1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest? Maanualne sekveneerimine seisneb selles, et igasse katseklaasi lisati
· Siit ruumist ei tohi minna protsessi algusesse! · Eelis reaal-aja PCRil! 26. PCR tugevad küljed · Kiire analüüsi aeg 12 tundi (vastus 1 ööpäevaga) · Tundlik avastab 2-20 patogeenirakku proovist · Tootlik võimalik määrata mitu patogeeni ühest proovist · Vähenõudlik transpordi- ja säilitustingimuste suhtes · Täpne tuvastab patogeeni olemasolu, mitte organismi reaktsiooni patogeenile (s.o antikehade teket) · Lisavõimalused genotüpeerimine, DNA sekveneerimine 27. PCR puudused VALEPOSITIIVNE TULEMUS: - ei tee vahet elusal ja surnud mikroorganismil.Kordusanalüüsi liiga varajane võtmine (4 - 6 nädalat peale ravi) - KONTAMINATSIOON Kontaminatsiooni avastamiseks/vältimiseks on kehtestatud ranged kvaliteedinõuded (sisemine,väline kontroll) VALENEGATIIVNE TULEMUS: · Proovimaterjali ebakorrektne võtmine uuritav materjal tuleb võtta põletikukoldest · Inhibiitorid ß-globiin: DNA kvaliteedi kontroll:
4. Geen- DNA molekuli funktsionaalne lõik, mis tavaliselt sisaldab informatsiooni ( mRNA vahendusel) ühe VALGU sünteesiks ( rRNA ja tRNA geenid ei kodeerivalgumolekule 5. DNA denaturatsioon - vesiniksidemete katkemine ja polünukleotiidiahelate lahknemine ( kõrge temp. 85 90 ºC)v tugeva aluse v happe mõjul 6. DNA renaturatsioon e noolutamine - termodenatureerunud DNA aeglasel jahutamisel toimuv ahelate reassotsiatsioon 7. DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse määramine Lämmastikalused jaotatakse põhistruktuuri alusel - puriin (adeniin, guaniin) - pürimidiin(uratsiin, tsütosiin, tümiin - · Nukleiinhappe ahela ehituslikuks aluseks on 3´5´- fosfordiesterside 3` otsas on vaba hüdroksüülrühm Ahel kasvab 5´ 3´suunas, uus nukleotiid lisandub 3´juurde · Omavahel on võimelised paarduma Guannin ja Tsütosiin ning Adeniin ning Tümiin
sekveneeritud genoomi koostu tegemise protsessi giidina. Siiski kogu genoomi jaoks seda kasutada ei saa ja unikaalsete järjestuste jaoks tuleb rakendada de novo lähenemisviisi. De novo genoomi koostu koostamine on ajaliselt ja rahaliselt kulukam, sest eelduseks on suur mate-pair raamatukogu olemasolu . Esmalt on vaja lähteandmeid, mida pakub DNA sekveneerimine. Sekveneerimine (inglise keeles sequencing) tähendab bioloogilises ja biokeemilises kontekstis meetodit, mis võimaldab määrata biopolümeeride (valkude ja nukleiinhapete) primaarstruktuuri. Sekveneerimise tulemiks on sekvents, mis sisaldab endas kindlatest märkidest koosnevat biopolümeeri jada. Tänasel päeval on sekveneerimine jagunenud kahte suunda - esimene (Sangeri ahela terminatsioon) ja järgmine põlvkond (NGS, inglise keeles the next generation sequencing)
16. der Hämoglobin, -e - hemoglobiin 17. der Gerinnungsfaktor, -en - hüübimisfaktor 18. klonen- kloonima 19. die Genkartierung- geeni kaardistus 20. der Mikroorganismus- mikroorganism 21. die Zelle- rakk 22. der Allel- alleel 23. anaerob- anaeroobne 24. das Antigen, -e - antigeen 25. der Startcodon- startkoodon 26. der Stopcodon- stoppkoodon 27. der Klonierungsverktor, -en - kloneerimisvektor 28. der Transformation, -en - transformatsioon 29. die Sequenzierung, -en - sekveneerimine 30. die Synthese- süntees 31. die Labormethod, -en laborimeetod 32. tierische Zelle- loomarakk 33. die Ribosomen- ribosoomid 34. die Morphologie, -n morfoloogia 35. der Embryo- embrüo 36. die Mutagen, -e - mutageen 37. die Klonierung, - en - kloneerimine 38. das Protein- valk 39. abschalten- vigastama 40. die Genome, -en - genoom 41. die Infektionskrankheit, -en - infektsioonihaigus 42. die Hybridisierungsprobe, -en - hübriidproov 43. der Wirkstoff- e - toimeaine 44
2001 a. 90% inimgenoomist sekveneeritud (Celera ja HGSC) 2003 a. inimgenoom on 99% ulatuses sekveneeritud Esmane eesmärk, saada informatsiooni inimese geneetilise pärandi kohta, mis omakorda aitab selgitada erinevate geenide osa ontogeneesis ja patoloogiate tekkes. Projekt algselt planeeritud 15 aastaks, lõpetatud 2 aastat varem! Lisaks suured satelliitprojektid: Uute genoomi uuringutele suunatud tehnoloogiate ja vahendite loomine. *Viie mudelorganismi genoomi sekveneerimine. *HGP eetiliste, õiguslike ja sotsiaalsete tagajärgede analüüs (Ethical, Legal, and Social Implications of Human Genetics Research, ELSI programm). ELSI kujunes 5% üldisest HGP maksumusest. Geneetilise informatsiooni säilitamise privaatsus ja õige kasutamine. *Geneetika meetodite integratsioon meditsiini. *Ühiskonna informeerimine ja teadlikuse tõstmine. *Eetilised probleemid. *Geneetika sobitamine religioosse, filosoofilisse, sotsioökonoomilisse tausta
