Molekulaardiagnostika (1)

KORDAMISKÜSIMUSED
Talpsep 1. Millisel juhul on LCR eelistatud meetod PCR ­ga võrreldes LCR on suurema spetsiifilisusega kui PCR. Seda on kaval kasutada tuntud järjestuste ja punktmutatsioonide tuvastamiseks kui kasutada oleva DNA kogus on limiteeritud.
2. Milline meetod võimaldab RNA amplifitseerimist DNA juuresolekul? NASBA on RNA tuvastamiseks eriti hea meetod: RNA ahelale saab panna pöördtranskriptaasiga praimeri juurde, sünteesitakse uus ahel, RNAas lõhutakse H-ga ära ja sünteesitakse uuesti jne kuni saadakse detekteeritav kogus nukleiinhappe molekule. Tal on ka see omadus, et töötab DNA juuresolekul ­ ei pea proovi ära puhastama, mis RNA puhul on väga keeruline. Kasutatakse ka ekspressiooniproduktide määramiseks.
3. Millised ensüümid on vajalikud TMA meetodil amplifitseerimiseks? TMA- transcription mediated amplification.
RNA polümeraas ja pöördtranskriptaas
4. Milliste nakkushaiguste diagnoosimisel on nukleiinhappe amplifitseerimise meetodid asendamatud? Bakteriaalsete: kuna ribosoomide järjestused on erinevate bakterite liikide korral erinevad, saab rRNA järjestuse põhjal liike määrata. Kui mikrokannukeses olevas uuritavas proovis on RNA molekul olemas, siis ta spiraliseerub kaksikheeliksiks, mille tunnevad ära värvusreaktsiooni katalüüsivate ensüümidega märgistatud antikehad . Meetodi piiranguks on RNA molekulide piiratud arv (10 000) rakus ­ sellepärast amplifitseeritaksegi RNA hulk PCRil (tekib miljardeid koopjaid). [Seda meetodit nimetatakse GenProbe meetodiks]
5. Mis limiteerib GenProbe meetodi (hübridiseerimine) puhul testi tundlikkuse?
Nukleiinhapete hübridiseerimine: amplifitseerimise korral nimetatakse oligonukleotiidi praimeriks, hübridiseerimisel sondiks. Ahelad keeratakse lahti ja kui on sondile komplementaarne järjestus, siis renaturatsiooni puhul see lühike sond seondub eelistatult DNA ahelaga, sest alati lühike nukleotiidi järjestus seondub pika ahelaga paremini kui kaks pikka ahelat omavahel.
INNO-LIPA hübriidimise meetod: amplifitseeritakse DNA, kasutades biotiin -märget (biotinoleeritud nukleotiidid ), mis seob streptavidiini ­ tekkiv kompleks on üks tugevamaid bioloogilisi interaktsioone. Streptavidiini küljes on veel fosfataas värvireaktsiooni läbi viimiseks . Peale amplifikatsiooni viiakse see kõik testribale, kus iga triip vastab ühele järjestusele. Hübridisatsiooni korral tekib värvireaktsioon.
*Sondi pikkus (mida lühem sond, seda suurem võimalus leida temale vastavaid sama lühikesi järjestusi erineva järjestusega pikemate järjestuste seast). *Nukleiinhape puhtus *Nukleiinhappe kogus *
6. Kuidas tuleks korraldada seroloogilist testimist kui antud nakkuse puhul on seropositiivsus laialt levinud nähtus? Otsida organismist antigeeni, mitte vastust sellele. · Vähemalt kaks järjestikust teist (10 ­ 14 päevase vahega) tuleb teha · Arvestada, et reinfektsioonil IgM tiiter ei tõuse · ja teisi ebamugavusi
7. Loetle PCR eelised. Kiire (analüüsi aeg 2 - 12h) tundlik (avastab 2 ­ 10 patogeeni rakku proovist) tootlik (võimaldab määrata mitu patogeeni ühest proovist) vähenõudlik (transpordi- ja säilitustingimuste suhtes) täpne (tuvastab patogeeni olemasolu, mitte organismi reaktsiooni sellele) lisavõimalused (genotüpeerimine, sekveneerimine ) 8. Loetle PCR puudused mittekvantitatiivne (tavaline PCR puhul) saastamisoht (võib anda valepositiivse tulemuse) ei tuvasta resistentsust antibiootikumidele ei tee vahet elusal ja surnud mikroobil hind (aparatuur, labor , patent) 9. Millised on PCR-diagnostikalabori organisatsiooni põhiprintsiibid? 1. 1. ruumis eraldatakse proovist DNA. See on bioohu ruum, sest töötajad võivad sealt ise nakkuse saada. Ruumid eraldi negatiivse rõhu all, sisse- ja väljaminev õhk filtreeritakse; töötajad hepatiidi vastu vaktsineeritud. 2. Puhas ruum, kus tehakse PCRi stock lahused. 3. Proovide kokku segamise ruum 4. amplifitseerimise ruum termoblokkidega 5. detekteerimise ruum, kus dokumenteeritakse ka tulemused. 6. Mitte ükski asi ei liigu ruume mööda vastupidises suunas. Kõige selle kontrollimiseks on kvaliteedi kontrollimise ja tagamise süsteem (räme bürokraatia) ­ külmkapi näidud käsistsi hommikul ja õhtul üles kirjutada; pipetid regulaarselt kalibreerimisel; jne. Oma arendusosakond peab in house laborites juures olema, et kontrollida ja arendada. Viimasele on alternatiivid robotite ja kitide kasutamine või kommertsiaalsete kitide kasutamine. Kvaliteedikontrollile alternatiive pole. 1. Valideerimise üks osa on laboritevahelised võrdluskatsed, mida viib läbi organisatsioon QCMD.
