Meditsiinilise mikrobioloogia praktikum (0)

Tartu Ülikool 
Mikrobioloogia  instituut 
 
Meditsi nilise mikrobioloogia  praktikum  
II osa 
       
 
 
 
Tatjana  Brilene, Kai Truusalu, Tõnis Karki 
 
 
 
 
 
 
 2014/2015 
 
1
 
Sisukord 
 
1.  Mikrobioloogilise  diagnostika  põhiskeem. 
Stafülokokknakkuste diagnostika. Streptokokknakkuste diagnostika. . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
2.  Enterobakterite  nakkuste  diagnostika uroinfektsioonide näitel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 
3.  Enterobakterite nakkuste diagnostika sooleinfektsioonide näitel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 16 
4.  Bordetel a ja Corynebacterium’i nakkuste diagnostika. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 
5.   Mycobacterium  spp.  infektsioonide  diagnostika. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .26 
6.  Anaeroobsete infektsioonide mikrobioloogiline diagnostika. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 
7.  Spiroheetide,Neisseria,  Chlamydia  ja Mycoplasma infektsioonide diagnostika. . . . . . . . .  .38 
8.   Seennakkused , algloomnakkused,zoonoosid ja riketsioosid…………………………. . .48 
9.  Molekulaarsed meetodid mikroorganismide samastamiseks ja iseloomustamiseks. . . . . . .63 
10.  Elektroforees . Viroloogiline diagnostika. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 
 
 
2
 
Mikrobioloogilise diagnostika põhiskeem 
1 
 
 
A. Uuritav materjal 
Materjali  valik  toimub  vastavalt  haiguse  patogeneesile,  s.o.   haigustekitaja   võimalikule  lokalisatsioonile 
organismis. 
B. Mikrobioloogiline diagnoosimine 
1.  Algmaterjali  mikroskoopiline   uurimine .  Eesmärk:  mikroorganismi   morfoloogia   kindlaksmääramine  ja 
organismipoolse põletikulise reaktsiooni olemasolu määramine. Klinitsistile antakse orienteeriv vastus. Algma-
terjal kantakse esemeklaasile, fikseeritakse leegil või  alkoholiga , värvitakse vastavalt otsitavatele mikroorgani-
smidele  mõne spetsiaalse  värvimismeetodi järgi (metüleensinine,  akridiinoranž,  Gram , Ziehl-Neelsen, Giemsa, 
tušimeetod jt.) ja uuritakse mikroskoobiga (valgus-, faaskontrast-, pimeväli-, fluorestsentsmikroskoopia). Regist-
reeritakse mikroorganismide värvumine, näit. Gram (+) või Gram (–), nende kuju, kihnu, eoste, inklusioonide 
olemasolu, suurus,  asetus  omavahel ja organismi rakkude suhtes. Hinnatakse  rakulise  reaktsiooni iseloomu (koe-
rakud , granulo-, lümfo- ja  monotsüüdid), põletiku  esinemist . 
2.  Haigustekitaja   isoleerimine   ja  identifitseerimine.  Eesmärk:  uuritavast  materjalist  mikroobi 
väljakasvatamine,  tema  omaduste  uurimine  ja  nende  alusel  haigustekitaja   samastamine   ja  ravimtundlikkuse 
määramine.  
 
Mikroorganismide  väljakasvatamiseks  kunstlikel  söötmetel  või  rakukultuurides  valitakse  kas  
aeroobsed,  anaeroobsed  või  mikroaerofiilsed  tingimused,  optimaalne  temperatuurirežiim,  sobiv  natiivsete 
valkude  ( veri ,   seerum ,  munakollane)  ja  kasvufaktorite  sisaldus.  Registreeritakse  mikroobide  pesade  kuju, 
hemolüüsi  esinemine  veriagaril,  mikroobikultuuride  värv,  läige  ja  lõhn.  Edasi  määratakse  mikroobide 
biokeemilis-füsioloogilised  omadused.  Vastavalt  sellele,  milliseid  ensüüme  antud  liiki/biotüüpi  kuuluvad 
mikroobid  omavad, on nad võimelised kindlateks biokeemilisteks reaktsioonideks. Viies tundmatuid baktereid 
kokku  mitmesuguseid  substraate  (enamasti  süsivesikuid  ja  aminohappeid)  sisaldavate    diagnostiliste 
süsteemidega  ja  registreerides  tekkivaid  reaktsioone,  on  võimalik  määrata,  milliseid  ensüüme   mikroob   omab 
ning vastavate  tabelite  või tarkvarasüsteemide järgi ta identifitseerida. 
•  I  põlvkonna  diagnostilised  süsteemid:  mitmesuguseid  substraate  ja  indikaatoreid  sisaldavad  valiksöötmed, 
kusjuures   määramiseks  on vajalik mikroobi kasv.  
•  II  põlvkonna  süsteemid:  kommertsiaalsed  mikroobide  identifikatsioonisüsteemid  (API,  Vitek  jt),  mis 
koosnevad 5–95 testist ja määravad mikroobide ensüüme substraadi lõhustamise teel.  Teste  hinnatakse kas 
visuaalselt   või  spektrofotomeetriliselt.  Iga  mikroobiliigi  jaoks  on  testil  oma  diagnostiline  väärtus  (kuni 
100%),  lõppidentifikatsioon  toimub  enamasti  spetsiaalsete  arvutiprogrammide  abil,  mis  annavad  teatud 
tõenäosusväärtusega uuritavale mikroobile nime (mõnikord ka 2–3 erinevat tõenäolist  varianti ). Klinitsistile 
väljastatavas  vastuses  on  oluline  märkida  mikroorganismide  tundlikkus  (antibiogramm)  mitmesuguste 
antibakteriaalsete  preparaatide  suhtes. 
•  MALDI-TOF  (" Matrix   Assisted  Laser  Desorption/Ionization")  ehk   proteiini   profiili  määramine  mass-
spektromeetria abil. Identifitseerib kuni 96 proovi 30 minuti jooksul. 
3.   Seroloogiline  uurimine. Eesmärk:  spetsiifiliste  antikehade esinemise või nende tiitri tõusu abil haigustekitaja 
olemasolu määramine organismis.  
Vereseerumis  määratakse  antikehade  sisaldus:  aglutinatsioonireaktsiooniga,  kusjuures   antigeen   võib  olla 
kinnistatud  mõnele  suuremale  rakulisele  kandjale,  nagu  erütrotsüüdid  hemaglutinatsioonireaktsioonis  (HA, 
HAPR); komplemendi  sidumise  reaktsiooniga (KSR); immunoensümaatilisel teel (EIA);  Western -Bloti meetodil 
jne. 
 
3
4.  Bioloogiline uurimine. Eesmärk: mikroorganismi  kindlakstegemine  või tema omaduste uurimine katseloo-
made organismis. Katselooma abil on võimalik uurida mikroobi haigustekitavust.  
5.  Allergilised 
nahareaktsioonid. 
Eesmärk: 
infektsiooni 
diagnoosimine 
patsiendi 
organismis 
mikroorganismide ainevahetusproduktide suhtes tekkivate allergiliste nahareaktsioonide abil. 
6.  Molekulaarsed meetodid – PCR, hübridisatsioon jt. 
 
C. Bakterpreparaadid 
 
D. Antibakteriaalsed  preparaadid  
 
 
Stafülokokknakkuste diagnostika  
 
 Üldiseloomustus 
 
Stafülokokid   koloniseerivad  sageli  inimese  ninakoobast,  eeskätt  selle  esimest,  ninasõõrmetega 
piirnevat  osa,  suuõõne  limaskesta  ja  nahka.  Tegemist  on  Gram+  kokkidega,   diameeter   0,8-1,0  µm,  mis 
mikroskoopilises preparaadis võivad ilmneda ühe- või paarikaupa, lühikeste ahelatena ning kõige sagedamini 
ebaregulaarsete,  viinamarjakobarat  meenutavate  kogumikena.  Stafülokokid  on  katalaas-positiivsed 
mikroobid, mis on enamasti suutelised taluma kõrgeid NaCl kontsentratsioone (7,5-10%). Viimast omadust 
kasutatakse stafülokokkide isolatsiooniks vajaliku selektiivse söötme valmistamisel. 
Kliiniliselt  olulised  on  enamasti  5  stafülokokkide  liiki:   Staphylococcus    aureus ,  S.  epidermidis,  S. 
saprophyticus, S. haemolyticus, S.  hominis . 
  S.  aureus  on  kõige  patogeensem  liik,  põhjustades  erinevaid  infektsioone.  Ligi  30%  täiskasvanutest  ja 
enamik lastest kannab seda nina limaskestal. Enamiku S. aureus’e infektsioonide allikaks on kliiniliselt terve 
kandja  või   kokkupuude   stafülokokilise  mädaga.  Sissetungiväratiks  on  enamasti  nahk.  S.aureus  võib 
põhjustada: 
•  Lokaalseid infektsioone (bakterite paljunemisest tingitult).  Pehmete  kudede intensiivset põletikku, mille 
käigus  tekib  mädakolle,  nimetatakse  abstsessiks.  Sõltuvalt  lokalisatsioonist  nimetatakse  abstsessi  kas 
mädapustuliks  ehk  follikuliidiks  (karvanääpsu   põletik );  furunkliks  (karvanääpsu  ümbritsevate  kudede 
põletik)  või  karbunkliks  (mitmekoldeline  suurema  pinnaga  mädapõletik)  S.  aureus  põhjustab  sageli 
traumaatiliste ja postoperatiivsete haavade infektsioone. 
•  Süsteemseid  infektsioone  -   sepsis ,  septiline   artriit ,   endokardiit ,   meningiit ,   osteomüeliit ,  samuti 
abstsesse  kopsus,  põrnas,  maksas,  neerudes.  S.  aureus’e   pneumoonia   võib  sageli  olla   sekundaarne , 
tekkides peale viirusliku  gripi  põdemist, harvem leetrite järgselt. 
•  Toksiini  poolt  indutseeritud  kahjustusi.  S.  aureus  võib  kahjustatud  nahalt  või   ninast   sattuda  toitu.  Kui 
tegemist  on enterotoksiini tootva tüvega,  tekib  stafülokokiline  toidumürgitus. Mõned  tüved toodavad 
ka  TSST-1  toksiini  ( toksilise   šoki  sündroomi  toksiin-1),  põhjustades  toksilise  šoki  sündroomi,  mis  on 
seotud  enamasti  vastavate  tüvede  kasvamisega  hügieenitampoonidel  ning  haavades.  Mõned  tüved 
produtseerivad ka eksfoliatiini – eksotoksiini, mis põhjustab väikelastel epidermolüütilist sündroomi e. 
eksfoliatiivset villilist dermatiiti. Kuna enamus S. aureus’e tüvesid produtseerivad ensüümi koagulaas, 
kutsutakse seda liiki ka koagulaas-positiivseteks stafülokokkideks. 
 
 
4
Teised kliinilist tähtsust omavad stafülokokid, mis ei ole S. aureus ja ei oma koagulaasi, kannavad üldistavat 
nimetust  koagulaas-negatiivsed stafülokokid (KONS’id).  
Tegemist  on  naha  normaalse  mikroflooraga.  Kuuludes  oportunistlike  patogeenide  hulka  võivad  põhjustada 
infektsioone langenud kaitsevõimega isikutel. 
 S. saprophyticus on sage uroinfektsiooni põhjustaja noortel tervetel naistel, mujalt isoleeritakse teda väga 
harva.  Enamus  KONS’i  poolt  põhjustatud  nakkusi  on  seotud  veresoonesiseste  kanüülidega,  südame 
klapiproteesidega,  šuntidega  –  “kateeter-sepsis”.  Nad  võivad  põhjustada  liigesproteeside  infektsioone, 
endokardiite, haavainfektsioone, kui haava jääb võõrkeha jne.  
 
Uuritav materjal 
 
Sõltub haigusprotsessi lokalisatsioonist: 
•  mädapõletike korral on uuritavaks  materjaliks   mäda  (võetakse tampooniga või punktsioonil) 
•   kopsupõletik  –  röga  
•  artriit – liigeseõõne punktaat 
•  meningiit –  ajuvedelik  
•   tsüstiit  ja  püelonefriit  – uriin 
•  sepsis ja toksilise šoki  sündroom  – veri 
•  toidutoksikoinfektsioonid – roe ja oksemassid, jne. 
•  sanitaarse näidustuse korral uuritakse kaabet kätelt ja ninalima stafülokokkide kandluse suhtes. 
 
Samastamine 
 
ALGMATERJALI  MIKROSKOOPIA .  
Stafülokokid  on      Gram+   kokid     ühe-  või  paarikaupa,  lühikeste  ahelatena  ning  kõige  sagedamini 
ebaregulaarsete, viinamarjakobarat meenutavate kogumikena.                               
NB! Alati ei ole võimalik eristada stafülokokke streptokokkidest mikroskoopia abil – morfoloogia võib olla 
suhteliselt sarnane!  
KATALAASI  PRODUKTSIOON . Kasutatakse stafülokokkide ja streptokokkide diferentsiaaldiagnostikas.  
Stafülokokid  on  katalaaspositiivsed,  streptokokid  –  katalaasnegatiivsed.  Esemeklaasil  suspendeeritakse 
tahkel  söötmel  kasvanud  uuritavast  pesast  külvinõelaga  võetud  kultuuri  3%  vesinikperoksiidi  lahusesse. 
Katalaaspositiivsete  mikroobide  puhul  hakkab  erituma  gaasimulle,  katalaasnegatiivsete  mikroobide  puhul 
mulle ei eraldu.  
KASV  VERIAGARIL  JA  NOVOBOTSIINTUNDLIKKUS.  Stafülokokkide   pesad   veriagaril  on  tavaliselt  ümarad, 
kuplikujulised,  1-2  mm  läbimõõduga,  valkjad,  hallikad  või  kollakad.  Hinnatakse  mikroobi  poolt 
põhjustatavat  hemolüüsi  ning  tundlikkust  novobiotsiinile  S.  saprophyticus’e  eristamiseks  teistest 
koagulaasnegatiivsetest stafülokokkidest. 
Test 
S. aureus 
S. epidermidis 
S.saprophyticus  
Hemolüüs  
Tavaliselt ß 
Tavaliselt  puudub 
Tavaliselt puudub 
Pigment  
Sageli kreemikas- kollakas  
Tavaliselt valge 
Tavaliselt valge 
Novobiotsiin 
Tundlik (>16 mm) 
Tundlik (> 16 mm) 
Resistentne  ( 4-5  aastastel  lastel ja täiskasvanutel meningiidi puhul. 
 
 
•Viridans-STREPTOKOKID. Põhjustavad alfa-või γ-hemolüüsi. Tegemist on  ülemiste  hingamisteede 
mikrofloorasse  kuuluvate  streptokokkidega  –  Streptococcus  mutans,  S.  sanguis,  S.mitis,  S.salivarius. 
S.mutans  põhjustab  hambakaariest.  Viridans-streptokokid  põhjustavad  50-70%  bakteriaalse  endokardiidi 
juhtudest,  eriti  kui  südameklapid  on  eelnevalt  kahjustatud  –  näiteks  reumaatiliselt.  Vahel  isoleeritakse 
baktereemia , haavainfektsioonide, hambaabstsesside korral. 
 
Streptokokkide  samastamine  ja  eristamine  üksteisest  toimub  biokeemiliste    ja  /või  seroloogiliste  ning 
MALDI-TOF  meetodite abil. 
 
 
Uuritav materjal 
 
Sõltub haigusprotsessi lokalisatsioonist. 
•  mädapõletike korral on uuritavaks materjaliks mäda (võetud kas punktsiooniga või tampooniga); 
•  farüngiit – tampooniga võetud neelumaterjal,  
•  artriit – liigeseõõne punktaat,  
•  meningiit – ajuvedelik, 
•  tsüstiit ja püelonefriit– uriin,  
•  sepsis – veri,  
•   reuma   -  vereseerum  anti-O streptolüsiini tiitri määramiseks.  
 
 
 
 
 
 
 
 
7
Samastamine 
 
ALGMATERJALI  MIKROSKOOPIA.  Streptokokid  on  grampositiivsed  kokid,  mis  on  mikroskoobis  nähtavad 
paaridena  või erineva pikkusega ahelatena.  Kopsupõletiku  korral on rögas näha Gram+  kihnuga  ümbritsetud 
diplokokid, mis tulevad hästi nähtavale värvunud  taustal.  
KATALAASI  PRODUKTSIOON.  Kasutatakse  stafülokokkide  ja  streptokokkide  diferentsiaaldiagnostikas. 
Streptokokid on katalaasnegatiivsed. (Vt. lk.5) 
KASV  JA  HEMOLÜÜSI  TÜÜP  VERIAGARIL.  Oluline  tunnus,  mille  alusel  rühmitatakse  kas  α-,  β-  või  γ-
hemolüütiliseks.  A  grupi  ß-hemolüütilised  streptokokid  kasvavad  väikeste,  valkjashallikate  1  mm 
läbimõõduga pesadena, mille ümber täieliku hemolüüsi tsoon. S.pyogenes produtseerib O- ja S-streptolüsiini. 
Kuna  O-streptolüsiin  inaktiveerub  hapniku  toimel,  on  hemolüüsi  võimalik  paremini   avastada   juhul,  kui 
külvinõelaga,  -aasaga  torgatakse  mitu  korda  agarsöötme  pinna  sisse.  B  grupi  streptokokkide  pesad  on 
enamasti suured. Ka D grupi pesad on suuremad  α-hemolüütilised pesad. Viridans-grupi pesad meenutavad 
nööpnõelapäid,  s.t.  väikesed  koos  vastava  hemolüüsiga.  S.  pneumoniae  pesad  on    limased  väikese  lohuga 
keskel (autolüüsist), võivad olla α- või γ-hemolüüsiga.   
 
ß-HEMOLÜÜTILISE A GRUPI STREPTOKOKI (S. pyogenes) SAMASTAMINE. Toimub  lateksaglutinatsiooni  ja 
PYR kiirtesti abil. PYR-test määrab pürrolidonüül- proteaasi  produktsiooni, mis lubab eristada A ja D grupi 
streptokokke.  PYR-reagent  tilgutatakse  kas  otse  väljakasvanud   kultuurile   või  inokuleeritud  kultuuriga  
kettale, positiivse tulemuse puhul  tekib 1 – 2 minuti jooksul punane värv.  
 