4 kb.). Intronid moodustavad 54% genoomist. Retroposonid puuduvad. *Aspergillus nidulans, Neurospora grassa, Tetrahymena (nukleaarne dimorfism!) ja mitmete patogeenide projektid Metazoa: *Hulkraksete organismide genoomiprojektid keskenduvad valdavalt:Arengulistele aspektidele. Haigustekke põhjuste selgitamisele. On juhitud kolmest motivatsioonist: Alusuuringud, Kommertsiaalsed huvid, Meditsiinikesksed huvid Caenorhabditis elegans: Ülitähtis mudelorganism arengubioloogias. Genoomi sekveneerimine lõpetatud 1999 a. Genoom ca 100Mb ja 20 000 geeni (1000 RNA kodeerivad). 9000 kohta eksperimentaalsed tõestused, ülejäänud ennustatud in silico. Kodeeriv osa 27%, intronid 26%. 32% kodeerivast osast sarnane inimese geenidega, 70% inimgeenidest sarnane C.elegansiomadega. Geeni keskmine pikkus 5 kb, suur osa koondunud operonidesse. Otsene HGP eelkäija (metodoloogia). Drosophila melanogaster Genoom 165 Mb (6 kromosoomi). 13601 valke kodeerivat geeni s.t. üks iga 9 kb. kohta
7) ribosoomi siseneb kolmas tRNA; 8) kahe kõrvuti asetseva tRNA molekuli otstes olevate aminohapete vahel sünteesitakse peptiidside; 9) … 10) Stoppkoodon -> sünteesitud valk vabaneb, eralduvad ribosoomi alamüksused ja mRNA 2. Geeni struktuur (promootor, RNA sünteesipiirkond, terminaator) ja geneetilise info edastamine. Intronid, eksonid, RNA splaising, pöördtranskriptsioon ja pöördtranskriptaas (õp lk 37, 40), genoomipank (lk 39). DNA sekveneerimine – mõiste. Vt esitlust Transkriptsioon (geeni struktuur) ja õpikust lk 40 ning üldist, kogu materjali esitlust (Rakendusbioloogia, lõpuosa slaidid) + vihikist tunni materjalid. GEENI STRUKTUUR: transkriptsiooni alguses kinnitub ensüüm DNA-polümeraas geeni algusossa. Seal paikneb kindla järjestuse ja struktuuriga DNA lõik (promootor). Kui ensüüm kinnitunud, algab transkriptsioon. Promootorpiirkonale järgneb RNA sünteesipiirkond. See
See RNA tüüp osaleb valgusünteesis. X 6. Loe artikkel ja vasta küsimustele. http://tartu.postimees.ee/315748/aparaat-loeb-otsast-lopuni-kogu-dna a) Mida teeb genoomi sekveneerija? Uus tehnoloogia annab infot inimese pärilikkusaine kohta algusest kuni lõpuni ehk järjestab kõik kolm miljardit nukleotiidi, ja seda vaid nädalaga. Seda on vaja, et kiiremini haigeid ravida b)Miks on vaja genoome sekveneerida? . Genoomi sekveneerimine tähendab genoomi nukleotiidse järjestuse määramist ehk kui teadlased seda järjestust teavad, teavad nad kogu infot ühe indiviidi pärilikkuse kohta. Leia internetist võimalikult palju näiteid liikide kohta, kelle genoom on praeguseks sekveneeritud.
Vaidlused: GMO poolt või vastu? Geenitehnoloogia GMO mutantsed loomad eetika küsimus Geenitehnoloogia Eesmärgid: * süvendada teadmisi geeni ekspressiooni mehhanismidest * täiustada tehnoloogiat, võita vähk ja teised geneetilised haigused (geeniteraapia) * täiustada tehnoloogiat, et luua inimesele kasulikke GMO-sid Meetodid: * geenide rekombinatsioon plasmiidsete vektoritega * geenide rekombinatsioon viirusvektoritega * DNA, RNA analüüsi meetodid: PCR, sekveneerimine, geel elektroforees Plasmiidid geenide vektorid Looduses kanduvad üle ühest bakterist teise geenide horisontaalne ülekanne Kui võõrad geenid plasmiidi DNA-sse sisestada lähevad üle teise bakterisse koos plasmiidiga Inimese kasvuhormooni geen GH1 (growth hormone) E. coli plasmiidi Kui GH1 muteerunud, ei tooda hüpofüüs kasvuhormooni kasv peatub lapseeas täiskasvanul kääbuskasv
4 kb.). Intronid moodustavad 54% genoomist. Retroposonid puuduvad, Aspergillus nidulans, Neurospora grassa, Tetrahymena (nukleaarne dimorfism!) ja mitmete patogeenide projektid. Hulkraksete organismide genoomiprojektid keskenduvad valdavalt: Arengulistele aspektidele, Haigustekke põhjuste selgitamisele, On juhitud kolmest motivatsioonist: Alusuuringud, Kommertsiaalsed huvid, Meditsiinikesksed huvid. Caenorhabditis elegans genoom: Ülitähtis mudelorganism arengubioloogias. Genoomi sekveneerimine lõpetatud 1999 a, Genoom ca 100Mb ja 20 000 geeni (1000 RNA kodeerivad). 9000 kohta eksperimentaalsed tõestused, ülejäänud ennustatud in silico. Kodeeriv osa 27%, intronid 26%. 32% kodeerivast osast sarnane inimese geenidega, 70% inimgeenidest sarnane C.elegansi omadega. Geeni keskmine pikkus 5 kb, suur osa koondunud operonidesse, Otsene HGP eelkäija (metodoloogia). Drosophila melanogaster genoom: Lõplikult sekveneeritud aastal 2002, Genoom 165 Mb (6