10. Millised ja millal tehtud avastused olid eelduseks molekulaardiagnostika meetodite väljaarendamisele ? (Nimetage mõned teie arvates olulisemad) 1869 ­ DNA avastamine 1953 ­ kaksikheeliks 1969/70 ­ ensüümid restriktaasid PCR 1989 ­ Taq polümeraas kaksikheeliksite de- ja renaturatsioon nukleotiidide komplementaarsus 11. Milliseid molekulaardiagnostika meetodeid kasutatakse Eestis nakkushaiguste diagnoosimisel? Hübriidimine (sh FISH ) PCR sekveneerimine mikrokiip -analüüs
12. Milliseid meetodeid kasutatakse patogeensete mikroorganismide tuvastamiseks ( mikroskoopia , isoleerimine ja kultiveerimine, biotestid, immunotestid s.o antigeeni määramine ja antikehade määramine, biokeemilised testid, molekulaarbioloogilised testid) ? Erinevate meetodite plussid ja miinused.
Meetodid: 1. mikroskoopia ­ vanim, väga kiire, odav. Paljude patogeenide puhul annab väga hea tulemuse. Valgusmikroskoobid on odavad. Puudused: eeldab väga hea mikroskoopia kogemust; pole väga tundlik meetod; sõltub transpordist; 2. isoleerimine/kultuurimeetod ­ plussiks on spetsiifilisus. Miinused: mikroob ei tohi transpordi käigus enne kultuuri panemist ära surra; võib siiski osutuda mittespetsiifiliseks (söötmetest sõltuv); aeganõudev (tuberkuloosibakter kasvab 1,5 ­ 2 kuud); nõuab samastamist (kasvatame üles, peame veel kinnitama , et on see bakter ­ DNA hübridisatsiooniga); inimest on juba ravima hakatud ja alles siis võetakse proov ­ kasv on pärsitud juba; saastamine transpordil. 3. Biotestid 1. rakukultuur ­ kliiniline proov, millega neid rakke nakatame. Kõige tuntum on klamüüdia diagnostika . Rakukultuuris kasvatatud organism ei tohi olla transpordil või ravi tõttu surnud. 2. Loomkatsed ­ katkupisiku diagnostika. Eetikaküsimus. Loomad on väga kallid. Loomakaitsjad võitlevad selle vastu. 4. Kiirmeetodid (molekulaardiagnostika) 1. nukleiinhapete määramine 2. antigeeni/ antikeha määramine ­ antigeen ja antikeha peavad omavahel väga hästi sobima (steeriliselt ja laenguliselt), kui ainult laengud sobivad, tekib palju valepositiivseid tulemusi. Seroloogilised testid taluvad suht hästi transporti. Palju võimalik osta valmisteste. Suht kiire meetod. Määratakse antigeeni olemasolu veres e organismi vastureaktsioon, aga mitte patogeeni olemasolu veres ­ paljude haiguste puhul jäävad antikehad eluks ajaks püsima ja nii saab seropositiivse tulemuse ja võib ravima hakata kui tegelt vaja pole. Segavad immunkompleksid; ristreaktsioonid; midagi ei saa teada rakulise immuunvastuse kohta. Nakkushaiguste puhul on rusikareegele, et rakuväliste patogeenide puhul tulevad antikehad ja rakusisese ( viirus ) puhul rakuline immuunvastus. Vastuseid on sageli väga raske interpreteerida: selleks, et näha antikehade teket, on vaja kirjeldada nende tekke dünaamikat kahe järjestikuse prooviga (võetakse nt nädalase vahega), mis analüüsitakse korraga. IgM antikeha tekkimisel on alguses kõik viis erinevat raske ahela tüüpi. Pärastpoole lülitatakse ümber teistele antikehatüüpidele. Vastus on alati polükloonne e palju eri antikehi tekib sama epitoobi vastu. Kui nakkus pikka aega püsib, valitakse kõik paremad ja aktiivsemad antikehad välja. Seda afiinsuse olulist muutust tihti laborites ei arvestata. Seroloogilist meetodit soovitatakse rangelt kasutada ainult teadusuuringutes, mitte kliinilistes! 3. proteoomika meetodid 4. PCR ­ suht kiire vastus, ülitundlik (isegi natuke liiga tundlik), väga tootlik, väga vähenõudlik transpordi- ja säilitustingimuste suhtes, väga täpne (tuvastab patogeeni olemasolu), annab palju muid võimalusi (genotüpiseerimine nt). Puudused: 1. DNA kontaminatsioonioht. 