VETERINAARGENEETIKA JA ARETUS MOLEKULAARBIOLOOGIA JA REKOMBINANT-DNA TEHNOLOOGIA Rekombinant-DNA (hubriidse DNA) tehnoloogia on tanapaeva geneetika ja molekulaarbioloogia peamisi meetodeid, mis leiab uha enam kasutamist ka veterinaarias. Rekombinant-DNA tehnoloogia kasutusele votmine on oluliselt avardanud voimalusi uurida geenide molekulaarset struktuuri ning parilikkuse biokeemiat. Uhtlasi on tanu rekombinant- DNA tehnoloogiale astutud kvalitatiivne samm edasi biotehnoloogias ja nakkushaiguste diagnostikas. Rekombinant-DNA tehnoloogia pohimeetodid on jargmised: DNA molekuli lohestamine e loikamine fragmentideks restriktsiooni ensuumide abil, mis lohuvad sidemed nukleiinhapete (NH) vahel spetsiifilise nukleiinhapete jarjetusega piirkonnas (iga ensuumi jaoks eri NH jarjestus) Nukleiinhappeline hubridiseerimine -tanu DNA, RNA molekulide voimele siduda vabasid Nhid on voimalik teataud NH-jarjestusega vabade margistatud DNAfragmentide abil...
Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2013 a) Nimi: YAGB41 Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin
Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2012 a) Nimi: Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin
liiga väike. Mida korduskatses teisiti teha? E1 lahuse lisamise järel tuleb veenduda et lahusesse ei jääks tükke. Kõik peab olema piimjas mass. Muidu need tükid ei lüüsu täielikult. Jälgida, et peale E2 12 lisamist ei inkubeeriks liiga palju. Jälgida, et etanooliga pesteks kogemata sadet kaasa ei võta! Kasvatada baktereid suuremas mahus. Praktiline töö nr. 8: Kontroll-restriktsioon Eesmärk: Lõigata puhastatud plasmiidset DNA’d restriktaasidega, et kontrollida tekkivate DNA fragmentide suuruste järgi, kas puhastatud plasmiid on õige. 5 µl Puhastatud plasmiidne Seda hakkame kontrollima DNA 3,9 µl MQ 1 µl Restriktaasi 10x puhver Luua sobiv keskkond restriktaasi töötamiseks 0,1 µl EcoRI restriktaas Lõikab DNA’d EcoRI saitidest.
13. Kuidas nimetatakse PCR analüüsil temperatuuriga DNA vesiniksidemete lõhkumist?- Denaturatsioon 14. Kuidas nimetatakse PCR analüüsil praimerite seondumise etappi?- annealing 15. Millist kliinilist materjali saab kasutada PCR meetodil haigustekitaja tuvastamiseks?- röga, lima, seemnevedelik (DNA) 16. Millised on etapid haigustekitaja tuvastamiseks kliinilisest materjalist PCR meetodil?-algmaterjalisd DNA eraldamine ja puhastamine; PCR reaktsioon; restriktsioon; tulemuste visualiseerimine geelelektroforeesil 17. Nimeta PCR jaoks vajalikud komponendid?- DNA->praimerid->nukleotiidid->ensüüm Taq-> puhver ja MgCl 18. Mis on praimer ja milleks seda vaja on?- 15-30 nukleotiidi pikk üheahelaline DNA lõik; vajalik komplementaarsuse tõttu saavad seonduda uuritava DNA molekulile ja selle tähistada 19. Mille poolest erineb multiplex PCR tavalisest PCR-ist?-sama PCR ajal kasutatakse mitut