Geenivaigistus- geeni avaldumise takistamine epigeneetiliste mehhanismidega transkriptsiooni või translatsiooni tasemel geeni struktuuri rikkumata. Kimäär- organism, kelle keha koosneb erineva geneetilise päritoluga rakkudest. 11. Geneetikas enimuuritud liigid (eri organismirühmadest), nende valiku kriteeriumid. Kõige rohkem on uuritud äädikakärbseid ja hiiri, kuna nende areng on kiire, siis saadakse vähese ajaga võimalikult palju katsetusi teha. 12. DNA sekveneerimine (järjestuse määramine) – kuidas toimub, mida tarvis? Desoksüribonukleotiid – DNA kui polümeeri monomeer, koosneb lämmastikalusest (A, T, C või G), monosahhariidist (desoksüriboos) ja fosforhappejäägist. Didesoksüribonukleotiid – eelmisest ühe hapnikuaatomi võrra vaesem ühend. Komplementaarsus – lämmastikaluste kindel üksteisele vastavus. • Uuritav DNA • Desoksüribonukleotiidid • Didesoksüribonukleotiidid (ddA,ddT,ddC,ddG)
Geeliks kasutatakse agarist puhastatud suhkrut agaroosi. Agaroosil on poorjas struktuur mis takistab DNA fragmentide vaba liikumist ja seega lahutab DNA fragmendid vastavalt nende suurusele, st väiksemad molekulid liiguvad kiiremini ja jõuavad kaugemale kui suuremad. Pärast geel eletroforeesi kasutamist saab dna fragmente: PCR-iga paljundamine, kloneerimine vektoritesse, geeni-raamatukogus säilitamine, mikrokiibi analüüs, järjestamine ehk sekveneerimine 22. Mis on Southern, Western, Northern, Eastern Blot ja Dotplot? Milleks neid kasutatakse ja millised on meetodite erinevused? Ühe molekuliga tuvastatakse teist, molekul kantakse üle kandjale. Southern DNA geenivariandi tuvastamine ja pikkuse määramine. Western spetsiifiliste valkude tuvastamine kompleksproovides. Northern kindla RNA järjestuse tuvastamiseks kompleksproovides. Eastern kindlate posttranslatsiooniliste valkudes aset leidnud muutuste leidmiseks
- Replikatsioon: rakutuumas toimuv DNA süntees, mille tulemusena saadakse DNA molekulist kaks ühesuguse nukleotiidse järjestusega DNA molekuli. 2. Geeni struktuur (promootor, RNA sünteesipiirkond, terminaator) ja geneetilise info edastamine. Intronid, eksonid, RNA splaising, pöördtranskriptsioon ja pöördtranskriptaas (õp lk 37, 40), genoomipank (lk 39). DNA sekveneerimine – mõiste. Vt esitlust Transkriptsioon (geeni struktuur) ja õpikust lk 40 ning üldist, kogu materjali esitlust (Rakendusbioloogia, lõpuosa slaidid) + vihikist tunni materjalid. 3. Geenivektor, selle loomise protsess, ligaas, restriktaas (ja tekkivad „kleepuvad otsad"), rekombinantne DNA. Õp lk 37 – 39. Plasmiid. Viirusvektor, plasmiidne geenivektor. - õp lk 38. 4
tähtsaks ka antropoloogias ja bioloogias. 8. Olulisemad faktid inimese evolutsiooni ja rännete rekonstrueerimisest mtDNA ja Y kromosoomi uurimise alusel? Molekulaarse evolutsiooni andmeil elas tänapäeva inimese eellane Aafrikas 100 000 200 000 a tagasi. Aafrikast väljaränne algas 100 000 a tagasi. Ränne Euroopasse ~40 000 a tagasi. kaasaegne mitokondriaalne Eeva elas ~130 000 a tagasi. Y kromosoomi DNA sekveneerimine (pärilikkus isaliini pidi) näitab, et Y kromosoomne Aadam elas Aafrikas ~60 000 a tagasi. kaasaegne inimene on evol-lt noor 9. Mis on klaad? Millisel eesmärgil kasutatakse evolutsioonibioloogias klaadide meetodit? - Klaad on taksonoomiline rühm, mis hõlmab endas viimase ühise eellase (liigi) ja kõiki selle eellase järeltulijaid. Klassifikatsiooniks kasutatakse erinevaid meetodeid traditsiooniline, kladistlik analüüs jt.,
jäävad vaid ühest otsast kinnitatud DNA üksikahelad. Neile lisatakse sekveneerimispraimerid mis on komplementaarsed DNA otsas olevate oligonukleotiididega. Nüüd on DNA valmis sekveneerimiseks. 18. Mille jaoks kasutatakse järgmise põlvkonna (Sangeri meetod on siin esimene põlvkond) sekveneerimist? Too näide mõnest projektist. Uue põlvkonna sekveneerimistehnoloogiaid on kasutatud erinevates genoomika uurimisvaldkondades, nagu nt kogu genoomi ja transkriptoomi sekveneerimine, transkriptsioonifaktorite seondumissaitide avastamine, mittekodeeriva RNA ekspressiooniprofiili määramine ja suunatud sekveneerimine. Näiteks Human Genome Project (HGP). 19. Uurimaks genotüübi seost haigusega, hinnatakse logistilise regressiooni mudel haiguse olemasolu näitavale tunnusele (1-haige, 0-ei ole haige). Mida iseloomustab genotüübitunnusele (0, 1 või 2 efektialleeli) vastava parameetri hinnang? Kuidas mõjutab genotüüp haiguse
komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist) o Geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon) membraanile nii , et nad oleksid üksikahelad. o Meid huvitav järjestus märgistatakse radioaktiivselt vm meetodil o Lastakse üksikahelatel omavahel paarduda o Mittepaardunud proov pestakse maha ja NA asukoht tuvastatakse märgise järgi · Sekveneerimine järjestuse määramine o Praegu kasutusel ensümaatiline meetod, kus DNA polümeraas lisab vahel ahela sünteesi käigus dNTP asemel didesoksünukleotiidi, mis lõpetab antud ahela pikenemise. Märgistatud DNA ahelda geel-elektrofreesis pikkuse järgi. Geenikogud 1. Genoomse DNA kogud 2. cDNA kogud (eri liigid ja koed) ainult eksoneid sisaldav, annab infot geenide avaldumise kohta. PCR(polümeraasi ahelreaktsioon
