alustanud 1 molekuliga. 227=134217728 Praktiline töö nr. 2: Agaroosgeeli valamine Eesmärk: PCR produkti analüüsimiseks vajaliku agaroosgeeli valmistamine. Materjalid: 4,5g Agaroosi pulber Varieerides geeli agaroosisisaldust saame lahutada ka suhteliselt sarnaste pikkustega DNA fragmente. 300ml 1x TAE puhver lahusti 3µl EtBr DNA visualiseerimise reagent (lõppkontsentratsioon 0,05µg/ml) Arvutused: 1,5 0,05× 300 Agaroosi pulber: 300 × =4,5 g EtBr: =0,0015 ml=1,5 µ l 100 10000 , aga meie paneme EtBr 2x rohkem, kuna õppejõud ütles nii. Parem karta kui kahetseda. Töö käik:
propanool TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2) Ribonukleaas A TE-s (5 g/ml,; Sigma) Fenool, tasakaalustatud TE-ga (NB! Fenooli pipeteerida ainult kummikinnastes ja tõmbe all!). 70% ja 95% Etanool. 1 M Na-atsetaat (NaOAc), pH 5,5 (lisatakse DNA sadestamiseks) Agaroos (FMC) 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2) 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (5 x TBE, 20% glütserool, 0,01% Broomfenoolsinine) EtBr 5 g/l (pipeteerida kummikinnastega, kantserogeenne) NB! Enne tööle asumist lugeda läbi fenooli ja etiidiumbromiidiga töötamise ohutuseeskiri (http://geen.ttu.ee/?id=10705, vt punkt C6. Fenooli ja etiidiumbromiidiga (EtBr) töötamine). Töö käik: 6 (1) Vala ~1,4 ml bakteri ON kultuuri tuubi, sule tuub ja tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 1 min. Tuubid asetada tsentrifuugi nii, et tuubi ja kaant ühendav osa jääks väljapoole.
propanool TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2) Ribonukleaas A TE-s (5 g/ml,; Sigma) Fenool, tasakaalustatud TE-ga (NB! Fenooli pipeteerida ainult kummikinnastes ja tõmbe all!). 70% ja 95% Etanool. 1 M Na-atsetaat (NaOAc), pH 5,5 (lisatakse DNA sadestamiseks) Agaroos (FMC) 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2) 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (5 x TBE, 20% glütserool, 0,01% Broomfenoolsinine) EtBr 5 g/l (pipeteerida kummikinnastega, kantserogeenne) NB! Enne tööle asumist lugeda läbi fenooli ja etiidiumbromiidiga töötamise ohutuseeskiri (http://geen.ttu.ee/?id=10705, vt punkt C6. Fenooli ja etiidiumbromiidiga (EtBr) töötamine). Töö käik: 7 (1) Vala ~1,4 ml bakteri ON kultuuri tuubi, sule tuub ja tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 1 min. Tuubid
õhukindlalt suletavat konteinerit. * Kokku puutunud prahti käideldakse ohtlike jäätmetena. Akrüülamiid, teised kahe komponendiga polümeerid ja naatrium dodetsüülsulfaat (SDS) * Ära kunagi puutu neid ühendeid otseselt. Pulbri kaalumisel kasuta alati kindaid, soovitavalt ka kaitseprille ning suukaitset. Kaalu alati tõmbe all. Fenool * Fenooli nahale sattumise oht on võrdlemisi suur, aga sügelusega kergesti märgatav ning veega mahapestav. Etiidiumbromiid * EtBr läheb latekskindast läbi, aga nitriilkindast mitte. * Geeli mitte kätega puutuda. * Ruumid, kus asub geelipildistamise aparatuur, tuleb lugeda EtBr-ga saastunuks. 2. Mis on zoonoosid? Milliseid zoonoose on kõige tõenäolisem saada laboris töötades. Miks? Zoonoosid- A-tüüpi salmonelloosid. 3. Millised on olulisemad infektsioonid, mis ohustavad töötamisel inimorganismi kudede ja kehavedelikega? HIV, hepatiidid(b, c, d), süüfilis. 4
