välja intronjärjestused, tekib mRNA (järelikult kopeeritakse see eksonitelt). Valkude splaising: pärast translatsiooni korraldatakse ümber peptiidijärjestusi, ka eemaldatakse.Valk valmib lõplikult (mäletatavasti on organismi valgud enamasti veel ka kõrgemat järku struktuuritasemena).Geenitehnoloogia meetodeid:1.rakkudesse võõrgeeni sisseviimine2.geeni avaldumiseefektiivsuse muutumine3.nn knock-out-meetod e geeninokaut4.kloonimine. neist 1. ja3. on kaks põhilist viisi Sama restriktaas tunneb ära sana järjestuse DNA eri molekulides. Ligaasi toimel ühinevad eri päritolu DNA lõigud omavahel kovalentse sidemegakokku Restiktaas lõikab plastiidi DNA lahti kindla järjestuse kohalt --> Sama restiknaasiga lõigatakse välja siirdavat geeni sisaldav DNA osa (nt inimese kromosoomist)-->plasmiis ja DNA osa segatakse kokku ehk nn. kleepuvad osad ühinevad-->DNA ühendatakse ligaasiga töötlemisel---> on tekkinud rekombinattiivne geenivektor
1. Lõigatakse lahti bakterite rõngaskromosoomid; 2. Liidetakse, igasse kromosoomi erinev lõik; 3. Bakterid paljundatakse; 4. Kolooniad eraldatakse kultuuriklaasidesse ja viiakse hoidlasse 2. Millistes punktides asuvad bakterid on rekombinantsed? 2 3. Millistes punktides asuvad bakterid on transgeensed? 3 4. Millistes punktides asuvad bakterid on geneetiliselt muundatud? 5. Kuidas nimetatakse ensüüme, mille abil lõigatakse DNA ahelad lahti? restriktaas 6. Kuidas nimetatakse ensüüme, mis liidavad ,,kleepuvate otstega" DNA lõigud kokku? ligaas VI 1. 2. 3. 4.
eri liikidelt pärit DNA osad. liikidelt pärit DNA osad. Rakkudesse viiakse võõraid Rakkudesse viiakse võõraid geene viirusvektori abil, plasmiidse geenivektoriga, geene viirusvektori abil, Agrobakteriga, DNApüssiga plasmiidse geenivektoriga, või mikropipetiga. Agrobakteriga, DNApüssiga või Restriktaastehnika: 1. Sama mikropipetiga. restriktaas tunneb ära sama Restriktaastehnika: 1. Sama järjestuse DNA eri molekulides. 2. Restriktaas restriktaas tunneb ära sama ,,lõikab" DNA ahelad pooleks järjestuse DNA eri molekulides. nii, et tekivad ,,kleepuvate" 2. Restriktaas ,,lõikab" DNA otstega DNA lõigud. 3. Eri ahelad pooleks nii, et tekivad päritolu DNA lõigud viiakse
suudab toota A-vitamiini eellasmolekuli -karoteeni. 2) Väljaspool organismi valmistatud päriliku materjali organismi viimine. 3) Looduses mitteesineval viisil kahe või enama raku ühinemisega muundatud geneetilise materjaliga elusrakkude saamist. 4) Organismi teatud geeni töö peatatakse ning organism ei tooda enam vastavat ainet. (nt tomat, kartul) Rekombinantse DNA loomise restriktaastehnika Rekombinantse DNA loomise restriktaastehnika Sama restriktaas tunneb ära sama järjestuse DNA eri molekulides Restriktaas "lõikab" DNA ahelad pooleks nii, et tekivad "kleepuvate" otstega DNA lõigud Eri päritolu DNA lõigud viiakse lahuses kokku; lõigud ühinevad komplementaarsuse alusel; kleepuvate otste vahele tekivad vesiniksidemed Ensüüm ligaasi abil ühendatakse eri päritolu DNA lõigud omavahel kovalentsete sidemetega kokku - tekib rekombinantne DNA molekul Geeninokaut 1. Geenivektor (vigane 5
põlvkonna meetoditest: a) Sekveneeritavat DNA-d ei amplifitseerita vaid järjestatakse otse reaal-ajas b) DNA sekveneerimiseks tekitatakse ensümaatiliselt erineva pikkusega fluorestsentsmärgisega fragmentide jadad, mis lahutatakse elektroforeesil c) DNA sekveneerimine toimub kloonide kaupa d) Kogu sekveneeritav DNA purustatakse, saadud fragmentidele liidetakse praimerid ning amplifitseeritakse sild- amplifikatsioonil kiibi pinnal 13. Restriktaas HindIII lõikab DNA-d järgmisest äratundmiskohast 5'AAGCTT3'. HindIII on seega: a) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 3' üleulatuva otsa b) Antud ensüüm annab DNA lõikamisel tömpotsa c) Tüüp 2 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa d) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa e) Tüüp 2 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 3' üleulatuva otsa 14
Geenitehnoloogia - molekulaargeneetika rakendusharu, DNA-fragmentide (geenide) siirdamine rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmiseks või nende käsutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel. Restriktaas -bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt, tekitades üheahelalised ,,kleepuvad" otsad; bakteritest on leitud palju restriktaase, millest igaüks tunneb ära oma spetsiifilise DNA-järjestuse. Ligaas -ensüüm, mis ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad Kimäär - biol. erineva genotüübiga ja eri organismidest pärit rakkudest koosnev organism. Geeninokaut - geenitehnoloogiliselt rikutud (,,nokauti löödud") geeniseisund Transg. Org. Mikroorganismid, bakterid Uute omadustega organismide abil toodetakse bioloogiliselt aktiivseid aineid: raviühendeid,antikehi,verehüübimisfaktoreid,kasvufaktoreid N...