Proovil on küljes radioaktiivne signaal, mis näitab tulemust. Northern blot- testib, kas mRNA on taimes olemas ja et transkriptsioon toimib korrektselt. mRNA eraldatatakse, kantakse filterpaberile. Radioaktiivse sildiga DNA proov seob mRNA külge ja on nähtav. Western blot- testib valgu olemasolu, valgu proovid eraldatakse transgeensetest taimedest ja kantakse membraanile. Prooviks on antikehad, mis tunnevad ära eesmärk valgu. DNA sekveneerimine- võimaldab kindlaks teha konkreetse DNA järjestuse. Promootor- Nende abil saab reguleerida geeni ekspressiooni. Konstitutiivne promooter ekspressioon toimub kogu aeg igas taime osas. Valikuline promooter ekspressioon toimub ainult teatud taime arengu faasides, teatud taime kudedes või sõltub ekspressioon välistest teguritest. Tugevad ja nõrgad promootorid mõjutab ekspressiooni kogust (valgu hulka)
Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2013 a) Nimi: YAGB41 Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin
Valik piimavalkude pärilike tüüpide järgi võimaldab parandada piima tehnoloogilisi omadusi EESTIS Genofondiuuringud (veised, hobused, lambad) Geneetiline identifitseerimine ja põlvnemisandmete õigsuse kontrollimine Veised, hobused, koerad (DNA msat) Sigade stressiresistentsus (PCR-RFLP) BLAD (PCR-RFLP) Piimavalkude pärilikud tüübid (CSN1, CSN2 ja CSN3, LGB, PCR-RFLP) CVM (PCR-RFLP) Skreipi lammastel (sekveneerimine) Põlvnemisandmete õigsuse kontrollimine Kohustuslik aretuses kasutatavatele isasloomadele (veised, hobused) Emasloomal on mitu seemendust või paaritust milline seemendus/paaritus oli tiinestav Kahtlus põlvnemisandmete õigsuses (omanik ise või ostja) Loomad, kellel on probleemid märgistusega Embrüosiirdevasikad põlvnemine geneetilistest vanematest Kloonvasikad identsus rakuliiniga Koerte puhul duubelpaaritused
DNA ahelas (kromosomaalse DNA mudel). Tetrsiaarstruktuure esineb ka tRNA'l ja rRNA'l b) DNA denaturatsioon/renaturatsioon DNA denaturatsioon on biheeliksi lahtikeerdumine. Struktuuri võivad lõhkuda ekstremaalne temperatuur, keskkonna pH (3 või 10) ja ioonjõud ning tugevad vesiniksidemete moodustajad. DNA renaturatsioon korrastatud struktuuri taastumine. c) DNA sekveneerimine DNA primaarstruktuuri ehk nukleotiidide järjestuse määramine. Meetodid: ahela katkestamise meetod, alus-spetsiifiline keemiline lõikamine, geel-sekveneerimine, automaatne DNA sekveneerimine d) PCR protsess (polümeraasahelreaktsioon) kontrollitud temperatuuriprogrammiga tsükliline protsess, mille käigus paljundatakse soovitud DNA järjestust. DNA polümeraas kopeerib üheahelalise DNA in vitro tingimustes. Vajalik on nelja
Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2012 a) Nimi: Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin
e) RNA suhkrujääk sisaldab täiendavat hüdroksüülrühma, mida DNA pentoos ei sisalda 12. Milline on nn. kolmanda põlvkonna sekvenerimismeetodite põhiline erinevus esimese ja teise põlvkonna meetoditest: a) Sekveneeritavat DNA-d ei amplifitseerita vaid järjestatakse otse reaal-ajas b) DNA sekveneerimiseks tekitatakse ensümaatiliselt erineva pikkusega fluorestsentsmärgisega fragmentide jadad, mis lahutatakse elektroforeesil c) DNA sekveneerimine toimub kloonide kaupa d) Kogu sekveneeritav DNA purustatakse, saadud fragmentidele liidetakse praimerid ning amplifitseeritakse sild- amplifikatsioonil kiibi pinnal 13. Restriktaas HindIII lõikab DNA-d järgmisest äratundmiskohast 5'AAGCTT3'. HindIII on seega: a) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 3' üleulatuva otsa b) Antud ensüüm annab DNA lõikamisel tömpotsa c) Tüüp 2 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa
· Arvestada, et reinfektsioonil IgM tiiter ei tõuse · ja teisi ebamugavusi 7. Loetle PCR eelised. Kiire (analüüsi aeg 2 - 12h) tundlik (avastab 2 10 patogeeni rakku proovist) tootlik (võimaldab määrata mitu patogeeni ühest proovist) vähenõudlik (transpordi- ja säilitustingimuste suhtes) täpne (tuvastab patogeeni olemasolu, mitte organismi reaktsiooni sellele) lisavõimalused (genotüpeerimine, sekveneerimine) 8. Loetle PCR puudused mittekvantitatiivne (tavaline PCR puhul) saastamisoht (võib anda valepositiivse tulemuse) ei tuvasta resistentsust antibiootikumidele ei tee vahet elusal ja surnud mikroobil hind (aparatuur, labor, patent) 9. Millised on PCR-diagnostikalabori organisatsiooni põhiprintsiibid? 1. 1. ruumis eraldatakse proovist DNA. See on bioohu ruum, sest töötajad võivad sealt ise nakkuse saada
1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. 43. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. vt. konspekt (05.11) 44. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest?
