Molekulaardiagnostika kordamisküsimused (3)

Kordamisküsimused (Jõers)
1.Millised on PCR-diagnostikalabori organisatsiooni põhiprintsiibid?
Puhas ruum
• Puhtas ruumis hoitakse reaktsioonilahuseid
• Segatakse kokku reaktsioonisegu nn. mastermix
• Puhtas ruumis oma kittel , pipetid, räkid – nendega ei tohi liikuda teistesse ruumidesse
Mida tehakse patogeeniruumis?
• DNA eraldamine proovimaterjalist ( seerum , uriin jne)
• Rakud lüüsitakse, DNA vabastatakse teda pakkivatest valkudest
• Edasi liigub juba mittepatogeenne materjal ehk puhastatud DNA
• Siin oht nakatada iseennast ja keskkonda!
Segamiseruum
• Segatakse kokku patogeeniruumist tulnud DNA ja puhtas ruumis kokku segatud mastermix
– Siin enam nakkusohtu ei ole, kuid kantakse kummikindaid – oht kontamineerida testitav materjal
– Siin tavalisi desinfektsioonilahuseid kasutada ei saa, pindade puhastamine DNAd lõhkuvate ainetega (kloor!)
– Siin asub arhiiv – proovimaterjalist eraldatud DNA säilitatakse 1 aasta laborikoodide alusel
Masinaruum
Masinaruumis toimub liigispetsiifilise märklaud DNA paljundamine
Nested -PCR korral pannakse proov nn. Kaks korda masinasse, et omakorda võimendada PCR signaali
Foreesiruum
• Viimane ruum, siin analüüsitakse PCR tulemusi
• Tuubid avatakse, kantakse reaktsiooniprodukt agaroosgeelile
• Suuremad DNA produktid jooksevad aeglasemalt, väiksemad kiiremini – produktide lahutamine
• DNA amplifikatsiooni produkt tehakse nähtavaks UV valguses, tulemus pildistatakse
Külmkapp:
• Defineerida, mis temperatuuril peab olema
• Igapäevane kontroll termomeetriga, mis on kalibreeritud referentstermomeetri vastu.
Temp. Näitu vaadates tuleb võttes arvesse parandit.
Üldtõed
• Iga etapp analüüsi käigus peab olema kontrollitud ja dokumenteeritud! Kirja, millise
lot nr. kemikaali kasutati, mis kell ja kes viis analüüsi läbi.
• Töö kindla reeglistiku järgi - töökirjeldused
• Lõpliku vastuse kinnitab alati kõrgema astme spetsialist oma allkirjaga.
• Soovitus! Võta igat proovi kui võimalikku kohtulahendit
2.Millised ja millal tehtud avastused olid eelduseks molekulaardiagnostika meetodite väljaarendamisele ? (Nimetage mõned teie arvates olulisemad)
3.Milliseid molekulaardiagnostika meetodeid kasutatakse Eestis nakkushaiguste diagnoosimisel?
Detection, genotyping
4.Milliseid meetodeid kasutatakse patogeensete mikroorganismide tuvastamiseks ( mikroskoopia , isoleerimine ja kultiveerimine , biotestid, immunotestid s.o antigeeni määramine ja antikehade määramine, biokeemilised testid, molekulaarbioloogilised testid) ? Erinevate meetodite plussid ja miinused.

Microbial culture

Microbiological culture is a principal tool used to diagnose infectious disease . In a microbial culture, a growth medium is provided for a specific agent . A sample taken from potentially diseased tissue or fluid is then tested for the presence of an infectious agent able to grow within that medium. Most pathogenic bacteria are easily grown on nutrient agar, a form of solid medium that supplies carbohydrates and proteins necessary for growth of a bacterium, along with copious amounts of water. A single bacterium will grow into a visible mound on the surface of the plate called a colony , which may be separated from other colonies or melded together into a "lawn". The size , color, shape and form of a colony is characteristic of the bacterial species , its specific genetic makeup (its strain ), and the environment which supports its growth.
Microbial culture may also be used in the identification of viruses: the medium in this case being cells grown in culture that the virus can infect, and then alter or kill . In the case of viral identification, a region of dead cells results from viral growth, and is called a "plaque". Eukaryotic parasites may also be grown in culture as a means of identifying a particular agent.

Microscopy

Another principal tool in the diagnosis of infectious disease is microscopy. Virtually all of the culture techniques discussed above rely, at some point, on microscopic examination for definitive identification of the infectious agent. Microscopy may be carried out with simple instruments , such as the compound light microscope, or with instruments as complex as an electron microscope. Samples obtained from patients may be viewed directly under the light microscope, and can often rapidly lead to identification. Microscopy is often also used in conjunction with biochemical staining techniques, and can be made exquisitely specific when used in combination with antibody based techniques. For example, the use of antibodies made artificially fluorescent (fluorescently labeled antibodies) can be directed to bind to and identify a specific antigens present on a pathogen. A fluorescence microscope is then used to detect fluorescently labeled antibodies bound to internalized antigens within clinical samples or cultured cells. This technique is especially useful in the diagnosis of viral diseases , where the light microscope is incapable of identifying a virus directly.

Biochemical tests

Biochemical tests used in the identification of infectious agents include the detection of metabolic or enzymatic products characteristic of a particular infectious agent. Since bacteria ferment carbohydrates in patterns characteristic of their genus and species, the detection of fermentation products is commonly used in bacterial identification. Acids, alcohols and gases are usually detected in these tests when bacteria are grown in selective liquid or solid media.
The isolation of enzymes from infected tissue can also provide the basis of a biochemical diagnosis of an infectious disease. Serological methods are highly sensitive, specific and often extremely rapid tests used to identify microorganisms . These tests are based upon the ability of an antibody to bind specifically to an antigen. The antigen, usually a protein or carbohydrate made by an infectious agent, is bound by the antibody. This binding then sets off a chain of events that can be visibly obvious in various ways, dependent upon the test. Complex serological techniques have been developed into what are known as Immunoassays. Immunoassays can use the basic antibody – antigen binding as the basis to produce an electro - magnetic or particle radiation signal , which can be detected by some form of instrumentation. Signal of unknowns can be compared to that of standards allowing quantitation of the target antigen. To aid in the diagnosis of infectious diseases, immunoassays can detect or measure antigens from either infectious agents or proteins generated by an infected organism in response to a foreign agent.

Molecular diagnostics

Technologies based upon the polymerase chain reaction (PCR) method will become nearly ubiquitous gold standards of diagnostics of the near future, for several reasons. First , the catalog of infectious agents has grown to the point that virtually all of the significant infectious agents of the human population have been identified. Second, an infectious agent must grow within the human body to cause disease; essentially it must amplify its own nucleic acids in order to cause a disease. This amplification of nucleic acid in infected tissue offers an opportunity to detect the infectious agent by using PCR. Third, the essential tools for directing PCR, primers, are derived from the genomes of infectious agents, and with time those genomes will be known, if they are not already .
Thus, the technological ability to detect any infectious agent rapidly and specifically are currently available. The only remaining blockades to the use of PCR as a standard tool of diagnosis are in its cost and application , neither of which is insurmountable. The diagnosis of a few diseases will not benefit from the development of PCR methods, such as some of the clostridial diseases ( tetanus and botulism ). These diseases are fundamentally biological poisonings by relatively small numbers of infectious bacteria that produce extremely potent neurotoxins. A significant proliferation of the infectious agent does not occur , this limits the ability of PCR to detect the presence of any bacteria.
5.Millest tulevad vead immunoloogiliste meetodite kasutamisel nakkushaiguste diagnoosimisel? Milliseid vigu ja kuidas saab vältida?
6.Mis on meetodi tundlikkus?

