Molekulaarbioloogia konspekt (1)

1
Õppevahend: Molekulaarbioloogia üldkursuse lühikonspekt
Põhiline õpik on B. Lewin “ Genes ” V ja VI väljaanne, edasises tekstis on viiteid Genes
VI joonistele (kui pole eraldi märgitud) ja üksikutel teemadel detailsematele
materjalidele. Kursiivis on esitatud lõigud, mis on mõeldud täindavaks lugemiseks aga
ei ole “kohustuslikud”.
Sissejuhatus
Molekulaarbioloogia on termin, mis võeti kasutusele selle sajandi teisel
poolel peale esimeste makromolekulide ruumilise struktuuri kindlakstegemist. Esialgu
tähistaski see termin just struktuurset bioloogiat molekulaarsel tasemel. Seega on
molekulaarbioloogia oma algses tähenduses keemia ja füüsika meetodeid kasutav
bioloogia osa, mis tegeleb bioloogiliste makromolekulide ruumilise struktuuri ja
struktuuri ning funktsiooni vaheliste seoste kindlakstegemisega. Hiljem, kui sama
teaduse piirid on ähmastunud seoses teadmiste laienemisega ja uute probleemide
kerkimisega, on kasutusele võetud termin - molekulaargeneetika. Sisulist vahet nende
kahe termini vahele ei ole. Molekulaarbioloogia (või molekulaargeneetika) tegeleb
päriliku informatsiooni kodeerimise, säilitamise ja ülekande mehhanismide uurimisega,
aga samuti päriliku informatsiooni realiseerumise molekulaarsete mehhanismidega st.
kuidas geenides sisalduv informatsioon määrab elusorganismide ehituse ja nende
funktsioneerimise . Seejuures ongi molekulaarbioloogia üks keskseid probleeme
füüsikalis-keemiliste struktuuride ja biokeemilis-füsioloogiliste funktsioonide
vastavuse uurimine . Molekulaarbioloogia sündi on kirjeldanud J. Watson oma raamtus
“ Double helix ” (e. k. Kaksikspiraal, “Loomingu” Raamatukogu, 1972). DNA on ilus
näide selle kohta kuidas makromolekuli struktuuri tundmaõppimine lõi eelduse pärilike
protsesside - geneetilise informatsiooni säilitamise ja paljundamise
kindlakstegemiseks. Just DNA komemõõtmelise struktuuri kindlakstegemine pani aluse
molekulaarbioloogiale.
1. Molekulaarbioloogia dimensioon
Molekulaarbioloogia on suures osas struktuurne teadus, mis tegeleb
bioloogiliste makromolekulide ja nende funktsionaalsete komplekside struktuuriga ja
uurib nende struktuuride tekke füüsikalis-keemilisi aluseid. See osa
molekulaarbioloogiast on analoogiline anatoomiale, ainult et molekulaarbioloogia
tegeleb molekulide ehitusega ja seega mikromaailmaga. Kovalentse keemilise sideme
pikkus on keskmiselt 1,4 Å (ongströmi, 1 Å = 10-10 meetrit). Sellest piirist väiksemate
suurustega molekulaarbioloogia reeglina ei tegele. Suuremad makromolekulide
kompleksid on kuni 300 Å läbimõõduga, mis on enamasti molekulaarbioogia ülemine
piir. Suuremate struktuuridega tegeleb juba rakubioloogia .
Järelikult on molekulaarbioloogia dimensioon ühest kuni mõnesaja ongströmini ehk
10-10 - 3·10-8 meetrit.
 Mõned näited:
kaheahelaline DNA ja kaheahelaline RNA, biheeliksi (kaksikspiraali) diameeter - 20 Å
keskmine  globulaarne valk, molekulmassiga 50 000 daltonit, diameeter - 50 Å
bakteriaalne RNA polümeraas (koosneb neljast globulaarsest valgust) molekulmassiga
500 000 daltonit, dimensioonid 90x90x160 Å
nukleosoom (DNA valkudega pakitud struktuuriüksus kromosoomides), molekulmassiga
300 000 daltonit, dimensioonid 60x110x110 Å
2
bakteriaalne ribosoom , molekulmass 2,5 megadaltonit, dimensioonid 200x200x230 Å
Rakubioloogia väiksemad uurimisobjektid on näiteks tuumapoorid, molekulmassiga
100 megadaltonit ja dimensioonidega 120x120x75 nm (1 nm = 10 Å).
Teine osa molekulaarbioloogiast sarnaneb füsioloogiale ja tegeleb vastavalt
molekulide funktsioonidega ja omavaheliste seostega. Nii nagu füsioloogiat ei saa
mõista ilma anatoomiat tundmata, ei saa ka molekulide funktsioone uurida ilma nende
struktuuri tundmata. Molekulaarbioloogia põhiline ülesanne ongi tundma õppida
molekulide “anatoomiat” ja “füsioloogiat” ehk nende struktuure ja funktsioone ja eriti
struktuuri ning funktsiooni vahelisi seoseid .
2. Molekulaarbioloogia põhidogma
Geneetilise informatsiooni ülekande suunda DNA ↔ RNA → valk nimetatakse
oma keskse tähtsuse tõttu molekulaarbioloogia põhidogmaks. Kuni 1969. aastani oli
molekulaarbioloogia põhidogma DNA → RNA → valk. 1969. aastal avastati uus
ensüüm - RNA-sõtuv DNA polümeraas ehk pöördtranskriptaas ehk revertaas, mis
katalüüsib DNA sünteesi RNA matriitsilt ja seega sai selgeks, et DNA’d sünteesitakse
nii DNA kui RNA alusel. Revertaas leiti esialgu imetajate RNA viirustest
(retroviirustestest), aga hiljem selgus, et see ensüüm on looduses väga laialt levinud nii
eu- kui prokarüootides.
Geneetilise informatsiooni ülekande kolm põhilist protsessi on:
1. Replikatsioon  - päriliku materjali (mis võib olla nii DNA kui RNA)
kahekordistumine. Elusorganismide geneetiline informatsioon on säilitatud
kaheahelalise DNA kujul. Erandi moodustavad mõned RNA viirused , mille geneetilise
materjali kandjaks on RNA. RNA viiruste puhul on replikatsioon RNA
kahekordistumine. Ülejäänud organismidel on replikatsioon DNA kahekordistumine.
Replikatsioon on DNA süntees. DNA süntees toimub liskas replikatsioonile veel
rekombinatsiooni ja reparatsiooni käigus. Teiselt poolt on replikatsioon laiem mõiste
kui DNA süntees hõlmates ka RNA praimeri sünteesi, DNA ja kromosoomi struktuuri
muutusi ja replikatsiooni regulatsiooni. DNA sünteesi viib läbi ensüüm - DNA-sõltuv
DNA polümeraas, kusjuures substraatideks on desoksü- nukleosiid 5’-trifosfaadid.
2. Transkriptsioon  - RNA süntees. Transkriptsioon tähendab mahakirjutamist ja
tähistab molekulaarbioloogias RNA sünteesi DNA matriitsi alusel. RNA sünteesi
regulatsioon on geeni aktiivsuse regulatsiooni põhiline tase. Seega on transkriptsiooni
regulatsioon väga oluline makromolekulide sünteesi kontrollmehhanism.
Transkriptsiooni viib läbi DNA-sõltuv RNA polümeraas. RNA polümeraase on väga
palju erinevaid tüüpe. Eukarüootides on kolm erinevat RNA polümeraasi, mis
sünteesivad erinevaid RNA molekule. RNA sünteesil on substraatideks (ribo-)
nukleosiid 5’-trifosfaatidest. Sünteesitud RNA ahel vastab üks-üheselt temaga
antiparalleelsele DNA matriitsahelale komplementaarsusprintsiibi alusel. RNA
järjestusega identset DNA ahelat nimetatakse kodeerivaks ahelaks. RNA sünteesi
käigus toimub DNA ahelate lahtiharutamine. Algne DNA struktuur taastub peale
transkriptsiooni lõppu. Transkriptsiooniga on seotud RNA protsessing ja
modifitseerimine.
3. Translatsioon  - valgu biosüntees. Translatsioon tähendab tõlkimist.
Molekulaarbioloogias tähendab translatsioon RNA (seega ka DNA) nukleotiidse
järjestuse tõlkimist valkude aminohappeliseks järjestuseks. Valkude sünteesiks
vajalikku geneetilist informatsiooni kannab mRNA (matriits- ehk informatsiooniline -
RNA). Valgu biosünteesi viib läbi ribosoom - RNA’st ja valkudest koosnev organoid .
3
Aminohapped seatakse ribosoomi abil vastavusse mRNA’s sisalduva geneetilise
informatsiooniga tRNA (transport-RNA) vahendusel. Aminohappe sidumine vastava
spetsiifilise tRNA molekuliga toimub ensüümide - aminoatsüül-tRNA süntetaaside ehk
aminoatsüül-tRNA ligaaside (ARS e. ARL) vahendusel. Aminoatsüül-tRNA (aa-tRNA)
süntees on valgu biosünteesi esimene, preribosomaalne etapp. Ribosoomides, kus
toimub valgusünteesi teine ehk ribosomaalne etapp, seatakse vastavusse mRNA’s
paiknev kolmest järjestikusest nukleotiidist koosnev  koodon  tRNA’s sisalduva
antikoodoniga. Ribosoom sünteesib tRNA küljes olevate aminohapete vahele
peptiidsideme. Kasvav peptiidahel on sünteesi käigus tRNA’ga kovalentselt seotud.
Valgu biosünteesil osalevad veel paljud valgulised faktorid , ATP ja GTP ning veel
mitmed molekulid, mida käsitleme valgusünteesi peatükis. Valkude ruumilise struktuuri
moodustumine toimub nii translatsiooni käigus kui peale seda. Valgud viiakse
organismis vajalikesse kohtadesse  valkude transpordi teel.
Geen - pärilikkuse ühik. DNA lõik, mis kodeerib eralduvat produkti
RNA genoomide puhul RNA lõik.
Eraldub produkt võib olla nii RNA kui valk. Algselt sünteesitakse valkude puhul
mRNA, mis aga ei ole info ülekande mõttes lõplik produkt. mRNA alusel sünteesitakse
valk.
DNA kodeerib eelkõige iseennast , aga see ei ole eralduv produkt, kuna jääb DNA
poolkonservatiivse replikatsiooni tõttu matriitsahelaga seotuks.
Geenid on kodeeritud ühe ahela poolt ja vastasahel kodeerimisel ei osale. Pikema
DNA lõigu ulatuses võivad siiski mõlemad ahelad kodeerida, osa geene paikneb ühel
ja osa teisel ahelal.
Geenid on DNA nukleotiidsed järjestused ja koosnevad mitmetest osadest:
-regulaatorpiirkonnad, mis paiknevad tavaliselt geeni alguses, aga võivad asetseda ka
geeni sees või osaliselt väljaspool geeni, geenist endast kaugel. Regulaatoralade hulka
kuuluvad ka terminaatorjärjestused, mis määravad RNA sünteesi lõpetamise.
- kodeeriva osa, millelt sünteesitakse RNA.
-nn., struktuurne osa mis vastab produktis sisalduvale pärilikule infole. Kuna peale
RNA sünteesi läbib RNA protsessingu, mille käigus osa järjestustest eemaldatakse, siis
ei satu kogu DNA kodeeriv osa produkti.
Prokarüootide geenid on tavaliselt pidevad , DNA järjestuse struktuurne osa paikneb
pideva järjestusena ja kopeeritakse produkti. Prokarüootsed geenid on enamasti
organiseeritud operonidesse, milles on mitut produkti kodeerivad järjestused ühise
regulaatori kontrolli all.
Eukarüootide geenid on enamasti katkendlikud, sisaldavad introne ja eksone. Geeni
primaarne produkt mRNA, läbib splaissingu, mille käigus osa RNA järjestusest
eemaldatakse. Intronid eemaldatakse. Eksonid jäävad alles ja nende ühendamise
(splaissingu) tulemusel tekib küps mRNA. (Inton- ekson skeem)
Ka küpses mRNA's on mittekodeerivad järjestused, nn liider ja treiler vastavalt mRNA
alguses (5' osas) ja lõpus (3' osas).
Ka ühe geeni intronid võivad kodeerida produkte, nn. intron kodeeritud produktid . Siia
kuuluvad mitmed väikesed RNA molekulid (snoRNA).
Imetajate geenides on paljude eksonite ühendamine võimalik mitmel erineval viisil,
mõned intronid on võimalik välja jätta. See protsess on alternatiivne splaissing , mille
4
puhul on ühel geenil mitu võimalikku produkti. Seega geenid ei ole alati
ühetähenduslikud.
Funktsionaalselt on geenid struktuursed ja regulaatorgeenid : struktuurgeenid kodeerivad
valke ja RNA molekule, mis viivad läbi rakkudes eluprotsesse. Regulaatorgeenide
poolt kodeeritud produktid, mis võivad samuti olla nii RNA kui valgulised,
reguleerivad teiste geenide avaldumist .
Eriline geenide rühm on nn. koduhoidjad geenid (housekeeping), mis avalduvad
hulkraksetes organismides igas rakus ja ainuraksetes organismides avalduvad nad
konstitutiivselt st. pidevalt (kui organism ei ole stressis ja geenid represseeritud).
Koduhoijatel geenidel on eriline struktuur, nende 5' osas paikneb oligopürimidiin
järjestus nn. TOP geenid. Just TOP geenide intronites on sageli veel teisigi kodeerivaid
järjestusi, mis samuti kuuluvad koduhoidjate geenide hulka. See on omamoodi geenide
kattumine, kus informatsioon küll füüsiliselt ei kattu. Siiski on mõlema geeni produktid
reguleeritud ühise kontrolljärjestuse poolt.
Geenide kattumine esineb väga ulatuslikult prokarüootides, esineb nii mRNA tasemel
geeni kattumist (siin on oluline lugemisraam , mida käsitleme lähemalt geneetilise koodi
juures) kui DNA tasemel kattumist, mis viib erinevate mRNA molekulide sünteesile.
Eriti oluline on geenide kattumine viiruste juures (parasiteerivad molekulid aga siiski
mikro -organismid).
DNA järjestuste võrdlemine:
4st nukleotiidist koosnevate DNA järjestuste võrdlemisel on igas positsioonis iga
nukleotiidi formaalne tõenäosus 25% ja seega on minimaalne kahe järjestuse vaheline
homoloogia st. homoloogia puudumine 25%. Järjestuse homoloogia alusel jagatakse
geenid perekondadesse ja superperekondadesse.
Geenid jagatakse järjestuse ja funktsiooni sarnasuse alusel Homoloogideks - järjestus
homoloogiline ja funktsioon sarnane, paraloogideks - järjestus homoloogiline,
funktsioon erinev ja ortoloogideks.
Tuleb teha vahet DNA homoloogia geeni homoloogia vahel.
Tüüpiline paraloogsete geenide näide on pseudogeenid , mis moodustavad suure osa
hulkraksete genoomidest.
Geenide võrdlemisel on oluline osa mitte kogu järjestuse globaalsel homoloogial vaid
lõikude leidmisel, mis on suure homoloogiaga. Eriti olulised on sellised kõrge
homoloogiaga lõigud valgu geenide võrdlemisel. Valkudes on järjestuse motiivid,
perekondade piires konserveerunud järjestuse elemendid, mis sageli koosnevad
lühikestest lõikudest, aga need lõigud peavad olema kindals järjestuses. Näiteks DEAD
motiiv on omane RNA (ja vahel ka DNA helikaasidele). Järjestuse võrdlemise alusel
on võimalik tundmatu funktsiooniga geenile ennustada tema produkti võimalikku
funktsiooni. Siit tuleneb pööratud geneetika . Tavaline geneetika otsib mutatsioone
funktsiooni muutuse kaudu, siis pööratrud geneetika otsib funktsiooni muutust järjestuse
muutmise tulemusel. Teiselt poolt otsib ta funktsioone olemasolevatele järjestustele.
DNA järjestuste võrdlemine on aluseks molekulaarsele evoltusiooniteooriale. Näiteks
tuleb tuua eksonid, mis ei varieeru kuigi suures ulatuses ja intronid, mis on suure
järjestuse varieeruvusega. Oletatavasti hoiab eksonite järjestusi varieerumast looduslik
valik.
5
I Bioloogiliste makromolekulide struktuur ja seda mõjutavad jõud
Geneetiliselt kodeeritud makromolekulid ( nukleiinhapped ja valgud) on polümeerid,
mis koosnevad suhteliselt väikesest arvust monomeeridest. Monomeerid sisaldavad
identset osa, mis omavahel ühendatuna moodustavad polümeeri selgroo . Viimase
küljest hargnevad monomeeride külgahelad. Geneetiliselt on kodeeritud
biopolümeeride monomeeride järjestus ehk primaarstruktuur . Samast järjestusest võib
moodustuda mitu erinevat ruumilist struktuuri ( sekundaar - ja tertsiaarstruktuuri
tasemel). Praeguste teadmiste juures ei ole veel võimalik täpselt ennustada valkude
(aga ka RNA) ruumilist struktuuri tuginedes üksnes nende primaarstruktuurile. Mitme
valgu puhul on ka teada, et nad võivad looduses eksisteerida mitmes erinevas ruumilise
struktuuri vormis (kuigi primaarstuktuur on sama).
I 1. Valkude struktuur
 Valgud koosnevad 20+1 kodeeritud aminohappest. +1 tähistab siin selenotsüsteiini
(Sec), mis esineb vaid vähestes valkudes ja on kodeeritus UGA koodoniga, mis
tavaliselt on stop-koodon (vt. valgusünteesi peatükk). Lisaks kodeeritud aminohapetele
esinevad valkudes veel mitmed aminohapped, mis lisatakse peale valguahela sünteesi
ribosoomides (post-translatsioonilised modifikatsioonid). Siia kuuluvad
modifitseetitud aminohapped nagu hüdroksüproliin ja atsetüleeritud aminohapped.
Paljude valkudega on ühendatud suhkrujäägid (vt. valkude glükosüleerimine) või
fosforhappe jäägid (valkude fosforüleerimine). Aminohapped on omavahel ühendatud
peptiidsideme abil. Peptiidside on amiidsideme vorm, mis moodustub α-amiknohapete
vahel. α-aminohapetel on amino- ja karboksüülrühm ühedatud sama süsinuku aatomi
(α-süsiniku) külge. Valguahel moodustub α-süsinike ja peptiidsidemete abil, kus α-
süsinike küljest hargnevad aminhapete külgahelad (joon 1.7). Valguahela otsad on
erinevad - ahela alguses (otsas millest valgusüntees algab) on valgu selgrool
aminogrupp (-NH2) ja ahela lõpus on karboksüülrühm (-COOH). Vastavalt nimetatakse
valguahela algust N-terminuseks e. amino-otsaks ja lõppu C-terminuseks e. karboksüül-
otsaks. Aminohapped on erinevate keemiliste omadustega erinevate külgahelate tõttu.
Erinevad aminohapped seonduvad omavahel lisaks peptiidsidemetele, mis moodustab
valgu selgroo, ka erinevate keemiliste sidemete varal , mille abil moodustub valgu
ruumiline struktuur. Eriline tähtsus on siinjuures vesiniksidemetel (H - sidemed).
Peptiidsidemes on olemas nii H - sideme doonor kui aktseptor , mis osalevad valgu
sekundaarstruktuuri moodustamisel. Väga olulised valkude ruumilise struktuuri tekkel
on tsüsteiinjääkidel, mis moodustavad stabiilseid disulfiidsidemeid ja nende abil
hoitakse valgu ruumiline struktuur stabiilsena.
Aminohapped jaotuvad mitmesse klassi vastaval oma keemilisele koostisele ja
omadustele. Siinkohal nimetan ainult klassid vastavalt laengule, mis on olulised
valkude ruumilise struktuuri tekkel:
Laetud aminohapped e. hüdrofiilsed aminohapped, mis jagunevad omakorda
happelisteks ja aluselisteks vastavalt külgahela laengule. Laetud aminohapped
osalevad valgu seondumisel teiste molekulidega ja nad on enamasti valgu ruumilises
struktuuris väljaspool.
Apolaarsed e. hüdrofoobsed aminohapped, mis ei sisalda laetud rühmi ja on seega
hüdrofoobsed e. vett tõrjuvad. Need aminohapped on sageli valgu ruumilises
struktuuris sisemuses, olles üksteise läheduses ja tõrjudes vett eemale.
Valmis valkudele lisatakse sageli mitmesugusei rühmi (sünteesijärgsed
modifikatsioonid), mille tulemusena tekivad modifitseeritud e. mittekodeeritud
6
aminohapped. Olulisemad modifikatsioonid on fosforüleerimine (foforhappe jäägi
lisamine), atsetüleerimine (NH2 rühmale äädikhappe jäägi lsamine amiidsideme abil,
esineb sageli N-terminaalselt ja lüsiinidel), metüleerimine ja glükosüleerimine
(suhkrujääkide lisamine OH ja NH2 rühmadele). Lisaks on veel mitmeid post-
translatsioonilisi (sünteesijärgseid) modifikatsioone, näiteks proliini
hüdroksüleerimine, mille tagajärjel tekib hüdroksü- proliin (esineb suure sagedusega
kollageenis). Modifitseeritud aminohapped esinevad enamsti valgu pinnal. Eriti sageli
on modifitseeritud need valgud, mis on raku pinnal või lahustuvad rakkudevahelises
ruumis st. on kättesaadavad teistele molekulidele. Modifikatsioonid kaitsevad valke
lagundamise eest, osalevad rakusiseste signaalide ülekandel (vt. signaali ülekanne ja
rakutsükli regulatsioon), moodustavad raku pinnamarkereid ja on olulised valkude
aktiivsuse regulatsioonil.