muutlikkuse põhjuste kohta. Molekulaargeneetika peerioodil selgitati välja geneetilise informatsiooni säilimine, muutumine, ümberkombineerumine ja realiseerumine organismide individuaalses arengus. Insenerigeneetika viis biotehnoloogia väljakujunemisele, praktiliste rakendusteni meditsiinis ja põllumajanduses. Genoomide mass-sekveneerimine on muutnud meie arusaamu elusloodusest ja elu olemusest. Nüüdisaja teadus on jõudnud geneetika ajajärku. 6. Pärilikkus, päritavus, pärandumine, kreatsionism Pärilikkus- järglaste sarnasus vanematega, tunnuste ülekanne vanematelt järglastele. Päritavus- päriliku muutlikkuse määr, geneetilise muutlikkuse suhtosa
AB gentamütsiini kasutatakse bakterhaiguste ravimiseks. Perekond Salinispora (lähedane Micromonosporaga) Morfoloogia: · Substraadimütseel, sellel sileda pinnaga üksikud või kobarates spoorid (koniidid). Oranzhikalt pigmenteerunud. Elupaik looduses: · merebakterid. Osa liike elab käsnadega koos. Biotehnoloogiline rakendus: · toodavad kasvajavastaseid antibiootilisi aineid. Salinispora tropica sekveneerimine lõpetati 2007 aastal. Avastati palju geeniklastreid, mis vastutavad sekundaarmetaboliitide sünteesi eest. Perekond Actinoplanes · Elupaik looduses: Looduses tavalised mullabakterid, isoleeritud ka veest. · Zoospoorid on liikuvad ja ujuvad veepinnale, kus koloniseerivad substraadi (tolmutera, karv) mõne päevaga. Raske isoleerida ja kultiveerida. · Oluline tunnus määramisel on ka mütseeli värvus, mis varieerub sõltuvalt liigist suuresti
olekus. Põhimõte seisneb lähedal asuvate lookuste paaride sageduse kindlaksmääramisel nende ristsidumisega. Toimub kolme sammuliselt: 1. Ristsidumine – formaldehüüdi lisamisel üksteisele lähedal asuvad kromatiini segmendid ristseotakse. DNA segmendid ristseotakse valkudega ja valgud ristseotakse üksteisega. 2. Kromatiin fragmenteeritakse ja ligeeritakse 3. DNA puhastatakse ja analüüsitakse (qPCR, sekveneerimine) 3C: one by one analüüs – kasutab 3C lookus-spetsiifilisi praimereid. Tulemus nt interaktsiooniprofiil valitud geenist näitab promootori ja ümbritseva kromatiini interaktsiooni. 4C: tsirkulariseeritud 3C, one by all analüüs – üle genoomne interaktsiooniprofiil üksikule lookusele. 5C: many by many analüüs – analüüsib interaktsioone kahe suurema lookuste kogumi vahel, nt promootorite kogumi ja distaalsete regulatoorsete elementide kogumi vahel
kloonbakterite kogumid 4)Kolooniad eraldatakse. Siiratud fragment(DNA) paljuneb koos bakteritega, saadakse DNA-pank. 47. Mis on cDNA? Kodeeriv DNA e eksonid. Paiknevad eukarüootide geenis vaheldumisis intronite e mittekodeerivate aladega. Neis oleva nukleotiidijärjestuse alusel järjestat ribosoomis aminohapped sünteesitavasse valgumolekuli. In genoomis on cDNAd ainult 2%. 48. DNA sekveneerimise põhimõte. Sekveneerimine on DNA nukleotiidse järjestuse kindlakstegemine. 49. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest? 50. Polümeraasi ahelreaktsioon. Kindla DNA lõigu kiireks paljundamiseks. Paljundada saab iga DNA lõiku, mille otsjärjestused on teada ning mille järgi on sünteesitud lühikesed 1-ahelalised DNA-lõigud(praimerid). Protsess on automatiseeritud vastava aparaadi, termotsükleri ja sellega ühendatud arvuti abil
47. Süsteemibioloogia. Bioloogia haru, mis püüab molekulaar-, raku-, organismi- ja teisi tasandeid integreerides mõista, kuidas bioloogilised süsteemid toimivad. 48. Funktsionaalne genoomika. Molekulaarbioloogia haru, mis püüab genoomide sekveneerimisest saadud andmeid geenide ja valkude funktsioonide ning interaktsioonide kohta muuta kasutatavateks. 49. Käitumisgenoomika. Uurib geneetika rolli loomade ja inimeste käitumises. 50. DNA sekveneerimine. Ehk järjendamine tähendab protsessi, mille käigus selgitatakse DNA nukleotiidne järjestus. DNA didesoksürinonukleotiidide meetod. 51. PCR reaktsioon. Ehk polümeraasi ahelreaktsioon. On meetod DNA või RNA järjestuse amplifikatsiooniks ehk paljundamiseks. 52. Kontiigid. DNA kattuvad alad või kogum kattuvaid kloone, mille põhjal saab moodustada DNA pidevjärjestuse või konkreetse kromosoomipiirkonna füüsilise kaardi. 53. Fluorestsentsmärgistus
1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. DNA sekveneerimine. DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. Polümeraasi ahelreaktsioon. PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks
· Thermoplasma liikidel on membraanides omapärased glükolipiidid (lipopolüsahhariididele sarnased molekulid), mis annavad neile vastupidavuse kõrgele temperatuurile ja madalale pHle. Need glükolipiidid koosnevad tetraeeterlipiidist, millega on seotud mannoosi ja glükoosi jäägid. Genoom on v. väike. Tal on leitud ka histoonid ja aktiinitaoline valk, mis agregeerub rakuskeleti niitideks. Genoomi sekveneerimine lubas oletada, et Thermoplasma ja Sulfolobus solfataricuse vahel on nähtavasti toimunud palju horisontaalset ´geenivahetust. Mõlemad elavad sarnases keskkonnas! · Aastal 2000 kirjeldati Ferroplasma acidophilum, mis on kestata punguv mükoplasmalaadne arhe. Ei ole nii termofiilne, kui Thermoplasma. Membraanis dieeterlipiidid. Oksüdeerib rauda ja mangaani hapnikuga. Kemolitoautotroof. · Arhede evolutsioonipuul hargnevad hästi juure lähedalt.
