentideks, mida nimetataksegi siRNA-ks. Iga siRNA hargneb lahti kaheks üheahelaliseks RNA-ks (ssRNA): guide-ahelaks ja passenger ehk anti-guide-ahelaks. Passenger-ahel lagundatakse, kuid guide-ahel kuulub RNA- indutseeritud geenivaigistamiskompleksi (RISC). Selle enim uuritumaks tulemiks on post-transkriptsiooniline geenivaigistamine . See ilmneb
M-saidiga seondunud replikaasi aktiivtsenter asub kontaktis genoomi 3’- otsaga. Seega on replikatsiooni initseerimiseks oluline pigem RNA ruumiline struktuur. Kuna replikatsioon initseeritakse G-jäägi liitumisega siis arvatakse, et selleks on oluline EF- Tu. Replikatsiooni käik RdRp sünteesi kiiruseks on umbes 35 b/sekundis. Replikatsiooni esimeseks etapiks on vaba negatiivse polaarusega RNA süntees, dsRNA-d ei teki. Tavaliselt toimub ühelt positiivselt RNA ahelalt mitu järjestikust negatiivse ahela sünteesi initseerimist. Süntees lõpeb ühe täiendava A-jäägi lisamisega minus ahela otsa. Kuna pluss ahel algab G- jääkidega (pppGpGpGp…) siis on negatiivse ahela 3’ otsas järjestus CCCAoh. Positiivse polaarsusega RNA de süntees erineb negatiivse polaarsusega RNA sünteesist, on lihtsam ja efektiivsem ning sõltub RNA 5’- ja 3’-otstes
Eukarüootsete organismide genoomiprojektid (pärmid, eelloomad, hulkraksed) Pärmid: *Esimesena sekveneeritud eukarüoot Saccharomyces cerevisiae -pagaripärm (1996 a., 14 Mb, 16 kromosoomi, lisaks plasmiidid ja dsRNA viirused). Umbes 6340 geeni, 7% kodeerib mittetransleeritud RNA-d. Valke kodeerivaid ORF-e 5773 (25% nendest iseloomustamata). Geenide pikkus ca. 1.5 kb. Geenide kaugus ca 2 kb. Genoom väga kompaktne. Kromosoomides funktsionaalsed elemendid ARS, TEL, CEN. 2002 a. Schizosaccharomyces pombekäärituspärm, genoom. 13.8 Mb. 4940 valke kodeerivat geeni e. 57% genoomist. Sarrnasem kõrgemate eukarüootidega kui S.cerevisiae. *Erinevused intronite arvus (S.cerevisiae275 e. 5%, S
olla üsna keerulise ehitusega. Mõnikord ümbritseb nukleokapsiidi veel peremeesraku rakumembraanist lipiidkest. 14. Nimeta RNA ja DNA viiruseid. DNA viirused klassifitseeritakse enamasti neis sisalduva DNA koostise järgi üksikahelaga DNA viirusteks ja kaksikahelaga DNA viirusteks (herpesviirus, papiloomviirus). RNA-viirused on viirused, mille genoomiks on RNA. Mõnede viiruste genoom on üheahelaline RNA (ssRNA), teistel kaheahelaline RNA (dsRNA). Üheahelaline RNA on kas pluss-ahelaline või miinus-ahelaline. Leidub ka viiruseid, mille genoom on osaliselt pluss- ahelaline ja osaliselt miinus-ahelaline. Neid kutsutakse ambisense-viirusteks. 15. Viirustel eristatakse lüütilist ja lüsogeenset elutsüklit. Lüütiline tsükkel Viirus sisestab peremees-rakku oma genoomi Peremeesraku ainevahetus korraldatakse ümber Peremeesrakus paljun-datakse viiruse genoom ja toodetakse viirusvalgud
Northern Blot - Testib, kas mRNA on taimes olemas ja et transkriptsioon toimib korrektselt mRNA eraldatakse, kantakse filterpaberile. Radioaktiivse sildiga DNA proov seob mRNA külge ja on nähtav. Western Blot - Testib valgu olemasolu Valgu proovid eraldatakse transgeensetest taimedest, denatureeritakse ja kantakse membraanile. Prooviks on antikehad, mis tunnevad ära eesmärk valgu. siRNA - RNA vaigistamine (RNA silencing) on mitme etapiline protsess, misläbi kaksikahelaline RNA (dsRNA) töödeldakse valgu Dicer poolt nii, et tekivad lühikesed RNA dupleksid. Need väikesed RNAd järgnevalt seonduvad valguperekonnaga Argonaute. Tulemuseks on geeni vaigistamine. siRNA ja miRNA loomisel Dicer või Dicerisarnased (DCL) valgud lõikavad pikad dsRNA (kaksikahelaline RNA) või tagasivolditud (linguvõi juuksenõela-kujuline) RNA väikesteks ~ 21 25 nt fragmentideks siRNA-d kaitsevad genoomi: · Löövad tagasi sissetungivad viirused · Vaigistavad ,,hälvik-transkripte