GENOOMIPANK- bakterikloonides säilitatav inimese genoomi DNA-fragmentide kogum; kasutatakse kindlate fragmentide (geenide) paljundamiseks, uurimiseks ja siirdusmaterjali saamiseks. RNA splaising- RNA transkriptist eemaldatakse intronid ja liidetakse eksonid PÖÖRDTRANSKRIPTSIOON- geneetilise info ülekanne RNA-lt DNA-le. DNA süntees RNA järgi, tekib cDNA. DNA sekveneerimine- protsess, mille käigus selgitatakse DNA nukleotiidne järjestus 3. Geenivektor, selle loomise protsess, ligaas, restriktaas (ja tekkivad „kleepuvad otsad"), rekombinantne DNA. Õp lk 37 – 39. Plasmiid. Viirusvektor, plasmiidne geenivektor. - õp lk 38. Rekombinantne DNA- DNA molekul, milles ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid. RESTRIKTAAS- ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Enamik lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel
DNA on lahustatud TE* lahuses (TE*, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na 2) kontsentratsiooniga 5-10 nanogrammi/mikroliiter (ng/l). HeLa ja NT2 rakuliini kohta vaata - http://www.lgcstandards-atcc.org/ Bluescript pBS SK+ plasmiid 10 ng/l lineariseeritud Cfr42I abil (~3h restriktsioon, puhastatud fenooltöötluse, etanooliga sadestamise abil; lahustatud TE-s). Plasmiidi kohta vt Stratagene; http://www.stratagene.com/ . Plasmiidi kaarti vt lisamaterjalidest. Restriktaas Cfr42I (SacII) 10 ühikut/mikroliiter (u/l), hoitakse jääl. Restriktaasi kohta vt Fermentas; http://www.fermentas.com/, ja lisamaterjalid. Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust) T4 DNA ligaas 5 u/l (Fermentas, vt. lisa), hoitakse jääl 5 x Ligeerimispuhver (Fermentas) Töö käik: (märgista kõik oma katsetuubid nii, et tunned need pärast ära; näiteks initsiaalidega) (1) Kahe üliõpilase peale restrikteerida ~120 ng genoomset DNA-d Cfr42I-ga:
teostamiseks , reproduktiivkloonimine inimese kloonimisvõimaluste käsitlemisel kasutatav mõiste, mis tähendab tuumkloonimist uute isendite saamise eesmärgil. rakuteraapia, kahjustunud või hävinud kudede ja elundite funktsiooni parandamine või taastamine vastavalt diferentseerunud rakumasside siirdamisega. tüvirakud hulkrakse looma jagunemisvõimeline rakk,mille tütarrakud võivad diferentseeruda eri tüüpi koerakkudeks. , geenitehnoloogia, molekulaargeneetika rakendusharu, restriktaas, ligaas, ensüüm, mis ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad. GMO, väljend, mis tähistab transgeenset ehk siirdgeenset organismi. Genoomipank- bakterikloonides säilitatav inimese genoomi transgeensed loomad, geeninokaut geenitehnoloogiliselt rikutud geeniseisund. , geeniteraapia, geenitehnoloogiline meetod geneetiliste haiguste raviks või leevendamiseks. geenivaigistus. geeni avaldumise takistamine epigeneetiliste mehhanismidega transkriptsiooni või
Praktiline töö nr. 8: Kontroll-restriktsioon Eesmärk: Lõigata puhastatud plasmiidset DNA’d restriktaasidega, et kontrollida tekkivate DNA fragmentide suuruste järgi, kas puhastatud plasmiid on õige. 5 µl Puhastatud plasmiidne Seda hakkame kontrollima DNA 3,9 µl MQ 1 µl Restriktaasi 10x puhver Luua sobiv keskkond restriktaasi töötamiseks 0,1 µl EcoRI restriktaas Lõikab DNA’d EcoRI saitidest. (lõppkontsentratsioon 0,1U/ µl) Agaroosgeel 2 µl 6x DNA värv Arvutused: Puhver: 10 x 1/10 = 1µl Restriktaas: 10U/ µl Tahame saada 0,1U/ µl ja meil on 10 µl. 0,1x10 = 1U 1/10 = x/1 ehk x=0,1 Vesi- 10-5-1-0,1 = 3,9 µl DNA värv: 10 / 5 = 2. Töö käik: Pipeteerime kokku DNA, MQ, restriktaari ja puhvri. Inkubeerime 37 kraadi juures 30 minutit.