retseptoreid ja seovad vabalt tsirkuleerivaid ag-Ab komplekse. FDC aktiveerivad B-rakke lümfisõlmedes. Follikulaarsed dendriitrakud (FDC) ja dendriitakud (DC) on vaatamata välisele sarnasusele täiesti erineva funktsiooniga rakud: FDC "hoiavad antigeeni (Ab-ag kompleksidena)" oma pinnal B- rakkudele, DC esitlevad (MHC-TCR interaktsioonis) antigeeni T rakkudele. NK rakud-5-10% lümfotsüütidest, suured, granuleeritud. Puudub TCR ja MHC klass I/II restriktsioon. Reageerivad MHC I puudumisele teistel rakkudel. Ei vaja eelnevat aktiveerimist. Sihtmärkraku lüüsimine toimub perforiini abil. Toodavad tsütokiine: IFNgamma. Intratsellulaarsete infektsioonide ja kasvajate vastane kaitse. Mõningane immunoloogiline mälu. Esmaseks ülesandeks on kiiresti ära tunda ja hävitada kasvajarakke ja viirusega infitseeritud rakke. Teiseks tähtsaks funktsiooniks on immuunvastuse kulu regulatsioon tsütokiinide tootmise kaudu (IFNgamma). 6
Tulemuseks on erineva pikkusega DNA lõikude teke. Sarnastel mikroorganismidel on samad praimerite seostumise kohad. RT-PCR (reverse transcription PCR) unikaalseks etapiks on ensüümi pöördtranskriptaasi kasutamine. Pöördtanskriptaas sünteesib uuritava RNA alusel komplementaarse DNA ahela. Peale DNA ahela tekkimist toimub reaktsioon edasi juba nagu klassikaline PCR reaktsioon. RFLP (restriction fragment polymorphism) Kombineeritud meetod: PCR, restriktsioon ja hübridisatsioon. Joonis 3. RFLP Southern blot M. tuberculosis’e DNA-st kasutades IS6110 sondi. Tekitaja kromosomaalse DNA restriktsiooniks on kasutatud restriktsiooniensüümi PvuII.
rakud lüüsuda ning saagis jääb väike, kui aga liiga kaua, siis lisandub saagisele bakteri genoomseid järjestusi ning väheneb renatureeruva plasmiidse DNA kogus iv. hoolikus supernatandi eemaldamisel (tuleb eemaldada võimalikult suur kogus supernatanti, ilma, et sade kaasa tuleks, vastasel juhul kas kaotatakse osa saagisest, või võetakse kaasa jääke) 6. Kontroll-restriktsioon a. Kontroll-restriktsiooni on vaja, et kontrollida, kas saadud plasmiid on õige, see võimaldab ka näha, kas puhastamine oli efektiivne foreesipildilt on näha, kui proovis on lisaks saadud plasmiidile ka näiteks bakteriaalset DNA-d. Valides sobivad restriktaasid, on võimalik kontrollida, kas insert on plasmiidi sisenenud õiget pidi. b. Kasutasime restriktaasi EcoRI, mis lõikab kahelt poolt EcoRV lõikamissaiti,
Kultuurtaimede tekkekolded ehk tsentrumid (1927) Morgan- pärilikkuse kromosoomiteooria (geenid asuvad kromosoomides) 1911 Watson-Crick- desifreerivad DNA molekuli (DNA biheeliks) 1953 3. Geneetika peamised meetodid: Hübridoloogline (Mendelism)- järglaste saamine isenditest, kes erinevad teineteisest kardinaalselt või mitme tunnuse poolest (ristamine) Tsütoloogiline- seisneb raku iseärasuste ja organismi tunnuste vaheliste seoste uurimises Restriktsioon analüüs-geeni struktuuri ja funktsioneerimise molekulaarne analüüs Matemaatiline meetod Mutatsioonimeetod Rekombinatsioonimeetod Populatsioonimeetod Genealoogiline meetod- inimese uurimine 4.Mendelism- mendeli seadustel rajanev pärilikkuse geeniteooria, mille järgi organismi tunnuseid määravad üksteisest sõltumatud ja vabalt kombineeruvad pärilikkustegurid (geenid, mis kanduvad järgmisele põlvkonnale võrdselt mõlema vanema sugurakkude kaudu jam is