Taime rakkude vahel on poorid, miskaudu toimub reguleeritud ainete transport. Vaigistamine levib süsteemselt niinerakkude (floeem) kaudu. Viirustel on valgud, mis suruvad alla RNA vaigistamise. RNA vaigistamise häirimisega saab viirus häirida taime viiruskaitse mehhanismi. Häirijad-valgud võivad olla aktiivsed igas faasis. Transgeenide vaigistamine Taime viidud transgeenid on sageli siRNA poolt vaigistatud Vaigistamise lülitab sisse: Väga kõrge ekspressiooni tase dsRNA, mis tekib transgeenilt Hälvik RNA-d, mida transgeen kodeerib Transgeene vaigistatakse post-transkriptsionaalselt ja ka transkriptsiooni ajal. 1980-tel lõid teadlased meetodi, et viia geene taime genoomi, kasutades taime patogeeni Agrobacterium tumefaciens (bakter). Sisestatud geene kutsutakse transgeenideks. Kalkooni süntaas on ensüüm, mis on oluline antotsüaanide biosünteetilise raja alguses. Fenomen, kus mõlemad geenid (transgeen ja oma geen) on vaigistatud, nimetatakse `koos-
Viiruse nukleiinhapet ümbritseb valkate – kapsiid, millel loomaviiruste puhul on ka ümbris (envelope) Viiruse genoom on kas üksikahelaline või kaksikahelaline : dsDNA – bakteriofaagid T4 ja lambda, papilloomiviirus ssDNA – bakterifaag M13, parvoviirused (koinfektsioon adenoviirustega) dsRNA – reoviirused (hingamisteede haigused) ssRNA – gripiviirus, HIV Mõnedel viirustel on genoomiks RNA Tubaka mosaiigiviirus TMV Gripiviiruse genoom koosneb mitmest ssRNA segmendist HIV on retroviirus – tema genoomiks on ssRNA, millelt pöördtranskriptaas sünteesib DNA Viiruse kapsiid on sümeetriline – helikaalne või ikosaeedriline
bakterirakkude lüüsi. Viriooni ehitus. Viiruspartikkel sisaldab nukleiinhapet, mis kodeerib viirusspetsiifilisi valke. Viiruse geneetiliseks materjaliks on kas DNA või RNA molekul. Eristatakse üksikahelalise (ss -single strand) ja kaksikahelalise (ds - double strand) genoomiga viirusi. dsDNA viirused on näiteks loomaviirustest papilloomiviirus ning bakteriofaagidest T4 ja lambda faag; ssDNA genoomiga on bakteriofaag M13. Reoviiruste (põhjustavad hingamisteede haigusi) genoomiks on dsRNA. ssRNA genoomiga viiruste näiteks võib tuua retroviirused, näit. HTLV, mis põhjustab leukoosi ja HIV, mis põhjustab AIDS-i. Retroviiruste genoomiks on ssRNA molekul. Pärast raku nakatamist retroviirusega sünteesitakse rakus viiruse RNA-le komplementaarse dsDNA. DNA sünteesi viib läbi pöördtranskriptaas e. revertaas, mis on viiruse poolt kodeeritud ja on valmiskujul olemas juba viiruspartiklites. dsDNA integreerub raku genoomi viiruse poolt kodeeritud integraasi abil