PNEUMOKOKKIDE  SAMASTAMINE.  Aluseks  on  iseloomulik  kasv  veriagaril  (vt.   eespool ),  positiivne 
lateksaglutinatsioonireaktsioon.  Isoleeritud  pneumokoki  samastamiseks  kasutatakse  optohiintesti.  Ainult 
S.pneumoniae 
on 
tundlik 
optohiinile 
(etüülhüdrokupreiin 
hüdrokloriid), mistõttu veriagarile asetatud optohiini sisaldava  diski   
ümber tekib kasvuvaba tsoon. 
 
ENTEROKOKKIDE  SAMASTAMINE.  Aluseks  on  iseloomulik  kasv 
veriagaril, 
lateksaglutinatsioonireaktsioon. 
Enterokokke 
aitab 
eristada  teistest  bakteritest  võime  kasvada   sappi   sisaldavatel 
söötmetel. Lisaks hüdrolüüsivad nad eskuliini, tekitades eskuletiini, 
mis  rauasooladega  annab  musta  värvi.  Viimane   reaktsioon   võib 
ilmneda  rohke  inokulaadi   olemasolul   15-20  minuti  jooksul, 
tavaliselt võtab küll aega 3-4 tundi.  
 
 
ANTIBIOOTIKUMTUNDLIKKUSE  MÄÄRAMINE.  Üldreeglina  farüngiidi  puhul  ei  määrata  S.  pyogenes’e 
resistentsust.  Viimasel  ajal  tsirkuleerivad  maailmas  siiski  makroliidresistentsed  A  grupi  streptokokid. 
Pneumokokkide  puhul  on  probleemiks  penitsilliinresistentsuse  tõus  –  PRSP.  Viimase  diagnoosimiseks  ei 
piisa   disk -difusiooni  testist,  vaid  määrata  tuleb  MIK  näiteks  E-  testiga.  Enterokokkide  kui  ühe  olulise 
hospitaalinfektsiooni põhjustaja korral tuleb määrata antibiootikumtundlikkus. 
 
Praktiline töö 
 
Ülesanne  1.  Vaadelda  ja  joonistada  Grami  meetodil  värvitud  demonstratsioonpreparaate  alljärgnevatest 
Gram-positiivsetest kokkidest. 
 
Staphylococcus aureus puhaskultuuris   
 
 
 
   
 
 
Staphylococcus aureus mädas 
 
 
 
 
8
Streptococcus pyogenes mädas   
 
Streptococcus pneumoniae hiirekõhuõõnes 
 
 
 
 
 Enterococcus faecalis puhaskultuuris 
                    
                          Viridans-streptokokid 
 
 
 
        
 
 
   
 
 
 
 
 
 
Ülesanne 2. Vaadelda demonstratsiooniks välja pandud järgmisi reaktsioone. 
 
•  Stafülokokkide  kasv veriagaril (pesade kuju, suurus, värv, hemolüüs) 
•  Stafülokokkide novobiotsiintundlikkus 
•  S. aureus’e ja S. epidermidis’e kasv soola-manniitagaril (pesade kuju, suurus, värv) 
•  Streptokokkide kasv veriagaril (pesade kuju, suurus, värv, hemolüüs).  
•  S. pneumoniae  optohiintest  veriagaril  
•  Positiivne ja negatiivne  sapi -eskuliintest enterokokkide samastamiseks. 
 
 
9
 
Ülesanne 3. Igale lauale on välja pandud uuritav materjal, mis sisaldab grampositiivset  haigustekitajat . Teha 
uuritavast materjalist joonkülv  kahele plaadile : veriagarile ja soola-manniitagarile. 
 
Uuritavate  materjalide päritolu.  
 
•  Materjal 
nr. 
1 
– 
haavaeritis, 
postoperatiivne 
haavainfektsioon; 
•  Materjal  nr.  2  –  haavaeritis  noorelt  meespatsiendilt, 
spontaanselt  tekkinud  ulatuslik  pehmete  kudede   nekroos , 
millega  kaasneb   turse   ja  tugev  valu,  haige  väga   raskes  
seisundis, 
•  Materjal  nr.  3  –  veri,  vastsündinute   intensiivravi   osakonnas 
veenisisese kanüüliga lapsel tekkinud sepsis. 
  
 
 
Ülesanne 4. Stafülokokkide kandluse määramine. Iga üliõpilane võtab tampooniga ninast materjali ja külvab 
selle soola-manniitagari sektorisse. 
 
Ülesanne  5.  Märkida  olulisemad  stafülokokilise  ja  streptokokilise  infektsiooni  raviks  kasutatavad  anti-
biootikumid  
•Stafülokokid   
•Streptococcus pyogenes 
 
•Pneumokokk   
•Enterokokid 
 
 
 
 
 
 
 
Enterobakterite põhjustatud uroinfektsioonide diagnostika 
 
Ülesanne 6. Erinevatest uriiniproovidest uroinfektsiooniga patsientidelt teha külv URICULT TRIO 
söötmele.  
 Protseduur: 
1.  Eemalda söötmetega plaat topsist. 
2.  Kasta  plaat  värske uriini sisse nii, et söötmepinnad oleks uriiniga täielikult kaetud. 
3.  Lase üleliigne uriin söötmelt maha tilkuda. 
4.  Eemalda  viimased  tilgad vajadusel puhta adsorbeeriva paberiga. 
5.  Pane söötmetega plaat topsi tagasi ja sulge  tops  hoolikalt. 
6.  Täida kleebis  andmetega  ja kinnita see topsile. 
7.  Aseta külviga tops püstises asendis kultuuride kasti.  
8.  Hindamine toimub  järgmises  praktikumis . 
 
10
 
Ülesanne 7.  Kvantitatiivne  uroinfektsioonitekitajate määramine  GOULD ’i  meetodil. Erinevatest 
uriiniproovidest uroinfektsiooniga patsientidelt teha külv  selektiivsele 
söötmele. 
 
1.   Standardse   külviaasaga  külvatakse  sektorisse  1  uriin  sellise 
arvestusega,  et  aas  liiguks  söötmel  täpselt  40  korda,  s.t.  20 
edasi- tagasi liigutust! 
2.  Seejärel   vahetatakse   aas  ning  tõmmatakse  sellega  4  joont 
sektorisse number 2, kusjuures jooned peavad ületama sektori 1 
külvijooni. 
3.   Aasa    vahetuse   järel  4  joont  sektorisse  3,  kusjuures  jooned 
ületavad  sektorit  2. 
4.  Aasa  vahetuse  järel  4  joont  sektorisse  4,  kusjuures  jooned 
ületavad sektorit 3, kuid mitte sektorit 1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11
 
Enterobakterite nakkuste diagnostika 
 2 
uroinfektsioonide näitel 
 
 
Üldiseloomustus 
 
Enterobacteriaceae  sugukonda kuuluvaid  mikroobe  iseloomustavad järgmised ühised tunnused:  
1.  Morfoloogialt gramnegatiivsed pulkbakterid; 
2.  Kui on liikuvad, siis tänu enamasti peritrihaalsetele viburitele; 
3.  Kõik on fakultatiivsed anaeroobid (kasvavad õhuhapniku tingimustes); 
4.  Valdavalt  oksüdaas -negatiivsed; 
5.  Kõik  fermenteerivad  glükoosi,  kuid  teiste   suhkrute   lõhustamises  on  erinevusi,  mis  võimaldab  neid 
samastada biokeemiliste reaktsioonide abil. 
 
Sugukonda  kuulub  vähemalt  26  perekonda  ja  rohkem  kui  100  bakteriliiki,  neist  meditsiinis  kõige 
olulisemad  on:   Salmonella ,   Shigella ,  Escherichia,   Proteus ,  Citrobacter,   Enterobacter ,  Serratia,  Klebsiella, 
Morganella, Yersinia, Edwardsiella, Providencia. 
Uroinfektsioonide  tekitajad  on 80-90% E. coli, Proteus, Klebsiella ja  Pseudomonas  sp. 
 
Uuritav materjal 
 
Uriini  on  võimalik  võtta  mitmel   erineval   meetodil:  keskjoauriin,  ööpäevauriin,  fraktsioneeritud  uriin, 
kateeteruriin, punktsiooniuriin, urostoomiuriin, tsüstoskoopia. 
•  Igal  nimetatud  meetodil  on  omad  eelised  ja  puudused.  Keskjoa  uriin  on  kõige  enam  kasutatav  uriini 
kogumise meetod.  
•  Uuringu kvaliteeti parandab see, kui enne plaanilist hommikust uriinianalüüsi võtmist  patsient  ei söö ega 
joo hilisõhtul. 
•  Uriini  kogumiseks  kasutatakse  steriilseid  spetsiaalseid  anumaid,  näiteks  Greiner  BIO-One 
vaakumsüsteem:   pesta hoolikalt  käed ja genitaalpiirkond  vee ja seebiga, kuivatada. Urineerida 20-30 
ml  uriini  WC-potti,  et  viia välja ureetra  esiossa  kogunenud  mikroobid,  seejärel topsi  vähemalt  50  ml. 
Suruda  uriinikatsuti  kaanes  oleva    avause  põhja.  Hoida  katsutit,  kuni  uriinivool  katsutisse  lõpeb. 
Eemaldada katsuti avausest, markeerida ja saata laborisse. NB! Uriin ei tohi seista toatemperatuuril 
üle kahe tunni. 
•  Keskjoauriini  kogumisel  mikrobioloogiliseks  uuringuks  peab  alati  arvestama,  et  see  võib 
kontamineeruda normaalse mikroflooraga. Diagnostiliseks kriteeriumiks loetakse ≥105 PMÜ/ml uriinis, 
kuid ka 103 PMÜ/ml on oluline teatud juhtudel: 
o  kui on tegemist tuntud uropatogeeniga – E. coli, Proteus spp., Pseudomonas spp 
o  kui on tugevad düsuurilised kaebused; 
o   kroonilise   püelonefriidi,  prostata  adenoomi,  laste  uroinfektsioonide  ja  püsikateetri  olemasolu 
korral. 
 
 
 
12
 
Samastamine 
 
URICULT TRIO.  Meetod põhineb kolme söötme üheaegsel  kasutamisel .  
Üks testplaadi külg on kaetud roheka CLED söötmega. Plaadi teisel küljel asetseb punakas MacConkey ja 
kollakas  E.  coli   sööde .  Viimane  sisaldab  sapisooli,  pärssides  seetõttu  grampositiivse   floora   kasvu.  E.  coli 
samastamine põhineb tema ß- glükuronidaasaktiivsusel, mistõttu mikroobipesad värvuvad pruuniks ning neid 
on kergem eristada.  
 
 
Tulemuste  hindamine.  Reeglina  hinnatakse   positiivseks   ≥  105  bakteri  esinemist   milliliitris   uriinis.  ≤104 
PMÜ/ml  on  negatiivne  ja  nende  väärtuste  vaheline  tulemus  on  piiripealne.  CLED  söötmel  kasvavad  kõik 
bakterid , MacConkey’l gramnegatiivsed ja E. coli söötmel kasvab E. coli pruunide pesadena. Hindamine 
toimub tabeli alusel. 
 
URIINIKÜLVI  KVANTITATIIVNE HINDAMINE GOULD’I MEETODIL. Meetodi põhimõte 
on  sama  mis  puhaskultuuri  isoleerimisel  joonkülvina  –  mida  suurem  mikroobide  hulk  milliliitris,  seda 
suurem  pesade  arv  söötmel.  Loetakse  pesade  arv  erinevates  sektorites.  Kui  kasutada  erinevaid  söötmeid 
(analoogia  Uricult’ile)  võib  määrata  ka  samas  uriinis  olevate  erinevate  mikroobide  (grampositiivsed, 
gramnegatiivsed jne.) hulk. Tulemuste hindamiseks on olemas spetsiaalne tabel.  
 
 
 
 
13
 
 
Tabel mikroobide hulga määramiseks 1 ml  vedelikus  Gouldi meetodil 
 
SEKTORIS KASVANUD PESADE ARV 
 
1.  sektor  
2. sektor 
3. sektor 
4. sektor 
Bakterite arv/ml 
1-6 
Puudub 
Puudub 
Puudub 
103 
8-20 
Puudub 
Puudub 
Puudub 
103 
21-30 
Puudub 
Puudub 
Puudub 
5 x 103 
31-60 
Puudub  
Puudub 
Puudub 
104 
70-80 
Puudub (1-5) 
Puudub 
Puudub 
5 x 104 
100-150 
5-10 
Puudub 
Puudub 
105 
Rohkem 
20-30 
Puudub (1-5) 
Puudub 
5 x 105 
Rohkem 
40-60 
Puudub (5-10) 
Puudub 
106 
Rohkem 
100-140 
 
Puudub 
5 x 106 
Rohkem 
Rohkem 
 
Puudub 
107 
 
Rohkem 
 
Üksikud 
5 x 107 
 
Rohkem 
 
Kuni 25 
108 
 
URISELECT 4. Meetod võimaldab määrata mikroobide üldarvu  uriinis ning eristada E.coli’t ,  Proteus 
mirabilis’t,  KESC grupi mikroobe (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), enterokokke, stafülokokke ja 
streptokokke. Näiteks moodustab E.coli kroomagaril roosat, Enterococcus spp.helesinist ja  Proteus pruuni 
värvi pesi.  
 
Praktiline töö 
 
Eelmises praktikumis tehtud külvide hindamine 
 
Ülesanne 1. Grampositiivse haigustekitaja samastamine (vt.eelmise praksi ül.3): 
 
UURITAVA MATERJALI NUMBER. ………….. 
• 
Pesa morfoloogia ja hemolüüs veriagaril 
• 
Pesa morfoloogia ja värv soola-manniitagaril 
• 
Puhaskultuuri morfoloogia Grami preparaadis 
• 
Katalaasireaktsioon 
 
14
 
• 
Lateksaglutinatsiooni test A-proteiini määramiseks stafülokokkidel 
• 
PYR test  streptokokkide eristamiseks 
• 
Isoleeritud  mikroorganism  oli:  
Ülesanne 2 . Hinnata ninakülvi tulemusi soola-manniitagari sektoris 
 
 
 
Ülesanne 3. Määrata bakterite hulk erinevates uriiniproovides. Kas tegemist on saastusega või tõelise uroin-
fektsiooniga? 
 
Uriin 1 
 
Uriin 2 
 
Uriin 3 
 
 
Enterobakterite põhjustatud sooleinfektsioonide diagnostika 
 
Ülesanne  4.  Erinevatest  rooja  proovidest  teha  külv  tampooniga  kolmele  selektiivsele  söötmele: 
MacConkey, Hektoen Enteric ja  XLD agarile. Tulemuste hindamine toimub järgmises praktikumis. 
 
 
 
 
 
 
15
 
3 
 
Enterobakterite nakkuste diagnostika 
sooleinfektsioonide näitel 
 
 
Üldiseloomustus 
 
Enterobacteriaceae  sugukonda  kuuluvatest  perekondadest  põhjustavad  sooleinfektsioone  kõige  sagedamini 
Salmonella, Shigella ja Escherichia. 
  
 Salmonella spp. 
Teada on ligi 2200 Salmonella serovarianti, mis omakorda jagunevad 6 (7) serogruppi.  
Põhjustavad: 
•  kõhutüüfust typhoid or enteric fever – Salmonella enterica serotüüp Typhi 
•  paratüüfust - S. ent.Paratyphi A,B,C; S.hirshfeldii 
•  salmonelloosi - S. ent. serotüüp Enteritidis, S.ent.serotüüp Cholerasuis 
•  võimalik on S. Typhi ja S.Paratyphi  asümptomaatiline  kolonisatsioon    
Kuna Salmonella lokaliseerub paljude loomade  seedekulglas , nakatuvad inimesed fekaaloraalsel teel toidu-
ainetega  (liha,  munad,  piimaproduktid),  mis  on  reostunud  loomse  väljaheitega  ja  seejärel  mitteküllaldaselt 
termiliselt töödeldud. 
 
Shigella spp. poolt põhjustatud haigusi kutsutakse shigelloosideks ehk düsenteeriaks. Sagedasemad tekitajad 
on: S. dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei 
Erinevalt  Salmonella’st  on  Shigella  reservuaariks  vaid  inimene,  haigestuvad  samuti  ainult  inimesed. 
Shigellad  võivad  toota  tsütotoksiini,  põhjustades  sellega  sooleepiteeli  kahjustusi,  haavandeid  ja 
mikroabstsesse. Düsenteeriale on iseloomulik kõhulahtisus, väljaheites on verd, lima ja mäda. 
 
Escherichia  coli  kuulub  soole  normaalsesse  mikrofloorasse,  kuid  teatud  tüved  võivad  põhjustada  erineva 
patogeneesiga soolenakkusi.  
•  Enterotoksigeenne  E.  coli  (ETEC)  toodab  enterotoksiini,  põhjustades  Na-ioonide  ja  vee  kaotust 
soolevalendikust, tekitades nn. reisijate diarröad (traveller’s diarrhea).  
•  Enteropatogeenne E. coli (EPEC) põhjustab endeemilist diarröad arenguriikides. Haigestuvad enamasti 
alla kuuekuused lapsed.  
•  Enteroagregatiivne  E.  coli  (EAEC)  moodustab  sooleepiteeli  pinnal  agregaate,  on  diarröa  põhjustaja 
arenguriikides. 
•  Enteroinvasiivne  E.  coli  (EIEC)  tungib  sooleepiteeli  rakkudesse,  põhjustades  düsenteeriataolist 
sündroomi.  
 
16
•  Enterohemorraagiline E. coli (EHEC) produtseerib Shiga-taolist toksiini, mis hävitab sooleepiteeli ja 
põhjustab  hemorraagilist  koliiti.  Vahel  jõuab  toksiin  ka  verre,  kandudes  neerudesse,  põhjustades 
hemolüütilis-ureemilist sündroomi (HUS). 
 
Teised  Enterobacteriaceae   sugukonna   liigid,  mis  samuti  kuuluvad   seedekulgla   mikrofloorasse  ja  võivad 
põhjustada  oportunistlikke  infektsioone,  on  Proteus  spp.,  Enterobacter  spp.,  Klebsiella  spp.,  Citrobacter 
spp. 
 
Lisaks enetrobakteritele võivad sooleinfektsioone tekitada veel:  
 
•  Pseudomonas  spp.  -  kuulub  aeroobsete  mittefermenteerivate  bakterite  hulka.  Tegemist  on 
nosokomiaalse ja/või oportunistliku patogeeniga (leidub sooles). 
Pseudomonas’t  on  leitud  pinnasest,  veest  ja  taimedelt,  ta  on  suuteline  kasvama  erinevates  keskkonna 
niššides: kraanikaussides, lillevees, puhastusvedelikes, ravimites ja isegi desinfitseeriva  iseloomuga  seepides.  
Infektsioone inimestel põhjustab juhul, kui koloniseerib langenud kaitsevõimega isikuid või satub organismi 
traumajärgselt.   
 