Sensitivity

A sensitivity of 100% means that the test recognizes all actual positives - for example, all sick people are recognized as being ill. Thus, in contrast to a high specificity test, negative results in a high sensitivity test are used to rule out the disease.
Sensitivity alone does not tell us how well the test predicts other classes (that is, about the negative cases). In the binary classification, as illustrated above, this is the corresponding specificity test.
Sensitivity is not the same as the positive predictive value (ratio of true positives to combined true and false positives), which is as much a statement about the proportion of actual positives in the population being tested as it is about the test.
The calculation of sensitivity does not take into account indeterminate test results. If a test cannot be repeated, the options are to exclude indeterminate samples from analysis (but the number of exclusions should be stated when quoting sensitivity), or, alternatively, indeterminate samples can be treated as false negatives (which gives the worst-case value for sensitivity and may therefore underestimate it).
A test with a high sensitivity has a low type II error rate .
7.Mis on meetodi spetsiifilisus?
A specificity of 100% means that the test recognizes all actual negatives - for example, all healthy people will be recognized as healthy. Because 100% specificity means no positives are erroneously tagged, a positive result in a high specificity test is used to confirm the disease. The maximum can trivially be achieved by a test that claims everybody healthy regardless of the true condition. Therefore, the specificity alone does not tell us how well the test recognizes positive cases. We also need to know the sensitivity of the test.
A test with a high specificity has a low type I error rate.
Specificity is sometimes confused with the precision or the positive predictive value, both of which refer to the fraction of returned positives that are true positives. The distinction is critical when the classes are different sizes. A test with very high specificity can have very low precision if there are far more true negatives than true positives, and vice versa.
8.Milline on lihtne arvutusvalem tundlikkuse ja spetsiifilisuse määramiseks? Milliste ühikutega neid näitajaid esitatakse?
Sensitivity
A sensitivity of 100% means that the test recognizes all actual positives - for example, all sick people are recognized as being ill. Thus, in contrast to a high specificity test, negative results in a high sensitivity test are used to rule out the disease.
Sensitivity alone does not tell us how well the test predicts other classes (that is, about the negative cases). In the binary classification, as illustrated above, this is the corresponding specificity test.
Sensitivity is not the same as the positive predictive value (ratio of true positives to combined true and false positives), which is as much a statement about the proportion of actual positives in the population being tested as it is about the test.
The calculation of sensitivity does not take into account indeterminate test results. If a test cannot be repeated, the options are to exclude indeterminate samples from analysis (but the number of exclusions should be stated when quoting sensitivity), or, alternatively, indeterminate samples can be treated as false negatives (which gives the worst-case value for sensitivity and may therefore underestimate it).
A test with a high sensitivity has a low type II error rate.
A specificity of 100% means that the test recognizes all actual negatives - for example, all healthy people will be recognized as healthy. Because 100% specificity means no positives are erroneously tagged, a positive result in a high specificity test is used to confirm the disease. The maximum can trivially be achieved by a test that claims everybody healthy regardless of the true condition. Therefore, the specificity alone does not tell us how well the test recognizes positive cases. We also need to know the sensitivity of the test.
A test with a high specificity has a low type I error rate.
Specificity is sometimes confused with the precision or the positive predictive value, both of which refer to the fraction of returned positives that are true positives. The distinction is critical when the classes are different sizes. A test with very high specificity can have very low precision if there are far more true negatives than true positives, and vice versa.
9.Võrdle kommertsiaalse kitil (testkomplektil) baseeruva PCR ja in house (home- brew ) diagnostikameetodeid. Millised on kummagi eelised ja puudused?
In-house metoodika
• In-house metoodika – nn. Majasisene metoodika ehk Quattromed HTI Laborites
arendustegevuse käigus välja töötatud metoodika
• Metoodikad on valideeritud. Valideerimine on suhtelise täpsuse, tundlikkuse ja
spetiifilisuse määramine referentsainete abil.
In-house või kommertsiaalne kit?
Kommertsiaalse kiti eelised:
o Ei nõua laboripersonalilt sügavaid teadmisi mol.biol.
o Võimaldab protsessi automatiseerida
o Kitiga kaasasolevad kalibratsioonilahused
Kommertsiaalse kiti puudused:
o Uute testide turuletulek aeglane
o Probleemid tundlikkusega (nii kõrge kui madala tiitriga proov)
o Tihti kiti valik laboris subjektiivne mitte objektiivne
o Hind
In-House IVD:
• in-house In Vitro Diagnostic Device (IVD)
- in vitro test mis on välja töötatud ja valideeritud laboris, kus seda ka
kasutatakse.
in-house IVD olemasolu põhjused:
• Kommertsiaalse IVD puudumine
• Sensitiivsus ja spetsiifilisus on parem kui alternatiivsel kommertsiaalsel kitil
• In-house IVD on tunduvalt odavam kui
kommertsiaalne IVD
Enne in-house IVD testi valideerimise kinnitamist ei tohi testi kasutada!
10.Võrdluskatsed ja referentsid.
Võrdluskatsed:
• Laborisiseselt 1x kvartalis
• Eestis laborite vahel 1x aastas (referentlabor)
• Rahvusvahelised n.ö. väline kontroll 1x 4 aasta jooksul – tegelik tihedamini
– FEPAS, FAPAS – Rootsi
– Labquality – Soome
– Instand - Saksamaa
– QCMD – Šotimaa jne.
Referentsained:
• WHO-st
– HCV RNA 100.000 cop/mL
– HIV-1 RNA 56.234 cop/mL
– Parvoviirus B19 77.247cop/mL
• INSTAND – Saksamaa Standardiamet
• ATCC – Ameerika tüüpkultuuride kollektsioon
11.Mis on hospitaalinfektsioonid ? Kuidas neid diagnoosida?
Erinevad võimalused:
-Kvalitatiivne PCR
-----PCR
-----nested-PCR
-----RT-PCR
-Semikvantitatiivne (Cobas Amplicor ja Becton- Dickinson )
- Kvantitatiivne PCR
----- reaal -ajas PCR ( real -time PCR)
-Muud: GeneProbe ja TMA põhinev APTIMA
------Combo2
12.Milline on HI-viirusega nakatumise tõenäosus? Millest see sõltub?
http://www.health.gov.ua/health.nsf/1b45f02676a7cea4c125678d003f98dc/ab8e1475b33bd7d8c12567eb0038598c?OpenDocument
Риск заразиться ВИЧ — каков он
Степень риска заражения ВИЧ различна в зависимости от типа передачи.