seletada) vaatas meie poole, sest fuugimisel sade tekib just sellisel tuubi põhja poolel. Tekib pisike plasmiidse DNA sade, mille pealt eemaldasin supernatanti. 8. Pipeteerisin sademele 200 μl 70% EtOH, fuugisin 5 min jooksul, et vabaneda sooladest, ning eemaldasin jälle sademe pealt etanooli. 9. Asetasin sadet kuivatada, et vabaneda etanooli jääkidest. Pärast suspendeerisin 20 μl MQ-s. 58. Nüüd DNA on puhas kontrolliks. 59. 60. 61.Kontroll-restriktsioon 62. Eesmärgiks on kontrollida kas soovitud DNA järjestus on sisestunud vektorisse nii nagu plaanitud oli. Restriktsiooni analüüsi käigus lõigatakse saadud DNA-d restriktaasiga ja vaadatakse elektroforeesil tekkinud DNA fragmentide suuruste järgi, kas soovitud DNA järjestus on plasmiidi sisestunud. Valitakse selliseid restriktaase, mis lõikavad nii inserdi kui vektori enda seest ning seejuures veel niimodi, et tekuksud erineva pikkusega jupid, mille
Kultuurtaimede tekkekolded ehk tsentrumid (1927) Morgan- pärilikkuse kromosoomiteooria (geenid asuvad kromosoomides) 1911 Watson-Crick- desifreerivad DNA molekuli (DNA biheeliks) 1953 3. Geneetika peamised meetodid: Hübridoloogline (Mendelism)- järglaste saamine isenditest, kes erinevad teineteisest kardinaalselt või mitme tunnuse poolest (ristamine) Tsütoloogiline- seisneb raku iseärasuste ja organismi tunnuste vaheliste seoste uurimises Restriktsioon analüüs-geeni struktuuri ja funktsioneerimise molekulaarne analüüs Matemaatiline meetod Mutatsioonimeetod Rekombinatsioonimeetod Populatsioonimeetod Genealoogiline meetod- inimese uurimine 4.Mendelism- mendeli seadustel rajanev pärilikkuse geeniteooria, mille järgi organismi tunnuseid määravad üksteisest sõltumatud ja vabalt kombineeruvad pärilikkustegurid (geenid, mis kanduvad järgmisele põlvkonnale võrdselt mõlema vanema sugurakkude kaudu
EESTI MAAÜLIKOOL VETERINAARMEDITSIINI JA LOOMAKASVATUSE INSTITUUT LOOMAGENEETIKA I OSA LOENGUKONSPEKT ÕPPEAINES VL.0779 ARETUSÕPETUS ÕPPEVAHEND EMÜ ÜLIÕPILASTELE Koostajad: A. Lüpsik E. Orgmets H. Viinalass TARTU 2009 GENEETIKA KUI TEADUS JA SELLE KOHT BIOLOOGIAS Geneetika on teadus organismide pärilikkusest. Mõiste geneetika tuleneb kreeka keelest ja tähendab sünnisse, põlvnemisse või tekkesse puutuvat. Tänapäeval on geneetika kujunenud bioloogia üheks keskseks haruks, sest ta uurib kõikidel organismidel esinevat nähtust pärilikkust ja selle muutumist ning geneetilise informatsiooni edastamise ja realiseerumise seaduspärasusi organismi elutsükli jooksul. Geneetika arengust sõltuvad elusorganismide soovikohase muutmise, valkude biosünteesi kontrolli ja ka...