•  Vibrio cholerae -  on eriti ohtliku nakkushaiguse koolera  tekitaja . Morfoloogiliselt gramnegatiivne, 
komakujuline,  ühe  viburiga   bakter .  Tähtsamad  virulentsusfaktorid  on  neuraminidaas-  ja 
mutsinaasensüümid ning LT ja ST enterotoksiinid. 
 
•  Campylobacter  spp.  -  on  gramnegatiivne  kruvisarnane  oksüdaaspositiivne  ja  katalaaspositiivne 
bakter, võib põhjustada enteriiti. 
 
 
Uuritav materjal 
 
 
KÕHUTÜÜFUS .  
Uuritavateks materjalideks on veri, roe, duodenaalmahl, luuüdipunktaat ja vereseerum.   
•  Haigelt võetav uuritav materjal sõltub haiguse  staadiumist . See on tingitud haiguse patogeneesist: 
algul  tekib  nn.  tüfoidne  sepsis,  kui  haigusetekitaja  ringleb  veres,  haiguse  kliinilises  perioodis 
haigusetekitaja  verest  kaob,  kuid  sooleseinas  toimuvad  nekrootilised  muutused,  mistõttu 
tüüfusetekitaja satub massiliselt soolevalendikku ja sealt rooja. 
•  Roojas ei leita tekitajaid tavaliselt enne 3 nädala möödumist organismi sattumisest.  
•  Luuüdist ja lööbeelementidest võib tekitajaid leida isegi siis, kui neid mujal ei ole.  
 
 
 
SHIGELLOOS   e düsenteeria.  
•  Haigelt: roe võimalikult kiiresti pärast roojamist, eelistatult tampooniga võetud roe. Võimaluse korral 
teha  esmaskülv  vahetult  pärast  materjali  võtmist.  Uuritava  materjali  kiire  saatmisvõimaluse 
puudumisel  saadetakse  materjal laborisse segatult konservandiga. 
•  Mikroobikandjalt: roe, tampooniga võetud roe. 
•  Väliskeskkonnast: toiduained, piimaproduktid, juur- ja puuvili, joogivesi. 
 
Rooja kogumise üldised nõuded: 
•  võtta mäda, lima, verd sisaldavat materjali; 
•  vajadusel 
säilitatakse 
4°C 
juures 
•  mitte kontamineerida uriiniga; 
füsioloogilise  lahuse  ja   glütserooli   segus 
või  transportsöötmes; 
•  kogus on 1–2 grammi;  
•  tampooniga  võetud  materjal    asetatakse 
•  haigusetekitaja isoleerimise tõenäosust suu-
 
17
rendab  korduv  materjal,  kuid  mitte  samal 
kuivamise   vältimiseks  transportsöötmesse. 
päeval;  
 
 
 
 
Samastamine 
 
ALGMATERJALI  MIKROSKOOPIA  ei  ole  informatiivne,  kuna  tekitajate  morfoloogia  on  sarnane. 
Olulisem  on  haigusetekitaja  isoleerimine,  kasutades  selektiivseid  söötmeid  ning  seejärel  isoleeritud 
puhaskultuuri samastamine biokeemiliste omaduste alusel. 
 
ISOLEERIMINE  VEREST.  Kasutusel  on  kommertsiaalsed  verekülvi  süsteemid  (   Septi - Check ).  Veri 
külvatakse söötmesse vahekorras 1:10, söötmeid inkubeeritakse kuni 7 päeva. Verekülvi kasvu kontrollitakse 
Grami  järgi  värvitud  preparaadiga.  Juhul  kui  verest  leitakse  Gram-negatiivseid  baktereid,  tehakse 
hemokultuurist ümberkülvid otse selektiivsele söötmele. 
 
ISOLEERIMINE  ROOJAST.  Uuritav  roe  külvatakse  selektiivsetele  ja/või  diferentsiaal-diagnostilistele 
söötmetele.  Enamasti  on  tegemist  söötmetega,  mis  valikuliselt  soodustavad  Gram-negatiivsete  mikroobide 
kasvu,  pärssides  samal  ajal  Gram-positiivseid.  Diferentsiaal-diagnostiliste  söötmete  puhul  peaks  meeles 
pidama   üldreeglit,  et  soolepatogeensed  mikroobid  (Salmonella,  Shigella)  on  laktoosnegatiivsed,  mis  aitab 
neid eristada seedekulgla normaalsetest laktoospositiivsetest bakteritest.  
 
Mõnede Gram-negatiivsete bakterite pesade morfoloogia MacConkey söötmel, Hektoen Enteric agaril ja XLD söötmel. 
Liik 
MacConkey 
Hektoen Enteric 
XLD 
Citrobacter spp. 
Värvuseta / heleroosa 
Värvuseta 
Punane, kollane või värvitu 
Escherichia coli 
Tumeroosa-punane 
Kollane 
Kollane 
Klebsiella spp. 
Roosa ,  limane  
Kollane 
Kollane, limane 
Salmonella spp. 
Värvuseta, läbipaistev 
Roheline 
Punane musta keskosaga 
Shigella spp. 
Värvuseta, läbipaistev 
Roheline 
Kollane  
Serratia spp. 
Punakas pigment 
Värvuseta 
Punane 
Pseudomonas spp. 
Värvuseta, läbipaistev 
Rohekas  
Punane 
 
 
Enterobacteriaceae  ja  Pseudomonas ‘e  eristamine. 
 
 
OKSÜDAASI PRODUKTSIOON.  Tsütokroomi oksüdaas oksüdeerib õhuhapniku juuresolekul 
para-amino-dimetüülanaliini Taxo-N  diskis roosakaspunakaks värvaineks indofenooliks. 
Enterobacteriaceae on oksüdaasnegatiivne, Pseudomonas spp. aga oksüdaaspositiivne. 
 
 
PIGMENDI  PRODUKTSIOON.  Mitte  ükski  Enterobacteriaceae  sugukonna  esindaja  ei  tooda 
37°C  juures  pigmenti,  Pseudomonas  aeruginosa  produtseerib  rohekassinist  pigmenti  püotsüaniini  ning 
fluorestseerivat fluorestsiini.  
 
 
18
 
LÕHN.  Enamusel  Enterobacteriaceae liikidel on ebameeldiv lõhn, samas kui Pseudomonas lõhnab 
küllaltki talutavalt. 
 
 
 
 
SUHKRUTE  FERMENTATSIOON.  Enterobacteriaceae  liigid  on  kõik  võimelised  lõhustama 
glükoosi, Pseudomonas aga mitte. Biokeemiliste omaduste määramiseks kasutatakse Kliegleri söödet. 
 
Kliegleri  sööde  sisaldab  laktoosi  1%,  glükoosi  0.1%  ning  raudsulfaati  ja  Na2S2O3.  Viimase  abil 
toimub  H2S  produktsiooni  määramine.  Hindamiseks  jälgitakse  punase  (aluselise)  söötme  värvuse  muutust 
kollaseks  (happeliseks)  längpinnal  ja  katsuti  põhjas.  Kui  mikroob  lõhustab  ainult  glükoosi,  kuid  mitte 
laktoosi  (soolepatogeen),  muutub  sööde  kollaseks,  kuid  happe  vähesuse  tõttu  längpinna  juures  muutub 
reaktsioon  õhuhapniku  toimel  tagasi  aluseliseks  –  längpind  on  punane.  Laktoosi  lõhustamisel  muutub 
längpind  kollaseks. Must värvus  viitab  H2S produktsioonile, söötme purunemine gaasile (vt. tabel).  
 
Mikroob 
Längpind 
Katsuti põhi 
Gaas  
H2S 
E. coli 
Kol ane ( hape ) 
Kol ane (hape) 
Lõhki 
Must puudub 
Salmonel a 
Punane (alus) 
Kol ane (hape) 
Lõhki 
Must 
S. typhi 
Punane (alus) 
Kol ane (hape) 
Terve 
Must 
Shigel a 
Punane (alus) 
Kol ane (hape) 
Terve 
Must puudub 
Pseudomonas 
Punane (alus) 
Punane (alus) 
Terve 
Must puudub 
 
Lõplik  samastamine  toimub  kas  kommertsiaalse  Vitek  2  süsteemi  või  MALDI-TOF  abil  (vt.üldosa 
praktikum); tüpiseerimiseks saadetakse isolaadid  Eesti Tervisekaitse laboratooriumi.  
 
 
 
ENTEROPATOGEENSE E. coli VIRULENTSUSMARKERITE MÄÄRAMINE  
 
•  ETEC  –  määratakse  võime  toota  termostabiilset  (ST)  ja  termolabiilset  (LT)  enterotoksiini, 
kasutades  ELISA -t, lateksaglutinatsioonireaktsiooni või DNA teste 
•  EPEC  –  määratakse  O  ja  H  antigeenne  struktuur,  otsitakse  aglutinatsioonireaktsiooni  abil 
teadaolevaid enteropatogeenseid serogruppe – O55, O111:H2 jt., kasutades selleks vastavaid polü- ja 
monovalentseid seerumeid 
•  EIEC  –  invasioonivõime  määramiseks  HEp-2  ja   HeLa   rakukultuuridel,  O  ja  H  serotüpeerimine, 
ELISA 
•  EHEC  –  otsitakse  aglutinatsioonireaktsiooni  abil  teadaolevaid  enterohemorraagilisi,  verotoksiini 
produtseerivaid  serotüüpe  –  peamiselt  serotüüpi  O157:H7,  aga  ka  O26:H11,  O111.  NB!  Mitte  kõik 
ühesuguste  immunoloogiliste  markeritega  E. coli  serotüübid  ei  ole  suutelised  tootma  verotoksiini, 
järelikult  pole  nad  ka  haigusetekitajad;  verotoksiini  määratakse  koekultuuridel  tsütopaatilise  efekti 
alusel 
•  EAEC – määratakse adhesioonivõimet Hep-2 või HeLa koekultuuri rakkudel 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19
Praktiline töö 
Ülesanne 1. Vaadelda mikroskoobis soolepatogeenide morfoloogiat, värvituna Grami meetodil 
 
 
           
           
        
 
 
 
Ülesanne 2. Vaadelda eelmises praktikumis tehtud rooja külve MacConkey agarile, Hektoen-enteric agarile 
ja XLD söötmetele. Hinnata: 
 
Pesade arvukus erinevatel söötmetel (külvati ühest materjalist!) 
 
 
 
 
 
Mikroobipesade  morfoloogia  HEA,  XLD  ja  MacConkey  söötmetel.  Millised  pesad  võivad  kuuluda 
soolepatogeenidele? 
 
 
 
 
 
Mikroobide morfoloogia Grami järgi värvitud preparaadis. 
 
 
 
 
 
Ülesanne 3. Biokeemiliste omaduste uurimiseks teha ümberkülv gramnegatiivse mikroobi pesast Kliegleri, 
SIM, Simmonsi ja uurea söötmetesse.  
 
 
Ülesanne  4.   Loetleda   tähtsamad  gramnegatiivsetest  pulkbakteritest  tingitud  infektsioonide  raviks  kasu-
tatavad  antibiootikumid . 
 
 
 
 
 
 
20
                     
Bordetel a ja Corynebacterium’i 
nakkuste diagnostika              4 
 
Bordetel a spp. 
 
Üldiseloomustus 
 
Sellesse  perekonda  kuulub  3  mikroobiliiki,  mis  põhjustavad  inimesel   läkaköha   või  läkaköhale  sarnaseid 
infektsioone. 
Enne  vaktsineerimise  kasutuselevõtmist  oli  tegemist  epideemilise  haigusega,  mis  põhjustas   suuremaid  
epideemiaid  iga  2  kuni  5  aasta   möödudes .  Tegemist  on  väga  kontagioosse  (nakkava)  ägeda  hingamisteede 
nakkusega.  Viimasel  ajal  on  selgunud,  et  tegemist  pole  vaid  laste  nakkusega,  ka  noorukid  ja  täiskasvanud 
põevad  seda,  olles  ilmselt  haigusetekitaja  reservuaariks.   Nakkus   kandub   inimeselt   inimesele  valdavalt 
piisknakkusena,  aga  ka  kontamineeritud  esemete  vahendusel.  Haigus  kulgeb  staadiumidena:  katarraalse, 
paroksüsmaalse (konvulsiivse) ja rekonvalestsentsiperioodina. 
•  Bordetella  pertussis  põhjustab läkaköha 
•  Bordetella parapertussis 
•  Bordetella  bronchiseptica 
põhjustavad  paraläkaköha,  mis  kliiniliselt  avaldub  läkaköhataolise 
kergema vormina ja sellel puudub epidemioloogiline tähendus.  
Tekitajad on morfoloogiliselt  sarnased: 
* väikesed gramnegatiivsed  kokobakterid , värvuvad tihti bipolaarselt 
 * obligaatsed aeroobid 
* virulentsetel tüvedel on  kihn  
*B.pertussis ja B.parapertussis on liikumatud 
*B.bronchiseptica - liikuv 
* B.pertussis kasvab ainult valiksöötmel ja vajab kasvufaktoreid; 
 B.parapertussis ja B.bronchiseptica on söötmete suhtes vähenõudlikud. 
Mikrobioloogilised uuringud on vajalikud läkaköha  kliinilise  diagnoosi kinnitamiseks, atüüpiliste haigusvor-
mide kindlakstegemiseks, mikroobikandjate avastamiseks ja retrospektiivse diagnoosi kinnitamiseks. 
Läkaköha diagnoosi kinnitavad kas B. pertussis’e isoleerimine ninaneelu limast või B. pertussis’ele 
iseloomulik antikehade tekkimine vereseerumis. B. pertussis’e nina- neelu  limast isoleerimise all mõistetakse 
kas haigustekitaja väljakülvamist või tema DNA tuvastamist polümeraasahelreaktsiooni  
(PCR) abil.  
 
 
 
 
21
Uuritav materjal 
Sõltub  haiguse staadiumist. 
KATARRAALSES     STAADIUMIS   kogutakse  materjal    tampooniga    ninaneelust  või  aspireerides  ninaneelu 
lima. 
•  Haigustekitaja 
isoleerimiseks 
tuleb 
ninaneelust 
proovi 
võtmisel 
kasutada 
sünteetilisi 
kaltsiumalginaadist  või  polüestrist  Darconi  fiibertampoone,  vatist  tampoone  tuleks  võimaluse  korral 
vältida, sest need sisaldavad Bordetella’dele toksilisi rasvhappeid  
•  Ideaalsel juhul jäetakse tampoon umbes 10 sek ninaneelu 
•  Materjal tuleb  külvata  kohe selektiivsele söötmele või kasutada  transpordiks  Regani- Lowe ’i agarit 
•  Viimast tuleks hoida kuni proovi laborisse saatmiseni +40C juures 
•  Külvid transportida laborisse 4-6 tunni jooksul 
•  Külvi meetod ei sobi haiguse tuvastamiseks, kui haigus on kestnud enam kui kaks nädalat.  
KONVULSIIVSES  STAADIUMIS  võetakse  verd  seroloogiliseks  uurimiseks.  WHO  soovituste  kohaselt 
kasutada  ainult  paarisseerumeid.  NB!  CDC  aga  seroloogilisi   meetodeid   ei  tunnista,  sest  need  ei  ole 
standartiseeritud. 
Samastamine 
ALGMATERJALI  MIKROSKOOPILINE  UURIMINE.  Grami  meetodit  ei  saa  kasutada,  sest 
haigustekitaja  morfoloogia  on   mittespetsiifiline ,  segab  ka  nina-neelu   mikrofloora .  Selle  asemel  kasutatakse 
algmaterjali otsest (direktset) immunofluorestsentsmikroskoopiat (DFM). 
Meetodi tundlikkus ei ole kõrge, kuid  eeliseks  on kiirus, võimaldades saada suhteliselt varakult orienteeruva 
diagnoosi.  Teostamisel  valmistatakse  tampooniga  võetud  materjalist  2  äigepreparaati.  Ühte  töödeldakse 
Bordetella pertussis’e ja teist B. parapertussis’e fluorestseeriva seerumiga.  
 
HAIGUSTEKITAJA ISOLEERIMINE. Tampooniga võetud materjal külvatakse enamasti  süsiagarile, kuhu 
on lisatud 10% hobuseverd ja konkureeriva mikrofloora mahasurumiseks antibiootikumi tsefaleksiini (Regani-
Lowe’I  agar ).  Külviplaate inkubeeritakse aeroobses, suhteliselt niiskes keskkonnas 35-36°C juures 5 kuni 12 
päeva.  Pesad  on  väikesed  kuni  keskmised,  valkjashallid,  siledad,  meenutades  kaste-  või  elavhõbeda  tilku. 
Külvimeetodi sensitiivsus ei ületa  60%!  
Valitud ja märgitud pesadest tehakse kontrollpreparaadid ja värvitakse need Grami meetodil. Kui preparaadis 
on  näha  bordetelladele  iseloomulikke  väikesi  gramnegatiivseid  pulgakesi  (kokobakterid),  samastatakse 
nimetatud pesades kasvavad mikroobid kas biokeemiliste reaktsioonide või aglutinatsioonireaktsiooni abil.  
 
SEROLOOGILISED  REAKTSIOONID.  Läkaköha  uurimiseks  kasutatakse  peamiselt  ELISA-meetodit. 
Läkaköha  põdemise järel  tekivad   antikehad   B.perussis’e filamentoosse  hemaglutiniini,  perkatiini,  fimbriate 
ja  toksiini  (PT)  suhtes.  Ainult  PT  antikehad  on   spetsiifilised   B.pertussis’e  suhtes,  teised  võivad  anda 
ristreaktsioone teiste Bordetella perekonna liikmetega. IgG antikehad tekivad umbes 3 nädalat pärast haiguse 
algust, saavutavad maksimumi umbes 4-5 nädala jooksul ning langevad tavaliselt 1-2 aasta jooksul. 
WHO soovituste kohaselt tuleks läkaköha seroloogiliseks diagnoosimiseks kasutada ainult paaris-seerumeid. 
CDC seevastu aga ei tunnista seroloogilisi meetodeid läkaköha laboratoorse kinnitusena, sest  
need meetodid ei ole standarditud.  
 