Eukarüootides sünteesitakse rRNA tuumakeses RNA polümeraasi I poolt. Valgusünteesiks (translatsiooniks) vajatakse kolme komplementaarse funktsiooniga nukleiinhapet: mRNA kannab koodonitena informatsiooni valgu primaarjärjestuse kohta; tRNA identifitseerib koodi ja toob ribosoomi koodile vastava aminohappe ; rRNA assotsieerub ribosoomi valkudega moodustades ensüümkompleksi, mis otseselt sünteesib peptiidsideme. 53. miRNA ja siRNA vahe tuleneb nende päritolust: siRNA pärineb dsRNA-st; siRNA on kõige tavalisemalt vastus võõrale RNA-le ja on tihti 100% täiendav(komplementaarne) sihtmärgile. miRNA pärineb ssRNA-st, mis moodustab U-kujulise sekundaarse struktuuri; miRNA reguleerib post-transkriptsionaalset geeni väljendust ja pole sageli 100 täiendav(komplementaarne) sihtmärgile. 54. hnRNP A1 tuumast ekspordi protsess: Lõplikult protsessitud mRNA-5' otsa ning hnRNP valk-kompleks (mRNP) assotseerub "cap"-siduva kompleksiga (CBC), mis läbib
vertikaalselt munade kaudu). GSV replikatsioon aktiveerub putuka hormoonide toimel. Kõige enam on nudiviiruste hulgast uuritud Hz-1 molekulaarbioloogiat. Hz-1 genoom on ca 228 kbp pikkune tsirkulaarne DNA ja see viirus tekitab peamiselt persistentset ja latentset infektsiooni, mida iseloomustab viiruse DNA stabiilne integreerumine peremeesraku kromosoomi. Vetikate viirused Vetikaid nakatavad väga mitmed erinevad viirused, sh. ssRNA, dsRNA, ssDNA ja dsDNA genoomiga viirused. Enim on uuritud suured dsDNA genoomiga viirused. Need viirused kuuluvad sugukonda Phycodnaviridae ja jagunevad mitmesse perekonda: - Chlorovirus (Paramecium bursaria chlorella virus 1 – PBCV1) - Coccolithovirus (Emiliania huxleyi virus 86 – EhV-86) - Prasinovirus (Micromonas pusilla virus SP1 – MpV-SP1) - Prymnesiovirus (Chrysochromulina brevifilum virus PW1, CbV-PW1)
genoomis. Taimede kaksikahelaline RNA indutseerib ka sama järjestust sisaldava genoomse DNA metüleerimist. Viimase mehanism ei ole teada. Selline RNAivahendatud geenimetüleerimise mehanism ei esine imetajatel. RNAi tsütoplasmas toimuv posttranskriptsioonilise geeniekspressiooni regulatsiooni mehhanism, mille käigus kaheahelaline RNA viib komplementaarse mRNA vaigistamiseni siRNA small interfering/inhibitory RNA väike kaheahelaline RNA (21-25 bp), mis saadase dsRNA lõikamisel Dicer ensüümiga ning mis viib komplementaarse mRNA degradatsioonini siRISC kompleksis miRNA microRNA genoomi poolt kodeeritud väikeste (21-23 bp) RNA-de tüüp, mis saadakse stem- struktuuriga prekursos RNA lõikamisel Dicer ensüümiga ning mis viib komplementaarse mRNA translatsiooni inhibitsioonini miRISC kompleksis RISC RNA induced silencing compleks kompleks (160kDa 80S), mis viib läbi siRNA-le või miRNA-le
Seda terminit kasutatakse Drosophila ja Ceanorabditis'e uurijate poolt. Kuna see lühend on RNA vahendatud geeni vaigistamise nähtuse tähistamiseks kasutatavatest kõige lühem, siis eelistan kasutada just RNAi'd. PTGS - post-transkriptsiooniline geeni vaigistamine (silencing). Kasutatakse taimede puhul. Kasutatakse ka lühendit PTGS/RNAi. quelling - sama tähendusega termin Neurospora puhul. (quelling Ingl. k. - lämmatama, maha suruma) dsRNA - kaheahelaline RNA (double stranded) on RNAi oluline vahendaja. RdRP - RNA sõltuv RNA polümeraas suunab RNA sünteesi RNA matriitsi alusel, mille tulemuseks on dsRNA. See ensüüm ei ole RNAi toimumiseks vajalik kui rakus on suur kogus dsRNA'd. RNaas III - dsRNA spetsiifiline endoribonukleaas, mis hürdolüüsib rohkem kui 10 aluspaarise dsRNA fosfodiestersidemed. RNAi puhul toimub pikkade dsRNA'de lagundamine väiksemateks fragmentideks (21-25 aluspaari), mida viivad läbi RNaas III