õhukindlalt suletavat konteinerit. * Kokku puutunud prahti käideldakse ohtlike jäätmetena. Akrüülamiid, teised kahe komponendiga polümeerid ja naatrium dodetsüülsulfaat (SDS) * Ära kunagi puutu neid ühendeid otseselt. Pulbri kaalumisel kasuta alati kindaid, soovitavalt ka kaitseprille ning suukaitset. Kaalu alati tõmbe all. Fenool * Fenooli nahale sattumise oht on võrdlemisi suur, aga sügelusega kergesti märgatav ning veega mahapestav. Etiidiumbromiid * EtBr läheb latekskindast läbi, aga nitriilkindast mitte. * Geeli mitte kätega puutuda. * Ruumid, kus asub geelipildistamise aparatuur, tuleb lugeda EtBr-ga saastunuks. 222 Mida tuleb silmas pidada, kasutades laboris mikrolaineahju? Mikrolaineahju ei tohi panna sööki/jooki. Seda tuleb puhastada. Lahuse asetamisel ahju tuleks teada, kaua protsess u aega võtab, et ei tekiks nn plahvatus või ülekeemisohtu. 222 Millised bioloogiliste ohutegurite ohurühmad on kirjeldatud Eestis
Pärast jätame segu jahtuma tasakesi 5 loksutades (et ei tarduks ära) ~ 50 C-ni, et pärast lisada 0,5 µl DNA visualiseerimise reagenti – EtBr. Kuna aine on orgaaniline, siis kõrgema temperatuuri juures on oht, et ta hakkab lagunema. EtBr seostub kaheahelalise DNAga ning uv-lainete all fluorestseerub oranžide viirgudena. (Suur oht
suletavat konteinerit. * Kokku puutunud prahti käideldakse ohtlike jäätmetena. Akrüülamiid, teised kahe komponendiga polümeerid ja naatrium dodetsüülsulfaat (SDS) * Ära kunagi puutu neid ühendeid otseselt. Pulbri kaalumisel kasuta alati kindaid, soovitavalt ka kaitseprille ning suukaitset. Kaalu alati tõmbe all. Fenool * Fenooli nahale sattumise oht on võrdlemisi suur, aga sügelusega kergesti märgatav ning veega mahapestav. Etiidiumbromiid * EtBr läheb latekskindast läbi, aga nitriilkindast mitte. * Geeli mitte kätega puutuda. * Ruumid, kus asub geelipildistamise aparatuur, tuleb lugeda EtBr-ga saastunuks. 2. Mis on zoonoosid? Milliseid zoonoose on kõige tõenäolisem saada laboris töötades. Miks? (siin vastus. A-tüüpilised sallmonelloosid. Kuid miks, uuri ise). on mets- ja koduloomade nakkushaigused, mis võivad nakatada inimest, või ka vastupidi: inimesed võivad nakatada loomi.
fragmentide jaoks on TAE lahutusvõime veidi parem kui TBE-l ja lühemaid fragmente lahutab TAE halvemini kui TBE. 72 GEL-LOADING DYE. Segatakse uuritava prooviga enne geelile kandmist, et 1. suurendada proovi tihedust, mis tagab proovi vajumise geelihamba põhja; 2. värvida proov, mis lihtsustab pealekandmist. DNA detekteerimine Nukleiinhapete nähtavaksmuutmine geelil toimub peale foreesi. Selleks kasutatakse • Etiidiumbromiidi (EtBr). EtBr seondub nukleiinhapetega ja fluorestseerub UV valguses (302 nm), muutes DNA nähtavaks. Kuna ilma EtBr-ta geelis on DNA bändid teravamad ja ilusamad, siis võib geeli värvida EtBr-ga peale foreesi. Selleks hoitakse geeli 30-45 min toatemperatuuril foreesipuhvris või destilleeritud vees, kuhu on lisatud EtBr (0,5 µg/ml). Tausta helenduse vähendamiseks võib EtBr-ga värvitud geeli loputada 20 min toatemperatuuril destilleeritud vees.