PCR-TEST. Meetodi peamiseks eeliseks on kiirus ja kõrge tundlikkus. Enam kasutatud on IS481, läkaköha 
toksiini  (PT)  promootorpiirkonna  (ptxA-Pr)  ja  pertaktiini  geeni   praimer .  Proovi  võtmisel  PCRiks  tuleb 
kasutada  polüestertampooni,  mis  asetatakse  pärast  proovi  võtmist  kuiva  steriilsesse  proovinõusse  ja 
säilitatakse  kuni  laborisse  saatmiseni  külmkapis  +40C  juures.  Materjal  peaks  jõudma  laborisse  48  tunni 
jooksul. 
 
 
22
 
Corynebacterium spp. 
 
Üldiseloomustus 
Siia  kuulub  suur  grupp  grampositiivseid  liikumatuid  eosteta  pulkbaktereid.  Esinevad    sageli  inimese  ja 
loomade organismis ning taimedel.   
Eristatakse patogeenseid liike: 
•  Corynebacterium diphtheriae - põhjustab inimesel difteeriat 
•  C.ulcerans  - võib põhjustada difteeriat inimestel,  patogeenne  loomadele 
•  C.pseudotuberculosis - patogeenne loomadele 
Korüneformseid e “difteroide “, mis kuuluvad naha ja  limaskestade  mikrofloorasse: 
•  C.pseudodiphtheriticum, C.renale, C.xerosis, C.jeikeium  
C.diphtheriae on iseloomuliku kujuga kergelt kõverdunud pulkbakterid, moodustavad  volutiinteri  ja võivad 
olla  otsast    paksenenud,  meenutades  natuke  nuia  või  hantlit;  liikumatud,  katalaaspositiivsed, 
oksüdaasnegatiivsed, söötmete suhtes nõudlikud. 
 
Difteeria  on haigus, mida esineb eelkõige arengumaades, kuid sporaadiliselt ka arenenud riikides. 
Tekitajaks  on  toksigeenne  C.diphtheriae  tüvi  (faagikonversioon),    kuid    ka  atoksigeenne  võib  põhjustada 
kaebusi.  
Kliinilise  pildi    järgi  on  kõige   sagedasem      kurgu   difteeria.  Harvemini    esinevad    nina-,  silma-, 
suguelundite ja haavadifteeria. 
Uuritav materjal 
 
•  Materjal  võetakse  enne  või  vähemalt  2  tundi  pärast  sööki.  Näidustustest  olenemata  võetakse  kõikidel 
juhtudel lima ja kattu  kurgust  ning ninast.  
•  Harvaesineva lokalisatsiooniga nagu silma-, kõrva, haava- ja tupedifteeria korral võetakse materjali peale 
haiguskolde alati ka ninast ja kurgust. Mikroskoopilise uurimise vajadusel tuleb nimetatud kohtadest ma-
terjali  võtta  paralleelselt  kahe  tampooniga.  Võetud  materjal  saadetakse    laboratooriumi  transportsöötmes 
(Amies) 2–3 tunni jooksul.  
 
Samastamine 
HAIGUSTEKITAJA  ISOLEERIMINE.  Enamik  korünebakteritest  on  suutelised  kasvama  veriagaril  või 
šokolaadagaril. Difteeriakahtluse korral on siiski parem kasutada spetsiaalseid difteeria söötmeid, mis suruvad 
maha ka kõrvalmikrofloora: Hoyle’s telluriitagar, 5% SBA (sheep blood agar), Tinsdale sööde jt.  
Veriagarit    inkubeeritakse  5-10%  CO2  keskkonnas  35-370C  juures  16-48  t.  NB!  Kurgu   materjalis   võivad 
esineda β-hemolüütilised streptokokid. 
 
PESADE  MORFOLOOGIA  HINDAMINE.  Külve  kontrollitakse  16,  24  ja  48  t  möödumisel 
binokulaarmikroskoobiga. Kasvu järgi eristatakse C.diphtheriae  kolme biovarianti :  
C. diphtheriae  var.  gravis  –  suured  1.5-2.0  mm  ∅,  mustjashallid,  läbipaistmatud,  tuhmid, 
mittehemolüütilised pesad;  
C. diphtheriae  var.  mitis  -    suured  1.5-2.0  mm  ∅,  kumerad,   sileda   servaga,  mustjashallid,  kitsa  β-
hemolüüsi tsooniga pesad; 
C. diphtheriae  var.  intermedius  –  väikesed  0.5-1.0  mm  ∅,  mustjashalllid  ,  läikiva  pinnaga  kitsa  β-
hemolüüsi tsooniga pesad; 
 
23
PUHASKULTUURI  MIKROSKOOPILINE  UURIMINE.  Iseloomulikest  pesadest  tehakse  preparaat. 
Värvitakse Grami järgi.  
IDENTIFIKATSIOON  BIOKEEMILISE AKTIIVSUSE ALUSEL. Võib kasutada API Coryne paneeli, 
Vitek 2 (bioMerieux) süsteemi.  
 Katalaastest. NB! Kõik  potentsiaalselt  toksigeensed korünebakterid on katalaaspositiivsed. 
 Uurea lõhustamistest spetsiaalses söötmes (võimaluse korral esmakülvidest), võtab umbes 4 tundi aega ja aitab 
koos iseloomuliku pesade morfoloogiaga anda kiiresti esmase mikrobioloogilise diagnoosi.  
Difteeria tekitaja ei lõhusta uureat. 
TOKSIGEENSUSE  MÄÄRAMINE.  Ainult  need  C.  diphtheriae  tüved,  mis  toodavad  eksotoksiini, 
põhjustavad haigust. Isoleeritud tüve toksigeensuse  määramiseks on võimalik kasutada katseloomi (merisiga), 
koekultuuri või siis PCR otseselt tox geeni detekteerimiseks. Levinum on in vitro Elek’i test e  pretsipitat-
sioonireaktsioon geelis  (vt.õpik, I osa). Seerumagarile asetatakse  filterpaberi  riba (disk),  mis on immutatud 
difteeriavastase  antitoksilise   seerumi   e  antitoksiini  või  selleks  ette  nähtud  spetsiaalse  seerumpreparaadiga. 
Kahele  poole  filterpaberi  riba  külvatakse  vaheldumisi  C. diphtheriae  toksigeenne  tüvi  PW-8  (kontroll)  ja 
uuritavad  tüved.  Kontrolltüve  ja  toksigeensete  uuritavate  tüvede  poolt  produtseeritud  eksotoksiinid  ja  
antitoksiin difundeeruvad söötmesse, positiivse reaktsiooni puhul  tekib  valge pretsipitaadijoon. Hindamisel 
pidada  silmas,  et  uuritav  tüvi  loetakse  toksigeenseks,  kui  selle  pesa  ees  tekkinud  pretsipitaadijoon   otstes  
ühineb  kontrolltüve  vastava   joonega .  Peale  selle  võivad  lisaks  esineda  veel  pretsipitaadijooned 
difteeriatekitajate mitmesuguste teiste antigeenidega, mis aga otstes ristuvad eksotoksiini pretsipitaadijoonega.  
 
Praktiline töö 
 
Ülesanne 1. Hinnata eelmises praktikumis tehtud väikese kirju rea tulemusi ja määrata mikroobi liik 
 
Kliegleri sööde 
 
SIM  sööde 
 
Simmonsi sööde 
 
Uurea sööde 
 
Isoleeritud on:  
 
Ülesanne 2. Vaadelda ja kirjeldada B. pertussis’e kasvu Regani-Lowe’i   agaril 
 
 
 
 
 
 
Ülesanne 3. Vaadelda, joonistada  B. pertussis’e ja B. parapertussis’e morfoloogiat  
Grami meetodil värvitud preparaatides. 
 
 
Bordetella pertussis  
 
Bordetella parapertussis 
 
 
 
 
 
   
 
 
 
24
Ülesanne 4. Vaadelda C. diphtheriae kasvu söötmel, kirjeldada pesade morfoloogiat.   Tasse  mitte avada! 
 
 
 
 
 
Ülesanne  5.  Vaadelda,  joonistada  C. diphtheriae  ja  C. pseudodiphtheriticum’i  kultuuridest  valmistatud  ja 
Grami meetodil värvitud preparaate. 
 
 
Corynebacterium diphtheriae 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Corynebacterium pseudodiphtheriticum 
 
 
 
   
Ülesanne 6. Hinnata C. diphtheriae toksigeensust pretsipitatsioonireaktsiooni abil geelis.  
Joonistada ja kirjeldada. 
 
 
 
 
 
 
 
Ülesanne 7. Võtta eraldi tampoonidega nina- ja kurgulima.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 NB!  Di fteeria   korral   
võetakse  ninali  
ma  nina  
koopa  t  
agumises t 
 
 
 
 
 osast, k  
una difteeriatekitajad lokaliseeruvad koaanide piirkonnas ja 
 nina-neelu  tagaseinas.  Tampooni  suund  on  materjali  võtmisel 
 ülevalt  alla  ja  mediaalselt  lateraalsele,  s.t.              tampoon  liigub 
 mööda   ninakoopa   põhja  suunaga  ninasõõrmest  kõrvanibule. 
 Külvata tampooniga võetud materjal seerumagari ja šokolaadagari 
 sektorisse.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ülesanne 8. Nimetada olulisemad antibiootikumid, mida kasutatakse järgmiste haiguste ravimiseks. 
 
 
•Läkaköha 
 
 
 
 
 
 
 
•Difteeria 
 
 
 
 
 
Ülesanne 9. Millised aktiivse ja passiivse immuniseerimise preparaadid on kasutusel läkaköha ja difteeria 
profülaktikas,  ravis ? 
 
 
25
 
Mycobacterium spp. infektsioonide 
5
diagnostika 
 
   
 
 
Üldiseloomustus 
 
Mükobakterid  on pulgakujulised happe- ja leelisekindlad  mikroorganismid . Nende happekindlus on tingitud 
unikaalsest rakuseina ehitusest (lipiidide sisaldus kuni 40% kuivkaalust). Grami meetodil need tänu sellele ei 
värvu, traditsiooniliselt kasutusel  Ziehl-Neelseni meetod ning  fluorestseeruv värv auramiin. 
Olulisemad  patogeenid  on tuberkuloosi tekitajad   
•  Mycobacterium  tuberculosis 
mis kuuluvad nn. M. tuberculosis kompleksi  
•  M. bovis 
•  M. africanum  
Leepra  ehk pidalitõve põhjustaja  
•  M. leprae   
Potentsiaalselt patogeenseid mükobaktereid 
•  M. avium  kompleks  (MAC) 
•  M. xenopi  
•  M. kansasii 
•  M. malmoense  
Potentsiaalselt  patogeensed  mükobakterid on looduses laialdaselt levinud (pinnases, tolmus, jõgede 
ja  järvede  vees,  kanalisatsioonisüsteemis,  basseinides,  akvaariumides  jne.),  võivad    põhjustada 
mükobakterioosi  eriti immuunpuudulikkusega inimestel.Viimasel ajal on kogu maailmas tõusuteel 
MAC’i  esinemissagedus , põhjustades süsteemseid infektsioone eeskätt AIDS-ihaigetel.  
Enamik  mükobakterite  liike  on  kultiveeritavad.  Kasvavad  väga  aeglaselt  (3-8  nädalat)  ja  ainult  keerulise 
koostisega valiksöötmetel.  
Tuberkuloos   jagatakse  esmaseks ja teiseseks.  
Esmane  tuberkuloos  tekib  peale  tekitaja  inhalatsiooni  ja  protsess   piirdub   enamasti  perifeerse 
kopsukahjustusega.  Rakulise  immuunsuse  mõjul  formeerub  granuloom.  Mikroob  võib  taolises  esmakoldes 
hävineda, jääda ellu või dissemineeruda.  
Sekundaarne   infektsioon , mis  ongi  tegelikult  see  infektsioon,  mida  me   tunneme   klassikalise  tuberkuloosina, 
tähendab kas esmatuberkuloosi  kolde  reaktivatsiooni või siis uut  nakkust .  
Leepra on naha ja perifeersete närvide kahjustus, mis võib esineda tuberkuloidses ja lepromatoosses vormis. 
Neist viimane on halvaloomulisem. Haiguse  diagnoos  põhineb kliinilisel pildil ja mikrobioloogilisel leiul.  
 
 
26
 
 
Tuberkuloosi diagnostikas on kaks lähenemisteed: 
a) otsene e mükobakterite detekteerimisel uuritavast materjalist ja nende samastamisel põhinev  
b) kaudne e organismi  humoraalse  ja rakulise immuunvastuse hindamine. 
 
Tuberkuloosi 
epidemioloogilise 
situatsiooni 
järgi 
grupeeritakse 
riigid 
endeemilisteks 
ja 
mitteendeemilisteks. 
Mitteendeemiliste  riikide  jaoks  on  esmatähtis  kõrge  riski  rühmas  latentse  infektsiooni  kindlakstegemine 
algetapil,  puhangute  ärahoidmine  (olme-  ja  nosokomiaalse  leviku  kiire  avastamine)  ja  mükobakterioosiga 
patsientide avastamine. Kasutatavad testid: 
Rakulise immuniteedi määramine (naha testid) 
–  PPD (purified  protein  derivates) 
• 
Puuduseks on reaktiivsus teistele mükobakteritele ja  BCG-le 
–  INF-γ (Quatiferon- gamma  test) 
 
Tuberkuloosi  diagnoosimiseks  endeemilistes  riikides  kasutatakse   klassikalist   laboratoorset   algoritmi : 
mikroskoopia,  haigustekitaja  isoleerimine,  biokeemiliste  omaduste  määramine,  seroloogilised  reaktsioonid, 
ravimtundlikkuse  määramine,  molekulaarsed  meetodid.  Aktiivse  tuberkuloosi  olemasolu  kinnitab  bakterite 
isoleerimine rögast. Viimasel ajal on söötmetel isoleerimisele lisandunud moodsamad, DNA-l ja metabolismi 
määramisel (BACTEC) põhinevad meetodid. 
 
Uuritav materjal 
 
Mükobakterite suhtes on võimalik uurida kõiki kehavedelikke, eritisi ning  kudesid . 
Kopsutuberkuloosi  ja kopsude mükobakterioosi kahtlusel on uuritavaks materjaliks kõige sagedamini röga. 
  Proov  võetakse hommikul vähemalt kolmel järjestikusel päeval. Enne proovivõttu peab patsient mõned korrad 
loputama  suud  veega  ja  seejärel  köhima.  Materjali  kogus  on  vähemalt  3-8  ml.  Sülg  uuritavaks  materjaliks  ei 
kõlba! 
Rögaerituse 
puudumisel 
kasutatakse 
bronhiaspiraati. 
Fiiberbronhoskoobi 
abil 
tehakse 
BAL 
(bronhoalveolaar-lavaaž)  või  olulise  kopsuosa  selektiivne  loputamine  5-10  ml  füsioloogilise 
keedusoolalahusega. Materjali kogus 10-25 ml. 
 Maoloputusvedelik  on  uuritavaks  materjaliks  lastel,  kes  sageli  neelavad  röga  alla,  ja  täiskasvanutel  ,  kellel 
rögaeritus  puudub  ning  bronhoskoopiat  pole  võimalik  teha.  Maoloputust  tuleb  teha  2-3  erineval  päeval,  see 
tagab  suurema  tõenäosuse olemasolevate  mükobakterite  leiuks.  Materjali  kogus  –  kogu  kättesaadav  vedeliku 
hulk. 
Tuberkuloosse  pleuriidi,  sünoviidi    kahtlusel  -    pleuravedelik  (soovitavalt  50-200  ml),  sünoviaalvedelik    
( kogu kättesaadav vedeliku hulk). 
Tuberkuloosse meningiidi või  generaliseerunud  tuberkuloosi (mükobakterioosi) kahtlusel –  liikvor  (3-8 
ml, väiksemad  kogused  halvendavad diagnostilisi võimalusi), veeniveri (1-5 ml),  luuüdi . 
NB! Veenivere võtmine näidustatud AIDSi kahtlusega või AIDSi haigetel. 
Urogenitaaltrakti  tuberkuloosi  korral  on  uuritavaks  materjaliks  uriin,  menstruaalveri  ja   biopsia  
endomeetriumist. 
 
27
Uurimiseks  kasutatakse  veel  operatsioonil  võetud  koe-  ja  organitükikesi  ning  lümfisõlmi,  mitmesuguseid 
sekreete (ninast, kõrvast, tupest jt.). 
Kahtlusel sooletuberkuloosile, mükobakteriaalsele enteriidile AIDSi korral on uuritavaks materjaliks roe. 
 
 
Samastamine 
 
ALGMATERJALI MIKROSKOOPILINE UURIMINE. Rögast ja mädast valmistatakse tavaliselt äigepre-
paraadid,  hõõrudes  väikese  tükikese  uuritavat  materjali  kahe  esemeklaasi  vahel  laiali.  Väga  vähe 
tuberkuloositekitajaid  sisaldavad  materjalid  (liigese-  ja  seroosõõnte  punktaat,  ajuvedelik,  uriin)  tuleb  enne 
preparaadi  valmistamist  tihendada.  Selleks  kasutatakse  kõige  sagedamini  vedela  või  veeldatud 
(homogeniseeritud)  materjali  tsentrifuugimist.  Viskoossete  materjalide  (röga,  mäda)  veeldamiseks  kasutatakse 
tsüsteiini, sputolüsiini, proteolüütilisi ensüüme ning NaOH ja H2SO4 madala  kontsentratsiooniga  lahuseid. 
 
Preparaadid värvitakse fluorokroomidega (auramiin, rodamiin) fluorestsentsmikroskoobiga uurimiseks.  
 
NB!  Bakterioskoopiline  algmaterjali  hindamine  ei  anna  vastust  küsimusele,  kas  uuritavas  materjalis  on  M. 
tuberculosis kompleks või mõni atüüpilistest mükobakteritest, mis on keskkonnas laialt levinud.  
 