siirdamises. Kus juures kasutadakse sama või teise isendi kromosoomi bakteri plaskidi ( väike molekul DNA-d) ja viirust ( genoom). Geenitehnoloogiat kasutadakse transgeensete organismide e GMO-de loomiseks, geeni raviks e geeniteraapias, sünnieelseks ja järgseks diagnostikaks ( DNA proov ), inimese tuvastamiseks ( DNA sõrmejälgede meetod ). Mis tahes transgeense organismi loomisel kasutadakse rekombinatse DNA loomise restritaas tehnikat. Restriktaas on ensüüm bakterites mis kaitseb neid viiruste eest. Ta lõikab viiruse genoomi (DNA) lõikudeks. Sama restriktaasi saab kasutada üldse DNA lõikamiseks. Tekivad kleepuvate otstega DNA lõigud. Need viiakse lahusesse, kus nad ühinevad komplement taarse alusel A=T; G=C. Ligaas on ensüüm, mis ühendab eri päritolu lõigud. Tulemuseks on rekombinantne DNA. Pöördtranskriptaas on ensüüm, mis leiab kasutamist siis kui mRNA pealt sünteesitakse komplementaas cDNA-d.
Restriktaasid Et teada saada, milline DNA sisaldab GH1 geeni järjestust, geenid kloneeriti sisestati plasmiidi Paljunesid koos plasmiidiga Selleks: * eraldati bakteri plasmiidid * lõigati restriktaasidega Restriktaasid tunnevad ära teatud kindla järjestuse palindroomi: "Madam I´m Adam" Mõlemalt poolt lugedes sama info palindroom Ühe ahela 5`- 3` suunas GAATTC, vastasahela 5`- 3` suunas GAATTC Kõige tuntum restriktaas - EcoR1 Ei lõika DNA kahte ahelat korraga otse aluspaaride vahelt, vaid nii, et jäävad üksikahelalised osad kleepuvad otsad Need seonduvad teiste fragmentide kleepuvate otstega Restriktaasid Looduses restriktaasid bakterile vajalikud lõikavad katki rakku sisenenud viiruse DNA Bakteri kromosoomi ei lõika, see metüleeritud, viiruse DNA ei ole metüleeritud
GEENITEHNOLOOGIA Geenitehnoloogia molekulaargeneetika rakendusharu, DNA-fragmentide siirdamine rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmiseks või nende kasutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel. Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA- fragmendid. Restriktaas bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt. Ligaas ensüüm, mis ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad. Geenides on intronid ja eksonid : · Intron lõigatakse · Ekson liidetakse Bakterid toodavad inimese valke alates 1978. aastast : · Esimene oli insuliin · Inim...
GEENITEHNOLOOGIA - bioloogia rakenduslik haru,mille ül-ks organismide geenide muutmine - seisneb DNA valitud lõikude eraldamises,töötlemises in vitro ja siirdamises sana või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri - lähtekohaks rekombinantse DNA metoodika loomine - rekombinante DNA-DNA molekul,milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid - restriktaas-ensüümid,mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järejestuste kohalt - enamik restriktaase lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse(4-8 nukleotiidipaari) eri otstest - kui sama restriktaasiga töödekda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised(nn kleepuvad) otsad - kui need fragmendid lahuses kokku viia, siis otste paardumisel nad ühinevad - lõigatakse katki kahte moodi: 1. tekivad kleepuvad otsad-DNA ahelale jäävad ü...
diferentseerumise suunatud mõjutamisega 45. rakuteraapia (rakkravi) - kahjustunud või hävinud kudede ja elundite funktsiooni parandamine või taastamine vastavalt diferentseerunud rakumasside siirdamisega 46. rekombinantne DNA - DNA molekul, mis koosneb tehnogeneetiliste meetoditega ühendatud 47. reproduktiivne kloonimine - inimese kloonimisvõimaluste käsitlemisel kasutatav mõiste, mis tähendab tuumkloonimist uute isendite saamise eesmärgil 48. restriktaas - bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt, tekitades üheahelalised ,,kleepuvad" otsad; bakteritest on leitud palju restriktaase, millest igaüks tunneb ära oma spetsiifilise DNA-järjestuse. 49. retroviirus - RNA-viirus, mis sisaldab pöördtranskriptaasi ja kopeerib selle abil oma genoomi DNA-sse ning võib sel viisil integreeruda peremeesraku genoomi. 50
Mutagenees- protsess, mille käigus toimuvad muutused organismi DNA järjestuses (mutatsioonid), mis jäävad genotüüpi püsima Transgenees- protseduur transgeensete organismide saamiseks (loomadel nokaut) +- suurem saagikus, uued ravimid, keskkonna saastuse vähenemine - - väheneb looduslik mitmekesisus, maitseomaduste halvenemine 7. Rekombinantse DNA loomine, geenivektor (plasmiidne geenivektor, viirusvektor). Restriktaas, ligaas, „kleepuvad otsad“. Osata koostada skeemi. Restriktaasid on ensüümid, need lõikavad DNA kindla koha pealt lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA juppe on mugavalt liita. DNA ühendamiseks piki suunas kasutatakse ensüüme nimega ligaas. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Geenid viiakse õigesse kohta kohale bakteri plasmiidiga