Geenide kloonimise abil saab luua suurt hulka geenide või DNA lõikude koopiaid. Seda kasutatakse Geenianalüüsiks a)geeni funktsiooni välja selgitamine b)geeni omaduste hindamine (nt suurus, kudede jaotus), c) jälgida mutatsioonide toimet geeni toimimisele biofarmatseutikaks ehk inimesele vajalike valkude süntees, nt insuliin või kasvuhormoon geeniteraapiaks geneetiliste haiguste ravimiseks 44. DNA sekveneerimise põhimõte. DNA sekveneerimine ehk järjestusanalüüs on monomeeride (nukleotiidide, aminohapete) järjestuse kindlaksmääramine DNA, RNA või valkude molekulides. See annab tulemuseks märkidest koosneva tõlgenduse, mida nimetatakse sekventsiks, ja kirjeldab suuremat osa sekveneeritud molekulist. See on tänapäeva bioteaduses üks olulisemaid tehnikaid. 45. Polümeraasi ahelreaktsioon võimaldab lühikese ajaga paljundada spetsiifilist DNA-d in vitro (katseklaasis) lähtudes üliväikesest DNA kogusest
· Multigene disorders Geneetiliste haiguste diagnostika- probleemid ja võimalused Geneetilise diagnostika eesmärk Pakkuda infot molekulaartasemel mis ühendades patsiendi sümptomite, kliinilise pildi ja ajalooga võimaldaksid täpsemat ja tundlikumat haiguse diagnoosi ja võimalusel vihjeid efektiivsete ravivõtete kohta Testid · Amplifikatsiooni põhised · Hübridisatsioonil baseeruvad · Elektroforeetilised meetodid · Array/kiibi tehnoloogiad · Sekveneerimine Võimalused · Preimplatatsiooni ja loote uuringutel võimalus vältida raskeid geneetilis haigusi · Presümptomaatilise diagnostika abil riskigruppidel võimalik käitumist muuta · Pere planeerimisel võimalik geneetilist tausta arvesse võtta Euroopa ja USA strateegiad GMO taimede osas erinevused ja saavutused Ohutus toode peab olema ohutu, ega mitte ohustama inimeste või loomade tervist, samuti mitte ohustama keskkonda. Kõik GMOd peavad olema vähemalt sama ohutud kui
Leeuwenhoek: Leiutas üheläätselise mirkoskoobi. Vaatles esimesena algloomi, baktereid, hallitusi, pärme ja vetikaid. Bdest spiiroheedid, pulkbakterid, kokid ja filamentsed bd. Uuris happe ja kuumuse mõjuvust bde liikumisele. Vinogradski:Kirjeldas esimesena autotroofe, kemolitoautotroofset toitumistüüpi. Avastas esimesed mittesümbiontsed N2 fiktseerovad bd. Kasutas rikaskultuuride meetodit bde eraldamiseks loodusest. Vinogradski kolonn. Fleming:antibiootikumide avastaja. Woese:RNAde sekveneerimine ja kasutamine fülogeneesi uurimisel. Arhede domeeni looja. Bakterite nimetuste tuletamine. Nimetustes sisalduv info. Bde nimetused koosnevad perekonnanimest ja liigiepiteedist. Ladina ja kreeka keel. Sageli tuletatakse nimi avastaja või kuulsa bioloogi nimest.Nimes info tema kuju, elupaiga, biokeemia, värvuse ja ainevahetuse kohta. Bakterite kirjeldamisel ja määramisel kasutatavad ehituslikud (morfoloogilised) ja mitteehituslikud tunnused. Oska nimetada kümme tunnust kummastki.
(NH) vahel spetsiifilise nukleiinhapete jarjetusega piirkonnas (iga ensuumi jaoks eri NH jarjestus) Nukleiinhappeline hubridiseerimine -tanu DNA, RNA molekulide voimele siduda vabasid Nhid on voimalik teataud NH-jarjestusega vabade margistatud DNAfragmentide abil avastada komplementaarse jarjestusega loike uuritavas DNA voi RNA molekulis. DNA kloonimine -uhe DNA fragmendi alusel on voimalik sunteesida sama fragmendi miljoneid koopiaid. DNA fragmendi nukleotiidide jarjestuse maaramine (sekveneerimine-ingl k. sequencing), mis voimaldab maaratleda geenide NH-lise koostise, nende tapse asukoha kromosoomis, aga ka geeni poolt kodeeritavate valkude aminohappelise koostise. Insenergeneetika -geenide DNA jarjestuse muutmine ja muudetud geenide voi uute geenide viimine rakkudesse ja organismi. Organismide geneetiline modifitseerimine. Restriktsiooni-ehk piiravad ensuumid 1970. a. avastati, et paljudel bakteritel on omadus
© MIHKEL HEINMAA, kevad 2010 4. Bioloogilised funktsioonid: katalüütiline (ribonukleaas); regulatoorne (insuliin); transport (hemoglobiin); struktuurne (kollageen); reserv (kaseiin); kontraktsioon (aktiin); kaitse (immunoglobuliinid); adaptor (AKAP-valgud); eksootilised funktsioonid (antifriisvalgud kalades). 5. Valgu sekveneerimine 1. aste. Ahelate lahutamine mitme polüpeptiidahela korral (ntks ekstremaalse pH'ga) 2. aste. Disulfiidsidemete katkestamine (ntks performaadiga oksüdeerimisel) 3. aste. N- ja C- terminaalsete jääkide määramine. 4. aste. Ahela fragmenteerimine ja iga fragmedi järjestuse määramine. 5. aste. 4. astme kordamine erinevate lõikeprotseduuridega, et saada erinevaid fragmente. 6. aste
(diameeter 320 nm) core-struktuuri. - Core-struktuur ei dissotseeru ja DNA ei vabanemist ja transporti tuuma ei toimu. Seega on mimiviiruse replikatsioon täielikult tsütoplasmaatiline. Seda võimaldab virionis olev RNA polümeraas. Kui viirus vajab tuumseid faktoried, siis transporditakse need tuumast välja. - Geeniekspressioonis on selgesti eristatavad varajane, vahepealne ja hiline faas. Mass- sekveneerimine on näidanud, et varajase promooteri konsensus on AAAATTGA. Kokku ekspresseeritakse ca 1000 valku - Viiruse DNA replikatsioon käivitab sfäärilise core-struktuuri dissotseerumise. Moodustuvad koonusja struktuuriga “viiruse vabrikud”, mille arv vastab alguses ligikaudselt rakku sisenenud virionide arvule. Hilisemas infektsioonis võivad “vabrikud” ka omavahel liituda. - Virionide moodustamine toimub “vabrikutes”