Valkude ruuminilne sruktuur sõltub ümbritsevast keskkonnast. Vee keskkonnas
surutakse hüdrofoobsed aminohapped valgu südamikku ja väljapoole jäävad
hüdrofiilsed (laetud) aminohapped. Vee molekulid on omavahel seotud
vesiniksidemetega. Nende sidemete eluiga on lühike (üks side püsib ligikaudu10-9
sek.). Sellegipoolest on suurem osa vee molekule igal ajahetkel omavahel
vesiniksidemetega seotud. Vee keskkonna struktuur ( vesiniksidemete moodustamise
võime) suunab valkude struktuuri teket ja püsimist. Valgu sekundaarstruktuur
moodustub samuti vesiniksidemete varal. Sekundaarstruktuuri moodustavd H-sidemed
tekivad valgu selgroo peptiidsidemete amino- ja karboksüülrühmade vahel. Valkude
sekundaarstruktuuri põhilised elemendid on α- heeliks ja β-kiht (lamepoogen) vt.
joonised 1.18 ja 1.19
Aminohapete külgahelate omavahelise seondumise tulemusena tekib valkude
tertsiaarstruktuur. Tertsiaarne struktuur on igale valgule spetsiifiline. Kindel
ruumiline struktuur on valkude bioloogilise funktsioneerimise alus. Kuna valgud
koosnevad paljudest erinevatest aminohapetest, siis on ka nende ruumiline struktuur
väga mitmekesine . Eraldiseisvaid ruumilise struktuuri elemente nimetatakse struktuuri
motiivideks. Ruumilise struktuuri motiivid sisaldavad sageli sarnaseid aminohappe
järjestusi - järjestuse ehk primaarstruktuuri motiive . Ühesuguste biokeemiliste
funktsioonide läbiviimine põhineb enamasti sarnastel ruumilise struktuuri motiividel.
Näiteks sisaldavad kõik tuntud guanosiin-nukleotiidi siduvad valgud 4-6
antiparallelsest β- kihist ja 1-3 nendega risti olevast  α-heeliksist koosnevast domäänist,
mis on G-nukleotiidi sidumise motiiv. See motiiv moodustab valgu ühe domääni. Valgu
struktuurne domään on suhteliselt iseseisva struktuuri ja funktsiooniga üksus, mis
moodustub pidevast järjestusest. Valgu struktuursed domäänid kannavad ka kindlaid
funktsioone. Struktuurse domääni ja struktuurse motiivi kattumine on pigem erand kui
reegel. Motiiv on üldjuhul domääni osa. Näiteks võib tuua kahe-ahelalise
nukleiinhappega seondumise motiivid: heeliks- ling -heelis (helix-loop-helix), heeliks
pööre-heeliks (helix- turn -helix), positiivselt laetud α-heeliks, Zn-sõrm ja mitmed
teised. Need on kõik erinevad struktuursed motiivid, mis aga ei moodusta iseseisvaid
domääne.
Biokeemilisi funktsioone viivad läbi enamasti mitmest polüpeptiidist koosnevad valgu
kompleksid. Enamus ensüüme koosnevad kas mitmest subühikust või esinevad
multiensüüm-kompleksidena. Sellised funktsionaalsed kompleksid tekivad valkude
omavahelise seondumise tulemusena ja seda struktuuritasandit nimetatakse ka valgu
kvaternaarseks struktuuriks. Valkude omavaheline seondumine põhineb aminohapete
külgahelate interaktsioonidel, nii nagu valgu domäänide omavaheline seonduminegi.
7
Valkude ruumilist struktuuri on uuritud suure eduga juba ligi pool sajandit. Väga
paljude (üle 1000) valkude ruumiline struktuur on teada atomaarsel tasemel
kasutades kristalliseeritud valkude uurimist röntgenkiirte hajumise ja lahustunud
valkude analüüsi tuumamagnet resonantsi abil. Need andmed võimaldavad mõista
valkude struktuuri tagavaid jõude ja struktuurse dünaamika ning struktuuri
stabiilsust määravaid tegureid. Samas on aga valgu ruumilise struktuuri
ennustamine primaarastruktuuri järgi jäänud suurel määral fenomenoloogilisele
tasemele . Kõige tulemuslikum meetod valkude ruumilise struktuuri ennustamiseks
primaarstruktuuri alusel põhineb primaarstruktuuri homoloogia otsingul mõne juba
tuntud ruumilise struktuuriga valguga. Kui primaarstruktuurid on piisavalt
homoloogsed , siis võib suure tõenäosusega oletada, et ka ruumilised struktuurid on
sarnased. Valkude ruumilise struktuuri ennustamine on väga oluline probleem nende
omaduste mõistmisel ja seega bioloogilistest protsessidest arusaamisel . Tänapäeval
on küllalt lihtne kindlaks teha DNA järjestust. Terve inimese genoomi järjestuse
määramine on mõne lähema aasta küsimus. Seega on peagi vähemalt teoreetiliselt
võimalik ennustada kõigi inimorganismis leiduvate valkude primaarstruktuuri. Kuigi
ka see probleem võib mõnel juhul osutuda väga komplitseerituks nagu edaspidi
näeme, saab enamuse valkude järjestust ennustada. Valkude omaduste ja
funktsioonide mõistmiseks oleks aga vajalik ennustada valkude ruumilist struktuuri.
Ruumilse struktuuri ennustamine on võimalik aga ainult neil valkudel, mille
homoloogi jaoks on see juba teada. Veelgi keerulisem probleem on valgu funktsiooni
ennustamine järjestuse alusel. See on küsimus struktuuri ja funktsiooni vahekorrast.
Valkude puhul oleme paraku struktuuri ja funktsiooni seoste mõistmisel üksikute
valkude kirjeldamise tasemel. Küsimusele, millised on valkude struktuuri ja
funktsiooni vahelise sõltuvuse üldised printsiibid ja kas neid üldse olemas on, ei ole
praeguse teadmiste taseme juures veel võimalik täpselt vastata. On küll selge, et
valgulistel ensüümidel on eraldi struktuurne domään ensümaatilise reaktsiooni
läbiviimiseks - aktiivtsenter. Teades ainult valgu aminohappelist järjestust on
aktiivtsentri asukohta valgus ja selle poolt katalüüsitavat reaktsiooni seni võimalik
ennustada vaid homoloogia põhjal.
I 1.a.Valgu struktuuri tekkimine sünteesi käigus
Valgud sünteesitakse vastavalt mRNA programmile ribosoomides. Enamusel valkudest
tekib funktsionaalne struktuur juba sünteesi käigus ja see protsess toimub väga kiiresti
(alla 1 min.). Siinjuures on oluline millises keskonnas toimub valgu süntees. Paljud
valgud sünteesitaks membraanseoseliste ribosoomide poolt nii, et valk satub peale
sünteesi kohe membraani ja sel juhul toimub valgu struktuuri teke (järjestuse voltumine)
membraanis. Membraanis on tegemist hüdrofoobse keskkonnaga, mis aitab tekitada
spetsiifilisel valgu konformatsioonil. Teised valgud aga sünteesitakse vabade
ribosoomide poolt ja nad satuvad peale sünteesi tsütoplasmasse vee keskonda
(hüdrofiilne keskkond), mis ei jäta oma mõju avaldamata valgu voltumisele ja sel juhul
tekib teistsugune valgu ruumiline struktuur. Valkude struktuuri teke ei toimu siiski ainult
keskonna toimel n.ö. iseenese tarkusest. Valgu struktuuri teket sünteesi käigus ja selle
järgselt suunavad erilised valgud - molekulaarsed ‘ chaperonid ’ e. ’lapsehoidjad’.
Need valgud võtavad sünteesitava polüpeptiid juba ribosoomis oma rüppe ja aitavad
valgu struktuuri tekkimisele kaasa või takistavad lõpliku ruumilise struktuuri teket enne
kui valk on viidud oma lõplikule kohale rakus. Chaperonid suunavad enamuse valkude
voltumist sünteesi käigus. Mõnede (peamiselt väiksemate, alla 150 aminohappe jäägist
koosnevate) valkude ruumiline struktuur tekib iseeneset sünteesi käigus ja ei vaja
8
lisafaktoreid. Sel juhul on kogu ruumilse struktuuri tekkeks vajalik informatsioon
olemas valgu primaarstruktuuris. Üks hästiuuritud näide on ribonukleaas A (RNaas A).
Kui RNaas A molekul denatureerida st. lõhkuda tema ruumiline struktuur kas
kuumutamise või keemiliste ainetega, siis jääb valguahela primaarstruktuur
muutumatuks ja lagunevad ainult nõrgad sidemed, mis hoiavad valgu ruumilist
struktuuri. Sobivates keskonnatingimustes tema aktiivne konformatsioon taastub. Seda
protsessi nimetatakse valgu renatureeumiseks. Mõnede valkude renatureerimiseks on
vajalikud kofaktorid, valgu ligandid, mis stabiliseerivad tema ruumilst struktuuri.
Sellised kofaktorid võivad olla näiteks metalli ioonid , mis moodustavad valgu
struktuuris koordinatiivseid sidemeid . Renatureerimine on aeglane protsess võrreldes
valgusünteesi käigus toimuva struktuuri tekkega. Renatureerumist kiirendavad mitmed
ensüümid (valgu disulfiid isomeraas , peptidüül-prolüül isomeraasid), mis kiirendavad
disulfiidsidemete vahetust või proliini konformatsiooni muutust. Need reaktsioonid on
iseenesest väga aeglased ja vajavad seepärast kiirendamist (proliini isomerisatsioon
joonisel 1.9). Valkude renatureerimist kiirendavad ka eelnimetatud molekulaarsed
‘lapsehoidjad’ (chaperonid). Chaperonid on väga suur molekulide klass, millest osa
toimivad valgusünteesi käigus, teised osalevad valgu transpordil ja hoiavad ära lõpliku
struktuuri tekke, kolmandad aga osalevad valkude renatureerimisel. Viimaste hulka
kuulub Hsp 60 ( heat  shock  protein nn. kuumaehmatuse valk) valkude perekond
( bakterites GroE), mis koosneb 14st 60 kDa molekulmassiga subühikust. Hsp 60
moodustab toru, millesse siseneb denatureeritud valk, kus ta ATP hüdrolüüsi abil lahti
harutatakse ja seejärel tema aktiivne struktuur taastatakse. Kuna temperatuuri tõusuga
kaasneb paljude valkude ruumilise struktuuri muutus ja seega ka füsioloogilise
aktiivsuse kadu, siis on kuumaehmatuse valgud vajalikud rakkude temperatuuritaluvuse
tagamiseks. Seega on valkude ruumilise struktuuri tekkimiseks mitmeid erinevaid teid:
kotranslatsiooniline (valgu sünteesi käigus), lokalisatsioonist sõltuv (peale transporti
raku kompartementi), iseeneslik ja ümbervoltumine (molekulaarsete ‘lapsehoidjate’
poolt suunatav struktuuri muutus).
I 2. Nukleiinhapete struktuur
Nukleiinhapete struktuur on bioloogiliselt väga oluline. Nende struktuur on
nukleiinhapete funktsioneerimise aluseks. Kuna nukleiinhapped on päriliku
informatsiooni kandjad , siis on geneetilise teabe ülekande ja säilitamise mõistmiseks
vaja tunda nukleiinhapete ehitust. Päriliku informatsiooni füüsikaline olemus on peidus
DNA kaksiheeliksis.
Nukleiinhapped koosnevad nukleotiididest ja viimased omakorda kolmest
komponendist: suhkur, lämmastikalus ja fosfaatjääk. Kaks looduslikku nukleiinhappe
liiki - desoksüribo- (DNA) ja ribonukleiinhape (RNA) erinevad omavahel suhkrujäägi
poolest. DNA sisaldab desoksüriboosi ja RNA riboosi . Sarnaselt valkudega koosnevad
nukleiinhapped selgroost, mis on ühesuguse lüli kordus, ja külgahelatest.
Nukleiinhappe selgroo moodustavad suhkrujääk ja fosfaatjääk (joonis 1.5).
Suhkrujäägid on seotud fosfaatidega fosfodiestersidemete abil. Nukleiinhapete
külgahelateks on lämmastikalused (joonised 4.4 ja 4.5). Nukleiinhappe monomeer on
nukleotiid , mis koosneb ühest suhkrujäägist, lämmastikalusest ja fosfaatjäägist
(lämmastikaluseid ja fosfaatjääke võib nukleotiidis olla mitu nagu näiteks ATP või
NADP). Suhkrujääk koos lämmastikalusega moodustavad nukleosiidi. Kuna suhkur ja
fosfaat on kõigil nukleotiididel samad (suhkur võib olla kas riboos või desoksüriboos),
siis nimetatakse nukleosiide ja nukleotiide lämmastikaluste järgi (vt. tabel 4.1)
Tabel 4.1
N-alus
nukleosiid
nukleotiid
nukleotiidi lühend
9
RNA
DNA
adeniin
adenosiin
adenüülhape
AMP
dAMP
guaniin
guanosiin
guanüülhape
GMP
dGMP
tsütosiin
tsütidiin
tsütosüülhape
CMP
dCMP
tümiin
tümidiin
tümidüülhape
dTMP
uratsiil
uridiin
uridüülhape
UMP
Lämmastikaluseid on kahte tüüpi: puriinid (joonis 4.5) ja pürimidiinid (4.4). Puriinid,
mis koosnevad 9-aatomilisest heterotsüklist on adeniin ja guaniin. Pürimidiinid
koosnevad 6-lülilisest heterotsüklist ja nende hulka kuuluvad tsütosiin, tümiin ja
uratsiil.
Suhkrud riboos ja desoksüriboos kuuluvad pentooside st. 5-süsinikuliste suhkrute
hulka, kusjuures 1. ja 4. süsiniku aatomid moodustavad 4’ hapniku aatomi varal tsükli.
Lämmastikalus on seotud alati suhkru 1. süsiniku aatomiga C-N glükosiidsideme abil
(vt. joonised 4.6 ja 4.8). Kõik aatomid nii suhkrujäägis kui lämmastikalustes on
nummerdatud vastavalt keemilisele nomenklatuurile. Selleks, et teha vahet suhkru ja N-
aluse aatomite vahel, tähistatakse suhkru aatomeid liskas numbrile ka ‘-ga (C1’, C2’,
C3’, O3’ jne). Fosfaatjäägiga on seotud 3’ ja 5’ C-aatomid. Nukleosiid trifosfaatides
on fosfaadid seotud C5’-ga. Suhkru aatomite järgi nimetatakse ka nukleiinhapete otsi 5’
ja 3’ otsteks. Nukleiinhapped sünteesitakse 5’ otsast alates 3’ suunas. Seejuures
lisatakse vabale 3’OH rühmale nukleotiid nii, et suhkru OH ühineb fosfaadi vesiniku
aatomiga ja tekkiv vee molekul vabaneb ning 3’C ja järgmise nukleotiidi fosfaadi
vahele tekib fosfoester side . Seega on nukleiinhappe sünteesil tegemist
polükondensatsioonireaktsiooniga.
Lämmastikalused on aromaatsed ühendid st. kõik heterotsükli aatomid paiknevad ühel
tasapinnal . Lämmastikalused moodustavad vesiniksidemeid, mille abil nad teineteisega
seonduvad. Seda nimetatakse aluste paardumiseks.
I 2.a DNA struktuur
J. Watson ja F. Crick esitasid 1953.a. DNA ruumilise struktuuri mudeli, mis hiljem
leidis eksperimetaalse tõestuse. Selle mudeli kohaselt koosneb DNA kahest
nukleiinhappe ahelast moodustades kaksikspiraali läbimõõduga 20 Å, milles suhkur-
fosfaat selgroog on väljaspool ja lämmastikalused asuvad heeliksi sisemuses.
Lämmastikalused paarduvad omavahel vesinisidemete abil. Paarid moodustuvad
puriinide ja pürimidiinide vahel. Adeniin paardub tümiiniga kahe H-sideme ja guaniin
tsütosiiniga kolme H-sideme varal. See mudel selgitab ka miks on DNA’s A sisaldus
võrdne T’ga ja G sisaldus C’ga (joonis 4.11). Vastavaid nukleotiidipaare nimetatakse
seepärast komplementaarseteks paarideks. Teisest küljest seletab Watsoni ja Cricki
mudel ka selle, et DNA on regulaarne ja ühtlase jämedusega kaksikspiraal. Ainult
komplemetaarsed paarid on isostruktuursed. Selline struktuur meenutab keerdtreppi,
mille astmeteks on komplemetaarsed aluspaarid ja astmed on omavahel seotud
mõlemast otsast suhkur-fosfaat karakssi abil. DNA kaksikheeliks teeb ühe täispöörde
34 Å kohta. Aluspaaride vahe on 3,4 Å. Seega on ühe täispöörde kohta 10 aluspaari .
DNA ahelad on kaksikheeliksis antiparalleelsed st. suhkru ja fosfaadi vahelised
fosfoester sidemed on vastas-ahelates vastassuunalised (vt. joonis 4.11). Järelikult on
ka ahelate otsad erinevad - ühes heeliksi otsas on esimese ahela desoksüriboosi 5’
süsinik (või sellega seotud fosfaatjääk) ja teise ahela 3’ süsinik ja sellega seotud OH
rühm. Heeliksi teises otsas on vastas-ahela desoksüriboosi 5’ süsinik ja esimese ahela
3’ süsinik ja sellega seotud OH rühm. DNA kaksiheeliks moodustab parempoolse
vindi. Iga kaksiheeliksi täispöörde kohta toimub üks kord ahelate teineteisest üleminek
ehk seotumine. Seepärast on ahelate lahutamiseks vajalik et kaksiheeliks teeks ümber
10
oma telje sama arv pöördeid kui temas on vinte. Kuna DNA ahelad on omavahel seotud
nõrkade - kuigi arvukate - vesiniksidemetega lämmastikaluste vahel, on DNA ahelad
omavahel lahutatavad. Temperatuuri tõstmisega on võimalik vesiniksidemed lõhkuda ja
DNA ahelad dissotseerida. See protsess on pöörduv. Tuleb aga silmas pidada, et DNA
ahelate paardumisel tekivad paljud struktuurid, kus ahelad on osaliselt iseendaga
paardunud , mis takistab kaksikahela teket. Samuti võivad tekkida struktuurid, kus eri
ahelad on küll omavahel paardunud, aga juhusliku komplementaarsuse alusel. Korrektse
kaksikahela tekkeks peavad kõik “valed” struktuurid lahti sulama ja see protsess võtab
aega kuni realiseerub korrektne kaksikahel, mis on kõige stabiilsem struktuur. Selleks,
et saada terves ulatuses paardunud DNA kaksikheeliks, on vaja ahelate paardumine
pika aja jooksul temperatuuril, kus ahelad on osaliselt paardunud ja “valed” struktuurid
ei püsi. DNA ahelate lahutamist temperatuuri toimel nimetatakse ka DNA sulamiseks.
DNA sulamise iseloomustamiseks kasutatakse sulamistemperatuuri - Tm, mõistet.  Tm
on temperatuur, mille juures ½ nukleiinhappe ahelates on lahti sulanud. See ei pea
tähendama, et pooled ahelad on eraldi, vaid võib tähendada ka, et kõik ahelad on
pooles ulatuses paardunud. Kuna G-C paaril moodustub 3 vesiniksidet A-T paari 2
vastu, siis on G-C paarid stabiilsemad ja järelikult DNA piirkonnad, mis sisaldavad
rohkem G ja C nukleotiide on stabiilsemad ja sulavad kõrgemal temperatuuril.
DNA kaksikahel võib eksisteerida mitmes erinevas vormis olenevalt
keskkonnatingimustest (A, B, C, D ja Z vormid). Rakkudes on DNA põhiliselt B-
vormis, mida iseloomustavad aluspaaride väike kalle heeliksi telje suhtes, aluspaaride
asumine heeliksi keskel ( teljel ) ja suur ja väike vagu (külgvaates, vt. joonis 5.8). B-
vormis DNA biheeliks on kõige painduvam DNA kaheahelaline vorm, mis võib
iseenesest moodustada rõnga umbes 200 aluspaari pikkuse lõigu kohta. See viimane
omadus võimaldab DNA tihedat pakkimis kromosoomidesse ja nukleosoomide
moodustumist.
RNA struktuurset omapära käsitleme edaspidi koos valgusünteesiga.