2. Geeni struktuur (promootor, RNA sünteesipiirkond, terminaator) ja geneetilise info edastamine. Intronid, eksonid, RNA splaising, pöördtranskriptsioon ja pöördtranskriptaas (õp lk 37, 40), genoomipank (lk 39). DNA sekveneerimine – mõiste. Vt esitlust Transkriptsioon (geeni struktuur) ja õpikust lk 40 ning üldist, kogu materjali esitlust (Rakendusbioloogia, lõpuosa slaidid) + vihikist tunni materjalid. 3. Geenivektor, selle loomise protsess, ligaas, restriktaas (ja tekkivad „kleepuvad otsad"), rekombinantne DNA. Õp lk 37 – 39. Plasmiid. Viirusvektor, plasmiidne geenivektor. - õp lk 38. 4. Geneetikas enimuuritud liigid (eri organismirühmadest), nende valiku kriteeriumid. (vt esitlus Geeniotehnol_enimuuritud). - Kasvaja jälgimine, bioluminestsents, inimese DNA viimine sea munarakku,
Geenitehnoloogia Insenergeneetika DNA valitud lõikude eraldamine,töötlemine in vitro ja siiramine kromosoomi,plastiidi või viirusesse. Eelduseks rekombinantse DNA loomine so. DNA molekul,mis koosneb eri liigi DNA juppide ühendusest.(1970) restiktaasid bakterites leiduvad ensüümid mis tagavad neile nn ,,immuunsuse" viiruste vastu lõigates nende DNA juppideks. · Bakterid omavad võõra DNA vastu nn R/M süsteemi · toimub kahe ensüümi koostöö : restriktaas(R) mis lõikab DNA tükkideks ja metüültransferaan(M) mis metüleerib ära oma DNA ja kaitseb seega oma DNA-d lõhkumise eest. · Restriktaasid tunnevad ära teatud järjestusega nukleotiidi paarid (4-8)DNA-s · teada erinevaid restriktaase üle 3500 · vastavalt restriktaasi toimele lõigatakse DNA lahti kas lõikuvalt või tömbilt. Kahe DNA kleepuvate otste liitumine toimub komplementaarsus printsiipide alusel ja ...
DNA on lahustatud TE* lahuses (TE*, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na 2) kontsentratsiooniga 5 nanogrammi/mikroliiter (ng/l). HeLa rakuliini kohta vaata - http://www.lgcstandards-atcc.org/ Bluescript pBS SK+ plasmiid 10 ng/l lineariseeritud Cfr42I abil (~3h restriktsioon, puhastatud fenooltöötluse, etanooliga sadestamise abil; lahustatud TE-s). Plasmiidi kohta vt Stratagene; http://www.stratagene.com/ . Plasmiidi kaarti vt lisamaterjalidest. Restriktaas Cfr42I (SacII) 10 ühikut/mikroliiter (u/l), hoitakse jääl. Restriktaasi kohta vt Fermentas; http://www.fermentas.com/, ja lisamaterjalid. Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust T4 DNA ligaas 5 u/l (Fermentas, vt. lisa), hoitakse jääl 5 x Ligeerimispuhver (Fermentas) Töö käik: (märgista kõik oma katsetuubid nii, et tunned need pärast ära; näiteks initsiaalidega) (1) Kahe üliõpilase peale restrikteerida ~120 ng genoomset DNA-d Cfr42I-ga:
48. Ligaas ensüüm, mid ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad. 49. Pöördtranskriptaas (revertaas) RNAst sõltuv DNA polümeraas; ensüüm, mis sünteesib üheahelalise RNA järgi kaheahelalise DNA-koopia. On omane retroviirustele. 50. Rekombinantne DNA DNA molekul, mis koosneb tehnogeneetiliste meetoditega ühendatud eri liikidelt pärit geenidest ning muudest järjestuslõikudest. 51. Restriktaas (restriktsiooniensüüm) bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt, tekitades üheahelalised ,,kleepuvad" otsad; bakteritest on leitud palju restriktaase, millest igaüks tunneb ära oma spetsiifilise DNA-järjestuse. 52. Retroviirus RNA-viirus, mis sisaldab põõrdtranskriptaasi ja kopeerib selle abil oma genoomi DNA-sse ning võib sel viisil integreeruda peremeesraku genoomi. 53
Geenitehnoloogia I konspekt Raku ja embrüotehnoloogiad Kloonimine geneetiliselt identse järglaskonna saamine paljundatavast üksikobjektist. Vegetatiivselt taime paljundamine on sisuliselt kloonimine Meristeempaljundus algkoerakkude kasutamine ühelt taimelt suure arvu vegetatiivsete järglaste saamiseks. Neid rakke leidub võrsete kasvukuhikutes, pungades. Ka vigastuste paranemisel tekkiv kallus on suures osas algkude. Algkoe rakud pole differentseerunud, seega sobivates tingimustes, taimehormoonide toimel, kasvab neist välja terve taim. Meristeemilõigust võib eri söötmetel kasvatada sadu kuni tuhandeid võrseid. Loomadel on sellised rakud vaid moorula rakud. Embrüosiirdamine arengu algusjärgus oleva embrüo ülekanne indleva emaslooma või rasestumisvalmis naise emakasse. Kasutatakse põllumajandusloomadel, et selekteerida välja kõige paremate omadustega järglased, mis tagab suure ressursside kokkuhoiu ning saadakse ühelt vää...
