Intragenomic Profiling Using Multicopy Genes: The rDNA Internal Transcribed Spacer Sequences of the Freshwater Sponge Ephydatia fluviatilis Liisi Karlep, To~nu Reintamm, Merike Kelve* Department of Gene Technology, Tallinn University of Technology, Tallinn, Estonia Abstract Multicopy genes, like ribosomal RNA genes (rDNA), are widely used to describe and distinguish individuals. Despite concerted evolution that homogenizes a large number of rDNA gene copies, the presence of different gene variants within a genome has been reported. Characterization of an organism by defining every single variant of tens to thousands of rDNA repeat units present in a eukaryotic genome would be quite unreasonable. Here we provide an alternative approach for the characterization of a set of internal transcribed spacer sequences found within every rDNA repeat unit by implementing direct sequencing methodology
FISH metoodikast on palju abi raskesti kultiveeritavate mikroobide analüüsil (Yersini pestis, Bartonella spp.) Samuti saab korraga detekteerida erinevaid organisme, kui kasutada erinevalt fluorestseeruvaid proove (erinev emissiooni lainepikkus) Protsess võtab aega 1-2 tundi, koos proovi fikseerimise, alusklaasile kandmise, rakkude permeabiliseerimise (kestad läbilaskvaks), proovi hübridiseerimise ja analüüsiga fluorestsents mikroskoobis (või FACS) 24. Patogeenide testimine 16S rDNA abil Kasutatakse universaalseid märklaudu: Ribosomaalse rRNA geenid 16S rDNA või 23S rDNA DNA mikrokiip kujutab endast väikest 2-mõõtmelist DNA fragmentide kõrgtihedat maatriksit, mis on kindlas järjekorras sünteesitud või trükitud klaas või silikoon kiibile. DNA fragmentide hübridiseerumine fluorestseeruva prooviga detekteeritakse spetsiaalse aparatuuriga.
funktsioone (raku kasvu pidurdamine, vananemine, plasmiidis kodeeritud mürkide abil konkurentide surmamine). Neid geene antakse edasi tsütoplasmaga seenehüüfide kokkukasvamisel (heteroplasmas). On kirjeldatud HGT bakterilt seenele, seenelt seenele (eri liikide või sama liigi eri isendite mtGenoomide vahel, seeneperekondade või ühe perekonna liikide tuumagenoomide vahel) ja seenelt taimele (sümbiontse või parasiitsete seene mtGenoomist taime mtGenoomi). HGT on leitud rDNA I grupi intronite osas ja mitmete valke kodeerivate järjestuste osas. Nii pärmidel kui hüüfe moodustavatel seentel on leitud mitootiline geenisiire, mis on sisuliselt sama, mis bakterite konjugatsioonil toimuv HGT. Kui haploidne tuum siseneb teise hüüfi, võib ta liikuda mitootiliselt jagunedes, säilitades oma intaktsuse. Selliselt tekkivad dikarüootsete hüüfide tuumad võivad olla küllaltki erinevad (aneuploidsus, kromosoomi pikkuse polümorfism)
1331-1335. Schardl, C.L. & Craven, K.D. 2003. Interspecific hybridization in plant-associated fungi and oomycetes: a review. Molecular Ecology 12: 2861–2873.lishing Zolan, M.E. 1995. Chromosome-length polymorphism in fungi. Microbiological Reviews, 49: 686–698. Tamm, H. 2004. Seeneperekonna Peziza (Pezizales, Ascomycota) gruppide P. varia ja P. violacea ning lähedaste liikide fülogeneetiline analüüs rDNA ITS regiooni alusel. Bakalaureusetöö. Tartu Ülikool. Käsikiri. Tamm, H., Kullman, B. & Kullman, K. 2005. Fungal Genome Size Database. In: Programme and Book of Abstracts of XVI Symposium of Mycologists and Lychenologists of Baltic States. 44. Cesis, Latvia. Taylor, W., Jacobson, D.J. & Fisher, M.C. 1999. The evolution of asexual fungi: reproduction, speciation and classification Annual Revue of Phytopathology 37: 197–246. Taylor, J.W
Ikkagi kaks riiki, loomad ja taimed (nuub). 19.sajandil areng 1)mikroskoopia täiustumine 2) evolutsiooniteooria juurdumine. Loomuliku süsteemi ideaaliks sai organismide rühmitamine põlvnemissuguluse ehk fülogeneetiliste suhete järgi. Fülogenees – evolutsiooniline päritolu. Ernst Haeckel – protistid, Herbert Copeland – bakterid, Robert Whittaker – seened. Carl Woese’i uurimused rDNA võrdluse kohta > hüpotees, et elu arengu algperioodil toimus lahknemine kolme harru ehk domeeni . Bakterid ja arhed säilitasid prokarüootse rakutüübi, kolmas arenes aga sümbiogeneesi kaudu eukarüootseks. Domeen – ülemriik e impeerium. Kaks prokarüootset ja neli eukarüootset riiki. Aga protiste tahetakse veel rohkematekski riikideks jagada (paras tulevastele õpilaspõlvedele!!!!!!).