alandades nende aktiivsust (nt seondudes mRNA-le, takistavad nad sellest toimuva translatsiooni. RNA interferentsil on oluline roll rakkude kaitses parasiitsete geenide vastu, organismi arengu suunamises ja geeniekspressioonis üldiselt. Dicer ja Argonaute : nende valkude funktsioon, olulisemad domeenid ja toimemehhanism Dicer on RNaas III perekonna endoribonukleaas, mis lõikab dsRNA-d and pre- mikroRNA-d lühikesteks 20-25 bp pikkusteks dsRNA-deks (2 bp jääb 3’-otsast üle ulatuma). Dicer koosneb 3 domeenist: 2 RNaas III domeeni ning üks PAZ domeen. Interageerub abivalkudega. Argonaut on RISC kompleksi katalüütiline komponent. Seondab endaga erinevate klasside väikseid mitte-kodeerivaid RNA-sid (miRNA, siRNA, piRNA). Väikesed RNA-d juhivad agronaudi valgud komplementaarsete mRNA-de juurde. Osadel
ülesehitus. Nende n.n. isohooride kompositsioon (G+C hulk) on homogeenne ja erineb teiste omast. L (light), H (heavy). Nukleaarses genoomis esinevad mõned kõrvalekalded universaalsest koodist (nt. Stopp > selenotsüsteiin). 7. Eukarüootsete organismide genoomiprojektid (pärmid, eelloomad, hulkraksed). Esimesena sekveneeritud eukarüoot Saccharomyces cerevisiae - pagaripärm (1996 a., 14 Mb, 16 kromosoomi, lisaks plasmiidid ja dsRNA viirused). Umbes 6340 geeni, 7% kodeerib mittetransleeritud RNA-d. Valke kodeerivaid ORF-e 5773 (25% nendest iseloomustamata). Geenide pikkus ca. 1.5 kb. Geenide kaugus ca 2 kb. Genoom väga kompaktne. Kromosoomides funktsionaalsed elemendid ARS, TEL, CEN. 2002 a. Schizosaccharomyces pombe käärituspärm, genoom. 13.8 Mb. 4940 valke kodeerivat geeni u. 57% genoomist. Sarnasem kõrgemate eukarüootidega kui S. cerevisiae, Erinevused intronite arvus (S. cerevisiae 275 e. 5%, S. pombe 43%),
imetajad. Eri taksonid kasutavad erinevaid geeni vaigistamise mehhanisme. See toimub nii tuumas (taimedes) kui tsütoplasmas. RNAi – RNA interferents – posttranskriptsiooniline geeni vaigistamine, mille käigus 2-ahelaline RNA suunab homoloogse mRNA lagundamist tsütoplasmas. PTGS – post transkriptsiooniline geeni vaigistamine (silencing). Taimede puhul. Kasutatakse lühendit PTGS/RNAi quelling – sama tähendusega termin Neurospora puhul (maha suruma) dsRNA – kaheahelaline RNA – double stranded – RNAi oluline vahendaja RdRP – RNA sõltuv RNA polümeraas suunab RNA sünteesi RNA matriitsi alusel, mulle tulemuseks on dsRNA. Pole RNAi toimumiseks vajalik kui rakus on suur kogus dsRNA-d RNaas III – dsRNA spetsiifiline endoribonukleaas, mis hüdrolüüsib rohkem kui 10 aluspaarilise dsRNA fosfodiestersidemeid. RNAi puhul toimub pikkade dsRNA-de lagundamine väiksemateks fragmentideks (21-25 aluspaari), mida viivad läbi
signaalid pathogen-associated molecular patterns - PAMPs; or pattern recognition receptors, mis seostuvad rakkude pinnal olevate Toll-like retseptoritega. Sellisteks elementideks on sageli rakuseina struktuursed molekulid, mis on omased paljudele bakteritele ja mis on - lipopolüsahhariid (LPS), petidoglükaan jne., ja mis ei ole omased eukarüootsele organismile. Rakulise loomuliku immuunvastuse aktivatsioon. Aktiveeritakse ohusignaali poolt (LPS, dsRNA jne.) omane paljudele patogeenidele. Ohu-signaali vahendab TOLL-like retseptor, mis on pidevalt ekspresseeritud enamuse immuunsüsteemi rakkude pinnal Komplemendi ülesanded Kasulikud toimed peremeesorganismile: opsonisatsioon paremaks fagotsütoosiks; fagotsüütide aktivatsioon; bakterite ja nakatunud rakkude lüüs; AK vastuse regulatsioon; immuunkomplekside eliminatsioon; apotootiliste rakkude eemaldamine. Kahjulikud peremeesorganismile: põletik, anafülaksia.