Kontraktsioon aktiin, müosiin Kaitse (antikehadena) immunoglobuliinid Adaptor e toes AKAP-valgud (siduvad valgud, proteiinkinaasid) Eksootilised funktsioonid antifriisvalgud kalades Valkude analüüsi meetodid. Valkude aminohappelise järjestuse määramiseks kasutatava sekveneerimise strateegia ja etapid. Valgu aminohappejärjestust saab määrata kahel viisil: - Valgu reaalne sekveneerimine - Valku kodeeriva geeni DNA sekveneerimine ning selle põhjal valgu järjestuse tuletamine. Valgusekveneerimine koosneb 7 etapist: 1) Mitme polüpeptiidahela korral lahutada ahelad 2) Katkestada (taandada või oksüdeerida) disulfiidsidemed 3) Määrata N ja C terminaalsed jäägid 4) Lõigata iga ahel lühemaks fragmentideks ja määrata iga fragmendi järjestus 5) Korrata 4
Väga laialt on levinud rakubioloogias nn. immuunfluorestsentsi meetod, mis pôhineb fluorestseeruvate värvainetega konjugeeritud antikehade kasutamisele. Enamlevinud fluorokroomidena antikehade märgistamiseks kasutatakse FITC (fluorestsiinisotiotsüanaat), TRITC (tetrametüülrodamiin isotiotsüanaat ) PE (fükoerütriin) jt. Fluorestsentsmikroskoobis on valgusallikaks elavhôbedalamp, mis annab lühilainelist kiirgust (paljudel lainepikkustel). 51. Täispikkade genoomide sekveneerimine, miks see on oluline? Et, mõista erinevate geenide omadusi.??! 52. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? Lihtsalt 53. Mille poolest erineb transgeense looma ja transgeense taime konstrueerimine? Taime rakkudel on teatud kemikaalide mõjul võime dedifferentseeruda. Mis tõttu võib ükskõik millisest taime osast saada uue organismi. Loomade puhul nii teha (veel) ei saa. 54. Mille poolest erineb organismide kloneerimine DNA kloneerimisest?
uute ravimite väljatöötamiseks, kuna ta sarnaneb väga inimesega nii geneetiliselt, füsioloogiliselt kui ka ainevahetuslikult. Ta on oluline ka primaatide evolutsiooni mõistmisel. Koduhiir (Mus musculus) on inimesele lähedane. Geenijärjestused, mis kodeerivad elutähtsate bioloogiliste protsesside eest vastutavaid valke, on inimeses ja hiires väga sarnased. Seepärast on hiir kasulik arengubioloogilistes, geneetilistes ja immunoloogilistes uuringutes. Hiire genoomi sekveneerimine aitab mõista ka inimhaigusi ja töötada välja ravistrateegiaid, mille testimine poleks lubatud inimese peal Rottide (Rattus norvegicus) kasutamine mudelorganismina on väga levinud, mistõttu on kogunenud suur hulk andmeid, mille põhjal uurida inimese tervist ja haigusi[38]. Aastakümneid on rotte kasutatud ravimite testimiseks. Väga palju teadmistest vähki tekitavate molekulide kohta on saadud just uuringutest rottidega.[2] 61
piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3’ otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Näitab mis järjestus DNA-s on. DNA polümeraas pikendab olemasolevat DNA ahelat, kuid selleks et DNA polümeraas saaks DNA- le kinnituda on vaja RNA molekule (praimerid), mis on komplementaarsed DNA molekuliga. Praimeri abil toimub ka sekveneerimine, sest siis on erinevate DNA molekulide algused samad. Milline meetod on reaalaja PCR? Reaktsiooni segusse pannakse täiendav praimer, mis jääb polümeerile ette. Selle küljes on floresents. Kui polümeraas teeb praimeri katki tekib floresentsi signaal, mille järgi saab teada et toimub DNA süntees. DNA küljes on floresents, kui tuleb polümeraas lükkab ta floresentsid lahti ja tekib värv. Praimerite vahel on kolmas praimer mille otsad on keemiliselt plokeeritud, ja selle
piirkonnas (iga ensüümi jaoks eri NH järjestus) (2) Nukleiinhappeline hübridiseerimine- tänu DNA, RNA molekulide vôimele siduda vabasid NHid on vôimalik tetaud NH-järjestusega vabade märgistatud DNA-fragmentide abil avastada komplementaarse järjestusega lôike uuritavas DNA vôi RNA molekulis. (3) DNA kloonimine- ühe DNA fragmendi alusel on vôimalik sünteesida sama fragmendi miljoneid koopiaid. (4) DNA fragmendi nukleotiidide järjestuse määramine (sekveneerimine- ingl k. sequencing), mis vôimaldab määratleda geenide NH-lise koostise, nende täpse asukoha kromosoomis, aga ka geeni poolt kodeeritavate valkude aminohappelise koostise. (5) Insenergeneetika- geenide DNA järjestuse muutmine ja muudetud geenide vôi uute geenide viimine rakkudesse ja organismi. Organismide geneetiline modifitseerimine. 3. Mis on restriktaasid? Restriktaasid (sait-spetsiifilised endonukleaasid) on ensüümid, mis lõikavad DNA-d
(genoomi repressiooni/aktivatsiooni muster). Genoomi aktiivsus ontogeneesis: Enamus genoomi DNA-st ei kodeeri valku (junk DNA;~98.5% inimesel). Merisiilikul on näiteks igal ajahetkel vaid ~6% unikaalsetest järjestustest transkriptsioonil. Diferentseerunud kudedes vaid 0,8% genoomist ekspresseeritakse. Ega me veel praegu ei tea "junk" DNA rolli, võimalik et see ei ole ainult kasutu. Molekulaargeneetika meetodid (I) 1. Amplifitseerimine (Polümeraasi ahela reaktsioon -PCR) 2. DNA sekveneerimine ehk järjestamine 3. DNA Fingerprinting 4. Ühe nukleotiidi polümorfism (SNP) Kuidas PCR töötab: DNA koos amplifitseerimist vajava lõiguga ja kaks sünteetilist oligonukleotiidist praimerit, mis on komplementaarsed lõigu algustega. Denatureerime DNA kaksikahela üheahelaliseks kuumutades 94°C. Kiiresti jahutada DNA (37-65°C) ja liita praimerid soovitava lõigu otsa külge (komplementaarne otsa nukleotiidiga). Nüüd ahela