2. Mittekvantitatiivne (võib anda valepositiivse tulemuse) 3. ei tuvasta resistentsust antibiootikumidele 4. ei tee vahet elusal ja surnud mikroobil ­ seda ei võeta enam väga tõsiselt, sest enamus surnud mikroobse viiakse organismist välja 2 ­ 3 päevaga. 5. Kallis ­ kas kasutada ise välja (in house) töötatud või kommertsiaalset meetodit. Kommertsiaalsed on kallid, väga paljude patogeenide jaoks ei ole neid kite üldse olemas. In house meetodeid saab suht kiiresti välja töötada patogeenidele vastavalt. PCRi tuleks eelistada siis, kui traditsiooniline meetod ei tööta: 1. mikroskoopia annab valepositiivse vastuse 2. rakusisese parasiidi puhul 3. kui tundlikkus on liiga madal 4. kui on vaja genotüpeerida ­ mis tüübiga on tegu (HCV, HSV) 5. kui mikroobi kasv on aeglane ( tuberkuloos )
13. Millest tulevad vead immunoloogiliste meetodite kasutamisel nakkushaiguste diagnoosimisel? Milliseid vigu ja kuidas saab vältida? Inimestel, kes korra Chlamydia pneumoniae'ga kokku puutuvad, jääbki antikehade tiiter verre igaveseks ­ seropositiivsus. Sellepärast on immunoloogilised (nt ELISA ) testid siinkohal täiesti kasutuskõlbmatud.
antigeeni/antikeha määramine ­ antigeen ja antikeha peavad omavahel väga hästi sobima (steeriliselt ja laenguliselt), kui ainult laengud sobivad, tekib palju valepositiivseid tulemusi. Seroloogilised testid taluvad suht hästi transporti. Palju võimalik osta valmisteste. Suht kiire meetod. Määratakse antigeeni olemasolu veres e organismi vastureaktsioon, aga mitte patogeeni olemasolu veres ­ paljude haiguste puhul jäävad antikehad eluks ajaks püsima ja nii saab seropositiivse tulemuse ja võib ravima hakata kui tegelt vaja pole. Segavad immunkompleksid; ristreaktsioonid; midagi ei saa teada rakulise immuunvastuse kohta. Nakkushaiguste puhul on rusikareegele, et rakuväliste patogeenide puhul tulevad antikehad ja rakusisese (viirus) puhul rakuline immuunvastus. Vastuseid on sageli väga raske interpreteerida: selleks, et näha antikehade teket, on vaja kirjeldada nende tekke dünaamikat kahe järjestikuse prooviga (võetakse nt nädalase vahega), mis analüüsitakse korraga. IgM antikeha tekkimisel on alguses kõik viis erinevat raske ahela tüüpi. Pärastpoole lülitatakse ümber teistele antikehatüüpidele. Vastus on alati polükloone e palju eri antikehi tekib sama epitoobi vastu. Kui nakkus pikka aega püsib, valitakse kõik paremad ja aktiivsemad antikehad välja. Seda afiinsuse olulist muutust tihti laborites ei arvestata. Seroloogilist meetodit soovitatakse rangelt kasutada ainult teadusuuringutes, mitte kliinilistes! 14. Mis on meetodi tundlikkus? Näitab valenegatiivse vastuse saamise ehk haigustekitaja ülesleidmise tõenäosust (%). 15. Mis on meetodi spetsiifilisus? Näitab valepositiivse vastuse saamise ehk ülediagnoosimise tõenäosust (%). 16. Milline on lihtne arvutusvalem tundlikkuse ja spetsiifilisuse määramiseks? Milliste ühikutega neid näitajaid esitatakse? Tundlikkus=positiivsed proovid /kõik proovid x 100% Spetsiifilisus=negatiivsed proovid/kõik proovid x 100% Mida suurem %, seda täpsem analüüs. 17. Võrdle kommertsiaalse kitil (testkomplektil) baseeruva PCR ja in house (home- brew ) diagnostikameetodeid. Millised on kummagi eelised ja puudused? In-house eelised: odavam, väga tundlik, väga kvaliteetne , uute avastuste kiire rakendamine, kliendisõbralik puudused: tulemuste kõikuvus Kommertsiaalne eelised puudused
18. Klamüdioosi, mükoplasmoosi ja ureaplasmoosi diagnoosimise päevaprobleemid (miks diagnoosida, kas diagnoosida, milliste meetoditega, millised on diagnoosimata jäänud nakkuse tagajärjed?).