HAIGUSTEKITAJA ISOLEERIMINE. Kõrvalfloorat sisaldav materjal  tuleb eelnevalt homogeniseerida 2–
4% NaOH või 3–7,5% H2SO4 abil, mis surmavad  kõik mikroobid peale mükobakterite. Tehakse külv  kahele 
(glütserooli ja püruvaadi lisandiga) Löwenstein-Jenseni munasöötmele või BACTEC- MGIT  vedelsöötmesse 
ja  glütserooliga  L-J  munasöötmele.  Tahke  söötme  külve  kontrollitakse  kord  nädalas.  Vedelsöötme  tuubid 
sisestatakse MGIT-960 automaatsesse mükobakterite testimise aparaati, kus positiivse tulemuse korral süttib 
aparaadi  punane  märgutuli.  Negatiivseks  loetakse  tulemus  6  nädala  möödumisel.  Üldjuhul  on  positiivne 
tulemus  hinnatav  1-3  nädala  möödudes.  Verest  mükobakterite  isoleerimiseks  on  kasutusel  spetsiaalne 
BACTEC Myco/F-Lytic  vedelsööde, mille  testimine  toimub BACTEC 9050MB aparaadis.  
 
Mükobakterite  kasvatamiseks  kasutatavale  BACTEC  söötmele  on  lisatud  14C-ga    märgistatud  substraati. 
Mükobakterid  on  suutelised  seda  substraati  utiliseerima,  metabolismi  tulemuseks  on  radioaktiivse  14CO2  teke. 
14CO2 hulk ja tekkekiirus on proportsionaalne mükobakterite kasvuga. Meetodi eeliseks on tema tundlikkus ja 
kiirus, sest radiomeetriliselt on võimalik avastada väga väikest 14CO2  hulka, mistõttu ka mükobakterite kasv on 
sedastatav  varajases  staadiumis.  
 
PUHASKULTUURI  MIKROSKOOPIA.  Kasvanud  kolooniatest  või  kasvu  andnud  BACTEC 
vedelsöötmest valmistatakse preparaat, mis värvitakse Ziehl-Neelseni meetodil. 
 
IDENTIFIKATSIOON. Kasutatakse  HAIN  Lifescience GenoType meetodit, mis seisneb DNA  fragmentide  
mitmekordses  amplifitseerimises,  mis  võimaldab  nii  tuberkuloosi  kompleksi  kuuluvate  kui  ka  paljude 
oportunistlike mükobakterite diferentseerimist. Analüüs tehakse mükobakterite puhaskultuurist. GenoType 
testribadel  reastatud  erinevad  DNA   fragmendid   annavad  uuritava  DNA  fragmentidega  hübridiseerimisel 
värvimuutusreaktsiooni, mida näeme testribal vöötidena. Igale mükobakteri liigile on omane kindel teistest 
erinev vöötide kombinatsioon, mis võimaldab mükobaktereid identifitseerida liigi tasemini. 
Lisaks  on  molekulaarsetest   meetoditest   tuberkuloosi  diagnostikas  kasutusele  võetud  PCR,  millega  saab 
haigustekitajat sedastada ka vahetult uuritavas materjalis. 
RAVIMITUNDLIKKUSE  MÄÄRAMINE.  Tuberkuloosi  kemoteraapia  vältab  kuid,  seepärast  määratakse 
kõikidel haigetelt isoleeritud mükobakterite tüvedel ravimitundlikkus. Ravimresistentsuse määramisele põhirea 
ravimite  suhtes  kuuluvad  kõik  esmashaigetelt  puhaskultuurina  isoleeritud  ja  samastatud  M.tuberculosis’e 
tüved, samuti juba ravi saanud patsientidelt puhaskultuurina isoleeritud tüved, kui eelmisest määramisest on 
möödas  vähemalt  3  kuud.  Eesmärk  on  hinnata  senise  ravi  efektiivsust  ning  välja  selgitada  võimalikku 
ravimresistentsuse teket. 
Põhirea  antibiootikumidest  määratakse   resistentsus   streptomütsiini,  isoniasiidi,  rifampitsiini  ja 
etambutooli suhtes. Alates oktoobrist 2004  testitakse  tüvesid ka pürasiinamiidi suhtes. 
 
28
 Reservrea  ravimitest  määratakse  tundlikkus  amikatsiini,    kanamütsiini,    ofloksatsiini,  protioonamiidi, 
kapreomütsiini suhtes. 
Mycobacterium  tuberculosis’e    kompleksi  samastamine  koos  ravimitundlikkuse  määramisega 
isoniasiidi ja rifampitsiini suhtes- MTBDR plus test 
HAIN  Lifescience  GenoType,  kus  amplifitseeritakse  neid  geeni  piirkondi,  mis  vastutavad  kahe  põhilise 
tuberkuloosiravimi  -  isoniasiidi  ja  rifampitsiini  -  ravimtundlikkuse  eest.   Mutatsioonid   kindlates  geenides 
viitavad resistentsusele nimetatud ravimite suhtes. Testi saab teostada nii mükobakterite puhaskultuurist kui 
ka bakterioskoopial positiivse tulemuse andnud algmaterjalist.  
Mycobacterium  tuberculosis’e  kompleksi  samastamine  koos  ravimitundlikkuse  määramisega 
fluorokinoloonide, aminoglükosiidide/tsükliliste peptiidide ja etambutooli suhtes-MTBDRs/test 
HAIN  Lifescience  GenoType  meetod,  kus  amplifitseeritakse  neid  tuberkuloosibakteri  geeni  piirkondi,  mis 
vastutavad  mitmete  reservrea  ravimite  ning  etambutooli  ravimtundlikkuse  eest.  Ühtlasi  annab  test 
samastamise tulemuse M.tuberculosis kompleksi tasemel. 
Mycobacterium  tuberculosis’e  kompleksi  samastamine  GeneXpert  meetodil  koos  ravimtundlikkuse 
määramisega rifampitsiini suhtes 
Poolkvantitatiivne astmeline reaalaja PCR (GeneXpert MTB/RIF), mis võimaldab: 
•  M.tuberculosis’e kompleksi DNA tuvastamist rögast või selle kontsentreeritud sademest  
•  rpoB geenis rifampitsiini resitentsusega seotud mutatsioonide tuvastamist 
Meetod  on  ette  nähtud  ravimata  tuberkuloosikahtlusega  patsientidel.  GeneXpert  süsteem  ühendab  ja 
automatiseerib proovi töötluse, nukleiinhapete amplifikatsiooni ja märklaud-järjestuste tuvastamise. 
GAMMAINTERFEROON  (P-M  TUBERCULOSIS  γINF)  TEST.  Immuunvastusena  toodetud 
gammainterferooni  hulk  on  suurem  (positiivne)  patsiendi  varasema  kokkupuute  korral  M.tuberculosis’e 
peptiidsete  antigeenidega  ning  väiksem  (negatiivne),  kui  tuberkuloosibakteritega  varasem  kokkupuude  
puudub. 
Mükobakteriooside mikrobioloogiline diagnostika 
Atüüpiliste  mükobakterite  ühekordne  isoleerimine  ei  pruugi  omada  kliinilist  tähendust,  vaid  võib  olla 
juhuleid: asümptomaatiline kolonisatsioon, instrumendi (bronhoskoobi)  kontaminatsioon  jne.  
Mükobakterioosi diagnoosimisel on vajalik lähtuda järgmistest kriteeriumidest: 
•  Rögast  ja  uriinist  peab  sama  (mittetuberkuloosne)  mükobakter  olema  isoleeritud  vähemalt  kahest 
erineval ajal võetud materjalist (kolonisatsiooni ja/või juhuleiu välistamiseks). 
•  Verest,  koebiopsiast  ja  punktaatidest  loetakse  diagnoosi  kinnituseks  ka  mükobakteri  ühekordset 
isoleerimist.  
Leepra mikrobioloogiline diagnostika 
Uuritav materjal  
Ninalima, nina limaskesta, naha, leproomi tükikesed.  
Nahalõike  kaabe  võetakse nahamuutuste perifeersetest osadest, laugudelt ning veel 4-6 kohast, näiteks käte 
distaalsete  osade  väliskülgedelt,  reie   distaalse   osa  esiküljelt,  põlveõndlast  jne.  Peale  uuritava  piirkonna 
puhastamist  70%  etanooliga  pigistatakse  nahk  pöidla  ja  nimetissõrme  vahele  nii  tugevasti,  et  nahk  oleks 
veretu  kohas,  kust  proovi  võetakse.  Tehakse  skalpelliga  ca  8  mm-pikkune  ja  2  mm-sügavune  nahalõige 
(veritsust ei tohi olla). Seejärel kaabitakse skalpelli servaga lõiget risti, et saada skalpelli servale vedelikku 
 
29
ja  rakke.  Materjal  kantakse  5  x  7  mm  suurusele  alale  alusklaasil.    Preparaadil  lastakse  õhu  käes  kuivada. 
Skalpell  kuivatatakse  ja  puhastatakse  70%  alkoholiga  pärast  iga  proovi  võtmist.  Preparaadid  fikseeritakse 
kuumutamisega leegis ja saadetakse laborisse. 
Samastamine 
 
ALGMATERJALI  MIKROSKOOPILINE  UURIMINE.  Põhiline  meetod  leepra  mikrobioloogilisel 
diagnoosimisel,  sest  M. leprae  pole  kultiveeritav  söötmetel  ja  rakukultuurides.  Uuritavast  materjalist 
valmistatakse  algselt  äigepreparaat,  edaspidi  aga  histoloogiline  preparaat.  Need  värvitakse  Ziehl-Neelseni 
meetodil. Mikroskopeerimisel pööratakse erilist tähelepanu mikroobide hulgale preparaadis (vaateväljas). Sellel 
on  diferentsiaaldiagnostiline  tähtsus,  sest  tuberkuloosi  puhul  on  tekitajaid  äigepreparaadis  vähe,  leepra  korral 
enamasti palju. Ravi tulemuste hindamisel arvestatakse homogeensete ja teralise struktuuriga M. leprae rakkude 
vahekorda  preparaadis.  Viimaste  osakaal  suureneb  efektiivse  ravi  korral.  Äigepreparaadiga  võrreldes  on 
histoloogiliste  preparaatide  uurimine  informatiivsem,  sest  annab  ülevaate  ka  patohistoloogiliste  muutuste 
iseloomust, s.o. leproomi olemasolust. NB! Leepra tekitaja ei ole kultiveeritav kunstlikel söötmetel! 
 
BIOLOOGILINE  UURIMINE.  M. leprae  suhtes  on  vastuvõtlikum  Lõuna-Ameerikas  elunev  sarvkilbilise 
rüüga loom üheksavöölane (Dasypus novemcintus). Leeprahaigelt võetud  materjaliga  nakatatud üheksavöölased 
haigestuvad  18–35  kuu  möödumisel  generaliseerunud  leeprasse,  mis  sarnaneb  leepra  lepromatoosse  vormiga 
inimesel. Pikk katseaeg on seletatav M. leprae äärmiselt  aeglase  paljunemisega kudedes - pooldumisaeg on 20–
30 päeva. 
 
Praktiline töö 
 
 
Ülesanne  1.  Vaadelda  tuberkuloosihaige rögast  valmistatud ja fluorokroomiga  värvitud 
äigepreparaati; joonistada ja kirjeldada. 
 
Mycobacterium tuberculosis 
 
Ülesanne  2
 
.  Tutvuda  mükobakterite  kasvatamiseks  kõige  sagedamini  kasutatavate 
valiksöötmetega. 
 
 
 
 
Ülesanne 3.  Vaadelda mükobakterite puhaskultuuri morfoloogiat   Ziehl-Neelseni järgi värvitud preparaatides. 
Pöörata tähelepanu mikroobide paiknemisele ja happekindlusele (värvus).    
 
 
  
 
 
 
 
     
 
 
 
 
 
 
 
 
30
 
Ülesanne 4. Vaadelda, kirjeldada ja joonistada leeprahaige silma leproomi Ziehl-Neelseni 
järgi värvitud äigepreparaati. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mycobacterium leprae 
 
Ülesanne 5. Nimetada olulisemad antibiootikumid, mida kasutatakse  
 
 
Tuberkuloosi ja mükobakteriooside raviks 
 
 
 
 
Leepra raviks 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ülesanne  6.  Millised  aktiivse  ja  passiivse  immuniseerimise  preparaadid  on  kasutusel  bakteriaalsete 
piisknakkuste profülaktikas, ravis? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ülesanne 7. Hinnata eelmises praktikumis tehtud nina- ja kurgulima külve. Valmistada preparaat ,värvida 
Grami järgi, mikroskopeerida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31
Anaeroobsete infektsioonide 
6 
mikrobioloogiline diagnostika 
 
 
Üldiseloomustus 
 
Kliinilisi infektsioone põhjustab üle 30 anaeroobsete mikroobide perekonna ja  >200 erineva liigi. 
Anaeroobide 
klassifikatsioon  
muutub 
pidevalt, 
vastavalt 
uute 
tüpiseerimismeetodite 
kasutuselevõtule. 
Anaeroobset infektsiooni kahtlustatakse si s,  kui 
•  esinevad ebameeldiva lõhnaga eritised;  
•  esineb kudede nekroos;  
•  esinevad abstsessid; 
•   kahjustatud kudedes on täheldatav gaasi teke; 
•  infektsioon ei  allu  ravile  ainult aeroobidele toimivate antibiootikumidega;  
•  infektsiooni  tekkekoht  asub  normaalselt  anaeroobidega  koloniseeritud  limaskestade 
lähedal  
Anaeroobide poolt põhjustatud  infektsioonid  võib jaotada 
1.
1   Endogeenseteks    -  mikrofloorast  pärinevad    mikroobid  satuvad  limaskestadelt  keha 
steriilsetesse piirkondadesse 
2.
2   Eksogeenseteks  -  väljastpoolt  organismi  sattunud  anaeroobsete  tekitajate  poolt 
põhjustatud  nakkused  
3.
3   Spetsi filisteks  -  kindla  kliinilise   pildiga   nakkushaigused:   gaasgangreen ,  teetanus, 
botulism ,  pseudomembranoosne   koliit . Tekitajateks  on  gram-positiivsed eostega 
klostriidid 
4.
4   Mittespetsi filisteks  -  ilma  kindla  kliinilise  pildita  erineva  lokalisatsiooniga  protsessid: 
mitmesugused  kõhukoopa,  kopsu  ja  aju  abstsessid  jne.  Reeglina  polümikroobse 
etioloogiaga.  
Uuritava materjali valik 
 Sõltub haigusprotsessi iseloomust ja lokalisatsioonist. Sobivateks  materjalideks on haavaeritis, 
punktaadid, koetükid normaalselt steriilsetest organitest, veri.  
Analüüse,  mis  on  võetud  normaalse   anaeroobse   mikroflooraga  koloniseeritud  piirkondadest 
(röga, ninalima, tupesekreet, roe), uuritakse  kvantitatiivsete  meetoditega. 
 
 
32
Materjali võtmine 
 Haavaeritis: haava pind puhastada steriilse füsioloogilise lahusega, eemaldada nekrotiseerunud 
kude ,aspireerida süstlasse. Kui nimetatud materjali pole võimalik saada, võtta proov tampooniga 
haavast  võimalikult  sügavalt.  Abstsessid,  punktaadid:  punkteerida,  aspireerida    materjal 
süstlasse. Kui abstsessi punkteerimisel on mädaeritus vähene, süstida sinna steriilset füsioloogilist 
lahust  ning  aspireerida  see  tagasi  süstlasse.    Koetükid:  panna  steriilsete  pintsettidega 
transportsöötmesse.  
Tampooniga  võetud  materjalist  on  anaeroobide  isoleerimise  tõenäosus  väiksem  materjali 
vähesuse ja aeratsiooni  tõttu. 
MATERJALI  SAATMINE.  Suuremad  kogused  (>  2  ml)  võib  saata    kummikorgiga  katsutis,  kui 
tagatakse  kiire  transport  laborisse  (3’suunas.  Seejuures 
on praimerite 3’ otsad suunatud üksteise poole. (C) 
Termostabiiline 
DNA 
polümeraas  
alustab 
komplementaarse ahela sünteesi praimeri 3’ otsast. 
DNA   pikenemine   tekitab  uue  lookuse,  kuhu  saab 
seostuda  praimer.  Tsükli  lõppedes  on  tekkinud 
kahest  originaalist  kaks  uut  DNA   koopiat .  (D) 
Teise  tsükli  ajal  seostuvad  kõik  4  peale 
denaturatsiooni   tekkinud  DNA   ahelat   praimeriga, 
algab  uus  DNA  sünteesi  etapp.  Kaheksast   ahelast  
on  kaks  pikkusega,  mille  määrab  ära  praimerite 
vaheline  kaugus  –  „lühike“   produkt .  Järgmistes 
ts  üklites  toimub  selle   produkti   eksponentsiaalne 
 
suurenemine. 
 
66
 
 
PCR  meetodi variandid 
 
Multipleks  PCR korral osaleb rohkem kui üks praimerite paar. Ühte reaktsiooni võib panna 
praimerid, mis on spetsiifilised erinevatele mikroorganismidele.  
 
Nested  PCR  on  sisuliselt  kaks  järjestikust  PCR  reaktsiooni,  kus  teine  PCR  tehakse  uue 
praimeripaariga esimese PCR produkti peal. Esimese reaktsiooniga saadakse amplikon sihtmärk-
DNA-st.  Seda  amplikoni  kasutatakse  sihtmärgina  teises  reaktsioonis,  kusjuures  kasutatakse 
praimereid, mis asetsevad esimesest praimeri paarist seespool. Teise reaktsiooni käigus saadakse 
lühemaid  nukleotiidahelaid. Nested PCR eeliseks on väga suur sensitiivsus ja spetsiifilisus. Samas 
on  reaktsioon  väga  tundlik  saastumisele  varasema  PCR  produktiga,  mistõttu  tekivad  kergesti 
vale-positiivsed tulemused. 
 
Arbitrary  primed  PCR  (RAPD  PCR)  puhul  kasutatakse  lühikesi  praimereid  (kuni  10 
nukleotiidi),  kusjuures  nende  järjestus  valitakse  juhuslikult.  Tulemuseks  on  erineva  pikkusega 
DNA lõikude teke. Sarnastel mikroorganismidel on samad praimerite seostumise kohad. 
 
RT-PCR ( reverse  transcription PCR) unikaalseks etapiks on ensüümi pöördtranskriptaasi 
kasutamine. Pöördtanskriptaas sünteesib uuritava RNA alusel komplementaarse DNA ahela. 
Peale DNA ahela tekkimist toimub reaktsioon edasi juba nagu klassikaline PCR reaktsioon. 
RFLP (restriction  fragment  polymorphism)  Kombineeritud  meetod: PCR,  restriktsioon  ja 
hübridisatsioon. 
 