DNA kõrgemat järku struktuurid ja seda mõjutavad ensüümid
helikaasid, topoisomeraasid
II Valgu biosüntees e. geneetiline translatsioon
Nagu eespool kirjas, seisneb geneetiline translatsioon nukleiinhapetes kodeeritud
geneetilise informatsiooni (nukleotiidse järjestuse) tõlkimises valkude
aminohappeliseks järjestuseks. Valgu biosüntees jaotatakse kaheks etapiks -
preribosoomseks ja ribosoomseks. Esimese, väjaspool ribosoome toimuva protsessi
käigus toimub aminohappe aktiveerimine ATP’ga ja aminohappe ühendamine
spetsiifilise tRNA’ga, sünteesitakse aminoatsüül-tRNA (aa-tRNA). Ribosoomides
viiakse läbi valgu biosüntees vastavalt mRNA programmile kusjuures substraadina
kasutatakse aminoatsüül-tRNA’d. Selles protsessis on oluline osa adaptormolekulil -
tRNA’l. Just aa-tRNA’s seotakse aminohape vastava nukleiinhappe järjestusega -
antikoodoniga. Igal tRNA molekulil on oma 3-st nukleotiidist koosnev  antikoodon .
Nukleiinhppe järjestusest valgu järjestuseks üleminek toimub geneetilise koodi alusel.
IIa Geneetiline kood
11
Geneetiline kood tehti kindlaks selle sajandi 60-ndate esimesel poolel põhiliselt M.
Nirenberg’i, Ph. Leder’i ja K. Khorona tööde tulemusena. Geneetiline kood on
sõnastik, mille abil tõlgitakse nukleiinhapete järjestuses sisalduv gneetiline
informatsioon valkude aminohappeliseks järjestuseks. Kolme nukleotiidiline järjestus
(koodon) vastab ühele aminohappele . Kuna valgusünteesil on informatsiooni kandjaks
RNA (mRNA), siis moodustuvad koodonid neljast erinevast nukleotiidist (A, C, G ja
U). Nelja nukleotiidi kolme kaupa kombineerides saame 43=64. Seega koosneb
geneetilise koodi sõnastik 64’st kolmetähelisest sõnast, millele vastavad 20 erinevat
aminohapet. See elu seisukohalt väga oluline sõnastik on enamuses organismides sama
nn. universaalne geneetiline kood (UGK). Erandeid käsitleme allpool eraldi. Koodi
universaalsust kasutatakse elu monofüleetilise päritolu argumendina, kuigi rangelt
võttes näitab see ainult UGK monofüleetilist päritolu. Küsimus, kas saab rääkida elust
ilma geneetilise koodita, jääb molekulaarbioloogia kursusest väjapoole.
Nukleotiididest moodustunud sõnu on rohkem kui aminohappeid , seega on osa
koodoneid sünonüümsed st. neil on sama tähendus ja nad kodeerivad samu
aminohappeid. Lisaks aminohappeid kodeerivatele koodonitele on UGK’s ka kolm stop
koodonit , millele ei vasta ühtegi aminohapet, aga mida kasutatakse valgusünteesi
lõpetamisel nagu punkti lause lõpus. Stop koodoneid e. terminaatoreid tunnevad ära
terminatsioonifaktorid, mis osalevad valgusünteesi lõpetamisel (vt. valgusünteesi
terminatsioon). Stop koodoneid on kutsutud ka nonsens koodoniteks, aga see ei ole
täpne termin, kuna stop koodonitel on kindel tähendus. Tegelikud  nonsens koodnid on
need, millele ei vasta ükski aminohape, ega ka mingi muu tähendus (vt. allpool).
Koodonite ja aminohapete vastavust kujutatakse tavaliselt tabelina (vt. Tabel 2
Universaalne geneetiline kood). Koodi tabelis vastab ühele aminohappele 1-6
koodonit. Geneetilise koodi mitmetähenduslikkus, ühele aminohappele mitme koodoni
vastavust, nimetatakse koodi kõdumiseks. Informatsiooni kõdumine geneetilise
informatsiooni käigus näitab, et nukleiinhappe järjestuse tõlkimisel valgu järjestuseks
läheb osa informatsiooni kaduma - valgu järjestusest nukleiinhappe järjestuseks ei ole
ühetähenduslikku tagasiteed.
Tabel 2 Universaalne geneetiline kood. Koodoni perekonnad on rasvases kirjas ja stop
koodonid on punased.
1.\2. täht
U
C
A
G
3.täht
UUU-Phe
UCU -Ser
UAU-Tyr
UGU-Cys
U
UUC-Phe
UCC
UAC-Tyr
UGC-Cys
C
U
UUA-Leu
UCA
UAA-Stop
UGA-Stop
A
UUG-Leu
UCG
UAG-Stop
UGG-Trp
G
CUU-Leu
CCU-Pro
CAU-His
CGU-Arg
U
CUC
CCC
CAC-His
CGC
C
C
CUA
CCA
CAA-Gln
CGA
A
CUG
CCG
CAG-Gln
CGG
G
AUU-Ile
ACU-Thr
AAU-Asn
AGU-Ser
U
AUC-Ile
ACC
AAC-Asn
AGC-Ser
C
A
AUA-Ile
ACA
AAA-Lys
AGA-Arg
A
AUG-Met
ACG
AAG-Lys
AGG-Arg
G
GUU-Val
GCU-Ala
GAU-Asp
GGU-Gly
U
GUC
GCC
GAC-Asp
GGC
C
G
GUA
GCA
GAA-Glu
GGA
A
12
GUG
GCG
GAG-Glu
GGG
G
Geneetilise koodi organisatsioon ei ole juhuslik. Aminohapped on organiseeritud
koodis nii, et ühele aminohappele vastavad koodonid paiknevad tabelis lähestikku.
Erandid on seriin (Ser) ja arginiin (Arg), millele vastavad 6 eri koodonit. Neist 4
koodonit asuvad koos, nende koodonite 1. ja 2. täht on identsed. Ülejäänud 2 koodonit
aga asuvad eraldi. Sellist koodonite rühma, mille tähendus on määratud 1. ja 2. tähe
abil st. olenemata koodoni 3. positsioonist ja mis vastavad kõik ühele aminohappele,
nimetatakse koodoni perekonnaks.
Erinevatel koodoni positsioonidel on erinev osakaal aminohappe määramisel. Kõige
olulisem positsioon on koodoni teine täht st. keskmine positsioon. Tähtsuselt järgmine
on koodoni esimene täht. Kõige väiksema tähtsusega aminohappe määramisel on
koodoni kolmas täht. UGK’s on 8 koodoniperekonda, st. 8 aminohappe puhul ei ole
koodoni kolmas täht oluline aminohappe määramisel. Ka ülejäänud aminohapete puhul
on koodoni kolmas täht väiksema tähtsusega, 7 aminohappe puhul on koodoni tähendus
määratud kolmanda positsiooni puriini või pürimidiiniga. Enamasti määrab koodoni
tähenduse kolmandas positsioonis olev puriin (A või G) ehk siis pürimidiin (C või U).
20st UGK’s esindatud aminohappest on kolmas täht ühetähenduslik ainult kahe
aminohappe puhul, metioniinil (Met) ja trüptofaanil (Trp). Neile kahele vastab vaid üks
koodon kummalegi. Seejuures on nii Met kui Trp koodonitel viimane täht puriin (G).
Pürimidiin koodoni kolmandas positsioonis ei mõjuta koodoni identsust, st. olenemata
sellest kas kolmas täht on U või C vastab koodon ikka samale aminohappele. Koodoni
kolmanda tähe mitmetäheduslikkus ehk koodi kõdumine võimaldab sama
aminohappelist järjestust kodeerida erinevate nukleiinhppe järjestuste abil. Kolmanda
koodoni tähe asendusi, mis ei muuda valgu aminohappelist järjestust, nimetatakse
sünonüümseteks asendusteks. Viimased on suure tähtsusega geenide evolutsioonilise
võrdlemise juures, aga samuti genoomi ehitusest tulenevate seaduspärasuste puhul.
Erinevate koodonite kasutamine on erinevates organismirühmades erinev ja ka
erinevatel geenidel erinev, aga seda vaatleme lähemalt eraldi.
Geneetilise koodi struktuur väljendub ka tRNA ehituses ja koodon-antikoodon
seondumise spetsiifikas. Koodon-antikoodon interaktsioon  toimub ribosoomis, kus
mRNA koodonile seatakse vastavusse tRNA antikoodon. RNA ehituse geomeetriast
tulenevalt on RNA A vormis kaksikheeliksis G-nukleotiidil võimalik paarduda lisaks
C’le ka U’ga. Selline paardumine saab stabiilselt toimuda teatud konformatsioonilise
vabaduse olemasolu korral. G-U paardumiseks vajalik struktuurne vabadus on olemas
koodon-antikoodon paardumisel koodoni kolmandas positsioonis (vastab antikoodoni
esimesele tähele). Koodoni kolmanda positsiooni suuremat vabadust paardumisel
nimetatakse “wobble” reegliks (wobble - ingl. k. võnkuma, võbisema). Vastavalt
“wobble” reeglile võib koodoni kolmandas positsioonis toimuda G-C ja G-U
paardumine võrdse eduga st. nii koodoni kolmandas positsioonis kui antikoodoni
esimeses positsioonis olev G võib paarduda C või U’ga. Seega suudab tRNA, mille
antikoodoni 1. positsioonis on G dekodeerida (ribosoomide abil transleerida e. lülitada
koodonile vastav aminohape valguahelasse) koodoneid, mille kaks esimest tähte on
samad ja kolmandaks on pürimidiin (C või U), teine tRNA, mille antikoodoni esimene
täht on U suudab dekodeerida koodoneid, mille kolmandas positsioonis on puriin (G
või A). Siit järeldub, et iga tRNA suudab dekodeerida kahte koodonit juhul kui tema
antikoodoni esimeses positsioonis on G või U. Tõepoolest, enamusel tRNA’dest ongi
esimeses positsioonis kas G või U. “Wobble” reegel võimaldab organismidel
tRNA’sid kokku hoida - 61 aminohappeid kodeeriva koodoni transleerimiseks kasutab
enamus organisme alla 40 erineva tRNA molekuli. Paraku on siin ka erandid -
13
metioniinil (Met), nagu juba öeldud, on vaid üks koodon - AUG. Met-tRNA
antikoodoni esimeses positsioonis on C nukleotiid, mis paardub ainult G’ga ja seega ei
ole Met-tRNA võimeline transleerima AUG’le lähimat koodonit AUA, mis vastab
isoleutsiinile. Teine erand on trüptofaani (Trp) tRNA, millel samuti antikoodoni
esimeses positsioonis C. Siiski toimub trüptofaani lülitamine tema koodonile (UGG)
lähedase, stop-koodoni (UGA) kohal suurema sagedusega kui teiste stop-koodonite
kohale aminohappe lülitumine. Sellist nähtust kus koodonit transleeritakse valesti
tuntakse valelugemisemise (miscoding, misreading ingl.k.) nime all. Koodon-
antikoodon paardumist kirjeldavad “koodilugemise reeglid”, mis seavad vastavusse
tRNA antikoodoneis sageli esinevad modifitseeritud nukleosiidid vastavate
koodonitega. Näiteks ei paardu tio-uridiin millegagi peale adeniini, mitokondrites ja
mükoplasmades aga suudab harilik U antikoodoni esimeses positsioonis dekodeerida
kõiki nelja koodoniperekonna liiget st. olenemata koodoni kolmandast tähest nn.
“neljane wobble”. Koodilugemise reeglid on täpsemalt kirjeldatud peatüki lõpus antud
viites (Osawa, et al., 1992).
Sarnased aminohapped paiknevad kooditabelis lähestikku. See tähendab, et juhuslikud
vead koodi lugemisel (valgusünteesil) ei muuda sünteesitava valgu omadusi eriti suures
ulatuses kuna aminohape asendub lähedaste omadutega aminohappega. Teiste sõnadega,
geneetiline kood on müra suhtes vähetundlik. Seda fakti, et universaalne geneetiline
kood on vigade summutamise suhtes optimaalne, on kasutatud argumendina geneetilise
koodi evolutsioneerumise tõestuseks. Teine seisukoht on, et kood on “külmunud
õnnetus”, mis tähendab, et kui kood kord tekkis, siis ei saanud ta enam muutuda kuna iga
muutus koodis tooks kaasa asenduse kõigis kodeeritud valkudes, see aga oleks
organismile väljakannatamatu. Alternatiivsete koodide puhul, mida käsitleme allpool,
on siiski mitmed asendused UGK’st aset leidnud, aga see on võimalik olnud ainult väga
väikeste genoomide korral. Tõenäoliseks tuleb pidada UGK küllalt pikaajalist
evolutsiooni. Eri küsimus on aga see, miks mingile kindlale koodonile vastab just see
konkreetne aminohape. Näiteks, miks koodonid UUU ja UUC kodeerivad
fenüülalaniini, aga koodoni perekond GGN kodeerivad glütsiini. Kas see võiks ka olla
vastupidi. Sellele huvitavale küsimusele on püütud vastata stereokeemiliste
(aminohappe seondumine oma koodoni või antikoodoniga) ja funktsionaalsete
argumentidega (eri aminohapete peptiidsideme moodustamise reaktsioonivõime ja
vastava koodon-antikoodon seondumise stabiilsuse vahel on negatiivne korrelatsioon).
Veenvat eksperimentaalnset tõestust pole kummagi argumendi kasuks seni avaldatud.
Järelikult on küsimus UGK tekkimisest ja tähendusest lahtine .
Nagu eespool juba märgitud vastab mõnele aminohappele 1 koodon, enamusele 2 või 4,
aga mõnele koguni 6 koodonit (alternatiivsete koodide puhul kuni 8 koodonit). On selge
positiivne seos aminohappe valkudes esinemise sageduse ja nendele kooditabelis
vastavate koodonite arvu vahel, mida sagedamini esinev aminohape, seda rohkem
vastab talle koodoneid (vt. joon. 9.2). Ka see fakt viitab koodi otstarbekohasusele ja
seega evolutsioonilisele optimiseeritusele e. pikale evolutsioonilisele ajaloole.
Valguahelat kodeerivad koodonid on järjestikku. Seetõttu on võimalik sama mRNA
järjestust tõlkida valguks kolmes erinevas “lugemisraamis”. Näiteks järjestus:
AUGGCUUCGCUCAA,
 tähendab esimeses lugemisraamis (alustades lugemist esimesest koodonist, AUG)
 Met-Ala-Ser-Leu,
teises raamis (nimetatakse ka +1 raamiks) on järjestus: UGGCUUCGCUCA, mis vastab
valgujärjestusele:
Cys-Leu-Arg-Ser,
14
kolmandas raamis (ka -1 raam) GGCUUCGCUCAA kodeerib sama RNA järjestusega
aminohappeid:
Gly-Phe-Ala-Glu
Näeme et need valgu järjestused on täiesti erinevad, vaid Ala ja Leu esinevad
korduvalt ja sedagi erinevais positsioonides. Järelikult on sama nukleotiidset järjestust
võimalik “tõlikida” valgu järjestuseks kolmes eri tähenduses.
Alternatiivsed koodid
Universaalsest geneetilisest koodist erinevaid koode esineb paljudes taksonites. Eriti
sagedased on alternatiivsed koodid väikese genoomiga organismides. Kõige väiksemad
genoomid on mitokondritel ja seega ei ole üllatav, et just mitokondrites on erinevused
universaalsest koodist üldiselt levinud. Mitokondrid jagunevad geneetilise koodi
poolest kaheks - taimsed mitokondrid, mis kasutavad universaalset koodi ja mitte-
taimsed mitokondrid, mille koodid erinevad UGK’st. Genoomi suuruse ja koodi
stabiilsuse vaheline seos tuleneb koodi “külmunud” olemusest. Kui geneetilises koodis
ühe koodoni tähendus muutub (näiteks hakkab üks tRNA ära tundma uut koodonit) siis
toob see kaasa mutatsiooni kõikides geenides, kus vastav koodon esineb. Üheaegne
muutus paljude valkude primaarstruktuuris on suure tõenäosusega organismile kahjulik.
Seepärast on muutused geneetilises koodis letaalsed. Väga väikeste genoomide puhul
võib üks kindel koodon esineda ainult ühes või kahes geenis ja üksikud aminohappe
asendused valkudes ei pruugi omada väga suurt mõju organismi eluvõimele. Sellisel
juhul saavad juhuslikud muutused geneetilises koodis evolutsiooniliselt fikseeruda,
mille tulemusel tekib alternatiivne geneetiline kood. Siiski on ka väikeste genoomide
puhul koodi muutumise kiirus väga aeglane, enamuse koodonite osas on kõik erinevad
koodid samad.
Vaatleme näitena selgroogsete organismide mitokondrite kooditabelit koos vastavate
antikoodonitega (A.K.):
aminohape  A.K.
aminohape  A.K.
aminohape  A.K.
Aminohape  A.K.
(koodon)
(koodon)
(koodon)
(koodon)
Phe (UUU)
Ser (UCU)
Tyr (UAU)
Cys (UGU)
Phe (UUC) GAA
Ser (UCC)
Tyr (UAC) GUA
Cys (UGC) GCA
Leu (UUA) UAA
Ser (UCA) UGA
Stop (UAA)
Trp (UGA) UCA
Leu (UUG)
Ser (UCG)
Stop (UAG)
Trp (UGG)
Leu (CUU)
Pro (CCU)
His (CAU)
Arg (CGU)
Leu (CUC)
Pro (CCC)
His (CAC) GUG
Arg (CGC)
Leu (CUA) UAG
Pro (CCA) UGG
Gln (CAA) UUG
Arg (CGA) UCG
Leu (CUG)
Pro (CCG)
Gln (CAG)
Arg (CGG)
Ile (AUU)
Thr (ACU)
Asn (AAU)
Ser (AGU)
Ile (AUC)  GAU
Thr (ACC)
Asn (AAC) GUU
Ser (AGC) GCU
Met (AUA) UAU
Thr (ACA) UGU
Lys (AAA) UUU
Stop (AGA)
Met (AUG)
Thr (ACG)
Lys (AAG)
Stop (AGG)
Val (GUU)
Ala (GCU)
Asp (GAU)
Gly (GGU)
Val (GUC)
Ala (GCC)
Asp (GAC) GUC
Gly (GGC)
Val (GUA) UAC
Ala (GCA) UGC
Glu (GAA) UUC
Gly (GGA) UCC
Val (GUG)
Ala (GCG)
Glu (GAG)
Gly (GGG)
Koodonite perekonnad on rasvases kirjas, antikoodon on kirjutatud komplementaarse
koodoni taha. Nagu tabelist näha on selgroogsete organismide mitokondriaalne
geneetiline kood lihtsam kui universaalne kood. Kõik koodonipaarid (3. positsioonis Pu
15
või Py) kodeerivad samu aminohappeid, erinevalt UGK’st vastab AUA koodon
metioniinile ja mitte isoleutsiinile, UGK stop koodon UGA vastab siin trüptofaanile,
lisaks on arginiinil vaid 4 koodonit ja UGK Arg koodonid AGPy vastavad siin stop
koodonitele, mida on kokku 4 (UGK’s on 3 stop koodonit). Selline koodi
organisatsioon võimaldab vertebraatide mitokondritel valku sünteesida väiksema arvu
tRNA’dega kui UGK’d kasutavates organismides. Vertebraatide mitokondrite kõigi
koodoniperekondade transleerimisel osaleb ainult üks tRNA, mis moodustab “neljase
wobble” paari kõigi nelja koodoniga. Väärib märkimist, et kõigil 4 koodonit
kodeerivatel tRNA’del on antikoodoni 1. positsioonis U. Mitokondrite koodide
evolutsiooniline suhe on kujutatud joonisel 9.6.
Lisaks mitokondritele esineb üksikuid kõrvalekaldeid UGK’st ka teistes oragnismides.
Eriti sage asendus on stop koodoni UGA asendumine Trp koodoniga. Neil organismidel
on ainult kaks stop koodonit. Mõnedel pärmseentel Candida perekonnast esineb
universaalse koodi leutsiini koodoni, CUG transleerimine seriinina. Seejuures
transleerib CUG koodonit seriini -tRNA antikoodoniga CAG. Erakordne siinjuures on
aga fakt, et see tRNASerCAG lülitab peptiidahelasse nii seriini kui leutsiini, viimast küll
väikese sagedusega. Seega on Candida pärmidel leutsiini koodon CUG
mitmetähenduslik. Selline olukord võis tekkida evolutsiooni käigus seetõttu, et koodonit
CUG kasutatakse pärmides harva ja selle muutus ei omanud mingil evolutsiooni
perioodil letaalset mõju.
Huvitav fenomen on ka koodonite ning vastavate tRNA’de puudumine. Mycoplasma
capricolum genoom ei sisalda (niipalju kui teada) CGG koodonit ega ka vastavat
tRNAArgCCG geeni. Kui sellese organismi viia CGG koodonit sisaldav geen, siis
viimase translatsioon peatub CGG koodoni kohal. Sellist asendumist seletatakse
‘genoomi AT survega ’ (vt. koodonite kasutamisest) koodoni kasutusele, mille
tuelemusena arginiini jaoks kasutatakse põhiliselt AGPu koodoneid. Pärmi
Torulopsis glabrata mitokondriaalsed geenid ei sislada ühtegi CGN koodonit, ega ka
vastavat tRNA geeni ei ole leitud. Ka siin võib oletada genoomi AT survet , kuna
pärmi mitokondritel on see kõrge. Kurioosumina puudub bakteril Micrococcus
luteus kuus koodonit (UUA-Leu, CUA-Leu, AUA-Ile, GUA-Val, CAA-Gln ja AGA-Arg).