Нужно знать, что переливание инфицированной крови, в 1 мл которой содержится от 1 до 10 инфекционных доз вируса, практически всегда приводит к заражению и последующему развитию у человека ВИЧ-инфекции. По существующим оценкам вероятность инфицирования после такой процедуры превышает 90 %. Возбудитель СПИДа передается также при введении клеточных компонентов крови, факторов свертывания крови (VIII и IX). Возможна передача ВИЧ через различные биологические жидкости организма, при пересадке органов и тканей. В литературе описаны случаи заражения ВИЧ при пересадке почек, а также искусственном оплодотворении спермой инфицированных доноров.
Контакт с вирусом во время беременности лишь немногим уступает переливанию инфицированной крови: по имеющимся сообщениям вероятность заражения при этом колеблется от 11 до 70 %. В среднем риск того, что инфицированная женщина передаст ВИЧ плоду или новорожденному, составляет 30— 50 %.
Половой акт является не самым опасным путем передачи ВИЧ с точки зрения вероятности заражения. Степень риска заражения зависит от типа половых контактов (вагинальные, анальные, оральные, смешанные), их числа с одним или несколькими половыми партнерами. Замечено, что вероятность инфицирования повышается за счет дополнительных факторов, в первую очередь наличия у одного из партнеров болезней, передаваемых половым путем, и особенно тех, при которых имеют место всевозможные нарушения целости кожи и слизистых оболочек в виде язв. Это наблюдается, например, при сифилисе, герпетической инфекции, грибковых поражениях и т.д. Вероятность передачи ВИЧ в результате одного полового акта по оценкам специалистов колеблется от 0,1 до 1 %. Однако ввиду большого числа половых актов между здоровыми и инфицированными ВИЧ лицами этот путь заражения доминирует в мире, о чем речь пойдет ниже-
Использование нестерильных медицинских инструментов, предназначенных для инъекций лекарственных средств, связано с несколько большим риском передачи ВИЧ по сравнению с одним половым контактом с человеком, инфицированным ВИЧ (от 0,5 до 1 %). Степень опасности зависит от объема передаваемой таким образом крови.
Контакт с вирусом в результате случайного укола иглой в медицинских или немедицинских условиях характеризуется самым низким показателем передачи ВИЧ. Вероятность того, что случайный укол зараженной ВИЧ иглой вызовет развитие инфекции, составляет около 0,3 %.
Теперь, когда известны пути заражения вирусом иммунодефицита человека и его вероятность в различных ситуациях, пришло время дать оценку ситуации в мире в целом и в Украине в частности. Следует отметить, что принципиальных различий здесь практически нет. В Европе на долю полового пути заражения приходится 50,2 % всех зарегистрированных случаев СПИДа, из них 8,9 % составляет гетеросексуальный способ передачи ВИЧ, т.е. от женщины к мужчине или наоборот, и 41,3 % — гомосексуальный — от мужчины к мужчине.
Характерной особенностью последнего времени является постоянное повышение процента случаев ВИЧ-инфицирования в результате гетеросексуальных контактов.
Доля случаев заражений при внутривенном использовании наркотиков превышает 33 %, при переливании крови реципиентам и больным гемофилией составляет 6,1 %, от матери ребенку — 1,8 %.
Среди детей были зарегистрированы 2338 случаев из 66 000 заболеваний СПИДом в странах Европы. Из этого количества в 913 случаях (39,1 %) заражение произошло в результате передачи вируса от матери ребенку, в 551 (23,6 %) — при переливании крови, в 113 (4,8 %) — при лечении гемофилии. Группа с другими видами передачи ВИЧ состоит из 761 человека, подавляющее большинство из которых (712) — это дети из Румынии, инфицированные в результате переливания необследованной на ВИЧ крови или при использовании непростерилизованных медицинских инструментов.
В Украине на долю полового пути заражения СПИДом приходится около 60 % всех случаев, из них гетеросексуальные контакты составляют 10 %, гомосексуальные — 50 %.
13.Kas HIV diagnostikat Eestis tuleks parendada? Kui “jah”, siis kuidas? Kui “ei”, siis miks?
Viimaste aastate jooksul on HIV-valdkonnas tähtsamate teenuste mahud suurenenud ning organisatsioonide haldussuutlikkus paranenud . Noorte ja üldelanikkonna ennetuses viidi läbi noortelt noortele koolitusi ja supervisioone. HIV
ja AIDSi kohta teavet jagavatel internetilehekülgedel on uuendatud järjepidevalt infot. 2009.aastal valmib inimeseõpetuse ainekava , kus on arvestatud riskikäitumise ennetamise
kaasaegseid suundi ja käsitlusi ning ennetustegevus on integreeritud inimeseõpetuse
ainekavasse 2.−12. klassini. Riikliku strateegia raames pakub Eestis anonüümset vabatahtliku nõustamise ja testimise teenust 8 AIDSi nõustamiskabinetti ning aktiivselt tegeletakse testimise vajalikkuse teadvustamisega. AIDSi nõustamiskabinettide külastatavus on aasta-aastalt suurenenud.Eesti Haigekassa katab kõik ravikindlustatud isikute ravikulud ning riigieelarvest on eraldatud vahendid ka ravikindlustamata HIV-nakatunutele mõeldud tervishoiuteenusteks. ARV- ravimid on kõigile patsientidele (ka ravikindlustamatutele) tasuta ning neid jagatakse haiglate infektsioonhaiguste osakondades.
14.Kas molekulaardiagnostika turg võiks olla investori jaoks atraktiivne? Miks?
15.Milliseid diagnoosimise meetodeid peaks kasutama regionaalhaigla ? Põhjenda.
16.GLP mõiste
GLP on standard teadus labori administreerimisest.
GLP põhipunktid:
-uurimisplan
-inimeste väljaõpe
- aparatuur
- kemikaalid
-jäätmekäitlus
- arhiveerimine
-andmete kokkuvõte-artikkel
17. Sertifitseerimine
• Protseduur, millega kolmas osapool annab kirjaliku tõenduse, et toode või protsess vastab esitatud nõuetele.
18. Kvaliteedisüsteemi juurutamine
• Kvaliteedikäsiraamatu (juhtimissüsteem)koostamine-üldkirjeldus laboratooriumist,
tema põhialused
• Tööjuhendid-metoodika kirjeldus, põhimõttel,et tänavalt tulnud inimene suudaks töö läbi viia
• Sellele eelneb metoodika valideerimine,millega näidataks, kas laboratoorium suudab
töötada konkreetse metoodikaga
• Valideerimine: suhtelise täpsuse, tundlikkuse ja spetsiifilisuse määramine referentsainete abil
19. Seadmete kontroll, kalibreerimine
-Sisemiselt paika panna- olulised seadmed laborisiseselt iga päev, ülejäänud N: kord
nädalas.
-Masina hooldaja või teatud masinagruppe kalibreerima akrediteeritud firmade poolt kord
12 või 6 kuu järel.
Kaalud:
• Enne kaalu kasutamist kaalude kontroll kontrollvihtidega. Kord aastas kaalu
kalibreerimine selleks tööks akrediteeritud ettevõtte poolt N:Metrosert.
20. Valideerimisprotokoll :
• Osaline valideerimine-metoodika on kirjeldatud rahvusvahelise standardina.
• Täielik valideerimine-metoodika ei ole välja antud standardina, vaid kirjanduses ilmunud artiklite põhjal.
• Nõue: min. 20 pos ja 20 neg proovi.
21. Emakakaelavähi skriining (HPV)
• HPV DNA/mRNA metoodika valideerimiseks 800 kinnitatud CINII ja
CINIII proovi
• Tundlikkus peab olema vähemalt 93%
• Metoodika tundlikkus 5
-SNP: tüüpiliselt 2
Detekteerimismeetod:
-STR: geel /kapillaarelektroforees
-SNP: sekveneerimine ; mikrokiipanalüüs
Multipleksi võimalus :
-STR: >10 markerit mitme fluores. värviga
-SNP: Potentsiaalselt 1000 SNPs kiibil
3.STR markerite iseloomustus (korduste tüübid, alleelide tähistamine, alleelide eristamine).
Lühikesed kordusjärjestused (Short Tandem Repeats - STR)
Proovides varieerub korduste arv (korduspiirkond), kordustega külgnev ala (PCR praimerite seondumise ala) on konstantne
Homosügoot = mõlemad alleelid on sama pikkusega