Joonis 
3. 
RFLP 
Southern  
blot 
M. 
tuberculosis’e  DNA-st  kasutades  IS6110 
sondi. 
Tekitaja 
kromosomaalse 
DNA 
restriktsiooniks 
on 
kasutatud 
restriktsiooniensüümi PvuII.  
Kui  restriktsioonimustrid  erinevad,  ei  ole 
tekitajad  epidemioloogiliselt  seotud.  Antud 
näite  puhul  on  kasutatud  kahte  meetodit  – 
restriktsiooni  (REA)  ja  seejärel  tekkinud 
fragmentide sedastamist hübridisatsiooniga.  
   
 
Nuklei nhapete  sekveneerimine  ja ensümaatiline restriktsioon 
SEKVENEERIMINE  on  meetod,  mille  puhul  määratakse  nukleiinhappe  täpne  nukleotiidne 
järjestus. Sekveneeritud mikroorganismi nukleiinhappe lõigu järgi saab: 
(1)  avastada ja klassifitseerida seni tundmatuid  mikroorganisme ; 
(2)  identifitseerida juba tuntud mikroorganisme ja nende alavariante;  
(3)  leida mutatsioone ja hinnata nende seost fenotüübiliste tunnustega;  
(4)  hinnata erinevate mikroorganismide tüvede omavahelist seotust. 
 
NUKLEIINHAPETE ENSÜMAATILINE RESTRIKTSIOON pole nii täpne meetod kui sekveneerimine. 
Samas on restriktsioonanalüüs oluliselt odavam ja kiiremini teostatav. 
 
DNA  ensümaatiliseks  lõikamiseks  kasutatakse  endonukleaase  e.  restriktsiooniensüüme. 
Iga   ensüüm   tunneb  ära  kindla  nukleotiidse  järjestuse,  mille  pikkus  on  tavaliselt  4  kuni  8 
 
67
nukleotiidi.  See  on  restriktsioonikoht,  kus  toimub  DNA  ahela  lõikamine.  Tekkivate  lõikude 
pikkus  ja  arv  sõltub  eeskätt  lõigatava  DNA  pikkusest  ja  ensüümi  tüübist.  Näiteks 
ribotüpeerimise  korral  teostatakse  bakteri  kromosomaalse  DNA  restriktsioon,  millele  järgneb 
elektroforees ja  Southern’  hübridisatsioon.  Hübridisatsiooniks  kasutatakse  sonde,  mis  seostuvad 
ribosoome kodeerivate geenidega.  
Restriktsioonile  järgneb  elektroforees  agaroosgeelis,  mis  võimaldab  tekkinud  DNA  fragmentide 
eraldamise nende  suurusest  lähtudes.  
PFGE  –  PULSED  FIELD  GEL  ELECTROPHORESIS.  Pulss-välja  geelelektroforees  on 
molekulaarsete  tüpiseerimismeetodite  standardiks. Terviklikest  bakterirakkudest  valmistakse  nn. 
agarpunnid.  Seejärel  tehakse  bakteri  DNA-le  restriktsioon.  Elektroforees  toimub  pulseeriva 
elektrivälja tingimustes. PFGE võimaldab lahutada väga suure molekulmassiga DNA fragmente 
vahemikus 10 kb kuni 800 kb. 
 
Joonis  4.  PFGE  restriktsioonimustrid  S. 
aureus 
puhangu 
korral 
haiglas. 
Stafülokoki  tüvede   lõikamisel   restrikt-
siooniensüümiga  SmaI  tulemusena  tekib 
terve 
rida 
suuri 
fragmente. 
Nagu 
elektroforeesi 
tulemustest 
näha, 
põhjustas  enamusel  patisentidel  haiguse 
üks ja sama tüvi. Antud tulemuste alusel 
saab  väita,  et  tegemist  on  hospitaalse 
nakkuse   puhanguga,  kus  edasi  kandub 
üks mikroobitüvi. 
    
 
Molekulaarsete meetodite rakenduslikud aspektid 
 
Molekulaarsete diagnostikameetodite rakendusalad on sarnased klassikalistele: 
(1)  haigustekitajate sedastamine uuritavas materjalis,  
(2)  puhaskultuurina isoleeritud mikroorganismide samastamine;  
(3)  mikroorganismide täpsem iseloomustamine mingi omaduse (geeni) tasemel – 
ravimiresistentsus, toksiin,  virulentsus , tüpiseerimine jne.  
 
Haigustekitajate sedastamine uuritavas materjalis 
 
Molekulaarsed meetodid on kõrge spetsiifilisusega.  
•  Konkreetne meetod on vaid ühe või kahe võimaliku  patogeeni  leidmiseks. 
Segainfektsiooni korral jäävad teised patogeenid diagnoosimata. Seetõttu ei välista negatiivne 
molekulaarne  test ühe kindla patogeeni tuvastamiseks veel teiste mikroorganismide olemasolu. 
•  Hübridisatsioonireaktsiooni puuduseks võib osutuda mittepiisav sensitiivsus. Uuritava 
DNA hulk võib olla ebapiisav või materjal  sisaldada  nn. „inhibiitoreid“, mis  pärsivad  nii 
hübridisatsiooni kui ka PCR reaktsiooni.                                                                                                    
 
 
68
PCR reaktsiooni eeliseid: 
• 
võimalik on leida mittekultiveeritavaid mikroorganisme (B  hepatiit , Whippele tõve tekitaja 
jne.); 
• 
aeglaselt kasvavate bakterite sedastamise kiirus tõuseb (mükobakterid, teatud seened); 
• 
võimalik on leida seni tundmatuid baktereid, kasutades universaalseid praimereid, mis 
seostuvad kõikidele mikroobidele omaste konservatiivsete DNA piirkondadega; 
• 
võimalus määrata patogeenide hulka (kvantitatiivne PCR), mis lubab teha järeldusi haiguse 
prognoosi ja ravi efektiivsuse kohta, eriti tähtis HIV ravis. 
 
Molekulaarseid meetodeid kasutatakse, kui: 
•  Haigust põhjustab üks või kaks tuntud patogeeni (Chalmydia trachomatis, Neisseria 
gonorrhoeae  – sagedased suguhaiguste põhjustajad). 
•  Puudub vajadus haigustekitaja täpsemaks iseloomustamiseks, näiteks pole vaja määrata 
isoleeritud haigustekitaja ravimitundlikkust ( viirused ). 
•  Puuduvad teised reaalsed diagnostika meetodid või nad on selgelt ebapiisavad (mitmed 
bakterid,  parasiidid , viirused ja seened). 
•  Olemas on diagnostilised meetodid, kuid need nõuavad aega (Mycobacterium spp.).  
•  Vaja on määrata patogeeni hulka, kuna see mõjutab ravi (HIV –  virus   load ). 
NB!  PCR  reaktsioon  ei  võimalda  teha  vahet elusa ja surnud  raku  vahel,  seetõttu  ei sobi  näiteks 
ravijärgses  kontrollis .  
  
Mikroorganismide täpsem iseloomustamine mingi omaduse (geeni) tasemel 
 
ANTIBIOOTIKUMRESISTENTSUSE MÄÄRAMINE. Ravimiresistentsus on determineeritud geenide 
poolt.  
MOLEKULAARNE TÜPISEERIMINE - TÜVEDEVAHELISE SEOSE MÄÄRAMINE. Üks olulistest 
nakkushaiguste leviku kontrolli meetmetest on nende reservuaari ja levikuteede määramine. 
Selleks on sageli vaja määrata tüvedevaheline sarnasus.  
Kui tegemist on haiguse puhanguga, siis on kõik haigustekitajad pärit ühest mikroorganismi 
rakust (klonaalsus). Seda juhul, kui klassikalise mõiste “puhang” all mõista ajaliselt ja ruumiliselt 
seotud samalaadsete haigusjuhtude kogumit.  
 
 
Praktiline töö 
 
ÜLESANNE  1.  Korduvaid  uroinfektsioone  põhjustavate  E.  coli  bakterite  iseloomustamine 
RAPD-PCR meetodil. 
 
Igale lauale on pandud  Petri  tass  E. coli puhaskultuuriga.  
Märkige alljärgnevalt Teie poolt  kasutatava  E. coli identifikatsiooninumber 
 
E. coli - .................................................................... 
 
 
 
 
69
I RAPD-PCR REAKTSIOONI ETAPP – DNA ERALDAMINE  
 PCR  reaktsiooniks  on  vaja  DNA  vabastada  bakerirakust.  See  kehtib  nii  puhaskultuuri  kui 
vahetult  kliinilise  materjali  korral.  Üks  lihtsamaid  DNA  vabastamise  meetodeid  on  bakterite 
termiline   töötlemine.  Kuumuse  mõjul  bakteri  sein  puruneb  ja  DNA  vabaneb  ümbritsevasse 
keskkonda. 
 
1)  Valmistada  kuumutamiseks  bakterite   suspensioon   1,5  ml  Eppendorfi  katsutis.  Selleks 
pipeteerida  automaatpipetiga  Eppendorfi  katsutisse  10  µl  steriilset  destilleeritud  vett.  Lisada 
steriilse pulgaga  Petri tassilt 1 koloonia, segada vorteksil kuni kaovad kõik nähtavad tükid. 
 
2)  Mikroobisuspensiooni   kuumutamine   DNA  vabastamiseks.    Asetada  valmistatud  bakterite 
suspensioon PCR masinasse, kuumutada suspensioone  950 C juures  10 min jooksul (spetsiaalne 
programm).  
 
II RAPD-PCR REAKTSIOONI ETAPP – VAHETU PCR REAKTSIOONI  TEOSTAMINE  
 
3)    PCR  segu  valmistamine.  PCR  reaktsiooni  toimumiseks  on  vajalikud  järgmised 
komponendid: sihtmärk DNA (bakterilt), spetsiifilised praimerid , Taq-polümeraas,  nukleotiidid , 
puhvrid  ja soolad. 
Ready-To-GoTM PCR Beads on kommertsiaalne kit (Amersham Pharmacia Biotech), mille puhul 
on  tegemist    0,2  ml  PCR  katsutitega,  mis  sisaldavad  lõppreaktsiooni  mahu  tingimustes  (25  µl) 
alljärgnevaid komponente: 
•  ~1,5 U Taq-DNA polümeraasi; 
•  10 mM Tris-HCL (pH 9,0); 
•  50 mM KCL; 
•  1,5 mM  MgCl2 ; 
•  200 µM  igat  dNTP; 
 
Töö käik. 
1.  Lisa katsutisse, mis sisaldab PCR kuulikest, reagendid alljärgnevas  järjestuses : 
1.1.  2 µl praimerit ERIC1 R (5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’); 
1.2.  2 µl praimerit ERIC1 F (5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’);  
1.3.  10 µl  kuumutatud  bakterite suspensiooni; 
1.4.  Lisa steriilset destilleeritud vett kuni lõppmahuni 25 µl. 
2.  Sulge katsutid  korgiga  ja  märgista   
3.  Sega  katsutite  sisu  vortexil  tagamaks  PCR  kuulikeste  sulamist.  Vajadusel  võib  kasutada 
steriilset pipetti. PCR  kuulike  peab olema täielikult sulanud! 
 
4.  PCR  reaktsiooni  teostamine  termotsükleris.  Kasutada  on  kas  Eppendorf  Mastercycler® 
gradient või Mastercycler. PCR reaktsiooni etapid on järgmised: 
1.    denaturatsioon  94ºC juures 5 minutit  – tagab DNA  ahelate  täieliku denaturatsiooni; 
2.  amplifitseerimine  40 tsüklit järgmise režiimiga: 
•  1 minut 94ºC; 
•  1 minut 50ºC; 
•  1 minut 72ºC  
 
 
70
 
Elektroforees. 
10 
Viroloogiline diagnostika 
 
 
 
Mitmed DNA/RNA määramisel põhinevad meetodid (ensümaatiline restriktsioon, PCR) vajavad 
elektroforeesi. 
Elektroforees 
DNA  ja  RNA  on  negatiivse  laenguga  ja  seetõttu  liiguvad  elektriväljas  negatiivse  elektroodi 
katoodi  poolt  positiivse  elektroodi  anoodi  suunas.  Nukleiinhapete  elektroforeesil  lahutatakse 
erineva  suurusega  DNA  fragmentide  segu  vastavalt  fragmentide  suurustele  ja  võrreldakse  neid 
mingi  standardiga  e.  markeriga.  Elektroforeesil  liiguvad  nukleiinhapped  elektrivälja  mõjul 
spetsiaalses keskkonnas geelis.  
Kaks tüüpilist foreesikeskkonda on:  
 
1.  Polüakrüülamiid 
2.   Agaroos  
 
Polüakrüülamiid  on  sünteetiline   polümeer ,  mis  moodustab   poorse   struktuuriga  erineva 
läbimõõduga  tunnelite  labürindi.  Kasutatakse  lühikeste  DNA/RNA  fragmentide  (5-500  bp) 
lahutamiseks. Polüakrüülamiidgeel elektroforees võib olla:  
•  Vertikaalne ühedimensiooniline 
•  Vertikaalne kahedimensiooniline 
•  Horisontaalne 
 
Agaroos  on  lineaarne  polümeer,  mis  koosneb  D-  ja  L-galaktoosi  jääkidest.  Agaroosi   ahelad  
moodustavad  heeliksikujulised  fiibrid,  mis  omakorda  agregeeruvad  20-30  nm  struktuurideks. 
Agaroosi  geelistumisel  moodustub  3- dimensiooniline   kanalite  (pooride)  võrgustik,  millede 
diameeter ulatub 50-200 nm.  
Agaroosgeeli  on  võimalik  teha  erineva  suuruse  ja  poorsusega  sõltuvalt  DNA  fragmentide 
suurusest, mida kavatsetakse lahutada.  
Agaroosforees on tehniliselt lihtsam ja kiiremini läbiviidav, aga agaroosi lahutuvus on väiksem 
kui  polüakrüülamiidil.  Seega  kui  foreesil  peab  eristama  väikeste  suuruste  vahega  fragmente 
kasutatakse polüakrüülamiidforeesi. 
Agaroos-geelelektroforees võib olla kas 
•  horisontaalne või 
•  vertikaalne 
DNA  liikumise  kiirus  väheneb  vastavalt  fragmentide  pikenemisele,  sõltudes  voolutugevusest. 
Mida  suuremad  on  geeli   poorid ,  seda  suuremaid  DNA  fragmente  saab  lahutada.  Seega,  mida 
madalam on kasutatava agaroosi % (nt. 0,1-0,2% v/v agaroosi), seda suuremad on geelis olevad 
 
71
poorid  ja  seda  suuremaid  fragmente  saab  lahutada.  Kuid  need  geelid  on  väga  haprad  ja 
elektroforees toimub aeglaselt (mitu päeva). 
 
DNA li kumine agaroosgeelis 
 
DNA   MOLEKULMASS .  Kaheahelalise  DNA  molekulid  liiguvad  läbi  geeli  kiirusega,  mis  on 
pöördvõrdeline  aluspaaride  arvu  logaritmväärtusega,  s.t.  suuremad  molekulid  liiguvad 
aeglasemalt kui väiksemad molekulid. 
AGAROOSI  KONTSENTRATSIOON.  Antud  konstantse  suurusega  lineaarne  DNA  fragment 
liigub erineva agaroosi kontsentratsiooniga geelides erinevalt (vt. tabel)  
 
Agaroosi % 
DNA fragmentide pikkus bp 
0,5 % 
1000 – 30000 
0,7 % 
800 – 12000 
1,0 % 
500 – 10000 
1,2 % 
400 – 7000 
1,4 % 
200 – 4000 
2,0 % 
50 - 2000 
 
DNA   KONFORMATSIOON   (KUJU).  DNA  superhelikaalne  rõngas  ja  lineaarne  vorm  liiguvad 
agaroosgeelis  erineva  kiirusega.  Nende  vormide  suhteline  liikuvus  sõltub  esmajärjekorras 
agaroosi tüübist ja kontsentratsioonist. 
VOOLUPINGE.  Madala  voolupinge  juures  on  lineaarse  DNA  fragmentide  liikumise  kiirus 
proportsionaalne  pingega.  Kui  elektrivälja  tugevus  tõuseb,  hakkavad  pikad  fragmendid  liikuma 
erineva  kiirusega.  Seega  pinge  tõustes  väheneb  agaroosgeeli   lahutusvõime .  Et  saavutada  >2kb 
DNA fragmentide maksimaalne lahutuvus, tuleks geeli jooksutada tingimuses, kus oleks 5-8V/cm 
kohta.  
AGAROOSI TÜÜP. Agaroosid jagatakse:  
•  standardagaroos  
•  madala sulamistemperatuuriga agaroos (low melting agarose) 
•  vahepealse sulamis-geelistumistemperatuuriga agaroosid 
Igas grupis on erinevaid agaroositüüpe, mida kasutatakse vaid teatud juhtudel.  
ELEKTROFOREESI   PUHVER .  DNA  liikumist  mõjutavad  elektroforeesipuhvri  koostis  ja 
ioontugevus.  Ioonide  puudumisel  (kui  foreesipuhvri  asemel  oleks  vesi)  on  elektrijuhtivus 
minimaalne ja DNA migreerub väga aeglaselt või üldse mitte. Väga kõrge ioonse jõuga puhvris 
(nt. 10× foreesipuhver) on elektriline  juhtivus  väga kõrge ja eraldub palju soojust isegi keskmistel 
pingetel. Selle tulemusena võib  geel  sulada ja DNA denatureeruda. 
 
Elektroforeesipuhvrid  tehakse  tavaliselt  kontsentreerituna  ning  neid  hoitakse 
toatemperatuuril.  TAE  (tris-atsetaat)  puhver  on  neist  kõige  väiksema  puhverdusvõimega  ning 
„väsib“  pikaajalisel  foreesil.  Sel  juhul  muutuvad  geeli  anoodsed  komponendid  („-„  laenguga) 
happelisteks ja broomfenüülsinine, mis liigub anoodi suunas, muutub sinakaslillast kollaseks.  
See muutus algab pH 4.6 juures ja 1õpeb pH 3.0 juures  
 
TBE  (tris-boraat)    on  veidi  kallim,  kuid  suurema  puhverdusvõimega.  Kaheahelalise 
lineaarse  DNA  fragmendid  liiguvad  umbes  10%  kiiremini  TAE-s  kui  TBE-s.  Pikkade  DNA 
fragmentide  jaoks  on  TAE  lahutusvõime  veidi  parem  kui  TBE-l  ja  lühemaid  fragmente  lahutab 
TAE halvemini kui TBE.  
 