puudub Restriktsiooni endonukleaasid Restriktaasid Järjestusspetsiifilised DNA endonukleaasid Produtseeritakse erinevate bakterite poolt selleks, et degradeerida ehk restrikteerida võõr DNA molekule Peremeesraku DNA on kaitstud tänu lämmastikaluste spetsiifilisele metülatsioonile Isoleeritud ja biokeemiliselt iseloomustatud on sadu restriktaase Nomenklatuur tähis tuletatakse isoleerimiseks kasutatud liigi nimest EcoRI E. coli tüvest R isoleeritud esimene restriktaas Restriktaasid Enamus restriktaase on kaksikahelalise DNA spetsiifilised Erinevate restriktaaside hüdrolüüsi tulemusena tekkivad molekulide otsad võivad olla erinevate "etteulatuvate" ahelatega Restriktaasid on endo(I) tüüpi nukleaasid DNA fragmentide katalüütiline HaeIII 5´...GGCC... 3´ fragmenteerimine leiab laialdaselt 3´...CCGG... 5´ rakendust
Fundamentaalteadus teadus, mis uurib objektide või nähtuste olemust, nendega seotud seaduspärasusi. Rakendusteadus teadus, mis tegeleb loodusteaduslike teadmiste praktilise rakendamise printsiipide ja meetodite otsimise ja arendamisega. Antibiootikum elusorganismide produtseeritud või tööstuslikult sünteesitud ained, mis surmavad mikroorganisme või pärsivad tugevalt nende kasvu ning terapeutilistes annustes ei kahjusta makroorganismi. Biotõrje umbrohu, metsa- ja aiakahjurite, taimehaiguste jms. leviku piiramine mitmesuguste looduslike mehhanismide kaasabil. Feromoon Loomade, tavaliselt putukate, poolt toodetud keemiline nõre, mis mõjutab teiste liigikaaslaste käitumist, füsioloogiat või arengut, tihti mõjudes vastassugupoolele ligitõmbavalt. Kloonimine DNA-fragmentide, rakkude või organismide geneetiliselt identsete järglaste tekitamine. Kloon isendi, raku või DNA-fragmendi kloonimisel tekkiv geneetiliselt identne jä...
RAKENDUSBIOLOOGIA Koostas Kersti Veskimets Funktsionaalne toit … toidule on lisatud midagi, et see parandaks inimese tervist. Biokeefir, biojogurt – lisatud probiootilisi baktereid, mis parandavad seedimist, immuunsüsteemi. “Hellus” sisaldab Eestis patenteeritud Lactobacillus fermentum ME-3, mis hävitab düsenteeria, salmonelloosi ja ateroskleroosi… Ka meditsiin kasutab biotehnoloogiat juba terve sajandi • Antibiootikumid seentest ja bakteritest (penitsilliin ja etratsükliin) A. Fleming avastas penitsilliini 1929.a • Alkaloidid, mida kasutatakse Parkinsoni tõve ja migreeni raviks. Põllumajanduses • Silo valmistamisel • Mügarbakterid küntakse mulda. • Biotõrje (taimekaitsevahendid) – - seentest saadud ensüümid peletavad putukaid ja seenhaigusi. - feromoonidega meelitatakse kahjurid lõksu - bakteritoksiin (Bt-toksiin on parim) tapab putukaid sel...
RAKENDUSBIOLOOGIA Fundamentaalteadused ja rakendusteadused Fundamentaalteadused püüavad välja selgitada loodusseadusi. Rakendusteadused otsivad avastatud loodusseadustele kasutamisvõimalusi. Tooge näiteid, kus sellest kasu saab? Bioloogias on samuti... fundamentaalteadused ... ja rakendusteadused... BIOTEHNOLOOGIA rakendusbioloogia valdkond, kus kasutatakse organisme, et toota inimesele vajalikke aineid. Peamiselt bakterid, seened, GM- loomad ja taimed. Biotehnoloogia eelised: Säästab energiat Vähem ja kahjutud jäätmed Odav tooraine ja puudused: Ajakulu vastavate organismide leidmiseks, kasvatamiseks. Tundlikkus keskkonnategurite suhtes. Noored "biotehnoloogid" Tallinna Tehnikaülikooli Loodusteadustemaja õppelaboris Mida toodetakse biotehnoloogiliselt? Toiduainetetööstuses juba sajandeid: juust, kohupiim, jogurt jt. piimatooted. köögiviljade hapendamine (kurk, kapsas, seene...