Heterosügoot = alleelid erineva pikkusega
STR korduste tüübid:
Microsatellite = simple sequence repeat (SSR) = short tandem repeat (STR)
-Dinukleotiid-(CA)(CA)(CA)(CA)
-Trinukleotiid-(GCC)(GCC)(GCC)
- Tetra nukleotiid-(AATG)(AATG)(AATG)
-Pentanukleotiid-(AGAAA)(AGAAA)
-Heksanukleotiid-(AGTACA)(AGTACA)
Alleelide kindlakstegemiseks vajalik suurusel põhinev DNA lahutamine; dinukleotiidsete korduse korral vaja paremat resolutsiooni.
4.Mikrovariantsed STR alleelid (definitsioon, tähistamine) ja null-alleelid (esinemine, miks probleemsed).
STR markerite bioloogilised “artefaktid”:
-“Stutter” produktid
-Matriitsist sõltumatu nukleotiidi lisamine
-Mikrovariandid
-Null-alleelid
- Mutatsioonid
Mikrovariantsed alleelid ja redelivälised alleelid :
-Mitte kõigil alleelidel ei ole täispikka kordusühikut
-Osaliste kordusühikutega alleele tähistatakse: täiskorduste arv - punkt - aluste arv osalises korduses
-Näide: TH01 9.3 alleel (AATG)6(-ATG)(AATG)3
Mikrovariandid:
- Defineeritakse alleelidena, millel pole aluskordusmotiivi täpseid kordusi või esinevad kordusmotiivi järjestuse variandid või mõlemad
-Võivad esineda insertsioonid, deletsioonid või aluse vahetused
-Järjestuse variatsioon võib esineda korduse sees, külgnevas alas või praimeri seondumise saidis
-Võib põhjustada PCR ebaõnnestumist, kui polümorfism praimeri saidis - “null alleelid”
Null-alleelid:
-Alleelid esinevad, kuid ei amplifitseeru nukleotiidi muutuse tõttu praimeri seondumissaidis
-Alleelide väljalangemine on probleem, kuna heterosügootne proov määratakse valesti homosüsoodiks (nn valehomosügootsus)
-Kaks PCR praimerite komplekti annavad erinevad tulemused
-Probleemid andmebaaside kasutamisel
-Uute kittide kasutuselevõtule eelnevad ulatuslikud uuringud
5.“Stutter” produktid (definitsioon, esinemine, miks probleemsed).
-Piigid, mis on peamiselt üks kordus lühemad tõelistest alleelidest (ahela libisemine DNA sünteesil)
-“Stutterid” avalduvad vähem suuremate kordusühikute korral
(dinukleotiidid > tri- > tetra- > penta-)
- Pikemad kordused tekitavad rohkem “stuttereid”
-Iga järgnev “sutterprodukt” on väiksema intensiivsusega
(alleel > kordus-1 > kordus-2)
-“Stutterpiigid” teevad keeruliseks segaproovide interpreteerimise
6.Autosoomsed markerid vs mtDNA markerid vs Y kromosoomi markerid kasutamiseks isikutuvastamisel.
“ Sugupuu ” markerid:
-Mitokondiaalne DNA (mtDNA)
--------Emaliinis päritav
--------Polümorfne kontrollregioon (D- loop )
--------Rakus mitmeid koopiaid; säilib paremini
-Y kromosoom
----------Isaliinis päritav
-----------arvukalt Y STR ja Y SNP markereid
Haplotüübi määramine
7.Bioloogilise materjali kasutatavus isikute tuvastamiseks: enimkasutatavd proovid , DNA saagised.
Bioloogiline materjal ekspertiisiks:
- Veri
- Sperma
-Sülg
-Uriin
-Karvad (s.h. juuksed)
-Hambad
- Luud
-Muud koed
8.Erinevad meetodid DNA eraldamiseks/DNA puhastamiseks : eelised, puudused.
DNA eraldamise meetodid:
1.Orgaaniline eraldusmeetod ( fenool -kloroform meetod)
Aeganõudev; ohtlikud kemikaalid;sobib RFLP -ks ja PCR-iks saadakse kõrgmolekulaarne hea kvaliteediga DNA;suur kontaminatsioonirisk ja vigade tekkimise risk;
2. Chelex meetod
Lihtne ja kiire; sobib PCR-iks;väike kontaminatsioonirisk ja vigade tekkimise risk
3. Kommertsiaalsed kitid
4. Proovid spetsiaalsetel kandjatel:
IsoCode kaart
FTA kaart
9.STR markerite multiplex analüüs fluorestsentsmärgiste kaudu (mis on multiplex analüüs, miks fluorestsenstsmärgised, milline märkimisviis).
Multiplex PCR:
-Samaaegselt võimalik kopeerida üle 10 markeri
-Tundlikkus alla 1 ng DNA-d
-Võimalik analüüsida segaproove ja deradeerunud proove
-Erinevad flourestsentsmärgised võimaldavad teha vahet sama pikkusega STR alleelide vahel
-Praimerite valik/ disain ülioluline
-10 või enam STR lookust amplifitseeritakse samaaegselt
-STR kitid müügil
Väljakutsed
-Praimerite disainimine (pole programme )
-reaktisooni optimiseerimine katse-eksituse meetodil, võtab aega
Multipleks PCRi eelised
-Ajaühikus saadakse rohkem infot
-Väiksem töökulu tulemuste saamiseks
-Vaja vähem proovi
10.Pikkusmarkerid ja alleelsed redelid STR alleelide kindlaktegemisel (mida endast kujutavad, miks on vaja).
DNA polümorfismide tüübid:
-Järjestuse polümorfism
Ühe nukleotiidi polümorfism (SNP - single nucleotide polymorphism)
Insertsioonid/deletsioonid
AGACTAG(A/G)CATTAGA
-Pikkuse polümorfism
Korduvad järjestused
AGTTC( GATA )(GATA)(GATA)TCCAG
Kordamisküsimused (Andres Veske)
1.Numbriliste ja struktuursete kromosoomi anomaaliate klassifikatsioon
Numbrilised kromosoomiide anomaalliiad
Polüploidiad
Kõigil kromosoomidel esinevad ekstra koopiad
Aneuploidiad
Teatava kromosoomi kadu või lisandumine
Miksoploidiad
Kaks või rohkem rakuliini erinevate kromosoomide arvuga
Mosaiiksus
Eri rakuliinid pärinevad samast sügoodist
Kimäärsus
Eri rakuliinid pärinevad erinevatest sügootidest
Polüploidne mosaiiksus
diploid/triploid
Aneuploidne mosaiiksus
normaalne/trisoomia21
Struktuursed kromosoomide anomaaliad (seotud kromosoomide murdumisega):
1 murre ühes kromosoomis
Terminaalsed deletsioonid
Kaob aktsentriline fragment
2 murret ühes kromosoomis
Inversioonid
Regioon murdekohtade vahel pöördub 180°
Sisemine deletsioon
Murrete vaheline osa deleteerub, terminaalsed fragmendid ühinevad
R6ngaskromosoomid
Murdekohtade vahel tekib fusioon
2 murret eri kromosoomides
Retsiprookne translokatsioon
Aksentriliste fragmentide balansseeritud vahetus
Tsentriline translokatsioon
Kahe akrotsentrilise kromosoomi tsenterfragmentide fusioon
3 murret: neist vähemalt kaks ühes kromosoomis
Insertsionaalne tranlsokatsioon
Regioon kahe murdekoha vahel lülitatakse kolmandasse murdekohta samal või teisel kromosoomil
2.Mosaiiksus ja kimäärsus
Mosaiiksus
Eri rakuliinid pärinevad samast sügoodist
Kimäärsus
Eri rakuliinid pärinevad erinevatest sügootidest
3.Genoomi ebastabiilsus
Genoomi ebastabiilsuse (instability) sündroomid
Harvad päriliku haigused, mille puhul on suurenenud somaatilisete mutatsioonide ning kromosoomide ümberkorralduste ja murdumiste sagedus.Viivad eelsoodumuseni vähi tekkeks.Suures osas tingitud mutatsioonidest DNA reparatsioonigeenides.
4.Uniparentaalne diploidia ja disoomia, vermimine
Tsütoloogiliselt „normaalne“ kuid patoloogiline karüotüüp
•Uniparentaalse diploidia puhul on kõik kromosoomid pärit ühelt
vanemalt (harvad juhud , kui isalt - koriokartsinoom, emalt – ovariaalne teratoom)
•Uniparentaalse disoomia puhul pärib indiviid spetsiifilise kromosoomi mõlemad homoloogid samalt vanemalt
5.Klassikalised kromosoomide värvimistehnikad
G-bändid: kromosoome töödeldakse trüpsiiniga ja värvitakse Giemsa
värviga. Tumedalt värvuvad vöödid on tuntud G-bändidena.
R-bändid: p6himõtteliselt vastupidine G bändingule. Kromosoomid
denatureeritakse kuuma ja sooladega enne Giemsa värvimist.
Q-bänding: kromosoome värvitakse fluorestseeruvate värvidega (DAPI,
Hoechst 33528), mis seostuvad eelistatult AT rikastele regioonidele.
Kromosoome vaadeldakse UV-valguses. Samane G-bändidega.
C-bändid: arvatavasti esindavad konstitutiivset heterokromatiini.
Kromosoome denatureeritakse BaOH lahusega, millele järgneb Giemsa
värvivimine.
6. FISH ja tema variatsioonid
Молекулярно - цитогенетические методы исследования