Chlamydia trachomatis on Euroopas kõige levinum suguhaigus. Aasias avastati laste silma kasvajatest. Naised on 80% asümptomaatilised, aga viga on selles, et ta tekitab väga palju raseduspatoloogiat, enneaegset sünnitust (2 ­ 3 x tihemini) ja sigimatust. Vaginaalse sünnituse kaudu saab laps ka nakkuse, reeglina hingamisteedesse. Diagnoosimine: · Koekultuur ­ spetsiifilisus 100%, aga tundlikkus väga varieeruv (40 ­ 85%); pole enam kuldne standard. · immunofluorestsents ­ tundlikkus väga varieeruv (50 ­ 90%); eeldab kogenud eksperdi kaasamist. · EIA ­ spetsiifilisus hea (93 ­ 99%), aga tundlikkus väga väike ja varieeruv (20 ­ 85%); nõuab täiendavaid uuringuid . · GenProbe ­ spetsiifilisus hea, tundlikkus parem kui eelmistel (70 ­ 85%), aga ikkagi liiga madal. · PCR ­ spetsiifilisus hea (97 ­ 100%), tundlikkus varieeruv, aga siiski parim (70 ­ 95%); DNA kontaminatsioonioht. WHO soovitab kasutada meetodit, mitte tundlikkus on >90% ja spetsiifilisus >99%, seega sobib kasutamiseks ainult PCR.
Ureaplasma parvum on normaalne mikrofloora osa inimesel. Raseduse ajal on ta väga ohtlik, põhjustab katkemist.
Chlamydia pneumoniae tekitab pärgarteri skleroosi (veresoonte lupjumist), tagajärjeks südamerabandus. Ta petab immuunsüsteemi ära: 1. blokeerib fagosoomi 2. varjub latentsesse olekusse (kaetult organismi oma epitoopidega) 3. produtseerib antiapoptootilisi valke (viirustele omane) Inimestel, kes korra CP-ga kokku puutuvad, jääbki antikehade tiiter verre igaveseks ­ seropositiivsus. Sellepärast on immunoloogilised (nt ELISA) testid siinkohal täiesti kasutuskõlbmatud. · Pole kultuuris detekteeritav · Ükski diagnoosimise meetod ei tööta perfektselt · Probleemid ja näpunäited · Kasuta paarisseerumeid (näitab tiitri dünaamikat) · Analüüsi seerumeid korraga (lugemid varieeruvad 2 ­ 4 korda) · Ühekordselt määratud IgG kontroll ei sobi diagnoosimiseks
19. Kopsuhaiguste (tuberkuloos, kopsupõletikud) diagnoosimise probleemid. Tuberkuloos: 1. röntgen ­ mingi plekk kopsus 2. preparaat ­ kui on plekk kopsus, võetakse proov. Sealt otsitakse Kochi kepikest, millega ikkagi ei tohi diagnoosi välja panna. 3. Bakteri kultuuri kasvatamine ­ 1-2 kuud + samastamine (mingi muu meetodiga tõestamine, et on ikkagi tegu õige bakteriga); selektiivsöötmel kaldagaril. 4. Ravimresistentsuse kultuur ­ vedelsöötmes kasvatatakse ja vaadatakse kas on resistentne . 5. PCR või GeneProbe ­ DNA test. Siit on vaja teada, et kasutatakse seda hästi pikka testi, kuigi on olemas ka kiirem test, mida ei kasutata. Lisaks võib tuberkuloos ka kopsuväline olla (nt neerus).