Restriktaasid – endonukleaasid, mis fragmenteerivad DNA-d spetsiifilistest kohtadest Metülaasid – modifitseerivad nukleotiide restriktaaside poolt äratuntavatest 4 – 6 bp pikkustest DNA järjestustest, kaitstes DNA-d restriktaasi eest Rakus lagundatakse võõrast DNA-d, mis ei ole antud bakteritüve restriktaasi eest kaitstud E. coli tüves RI on kirjeldatud restriktaas EcoRI ja sellele vastav metülaas, mis metüleerib adeniini restriktaasi poolt äratuntavast järjestusest GAATTC Bakterifaagi DNA modifitseerimine Vahetult pärast faagi varajaste geenide avaldumist lagundatakse bakteri DNA faagi poolt kodeeritud endonukleaaside abil
Holland, Taani, Rootsi, Soome, Eesti, Läti, Leedu, Venemaa, Poola, Tsehhi, Slovakkia, Ungari, Gruusia, Rumeenia, Türgi, Bulgaaria, Küpros, Kreeka, Serbia-Montenegro, Horvaatia, Sloveenia, Malta, Itaalia, Austria, Sveits, Hispaania, Portugal, Prantsusmaa, Saksamaa.6 5 http://www.eko.org.ee/gmo/index.php 6 http://www.gmo-free-regions.org/ 8 GMO'de tootmine GMO'de saamiseks lõikab restriktaas (,,ensüümkäärid") DNA-d spetsiifilistest kohtadest, plasmiidist (rõngakujuline kaheahelaline DNA molekul) eraldatakse mittevajalikud geenid ja DNA ligaas (ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad) ühendab fragmendid. Doonororganismist eraldub uus geen, mis viiakse Agrobacterium tumefaciens'i. Uus plasmiid siseneb taime rakkudesse lehe lõikepinnal ja neid lehe lõike töödeldakse Agrobacterium'i (Gram-negatiivsesse perekonda kuuluv bakter, mis kasutab horisontaalset geenisiiret
15. Iseloomustage järgmiste ensüümide toimet (kirjeldage katalüüsitavaid reaktsioone). Vajadusel illustreeriga vastust joonise või skeemi abil. a) Endonukleaas Rnaas A endonukleaasid hüdrolüüsivad nukleiinhapete sisemisi fosfodiestersidemeid. Powerpoindist võetud tabel: Ahelate lõikamise loogika üldiselt: Alguses: Peale hüdrolüüsimist: a - fosfodiestersideme 3' pool; b - fosfodiestersideme 5'-pool b) Restriktaas EcoRI (,,kleepuvaid" otsi produtseeriv endonukleaas) restriktaas ehk restriktsiooniensüüm kaitseb bakterit võõra DNA sissetungi eest. II ja III tüüpi restriktaasid lõikavad DNA ahelaid kindlates kohtades Ei vaja ATP. Kaheahelalise DNA restriktaaside äratundmissaitidel on 2-kordne sümmeetriatelg. Sõna EcoRI tuleb E. coli (soolekepike) R liinis avastatud esimene restriktaas. c) DNA polümeraas ensüümid, mis viivad läbi DNA
“cis-acting” elementideks. Transkriptsioonifaktorid seostudes teiste geenide cis elementidega reguleerivad nende geenide ekspressiooni: “trans-acting” faktorid. DNA-valk interaktsioonid. regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste. mitte-kovalentsed Rekombinantse DNA metoodika alused. Rekombinantseks DNA-ks nim. DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA fragmendid. Metoodika 1.Sama restriktaas (restriktsiooniesüüm) tunneb ära sama järjestuse DNA erimolekulides. 2.Restriktaas „lõikab“ DNA ahelad pooleks nii,et tekivad „kleepuvate“ otstega DNA lõigud. 3.Eri päritolu DNA lõigud viiakse lahuses kokku; ühinevad komplementaarsuse alusel; „kleepuvate“ otste vahele tekivad vesiniksidemed. 4. Ensüüm ligaasi abil ühendatakse eri päritolu DNA lõigud omavahel kovalentsete sidemetega kokku- tekib rekombinantne DNA molekul. Restriktaasid.
Kasutatakse baktereid, viirusi, mille üheks põhiomaduseks on tungida peremeesrakkudesse ning pärmseeni, mis toituvad orgaanilisest ainest. Peale paljunevad nad väga kiiresti. GMO loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada mikro organismi DNA või RNAga. Selliseid DNA konstrukte nimetatakse geeni vektoriteks ehk siirdajateks. Vaatleme plasmiidse geenivektori saamist. Plasmiid on baketeris. See on DNA väike rõngas. 1) Restriktaas lõikab selles DNA lahti. 2) Sama restriktaasiga lõigatakse lõik inimese genoomist. Need ühinevad komplentaalselt. 3) Plasmiid ja DNA konstrukt segatakse kokku, kleepuvad otsad ühinevad. Nii saadakse lõppkokkuvõttes plasmiidne geenivektor, mis omakorda sisestatakse bakterorganismi. Tänu sellele tehnikale on võimalik luua DNA panku. Need osutuvad vajalikuks teaduslikel eesmärkidel. Nendest bakteritsest saab alati eraldada DNA lõike.