• Интерфазная цитогенетика:
  
• Многоцветный бэндинг хромосом (МВС).
  
• Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH).
  
• Комбинация FISH с другими методами:
  
  • цитология + FISH;
    
  • гистология + FISH;
    
  • имунофенотипирование + FISH (FICTION);
    
• Метафазная цитогенетика:
  
• Сплошное окрашивание хромосом ( Whole painting).
  
• Сравнительная геномная гибридизация (CGH).
  
• Кариотипирование с переменой цвета (ССК).
  
• Многоцветное кариотипирование:
  
  • cпекральное кариотипирование (SKY);
    
  • многоцветная FISH (M - FISH, M - BAND ).
    

Cod-FISH ( chromosome orientation and direction FISH) – võimaldab määrata absoluutset 3‘-5‘ orientatsiooni ja inversioone.

Q-FISH (kvantitatiivne FISH)
• Põhiliselt telomeeride pikkuse tuvastamine
• Kasutatakse telomeerispetsiifilisi PNA-si
• Signaal kvantifitseeritakse digitaalselt (lahutusvõime ~ 200 bp.)
• Võimaldab võrrelda individuaalsete kromosoomide telomeeride pikkusi
• Subtelomeersed deletsioonid nõrgamõistuslikuse sage põhjus

Flow-FISH, kasutatakse
interfaasi rakke, hübridisatsioon suspensioonis, signaal tuvastatakse FACS-i abil. Eelis paljude rakkude üheagne analüüs.

LT-FISH (madaltemperatuuri FISH)
•Hübridisatsioon toimub 37°C
•Mitteensümaatilin
•Kromosoomide analüüs toimub skaneeriva lähivälja optilise mikroskoopia (SNOM) abil
•Eelis kromosoomide ja kromatiini intaktsuse säilimine

COMBO-FISH (combinatory oligonucleotides)
• Madaltemperatuuri FISH edasiarendus
• Põhineb faktil, et 1-2% inimgenoomist on ~ 14 aluspaarised homopuriin või homopürimidiin järjestused
• Proovina homopuriin või homopürimidiin oligonukleotiidid, mis moodustavad DNA-ga kolmikahela
• DNA eelnev denaturatsioon pole vajalik ! Suured laigud on mittespetsiifiliselt värvunud tuumakesed

Fiber-FISH
Kasutatakse väljavenitatud kromatiinkiudusid. Eriline lüüsipuhver, mis lõhub ka tuumamaatriksi. DNA pikeneb 130% teoreetilisest väärtusest! Lahutusvõime paar kb d!