Failis vetikate, samblate, samblike ,sõnajalgade, seente, käsnade, korallidega jne. Ikkagi kaks riiki, loomad ja taimed (nuub). --- 19.sajandil areng 1)mikroskoopia täiustumine 2) evolutsiooniteooria juurdumine. Loomuliku süsteemi ideaaliks sai organismide rühmitamine põlvnemissuguluse ehk fülogeneetiliste suhete järgi. Fülogenees evolutsiooniline päritolu. --- Ernst Haeckel protistid, Herbert Copeland bakterid, Robert Whittaker seened. Carl Woese'i uurimused rDNA võrdluse kohta -> hüpotees, et elu arengu algperioodil toimus lahknemine kolme harru ehk domeeni. Bakterid ja arhed säilitasid prokarüootse rakutüübi, kolmas arenes aga sümbiogeneesi kaudu eukarüootseks. Domeen ülemriik e impeerium. Kaks prokarüootset ja neli eukarüootset riiki. Aga protiste tahetakse veel rohkematekski riikideks jagada (paras tulevastele õpilaspõlvedele!!!!!!). Inimese põlvnemine Death is imminent
vahendavad TTAGGG korduste kinnitumist tuuma maatriksile. Telomeeri kromatiini struktuur mõjutab ka telomeeriga külgnevae geenide ekspressiooni, mistõttu telomeeri vahetus läheduses on geenid sageli represseeritud. Tuumakese organisaatori piirkond ehk NOR Tuumakese organisaatori piirkond on kromosoomiala, mis moodustab tuumakese. NOR-is paiknevad rRNA tandeemselt korratud geenid. Iga rDNA transkriptsiooniühik sisaldab rRNA geene kodeerivaid järjestusi ja mittetranskribeeritavat intergeenset speisserit. Inimese 5S RNA geenid, mis on 120 bp pikad ja mitusada korda tandeemelt korratud, paiknevad 1. kromosoomi pikal õlal ja ei ole seotud tuumakesega. 18S, 5.8S ja 28S rRNA geenid on 44 bp pikad ja paiknevad akrotsentriliste kromosoomide 13-15 ja 21-22 NOR-alades. DNA kordusjärjestused
Hübriidse DNA suhtelise hulga järgi on võimalik hinnata kahe võrreldava DNA homoloogsust. Ühte liiki kuuluvatel tüvedel on DNA homoloogsus 70% või enam. Kui see homoloogsus on madalam, siis ei kuulu võrreldavad tüved samasse liiki. Ühte perekonda kuuluvatel liikidel peaks DNA homoloogsus olema 40-60%. 6) Makromolekulide järjestused, (täisgenoomid, teatud geenide järjestused, valgujärjestused). rRNA järjestused . Juba ca 25 aastat on määratud rRNAd kodeerivate geenide (rDNA) järjestusi. rRNA geenid on head evolutsioonilised markerid, sest nende järjestused on vähe muutunud. Bakterite ribosomaalsete rRNAde ultratsentrifuugimisel eraldub 3 erinevat rRNAd: 23S, 16S ja 5S. Nende pikkused on 3300, 1650 ja 120 nt. Praegu on väga populaarne 16S rRNA sekveneerimine ja selle järjestuse kasutamine prokarüootide evolutsiooni uurimisel. 16S rRNA järjestuste sarnasust/erinevust saab kasutada just kõrgema järgu taksonite
polmeraasi ahelreaktsioon (PCR), DNA kloneerimine ja sekveneerimine on teinud vimalikuks uute meetodite arengu, mis on suuresti muutnud meie arusaamist bakterikooslustest ja mikroobide mitmekesisustest looduses. Mitmekesisus: feneetiline ssteem, numbriline taksonoomia- bakterite liikideks rhmitamine phineb morfoloogilistel ja biokeemilistel tunnustel Molekulaarsetest markeritest kasutatakse mikroobide mitmekesisuse uurimisel kige rohkem ribosomaalse operoni geene (16S rDNA, 5S rDNA), samuti ribosomaalsete geenide vahelist intergeenset piirkonda, samuti kasutatakse DNA graasi B alahiku GyrB , .70 RNA polmeraasi faktori, elongatsioonifaktori geeni EF-Tu ja ATPaasi b alahiku jrjestusi. Molekulaarsetest markeritest saadud informatsiooni phjal jaotatakse elusorganismid kolme domeeni: eubakterid, arhed ja euakroodid. Bakterite flogeneetiline puu koosneb vhemalt 18 alamjaotusest ehk himkonnast (uues Bergey mrajas on 23 himkonda), arhede puu kolmest himkonnast.