4 . Allelic discrimination and identification 5 . Multiplex PCR assays 6 . Diagnostic clinical assays 18.Suure võimsusega genotüpiseerimise võimalused 30 Suure võimsusega genotüpiseerimis tehnikad (high throughpout): Polümeraasipõhised ekstensioonitehnikad (a, b) - Polümeraasipõhised pürosekveneerimistehnikad(c) -Hübridisatsioonipõhised (d) -Alleelspetsiifilised ligatsioonitehnikad -Alleelspetsiifiline nukleaasi restriktsioon 19.Preimplantatsioonilise diagnostika meetodid Standartsed prenattaallse diiagnosttiika ttehniikad Indikatsioonideks: 1. Ema vanus (>35) 2. Eelnev laps kromosomaalse hälbega 3. Perekonnas kromosomaalse hälbe juhud 4. Perekonnas monogeensed haigused 5. Perekonnas neuraaltoru või teised strukturaalsed defektid 6. Hälbed tuvastatud raseduse käigus (kasv) 7. Kokkupuuted riskifaktoritega(sagedased abordid, ravimid) Testimine võii skriiiiniimiine
agregatsiooni tulemusena. Immunoloogiline sünaps toimubki kokkuvõttes järgnevalt: peptiidi seostumine MHC I või II klassi molekuliga - MHC seostumine TCR-iga - T-helperi või T-tsütotoksilise raku aktiveerumine - patogeeni hävitamine või B-lümfotsüüdi aktiveerimine. Veel: *MHC I ja II on polügeensed st iga geen omab mitut varianti ja polümorfsed st populatsioonis esineb mitu varianti igast geenist. *MHC restriktsioon - omavahel vahetavad infot vaid sarnase MHC genotüübiga rakud *MHC klassi restriktsioon - II klassi kaudu esitatakse Ag CD4 rakule e T-helperile. I klassi kaudu esitatakse Ag CD8 rakkudele e T-tsütotoksilisele. *CD4 - T-lümfotsüüdi rakupinna marker (T-helper-rakud) *CD8 - T-lümfotsüüdi rakupinna marker (T-tsütotoksilised-rakud) *Koesobivusmolekulid (MHC) koos rakumarkeritega ja immunoglobuliinidega ja T- ja B-rakkude
restriktsiooni ensüümiga. Siis saab sinna panna sama ensüümiga läbi lõigataud DNA lõigu. Mingi marker, millega saab eristada inserdiga plasmiide, mitte rekombinantsetest (näit. lacZ geen). Milleks cDNA raamatukogu kasutatakse: 1. Isoleerida ja järjestada geene, mis kodeerivad valku 2. Võrrelda eri organismide homoloogseid järjestusi 3. Määrata mRNA hulka ja geeni ekspressiooni taset rakus Restriktsioon analüüs: Geeni struktuuri määramiseks; piiranguks on restriktsiooni saitide olemasolu ja restriktaaside valik. RFLPs on väga oluline analüüs nii kriminalistikas kui fülogeneesi uuringutes (igal indiviididil erinevatel kohtadel restriktsiooni saidid, selle tulemusena ka erinevad lõikude pikkused. Meetod oluliselt odavam kui DNA sekveneerimine. DNA lõikusid saab hübridiseerida nn.Southern blotiga, ilma kloonimata. See näitab homoloogia olemasolu või ka geenikoopiate arvu.
4) Eksonukleaas lagundab valestipaardunud nukleotidiidist kuni MutH valguni (lähim GATC järestus) 5) DNA polümeraas III, kasutades vana ahelat matriitsina, sünteesib tekkinud tühiku täis. Ligaas seob katkeid. (valke üks, kujutatud kaks, vahepeale ei saanud kirjutada) ― G ― GATC ―→ ―MutS ―MutH → ―MutS (+ MutL)-MutS-MutS-MutH ― A ― CTAG ―→ ― MutS ― MutH →―MutS (+ MutL)-MutS-MutS-MutH ― G ―GATC ― ära lõigatud ahela jupp ― sünteesitakse uuesti Restriktsioon - modifikatsiooni süsteem bakterites Restriktsiooniensüümid tunnevad ära kindlaid järjestusi ja lõikavad DNA selle koha pealt lahti → tekivad kaheahelalised katked DNA-s. Vajalikud bakteriofaagide jaoks. Bakterites sama DNA järjestuse tunnevad ära nii restriktaas kui metülaas. Restriktaas ei lõika metüleeritud DNA-d. Restriktaas lagundab metüleerimata DNA (võõra DNA) sptesiifilistest kohtadest. Restriktaas ja metülaasi äratundmiskohad kattuvad
annaabi.ee 