Kolmedimensionaalne FISH
Kromosoomiterritooriumid intaksetes interfaasi tuumades konfokaalmikroskoopia vahendusel
7.Võrdlev genoomne hübridisatsioon
Comparative genome hybridization CGH Сравнительная геномная гибридизация (CGH
8.Mikrokiipide variandid, kasutamine, põhimõtted
-Mikrokiibid on väikesed klaasi- või silikoonslaidid, mille pinnale on paigutatud sadu tuhandeid DNA fragmente
-Teistel kandjatel n.n. nitrotselluloos järjestatud nukleiinhapete fragmente võib nimetada makrokiipideks
-Kasutades erinevaid DNA hübridisatsiooniprotsesse mõõdetakse nende geenide ekspressioonitase
-Andmed kogutakse kasutades laseraktiveeritud fluorestsentsloendureid
-Kogu protsessi võib nimetada “ ultra kiireks ja ökonoomseks” (ultra-high throughput”)
Mutatsioon ja SNP analüüs, genoomi kaardistamine:
Kõrgtihedusega oligonukleotiidkiibid. Mutatsioonikiibid nt. ATM, CFTR , BRCA1, HIV jaoks.Suuremahuline genotüpiseerimine. Võrdlev hübridiseerimine näitas 4000 SNP-i kahe pärmitüve vahel (Science 1999).Inimgenoomis 2,3 Mb ca 3000 SNP-i. Kandidaatgeenide evaluatsioon kõrgvererõhu tõve korral (Nat. Genetics 2000)
Viimase aastakümne olulisem läbimurre molekulaarbioloogia metodoloogias
Miks esineb vajadus kiipide järele?
1.Uurimaks genoomi mutatsioonide osas mitmetes geenides
2.Uurimaks genoomi SNP-de osas tuvastamaks aheldatust
3.Uurimaks toiduaineid potensiaalsete patogeenide tuvastamiseks
4. Transkripti olemasolu ja koopianumbrite leidmiseks kas genoomses DNA-s või transkribeeritud RNA
Mikrokiipide tehnoloogiad:
Esineb kaks põhilist mikrokiibi valmistamise tehnoloogiat mis mõnevõrra kattuvad:
1. Oligonukleotiidide süntees in situ kiibil endal: n. Affymetrix® Gene Chips
(oligo- v6i geenifragmendid “ESTd”, n.n. cDNA kiibid )
Affymetrix Gene Chip TM:
-Valmistatakse tuhandete lühikeste oligonukletiidide in situ sünteesi teel klaasmaatriksil
-Kiibil vastab 16-20 nukleotiidine ahel ühele kindlale geenile
-Igale oligole kiibil vastab veel teine, mis erineb vaid ühe nukleotiidasenduse poolest
-Võrreldakse proovi intensiivsust kahe partneroligo vahel
-Mõõdetakse geeniekspressiooni absoluutset taset
2. Otsene DNA deposeerimine (spottimine):
Spotitud cDNA mikrokiibid:
Plussid
-Madalam hind ja suurem paindlikus
-Kahe erineva bioloogilise proovi paralleelne võrdlus (n. vähirakud ja normaalne kude, mõjutatud rakud ja normaalsed rakud)
-EST-de kasutamine võimaldab uute geenide avastamist
Miinused
-Vajalik on järjestuste kontroll
-Mõõdetakse suhtelist ekspressioonitaset kahe proovi vahel
Mikrokiip eksperimendi kuus põhietappi:
-Mikrokiibi ettevalmistamine: kloonide kollektsiooni olemasolu (sekveneerimine), PCR amplifikatsioon ja insertide kontroll, spottimine ja QC.
-Eksperimendi ettevalmistamine ja referentsi valik: mida võrrelda millega?
- Proovide ettevalmistamine (märgistamine) ja hübridiseerimine
-Tulemuse salvestamine (pildi skaneerimine ) ja kvantifitseerimine (signaalitugevuse väljendamine numbriliselt)
-Andmebaasi loomine, normaliseerimine ja filtreerimine
-Statistiline analüüs ja andmetöötlus
Mikrokiipide kasutamine meditsiinis:
-Haigusseoseliste geenide leidmine
- Õige ravikuuri määramine
-Ravimite kõrvalmõjude ja vastuse ennustamine
-Täpse diagnoosi andmine, sadade eri parameetrite põhjal
-Geenikoopiate arv ( array CGH)
-Uute ravimite sihtmärkide leidmine, ravimite testimis ning avastamis hõlbustamine jpm.
Mikrokiipide põhiplatformid:
-cDNA kiibid
-Lühikeste oligodega kiibid
-Pikkade oligodega kiibid
Mikrokiipide problemaatilised parameetrid :
-Kõrgekvaliteetsete (kliiniliste) proovide (tuumori, kontrollkoed) olemasolu
-Kõrgekvaliteetse RNA puhastamine
-Eksperimendi ettevalmistus: mida võrrelda millega?
-Andmeanalüüs -1: Mida teha andmetega?
-2: Kuidas seda teha?
-Väga suur hulk andmeid
-Tohutud andmefailid
-Analüüsi strateegia/ algoritmi /programmi valik
Eksperimendi ettevalmistamine:
-Kontrolli valik: Tavaline (bioloogiliselt mitteoluline) kontroll või paarilised proovid?
-Replikaatide arv: palju ma vajan? (Palju on võimalik saada...?). Kas replikaadid summeeritakse või vaadeldakse eraldi?
-Kas kasutada värvide vahetust? - Esimene katse: eksperimentaalne proov märgitud Cy5 ja referents märgistatud Cy3 (“ straight ”). Korduskatse kus eksperimentaalne proov märgitud Cy3 ja referents (kontroll) märgistatud Cy5 (“ switch ”)
-Andmepanga valik: kus ja kuidas säilitada andmeid?
Andmete eeltöötlus ja normaliseerimine:
-Filtreerimine: müra (taustsignaal) kõrvaldamine? Madala intensiivsusega signaalid (spots)? Küllastunud signaalid? Madala kvaliteediga signaalid (ghosts spots, tolmu spots etc).
-Ekstreemsed proovid?
-Koduhoidjad (housekeeping) geenid = kontrollgeenid
-Intensiivsusest sõltuv (tavalisene): globaalset intensiivsust või globaalset suhet kasutades arvutatakse üks normaliseerimifaktor
Mikrokiipidel põhinevad valk-DNA seostumiskohtade uuringud:
-Kaardistamine kasutades kromatiini immunopretsipitatsioonitehnikaid ja kiipe .
-----Valgud ristseotakse (crosslinking) genoomsele DNA-le in vivo .
-----DNA lõigatakse ensüümidega või mehhaniliselt
-----DNA-valk kompleksid immunopretsipiteeritakse
-----Eri allikatest pärit ( kotroll ja test DNA) kompleksidega seostatakse linkerid ja amplifitseeritakse ning märgistatakse erinevate värvidega
-----Tulem hübridiseeritakse kiipidele
-----Mida erinevam on signaali erinevus fragmentide vahel, seda tugevam on valkude seostumine antud fragmendiga
-Kaardistamine kasutades DNA adeniin metüültransferaasi määramist
------DNA adeniin metüültransferaas seotakse kromatiiniga seostuvatele valkudele ja ekspresseeritakse rakkudes
------Kimäärne valk seostub kromatiiniga ja metüleerib naabruses asuva adeniini.
------Metülatsioonitundlik DpnI lõikab DNA metüleeritud GATC saitides.
------Fragmendid eraldatakse suuruse järgi, märgistatakse ja hübridiseeritakse kiipidega
L-DNA-l baseeruv universaalne kiip :
Algne hübridisatsioon toimub lahuses, mille järel märgistatud proovid deotakse kiibile. Proovid koosnevad spetsialiseeritud D-DNA osast ja n.ö. koodi osast L-DNAst, mille kaudu toimub tahkele kandjale sidumine. Vähendab olulist müra ja tõstab spetsiifilisust.
Kromatiini immuunsadestamine kiipidel (ChIP-on-chip):
Genoomne DNA inkubeeritakse valguga ning stabiliseeritakse cross -linkimise teel. Valk pretsipiteeritakse spetsiifilise AK-ga ning lagundatakse. DNA ahel märgistatakse ja hübridiseeritakse kiibile.
Tundmatute eksonite identifitseerimine kiipidel:
RNA või cDNA hübridiseeritakse kiibile seotud eksonispetsifiliste praimeritega. Amplifikatsioonisignaali tugevus kiibil näitab uute eksonite olemasolu.
9.Koekiibid
Organiseeritud kudede parafiinlõigud (0,6mm).Koostatud sadadest prooviblokkidest .
Kasutatavad metoodikad:
1.IHC
2.ISH
3.FISH
4.HC
Koekiipide plussid ja miinused:
-Uute antikehade sobivuse testimine
-Uute prognostiliste antigeenide leidmine
-Arengubioloogilised küsimused
-Võimalus kiirpatoloogiliseks uuringuks
-Võimalik edasiarendus rakukiip
-Kudede omadused muutuvad sügavuti
-Paljud antikehad ei tööta parafiinlõikudel
-ICH on raskesti kvantifitseeritav
-Suhteliselt kallid
10.Rakukiibid
Transfekteeritud rakkude mikrokiibid:
Positsionaalsed ja mittepositsionaalsed kiibid
Kasutatakse imetaja rakkudes „high-throughput“ testidena uurimaks geenifunktsioone pärast mõjutamist potensiaalsete ravimite, patogeenide, keskkonnamõjude, stressifaktorite jne. poolt
Positsionaalsed kiibid on tehnika, kus kasutatakse võrdluseks kindlaid cDNA-si ekspresseerivaid rakuklastreid X,Y koordinaatides. cDNA-d, on kloneeritud ekspressioonivektoritesse ja algselt seotud mikroskoobi slaididele. Pärast transfekteerimist adheeruvad rakud moodustavad elusa korrastatud „array“. Eeliseks valkude natiivne vorm
Cellomics CellChip (1999) kasutab märgistatud eri tüüpi rakke, mis püütakse plaadile kasutades erinevaid affiinsus reagente.