Seega on siin geneetilise koodi evolutsiooniks vaba ruumi. Koodonid, millel puudub
tähendus on tõelised nonsens koodonid.
Koodonite kasutamisest.
Kuna koodoneid on kolm korda rohkem kui kodeeritud aminohappeid, siis on igal
organismil vabadus valida milliseid koodoneid kasutada rohkem ja milliseid vähem.
Koodonite ebavõrdset kasutamist eri organismides ja ühe organismi eri geenides on
palju analüüsitud. On kindlaks tehtud mõned üldised reeglid koodonite kasutamise
kohta.
Kõigepealt nn. genoomi efekt: igale genoomile on omane kindel aluspaaride
sisaldus, G-C paaride osa kogu DNA aluspaaride hulgast väljendab GC%
(G+C/A+C+G+T). See väärtus kõigub 0,3 - 0,7. Kõrge GC sisaldusega organismidel
on koodoni kolmandas positsioonis enamasti G või C nukleotiid. Vastupidine on
olukord madala GC sisaldusega genoomides, kus koodoni kolmandas positsioonis on
sagedamini A või T. Genoomi efekti juurde pöördume tagasi genoomi peatükis.
Teine oluline seaduspära seondub valgusünteesiga ja on energeetiline printsiip.
Erinevatel valgugeenidel on erinev koodni kasutus vastavalt valkude
ekspressioonitasemele (sünteesi kogusele). Ainult suhteliselt väike osa geenidest
(alla 10%) avaldub kõrgel tasemel, nende produkte sünteesitakse rakus suures
koguses. Need ohtralt avalduvad geenid kasutavad väikest arvu koodoneid. See
16
seaduspära paistab eriti silma nende aminohapete puhul, millele vastab 4 või 6
koodonit aga on täiesti märgatav ka 2 koodoniste aminohapete puhul. Ohtralt
avalduvatele geenidele vastavad mRNA’d, kuigi neid on vähe liike, moodutavad
suurema osa mRNA koguhulgast rakus. Seega on raku valgusünteesiaparaat ametis
põhiliselt just kõrgelt ekspresseeruvate valkude sünteesiga. Järelikult kulub rakus
rohkem tRNA’sid, mis kodeerivad ohtralt avalduvates mRNA’des sageli esinevaid
koodoneid. Sellise koodoni kasutamisega on suurem osa rakus olevatest mRNA’dest
võimalik transleerida vähese arvu tRNA’dega, mida on rakus kõrgemas
kontsentratsioonis. Selline “tööjaotus” tRNA’de vahel võimaldab rakkudel
sünteesida väiksemat arvu tRNA’sid ja seega energiat säästa. Seda seaduspära võib
nimetada ka tRNA’de standardiseerimiseks.
Järgmine seaduspära koodonite kasutamisel seondub samuti valgusünteesiga ja
seisneb nn. konteksti efektis. Nimelt ei ole koodonite järgnevus juhuslik, koodoni
kolmas täht sõltub järgmisest koodonist. Kuna koodoni esimene ja teine täht
määravad aminohappe, siis nende osas on valikuvabadus väiksem. Koodonite
konteksti efekt on nii tugev, et seda on võimalik edukalt kasutada kodeerivate
järjestuste leidmiseks. Kodeerivate järjestuste leidmine on sajandilõpu
molekulaarbioloogias aktuaalne probleem suure hulga DNA järjestuse andmete
akumuleerumise tõttu. Sageli ei ole nende järjestuste kohta kuigi palju teada. Veelgi
enam, eukarüootsete geenide intron-ekson struktuuri tõttu ei ole kuigi ekrge
kodeerivaid järjestusi ära tunda. Seetõttu kasutataksegi koodnite kasutamise ja
koodonite konteksti andmeid kodeerivate piirkondade indentifitseerimiseks. Koodoni
konteksti põhjused ei ole paraku veel selged. Eriti tugev on konteksti efekt stop
koodonite puhul ja kontekst mõjutab oluliselt valgusünteesi terminatsiooni
efektiivsust .
Täiendav kirjandus geneetilise koodi kohta:
Osawa, S., Jukes, T. H., Watanabe, K., Muto, A., (1992) Recent evidence for evolution
of the genetic code . Microbiological Reviews 56, (1), p. 229-264
Suzuki, T., Ueda, T., Watanabe, K., (1997) The ‘polysemous’ codon - a codon with
multiple amino acid assignment caused by dual specificity of tRNA identity . EMBO J.
16, (5), p. 1122-1134
IIb tRNA ja valgusünteesi preribosomaalne etapp
Transport-RNA struktuur
Transport RNA (tRNA) avastati 50. aastate lõpul. Varem oli F. Crick ennustatud
adaptormolekuli, mis seaks aminohappe vastavusse nukleotiidse koodoniga. Sellest
ajast alates on tRNA olnud üks enam-uuritud biomolekul . tRNA oli esimene RNA,
mille primaarstruktuur kindlaks tehti ja samuti esimene RNA molekul, mille ruumilist
struktuuri tundma õpiti. Tänaseks on teada paljude tuhandete tRNA molekulide
primaarstruktuur väga pajudes eri liikidest. Kõigi tuntud tRNA molekulide ruumiline
struktuur on sarnane nii sekudaar- kui tetsiaarstruktuuri tasemel. tRNA molekulide
pikkus varieerub tavaliselt 74-92 nukleotiidini, kuigi üksikud erandid on mõnevõrra
lühemad või pikemad . tRNA nukleotiidid on nummerdatud ühtse nomenklatuuri alusel,
esimene nukleotiid on 5’ otsas, antikoodoni moodustavad nukleotiidid 34, 35, 36 ja 3’
otsa konserveerunud järjestus CCA kannab numbreid 74-76 olenemata sellest mitu
nukleotiidi konkreetses tRNA molekulis on. Näiteks on lisalingus nukleotiidid 47, 47:1,
47:2,…. Samas puudub nukleotiid 47 paljudel tRNA molekulidel.
Sekundaarstruktuur on tRNA molekulidel samuti konserveerunud, mida
iseloomustatakse ristikheina lehe kujuga (vt. joon. 7.3). tRNA sekundaarstruktuuri
moodustavad 4 kaksiahelalist osa (õlga) ja 4 üksikahelalist piirkonda (3 lingu e. aasa ja
17
4 paardumata nukleotiidi 3’ otsas), mis paiknevad vastavate õlgade otstes (vt. joonis
7.4).
tRNA molekuli otsad asuvad lähestikku, nende paardumisel tekkiv kaksiahelaline osa e.
õlg kannab nime aktseptoorne õlg (acceptor arm). Viimase pikendus on üheahelaline
osa 3’ otsas, millele liidetakse estersidemega karbonüülradikaali kaudu aminohape
(joonis 7.3). Aktseptor-õlg on 7 aluspaari pikk.
T-õlg (ka Tψ C õlg) on saanud oma nime modifitseeritud lämmastikaluste pärast, mis
asuvad T-aasas. Järjestus Tψ C on tRNA T-aasas väga laialdaselt konserveerunud.
Need alused on ribosüültümidiin - T (tRNA sünteesi käigus on sellel kohal harilik U
nukleotiid, mis muudetakse tümidiiniks juba tRNA koosseisus nn. post-
transkriptsiooniline modifikatsioon ) ja pseudouridiin - ψ  (vt. joon. 9.4) (ka
pseudouridiin tekib transkriptsioonijärgse modifitseerimise tulemusena). T-õlg on 5
aluspaarine, aga T-aasa pikkus võib varieeruda 7-9 nukleotiidi ulatuses.
Antikoodon õlg on alati 5 aluspaari pikk ja nagu nimi ütleb, sisaldab antikoodon ling
kolme nukleotiidist antikoodonit, mis määrab tRNA koodoni spetsiifika. Antikoodon
lingus on alati 7 nukleotiidi. Ka antikoodon ling sisaldab modifitseeritud nukleotiide,
mida käsitleme lähemalt allpool.
D-õlg, mis koosneb tavaliselt 4 aluspaarist ja kannab D-lingu, on saanud nime
dihüdrouridiinjääkide (jällegi RNA sünteesijärgne modifikatsioon vt. joon. 9.4) alusel.
D-lingu pikkus on varieeruv .
Lisaks neile sisaldavad paljud tRNA molekulid lisaõlga ja/või lisalingu, mille pikkus
võib varieeruda laias vahemikus.
tRNA ruumiline struktuur tekib heeliksite liitumise (coaxial stacking) teel, kusjuures
tekib L tähe kujuline struktuur, mille ühes otsas on antikoodon aas ja teise otsa (3’ otsa)
kinnitub aminohape (vt. joonised 7.5 ja 7.6). Omavahel liitunud aktseptoorne ja T-õlg
moodustavad ühise heeliksi. Teine heeliks tekib D-õla ja antikoodon õla liitumise
tulemusena. Ruumilises struktuuris satuvad D-aas ja T-aas lähestikku ja nad on
omavahel lämmastikaluste vaheliste vesiniksidemete abil seotud ( tertsiaarsed
vesiniksidemed), mis stabiliseerib tRNA molekuli struktuuri. Erinevate tRNA
molekulide ruumiline struktuur peab olema sarnane, kuna nad kõik peavad seonduma
ribosoomil samasse piirkonda. Seepärast on aminohappe ja antikoodoni vaheline
kaugus oluline parameeter , mis peab kõigil tRNA’del olema sama (70 Å).
tRNA funktsiooni seisukohalt on tähtsaim osa antikoodon (nukleotiidid 34-36).
Antikoodoni kolm nukleotiidi paarduvad mRNA kolme nukleotiidiga (koodoniga), mis
on geneetilise translatsiooni (nukleiinhappe järjestuse valgu järjestuseks tõlkimise)
struktuurseks aluseks. Seepärast on antikoodoni geomeetria oluline koodon-antikoodon
interaktsiooni toimumisel. Antikoodon aasas on alati (v.a. raaminihke suppressorid, vt.
allpool) 7 nukleotiidi, milles antikoodoni moodustavad 3 keskmist nukleotiidi.
Antikoodoni ees paikneb konserveerunud U33 nukleotiid, mille järel teeb
nukleiinhappe ahel järsu pöörde (vt. joonis 7.7). Antikoodoni kõik kolm nukleotiidi
paiknevad RNA ahela ühel küljel sarnases konformatsioonis nagu esineb RNA
kaheahelalises A vormis. Atikoodon on sobivas struktuuris koodoniga paardumiseks.
Antikoodon aasa struktuur on oluline ka lugemisraami hoidmisel, kuna U33 on
antikoodoni teljest järsult ära pööratud, siis ei saa see nukleotiid osaleda mRNA’ga
paardumisel pideva heeliksina. Tuleb silmas pidada, et nukleotiid 34, esimene
antikoodoni nukleotiid, paardub koodoni viimase, 3. nukleotiidiga ja seepärast on
oluline, et koodon-antikoodon interaktsioon lõppeks just 34. nukleotiidiga ega jätkuks
U33’ga. Seepärast määrab U33 juures toimuv järsk pööre ära koodon-antikoodon seose
pikkuse (3 aluspaari). Antikoodoni järel paiknevad nn. hüpermodifitseeritud
nukleotiidid, mis tavaliselt ei ole võimelised aluspaardumises osalema . On teada, et
18
modifitseeritud aluste olemasolu antikoodoni 3’ küljel on vajalik translatsiooni täpsuse
tagamiseks. Bakteri mutantides, kus mõni tRNA’d modifitseeriv ensüüm puudub,
tehakse valgusünteesil rohkem vigu.
tRNA teine oluline piirkond, 3’ ots, asub antikoodonist ~70 Å kaugusel. tRNA kolm
viimast nukleotiidi on CCA järjestus, mis seondub ribosoomis peptiidsideme
moodustumist katalüüsiva tsentriga.
Aminoatsüül-tRNA süntees
tRNA ruumiline struktuur on kõigil erinevatel tRNA molekulidel sarnane. See sarnasus
on vajalik tRNA funktsiooni täitmiseks valgusünteesil. Ribosoomidega seonduvad kõik
tRNA molekulid samadesse piirkondadesse aga samuti peavad kõik aa-tRNA
molekulid seonduma elongatsioonifaktor T’ga, mis transpordib neid ribosoomidesse,
nagu näeme edaspidi. Teisest küljest peavad kõik tRNA molekulid olema erinevad, et
tagada nende identiteeti st. igal tRNA liigil peavad olema mingid struktuursed
determinandid , mille järgi teda ära tuntakse ja mis määravad aminohappe spetsiifika.
Põhilised ensüümid, mis peavad tRNA molekuli identifitseerima on aminoatsüül-tRNA
süntetaasid e. ligaasid (tähistatakse lühenditega ARL või ARS aga samuti
kolmetäheline aminohappe lühend-RS, näiteks Ala-RS, Phe-RS). Edaspidi kasutan
lühiduse huvides nimetust süntetaasid. Viimased on geneetilise koodi realiseerimise
seisukohalt sama tähtsad kui tRNA. Just süntetaasid seavad vastavusse tRNA molekuli
ja vastava aminohappe. Seejuures peab süntetaas üheselt ära tundma nii tRNA kui
aminohappe ja seejärel nad omavahel estersidemega liitma .
Neid tRNA struktuuri elemente, mis määravad ära millise aminohappega tRNA
aminoatsüleeritakse, nimetatakse tRNA identsuse elementideks. tRNA identsuse
elemendid on tRNA nukleotiidid kindlates positsioonides. Siin tuleb arvestada, et üht
aminohapet kodeerib 1-6 koodonit ja seega tavaliselt mitu erinevat tRNA molekuli
(isoaktseptoorset tRNA’d), mis erinevad teineteisest antikoodoni järjestuse poolest.
Süntetaase on aga iga aminohappe jaoks üksainus (igas rakus on 20 erinevat süntetaasi,
nii nagu kodeeritud aminohappeidki). Seepärast peab üks süntetaas võrdselt hästi ära
tundma ja ühe ning sama spetsiifilise aminohappega aminoatsüleerima mitut erineva
antikoodoniga tRNA molekuli. Sama aminohappe spetsiifilistel tRNA liikidel
(isoaktseptoorsetel tRNA’del) on samased identsuse elemendid. Identsuse elemendid
on antikoodonis ainult osaliselt ja sedagi vaid nende nukleotiidide osas, mis on kõigil
isoaktseptoorsetel tRNA’del samad. Siiski on antikoodoni nukleotiididel tRNA
aminohappelise identsuse määramisel suur tähtsus. Kõik süntetaasid tunnevad ära 4.
nukleotiidi 3’ otsast st. nukleotiidi 73, mis on isoaktseptooretel tRNA’del identsed ja
mida seetõttu nimetatakse diskriminaator-aluseks. Suurem osa tRNA identsuse elemente
paiknevad kas aktseptoorses õlas või antikoodon lingus. Need kaks piirkonda on
süntetaasidega tihedas kompleksis, kusjuures ülejäänud tRNA molekul moodustab
süntetaasiga vaid üksikuid kontakte (vt. joonised 9.9-9.11).
Süntetaasid jaotuvad järjestuse homoloogia alusel kahte klassi. Klass 1 süntetaasidel
on N-terminaalne katalüütiline domään aminohappe ja nukleotiidi sidumiseks. Sama
domään sisaldab ka kaheosalist osaliselt konserveerunud järjestust mis on sarnane
kõigil klass 1 süntetaasidel. Seda konseveerunud järjestust kutsutakse ka
allkirjajärjestuseks (signature sequence). Nukleotiidi siduva domääni tertsiaar -struktuur
on sarnane pea kõigil nukleotiidi siduvatel valkudel ja see koosneb tavaliselt 4-6
antiparalleelsest β-ahelast ja 2-4 α-heeliksist, mis on β  kihiga risti. Ülejäänud osas on
klass 1 süntetaaside nii primaar - kui tertsiaar-struktuur varieeruv. Ka klass 2
süntetaasidel on katalüütilises domäänis homoloogne osa, aga see on varieeruvam kui
19
klass 1 ensüümidel. Nukleotiidi siduvate domäänide ruumiline struktuur on mõlemal
klassil sarnane, aga järjestuse homoloogia nende vahel puudub. Ka tRNA’ga
seondumine toimub kahel klassil erinevalt (vt. joon. 9.10 ja 9.11). Kahe süntetaaside
klassi struktuurielementide jaotus ja võrdlus on toodud joonisel 9.8. Kuna kahe
süntetaaside klassi vahel homoloogiat ei ole, on nad ilmselt tekkinud sõltumatult aga
kummalgi klassil võib oletada ühist eellasmolekuli.
Aminohappe liitmine tRNA molekulile toimub kaheastmelise reaktsioonina (vt. joon.
9.7). Kõigepealt seonduvad süntetaasiga aminohape ja ATP molekul, mis ensüümi
pinnal moodustavad aminoatsüül-adenülaadi (aminohappe karboksüülrühma hapnik
reageerib ATP α-fosfaadiga, vt. joon 9.7). Aminoatsüül-adenülaadis on aminohape
aktiveeritud karboksüülrühma kaudu. Teise etapina toimub estersideme süntees
aminohappe karboksüülrühma ja tRNA 3’-terminaalse riboosi 2’ või 3’ süsiniku vahel
ja vabaneb AMP (joonised 9.7, 7.3). Seega jääb aminohape seotuks tRNA 3’
terminaalse riboosiga estersideme abil. Aminoatsüleerimise reaktsiooni mõlemad
etapid on pöörduvad, süntetaas võib aminoatsüül-tRNA’st ja AMP’st pürofosfaadi
manulusel sünteesida ATP’d, kusjuures vabanevad aminohape ja tRNA.
tRNA aminoatsüleerimisreaktsiooni võrrand:
1. E + aa + ATP ↔ E.ATP.aa ↔ E.AMP-aa + PP
2. E.AMP-aa + tRNA ↔ E.AMP-aa.tRNA ↔ E.aa-tRNA + AMP ↔ E+ aa-tRNA,
kus E on aminoatsüül-tRNA süntetaas, aa on aminohape, AMP-aa on aminoatsüül-
adenülaat, . tähistab mittekovalentset kompleksi ja “-“ tähistab kovalentset keemilist
sidet.
Aminoatsüül-tRNA sünteesi täpsus on väga kõrge, vigade sagedus on 10-5 (üks vale
aminohape 100 000 õigesti sünteesitud aa-tRNA kohta). Kuna paljud aminohapped on
omavahel väga sarnased (näiteks erinevad Ala ja Glu, ning Ile ja Val ainult ühe
metüülrühma poolest), siis on sellise täpsuse tagamine väga huvitav molekulaarse
äratundmise küsimus. Teisest küljest peab süntetaas suutma valida paljude tRNA
molekulide vahel, mis on omavahel sarnase ruumilise struktuuriga. tRNA valik
süntetaasi poolt toimub kahes etapis . Esiteks seondub süntetaas stabiilselt vaid
“sobiva” tRNA molekuliga ja teiseks toimub vaid “õigele” tRNA’le aminohappe
liitmine kiiresti, st. vale tRNA võib küll seonduda süntetaasiga, aga teda ei
aminoatsüleerita (vt. joon 9.12). Õige tRNA molekul indutseerib süntetaasil
konformatsiooni muutuse, mis kiirendab aminoatsüleerimise reaktsiooni, samas aga
“vale” tRNA süntetaasi struktuuri muutust esile ei kutsu ja ta jõuab enne ensüümi
pinnalt lahkuda kui keemilise sideme süntees aset leiab.. Sellist valiku mehhanismi, mis
põhineb reaktsioonide kiiruste erinevusel nimetatakse ka “kineetiliseks
veerulugemiseks” (“kinetic proofreading”). Aminohappe valik toimub neil
süntetaasidel, mille substraadil on keemiliselt lähedasi “valesid” aminohappeid
(näiteks Ile, millel on lähedased Val ja Leu), samuti mitmeastmelisena. Kui “vale”
aminohape ühendatakse tRNA’ga, siis hüdrolüüsib sünteataas tekkinud estersideme,
mille tulemusena valesti sünteesitud produkt laguneb ja aminohape ning tRNA
vabanevad. Seda reaktsiooni viib läbi süntetaasi eriline hüdrolüütiline tsenter , mis on
osa esüümi aktiivtsentrist. Ka see hüdrolüütiline mehhanism toimub reaktsioonikiiruste
erinevuse tõttu, õige produkti hüdrolüüs on aeglane ja “vale” produkti hüdrolüüs kiire.
Sarnased mitmeastmelised valikumehhanismid on omased paljudele ensüümidele, mis
viivad läbi geneetilise informatsiooni ülekannet ja nendega puutume kokku ka edaspidi.
IIc Valgusüntees ribosoomides
20
Ribosoom
Ribosoomid viivad kõikides organismides läbi programmeeritud valgusünteesi
kasutades aminoatsüül-tRNA’d (aa-tRNA) substraadina. Süntees toimub vastavalt
mRNA programmile (vt. geneetiline kood ja allpool). Ribosoomid koosnevad alati
kahest ebavõrdsest osast, suurest ja väiksest subühikust. Ribosoomi on tähistatud ka
sõnaga “pihukeha” tema väikeste mõõtmete tõttu. Nimetus “ribosoom” tuleneb RNA
sisaldusest. Ribosoomi mõlemad subühikud koosnevad RNA’st ja valkudest.