c) Geelipildilt on näha, et PCR on tõenäoliselt ebaõnnestunud, kuna bändi pole näha (peaks olema noolega märgitud kohas). Põhjuseks võib olla ebatäpsus. Edasiseks tööks sain L-Envo pEGFP-C2. 2. PCR-i produkti puhastamine a) Kaalusime 1,5g agaroosi, viisime mahu TAE puhvriga 100ml-ni ja kuumutasime segu mikrolaineahjus, kuni agaroos täielikult lahustus. Seejärel jahutasime lahust ringjate liigutustega loksutades. Jahtunud segule lisasime 0,5l EtBr, loksutasime ning valasime lahuse geelialusele. Lasime geelil tarduda. b) Kuna produktide pikkus varieerus 300-2000 bp vahel, siis valmistasime 1,5% agaroos geeli. Mida pikemad produktid, seda lahjem peab olema geel, ning vastupidi. c) Kontrollgeeli valasime selleks, et hinnata, kas puhastamine on olnud efektiivne. Kui segusse on jäänud peale soovitava produkti muid jääke, on kontrollgeeli pildil näha peale õige pikkusega lõigu ka teisi bände
23.DNA lahutamine agaroosgeelis 24. Eesmärgiks on visualiseerida oma produkti ning hinnata selle suurust. DNA lahutamisel kasutatakse agaroosi (disahhariid, koosneb D-galaktoosist ja 3,6-anhüdro-L-galaktoosist). 1. päev: kasutatava agaroosgeeli kangust arvutatakse võttes arvesse oodatava produkti pikkust. Meie kasutasime 1% geeli. Segasime kokku 100 ml TAE puhvrit, 1 gr agaroosi ning kuumutasime mikholaineahjus sulamiseni. Jahtunud geelisegule lisasime1 μl EtBr, mida kasutatakse DNA visualiseerimiseks. Valasime lahus geelialusele ning jätsime tarduma järgmise praktikumini. 2. päev: lisasin PCR segule 4 μl 6x DNA värvi, et DNA nähtav oleks, ning kandsin kogu segu TAE geelile (hambasse). DNA lahutamine toimub elektrivoolu toimel (100 V 15 min) 25. 26. 27. 28. 29. 30. Kuna minu produkt ei ole üldse geelipildil nähtav, võin järeldada, et midagi tegin valesti PCR reaktsiooni teostamisel (nt
3. platoo (reaktsioon on lõppenud, enam produkte ei tehta). Siit mõõdab PCR. 9. Mille poolest PCR erineb RT-PCR-st? * Andmete mõõtmiskoht - PCR on mõõdetud lõpp-punktist (platoo). RT PCR mõõdab eksponentsiaalsest faasist – ehk RT-PCR on täpsem → saab kasutada kvantiteerimiseks. * Kiirus – PCR on aeglasem – määratakse produkti agaroosgeelil. RT PCR kvantiteerib DNA- d reaktsiooni käigus – RT-PCR on kiirem. * Tundlikkus - PCRi produkte määratakse EtBr-ga värvunud produktide suuruse alusel. RT PCR määrab produkti kogust fluorestsentsi intensiivsuse alusel. Geeli lahutusvõime (10x erinevust saab tuvastada) on tunduvalt madalam kui fluorestsentsil (2x erinevust). * Tulemuste esitamine – RT PCR-il numbritega, PCR-il ei ole. * Produkti suurus - RT PCR-ga on amplifitseeritud DNA lõigu suurus on väiksem. 5. 10. Mis on GMO? Geneetiliselt muundatud organism. Organism, mille genoomi on inimese poolt muudetud.
mutM N-glükosülaas + AP- endonukleaas, kõrvaldab valesti lülitunud A jäägi asendades selle Cga. mutY N-glükosülaas, mis spetsiifiliselt püüab kõrvaldada 8-oxoG=A paarist sinna valesti lülitunud A mutT fosfataas; 8-oxoGTP8-oxoGMP 2.3. Raaminihke mutatsioonid. Põhjuseks on ühe N-aluste paari kadumine või lisandumine. See võib toimuda nii spontaanselt kui ka mõnede mutageenide toimel. Selliste ühendite hulka kuuluvad 9-aminoakridiin, proflaviin, EtBr jt. Need nn. interkaleeruvadühendid paigutuvad ahelas kahe kõrvutioleva nukleotiidi vahele ja põhjustavad ahelate libisemist teineteise suhtes. Seda juhtub kõige sagedamini DNA piirkondades kus esinevad AT või GC kordused. 2.4. Deletsioon mutatsioonid Enamasti on deletsioonide tekke põhjuseks mitmesugused rekombinatsioonid erinevate DNA molekuli piirkondade vahel. Sageli toimub see DNA järjestuste vahel, mis kujutavad endast otseseid kordusjärjestusi
annaabi.ee 