Mittepositsionaalsed kiibid:
Põhinevad mitte andmepunktide kogumisele X,Y koordinaadistikus vaid andmepunktid on assotseerunud unikaalsete eri päritolu koodidega. Andmeanalüüs kas FACS või mikroskoopia abil
Pharmaseq (2002) tehnoloogia:
-Uut tüüpi DNA mikrokiip – nanoülekandja. On väikseim kuubikujuline raadiosaatja-vastuvõja võimaldades üle kanda eri koode raadiosagedustel
-Koosneb fotoelemendist, mälust, kellast, antennist ja kandjale kinnitatud oligodest ning võimaldab DNA analüüsi 3D kandes eri proove näit. mutatsioonide detektsiooniks
-Odav (1/5 mikrokiibi hinnast)
-Testi ajal viiakse ülekandjad lahusesse, mis sisaldab fluorokroomidega ühendatud DNA-d. Pärast hübridisatsiooni proovid ergastatakse laseriga , mis põhjustab omakorda raadiosignaali tekke ja ülekandja identiteedi tuvastamise
11.Valgukiibid
Genoomika lähendused (DNA mikrokiibid) tihedalt
seotud proteoomikaga (valgukiibid). Tehniliselt sarnased.
Valgukiipide eelis – vaheetappide (bioloogilise materjali amplifikatsioon) puudumine, otseste interaktsioonide määramine, valguekspressiooni muutuste tuvastamine.
Võimaldab tuhandete parameetrite üheagset analüüsi ühes eksperimendis. Valgukiibile on immobiliseeritud valgud, mida kasutatakse eelkõige valk-valk interaktsioonide tuvastamiseks.
Rakendustest : antikehade kiibid diagnostikas, uute
Interaktsioonipartnerite tuvastamine, prognostika, farmakoloogilised eksperimendid .
Valgukiipidele on kinnitatud:
- Antigeenid
-Antikehad
-Aptameerid (ka DNA v RNA)
-Retseporid
-Substraadid (madalmolekulaarsed)
-Ensüümid
12.LCM
Laserpüüdur mikrodissektsioon (LCM):
LCM (Emmert-Buck; NIH) võimaldab valmistada ülipuhtaid mikroanalüütilisi preparaate teiste „high-throughput“ genoomika ja proteoomika meetodite jaoks või otseseks
diagnostikaks.Põhineb inverteeritud mikroskoobi ja madalsagedus infra-punase laseri kombinatsioonil.Tavalisele koeslaidile paigutatakse film , millele laseri toimel
fikseeritakse valitud rakud või koeosad. Neid kasutatakse omakorda kas DNA, RNA või valgu eraldamiseks.Saadud materjale kasutatakse, kas mRNA profileerimisel, DNA aberratsioonide leidmisel, proteoomikas jne.
13.Mittepositsionaalsed kiibid
Põhinevad mitte andmepunktide kogumisele X,Y koordinaadistikus vaid andmepunktid on assotseerunud unikaalsete eri päritolu koodidega. Andmeanalüüs kas FACS või mikroskoopia abil.
14.Mutatsioonide tüübid
Paar bp,suured deletsioonid,triplet ekspansioon ,numeraalsed ja struktuurilised,suured insertsioonid.
Nukleotiidi asendus:kõik.- Suhteliselt tavalised . Sünonüümsed tavalisemad kui mittesünonüümsed.Transitsioonid tavalisemad kui transversioonid
Insertsioon:paar bp, triplet ekspansioon, suured insertsioonid.- Sagedased mittekodeerivas DNAs.Harvad, kuid patogeensed .Harvad (duplikatsioonid, transposonid)
Deletsioon:paar bp, suured deletsioonid.- Sage mittekodeerivas DNAs, harvad kodeerivas osas.Harvad (esinevad kordusjärjestustega regioonides)
Kromosomaalsed vead: numeraalsed ja struktuurilised.- Harvad, tavaliselt patogeensed. Tihti vähirakkudes ja tavalisemad kui somaatilised mutatsioonid.
Transversioonid on pürimidiinide asendused puriinidega ja puriinide asendused pürimidiinidega.
Transitsioonid (sagedad) on pürimidiinide asendused pürimidiinidega ja puriinide asendused puriinidega.
Mutatsioonide klassifikatsioon:
•Funktsiooni kaod (peamiselt retsessiivsed mutatsioonid)loss of function .
•Muutunud funktsioonid (peamiselt dominantsed mutatsioonid)gain of function.
Funktsiooni kaod:
• Geeni deletsioon
• Osaline geeni deletsioon
• Geenistruktuuri muutus (translokatsioon, inversioon)
• Insertsioon geeni sisse
• Transkriptsiooni takistamine
• Promootormutatsioonid
• mRNA stabiilsuse muut
• Doonor splaisingu saidi muutus
• Inaktiveeri splaisingu aktseptorsait
• Aktiveeri krüptiline splaisingu sait
• Lugemisraami nihke teke
• Stopp koodoni teke
• Vajaliku aminohappe asendus
• Takistada protsessing
• Takistada rakusisene 6ige lokalisatsioon
Muutunud funktsioonid (peamiselt vähi puhul):
• Üleekspressioon (CMT)
• Retseptor on pidevalt aktiveeritud
• Uus substraat
• Strukturaalselt valed multimeerid
• Kimäärsed geenid
• Ioonkanalite funktsiooni muut
Dominant negatiivsed mutatsioonid ( kollageen )
15.“Suurte” geenmutatsioonide tuvastamise meetodid
Suurte (≥1000 bp) geenmutatsioonide (deletsioonid,
duplikatsioonid) tuvastamine
• Tsütogeneetilised meetodid
• Southern blot analüüs
• dHPLC
Ühe ahela konformatsioonanalüüs (single strand conformation analysis - SSCP).
Muud mutatsioonide tuvastamise meetodid
• Heteroduplex analüüs (heteroduplex analysis)
• Keemiline ja RNAse A vahendatud mittepaardumise äratundmine (mismatch cleavage)
• Ligaas ahelreaktsioon (LCR)
• Valgu lühenemise test (PTT)
• Otsene sekveneerimine
16.Dünaamiliste mutatsioonide tuvastamine
Dünaamiliste mutatsioonide tuvastamine(trinukleotiidkordused)
Molekulaardiagnostiliste meetodite võrdlus:
Southern blot:
-eelised: Parim tuvastamaks suuri genoomseid muutusi
-puudused: Töömahukas, vajab palju lähtematerjali
Sekveneerimine:
-eelised: Tuvastab kõik muutused
-puudused: Kallis
Heterodupleks analüüs:
-eelised: Lihtne ja odav
-puudused: Puudulik tundlikus ,Väikesed fragmendid
dHPLC:
-eelised: Kiire ja kvantitatiivne
-puudused: Kallis, ei selgu asukoht
SSCP:
-eelised: Lihtne ja odav
-puudused: Väikesed fragmendid
DGGE:
-eelised: Kõrge tundlikus
-puudused: Kallid praimerid
17.TaqMan ja Molecular Beacon töötamisprintsiip
Homogeensed hübridisatsioonitestid kasutades reaalaja PCR-d ja fluorestsentsil põhinevat detektsiooni:
-Tuntumad TaqMan ja Molecular Beacon proovid.Erinevad quencherid (TAMRA ja DABCYL)
-Põhinevad energia ülekandel, kus fluorestsents detekteeritakse tänu muutusele füüsikalises distantsis fluorokroomi ja vaigistaja (quencher) vahel pärast
proovide hübridisatsiooni. FRET (fluoresence resonance energy transfere) tehnika
-Iga SNP vajab spetsiaalpraimereid
-Kõige efektiivsemad väheste SNP-de ja suure hulga proovide puhul
Introduction to TaqMan® probes
TaqMan® probes are dual labeled hydrolysis probes and are a registered trademark of the Roche Molecular Systems, Inc. TaqMan® probes utilize the 5' exonuclease activity of the enzyme Taq Polymerase for measuring the amount of target sequences in the samples. TaqMan® probes consist of a 18-22 bp oligonucleotide probe which is labeled with a reporter fluorophore at the 5' end and a quencher fluorophore at the 3' end.
TaqMan® probe functioning
While carrying out a TaqMan® experiment, a fluorogenic probe, complementary to the target sequence is added to the PCR reaction mixture. This probe is an oligonucleotide with a reporter dye attached to the 5' end and a quencher dye attached to the 3' end. Till the time the probe is not hydrolized, the quencher and the fluorophore remain in proximity to each other, separated only by the length of the probe. This proximity however, does not completely quench the flourescence of the reporter dye and a background flourescence is observed . During PCR, the probe anneals specifically between the forward and reverse primer to an internal region of the PCR product. The polymerase then carries out the extension of the primer and replicates the template to which the TaqMan® is bound. The 5' exonuclease activity of the polymerase cleaves the probe, releasing the reporter molecule away from the close vicinity of the quencher. The fluorescence intensity of the reporter dye, as a result increases. This process repeats in every cycle and does not interfere with the accumulation of PCR product.
TaqMan® probe applications:
1. Quantitative real time PCR.
2. DNA copy number measurements.
3. Bacterial identification assays.
4. SNP genotyping.
5. Verification of microarray results.