Nüüd katseklaasis kasutades pöördtranskriptaasi sünteesime sellele mRNA'le ühe kaheahelalise DNA koopia. Seda koopiat kutsutakse sidiDNA'ks (?). Ja kõik jätkub endisel viisil. 05/11/09 Erinevad bakterid sünteesivad erinevaid restriktaase, erinevatel restriktaasidel on järjestusspetsiifika. Kui tahame kindlat lõiku DNA'st, siis valime sellise restriktaasi, mis lõikab katki sobivaid järjestusi. Kuidas me teame DNA nukleotiidset järjestust? Sequencing sekveneerimine. DNA nukleotiidse järjestuse väljaselgitamise meetodi mõtles välja F.Sanger. metoodika baseerub sellel, et Sanger võttis kasutusele nn modifitseeritud nukleotiidid. /ribonukleotiidis on nii 3' positsioonis ja 2' positsioonis on riboosi jäägi küljes OH rühmad, desoksüribonukleotiidis on hapnik puudu 2' positsioonist puudu. OH rühm on vajalik fosfodiester sidemete moodustamiseks./ Modifitseeritud nukleotiidil puudub OH rühm ja ahela polümeriseerimine sellest
1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 41. DNA sekventeerimine DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus, need saab siis tuvastada. 42. Polümeraasi ahelreaktsioon PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks
geneetik Marc R. Wilkins 1994. aastal 287. Süsteemibioloogia: uuetasandiline süsteemne käsitlusviis bioloogiliste küsimste lahendamiseks teaduste andmete integratsiooni põhjal 288. Funktsionaalne genoomika: Alt-üles lähenemine- lähtub rakus olevatest molekulidest, selgitab kuidas geenid töötavad, seosed (ahelad) geenide aju ja käitumise vahel 289. Käitumisgenoomika: Ülalt-alla lähenemine- geenidelt käitumisele, selgitab kuidas kogu organism käitub 290. DNA sekveneerimine: meetod, millega määratakse nukleiinhapete nukleotiidne järjestus ja polüpeptiidide aminohappeline järjestus, A. Sama DNA-järjestuse saamine plaatgeeli autoradiograafial ja fluorestsentsmärkega automaatsekveneerimisel, B. DNA radioaktiivse või fluorestsentsmärgistuse viisid: 1) märgistatakse praimer; 2) märgistatud dNTP; märgistatud ddNTP, C. Automaatsekveneerimine. Andmete automaatsalvestus toimub skaneeriva laseri, fluorestsentsdetektori ja arvuti abil. 291
Väga laialt on levinud rakubioloogias nn. immuunfluorestsentsi meetod, mis pôhineb fluorestseeruvate värvainetega konjugeeritud antikehade kasutamisele. Enamlevinud fluorokroomidena antikehade märgistamiseks kasutatakse FITC (fluorestsiin-isotiotsüanaat), TRITC (tetrametüül-rodamiin- isotiotsüanaat ) PE (fükoerütriin) jt. Fluorestsentsmikroskoobis on valgusallikaks elavhôbedalamp, mis annab lühilainelist kiirgust (paljudel lainepikkustel). 51. Täispikkade genoomide sekveneerimine, miks see on oluline? Et mõista erinevate geenide omadusi ja mõista paremini haiguseid ning töötada ravimeid välja. Küsimus on idee järgi sama, mis punkt 55. 52. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? Transgeensete loomade konstrueerimisel on 2 metoodilist lähenemist. Enamasti süstitakse rekombinantne DNA viljastatud munarakku. Süstitav DNA võib olla kas lineaarne või rõngasmolekul. Lineaarne DNA integreerub genoomi ligi 5 korda efektiivsemalt kui tsirkulaarne DNA
Kui restriktsioonimustrid erinevad, ei ole tekitajad epidemioloogiliselt seotud. Antud näite puhul on kasutatud kahte meetodit – restriktsiooni (REA) ja seejärel tekkinud fragmentide sedastamist hübridisatsiooniga. Nukleiinhapete sekveneerimine ja ensümaatiline restriktsioon SEKVENEERIMINE on meetod, mille puhul määratakse nukleiinhappe täpne nukleotiidne järjestus. Sekveneeritud mikroorganismi nukleiinhappe lõigu järgi saab: (1) avastada ja klassifitseerida seni tundmatuid mikroorganisme; (2) identifitseerida juba tuntud mikroorganisme ja nende alavariante; (3) leida mutatsioone ja hinnata nende seost fenotüübiliste tunnustega; (4) hinnata erinevate mikroorganismide tüvede omavahelist seotust.
6) Makromolekulide järjestused, (täisgenoomid, teatud geenide järjestused, valgujärjestused). rRNA järjestused . Juba ca 25 aastat on määratud rRNAd kodeerivate geenide (rDNA) järjestusi. rRNA geenid on head evolutsioonilised markerid, sest nende järjestused on vähe muutunud. Bakterite ribosomaalsete rRNAde ultratsentrifuugimisel eraldub 3 erinevat rRNAd: 23S, 16S ja 5S. Nende pikkused on 3300, 1650 ja 120 nt. Praegu on väga populaarne 16S rRNA sekveneerimine ja selle järjestuse kasutamine prokarüootide evolutsiooni uurimisel. 16S rRNA järjestuste sarnasust/erinevust saab kasutada just kõrgema järgu taksonite eristamiseks, kuna näiteks liikide eristamiseks ei ole tal piisavalt "lahutusjõudu". 34. Pasteuri katse skeemi kommenteerimine Pasteuri katse skeem. Kurekaelaga kolvis kuumutatud puljong jäi steriilseks, kuigi hapnik pääses kolbi. Välisõhus sisalduvad mikroorganismid sadenesid kolvikaelas. Kui kolbi kallutada ja pesta
annaabi.ee 