20. Miks on vaja tüpeerida inimese papilloomiviirust, kuidas seda teha?
Tüpeerimine: Sest nad tekitavad kasvajaid (emakakaelavähk, aga ka suu, anaal - ja peenisevähkkasvajad). · Madala riskiga HPV (sh 6 ja 11) põhjustavad tavaliselt genitaaltüükaid · Kõrge riskiga HPV (sh 16 ja 18) põhjustavad halvaloomulisi kasvajaid · Eestis kannab 75% nakatunutest kõrge riskiga viirust · neist ühel kolmandikul on multinakkus, mis tõstab vähki haigestumise riski. HPV-DNA test e genotüpeerimine ja PAP test. DNA test on palju tundlikum , PAP test hästi natuke spetsiifilisem ning risk viie aasta jooksul vähki haigestuda on pap-testiga uurituil 44x suurem kui HPV testiga.
Tekitab emakakaelavähki, levib sugulisel teel. Seega võib vähk olla nakkushaigus. Kusjuures 100% emakakaelavähi juhtudest on viraalse tekkega. HPV kapsiidi valgud on L1 ja L2 geenidelt transleeritavad (late1, late2). Ta on DNA viirus, üks väiksemaid. Episomaalne ­ tema genoom ei lülitu kromosoomi. HPV on hästi levinud ka loomadel, aga siiski liigispetsiifiline. Inglismaal on hästi palju koertel. Lisaks koespetsiifilised (ainult epiteeli , aga erinevad viirused nakatavad erinevat epiteeli). Madala riskiga HPVd vähkkasvajaid ei anna ­ tekitavad kondüloome, tüükaid.
P53 ja veel mõned hoiavad rakkude paljunemise kontrolli all. Vähkkasvaja tekib kui viirus integreerub kromosoomi ja blokeerib paljunemiskontrolli mehanismid ära ­ rakud hakkavad paljunema. Lisaks blokeerivad immuunsüsteemi.
Emakakaelavähk on väga hästi diagnoositav ja ravitav (enne metastaaside andmist).
Levib puutekontaktil (käsi-kõht nt), mistõttu kondoom 100% ei kaitse. Lisaks mitteseksuaalne ülekanne: sünnitusel (lapsel kasvab kõri seest kinni ­ selline rõve haigus võib tekkida); kontamineeritud vahendid (loomad viiakse aastaid kasutamata seisnud latrisse, kus varem oli HPV ja nad nakatuvad ).
Nakkuse 2 perioodi: ajutine ja püsiv (integreerunud vormiga ) infektsioon .
Emakakaela basaalrakkudeni pääsemiseks peab olema koekahjustus, et sisse pääseda. Kogu viiruse elutsükkel on rakkude tsüklist sõltuv. Healoomuliste HPVde puhul tekivad tüükad. Nakatund rakkude ümber on näha suur valge halo, mida on mikroskoobis hästi näha. Integreerunud viiruse jaoks on tegu surnud teega, sest viirus ei saa paljuneda, aga nakatunul on ka kehvasti, sest suure tõenäosusega rakud hakkavad paljunema ja metastaase andma. HeLa ­ emakakaela kartsinoom . HPV puhul immuunvastust ei teki, sest ta vere kaudu ei levi; kapsiidivalkude ekspressioon on väga madal, v.a viimases etapis; nakatund rakud ei puhune ja proinflammatoorseid tsütokiine ei vabane; E6 ja E7 blokeerivad immuunsüsteemi.
21. Mis on hospitaalinfektsioonid ? Kuidas neid diagnoosida?
Molekulaardiagnostika on täiesti asendamatu hospitaalinfektsioonide puhul. Neid on 2 tüüpi: need, mis on pidevalt haiglas olemas ja need, mis tuuakse sinna teiste inimestega sisse. Hospitaalinfektsioonid on haiglaspetsiifilised, selle tuvastamiseks kasutatakse Pulse-Field elektroforeesi. Nii saab suuri DNA fragmente paremini lahutada.