hulk rakus kõrgem, see võib väljenduda kõrgenenud ensüümiaktiivsuses. Duplikatsioonide analüüsiks kasutatakse sageli translokatsioonidega kromosoome. Proovitakse erinevaid versioone ning mõõdetakse ensüümaktiivsuse järgi, kus geen asub. 41. Millist tüüpi nukleiinhape võib olla päriliku informatsiooni kandjaks? Päriliku informatsiooni kandjaks võib olla kaheahelaline DNA, rõngas DNA, üheahelaline DNA, ssRNA, dsRNA. 42. Eksperimentaalsed tõendid selle kohta, et DNA kannab geneetilist informatsiooni. Sia ja Dawsoni katse: tehti eksperiment kahe bakteritüvega IIR (mitte virulentne, kapslita ning väikesed karedapinnalised kolooniad) ja IIIS (limakapsliga, virulentne, suured karedapinnalised kolooniad). Virulentne IIIS tüvi tapeti kuumaga, pandi kokku elusa IIR tüvega ja töödeldi teatud seerumiga, tulemuseks olid IIIS kolooniad.
transleerimist või kiirendada mRNA degradatsiooni 2. siRNA – väike interfereeriv RNA on lühike kaheahelaline RNA. Neid tekib nii viriaalsete RNAde lagundamisel kuid on ka endogeenseid siRNAde allikaid. 3. piRNA – osaleb transposoonide kaitsel 4. Antisenss-RNA – enamus surub maha geene, kuid mõned võivad olla transkriptsiooni aktivaatorid. Seondub mRNAle, moodustub dsRNA, mille lagundavad ensüümid. 5. CRISPR RNA – paljudel prokarüootidel, moodustavad RNA interferentsile sarnase süsteemi 6. lncRNA • • “Molekulaarbioloogia keskne dogma” • DNA ↔ RNA valk. Ehk DNAst transkribeeritakse RNA ja RNAst transleeritakse valku. Genoomist transkribeeritakse pre-mRNA, mida snoRNA ja snRNAde vahendusel splaissitakse ja protsessitakse, küpsest mRNA transleeritakse
pinnal) TLR-id on 3,7,8 ja 9 ning nad on olulised mikroobide nukleiinhapete äratundmisel. Ekstratsellulaarseteks TLR-ideks on TLR1:2, TLR2, TLR4,TLR5, TLR2:6, retseptoreid stimuleerivad erinevad PAMP-id (pathogen associated molecular patterns), nt TLR5 aktiveerub flagelliini seondades. TLR retseptoreid stimuleerivad veel: gram-negatiivsete bakterite LPS, gram-positiivsete bakterite peptiidoglükaan, bakteriaalsed lipoproteiinid, flagelliin, metüleerimata CpG motiivid, dsRNA jne. TLR signaliseerimisrada: TLR seondab ligandi (milleks on PAMPi sisaldav molekul) TLR molekulide dimeriseerumine adapter proteiinide aktiveerimine (TIR domään sisaldab neid) proteiin kinaaside aktiveerimine transkriptsioonifaktorite aktivatsioon geeni transkriptsioon ekspresseeritakse: põletikulisi tsütokiine (TNF, IL-1, IL-12), kemokiine (IL-8), endoteliaalseid adhesiooni molekule (E- selektiin) jne.
karvarakke. Ehk siis tüvirakud tekitavad ainult epidermi rakke mitte karva rakke. B kateniin nagu lüliti, mis kontrollib millised rakud epiteeli tüvirakkudest tekivad. Wnt signaalidel on samuti stimulatoorsed mõjud rakujagunemisele, neid hoiavad tagasi Wnt raja inhibiitorid nagu DKK ja sFRP. 10. Epigeneetika 83. Milliste mehhanismidega toimub geneetilise info epigeneetiline reguleerimine? RNA interferents – RDR – RNA polümeraas kaheahelaline RNA (dsRNA) → Üheahelalised interfereerivad RNA-d moodustuvad kaheahelaliselt RNAlt (20-30 nukleotiidi). → Nad paarduvad sihtmärk RNAle ja võivad nii põhjustad mitmeid kahjustusi: 1. lõikavad, 2. represseerivad translatsiooni ja sihtmärk RNA destruktsiooni, 3. moodustavad heterokromatiinseid alasid DNA-l, millelt sihtmärk RNA transkribeeritakse. DNA metüleerimine – lisad metüülrühma – algul ei mõjuta, aga metüülrühm on
annaabi.ee 