Ribosoomides osalevad substraadi sidumisel ja keemiliste reaktsioonide läbiviimisel
nii valgud kui RNA. Viimase osa valgu biosünteesil käsitleme veel eraldi peatüki
lõpus. Fakt, et ribosoomides on RNA katalüütilise funktisooni kandjaks on olnud
oluliseks aluseks nn. “RNA maailma” hüpoteesilse. Selle hüpoteesi kohaselt tekkis elu
kõigepealt RNA baasil, mis kandis algselt nii geneetilist informatsiooni kui oli ka
keemiliste reaktsioonide läbiviijaks.
Bioloogiliste makromolekulide ja nende komplekside suuruse iseloomustamiseks
kasutatakse raskusväljas liikumise kiirust. Viimast kirjeldab Svedbergi ühik (S). Mida
suurem partikkel , seda suurem S väärtus. Raskusväljas liikumise kiirus (S) sõltub nii
partikli molekulmassist kui tema mõõtmetest (tihedusest) kusjuures see sõltuvus on
mittelineaarne. Ribosoomide komponente ja nende suurust esitab järgmine tabel
Ribosoomide komponendid E. coli’s ja inimeses (vastavate komponentide
molekulmassid on sulgudes). Ribosomaalse RNA (rRNA) pikkus nukleotiidides on
lisatud. Ribosoomi valkude (r-valkude) puhul on toodud molekulmasside vahemik,
inimese ribosoomivalkude molekulmassid on teada ainult osaliselt.
Ribosoom
Subühikud
rRNA
r-Valgud
Bakteriaalne
väike 30S
16S - 1542
21 (6-61 kD) S-valgud
ribosoom
suur 50S
23S - 2904, 5S - 120
33 (5-30 kD) L-valgud
(2,5x106 D)
Inimese
väike 40S
18S - 1874
33 S-valgud
ribosoom
suur 60S
28S - 4718, 5,8S - 160,
49 L-valgud
(4,2x106 D)
5S - 120
Ribosomaalne RNA (rRNA) moodustab bakteriaalsetes ribosoomides 66% massist ja
eukarüootsetes ribosoomides 60% massist. Ribosoomid ise moodustavad bakterites
20-40% kuivmassist, eukarüootides tunduvalt väiksema osa.
Ribosoomi struktuuri uurimise alal on viimaste aastate jooksul toimunud läbimurre, on
suudetud kristalliseerida ribosoomide subühikud ja lahendada röngenkiirte hajumisel
tekkiv difraktsioonipilt, mille tulemusel koos elektronmikroskoopia andmetega on
esitatud ribosoomide ruumilise struktuuri mudel. Mudelid on seni veel keskmise
lahutusvõimega (5-5,5 Å,  Thermus thermophilus’e 50S ja Haloarcula marismortui
30S), aga annavad siiski pildi ribosoomi struktuurse organisatsiooni kohta. rRNA ja
valgud on organiseeritud ribosoomi struktuurseteks domäänideks, mis moodustavad
mRNA, tRNA’de ja valguliste translatsioonifaktorite sidumiskohad. rRNA moodustab
suurema osa ribosoomist ja seega annab just rRNA struktuurne organisatsioon
ribosoomi põhilise vormi. rRNA sekundaarstruktuuri domäänid (vt. joon. 8.3)
moodustavad ka ribosoomis eraldi struktuursed üksused. r-Valgud seonduvad rRNA
kindlatesse kohtadesse stabiliseerides rRNA ruumilist struktuuri ja ühendades
erinevaid rRNA domääne omavahel nii valk-valk kui valk-RNA interaktsioonide
kaudu. E. coli ribosoomis on suurema osa valkude sidumiskohad rRNA’l teada.
Ribosoomi suuremas subühikus on kanal, mille kaudu ilmselt väljub kasvav
peptiidahel.
21
Ribosoomi subühikud on omavahel seotud kahest kohast ja subühikute vahele jääb
põhiline aktiivtsenter, mis moodustab tRNA’de sidumiskohad. Ribosoomis on kolm
tRNA sidumispiirkonda, mida nimetatakse tRNA sidumis-saitideks. Saidid on
nimetatud vastavalt tRNA liigile, mis põhiliselt seondub vastava ribosoomi
piirkonnaga kuigi nagu kohe näeme, võivad A- ja P-saidid siduda mitut erinevat tRNA
liiki.
A-saiti seondub aminoatsüül-tRNA (millest ka nimi). Samas kohas toimub ka aa-
tRNA’de valik mRNA koodoni alusel. A-saidis olev aa-tRNA reageerib ribosoomis
peptidüül-tRNA’ga, mille tulemusena moodustub peptiidside. Peale peptiidsideme
sünteesi asub A saidis värskeltsünteesitud peptidüül-tRNA. A- sait paikneb nii
väiksemal kui suuremal subühikul.
P-saiti seondub peptidüül-tRNA. Saidi nimetus tulebki peptidüül-tRNA järgi. Peale
peptiidsideme moodustumist, kui kasvav peptiidahel kantakse ribosoomis peptidüül-
tRNA’lt A-saidis asuvale aa-tRNA’le jääb ribosoomi P-saiti alles deatsüleeritud
tRNA (lihtsalt tRNA, mille 3’ otsas on vaba hüdroksüülrühm). P-sait paikneb samuti
mõlemal ribosoomi subühikul.
E-sait on deatsüleeritud tRNA spetsiifiline. Peale seda kui P-saidis tekkis deatsüül-
tRNA liiguvad tRNA’d koos mRNA’ga ribosoomis ühe koodoni võrra edasi ja
deatsüül-tRNA satub E-saiti. E-sait on saanud oma nime selle järgi, et selle koha kaudu
väljub ribosoomist deatsüül-tRNA et minna “uuele ringile”. E-sait ei ole võimeline
siduma ei aa-tRNA’d ega peptidüül-tRNA’d. E-sait asub põhiliselt ribosoomi suuremal
subühikul.
Nii A- kui P-saidis toimub tRNA antikoodoni paardumine mRNA koodoniga. Kui
tRNA liigub E-saiti siis jääb koodon-antikoodon seos ilmselt ajutiselt alles, aga katkeb
enne tRNA lahkumist ribosoomist. Seepärast tehakse mõnede autorite poolt vahet kahe
erineva E-saidi oleku vahel. Kui ribosoomi saite vaadata tRNA liigi järgi, siis aa-
tRNA seondub ainult A-saiti, peptidüül-tRNA võib asuda nii A- kui P-saidis ja
deatsüül-tRNA võib asuda nii P- kui E-saidis. tRNA sidumis-saite vaatleme veelkord
peale elongatsioonitsükli käsitlemist seoses translatsiooni elongatsiooni hübriidsaitide
mudeliga.
Lisaks tRNA sidumiskohtadele on ribosoomis veel aktiivtsentrid. Ribosoomi
dekodeeriv tsenter asub ribosoomi väiksemal subühikul. Dekodeerivas tsentris
toimub koodon-antikoodon äratundmine. Selles protsessis osaleb ribosoom aktiivselt,
ribosoomis toimuv koodon-antikoodon interaktsioon on stabiilsem ja täpsem kui vabas
lahuses tRNA antikoodoni ja mRNA koodoni paardumine. Dekodeeriva tsentri
moodustumisel osalevad nii 16S rRNA kui ribosoomi väiksema subühiku valgud.
Dekodeeriva tsenri läheduses paikneb ribosoomi väiksemal subühikul mRNA
sidumispiirkond, mis toimib valgusünteesi initsiatsioonil. See piirkond koosneb
eranditult rRNA’st ja moodustub 16S rRNA 3’ otsas, mis paardub mRNA ribosoomi
seondumispiirkonnaga (nn. anti- Shine - Dalgarno järjestus). Ribosoomi suuremal
subühikul asuvad peptiidsideme moodustumist katalüüsiv tsenter e.
peptidüültransferaasne tsenter on piirkond kuhu seonduvad aa-tRNA ja peptidüül-
tRNA 3’ otsad koos vastavalt aminohappe- ja kasvava peptiidahelaga, ning viimane
oluline koht, valgusünteesi faktoreid siduv tsenter. Neist esimene, aminohappeid
omavahel ühendav tsenter, koosneb põhiliselt 23S rRNA’st, aga selle tsentri
moodustumisel osalevad ka L-valgud. Faktoreid sideuva tsenteri tähtsaim komponent on
aga valguline, mille moodustavad valgud (L7/L12)2 kompleksis L10’ga kuigi selle
tsentri tähtsad osad on ka kaks piirkonda 23S rRNA’s.
Ribosomaalse valgusünteesi etapid
22
Valgusüntees ribosoomidel jagatakse kolmeks etapiks: initsiatsioon , elongatsioon ja
terminatsioon. Initsiatsioonil toimub ribosoomi subühikute assotseerumine, valku
kodeeriva ala alguse leidmine mRNA’l, õige lugemisraami fikseerimine ja esimese
peptiidsideme süntees. Elongatsiooni käigus toimub valguahela pikenemine kuni stop-
koodonini. Terminatsioonil toimub stop-koodoni äratundmine terminatsioonifaktori
poolt, sünteesitud valgu, mRNA ja tRNA vabanemine ning ribosoomi subühikute
eraldumine. Sellega on taastunud ribosoomide algne olek, st. subühikud on eraldi ja
ribosoomid on läbinud valgusünteesi ribosoomi tsükli (joon. 8.9).
Valgusünteesi initsiatsioonil osalevad lisaks ribosoomidele ka valgulised
initsiatsioonifaktorid, initsiaator -tRNA ja GTP. Initsiatsioon toimub prokarüootidel ja
eukarüootidel võrdlemisi suurte erinevustega, seepärast käsitleme siin ainult
prokarüootset initsiatsiooni ja eukarüootide valgusünteesi omapära käsitleme eraldi
peatükis.
Bakteritel on kaks konserveerunud valgusünteesi initsiatsioonifaktorit, mõnedel
bakteritel on kolm erinevat initsiatsioonifaktorit. Neist IF-2 on suur valk (molekulmass
110 kD), IF-3 ja IF-1 on väikesed valgud (9 ja 25 kD vastavalt). IF-2 ja IF-3 esinevad
kõigil bakteritel. IF-2 seob GTP juuresolekul initsiaator-tRNA’d, mis bakterites on
fMet -tRNAfMet. Sellise kolmik -kompleksina seondub IF-2 ribosoomi väiksema
subühikuga ja moodustab viimasega stabiilse kompleksi. IF-2 on GTP’d siduv valk ja
tal on teistele GTP’ga seonduvatele valkudele omane valgudomään nn. GTP domään.
IF-2 omab GTP’d hüdrolüüsivat tsentrit, mis aktiveerub intsiatsiooni käigus ja on
sõltuv ribosoomide suuremast subühikust. IF-3 on ribosoomide dissotsiatsioonifaktor,
ta takistab ribosoomide subühikutel assotseerumast, võimaldades niiviisi vabade 30S
subühikute olemasolu, mis on vajalikud mRNA ja IF-2.GTP.fMet-tRNAfMet kompleksi
sidumiseks. Initsiaator-tRNA, mis prokarüootides on fMet-tRNAfMet, erineb veidi
tavalistest tRNA’dest. Esimene nukleotiid ei ole initsiaator-tRNA’s paardunud. Teistel
tRNA’del on esimene nukleotiid paardunud 72. nukleotiidiga. Ka antikoodon õla
struktuur on veidi erinev (vt. joon. 8.13). Need erinevused on vajalikud,
transformülaasile äratundmiseks mis lisab Met-tRNAfMet’le formüülgrupi ja fMet-
tRNAfMet seondumiseks otse ribosoomi P saiti, ilma eelnevalt A saiti läbimata.
Bakteriaalne mRNA on reeglina polütsistroonne, st. üks mRNA kodeerib mitut valku
(joon 7.15). Valku kodeerivat järjestust nii mRNA’l kui DNA’l nimetatakse ka avatud
lugemisraamiks, lühend ORF (open reading frame). Avatud lugemisraam on
nukleiinhappe järjestus, mis sisaldab järjestikuseid aminohappeid kodeerivaid
koodoneid ja mis algab initsiaator-koodoniga ning lõpeb stop-koodoniga. mRNA’d
sisaldavad lisaks kodeerivale järjestusele (ORF’le) ka speisserjärjestusi. Enne (5’
poolselt) ORF’i asub liiderjärjestus ja peale viimast ORF’i on treilerjärjestus.
Erinevate lugemisraamide vahel asuvad inter -tsistroonsed speisserid.
Initsiatsiooniprotsessi käigus otsib ribosoom üles ORF’i alguskoha st. initsiaator-
koodoni, mis on enamasti AUG. Bakteriaalsetel mRNA’del eelneb initsiaator-
koodonile ribosoomi sidumispiirkond RBS (ribosome binding site). RBS on 4-7
nukleotiidine järjestus, mis on komplementaarne ribosoomi väiksema subühiku RNA
(16S rRNA) 3’ otsaga. RBS paikenb AUG koodonist 5-7 nukleotiidi eespool (5’
suunas). RBS järjestust kutsutakse ka Shine-Dalgarno järjestuseks (lühend SD)
avastajate järgi. Prokarüootides esinevad ka ilma RBS’ta mRNA’d, mis on aga madala
ekspressiooniga, kuna nad ei osale efektiivselt valgusünteesi initsiatsioonil.
Bakteriaalne mRNA on võimeline seonduma ribosoomi väiksema subühikuga ilma
lisafaktorite abita moodustades kaksikahelalise kompleksi mRNA RBS järjestuse (e.
SD järjestuse) ja 16S rRNA 3’ otsa vahel. Kuigi ribosoomi väiksem subühik on
komplekseerunud IF-3’ga, ei oma see faktor olulist mõju mRNA seondumisele.
23
mRNA.30S kompleks seondub IF-2.GTP.fMet-tRNAfMet kompleksiga, mille käigus tekib
esimene koodon-antikoodon paardumine. Viimane määrabki ära lugemisraami alguse.
Initsiaator-tRNA (fMet-tRNAfMet) seondub 30S ribosoomi P saiti (joon. 8.12). Umbes
10% bakteriaalsetest mRNA’dest on initsiaator-koodoniks GUG ja väga harva mõni
teine lähedane koodon. Hoolimata sellest milline koodon on initsiaator-koodoniks
seondub sellega ikka sama fMet-tRNAfMet (Initsiatsioon on skemaatiliselt joonisel
8.14).
Järgmine etapp valgusünteesi initsiatsioonil peale 30S.mRNA.IF-2.GTP.fMet-
tRNAfMet.IF-3 kompleksi teket on ribosoomi suurema subühiku (50S) seondumine.
Viimasega ühinemise tulemusena tekib 70S ribosoom ning hüdrolüüsitakse IF-2’ga
seotud GTP. Peale GTP hüdrolüüsi vabanevad IF-2, IF-3 ja GDP. Järgmine aa-tRNA
seondub ribosoomidega juba kompleksis EF-Tu ja GTP’ga. Peale esimese
peptiidsideme sünteesi on valgusünteesi intsiatsioon lõppenud ehk sujuvalt
elongatsiooniks üle läinud.
Valgusünteesi elongatsiooni käigus toimub ribosoomis peptiidahela pikendamine
vasavalt mRNA programmile kuni ribosoomi dekodeerivasse tsentrisse jõuab üks
kolmest stop-koodonist. Elongatsioon on tsükliline protsess, mis toimub bakterites
kiirusega kuni 20 amionohapet sekundis. Iga tsükli käigus lisatakse kasvavasse peptiidi
üks aminohape. Elongatsioonil osalevad lisaks ribosoomidele, mRNA’le ja aa-
tRNA’le veel elongatsioonifaktorid: EF-Tu, EF-Ts ja EF-G ning kofaktorina GTP.
EF-Tu ja EF-Ts moodustavad kompleksi, mis kannab EF-T nime. Lühendite
tähendused: EF - elongatsiooni faktor; EF-T - T tuleneb sõnast “ transfer ”, väikesed
tähed “u” ja “s” tähistavad termilist stabiilsust; u - “unstable” (ebastabiilne), s -
“stable” (stabiilne). Seega EF-Tu ja EF-Ts on transpordi funktsiooniga
elongatsioonifaktorid, millest esimene on ebastabiilse ja teine stabiilse struktuuriga.
EF-G nimetus tuleneb tema võimest hüdrolüüsida ribosoomide juuresolekul GTP’d.
Nagu juba faktorite nimedest näha osalevad EF-Tu ja EF-Ts aa-tRNA transpordil
ribosoomi A saiti. Nende osa selles transpordis on aga täiesti erinev. EF-Tu moodustab
kompleksi aa-tRNA ja GTP’ga. Seda kompleksi kutsutakse ka “kolmik-kompleksiks”
(ternary complex  – ingl. k.). EF-Tu.GTP.aa-tRNA kolmik-kompleks seondub ribosoomi
A saiti. Juhul, kui aa-tRNA antikoodon on komplementaarne ribosoomi dekodeerivas
tsentris eksponeeritud koodoniga, toimub EF-Tu’l GTP hüdrolüüs ja EF-Tu.GDP ning
fosfaatjääk lahkuvad ribosoomist. Kui aga tRNA antikoodon ei ole komplementaarne,
siis kolmikkompleks ribosoomiga ei seondu. EF-Tu seondub GDP’ga väga stabiilselt,
umbes 100x tugevamini kui GTP’ga. GDP stabiilsem sidumine võrreldes GTP
sidumisega on omane paljudele G-nukleotiidi siduvatele valkudele (nn. G-valkudele).
Lisaks sidumise stabiilsusele on GDP dissotsiatsioon EF-Tu’lt väga aeglane.
Nukleotiidi vahetust EF-Tu’l katalüüsib EF-Ts. Sarnased nukleotiidi vahetust
katalüüsivad faktorid on paljudel G-valkudel. Rakkudes on GTP kontsentratsioon
harilikult 1000x kõrgem kui GDP kontsentratsioon, seepärast tekib peale EF-Ts’i poolt
katalüüsitud nukleotiidi vahetust EF-Tu.GTP kompleks, mis on võimeline seonduma
järgmise aa-tRNA’ga (EF-Tu.GDP kompleks ei seo aa-tRNA’d). Teine hästi tuntud G-
valk valgusünteesi aparaadis on EF-G, mis katalüüsib ribosoomidel mRNA.tRNA
kompleksi translokatsiooni (vt. allpool).
Elongatsioonitsükli esimene reaktsioon on EF-Tu sõltuv aa-tRNA sidumine ribosoomi
A saiti. Siin toimub ka aa-tRNA’de valik vastavalt mRNA programmile. aa-tRNA valik
ribosoomi A-saidis toimub stohhastiliselt, st. EF-Tu.GTP.aa-tRNA kompleksid
seonduvad ribosoomi A saidiga juhuslikult ja ainult nende kompleksidega, millel tekib
koodon-antikoodon äratundmine (tRNA antikoodon on komplementaarne mRNA
koodoniga), tekib stabiilne seondumine, mis omakorda indutseerib GTP hüdrolüüsi EF-
24
Tu’l. EF-Tu seondub aa-tRNA aktseptoorse õla ja 3’otsaga nii, et aminohape on
kolmik-kompleksis kaitstud st. ei ole ribosoomile kättesaadav. Seni kuni ribosoomis on
EF-Tu ei saa aa-tRNA osaleda peptiidsideme moodustumisel kuna aa-tRNA 3’ ots ja
aminohape on seotud EF-Tu’ga. See asjaolu hoiab ära peptiidsideme moodustumise
“vale” aminohappega. Alles peale EF-Tu sõltuvat GTP hüdrolüüsi ja EF-Tu.GDP
kompleksi lahkumist ribosoomidelt saab toimuda peptiidsideme süntees. EF-Tu lahkub
ribosoomist GDP vormis ja enne järgmise aa-tRNA sidumist peab toimuma nukleotiidi
vahetus - GDP asendub GTP’ga. Seda vahetusreaktsiooni viib läbi EF-Ts. EF-Tu
sõltuvad reaktsioonid on kujutatud joonisel 8.20.
Järgmine reaktsioon elongatsioonitsüklis on peptiidsideme süntees. Peptiidside
moodustub aminoatsüül-tRNA α-aminogrupi nukleofiilse ataki tulemusena peptidüül-
tRNA peptidüül-estersidemesse (vt. joon 8.21). Teiste sõnadega, aminohape, mis on
tRNA 3’ otsas, reageerib oma aminorühma kaudu peptidüü-tRNA karboksüülrühmaga
ehk veelkord teisiti öeldult, peptiidjääk kantakse peptidüül-tRNA’lt üle aminoatsüül-
tRNA’le. Kuna peptiidsideme sünteesi käigus kantakse peptiidjääk üle siis nimetatakse
seda reaktsiooni ka peptidüül-transferaasseks reaktsiooniks. Keemilises mõttes on
peptiidsideme süntees kõige tähtsam ribosoomi poolt katalüüsitav reaktsioon, kuna kõik
teised reaktsioonid on mittekovalentsete komplekside moodustamised, mis seejärel
jälle lagunevad. Selle reaktsiooni produktid on ühe aminohappe võrra pikem peptidüül-
tRNA ja vaba tRNA (deatsüül-tRNA). Peptiidsideme sünteesi katalüüs on ribosoomi
suurema subühiku integraalne funktsioon, mis ei vaja ribosoomiväliseid lisafaktoreid.