72
GEL-LOADING DYE. Segatakse uuritava prooviga enne geelile kandmist, et  
1.  suurendada proovi tihedust, mis tagab proovi vajumise geelihamba põhja;  
2.  värvida proov, mis lihtsustab pealekandmist.  
DNA  detekteerimine  
Nukleiinhapete nähtavaksmuutmine geelil toimub peale foreesi. Selleks kasutatakse  
•  Etiidiumbromiidi  ( EtBr ).  EtBr  seondub  nukleiinhapetega  ja  fluorestseerub  UV  valguses 
(302  nm),  muutes  DNA  nähtavaks.  Kuna  ilma  EtBr-ta  geelis  on  DNA   bändid   teravamad  ja 
ilusamad,  siis  võib  geeli  värvida  EtBr-ga  peale  foreesi.  Selleks  hoitakse  geeli  30-45  min 
toatemperatuuril  foreesipuhvris  või  destilleeritud  vees,  kuhu  on  lisatud  EtBr  (0,5  µg/ml). 
Tausta   helenduse  vähendamiseks  võib  EtBr-ga  värvitud  geeli  loputada  20  min 
toatemperatuuril destilleeritud vees.  
•  Polüakrüülamiidgeelide  hõbetamist.  See  on  tehniliselt  keerulisem  kui  EtBr-ga   värvimine , 
kuid samas  tundlikum .  
 
Geelelektroforeesi protokol  
 
MATERJALID JA APARATUUR 
 
PUHVRID JA  LAHUSED .  
•  Agaroosgeel  saadakse  agaroosi  kuumutamisel  koos  puhvriga,  kuni  lahus  on  selge  ja 
läbipaistev. Seejärel valatakse agaroosilahus geelialusele ja lastakse tarduda.  
•  Elektroforeesipuhver (tavaliselt 1× TAE või 0,5× TBE).  
•  Etiidiumbromiid,  
•  Geeli pealekandmispuhver (gel loading dye) 
 
MOLEKULMASSI MARKER. 
•  DNA suurusmarker (size standard). Teadaoleva suurusega DNA  proovid  saadakse tavaliselt 
plasmiidi või bakteriofaagi DNA lõikamisel restriktsiooniensüümidega. Hea oleks omada nii 
kõrgmolekulaarmassiga  1  kb  -  >20  kb  fragmendi  pikkusega  standardit  kui  ka  madala 
molekulaarmassiga 100-1000 bp fragmendi pikkusega standardit.  
PCR PRODUKT, mis saadi eelmises praktikumis 
 
Protseduur: 
 
1.   Valmista   ette  piisav  kogus  elektroforeesipuhvrit,  et  täita  elektroforeesivann  ja  teha 
agaroosgeel. Väga oluline on kasutada nii geelis kui vannis täpselt sama puhvrit.  
2.  Valmista vajaliku %-ga agaroosilahus, lisades agaroosi foreesipuhvrisse. 
3.   Kuumuta  segu mikrolaineahjus, kuni agaroos on lahustunud.  
4.  Samal  ajal  kui  geel  jahtub,  otsi  välja  vajaliku  suurusega  kammid  ja  aseta  need  geelialusele 
ettenähtud  kohta.  Jälgi,  et  kammi  alumise  otsa  ja  geelialuse  vahele  mahuks  piisav  kogus 
geeli, et tekiks tugeva põhjaga geelihammas.  
 
73
5.  Kui agaroosilahus on  jahtunud  umbes 55ºC- ni, lisa EtBr lahust  ning vala geel alusele. NB! 
Kasutades  plastikust  geelialuseid  on  oluline  jälgida,  et  geelilahuse  temperatuur   langeks   alla 
60°C. Kuumemad lahused lõhuvad geelialuse. Vala aeglaselt ja väldi õhumullide teket geelis. 
6.  Oota  kuni  geel  on  täiesti  tardunud,  eemalda  ettevaatlikult   kamm   ja  geelialuse  otstest  teip. 
Aseta geel foreesivanni. 
7.  Lisa foreesipuhvrit, et see kataks geeli umbes 2-3 mm. 
8.  Lisa DNA proovile umbes 0,2 mahu ulatuses värvainet (loading dye).  
9.  Kanna proov aeglaselt hambasse. Kindlasti kanna geeli äärmistele radadele ka suurusmarker.  
10.   Sule   foreesivann  kaanega  ja  lülita  vool  sisse.  Voolupinge  peaks  olema  1-5  V/cm  ( distants  
positiivse  ja  negatiivse  elektroodi  vahel).  Elektroodi  juurest  hakkab  eralduma  mulle  ja 
broomfenoolsinine liigub mõne minuti jooksul hambast geeli. Forees kestab seni kuni värvid 
on liikunud nõutavale kaugusele hammastest.  
11.  Kui DNA proov ja värvid on liikunud nõutavale kaugusele, lülita vool välja, võta geel vannist 
välja 
12.  Aseta geel sisaldavasse vanni ja värvi umbes 10-15 minutit. 
13.  Tulemuste dokumenteerimine toimub digitaalselt IV korrusel. 
 
Praktiline töö 
 
ÜLESANNE  1.  Teostada  elektroforees  eelmises  praktikumis  valmistatud  PCR  reaktsiooni 
produktidega.  
 
 
 
 
ÜLESANNE 2. Analüüsida  erinevate E. coli tüvede RAPD-PCR  mustrit . Märkida PCR bändide 
arv ja ligikaudne suurus, kasutades selleks molekulmassi markeri tulemusi. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
74
Viroloogiline diagnostika 
Uuritava materjali võtmine 
  
Oluline on arvestada: 
•  kus lokaliseerub  viirushaigus  antud haigusstaadiumis; 
•  kas kahjustuskohas võiks leiduda viiruspartikleid, viiruse antigeene või nukleiinhappeid; 
•  missugune on oletatava viirusinfektsiooni korral antikehade dünaamika vereseerumis – s.t. kas 
on vajalik koguda paarisseerumid või  piisab  IgM tüüpi antikehade määramisest. 
 
Materjali valik: 
•  Hingamisteedest võetakse haiguse ägedas staadiumis 1-5 haiguspäeval kuiva vatitampooniga 
alumise  ninakarbiku   piirkonnast   tugeva  pöörava  liigutusega  nii,  et  preparaadis  oleksid 
silinderepiteelrakud.  
•  Ajuvedelikku peab olema vähemalt 2 ml, sest tavaliselt on  viirus  ja antikehad (AK) madalates 
kontsentratsioonides.  Tihti  võetakse  paralleelselt  vereproov,  et  uurida  antikehade  suhet 
liikvoris ja veres. 
•  Nahavillidest  võetakse  süstlaga  1  ml  vedelikku  haigustekitaja  isoleerimiseks  või 
elektronmikroskoopiaks. Transpordil jääb vedelik süstlasse.  
•  Nahahaavanditest  võetakse  materjali  tampooniga  kahjustuse  ääreosast,  tüügastest  võetakse 
väikesed tükikesed, mõlemad paigutatakse transportlahusesse. 
•  Urogenitaaltraktist  võetakse  materjal  steriilse  vatitampooniga,  keerates  tampooni  küllalt 
tugevalt, et saada rohkem infitseerunud rakke (emakakaelalt proovi võttes eelnevalt kindlasti 
kuiva  tampooniga  eemaldada  lima  ja  eritised  emakakaela  välissuudmelt).  Tampoon  asetada 
steriilsesse  katsutisse  ja  saata  koheselt  laborisse.  Kui  ei  saa  saata  võetud  materjali  laborisse 
samal  päeval,  võib  uuritava  materjali  kanda  preparaadiklaasile,  lasta  kuivada,  seejärel 
fikseerida  etanooliga ning saata hiljem laborisse. 
•  Silmast  võetakse  steriilse  vatitampooniga,  mis  on  soovitavalt  eelnevalt   niisutatud  
füsioloogilises  lahuses,  hõõrudes  tampooni  vastu   üla -  või  alalau  sisepinda,  et  saada 
võimalikult rohkem nakatatud rakke.  
•  Rooja umbes herneterasuurune tükike  transpordiks mõeldud plastiktopsi. Kui transport ei ole 
võimalik  samal  päeval,  säilitada  uuritav  materjal  +4oC  juures  külmkapis  ja  saata  järgmisel 
päeval laborisse. 
Transportlahused: 
•  isotoonilised soolalahused (Hanks’i lahus, fosfaatpuhvrit sisaldav Dulbecco A  soolalahus , 
trüptoosfosfaatpuljong); 
•  valku sisaldavad materjalid (albumiini, želatiini 2–5% lahused); 
•  lahuses on üks või mitu  antibiootikumi (penitsilliin, streptomütsiin, nüstatiin, gentamütsiin), 
et hävitada bakterid uuritavas materjalis 
•  sisaldavad indikaatorit  (fenoolpunane – pH hindamiseks). 
 
75
Materjal 
Võtmise meetod 
Transport 
Ninalima kaabe 
Tampooniga ninasõõrmest  
0°, VTL* 
Kurgu- ja ninalima 
Aspiratsioonivedelik 
0°, ilma lisandita 
Kurgulima kaabe 
Tampooniga neelust 
0°, VTL 
Kurguuhtmed 
Kuristamine füsioloogilise lahusega 
0°, ilma lisandita 
Bronhiaalsekreet 
Aspiratsioonivedelik 
0°, ilma lisandita 
Konjunktivaalkaaped 
Tampooniga ülemise ja alumise lau 
0°, VTL 
alt 
Villivedelik 
Tampooniga, punktsioon nõela või 
0°, VTL, ilma lisandita 
kapillaariga 
Limaskesta 
Tampooniga, nekrootilise koe 
0°, VTL 
erosioonvedelik 
äärelt, kahjustuse põhjast 
Uriin 
Keskjoauriin 
0°, ilma lisandita (VTL vaid 
kokkuleppel laboriga) 
Roe 
Roojatükike 
ilma lisandita 
Liikvor 
Punktsioon 
0°, ilma lisandita 
Koetükid  
Biopsia, autopsia 
Laboratooriumiga kokkuleppel 
Veri viiruse 
Punktsioon 
-70°C, antikoagulandid, 
isoleerimiseks 
Punktsioon ilma lisandita 
spetsiaaltransport  
Veri seroloogiaks 
Toatemperatuur 
 
* VTL – viiruse transportlahus 
 
Optimaalne  on  võimalikult  kiire  materjali  transport  laborisse.  Kui  seda  ei  ole  võimalik  teha 
mõnekümne  minuti möödudes, on  soovitav  transportida +4° C juures jää peal. Neis tingimustes 
säilib  enamus  viirusi  24  tundi,  kuid  mõned  (RSV,  paramüksoviirused)  võivad  inaktiveeruda.  Ei 
ole soovitav külmutada viirust sisaldavat materjali (-2°C -40°C), sest kui tekib veest jäävõrestik, 
milles  sisaldub  veel  jäätumata  hüpertooniline  soolalahus,  võivad  viirused  inaktiveeruda  ja 
valguline  materjal  ( antigeenid   ja  antikehad)  laguneda.  Näiteks  on  gripiviirust  sisaldav  materjal 
hästi  säiluv  +4°C  juures,  kuid  külmutamine  -20°  C  juures  võib  tema  infektsioossuse  täielikult 
hävitada. Kui on ette näha, et materjali ei õnnestu sama päeva jooksul laborisse saata, on soovitav 
kasutada “kuiva jääd” (tahket CO2) sisaldavad termosed või vedelat lämmastikku (-196°C).  
 Mõningad  viirused,  näiteks  tsütomegaloviirus,  ei  talu  külmutamist.  Külmutada  ei  tohi  ka 
verd,  sest  lüseerunud  rakumaterjal  takistab  edasiste  protseduuride  läbiviimist,  seevastu  verest 
eraldatud seerum on külmutatav.  
 
Vi ruste diagnostika ja identifikatsioon 
 
•  Viiruspartiklite,  viirusliku  antigeeni  või  viirusliku  nukleiinhappe  olemasolu  määramine 
uuritavas materjalis. 
•  Seroloogiline  diagnostika  määrab  kas  antikehade  esinemist  vereseerumis  või  viiruslikku 
antigeeni  uuritavas materjalis. 
 
 
76
Diagnostilised meetodid jagunevad: 
1.  Mitteimmunoloogilised meetodid; 
2.  Immunoloogilised meetodid. 
 
 Mitteimmunoloogilised meetodid 
 
Vi ruste isoleerimine ja  kultiveerimine  
Viiruste  isoleerimine  ja  identifitseerimine  toimub  enamasti  rakukultuurides.  Kasutatakse 
ühekihilisi  (monolayer)  rakukultuure,  harvem  kasutatakse  kanaembrüosid  või  katseloomi. 
Teatud  viirused  ei  kasva  rakukultuurides  (näiteks  rotaviirused,  hepatiidi,  papilloomi,  HIV, 
Epstein- Barri  ja mõned arboviirused). 
Eristatakse : 
•  Primaarsed rakukultuurid. Koetükike peenestatakse kääridega steriilsetes tingimustes, 
töödeldakse  proteolüütilise  ensüümi  (tavaliselt  trüpsiini)  lahusega  ja  saadud  rakkude 
suspensioon  külvatakse   klaasile   erilistes  lamedates  kolbides  –  madratsites.  Külvatud 
rakud  moodustavad  madratsi  pinnal  kasvu,  mis  diploidsete  kromosoomidega  rakkude 
puhul 
on 
kontakt-inhibeerimisfenomeni 
tõttu 
ühekihiline. 
Tuntumateks 
primaarkultuurideks  on  reesusahvide  neerukultuur  (pRMK)  ja  inimese  loote 
neerukultuur (pHEK). 
•  Diploidsed  rakukultuurid  ehk  rakutüved.  Saadakse  normaalse  kromosoomide 
garnituuriga  primaarkultuurist.  Kindel  toitelahuse  koostis  ja  ümberkülvide  regulaarsus 
(50–100)  tagavad  koekultuuri  säilimise.  Esindajateks  on  inimese  loote  kopsude 
fibroblastid  MRC-5 ja WI-38. 
•  Püsikultuurid  ehk  rakuliinid  koosnevad  polüploidsetest  rakkudest  (üksikute 
kromosoomide arv raku  kohta on suurem kui 2), neid saadakse kasvajakudedest ja võib 
ümber külvata praktiliselt piiramatu arv kordi. Esindajateks on emakakaela vähi (HeLa) 
ja kõrivähi (HEp-2) kultuurid. 
Rakukultuuride   kasvatamine   toimub  toitelahustes.  Toitelahuste  aluseks  on  transportlahused 
(Hanks’i  ja  Earle’i  lahused),  lisaks  aminohapped,  fermendid,  kofaktorid,  antibiootikumid  ja 
indikaatorvärvaine: fenoolpunane, mis rakkude kasvamisel ja pH langemisel muutub punasest 
kollaseks. 
 
Tsütopaatiline efekt 
 
•  Koekultuurides  või  elusorganismi  rakkudes  paljunedes  kutsuvad  viirused  esile  rakkude 
muutusi:  
1.   Lüüs  peremeesraku destruktsioon. Pikornaviirustel peenteraline rakkude destruktsioon.  
2.  Kokkusulamine ( fusion ) paramüksoviirustel gigantsete paljutuumsete süntsüütsiumide teke.  
3.  Inklusioonide ehk sulundkehakeste teke:  
•  tuumasisesed inklusioonid on iseloomulikud DNA viirustele  
•  tsütoplasmasisesed inklusioonid iseloomustavad RNA viirusi  
 
 
 
 
77
Histoloogiline värvimine. 
  
Histoloogiline rakukultuuride värvimine  võimaldab kahjustusi demonstreerida, kuid on suunava 
ja edasist tööd kergendava, mitte aga lõpliku diagnostilise väärtusega 
 
Hemaglutinatsioon. 
 
Hemaglutineerivate  viiruste  hulka  kuuluvad   entero -,  gripi,  paragripi,  adeno-,   mumpsi ,  reo-, 
punetiste,  leetrite  viirused.  Erinevad  viirused  aglutineerivad  erinevaid  erütrotsüüte  (inimese, 
kana, merisea, ahvi jne). 
 
Elektronmikroskoopia. 
Võimaldab  otseselt  vaadelda  haigustekitajat,  eristada  sugukondi,  näiteks  poksviirusi 
herpesviirustest, kuid ei anna võimalusi  tavalisel  kujul eristada näiteks HSV-1 ja HSV-2.  
 
Molekulaarsed meetodid. 
Vaata eelmine praktikum. 
 
 
Immunoloogilised meetodid 
 
VIIRUSLIKU ANTIGEENI MÄÄRAMISEL  kasutatakse tuntud diagnostilisi antikehi (AK).  
 
Immunoelektronmikroskoopia  (IEM)  korral  lisatakse  uuritavatele  proovidele  ferritiini  või 
ensüümiga märgistatud antikehi. Nii määratakse  rota - ja hepatiidiviirusi. 
 
Immunofluorestsentsmeetod(IF). Viiruste poolt nakatatud rakkudes olevate viirusantigeenide 
reageerimisel 
spetsiifiliste 
fluorestseeruvate 
antikehadega 
moodustunud 
kompleksi 
immunofluorestsentsmikroskoopia.  
•  Otsese immunofluorestsentsmeetodi korral on fluorestseeriva värvainega märgistatud otseselt 
viirusantigeeniga reageeriv  antikeha . 
•  Kaudse  immunofluorestsentsmeetodi  puhul  reageerib  antigeen   esmalt   temale  spetsiifilise 
antikehaga ,  mis  pole  märgistatud.  Tekkinud  Ag-AK  kompleksile  lisatakse  märgistatud 
antikeha,  mis  on  saadud  esimesena  reaktsioonis  osalenud  antikeha  kui  liigispetsiifilise 
valguga katselooma  nakatamisel  (teine antikeha reageerib esimese antikeha epitoopidega).  
Immunofluorestsentsmeetodit kasutatakse: 
•  marutõve viiruse määramisel süljenäärmete eritises,  
•  herpesentsefaliidi diagnoosimisel,  
•  respiratoorseid infektsioone põhjustavate viiruste määramisel 
•   Varicella -Zosteri sedastamisel nahakahjustustes.  
•  tsütomegaloviiruse määramisel bronhoalveolaarloputises. 
 
Tahke faasi immuuntestid. Uuritava antigeeni määramiseks kasutatakse spetsiifilisi antikehi, mis 
on  fikseeritud  polüsteroolile.  Tekkiv  spetsiifiline  antigeen-antikeha  kompleks  on  stabiilselt 
alusele fikseeritud ja seda ei saa mehhaaniliselt (loputamisega) eemaldada. 
 