Molecular Beacons:

Structure:
A molecular beacon consists of 4 parts, namely
-Loop: This is the 18-30 base pair region of the molecular beacon which is complementary to the target sequence.
-Stem: The beacon stem sequence lies on both the ends of the loop. It is typically 5-7 bp long at the sequences at both the ends are complementary to each other.
-5' fluorophore: Towards the 3' end of the molecular beacon, is attached a dye that fluoresces in presence of a complementary target.
-3' quencher (non fluorescent): The quencher dye is covalently attached to the 3' end of the molecular beacon and when the beacon is in closed loop shape, prevents the fluorophore from emitting light.
Molecular Beacons Functioning:
Molecular beacons can report the presence of specific nucleic acids from a homogeneous solution . In the presence of a complementary target, the "stem" portion of the beacon separates out resulting in the probe hybridizing to the target.
Applications of Molecular Beacons Include:
1 . SNP detection
2 . Real-time nucleic acid detection.
3 . Real-time PCR quantification.
4 . Allelic discrimination and identification
5 . Multiplex PCR assays
6 . Diagnostic clinical assays
18.Suure võimsusega genotüpiseerimise võimalused
Suure võimsusega genotüpiseerimis tehnikad (high throughpout):
Polümeraasipõhised ekstensioonitehnikad (a, b)
- Polümeraasipõhised pürosekveneerimistehnikad(c)
-Hübridisatsioonipõhised (d)
-Alleelspetsiifilised ligatsioonitehnikad
-Alleelspetsiifiline nukleaasi restriktsioon
19.Preimplantatsioonilise diagnostika meetodid
Standartsed prenattaallse diiagnosttiika ttehniikad
Indikatsioonideks:
1. Ema vanus (>35)
2. Eelnev laps kromosomaalse hälbega
3. Perekonnas kromosomaalse hälbe juhud
4. Perekonnas monogeensed haigused
5. Perekonnas neuraaltoru või teised strukturaalsed defektid
6. Hälbed tuvastatud raseduse käigus (kasv)
7. Kokkupuuted riskifaktoritega(sagedased abordid, ravimid)
Testimine võii skriiiiniimiine
-Testitakse indiviide tuvastamaks mutatsiooni ja:
-Pakutakse välja kui esineb perekonnas
-Kui esinevad sümptomid
-Vastsündinutel vaid vara ilmnevate haiguste puhul ning kui saadud infot saab kasutada praktikas
-Skriinitakse valimit kindlast populatsioonist kes:
-Aitaks selgitada haigustumuse riski
-Aitaks kaasa paremaks testimiseks
-Varemaks raviks või elustiili kohandusteks
Geneetilise ttesttiimiise lläbiiviiiimiise kriitteeriiumiid:
-Peab esinema seos testitava geneetilise variandi ja tunnuse vahel
-Indiviid või vastutaja peab andma selleks nõusoleku
-Haigustumuse riski peab olema võimalik modifitseerida (otsene ravi või elustiili muutus)
-Erinevad eetilised, legaalsed ja sotsiaalsed väljundid peavad olema arvesse võetud
-Kasvanud riskiga isikutele tuleb anda võimalus haigusriski vähendamiseks
Ema seerumii uuriingud
-Kasutatakse rutiinselt neuraaltoru defektide ja Down`i sündroomi tuvastamiseks (triple test FP_, hCG_ ja östriool_)
-Verd võetakse 16 rasedusnädalal
-Tuvastatakse 75% neuraaltoru defektidest ( spina bifida) ja 60% Down`i sündroomist
-Uuritakse ka looterakke ema veres (rikastamine trofoblasti vastaste antikehadega)
-α-FP tase näitab ka anencephaly, mitmike olemasolu, emakasisest loote veritsemist jpm.
Amniotsentees ja koorioniibiopsia
Ultrahelli
Fragiilse X diiagnostika kasuttades Soutthern blotingutt(CTG kordused)
-PGD on kliinilise diagnostika osa mis on tekkinud in vitro fertilisatsioonitehnika (IVF) kasutuselevõtu tagajärjel 25 a. tagasi. Varajane alternatiiv prenataalsele diagnostikale (amniotsentees, koorionbiopsia)vähendamaks geneetiliste haiguste edasikannet.
-PGD puhul kasutatakse testimiseks munaraku või varajase loote materjali. Pärast testimist kasutatakse ülekandeks emakasse ainult terveid embrüosi
-Esmakordselt kasutati 1968 küülikutel soo määramisel.Kasutati peamiselt loomapidamises soovitud sooga järglaste saamiseks. Inimesel kliinises diagnostikas
algselt pärilike ensümaatiliste defektide (SCID, Lesch-Nyhani ja Tay-Sachsi sündroom) testimiseks. Alates 80a. seoses PCR ja FISH tehnikate arenguga kiire
edasiminek .
-Momendil kasutatakse erinevat tüüpi reproduktiivsete riskide puhul (X-liitelised retsessiivsed haigused; Xseoselised haigused, kromosomaalsed aberatsioonid)
ning viljatute paaride IVF puhul.
-Alternatiivideks näiteks spermadoonorite(munarakudoonorite) kasutamine
-Diagnostikamaterjalina PGD puhul kas polaarkehad ja hilised (ca. 300) või varajased (8-16 rakku) blastomeerid.
20.Fertiilsuse säilitamise võimalused
Fertiilsuse säilitamise võimalused naistel:
-Munarakkude krüopreservatsioon – kasutatakse eelkõige vähihaigete puhul aga ka diagnoositud varajase menopausi puhul
-Võrreldes loodete külmutamisega väheedukas. Esimene laps külmutatud munarakust 1986, siiani vaid üksikud õnnestunud juhud. Edukus 1:100 külmutatud
munarakust.
-Ohtudeks külmutatud ootsüüdi metafaasi käävi muutused, mis võivad pärast fertilisatsiooni anda aluse karüotüüpiliselt defektsele embrüole.
-Alternatiivseks võimaluseks ovariaalsete kudede krüopreservatsioon ja ootsüütide hilisem küpsemine in vitro. Antud juhul külmutatakse biopsia materjal,mida saab pärast siirdada või eemaldada munarakk IVF-ks. Katseliselt töötab hästi loomadel (kuni
inimahvideni)
-Meestel sperma säilitamine lihtne ja väga levinud.Problemaatiline prepuberteedi eas poiste puhul.Kasutatakse testikulaarsete kudede biopsiate säilitamist. Hulgaliselt eetilisi probleeme.
Meestevärk:
Infertiilsus defineeritakse kui võimetus saada lapsi pärast 1 aastast pidevat üritamist. USA-s 13% abielupaaridest (5 milj. inimest). Meeste viljatuse sagedaseim põhjus on
varicoceles (38%). Areneb välja 15% meestest.
Kordamisküsimused (Kaiu Prikk):
1.Morfoloogiliste uuringute vajadus meditsiinis. Too välja 3 peamist põhjust
Van Gieson värvingut (Picric Acid and Acid Fuchsin segu)kasutatakse
- kollageeni eristamiseks lihastest kasvajate korral
- sidekoe (kollageenide ) rohkenemise näitamiseks haiguste korral
2.Tsütoloogiline ja histoloogiline meetod: mis on nende meetodite olemus, võrdlus ( positiivsus ja negatiivsus )
tsütoloogiline uuring e. rakulise materjali uuring
A: positiivsus:
suhteliselt lihtne ja kiire meetod
B: negatiivsus:
materjali vähesus
materjal eraldatud koestruktuuridest.
vaadeldakse üksikuid rakke
Histoloogiline meetod e.
– haigelt eemaldatud koematerjali uuring
vajab spetsiaalset koetöötlust
enam informatiivne kui tsütoloogiline uuring
Igapäevane diagnostika:
tsütoloogia ja histoloogia täiendavad teineteist
3.Miks teostatakse immunohistokeemilisi uuringuid
Immunohistokeemia = immunotsütokeemia on uurimismeetod ,
-määratakse raku antigeene antikehade abil, millega on liidetud fluorestsiini või värvilisi metaboliite tootvad ensüümid.
-IHK-meetodi eesmärgiks on rakkude täpsem iseloomustamine
IHK-meetod on antigeen - antikeha reaktsioon ,põhikomponentideks on:
1) antigeen - olemas koetükis
2) antikeha - toodetakse kommertsiaalselt või teaduslaborites(suurimad tootjafirmad: Dako, Novocastro, Santa Cruz jne)
3) värvaine-kromogeen (DAB-diaminobensidiin, AEC jne)
Patoloogiateenistuses on kasutusel _135 antikeha (arv täieneb
pidevalt)
Immunohistokeemia põhimõte:
-Ag-Ak reaktsioon ag lokaliseerimiseks
-Värvuva või fluorestseeriva ainega märgistamine
-Elektroontiheda aine kasutamine ( kuld , ferritiin ,peroksüdaaas)
4.Kude fikseerimise eesmärk, fiksatsiooni meetodid
5. Kude fikseerimine formaliinis: positiivsus ja negatiivsus
6. Mis on kiiruuring ehk cito uuring patoloogia laboris
7.Miks kasutatakse antigeeni taastavaid lahuseid immunohistokeemias
Antigeeni taastamine(Antigen Retrieval )
-Formaliini fiksatsioon võib maskeerida ag
-Eeltöötlus nn. ag-taastava lahusega: lagundab proteiinide ristsidemed (tekkinud formaliini fikseerimisel)
Kasutatakse:
- Kuumutamine ag-taastavaslahuses (sobib parafiinlõikudele)
Nimetus: " Heat Induced Epitope Retrieval( HIER )".
Ensümaatiline nimetus "Proteolytic Induced Epitope Retrieval ( PIER )“).
8.Nimeta immunohistokeemias antigeeni taastavad meetodid
9.Immunohistokeemilise värvingu meetodil võib esineda mittespetsiifiline tausta värving: nimeta põhjus, kuidas vältida
-Prim või sek ak mitte-spetsiifiline seondumine
-Pesu pole korralikult tehtud
-Endogeensed ensüümid
10.Millised kontrollvärvingud on vajalikud teostada immunohistokeemias
11.Nimeta peamised immunohistokeemilised meetodid
-Immunofluorestsents meetod
-PAP - peroksidaas-antiperoksidaas meetod
-APAAP meetod – alkaalne fosfataasantialkaalne fosfataas meetod
-Avidiin – biotiin meetod
12.Mis on kaksikvärving
-Vaja ak-produtseeritud erinevates loomades/ rabbit , goat/
-Kui erinevates loomadest võib kasutada nende mikstuuri (hoiad aeg kokku)
-sek ak valik
-Vastava substraadi valik
13.Immunohistokeemilisel värvingul tekkis väga nõrk signaal. Nimeta 5 peamist põhjust.
-Ak lahjendus liiga nõrk
-Ak ei seondu (ei tunne ära) proteiini
-Ak vana, valesti käsitletud
-Deparafiniseerimine pole küllaldane
-Sek ak ei seondu prim ak
-Kude pole korralikult ettevalmistatud
-Ag “retrieval” pole teostatud
-Proteiinid on tundlikud formaliinfiksatsioonile
35