Ribosoomide peptiidsideme moodustumist katalüüsiv tsenter nn.
peptidüültransferaasne tsenter, koosneb nii rRNA’st (23S rRNA) kui ribosoomi
suurema subühiku valkudest. Peptidüültransferaasses tsentris on kaks tRNA 3’ otsa
sidumiskohta, üks aa-tRNA ja teine peptidüül-tRNA CCA järjestuse jaoks. Peptdüül-
tRNA 3’ otsa CCA järjestus on vähemalt osaliselt paardunud 23S rRNA’ga. On
kindlaks tehtud Watson-Crick tüüpi aluspaar tRNA nukleotiidi C73 ja 23S rRNA
nukleotiidi G2252 vahel. Peale peptiidsideme moodutumist või ka selle reaktsiooni
käigus paiknevad tRNA’de 3’ otsad ribosoomis ümber. Värskelt sünteesitud peptidüül-
tRNA 3’ ots asetub endise peptidüül-tRNA kohale ja viimane omakorda (mis on
nüüdseks oma peptiidjäägi kaotanud ja on muutunud deatsüül-tRNA’ks) liigub
deatsüül-tRNA spetsiifilisse E saiti. Peptidüül-tRNA paiknemise kohta ribosoomis
näitab selle võime reageerida puromütsiiniga. Puromütsiin on antibiootikum, Tyr-
tRNA 3’ otsa analoog (joon. 8.22), seega aminoatsüül-tRNA 3’ otsa analoog, mis võib
peptiidsideme sünteesil viimast asendada . Kasvav peptiidahel võidakse puromütsiinile
üle kanda ja sel juhul muidugi katkeb mRNA suunatud peptiidahela pikenemine, kuna
puromütsiin koos peptiidahelaga lahkuvad ribosoomilt. Puromütsiiniga reageerib ainult
P saidis asuv peptdüül-tRNA. Vahetult peale uue peptiidsideme moodustamist, kui
peptidüül-tRNA on A saidis, ei ole ta võimeline puromütsiiniga reageerima . A ja P
saidid ongi ajalooliselt määratud peptidüül-tRNA võime järgi osaleda reaktsioonis
puromütsiiniga.
Järgmine reaktsioon ribosoomi elongatsioonitsüklis on  translokatsioon , mille käigus
mRNA kompleks, mis koosneb mRNA’st koos kahe tRNA’ga nihkub ribosoomis ühe
koodoni võrra edasi. Peale translokatsiooni asetub pepitüül-tRNA tervenisti ribosoomi
P saiti ja deatsüül-tRNA asetub ribosoomi E saiti. Seda ümberpaiknemise reaktsiooni
katalüüsib elongatsioonifaktor G (EF-G) koos GTP’ga. Peale translokatsiooni või ka
selle käigus toimub EF-G’l GTP hüdrolüüs ja EF-G koos GDP’ga lahkub ribosoomist
(joonised 8.23 ja 8.24). EF-G seostub G nukleotiididega nõrgalt ja ei vaja nukleotiidi
vahetuseks lisafaktorit nagu seda vajab EF-Tu. Ribosoomi translokatsioon on huvitav ja
kompleksne protsess, milles on veel palju ebaselget ja mille kohta on mitmeid
25
vasturääkivaid mudeleid . Muuhulgas on ebaselge GTP osa translokatsioonis. Üks
huvitav fakt ribosoomi elongatsioonifaktoritega seotud reaktsioonides on EF-Tu ja EF-
G seondumine ribosoomi sama piirkonnaga (faktorite sidumistsentriga). EF-G
ruumiline struktuur on sarnane EF-Tu.GTP.aa-tRNA kompleksi struktuuriga, kusjuures
üks EF-G struktuurne domään sarnaneb tRNA antikoodon ling-õlg omaga st. valguline
EF-G osa meenutab RNA struktuuri. Sellist struktuurset sarnasust eri molekulide vahel
nimetatakse molekulaarseks mimikriks. Translokatsiooni käigus asendab EF-G.GTP
ribosoomi A saidis EF-Tu.GTP.aa-tRNA kompleksi, mis on tõenäoliselt üheks
translokatsiooni molekulaarseks aluseks. Ka teised GTP’d hüdrolüüsivad
translatsioonifaktorid (IF-2, RF-3) sisaldavad elongatsioonifaktoritega sarnast
domääni, mis tõenäolisekt seondub ribosoomis sama piirkonnaga kui EF-Tu ja EF-G.
Ribosoomi faktorite sidumistsenter koosneb nii valkudest (suurema subühiku valgud
L7/12) kui kahest eri piirkonnast 23S rRNA’s.
Ribosoomi struktuuri alased artiklid:
Ban, N., Nissen, P., Hansen , J., Moore , P. B., Steitz, T. A. (2000) The complete atomic
structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science  289, 905-920.
Schluenzen, F., Tocilj, A., Zarivach, R., Harms, J., Gluehmann, M., Janell, D., Bashan,
A., Bartels, H., Agmon, I., Franceschi, F., Yonath, A. (2000) Stucture of functionally
activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell 102, 615-623.
Wimberly, B. T., Brodersen, D. E., Clemons Jr., W. M., Morgan- Warren , R. J., Carter,
A. P., Vonrhein, C., Hartsch, T., Ramakrishnan, V. (2000) Structure of the 30S
ribosomal subunit. Nature  407, 327-339.
Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate,
J.H.D. and Noller, H.F. (2001) Crystal structure of the ribosome at 5.5 Å resolution.
Science, 292, 883-896
Ribosoomi elongatsioonitsükli mudelid
Peptiidahela terminatsioonil osalevad terminatsioonifaktorid RF-1, RF-2, RF-3 ja
RRF. Nimed tulenevad sõnadest release (vabanema ingl. k.) ja factor, RRF tuleneb
ribosome release factor’ist. Terminatsioonifaktorid RF-1 ja RF-2 tunnevad kumbki ära
kaks terminaator -koodonit. RF-1 seondub spetsiifiliselt UAA ja UAG stop-koodoniga
(kooditabelis asuvad need koodonid kõrvuti vertikaalselt). RF-2 tunneb ära stop-
koodoneid UAA ja UGA (kooditabelis horisontaalsed naabrid ). Seega tunnevad
mõlemad terminatsioonifaktorid ära stop-koodoni UAA ja ülejäänud stop-koodonite
jaoks on kummalegi oma faktor. Seepärast pole üllatav, et UAA on kõige tugevam ja
kõige sagedamini esinev stop-koodon bakterites. RF-1 ja RF-2 käituvad ribosoomis
nagu tRNA molekulid seondudes ribosoomil samasse piirkonda (A saiti)
interakteerudes nii 30S kui 50S subühikutega. Seega on ka siin tegemist molekulaarse
mimikri nähtusega. Terminatsioonifaktorid RF-1 ja RF-2 vajavad seondumiseks
ribosoomi A saidis eksopneeritud vastavat stop-koodonit ja P saidis polüpeptidüül-
tRNA’d. Kui ribosoomis on lühike peptidüül-tRNA, siis ei ole terminatsioonifaktorite
seondumine ribosoomidega stabiilne ja järelikult on terminatsiooni toimumine vähese
efektiivsusega. RF-3 seondub ribosoomiga siis kui ribosoomis on juba RF-1 või RF-2.
RF-3 stimuleerib RF-1 ja RF-2 suunatud reaktsiooni, peptidüül-tRNA hüdrolüüsi,
mille tulemusena vabaneb ribosoomist polüpeptiidahel. mRNA vabanemiseks on
vajalik RRF.
Stop koodonid ei ole ribosoomis võrdsed valgusünteesi lõpetamise suunamisel. Kuigi
stop-koodonitele ei vasta otseselt ükski tRNA, tuleb siiski arvestada, et
26
terminatsioonifaktorite kontsentratsioon rakus on suhteliselt madal ja et stop-koodonile
lähedast koodonit transleerivad tRNA’d võivad osaleda stop-koodoni transleerimisel
(vt. ka suppressor tRNA). UGA koodonile on lähedane UGG koodon, mis vastab
trüptofaanile. Trüptofaani lülitatakse väikese sagedusega UGA stop-koodoni kohale.
Selline “ vigane ” translatsioon viib normaalsest pikemate valkude sünteesile. Stop-
koodonite transleerimist nimetatakse ka “ülelugemiseks” (readthrough ingl. k.).
Ülelugemine on rakkude eluks vajalik protsess. Mõnede valkude pikemad vormid
omavad kindlat regulatoorset tähtsust. UAA on kõige tugevam stop-koodon ja selle
koodoni kohale aminohapet ei lülitata. Seepärast on stop-koodoni valik valgu sünteesil
oluline parameeter.
Selenotsüsteiini (Sec) kodeerib UGA stop-koodon. Selenotsüsteiin esineb vaid
vähestes valkudes (E. coli’s kahes valgus ja needki on vajalikud ainult
anaeroobsetes tingimustes). Selenotsüsteiini lülitumist valkudesse määravad kolme
geeni produktid. Neist esimene kodeerib tRNA’d, mis aminoatsüleeritakse seriiniga.
Teine geen kodeerib Sec süntetaasi, ensüümi mis muudab tRNA’ga seotud seriini
selenotsüsteiiniks. Kolmas geen aga on spetsiifiline EF-Tu, mis seondub ainult Sec-
tRNASer’ga. Sec sünteesi määravad geenid indutseeritakse ainult anaeroobsetes
tingimustes, tavalistes, aeroobsetes tingimustes kasvavates bakterites need geenid ei
avaldu. Sec lülitumiseks valgu kindlasse kohta ei piisa siiski neist kolme geeni
produktidest. mRNA’s on Sec’i kodeeriva UGA järel eriline juuksenõel struktuur, mis
tekitab ribosoomi peatumise. UGA koodoni kohal toimub konkureerimine Sec-tRNA
ja RF-2 vahel. Tõenäoliselt toimub Sec lülitumine ainult osadel valkudel ja teistel
toimub sel kohal terminatsioon. Eriline, Sec-spetsiifiline EF-Tu ei lase
selenotsüsteiini lülitada stop-koodonina funktsioneerivate UGA koodonite kohale.
Suppressor tRNA ja translatsiooni täpsus. Valgu geenides toimuvad mutatsioonid
võivad tekitada lugemisraamis stop koodoneid, mis viivad valgu lühenemisele ja valgu
funktsiooni kadumisele. Sellistest kahjulikest mutatsioonidest saavad organismid üle
suppressor tRNA’de abil. Suppressor tRNA’d võivad transleerida nii stop koodoneid
(neid kutsutakse nonsens suppressoriteks) kui aminohappeid kodeerivaid koodoneid
teise aminohappena (misens suppressorid) ja muuta valgusünteesi lugemisraami
(raaminihke suppressorid). Suppressor tRNA’d on võimelised ära tundma stop
koodoneid ja suunama stop koodonist sõltuvalt peptiidahelasse aminohappe lülitumist.
Eriti sagedased on suppressor tRNA’d miko -organismides. Mutatsioonid tRNA
antikoodonis võivad viia stop koodonile komplementaarse antikoodoni tekkele ja nii
saabki alguse suppressor tRNA. Mõned näited suppressor tRNA’dest on järgnevas
tabelis:
Suppressor tRNA’d. Koodonid on 5’ 3’ suunas, antikoodonid on vastupidises suunas,
st. 3’ 5’. Muteerunud nukleotiidid antikoodonis on näidatud rasvases kirjas.
tRNA geeni
aminohape
algne
suppressor
lookus
koodon/anitk.
antik. / koodon
supD (su1)
Ser
UCG
CGA
CUA
UAG
supE (su2)
Gln
CAG
CUG
CUA
UAG
supF (su3)
Tyr
UAC
GUA
CUA
UAG
UAU
supC (su4)
Tyr
UAC
GUA
UUA
UAA
UAU
UAG
supG (su5)
Lys
AAA UUU
UUA
UAA
27
AAG
UAG
supU (su7)
Trp
UGG
CCA
UCA
UGA
UGG
Tabelist on näha, et kõik suppressor tRNA’d on tekkinud ühe punktmutatsiooni
tagajärjel. supC ja supG transleerivad üheaegselt kahte stop koodonit UAA ja UAG.
supU suudab transleerida nii stop koodonit (UGA) kui normaalset trüptofaani koodonit
(UGG). Suppressor tRNA geenid tekivad piisavalt kõrge sagedusega et tagada bakterite
kasv ka nonsens mutatsiooni korral elutähtsas geenis. Neid on võimalik selekteerida
kasutades bakterite nonsense mutatsiooniga geeni, mis on mikroobide kasvuks vajalik.
Sellist selektsiooniskeemi kutsutakse vahel “viga parandab vea” printsiibiks.
Suppressor tRNA’de puhul tekib küsimus: kuidas on bakteritel, mis sisaldavad  stop
koodonit transleerivat tRNA’d, võimalik veel valgusünteesi terminatsioon, mis nõuab
stop koodoni äratundmist terminatsioonifaktori poolt. Vastuse sellele küsimusele annab
valgusünteesi kineetiline mudel. Ensümaatiliste protsesside täpsuse määramisega
kineetiliste parameetrite erinevuse alusel puutusime juba kokku aminoatsüült-RNA
sünteesi juures. Valgusüntees on dünaamiline protsess, mille kiiruse määravad
substraatide kontsentratsioon ja ensüüm – substraat komplekside moodustumise kiirus
ja taskaal . Eriti oluline on dünaamiline aspekt aa-tRNA’de valiku juures.
Ribosomaalse valgusünteesi vigade sageduseks on mõõdetud 10-4 st. üks viga 10 000
õigesti transleeritud koodoni kohta. Valgusünteesi täpsuse määrab põhiliselt ribosoomi
A saidis toimuv aa-tRNA selektsioon vastavalt eksponeeritud mRNA koodonile. See
valik toimub kaheastmelisena: esmane valik toimub kolmikkomplekside (EF-
Tu.GTP.aa-tRNA) seondumise tasemel, ja teine valikuetapp toimub peale EF-Tu
suunatud GTP hüdrolüüsi aga enne peptiidsideme moodustumist. Nagu juba eespool
kirjeldatud toimub kolmikkomplekside valik stohhastiliselt st. iga aa-tRNA põrkub
juhuslikult ribosoomi A saidiga. Kolmikkompleksid, mille aa-tRNA antikoodon
paardub vähemalt kahe koodoni järjestikuse nukleotiidiga, indutseerivad ribosoomiga
seondumisel EF-Tu’l GTP hüdrolüüsi. Peale GTP hüdrolüüsi dissotseeruvad
ribosoomilt EF-Tu.GDP kompleks. Selles etapis võib toimuda ka aa-tRNA
dissotsiatsioon juhul kui koodon-antikoodon kompleks ei ole kõgi kolme
nukleotiidipaari ulatuses paardunud. aa-tRNA dissotsiatsioon ribosoomilt peale EF-Tu
suunatud GTP hüdrolüüsi ongi tRNA selektsiooni teine etapp nn. “kineetiline
veerulugemine”. Piltlikult väljendudes mõõdetakse teises selektsiooni etapis koodon-
antikoodn seondumise stabiilsust aja skaalal – kui antikoodon seondub koodoniga
stabiilselt siis püsib kompleks piisavalt kaua ja ribosoom  katalüüsib peptiidsideme
moodustumist, mis muudab reaktsiooni pöördumatuks. Kui aga koodon-antikoodon
seondumine ei ole piisavalt stabiilne, siis ei jõua peptiidside moodustuda ja aa-tRNA
lahkub ribosoomist. On leitud ribosoomi mutante (mutatsioonid ribosoomi valgus S12
või rRNA’s) mille puhul selektsioon on nii tugev, et ka õige aa-tRNA peab läbima
rohkem kui ühe valikutsükli enne kui aminohape lülitub kasvavasse peptiidahelasse.
Need mutatsioonid viivad nn. “ülitäpsele” valgusünteesile ja neis bakteritüvedes
toimub nonsens suppressioon väga väikese efektiivsusega. Ribosoomidel toimuvat
kaheastmelist aa-tRNA valikut iseloomustab järgmine skeem:
1
         2
EF-Tu.GTP.aa-tRNA + RSA ↔ EF-Tu.GTP.aa-tRNA.RSA →
      3
aa-tRNA.RSA + EF-Tu.GDP+ Pi → pep-tRNA.RSE
↓ 4
aa-tRNA + RSA ,
28
kus RSA on vaba A saidiga ribosoom, RSE on ribosoom peale peptiidsideme
moodustumist, Pi on anorgaaniline fosfaat, mis tekib GTP hüdrolüüsil. Numbritega on
tähistatud reaktsioonid: 1. on aa-tRNA valiku esmane etapp. See reaktsioon on
pöörduv, stabiilne kompleks ribosoomi ja kolmikkompleksi vahel tekib ainult siis kui
vähemalt kaks järjestikust antikoodoni nukleotiidi paarduvad mRNA koodoniga. 2.
reaktsioon on GTP hüdrolüüs EF-Tu’l, mida indutseerib koodon – antikoodon
paardumine. 3. reaktsioon on peptiidsideme süntees, mille tulemusel tekib üha
aminohappe võrra pikem peptidüül-tRNA. See reaktsioon viib peptiidahela
pikenemisele. 4. reaktsioon on mitteproduktiivne dissotsiatsioon peale GTP
hüdrplüüsi. Seda protsessi nimetatakse ka “proofreading’uks” e. veeruparanduseks. 2.,
3. ja 4. rekatsioon on pöördumatud.
Suppressor tRNA’d on tavalistega võrreldes “vähemvõimekad”, nad ei lülita mitte iga
valikutsükli käigus aminohapet peptiidi. Suppressor tRNA’de poolt moodustuvad
kolmikkompleksid seonduvad ribosoomidega vähempüsivalt ja neil on suurem
tõenäosus dissotseeruda peale EF-Tu suunatud GTP hüdrolüüsi. Seepärast suunavad
suppressor tRNA’d stop koodoni tranlseerimist ainult väikese efektiivsusega, enamikel
juhtudel toimub stop koodoni kohal siiski terminatsioon. Suppressor tRNA ja
terminatsioonifaktorite vahelises konkureerimises on terminatsioonifaktoritel peaaegu
alati ülekaal. Suppressor tRNA juuresolekul toimub vastav stop koodoni transleerimine
sense koodonina alla 50%, mis on siiski piisav muteerunud valgugeeni translatsiooniks
ja samas viib suppressor tRNA ka normaalsete valkude pikenemisele, aga seda siiski
alla 50% juhtudest. Nii saab rakk vajaliku valgu ja ka peptiidahela terminatsioon saab
toimuda piisava sagedusega. Siin tuleb arvestada, et enamikul valgugeenidel on stop
koodonid väikese vahega korratud, kui ei toimu terminatsioon esimesel stop koodonil,
siis järgmisel toimub see juba suure tõenäosusega, eriti kui on tegemist erinevate stop
koodonitega. Lisaks on normaalsed stop-koodonid sobivas järjestuse kontekstis, mis
suurendab terminatsiooni tõenäosust ja vähendab suppressiooni efektiivust. Raaminihke
ja misense suppressorid on veelgi väiksema “võimekusega” kui nonsense suppressorid.
See on ka mõistetav, arvestades milliseid tagajärgi nad võivad kaasa tuua lülitades
aminohappeid metsiktüübi valkudesse.
Valgusünteesi täpsusega on seotud ka valgusünteesi protsesiivsus, mis näitab kui suur
osa alustatud valkudest lõpuni sünteesitakse. Valgusünteesi protsesiivsus on
hämmastavalt kõrge arvestades kui palju erinevaid põhjusi võivad viia protsesiivsuse
vähenemisele. Prokarüootides sõltub valgusünteesi protsesiivsus ka RNA sünteesi
protsesiivsusest, mis on tingitud translatsiooni ja transkriptsiooni seotusest ( polaarne
effekt vt. transkriptsiooni regulatsioon). Põhiline põhjus, mis vähendab valgusünteesi
protsesiivsust on pep-tRNA lahkumine (dissotsiatsioon) transleerivatelt ribosoomidelt.
Raku elutegevuseks on väga oluline, et alustatud valgud ka lõpuni sünteesitakse,
poolikud valgud võivad põhjustada mitmete protsesside häirimist rakus.
Kui valgusüntees lõpeb enneaegselt mRNA katkemise tõttu, siis on selliste poolikute
valkude lagundamiseks eraldi süsteem. Mittetäielikele valkudele lisatakse C-otsa
eriline aminohapete järjestus, mis on valgu lagundamise (degratatsiooni) signaaliks ja
sellist järjestust (järjestuse märge, sequence tag) kandev peptiid lõhutakse proteaaside
poolt aminohapeteks. Kui ribosoomi A saiti satub katkenud mRNA st. ei ole normaalset
kolmenukleotiidist koodonit, siis seondub ribosoomiga eriline RNA, 10Sa RNA.