even in absence of insecticide ; in absence of J, mortality, high / c. 87% ; ref to comparative figures ; e.g. 87 to 48% / almost halved, in presence of insecticide 16 to 7% / more than halved, in absence of insecticide slight expression of E in absence of J caused by insecticide ; 4 max [4] 123. (a) rDNA = DNA from two sources ; both DNAs cut with, restriction enzyme / named restriction enzyme ; giving sticky ends ; or giving blunt ends to which sticky ends added ; complementary binding of sticky ends ; H bonds / e.g. A to T / e.g. C to G ; nicks in (sugar-phosphate) backbone sealed by ligase ; 3 max (b) percentage / proportion, of, muscle fibres with central nuclei / dying muscle
aitab tRNA koos a/h siduda mRNA); tRNA, transport RNA (Transpordib a/h mRNA translatsiooniks); snRNA, väike nukleaarne RNA )Koos valkudega moodustab splaissosoomi, mis võtab osa RNA protsessingust (intronite eemaldamine); interferents RNA reguleerib ekspressiooni. rRNA süntees ja ribosoomid: Rakus tuhandeid ribosoome. Koosnevad kahest subühikust:suurest ja väikesest; kompleks valkudega. DNA piirkonnad, mis kodeerivad rRNAd nimetatakse rDNA-ks. Eukarüootidel on palju rRNA geene, mis korduvad tandeemselt. Transkriptsioon sarnane valke kodeerivate geenide transkriptsiooniga, kasutades RNA I polümeraasi. rRNA süntees nõuab oma transkriptsioonifaktorit. Kodeerivatel rRNA geenidel on omad speisserid, mis eraldavad subühikuid ja aitavad rRNA assambleerumiseks ribosoomis. Ribosoomi subühikud on omavahel seotud vesiniksidemetega. Lõpuks transporditakse RNA tuumast tsütoplasmasse ja initseeritakse valgu süntees. tRNA süntees:
See töö on siiski juba alanud ja kõigil tasandeil korraga. Võtame näitena eubakterid ja arhaed: enne FLK kasutuselevõttu oli kirjutatud pakse raamatuid bakterite süstemaatikast, kuid kogu see töö oli üks kolossaalne kokkuleppeliste tunnuste loend. Muidugi oli püüeldud loogiliste üldistuste poole, kuid saadud jaotuse pilt oli vaid osalt kattuv ideega ühiste eellaste olemasolust. Vaid tänu viimase kahe aastakümne jooksul (üha kasvavas mahus) toimuv massiline geenide (eelkõige rDNA) analüüs andis aluse fülogeneesile ülesehitatud süstemaatika rajamiseks. FLK on esialgu tugev siiski kui teoreetiline alus. Praktikas on raskusi. Võibolla koguni nii suuri raskusi, et tuleb kaaluda, kas bioloogiale (eriti süstemaatikale) nii oluline mõiste nagu liik ei vajaks ülepea asendamist rangemat sisu omava terminiga. Fülogeneetikud eelistavad rääkida populatsioonidest. Mikroorganismide süstemaatikas toimunud revolutsioon on selles mõttes
sarnaselt reguleeritavatel geenide homoloogsed DNA regulaatorjärjestused, mis on samade või sarnaste transkriptsioonifaktorite seondumiskohtadeks. Eukarüootides on kolm erinevat RNA polümeraasi, millest igaühel on oma kindlad märklaudgeenid - eukarüootide 3 erinevat RNA polümeraasi: RNAP I – vastutab ribosomaalsete RNA geenioperonide transkriptsiooni eest (18S- 5, 8S-28S rRNA), transkribeerib ühte geeni, mida on paljusid koopiaid (rRNA). rDNA – geenid, mis kodeerivad ribosoomi RNA-d. Ühte operoni organiseeritud – erand eukarüootides, tavaliselt seda neil ei esine. RNAP II – sünteesib valke kodeerivaid mRNA molekule – transkribeerib enamikke geene, olulisim (!) RNAP III – transkribeerib 5S rRNA, tRNA ja mitmeid U-RNA molekule, sno RNA (ja ka tuumas!) epigeneetilised fenomenid: 1. Prion 2. Chaperonid (Hsp 90) mutatsioonide varjestajatena 3. RNA interferents 4. DNA metüleerimine ja geenide päritav represseerimine
aureus Spain SDS-PAGE-sequencing of 16S-rRNA gene18 St. auricularis serbian Phenotypic10 St. capitis Serbia Phenotypic10 Croatia St. caprae Greece Phenotypic10 Bosnia-Herzegovina St. carnosus Slovakia Species specific PCR2,11 Spain 16S–23S rDNA intergenic region amplification— Croatia species specific PCR9 Italy Phenotypic10 St. cohnii Italy PCR-DGGE11 St. cohnii cohnii Greece Phenotypic24 St. cohnii urealyticum Greece Phenotypic10 St. epidermidis Spain 16S–23S rRNA intergenic region amplification-species
annaabi.ee 