22. Milline on HI-viirusega nakatumise tõenäosus? Millest see sõltub? Suguline: naiselt mehele ­ 1/700 - 1/3000 mehelt naisele ­ 1/200 - 1/2000 mehelt mehele ­ 1/10 - 1/1600 fellatsioon - 1/16 Parenteraalne: nakatund verega - 95/100 nakatund süstlaga - 1/150 Emalt lapsele AZT ravita - 1/4 AZT ravi foonil ­ 1/10
Sõltub HIV tiitrist seksuaalsekreedis, HIV tiitrist veres, seksuaalkontaktist, HIV nakkuse faasist, ülekande viisist, teiste suguhaiguste põdemisest (näiteks sperma viirustiiter sõltub koinfektsioonist), immuunsüsteemist, retseptorist (CCR5 defektid ), epiteeli olukorrast, soost. Teiste suguhaiguste põdemise korral tõuseb nakatumise risk 3 ­ 4 korda, sest tõenäoliselt esinevad põletikud, epiteeli vigastused, endotserviksis on rohkem CD4 lümfotsüüte. Süüfilis tõstab CCR5 ekspressiooni, klamüüdia võimendab replikatsiooni.
23. Kas HIV diagnostikat Eestis tuleks parendada? Kui "jah", siis kuidas? Kui "ei", siis miks? Eesti probleemid: 1. kvaliteedisüsteem on pigem erand kui probleem. 2. Laborid omavahel ei taha koostööd teha, konkurentidena käsitlemine absurdini: näiteks puudub HIV register tänu sellele, sest keegi ei anna teistele infot välja ja Eestis toimuvast ei saa korralikku ülevaadet. 3. Kommunikatsioonibarjäärid: arst vs labor. Laboriarstid õpivad arstiks ja pärast spetsialiseeruvad laborile, saades keemia poolest aru ja seletades selle arstile arusaadavalt ära (ja vastupidi). Reeglina arstid, eriti perearstid , ei oska labori tulemusi interpreteerida (eriti need, kes paarkend aastat tagasi med.kooli lõpetasid). 4. Kõigil peab olema pikem ja säravam kui naabril ­ haigekassa maksab sigakallid masinad kinni, mitte et keegi neid kasutada oskaks.
Spetsiifilisust on võimalik tõsta, tundlikkust mitte eriti (matemaatiline). Testide kombineerimine tõstab spetsiifilisust.
24. Kas molekulaardiagnostika turg võiks olla investori jaoks atraktiivne? Miks? Jah, sest ravimitööstus, sh diagnostika, on üks maailma juhtivatest majandusharudest ja seal liiguvad vähemalt sama suured summad kui teises juhtivharus ­ sõjatööstuses. Kuna inimesed tahavad terved olla, on ravimitele ja diagnostika meetoditele alati nõudlust, mis eriti suureneb seoses maailma rahvaarvu kasvuga. Muidugi on siin tagasilöögiks, et rahvaarv kasvab eelkõige maksujõuetute arengumaade arvelt, kuid samas muutuvad rikkamate riikide poolt neile saadetavad toetused ka selle võrra suuremaks ja kuna arengumaades on meditsiiniabi eriti kriitiline seoses rahapuudusega ja nakkushaiguste vohamisega, läheb suur osa sellest rahast ravimitööstuse tasku . Kuna molekulaarrdiagnostika on alles arenev haru, kus on väga palju avastustöid veel tegemata, tasub investoritel vaadata perspektiivikamad teaduslaborid ja teadlased välja ning neile raha anda, et hiljem nende pealt rikastuda. Kui esimene valik ei õnnestu ja põhja läheb, pole hullu midagi, sest tegijaid kerkib nagu seeni peale vihma ja mõni neist teeb lõpuks ikka kõik investeerija seni ebaõnnestunud investeeringud mitmekordselt tasa. Probleemid molekulaardiagnostika turu arenemisel: * Asümptomaatilised patsiendid ei ole huvitatud preventiivsetest sõeluuringutest. Lahendus: tõstame teadlikkust ja paneme nad muretsema, küll siis huvi tekib.
25. Milliseid diagnoosimise meetodeid peaks kasutama regionaalhaigla? Põhjenda.
Aaspõllu 1. Kriteeriumid DNA tüpiseerimismarkerite valimiseks. * peavad olema polümorfsed (et oleksid informatiivsed) * peavad olema ühe lookuse markerid (selge arv ja asukoht) * neutraalsed (et puuduks valik) * erinevates kromosoomides (sõltumatud)
2. Isikutuvastamisel kasutatavad RFLP , STR ja SNP markerid: eelised ja puudused. RFLP - restriction fragment length polymorphism STR ­ short tandem repeats : eelistatuimad geneetilised markerid, kuna on hõlpsalt ja kiiresti analüüsitavad, genoomis küllalt sagedased, erinevates populatsioonides sagedased, kodominantsed, väikese suurusega, võimalik multipleks analüüs, PCR võimaldab kasutada väga väikeseid proovikoguseid, degradeerunud DNA analüüsitav.