Viimane molekul täidab üheaegselt nii tRNA kui mRNA funktsioone ja seda
nimetatakse seepärast tmRNA’ks. tmRNA sarananeb osaga tRNA’st, nimelt selle
aktseptoorse ja T-õlaga, mis moodustavad nii tmRNA’s kui harilikes tRNA’des liitunud
heeliksi (vt. tRNA struktuur). tmRNA sisaldab aminohappe alaniiniga liitumiseks
29
vajalikke nukleotiide (RNA determinante ) ja on seega substraadiks alanüül-tRNA
süntetaasile. Lisaks tRNA’ga sarnanevale osale sisaldab tmRNA ka mRNA järjestust ja
üleminekujärjestusi. Kui tmRNA on aminoatsüleeritud alaniiniga siis moodustab ta
kompleksi EF-Tu ja GTP’ga ning selline kolmikkompleks, mis sarnaneb aa-tRNA poolt
moodustatava kompleksiga, seondub ribosoomi A saiti juhul kui seal ei ole korrektset
tripletset koodonit. Peale Ala-tmRNA seondumist ribosoomiga toimub EF-Tu’l GTP
hüdrolüüs ja EF-Tu.GDP vabaneb ning kasvav peptiidahel kantakse üle alaniniinele.
Peale EF-G ja GTP suunatud translokatsiooni satub peptidüül-tmRNA ribosoomi P
saiti ja katkenud mRNA ning detatsüül-tRNA lahkuvad ribosoomist. Nüüd satub
ribosoomi dekodeerivasse tsentrisse tmRNA osa, mis asendab mRNA’d ja kodeerib
spetsiifilist järjestust suunates valgu lagundamise teele. Seega täidab tmRNA
kõigepealt tRNA, seejärel nii tRNA kui mRNA ja lõpuks ainult mRNA funktsiooni.
tmRNA lugemisraam (kodeeriv järjestus) lõpeb stop-koodoniga, mis suunab valguahela
lõpetamisele. Peale tmRNA poolt “märgitud” valgu vabanemist ribosoomidelt see
lagundatakse. Nii ei saa osaliselt sünteesitud valgud eksitada raku normaalset
elutegevust.
Eukarüootse translatsiooni eripära
Eukarüootsetes (päristuumsetes) rakkudes toimub valgusüntees põhiliselt sama skeemi
kohaselt nagu prokarüootideski. Nagu eespool kirjeldatud, on eukarüootide ribosoomid
suuremad ja sisaldavad suhteliselt rohkem valku. tRNA molekulid on eukarüootides
sama suured kui bakteris. Nagu prokarüootides, on ka eukarüootides initsiatoorne
tRNA eriline metionüül-tRNA, mida aga ei formüleerita. Tähistus: Met-tRNA Met
i
mRNA ehitus eukarüootides on võrreldes prokarüootsete mRNA-dega oluliselt erinev:
1. Eukarüootne mRNA on reeglina (>90%) monotsistroonne ja kodeerib seega ainult
ühte valku. Prokarüootne mRNA on reeglina polütsistroonne st. kodeerib mitut erinevat
valgu molekuli (ühes mRNA molekulis on mitu ORF’i ehk avatud lugemisraami).
2. Transkriptsiooni käigus lisatakse eukarüootse mRNA 5’ otsa m7G cap struktuur
(m7GpppNpNpN). m7G cap on mRNA-ga ühendatud 5’-5’ sidemega, seega on
eukarüootsel mRNA’l kaks 3’ otsa, algne 5’ ots on aga cap struktuuriga peidetud.
Prokarüoodis sellist struktuuri ei esine.
3. Eukarüootse mRNA 3’ otsas on kuni 200 nukleotiidi pikkune polü(A) järjestus, mis
lisatakse mRNA 3´-mittetransleeritavas osas paiknevale polü(A) signaaljärjestusele
(AAUAAA).
4. Eukarüootse mRNA initsiaator-AUG on raamistatud spetsiifilise kontekst-
järjestusega A/GNNAUGG, mida nimetatakse avastaja järgi Kozak’i konsensuseks ja
mis soodustab oluliselt translatsiooni initsatsiooni. Bakteris täidab sarnast rolli Shine-
Dalgarno järjestus.
Eukarüootides sünteesitakse mRNA tuumas, translatsioon toimub aga tsütoplasmas,
seega on transkriptsioon ja translatsioon ruumiliselt lahutatud. Eukarüootne mRNA
läbib reeglina enne tsütoplasmasse jõudmist “protsessingu”, mille käigus primaarsest
transkriptist eraldatakse intronid ja lisatakse 5’ otsa cap struktuur ning 3’ otsa lisatakse
poly (A) järjestus. Peale protsessingut transporditakse küps mRNA läbi tuumapooride
tsütoplasmasse. Nii “cap” kui polü(A) on lisaks mRNA stabiilsusele ja transpordile
vajalikud ka mRNA seondumiseks eukarüootsete initsiatsioonifaktoritega ja
soodustavad väga tugevalt translatsiooni initsiatsiooni. Initsiaatorkoodon AUG asub
sageli 5’ otsa läheduses (40-100 nt. cap’ist). Paljudel eukarüootsetel mRNA’del on
30
initsiaator-koodon siiski cap-st väga kaugel, see vahe võib olla kuni tuhandeid
nukleotiide. Initsiaator-AUG on raamistatud spetsiifilise kontekst-järjestusega
A/GNNAUGG, mida nimetatakse avastaja järgi Kozak’i konsensuseks. Translatsiooni
initsatsiooni efektiivsus on maksimaalne kui AUG-st –3 positsioonis on A või G ja +4
positsioonis on G (vt eelpool allajoonitud tähti). Ainult ~ 35% eukarüootsetel mRNA-
del on –3 ja +4 positsioonid mõlemad optimaalsed. Seega võib arvata, et 65% mRNA-
dest on oma järjestusest tulenevalt initsatsiooni tasemel allareguleeritud. Eukarüootse
mRNA kodeeriv osa erineb prokarüootsest selle poolest, et sisaldab tüüpiliselt vaid
üht tsistronit e. ORF’i. Erineva struktuuri tõttu ei ole mRNA eukarüootide ja
prokarüootide vahel vahetatav, st. prokarüootne mRNA ei tööta eukarüootses
valgusünteesis ja vastupidi, eukarüootne mRNA ei ole substraadiks prokarüootsetele
ribosoomidele.
Kui translatsiooni elongatsioonitsükkel ja terminatsioon on pro- ja eukarüootides
põhimõtteliselt sarnane, siis translatsiooni initsatsioon on küllalt erinev. Arvatavasti
peegeldab eukarüootse translatsiooni initsatsiooni keerukus eukarüootse organismi
suuremat vajadust geeniekspressiooni kontrollitavuse üle ka translatsiooni tasemel. Kui
nii prokarüoodis kui eukarüoodis on 2 valgulist elongatsioonifaktorit, siis eukarüoodil
on bakteri 3 initsatsioonifaktori vastu välja panna vähemalt 12 erinevat valku või
mitmest valgust koosnevat kompleksi. Erinevaid translatsiooni kontrolli mehhanisme on
eukarüootides nii palju, et neid üldkursuses puudutada ei jõua. Erinevate mRNA-de
translatsiooni kontrollitakse initsiatsioonifaktorite (eIF-de), mRNA struktuuride,
mRNA-ga seonduvate valkude, mRNA polü-adenüleerimise, mRNA rakulise
lokalisatsiooni jm kaudu.
Prokarüootides toimub enamasti sisemine initsiatsioon st. mRNA sisaldab mitut
tsistronit ja valgusüntees toimub kõigil initsaatorkoodoni ja Shine-Dalgarno
järjestusega varustatud lugemisraamidel. Eukarüootidel on valdav (>95% mRNA-dest)
initsiatsioon mRNA 5’ otsale kõige lähemal asuvalt initsiaator-koodonilt. AUG
koodonite või tugevate (> -50 kJ/Mol) RNA sekundaarstruktuuride tekitamine 5´cap-i
ja valku kodeeriva lugemisraami vahele inhibeerib sellelt translatsiooni või kaotab
selle sootuks.
Siit tuleneb klassikaline skaneeriv translatsiooni intsatsiooni mudel, mille kohaselt
ribosoom seostub mRNA-le 5´cap-st sõltuvalt ning koos initsiaator-tRNA'ga skaneerib
mRNA-d 5´→3´ suunas kuni esimese õiges kontekstis initsaatorkoodonini kus toimub
valgusünteesi initsatsioon.
Initsiatsioonikompleksi moodustumine toimub järgmiste etappide kaudu:
1. eIF1A ja eIF3 seonduvad ribosoomi 40S alaühikuga, tekib 43S kompleks. eIF3
takistab 60S alaühiku seondumist 40S-ga.
2. 43S kompleks seob Met-tRNA Met
i
-eIF2-GTP kompleksi.
3. eIF4E , eIF4G ja eIF4A (neid kolme valku koos kutsutakse eIF4F-ks) seonduvad
mRNA 5´-otsaga. eIF4E on mRNA cap-i siduv valk, eIF4A on RNA helikaas , mis
harutab lahti RNA sekundaarstruktuuri. eIF4G on selles cap-i siduvas kompleksis
adaptorvalk. eIF4G seob teisi initsiatsioonifaktoreid (eIF3, eIF4E, eIF4A ja Pab1p
valku), moodustades koos 43S ribosoomi kompleksiga uue, 48S kompleksi. Pab1p
on valk, mis seondub mRNA 3´ polü(A) struktuuriga. Seega tuuakse translatsiooni
initsioonil mRNA mõlemad otsad lähestikku.
3. 48S kompleks skaneerib 5´→3´ suunas kuni esimese sobivas kontekstis
initsiaatorkoodonini. Skaneerimiseks on sünergistlikult vajalikud eIF1 ja eIF1A valgud.
4. Nüüd seondub 60S alaühik kompleksis eIF5-ga. eIF5 katalüüsib GTP hüdrolüüsi
eIF2-l.
31
5. Ribosoomi alaühikute antiassotsatsioonifaktorid (eIF-3, eIF5) ja eIF2-GDP
vabanevad, valgusünteesi elongatsioon võib nüüd alata .
Eukarüootsed translatsioonifaktorid
Initsiatsioonifaktorid:
eIF1 (15 kDa) koos eIF1A-ga (16 kDa) on vajalik 43S-i skaneerimiseks mRNA-l.
eIF2 (koosneb 3 valgust: α- 35 kDa, β- 38 kDa ja γ-52 kDa). α alaühiku
fosforüleerimine inhibeerib translatsiooni initsatsiooni peatades eIF2-GTP kompleksi
tekke. See fosforüleerimine kutsutakse esile näiteks viirusinfektsiooni korral, et
pidurdada viiruse elutsüklit rakus. β ja γ alaühik osalevad Met-tRNAi ja GTP
sidumisel. Seega on eIF2 bakteri IF2 analoog.
eIF2B (5 alaühikut). Katalüüsib G nukleotiidi vahetust eIF2-l.
eIF3 (8-10 alaühikut, 650 kDa). Seob ribosoomi 40S alaühikut, ei lase sel seonduda
60S-ga. Seob ka eIF4G-d.
eIF4A (25 kDa). RNA helikaas, nõrgendab mRNA sekundaarstruktuuri ATP
hüdrolüüsist sõltuvalt.
eIF4B (80 kDa). Stimuleerib eIF4A helikaasset aktiivsust, seostub mRNA-ga.
eIF4E (24 kDa). Seob mRNA 5´cap struktuuri. eIF4E on translatsiooni initsatsioonil
limiteeriv faktor. Üle selle valgu toimub translatsiooni aktiveerimine vastusena
insuliinile või kasvufaktoritele, viirusinfektsioonil aga võib üle eIF4E toimuda ka cap-
sõltuva valgusünteesi inhibitsioon.
eIF4G (220 kDa). Molekulaarne adaptor, seob eIF4E, eIF4A, eIF3, Pab1p.
eIF5 (125 kDa). Ribosoomist sõltuv GTPaas, soodustab ribosoomi alaühikute
ühinemist.
eIF6 (25 kDa) Seob 60S alaühikut, põhiline antiassotsiatsioonifaktor.
Elongatsioonifaktorid
eEF1 (3 alaühikut: 51 kDa, 48 kDa ja 35 kDa). Seob GTP-sõltuvalt aa-tRNA-d, omab
ka GDP-GTP vahetusaktiivsust. Seega EF-Tu ja EF-Ts analoog.
eEF2 (95 kDa). Bakteri EF-G analoog, translokatsiooni faktor.
eEF3 (125 kDa). Ainult pärmis, katalüüsib tRNA dissotsatsiooni ribosoomi E-saidist.
On ribosoomist sõltuv GTPaas ja ATPaas.
Eukarüootides on leitud üks universaalne terminatsioonifaktor:
eRF (54 kDa dimeer). Põhjustab terminatsioonikoodonist sõltuvat valgusünteesi
terminatsiooni. Kuna eukarüootide valgusünteesi terminatsiooni on seni suhteliselt vähe
uuritud, siis on tõenäoline, et on veel avastamata terminatsioonifaktoreid (näiteks
prokarüootse RRF'i analoog).
On leitud eukarüootseid mRNA-sid kus 5´cap-i ja valku kodeeriva lugemisraami vahel
on tuhandeid nukleotiide. Need mRNA-d sisaldavad oma 5´-mittekodeerivas osas
tugevaid RNA sekundaarstruktuure ja sageli ka kümneid AUG koodoneid. Selliste
mRNA-de translatsiooni initsiatsioon ei saa toimuda skaneerimise teel. On teada, et
nende mRNA-de sekundaarstruktuurid juhivad kuidagi 40S alaühiku õige
initsiaatorkoodoni lähedale. Sisemist translatsiooni initsiatsiooni suunav struktuuri
mRNA's kannab nime IRES (internal ribosome entry site). Sellist cap-st sõltumatut
translatsiooni kasutavad mitmed rakulised mRNA-d (TBP, FGF2, IGF2, antennapedia,
ultrabithorax, eIF4G, BiP jt) ja paljud viiruste mRNA-d. Sisemist initsiatsiooni
kasutavad rakulised mRNA-d kodeerivad enamasti proto -onkogeene või arengugeene,
mille ekspressiooni on oluline täpselt reguleerida. Paljud viirused kasutavad cap-st
sõltumatut translatsiooni initsiatsiooni, et selektiivselt inhibeerida peremeesraku cap-st
32
sõltuvat translatsiooni ja suunata peremehe valgusünteesi aparaat eelistatult viiruse
valke tootma .
Osad viirused ( hepatiit C) suudavad oma sisemist initsiatsiooni kasutaval mRNA-l
initsiaatorkoodonit ära tunda kasutades vaid ribosoomi 40S alaühikut, Met-tRNA Met
i
eIF2 ja GTP-d. See komplekt faktoreid vastab aga täpselt prokarüootseks
initsiatsiooniks vajaliku faktorite komplektiga. Seega tundub, et eukarüootse
translatsiooni suurem keerukus on ehitatud konserveerunud prokarüootset päritolu
initsiatsioonimehhanismile. Seega ei ole eukarüoot oma translatsiooni mehhanismi
mitte uuesti üles ehitanud vaid lihtsalt prokarüootset translatsiooni täiendanud, et
tagada protsessi paremat kontrollitavust.
Valkude kotranslatsiooniline transport eukarüootides.
Valgusünteesi inhibeerivad antibiootikumid ja ribosomaalse RNA funktsioonid.
Antibiootikumid on madalmolekulaarsed ained, mis pidurdavad mikroobide elutegevust
ja paljud neist on sedamööda kasutusel ravimitena. Varem tuntud antibiootikumid olid
pärit mikro- või ka hulkraksetest organismidest (looduslikud antibootikumid). On
huvitav, et ka inimese organism toodab mitmeid antimikroobseid aineid, nn. defensiine,
mis on oma keemiliselt loomuselt lühikesed peptiidid ja nad on geneetiliselt kodeeritud
st. igale defensiinile vastab oma geen. Tänapäeval on kasutusel suur hulk sünteetilisi
antibiootikume, mis on kas looduslike ravimite derivaadid või täiesti uued keemilised
ühendid. Enamasti on antibiootikumid madalmolekulaarsed ained. Antibiootikumidel on
väga palju paralleelnimesid, iga ravimifirma kasutab sama toimeaine tähistamiseks eri
nime. Mikrobioloogias on siiski kasutusel iga aine jaoks üks nimi. Suur osa
antimikroobsetest ainetest, mida kasutatakse inimese ja loomade ravimisel , toimivad
valgusünteesi aparaadile. Siinkohal käsitleme mõningaid neist, mis toimivad kas otse
ribosoomile või on seotud elongatsioonifaktorite poolt suunatud protsesside
inhibeerimisega. Antibiootikumidel on spetsiifilise seondumise piirkond mõne
ribosoomi aktiivtsentri läheduses ja nad inhibeerivad reeglina põhiliselt üht ribosoomi
osareaktsiooni. Lisaks valgusünteesi inhibitsioonile ja seeläbi ravimi omadustele on
antibiootikumid olnud väga kasulikud ka valgusünteesi uurimisel . Parim näide on
siinkohal puromütsiin. Puromütsiinist oli juba eespool juttu seoses ribosoomi tRNA
sidumiskohtade ja peptiidsideme moodustumisega. Siin on kohane märkida, et
antibiootikumid on olnud olulisteks abimeeteks valgusünteesi molekulaarsete
mehhanismide väljaselgitamisel ja neid kasutatakse valgusünteesi uurimisel ka praegu.
Alljärgnevalt vaatleme antibiootikume, valgusünteesi inhibiitoreid, vastavalt nende
poolt mõjutatavatele protsessidele.
tRNA sidumist ja koodoni äratundmist (koodon-antikoodon interaktsiooni) mõjutavad
rohud:
Aminoglükosiidid (streptomütsiin, neomütsiin, kanamütsiin, gentamütsiin,
kasugamütsiin), inhibeerivad aa-tRNA seondumist ribosoomi A saiti ja koodon-
antikoodon äratundmist. Streptomütsiin (Strp) on tuntud omaduse poolest indutseerida
koodilugemise vigu st. valede aminohapete lülitumist valkudesse. Kui normaalselt
teevad bakteri ribosoomid ühe vea 10 000 õigesti lülitatud aminohappe kohta, siis
streptomütsiini juuresolekul võib vigade sagedus kasvada 50 korda. Valest sünteesitud
valgud ei suuda rakus täita vajalikke funktsioone ja kutsuvad esile proteaaside
aktiviseerimise. Selle tulemusena peatub valgusüntees ja raku kasv ning lõpuks järgneb
raku surm. Peale valelugemise vigade indutseerib streptomütsiin ja ka teised
aminoglükosiidid translatsiooni raaminihke teket, mis on raku elu seisukohalt veelgi
33
kahjulikuma efektiga kui valelugemine. Enamus aminoglükosiidseid antibiootikume
toimivad ainult prokarüootidele. Selline spetsiifika tuleneb eelkõige prokarüootsete ja
eukarüootsete ribosoomide ehituse erinevustest.
Aminoglükosiidid on tugeva positiivse laenguga ained ja seonduvad ribosoomides
põhiliselt 16S rRNA’ga. Seondumine ribosoomidega on väga spetsiifiline ja sageli ka
väga stabiilne (streptomütsiin seondub ribosoomidega pea kovalentsele sidemele
omase stabiilsusega). Prokarüootsetes ribosoomides takistavad aminoglükosiidid
koodoni seondumist antikoodoniga või põhjustavad selle protsessi selektiivsuse
vähenemist. Eukarüootsed ribosoomid aga ei seo enamusi aminoglükosiidseid
antibiootikume. Küll aga seovad aminoglükosiide mitokondrite ribosoomid.
Aminoglükosiidide seondumine põhiliselt rRNA’ga on olnud oluliseks argumendiks,
millel põhineb veendumus , et ribosoomide katalüütilised tsentrid on ehitatud peamiselt
RNA’st.
Bakterite resistentsuse aminoglükosiidsete ravimite suhtes tagavad mutatsioonid nii
16S rRNA’s kui ribosoomi valkudes. Streptomütsiini resistentsust põhjustavad
mutatsioonid vähemalt neljas erinevas 16S rRNA piirkonnas (primaarstruktuuril).
Ribosoomi ruumilises struktuuris paiknevad kõik need piirkonnad siiski lähestikku. 16S
rRNA mutandid, mis tagavad streptomütsiini resistentsuse, nõrgendavad oluliselt selle
ravimi seondumist ribosoomidele. Ribosoomi valgu S12 mutatsioonid võivad samuti
tagada streptomütsiini resistentsuse. Streptomütsiini resistentsed ribosoomid (S12
mutandid) transleerivad mRNA’d suurema täpsusega kui metsiktüübi ribosoomid.
Seejuures ei mõjuta nad väga oluliselt streptomütsiini seondumist ribosoomidega.
Viimase seondumisel väheneb küll translatsiooni täpsus aga jääb siiski raku taluvuse
piiridesse .