78
Kompleksi olemasolu määratakse kindlaks teise spetsiifilise antikehaga, mis on märgistatud 
•  kas isotoobiga – radioimmunoloogiline meetod (RIA) või  
•  ensüümiga  –  ensüümimmunoloogiline  meetod  (EIA).  Fikseeritakse  Ag-AK  kompleks 
spetsiifilise antikehaga ja seejärel lisatakse eelmisele antikehale spetsiifiline antikeha, mis 
on vastavalt märgistatud. Kompleksis fikseerunud radioaktiivsus määratakse loendajates, 
ensümaatiline 
aktiivsus 
ensüüm-substraadile 
omases 
värvusreaktsioonis 
(spektrofotomeetriga). 
 
Lateksaglutinatsioon.  
 
On  vähem  tundlikum  kui  RIA  ja  EIA.  Väikestele  latekspartiklitele  on  kantud  viirusspetsiifilised 
antikehad,  antigeeni  lisamisel tekivad  nähtavad  aglutinaadid.  Saab  määrata  rota-  ja  adenoviirusi 
roojas.  
 
 
VIIRUSVASTASTE ANTIKEHADE MÄÄRAMINE PATSIENDI 
VERESEERUMIS.  
 
Western  immunoblotting    on  väärtuslik  analüütiline  meetod  antikehade  määramiseks  eri 
viirusvalkude  suhtes. Selleks toimub esiteks tuntud viiruse puhastamine, edasi eraldatakse  valgud  
elektroforeesil  naatriumdodetsüülsulfaati  sisaldavas  geelis.  Geelist  kantakse  erinevad  valgud 
eraldi  nitrotselluloosfiltritele.  Filtrid  lõigatakse  tükkideks  ning  säilitatakse  kuivatatutena.  Kui 
filtritele   lisada  uuritavat  seerumit,  tekib  antigeeni-antikeha  reaktsioon,  mis  testitakse  esimese 
antikeha suhtes spetsiifilise märgistatud antikeha lisamisega. Nii on võimalik vereseerumis leida 
erinevate  viirusvalkude  suhtes  spetsiifilisi  antikehi,  mis  on  oluline  mitmete  nakkuste  (HIV, 
hepatiidid ) kulu ja prognoosi  uurimisel . 
 
IgM määramine. M tüüpi immunoglobuliinid tekivad varem kui G  globuliinid , kuid püsivad ka 
vereseerumis tunduvalt vähem (IgM 2–3 kuud, IgG – aastaid, tihti ka  eluaeg ). Seepärast on IgM 
leid haige vereseerumis tavaliselt teatud viirusinfektsiooni üheks varasemaks tunnuseks ja seega 
diagnostilise  väärtusega.  See  on  eriti  väärtuslik  nende  infektsioonide  varases  diagnostikas, 
millised  jätavad  eluaegse  immuunsuse  ( punetised ,   leetrid ),  kuid  väiksema  väärtusega  nende 
infektsioonide puhul (näiteks herpes), millised annavad reinfektsioone (millistega võib kaasneda 
ka IgM teatav fluktuatsioon – ajutine tiitri tõus). 
 
Praktiline töö 
 
Ülesanne 1.. Vi ruslikud hingamisteede nakkused 
 
Loetleda  olulisemaid  hingamisteede  nakkusi  põhjustavaid  viirusi  sõltuvalt  nende   
poolt  tekitatava  haiguse  põhilisest  lokalisatsioonist  ja  nende  koht  viiruste 
klassifikatsioonis. 
•  Ülemiste ja alumiste hingamisteede nakkuste põhjustajad 
 
 
 
 
79
 
 
•  Põhiliselt ainult ülemiste hingamisteede nakkuste põhjustajad 
 
 
 
 
 
•  Olulisemad laste hingamisteede nakkuste põhjustajad. 
 
 
 
 
•  Loetleda erinevate uuritavate materjalide võtmise ja saatmise viise hingamisteede nakkuste 
korral (viirusdiagnoosiks ja tekitaja isoleerimiseks). 
 
 
 
 
 
•  Loetleda põhilisemaid reaktsioone ja meetodeid, millised on Eestis kasutusel olulisemate 
hingamisteede viirusnakkuste diagnostikas.  
 
 
 
 
 
 
Ülesanne 2 . Vi ruslikud  neuroinfektsioonid  
 
  Loetleda olulisemad närvisüsteemi haigusi tekitavad viirused 
 
•  Meningiitide põhjustajad 
 
 
 
 
 
•  Entsefaliitide põhjustajad 
 
 
 
 
•   Krooniliste  närvisüsteemi infektsioonide põhjustajad 
 
 
 
 
 
•  Olulisemate neuroinfektsioonide diagnoosimise meetodid 
 
 
 
80
 
 
 
Ülesanne 3. Vi rushepati did 
 
Loetleda viirushepatiitide tekitajad, samuti viirushaigused, milliste puhul hepatiidid esinevad 
tüsistusena. 
 
 
 
 
 
 
A. Uuritav materjal hepati tide korral. 
•  HAV – roe, veri (harva), vereseerum; 
•  HBV (+HDV) – veri, vereseerum; 
•  HCV – veri, vereseerum; 
•  HEV – roe, vereseerum. 
 
B. Diagnostika 
 
 Serodiagnostika. Teostatakse EIA ja RIA  meetoditel . Haiguse algfaasis ilmuvad tavaliselt IgM 
antikehad  vastavatele  antigeenidele,  mis  hiljem  asenduvad  IgG  antikehadega.  Nende  ilmumise 
järgi määratakse haiguse staadium ja prognoos (krooniliste vormide võimalikkus). 
 Molekulaarsed  meetodid.  PCR  kasutatakse  HBV,  HBV(+HDV)  ja  HCV  puhul  viiruslike 
nukleiinhapete  (vastavalt  DNH,  DNH  (+RNH)  ja  RNH)  testimiseks  veres  ja  vere  vorm-
elementides nii ägedate kui ka krooniliste haigusvormide puhul, samuti doonoriveres. 
 
 
Ülesanne 4. Vi ruslikud lööbenakkused 
 
Punetised, 
Leetrid 
Erythema infectiosum 
 
Roseola infantum 
Makulopapuloosne  lööve   
COXSACKIE 
 
ECHO  
CMV 
EBV 
 
 
Tuulerõuged  
Dissemineeritud HSV infektsioon  
Vesiko-bulloosne lööve  
Eczema herpeticum 
ECHO 
COXSACKIE  
 
 
 
 
 
 
81
 
 
Leetrid 
 
HAIGUSTEKITAJA on Morbillivirus  Paramyxovirus perekonnast ( üheahelaline  RNA  viirus ).  
Levib õhu kaudu piisknakkusena haige köhimisel või aevastamisel. 
Haige on nakkusohtlik  prodromaalperioodis,  4 päeva enne ja 4 päeva peale lööbe teket. 
Tekivad  köha ,  nohu  ja silmapõletik.  
Teisel päeval pärast haigustunnuste ilmnemist tekivad põskede limaskestale eespurihammaste 
kohale valkjad erkpunase äärisega laigud (nn Kopliki laigud). Lööve algab kõrvade tagant, levib 
näole, järgmisel päeval kehale ja kätele.  Kolmandaks  päevaks on lööve ka peopesades ja jala- 
taldadel. Lööve on algul roosa, hiljem intensiivselt punetav, kestab 5 päeva ja kaob samas 
järjekorras nagu tekkiski.  
Sagedasemad tüsistused on pneumoonia, otiit ja entsefaliit. 
Diagnostika: 
Haigus diagnoositakse kliiniliste sümptomite ja epidemioloogiliste andmete alusel. 
SEROLOOGILINE UURIMINE on peamine diagnostikameetod: spetsiifiliste IgM-antikehade 
määramine  veres alates 4-5-st päevast pärast lööbe teket (ELISA). 
Profülaktika : aktiivne immuniseerimine 12. elukuul, revaktsineerimine 13.a.-l. 
Immuniseeritakse ka asümptoomsed HIV positiivsed lapsed. Alates 1994. aastast võeti kasutusele 
leetrite-mumpsi-punetiste liitvaktsiin (MMR). 
 
Punetised 
 
HAIGUSTEKITAJA on Rubivirus  Togaviridae perekonnast (üheahelaline RNA viirus) 
Enamikul juhtudest levib viirus piisknakkusena. Raseduse ajal, kui ema põeb punetisi, kandub 
punetiseviirus transplatsentaarselt  lootele  (vertikaalne ülekandumine). 
 
      
Äge viirushaigus, mis avaldub  kurguvalu ,  nahalööbe  ja  lümfisõlmede  suurenemisena. 
Peiteperiood    kestab  11-17 päeva (harva 21 päeva). Seejärel tekib kaela ja kukla lümfisõlmede 
suurenemine, kurguvalu,  palavik  kuni 380C, halb enesetunne, nõrkus ja peavalu. 
 2.-3.   haiguspäeval tekib kiiresti leviv õrnroosa lööve, mis algab peanahalt ja levib ühe päevaga 
kehale ja jäsemetele. Lööve on intensiivsem käte ja jalgade sirutuskülgedel, möödub 2-3 päevaga. 
Raseduse ajal on oht spontaansele abordile, enneaegsele sünnitusele või kaasasündinud 
väärarendile. Mida varasem on  rasedus , seda  tõsisemad   väärarengud  tekivad: 1.-2. raseduskuul 
on risk lootele 65-85%, 3. kuul 30-35%, 4.raseduskuul 10%.  
Kaasasündinud punetiste korral võib laps olla alakaaluline, esineb vaimse arengu peetus, 
maksa suurenemine, südamerike,  kurtus , silmahaigused.  
Sagedasemad tüsistused on: 
artralgiad, artriit (väga harva),entsefaliit 
Diagnostika: 
  kliinilis-epidemioloogiline  
  punetiseviiruse  nukleiinhappe tuvastamine (PCR) 
  IgM ja IgG tüüpi antikehade määramine (kemiluminestsents-
immuunmeetod, ELISA) 
 
Kaasasündinud punetiste diagnostika: 
  viiruse isoleerimine 
  IgM tüüpi antikehad  seerumis  
  ja/või antikehade persisteerumine seerumis üle aasta või ak tiitri tõus 
vaktsineerimata väikelapsel 
  viiruse määramine monoklonaalsete antikehadega või PCR-ga biopsiast 
ja/või verest ja liikvorist 
 
82
Profülaktika:  vaktsineerimine . Punetiste  vaktsiin  on kõrge efektiivsusega ja 97%-l säilib 
immuunsus  vähemalt 15-18 aastat endeemilise haigestumuse puudumisel, mõnede uuringute 
andmetel tekib immuniseerimise järgselt elukestev immuunsus. 
 
 
 
Tuulerõuged 
 
HAIGUSTEKITAJA on  Varizella zoster virus (VZV) Herpesviridae perekonnast 
Tegemist  on  kõrge  kontagioossusega  piiskinfektsiooniga,    samuti  on  ohtlik  kokkupuude  villide 
eritisega.    Esmane  infektsioon  esineb  sagedamini  varases   lapseeas .  Põdenutel  võib  esineda 
infektsiooni reaktivatsioon,  mis avaldub vöötohatisena.  
Nakkusallikaks   on  haige  inimene  1-2  päeva  enne  nahalööbe  ilmumist  kuni  koorikute 
äralangemiseni 5-6 päeva jooksul. Nakkusallikaks võivad olla ka vöötohatisehaiged. 
 
 
Peiteperiood  on  13-15  (max  21)  päeva.  Haigus  algab  katarraalsete  nähtude  ja  kehatemperatuuri 
tõusuga, mille kestus on 1-2 päeva. Seejärel tekib sõlmelis-villiline lööve,  esineb palaviku tõus. 
Lööbeelemendid võivad olla erinevad ja esineda kehal üheaegselt. Lööbeelementide arv on erinev 
lastel  ja  täiskasvanutel.  Näiteks  väikelapsel  võib  olla  ainult  paar  täpikest,  täiskasvanul  aga  üle 
500. 
Lööve levib tavaliselt juustega kaetud peanahalt, kaelalt ja näolt asümmeetriliselt üle kogu keha. 
Ville  võib  leiduda  ka  silma-,  suu-  ja  genitaalide  limaskestal.  Lööve  puudub  jalataldadel  ja 
peopesadel. 
Tüsistustena  võivad  tekkida  naha  sekundaarne   bakteriaalne   nakkus,  kopsupõletik  või  raskete 
vormide korral entsefaliit.        
Perinataalsete tuulerõugete korral on suremus kõrgem, kui ema  haigestub  5 päeva enne sünnitust 
või 48 tundi pärast seda. 
 
Kaasasündinud 
tuulerõuged: 
väärarengud 
– 
mikroftalmia, 
korioretiniit, 
katarakt, 
mikrotsefaalia, kurtus,  vaimne alaareng. 
Diagnostika: 
•  kliinilis-epidemioloogiline  
•  viiruse otsene sedastamine algmaterjali preparaadis –immunofluorestsents nahakaape 
puhul  
•  VZV DNA määramine liikvoris,  villisisus. Uuritakse ka haavandikaabet ja koetükikesi. 
Test: reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon (  Real  time PCR) 
•  VZV IgM ja IgG määramine seerumis ja liikvoris.  
Test: ELISA 
 
NB! Neuroinfektsiooni diagnoosimiseks ei ole spetsiifiliste antikehade leid liikvoris piisav. Selle 
tuvastamiseks kasutatakse mikroorganismi-spetsiifiliste antikehade indeksit (MOSAI – 
microorganism  specific  antibody index). MOSAI on mikrorganismi-spetsiifilise IgG ja IgG 
üldkontsentratsiooni suhe liikvoris ning seerumis korreleerituna albumiini väärtustega 
samades proovimaterjalides. MOSAI arvutamiseks tuleb saata laborisse nii seerum kui liikvor. 
 
Profülaktika: võimalik  vaktsineerida . 
 
Ülesanne 5. HIV infektsioon 
 
 
HIV-testimiseks on kaks peamist võimalust: 
•   automatiseeritud  või poolautomatiseeritud uurimine veeniverest (aknaperiood 
umbes 3–4 nädalat)  
•  kiirtest veeni või näpuotsaverest (aknaperiood  8–12 nädalat).  
 
83
 
 
HIV antikeha testid võivad anda 3 erinevat tulemust: 
l. Positiivne tulemus - inimese veres on olemas HI-viiruse vastased antikehad. 
2. Negatiivne tulemus - inimese veres HI-viiruse vastased antikehad puuduvad. 
3. Selguseta tulemus - valitud HIV antikehadest annavad positiivse tulemuse ainult 
mõned. 
 
 
Selguseta tulemuse võimalikud põhjused: 
•  Varajane HIV nakkus 
•  Eelnev vereülekanne ( isegi mitte- HIV nakatunud vere) 
•  Vana või värske   süüfilis ,  malaaria  või mõni viirusnakkus. 
•   Autoimmuunhaigus  (luupus,  diabeet ) 
•  HIV vastase vaktsiini  manustamine  (uuringu käigus) 
 
 
Kinnitava diagnostika  skeem 
 
Kinnitamisele kuuluvad kõik esmasel testimisel positiivseks/piiripealseks osutunud 
tulemused, mis on saadud HIV-antikehade või kombineeritult HIV-antikehade ning 
HIV antigeeni määramisel.  
 Sõltuvalt esmasel testimisel kasutatud metoodikast ja mõõtetulemustest kasutatakse  kinnitavaks 
diagnostikaks järgmisi metoodikaid:  
•  4. põlvkonna EIA HIV-1/HIV-2 antigeeni ja antikehade määramiseks, 
•  immunoblot HIV-1 ja HIV-2 spetsiifiliste antikehade määramiseks,  
•  HIV-1 antigeeni määramine,  
•  HIV-1 antigeeni neutralisatsioonitest, 
•  HIV-1 RNA määramine. 
 
 Standartne skeem kinnitaval testimisel on järgmine: 
1. Positiivse esmase tulemuse korral tehakse kinnitav uuring esmalt kahe erineva EIA 
testsüsteemiga.  Kui  mõlema  testsüsteemiga  saadakse  negatiivne  tulemus,  loetakse  kinnitava 
uuringu tulemus negatiivseks. Kui EIA uuring on positiivne, uuritakse proovi edasi immunobloti 
abil (tugevalt positiivse tulemuse korral) või antigeeni testi abil (nõrgalt positiivse või selgusetu 
tulemuse korral). 
2. Immunoblot HIV-1/HIV-2 antikehadele tehakse antikehade suhtes selgelt positiivse 
EIA  tulemuse  spetsiifilisuse  kinnitamiseks.  Kui  immunoblotiga  saadakse  positiivne  tulemus, 
loetakse tulemus kinnitatult positiivseks, vastasel korral uuritakse proovi edasi HIV-1 antigeeni 
suhtes. 
3.  HIV-1  antigeen  määratakse  kinnitava  testina,  kui  uuringud  HIV-antikehade tuvastamiseks  on 
andnud  selgusetu  tulemuse.  Kinnitav  uuring  HIV-1  antigeenile  loetakse  positiivseks,  kui 
positiivne tulemus on saadud nii HIV-1 antigeeni määramisel kui ka selle neutralisatsioonitestil. 
Kui  HIV-1  antgeeni  uuring  või    vastav  neutralisatsioonitest  osutuvad  negatiivseks,  siis  loetakse 
kinnitava uuringu tulemus negatiivseks. 
4.  HIV  RNA  kvantitatiivset  sisaldust  proovimaterjalis  määratakse  juhul,  kui  esmast   positiivset  
tulemust  ei  ole  õnnestunud  eelnevate  uuringutega  ei  kinnitada  ega  ümber  lükata  (tulemus  on 
piiripealne  või  selgusetu).  Uuringuks  tellitakse  täiendavalt  teine   proovimaterjal .  Vastusena 
väljastatakse  uuringu  tulemus  koos kasutatud  metoodika  määramispiiriga.  Juhul,  kui   intervall , 
 
mille  möödudes  on  võetud  uus  proovimaterjal,  on  pikem  kui  kaks  nädalat,  alustatakse 
proovimaterjali  uurimist  uuesti antikehade ja antigeeni kombineeritud määramisega. 
 
Positiivne  HIV  p24  antigeeni  või  HIV  RNA  tulemus  kinnitavad  HIV-infektsiooni  olemasolu, 
kuid ei kinnita HIV serokonversiooni. 
 
84
 
 
 
 
(Eesti Arst 2013;92(1):51-55) 
 
 
 
 
85