Polümorfsuse probleemist üle saamiseks on vaja analüüsida paljusid erinevaid lookusi, et viia kahtlusaluste ringi võimalikult väikeseks. SNP lookuste puhul on eriti palju erinevaid lookusi vaja analüüsida, sest nad on nii väikesed, et juhusliku kokkulangevuse tõenäosus on suurem. SNP alusel saab rassi määrata ­ nende populatsioonidevahelised erinevused on suuremad kui STRide puhul. Puudus: teises populatsioonis ei saa jälle sama SNPi kasutada, sest sagedus on väga erinev. STRid on eelistatuimad geneetilised markerid: · Hõlpsalt analüüsitavad · genoomis küllalt sagedased · Erinevates populatsioonidest väga varieeruvad · Kodominantsed (saab tuvastada mõlemad alleelid ) · Väikesed, võimalik multiplex analüüs · Võimalik alleelide digitaalne säilitamine · alleelsed redelid (ehk teadaolevat erinevate alleelide komplektid) lihtsustavad interpretatsiooni · PCR võimaldab kasutada väga väikseid proovikoguseid · Degradeerunud DNA on analüüsitav STR (short tandem repeats) SNP ( single nucleotide polymorphisms) Esinemine inimgenoomis ~1 iga 15kb kohta ~1 iga 1kb kohta Üldine informatiivsus Kõrge Madal Markeri tüüp di-, tri-, tetranukleotiid, Bialleelsed markerid kordusmarkerid Alleelide arv markeri kohta Tüüpiliselt >5 Tüüpiliselt 2 Detekteerimismeetod geel/kapillaarelektroforees Sekveneerimine, mikrokiip Multipleksi võimalus >10 markerit mitme Potentsiaalselt 1000 SNPd fluorestseeruva värviga kiibil
3. STR markerite iseloomustus (korduste tüübid, alleelide tähistamine, alleelide eristamine).
· Dinukleotiid · Trinukleotiid · Tetranukleotiid · Pentanukleotiid · Heksanukleotiid Alleele eristatakse pikkuse alusel ehk mõõdetakse DNA juppide pikkusi. Mida suurem on 2 alleeli pikkuse erinevus, seda väiksem võib lahutustundlikkus olla. Näiteks 1 nukleotiidilise erinevuse nägemiseks peab suurem lahutusvõime olema ­ agaroosgeelil paarinukleotiidilist erinevust ei erista. Kordused->kordusühikud->kordusjärjetused. Kordused võivad ka järjetuse siseselt natuke erineda. Korduste arv lookuses on erinev ­ alleelid erinevad teineteisest selle poolest, mitu korda seda kordust seal on. Sellega külgnev ala pole polümorfne ja selle vastu disainitakse praimerid. Kui saame vanematelt täpselt samasugused alleelid samade korduste arvuga, on nad sama lookuse suhtes homosügootsed. Tavaanalüüsil kasutatakse erinevaid lookusi eri kromosoomides. Võrdluseks kasutatakse erinevatest proovidest võetud samu lookusi.
4. Mikrovariantsed STR alleelid (definitsioon, tähistamine) ja null-alleelid (esinemine, miks probleemsed). Kõigil alleelides ei ole täispikka kordusühikut osaliste kordusühikutega alleelide tähistamine: täiskorduste arv ­ punkt ­ aluste arv osalises korduses DEF: Alleelid, millel pole aluskordusmotiivi täpseid kordusi või esinevad kordusmotiivi järjestuse variandid või mõlemad Võivad esineda insertsioonid, deletsioonid, aluse vahetused Järjestuse variatsioon võib esineda korduse sees, külgnevas alas või praimeriga seondumise alas Võib põhjustada PCR ebaõnnestumist, kuid praimeriga seondumise sait on muteerunud : null-alleelid Alleelid esinevad, kuid ei amplifitseeru nukleotiidi muutuse tõttu praimeri seondumissaidis heterosügootse isiku võib nii vale-homosügootseks määrata kaks PCR praimerite komplekti annavad erinevad tulemused probleemid andmebaaside kasutamisel uute kittide kasutusele võtmisele eelnevad põhjalikud uuringud
5. "Stutter" produktid (definitsioon, esinemine, miks probleemsed). Piigid, mis on tõelistest alleelidest peamiselt 1 kordus lühemad (ahela libisemine DNA sünteesil) Avalduvad vähem suuremate kordusühikute korral Pikemad kordused tekitavad rohkem stuttereid Iga järgnev stutter on väiksema intensiivsusega Teevad segaproovide interpreteerimise keeruliseks (kas on tõesti stutter või hoopis teise inimesed DNA).