Mikroobigeneetika seisukohalt on oluline, et S12 mutatsioonid mõjutavad nonsens
suppressiooni aktiivsust. Suppressor tRNA’d, nagu juba eespool öeldud, ei
konkureeri tavaliste elongaator tRNA’dega võrdselt. Tavalisest täpsemate
ribosoomide aa-tRNA selektsioon on võimendunud ja seepärast ei suuda suppressor
tRNA’d oma funktsiooni täita. See asjaolu näitab veelkord, et ribosoomidel on
koodon-antikoodon äratundmises aktiivne osa. Mutatsioonid ribosoomi väiksema
subühiku valkudes S4 ja S5 pööravad S12 sõltuvad streptomütsiini resistentsused
ribosoomid taas ravimitundlikeks. Nimetatud valkude mutatsioonid ei mõjuta aga
streptomütsiini seondumist ribosoomidega vaid suurendavad ribosoomi poolt
tehtavate translatsiooni vigade sagedust. Neid mutatsioone nimetatakse ribosoomi
võimekuse mutatsioonideks (ribosome ambiguiti mutations - ram).
Tetratsükliin inhibeerib samuti aa-tRNA seondumist ribosoomi A-saiti. Tetratsükliin
seondub nii pro- kui eukarüootsete ribosoomidega. Eukarüoodid ei ole aga
tetratsükliini suhtes enamasti tundlikud, kuna rohi ei pääse eukarüootide rakkudesse.
Väga huvitav on tetratsükliini resistentsuse mehhanism. Bakterites on leitud valk
(TetO), mis tagab tetratsükliini resistentsuse. TetO valk eemaldab ribosoomidega
seondunud tetratsükliini. See reaktsioon on sõltuv GTP hüdrolüüsist. TetO valk ise
aga on homoloogne elongatsioonifaktor G’ga (EF-G). Piltlikult väljendudes pumpab
TetO valk ribosoomidest GTP hüdrolüüsi abil seondunud tetratsükliini välja.
Peptiidsideme sünteesi ja peptiidahela pikenemist inhibeerivad antibiootikumid
(koloroamfenikool, sparsomütsiin, erütromütsiin, linkomütsiin, klindamütsiin ja
nukleotiidsed antibiootikumid). Peptiidsideme sünteesi inhibeerivad väga paljud
antibiootikumid, millest siin käsitleme vaid mõnda. Kloroamfenikool ja sparsomütsiin
34
on kõige tüüpilisemad ensüümi inhibiitorid , nad seonduvad ribosoomi peptidüül-
transferaasse tsentri aktseptor saiti (ribosoomi A saidi osa, kuhu seondub tRNA 3’ ots -
CCA-aa), takistades aminoatsüül-tRNA (aktseptorsubstraadi) seondumist ribosoomi
aktiivtsentrisse. Kloroamfenikool ja sparsomütsiin takistavad peptiidsideme
moodustumist konkurentse inhibitsiooni kaudu.
Ribosoomide resistentsuse kloroamfenikooli ja sparsomütsiini suhtes tagavad
mutatsioonid 23S rRNA's (domäänis V, nn. peptidüültransferaasses regioonis). Kuna
resistentsuse nende peptiidsideme sünteesi inhibeerivate antibootikumide suthes
annavad mutatsioonid 23S rRNA’s, siis on tõenäoline, et ribosoomi peptiidsideme
sünteesi eest vastutav piirkond – peptidüültransferaasne tsenter – koosneb kas
tervenisti või osaliselt 23S rRNA’st. rRNA keskset osa peptiidsideme sünteesil ja
substraatide (aa-tRNA, pep-tRNA) sidumisel toetavad ka teised biokeemilised
andmed. Mutatsioonanalüüsiga on tuvastatud, et pep-tRNA nukleotiid C74 paardub
peptiidsideme moodustumise protsessis 23S rRNA numleotiidiga G2252 (moodustub
Watson-Crick aluspaar). Ka fotoafiinsusmärkega substaatide ristsidumise,
keemislise modifikatsiooni eest kaitsmise ja modifitseeritud substraatide
selekteerimisega saadud tulemused viitavad 23S rRNA kindlate piirkondade, mis kõik
asuvad domäänis V, lähedusele või otsesele osalusele ribosoomi
peptidüültransferaasele tsentrile.
Erütromütsiin kuulub makroliidsete antibiootikumide rühma. Makroliidid (lisaks
erütromütsiinile kuuluvad siia rühma veel paljud, näiteks karbomütsiin,
spiramütsiin, leukomütsiin, nidamütsiin, oleandomütsiin) inhibeerivad peptiidahela
pikenemist. Erütromütsiin blokeerib peptiidahela kasvu ribosoomis ainult sünteesi
algusfaasis ja ei mõjuta ei translatsiooni initsiatsiooni ega peptiidi sünteesi kui ahel
on pikem kui 6-7 aminohapet. Seepärast arvatakse, et makroliidid takistavad
kasvava peptiid ja ribosoomi vahelist interaktsiooni, tõenäoliselt peptiidi sisenemist
ribosoomi suuremat subühikut läbivasse tunnelisse. Erütromütsiini resistentsuse
tagavad mutatsioonid ribosoomi valgus L4, L22 ja 23S rRNA’s. Seega võib arvata, et
erütsomütsiin seondub ribosoomis nii suurema subühiku valkudega kui 23S rRNA’ga.
Makroliidide sidumispiirkond ribosoomis kattub osaliselt kloroamfenikooli
sidumiskohaga. Makroliidide ja kloroamfenikooli seondumine ribosoomidele on
teineteist välistav. Erütromütsiini, nagu paljude teiste antibiootikumide resistentsus
bakterites, saavutatakse ka teiste mehhanismide abil peale mutatsioonide ribosoomi
komponentides, näiteks permeaablust (ravimi transport bakterisse ) mõjutavad
mutatsioonid.
Linkomütsiin ja klindamütsiin (linkoosamiidid) inhibeerivad samuti peptiidsideme
sünteesi ribosoomidel. Nad blokeerivad aminoatsüül-tRNA 3’-otsa
(aktseptorsubstraadi) fikseerimist ribosoomi peptidüültransferaases tsentris ja on
selle omaduse poolest sarnased kloroamfenikooliga. Viimasega aga samuti
makroliididega on neil osaliselt kattuv sidumispiirkond ribosoomidel. Mõned 23S
rRNA mutatsioonidest, mis tagavad makroliidide resistentsuse annavad ka
linkoosamiidide resistentsuse.
Peptiidsideme sünteesi ribosoomidel inhibeerivad ka nukleotiidsed antibiootikumid:
amitsetiin, bamitsetiin, plikatsetiin, blastitsidiin S, gougerotiin.
Lisaks nimetatuile veel terve rida antibiiotikume takistavad peptiidsideme sünteesi
ribosoomidel, millest mõned näited: glutaarimiidid (tsükloheksimiid, streptividoon),
streptogramiinid (vernamütsiin, virginiamütsiin), krüptopleuriin, krototsiin.
Ribosomaalset translokatsiooni inhibeerivad tiostreptoon, viomütsiin ja
spektinomütsiin. Neist esimene, tiostreptoon, seondub ribosoomi suurema
35
subühikuga. Tiostreptooni seondumiskoha moodutavad ribosoomi valk L11 ja 23S
rRNA. Tiostreptoon ja viomütsiin blokeerivad ribosoomi struktuurse muutuse, mis on
vajalik translokatsiooni (mRNA ja 2 tRNA moklekuli kompleksi liikumine ribosoomis
ühe koodoni võrra) toimumiseks. Tiostreptoon, aga mitte viomütsiin blokeerib ka
elongatsioonifaktor G seondumise ribosoomidega, mis võimendab translokatsiooni
inhibeerimist veelgi. Tiostreptooni resistentsuse tagavad 23S rRNA modifitseerimine
või muteerimine ja valgu L11 puudumine ribosoomidest. Viomütsiini resistentsuse
tagavad mutatsioonid nii 23S kui 16S rRNA’s ja seega on põhjust arvata, et see
ravim seondub mõlema ribosoomi subühikuga. Kuna viomütsiin on 8 aminohappe
jäägist koosnev peptiid, siis peab tema seondumiskoht olema ribosoomi kahe
subühiku vahel sest oma väikeste mõõtmete tõttu ei saaks ta muidu mõlema
subühikuga seonduda. Spektinomütsiin, mis takistab EF-G seondumist
ribosoomidega, blokeerib samuti translokatsiooni takistades EF-G suunatud
reaktsiooni. Spektinomütsiini resistentsuse annavad ribosoomidele mutatsioonid
ribosoomi väiksema subühiku valgus S5 ja 16S rRNA’s. Spektinomütsiin seondub
ainult ribosoomi väiksema subühikuga. On huvitav märkida, et EF-G seondub
põhiliselt ribosoomi suurema subühikuga. Sektinomütsiini efekt translokatsioonile
toimub ilmselt kahe subühiku omavahelise orientatsiooni muutmise kaudu.
Elongatsioonifaktoritega seonduvad antibiootikumid on kirromütsiin ja fusiidhape.
Kirromütsiin seondub EF-Tu’ga aga ei takista EF-Tu komplekseerumist GTP ja aa-
tRNA’ga. Kui selline nelik-kompleks seondub ribosoomi A saiti toimub küll EF-Tu
suunatud GTP hüdrolüüs aga ei toimu EF-Tu ja GDP dissotsiatsiooni ribosoomidelt
ja peptiidsideme sünteesi ning valgusünteesi elongatsioon peatub. Mutatsioonid EF-
Tu’s annavad resistentsuse kirromütsiini suhtes. Fusiidhappel on sarnane efekt, aga
ta seondub EF-G’ga ja stabiliseerib EF-G .GDP kompleksi ribosoomiga takistades
niiviisi järgmise elongatsioonitsükli toimumist .
Transkriptsioon
Ülevaade ja terminid
RNA süntees e. geneetiline transkriptsioon on RNA süntees DNA alusel, mis on
geenide avaldumise peamine regulatsiooni tase. RNA polümeraasid (lühendid RNA
pol; RNAP) on ensüümid, mis vastutavad RNA sünteesi eest. Seepärast on RNA
polümeraas võtme-ensüümiks geenide aktiivsuse regulatsioonil. Just selle ensüümi
vahendusel määratakse rakkudes millised geenid avalduvad, millal ja millises ulatuses.
DNA sõltuv RNA polümeraas sünteesib DNA järjestuse alusel RNA ahela kasutades
substraadina nukleosiid trifosfaate. Keemilisest seisukohast on tegemist
polükondensatsiooni reaktsiooniga, mille käigus sünteesitakse fosfodiestersidemed
polünukleotiidahelasse ja reaktsiooni käigus vabanevad pürofosfaadi jäägid (vt. joonis
11.6). Nii nagu kõik nukleiinhapete biosünteesi reaktsioonid, kulgeb ka RNA süntees
rakkudes 5' → 3' suunas. Rakuliste organismide RNA polümeraasid koosnevad
paljudest subühikutest. Mitterakuliste mikro-organismide (viiruste) RNA polümeraasid,
mis ei vaja keerukat regulatsiooni, võivad koosneda ka ühest polüpeptiidist.
Transkriptsioon, nagu ka kõigi teiste makromolekulide sünteesi protsessid jagatakse
kolmeks: initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon. RNA süntees algab DNA ahela
kindlast kohast nn. start saidist. Enne kui süntees algab, peab RNA polümeraas
seonduma DNA kindla piirkonnaga, mida kutsutakse geeni promootoriks. Promootorid
on kindla järjestusega DNA lõigud (vt. allpool). Lisaks promootoritele on ka teisi DNA
järjestuse elemente, mis suunavad transkriptsiooni alustamist. DNA järjestuse
36
elemente, mis osalevad samal DNA molekulil transkriptsiooni initsiatsioonil,
kutsutakse cis järjestusteks või cis elementideks. RNAP seondub DNA
promootorpiirkonnaga koos lisafaktoritega, mis hilisemal ahela pikendamisel
(elongatsioonil) ei osale. Selliseid lisafaktoreid tuntakse trans faktorite nime all. Eriti
palju on RNAP'ga seonduvaid trans faktoreid eukarüootsetes organismides, kus
transkriptsiooni aktiveerivad faktorid (lühend TAF) on määrava tähtsusega
transkriptsiooni alustamisel. Lisafaktorid osalevad promootori äratundises ja aitavad
RNAP'il seonduda "õige" DNA piirkonnaga. Ka RNA ahela pikendamisel
(elongatsioonil) osalevad mitmed lisafaktorid, millest teeme juttu allpool. RNA
sünteesi lõpetamine võib vähemalt prokarüootides toimuda nii terminatsioonifaktorite
osavõtul (ρ-sõltuv terminatsioon) kui ilma nendeta (ρ-sõltumatu terminatsioon).
Eukarüootide transkriptsiooni terminatsioonist on vähem teada, kuid see toimub
tõenäoliselt ainult terminatsioonifaktorite vahendusel.
RNA polümeraasid
Pro- ja eukarüootsete organismide ribosoomid on väga sarnased nii ehituselt kui
talitluselt. RNA polümeraasid vahel on olulisi erinevusi pro- ja eukarüootide vahel,
samuti on RNA sünteesi regulatsioonis suuri erinevusi. Kui prokarüootidel on üks
aktiivne RNA polümeraas, siis eukarüootidel on neid kolm. Vaatleme kõigepealt
prokarüootset RNA polümeraasi eubakterite näitel. Nagu eespool märgitud
seonduvad transkriptsiooni eri etappidel RNAP'ga erinevad faktorid, millest mõnda
peetakse ensüümi koostisosaks. E. coli RNAP holoensüüm (täisensüüm) koosneb
neljast erinevast polüpeptiidist (valgust), millest üks on kahe koopiana. Holoensüümi
erinevaid osi tähistatakse kreeka tähtedega. Holoensüümi komponendid ja neid
kodeerivad geenid on toodud alljärgnevas tabelis:
Escherichia coli RNA polümeraasi subühikud ja nende geenid
geen
subühiku tähis
molekulmass
rpoA
α (alfa)
40 kDa
rpoB
β (beeta)
156 kDa
rpoC
β' (beeta prim)
160 kDa
rpoD
σ (sigam)
32-90 kDa
Holoensüümis on kaks α subühikut, üks β, üks β' subühik ja üks σ sübühik (α ββ
2
'σ)
molekulmassiga 428-486 kDa. Transkriptsiooni elongatsiooni viib läbi põhi- e.
tuumikensüüm (' core enzyme' ingl. k.), milles puudub σ subühik, seega α ββ
2
'. σ
subühik osaleb ainult translatsiooni initsiatsioonil suunates põhiensüümi seondumist
promootoriga. Kuna bakteri kromosoomides on mitut tüüpi promootoreid, siis on ka
neile vastavaid σ faktoreid mitu. Neist põhiline on σ32, molekulmassiga 32 kDa, valk
mis suunab suure enamuse bakteri geenide avaldumist.
1999. aastal avaldati kolm olulist tööd RNA polümeraaside ruumilisest struktuurist
(vt. Cell vol. 98, Sep. 17), mis kirjeldavad pärmi RNAP II (kuni 6 Å lahutuse tasemel)
ja bakteri Thermus aquaticus RNA polümeraasi põhiensüümi (3,3 Å lahutuse
tasemel) ruumilst struktuuri.
Struktuursed andmed aitavad mõista kuidas toimub σ faktor stimuleerib RNAP
seondumist promootoriga ja kuidas ensüümi struktuur muutub kinniseks peale 8 esimese
nukleotiidi lülitumist kasvavasse  RNA ahelasse. DNA kaksikahel, millelt toimub RNA
transkriptsioon on seotud RNAP β ja β subühikute vahele ning on seotud mõlemalt
poolt ensüümi, seega teeb DNA kaksikahel poolkaare ümber RNAP ensüümi. RNAP
maksimaalne läbimõõt on 150 Å, aga RNA sünteesi initsiatsiooni käigus katab RNAP
37
70-90 aluspaari DNA ahelast, seega 235-305 Å, mida seletab RNAP-DNA kompleksi
kolmemõõtmeline stuktuur, kus DNA pöördub ümber RNAP ensüümi. DNA on
transkriptsiooni käigus tihedalt seotud RNAP subühikute vahele, mis seletab
transkriptsiooni kõrge protsessiivsuse.
Eukarüootsest transkriptsioonist
Eukarüootidel on reeglina rohkem geene kui prokarüootidel. Näiteks imetajatel
arvatakse olevat 40 000 erinevat geeni, kuna prokarüootidel on neid rohkem kui 10x
vähem. Seepärast on ka eukrüootide geenide regulatsiooni mehhanismid oluliselt
komplitseeritumad. Lisaks on hulkraksetel eukarüootidel erinevad rakutüübid ja koed ,
milles ekspresseeruvad erinevad geenikomplektid. Eriti keeruliseks muudab geeni
ekspressiooni regulatsiooni hulkraksetes organismides rakkude difentseerumine
individuaalse arengu käigus, mille eri astmetel avalduvad erinevad geenikomplektid ja
toimub ulatuslik geenide avaldumise ümberlülitumine.
palju DNA cis elemente ja trans faktoreid
Erienevalt reguleeritud geeniperekonnad
5'TOP näiteks on housekeeping geenid
Üheaegselt avalduvatel geenidel sarnased faktorid (osaliselt kattuvad) ja ka
homoloogsed DNA cis järjestused, millega faktorid seonduvad
Sarnaselt reguleeritavatel geenidel homoloogsed DNA regulaatorjärjestused, mis
onsamade või sarnaste transkriptsioonifaktorite seondumiskohtadeks.
Eukarüootides on kolm erinevat RNA polümeraasi, millest igaühel on oma kindlad
märklaudgeenide:
RNAP I vastutab ribosomaalse RNA geenioperonide (18S-5,8S-28S rRNA)
transkriptsiooni eest.
RNAP II sünteesib valke kodeerivaid mRNA molekule
RNAP III transkribeerib 5S rRNA, tRNA ja mitmeid URNA molekule.
38
Epigeneetilised fenomenid
1. Prionid
2. Chaperonid (Hsp 90) mutatsioonide varjestajatena
3. RNA interferents
4. DNA metüleerimine ja geenide päritav represseerimine
Geenide vaigistamine ja RNA interferents.
Geenide vaigistamisele ja epigeneetilisele fenomenile on pühendatud ajakirja Science
10 Aug. 2001 erinumbri (vol. 293, No. 5532, p. 1064-1105) mitmed artiklid. Muude
hulgas ka M. Matzke, et al., ibid . 1080-1083.
Kuna nähtus on avastatud 1980ate lõpul taimedes ja 10 aastat hiljem loomadel, siis
kasutatakse põhiliselt sama nähtuse tähistamiseks palju erinevaid termineid. Nagu ikka
molekulaarbioloogias, on kasutusel suur hulk lühendeid, mille tähendust ei seletata just
igal pool lahti.
Terminid ja lühendid:
RNA vahendatud geeni vaigistamine - homoloogsete RNA'de või RNA ja DNA
interaktsioon viib geeni aktiivsuse kadumisele ja DNA metüleerimisele. Nähtus on
levinud paljudes päristuumsete rühmades nagu taimed, pärmid, ussid, putukad ja
imetajad . Eri taksonites kasutatakse erinevaid geeni vaigistamise mehhanisme. RNA
vahendatud geeni vaigistamine toimub nii tuumas (taimedes) kui tsütoplasmas.
RNAi - RNA interferents, post-transkriptsiooniline geeni vaigistamine, mille käigus 2-
ahelaline RNA suunab homoloogse mRNA lagundamist tsütoplasmas. Seda terminit
kasutatakse  Drosophila  ja Ceanorabditis'e uurijate poolt. Kuna see lühend on RNA
vahendatud geeni vaigistamise nähtuse tähistamiseks kasutatavatest kõige lühem, siis
eelistan kasutada just RNAi'd.
PTGS - post-transkriptsiooniline geeni vaigistamine (silencing). Kasutatakse taimede
puhul. Kasutatakse ka lühendit PTGS/RNAi.
quelling - sama tähendusega termin Neurospora puhul. (quelling Ingl. k. - lämmatama,
maha suruma )
dsRNA - kaheahelaline RNA (double stranded) on RNAi oluline vahendaja .
RdRP - RNA sõltuv RNA polümeraas suunab RNA sünteesi RNA matriitsi alusel,
mille tulemuseks on dsRNA . See ensüüm ei ole RNAi toimumiseks vajalik kui rakus on
suur kogus dsRNA'd.
RNaas III - dsRNA spetsiifiline endoribonukleaas, mis hürdolüüsib rohkem kui 10
aluspaarise dsRNA fosfodiestersidemed. RNAi puhul toimub pikkade dsRNA'de
lagundamine väiksemateks fragmentideks (21-25 aluspaari), mida viivad läbi RNaas III
homoloogid , näiteks Drosophilas valk nimega Dicer.
siRNA  - vaigistamist indutseeriv RNA on RNaas III sarnaste ensüümide hüdrolüüsi
produkt, 21-25 nt pikk, mis on kas "sense" või "antisense" järjestuse orientatsiooniga.
RISC  - RNA indutseeritud vaigistuskompleks (RNA induced silencing complex). See
on RNAi põhiline efektorkompleks, mis lagundab siRNA'ga homoloogse mRNA. Seega
siRNA kuulub koos mitmete valkudega RISC kompleksi.
Helikaasid - dsRNA'd või dsDNA'd lahtiharutavad ensüümid. Neurosposa puhul on
leitud et DNA helikaas osaleb RNAi toimumisel. Teistes organismides on leitud, et
RNAi jaoks on vajalikud RNA helikaasid.