Enamasti esineb DNA elusorganismides kahe antiparalleelse omavahel komplementaarse ahela kujul (st kohakuti paiknevad ahelate A ja T ning G ja C nukleotiidid), sest lämmastikaluste vahel moodustuvad komplementaarsusprintsiibist lähtudes vesiniksidemed. DNA süntees toimub tavaliselt replikatsiooni teel, mida viib läbi DNA polümeraas. DNA lagundamine toimub nukleaaside abil (vt endonukleaas, eksonukleaas, restriktaas, apoptoos). DNA sekundaarstruktuuri muutvad ensüümid on DNA ligaasid, helikaasid, güraasid. Päriliku info säilitamine ja selle täpne ülekanne tütarrakkudele. Nukleiinhapete sünteesil on kindel suund: 5´ (prim) ots + 3´ (prim) ots. Ahelad on antiparalleelsed: üks ahel:-5´ ots, teine-3´ots ja komplementaarsed A=T, C=G. Kõiki DNA molekule rakus sünteesib DNA polümeraas. DNA´l on kolm struktuuri: DNA esmane struktuur -esineb rakus sünteesiprotsessides ja teatud
DNA järjestuse äratundmine varieerub erinevate restriktaaside vahel, lõigates tekivad eri pikkusega “kleepuvad” üleulatuvad osad. “Kleepuvad” üleulatuvad osad võivad olla nii peaahelal kui “komplementaarsel” ahelal. Selliste otstega DNA ahelaid on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita, tekib rekombinantne DNA. Restriktaasid on ensüümid, mis katkestavad hüdrolüüsi fosfordiester sidemel, tunnevad ära 6 järjestust iga restriktaas tunneb erineva. DNA kloneerimise etapid. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik Vektor-DNA ettevalmistamine Kloonitava DNA ettevalmistamine Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil Rekombinantse DNA sisendamine peremeesorganismi Rekombinantide selekteerimine Rekombinantide analüüsimine Etapp 1. Valitud DNA tükk lõigatakse päritoluorganismist restriktsiooniensüümide abil. Etapp 2
denatureerida ja renatureerida? 4. Milline ensüüm viib läbi järgnevaid: REPLIKATSIOON – DNA polümeraasid TRANSKRIPTSIOON – RNA polümeraas: avab DNA ning sünteesib ühte ahelat kasutades komplementaarsus-printsiibi alusel RNA. Polümeraas seostub promootorpiirkonnaga ning transkriptsioon jätkub seni kuni RNA polümeraas jõuab stoppkoodonini DNA lõikude liitmine - ligaas DNA lõikamine kindla järjestuse juurest – restriktaas 5. Millisesse piirkonda seostub RNA polümeraas? - DNA-l nn promootor lookusega (promootorpiirkond) 6. Nimeta bakteriaalse transkriptsiooni eripärad võrreldes eukarüootse transkriptsiooniga Kõik bakteriaalse RNA vormid (mRNA, TRNA ja rRNA) sünteesitakse vaid ühe ensüümi – RNA polümeraasi poolt, transkriptsiooni kiiruseks on 55 nukleotiidi sekundis mRNA-d ei transpordita tsütoplasmasse, vaid tema alusel algab valgu
järglastele päranduvad. Neil organismidel ilmneb uus, mõnele teisele liigile omane tunnus. Transgeensed mikroorganismid. Transgeensete organismide loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada niisugusesse DNA või RNA kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Selliseid DNA konstrukte nimetatakse geenivektoriteks ehk –siirdajateks. (Plasmiidse geenivektori tegemine. Restriktaas lõikab plasmiidis DNA lahti kindla järjestuse kohalt. Sama restriktaasiga lõigatakse välja siiratavat geeni sisaldav DNA-fragment. Plasmiid ja DNA-fragment segatakse kokku, ”kleepuvad otsad” ühinevad. DNA ühendatakse ligaasiga töötlemisel.). Kuna niisama lihtsalt ei ole võimalik inimese geene bakteri plasmiidi sisestada, kasutatakse selleks ensüüm transkriptaasi. Eraldatakse huvipakkuvast geenis mRNA ja
― G ― GATC ―→ ―MutS ―MutH → ―MutS (+ MutL)-MutS-MutS-MutH ― A ― CTAG ―→ ― MutS ― MutH →―MutS (+ MutL)-MutS-MutS-MutH ― G ―GATC ― ära lõigatud ahela jupp ― sünteesitakse uuesti Restriktsioon - modifikatsiooni süsteem bakterites Restriktsiooniensüümid tunnevad ära kindlaid järjestusi ja lõikavad DNA selle koha pealt lahti → tekivad kaheahelalised katked DNA-s. Vajalikud bakteriofaagide jaoks. Bakterites sama DNA järjestuse tunnevad ära nii restriktaas kui metülaas. Restriktaas ei lõika metüleeritud DNA-d. Restriktaas lagundab metüleerimata DNA (võõra DNA) sptesiifilistest kohtadest. Restriktaas ja metülaasi äratundmiskohad kattuvad. GATC on restriktaasi (kindla) äratundmisjärjestused, mis on vanas DNA-s kõik metüleeritud, ei lõigata katki. Kui rakku tuleb faagi DNA, siis see ei ole sellelt kohalt metüleeritud st lõigatakse katki. Erinevus metüleerimisel tuleneb erinevustest bakteri ja faagi DNA replikatsiooni mehhanismides.
järglased. 6. Geenide kloonimine 1. Restriktaasid a. Kleepuvad ja tömbid otsad b. Restriktsiooni-modifikatsioonisüsteem 2. Rekombinantne DNA a. Kloonimisvektorid b. Multikloonimissait c. Fagemiidid (ekspressioonivektorid) d. Kosmiidid e. Süstikvektorid f. Kunstlikud kromosoomid 7. Restriktaasid, kloonimissait restriktaas (ingl. Restrictase)- Endonukleaas, mis tunneb ära lühikesi spetsiifilisi DNA-järjestusi ja lõikab DNA-molekuli selles restriktsioonisaidis või selle lähedalt katki. polülinker (polükloonimissait) (ingl. Polylinker, Polycloning site)- DNA-segment, mis sisaldab rea unikaalseid restriktaaside lõikesaite. 8. Kloonimisvektorid, tüübid kloonimisvektor (ingl. Cloning vector)- Väike isereplitseeruv DNA-
Heterodupleks test segad kontrollDNA paljude teistega kokku, kuumutad ja paned geelile. Ahelad hübridiseeruvad, mittesobivuse korral tekib ahelasse mull (mutatsioonide korral). Mulliga liiguvad tavaliselt aeglasemalt ja on geelis ootamatute kohtade peal. RFLP ensümaatilisel restriktsioonil põhinev polümorfismide analüüs. Esinevad polümorfismid, mis tekitavad või kaotavad restriktsioonisaite. Regioon amplifitseeritakse ja pannakse restriktaas juurde. Kui restriktsioonisait on kadunud, siis tekib üks suur bänd 2 väikese asemel. Reaalselt on sel vähe kasutusvõimalusi. DGGE Spetspraimerid, mille otsas on GC-clamp'id, mille sulamistäpid on arvutatavad. Amplifitseeritakse kontroll- ja uuritav proov. Produkt hakkab denatureeruma (uurea vmt toimel) erinevates piirkondades sõltuvalt mutatsiooni olemasolust. Keemiline RNAas vahendatud: üks praimeripaar on biotiiniga märgistatud. Kui tekib heterodupleks ja seal on
Abiootilised tegurid - organismide elutegevust mõjutavad eluta looduse tegurid; eristatakse elukeskkonnaga (õhk, muld ja vesi) ning kliimaga seotud tegureid. Adaptatsioon - organismide ehituse ja talitluse (ka käitumise) muutumine, sobitumaks keskkonnatingimuste ja eluviisiga. Adaptiivne radiatsioon - evolutsioonilise mitmekesistumise erivorm, mille puhul ühest liigist (või perekonnast) lahkneb suhteliselt lühikese aja jooksul mitmeid erinevalt kohastunud liike. Adenosiintrifosfaat (ATP) - kõigis rakkudes esinev makroergiline ühend, mis osaleb raku aine ja energiavahetuses, energia universaalse talletajana ja ülekandjana. Aegkond - geokronoloogilise skaala suurjaotustest keskmine, eooni ja ajastu vahel; eoon jaotub aegkondadeks ja aegkond ajastuteks. Aeroobne glükolüüs - kõigi rakkude tsütoplasmas glükoosi esmane lagundamine hapnikurikkas keskkonnas. Protsessi tulemusena saadakse ühest glükoosimolekulist kaks püroviinamarihappe molekuli...
analüüsil saab koostada erinevate RFLP-ide aheldatuse kaarte ning analüüsida siis neid juba teadaolevate geenide asukohtade suhtes. Näiteks võiks tuua autosomaalse retsessiivse haiguse tsüstilise fibroosi (CF), mille geen lokaliseeriti aheldatuse analüüsil 7. kromosoomi. Kasutades mõlemal pool geeni paiknevaid RFLP-e kloneeriti geen, mille produkt oli siis veel tundmata Kui mutatsioon DNA-s on tekkinud restriktaasi lõikesaiti, siis seda järjestust restriktaas enam ei lõika. Mutatsioonid võivad muuta DNA järjestust ka nii, et tekivad uued restriktaaside lõikesaidid. Seega põhjustavad mutatsioonid DNA restriktsioonifragmentide mustris erinevusi, kuna võrreldes algse DNA-ga tekib mutatsioone sisaldava DNA lõikamisel mingi kindla restriktaasiga teistsuguse pikkusega fragmente. Nii võib erinevatest isolaatidest pärinev DNA olla DNA restriktsioonanalüüsi
dimensionaalsust. Redutseeritakse difusiooni dimensionaalsust 3D2D (lateraalne difusioon). Lateraalne dimensioon membraanides, tsellulaasid otsivad pm pinnalt. 1D (mööda ahelat) Ühe dimensionaalsust kasutavad restriktsiooniensüümid, sest vaja leida spets järjestus). Mittespetsiifiline kompleks liigub DNA ahela peal, kui tuleb oma järjestus, siis tekib spetsiifiline kompleks ja enam ei liigu. Suunda pole. Restriktaas pendeldab juhuslikult DNA peal võib ka dissotsieeruda, kui protsesssiivsus oleks väga kõrge, siis oleks korduv kontrollimine, jääb pendeldama. Seetõttu on mõistlik aegajalt maha hüpata ja mujale liikuda. Suunatud liikumise jaoks on vaja energiat juurde anda. Klassikaline, massitoimeseadusel põhinev ensüümkineetika ei pruugi kehtida tingimustes, kus 3D difusioon on piiratud. Massitoimeseadus keemilise reakt kiirus on võrdeline reageerivate ainete kontsiga. Kui reaktsiooni
annaabi.ee 
Sisene Facebook'ga
Sisene Google'ga
Sisene LinkedIn'ga