6. Autosoomsed markerid vs mtDNA markerid vs Y kromosoomi markerid kasutamiseks isikutuvastamisel. Amelogeniin ­ soo määramise marker Sugupuu markerid: mtDNA ­ informatiivsus väike, sest muteerub palju; heteroplasmia: ühel inimesel mitu erinevat mtDNA järjestust emaliinis päritav polümorfne kontrollregioon (D- loop ) rakus palju koopiaid: säilib paremini ­ võrdlemiseks palju võimalusi Y kromosoom isaliinis päritav palju Y STR ja Y SNP markereid Haplotüübi määramine mtDNA ja Y puhul ei saa sugulaste vahel vahet teda, tuumsete markeritega saab. Tunnus Tuumne DNA mtDNA Genoomi suurus ~3 miljardit bp 16 000+ bp Koopiate arv rakus 2 (1 alleel mõlemalt vanemalt) Võib olla >1000 Struktuur Lineaarne (kromosoomides) Rõngas Päritakse Emalt ja isalt emalt Põlvkondlik rekombinatsioon Jah Ei Unikaalsus Unikaalne Ei ole unikaalne Muteeruvus Madal >5-10x tuumsest kõrgem
7. Bioloogilise materjali kasutatavus isikute tuvastamiseks: enimkasutatavd proovid, DNA saagised. Klassikalised proovid sisaldavad palju DNAd, vanasti kasutati ainult neid ( veri , sülg, sperma jm). Mitteklassikalised proovid on kasutusel tänapäeval rohkem kui klassikalised, põhiosa neist tuleb kontaktjälgedest. Enimkasutatavad proovid ja DNA saagis: · veri, 30 000 ng/ml · sperma, 250 000 ng/ml · sülg, 5000 ng/ml · uriin, 1 ­ 20 ng/ml · karvad , tõmmatud: 1 ­ 750 ng/ml; langenud: 1 ­ 12 ng/ml · hambad, · luud , · muud koed .
8. Erinevad meetodid DNA eraldamiseks/DNA puhastamiseks : eelised, puudused.
· Orgaaniline ( fenool -kloroform) ­ puudused: aeganõudev, ohtlikud kemikaalid , suur kontaminatsioonioht ja vigade tekkimise oht. Eelised: sobib RFLPks ja PCRiks, saadakse kõrgmolekulaarne ja hea kvaliteediga DNA. · Chelex ­ põhineb ioonvahetajatel (lahusest võetakse ära kahevalentsed ioonid , et nukleaasid ei saaks DNAd lagundama hakata); puudus: kõiki amplifikatsiooni inhibiitoreid ei saa välja. Kasutatakse põhiliselt võrdlusproovidel. · Kommertsiaalsed kitid · Proovid spetskandjatel ­ proov võetakse kohe spetskandjale. Nagu filterpaber : DNA läheb maatriksisse ja kaitstakse degradatsiooni eest. Eelis: saab pikaajalised toatemperatuuril säilitada. Enamasti kasutatakse võrdlusproovidel. · IsoCode kaart · FTA kaart
9. STR markerite multiplex analüüs fluorestsentsmärgiste kaudu (mis on multiplex analüüs, miks fluorestsenstsmärgised, milline märkimisviis). Multipleks: samaaegselt võimalik kopeerida üle 10 markeri tundlikkus alla 1ng DNA võimalik analüüsida segaproove ja degradeerunud proove erinevad fluorestsentsmärgised võimaldavad vahet teha sama pikkusega STR alleelide vahel Praimerid: ei tohi kinnituda samasse kohta ega omavahel valik/ disain ülioluline Eelised: ajaühikus saadakse rohkem infot väiksem töökulu tulemuste saamiseks vaja vähem proovi Väljakutsed: praimerite disainimine (pole programme) reaktsiooni optimeerimine katseeksituse meetodil, võtab aega
10. Pikkusmarkerid ja alleelsed redelid STR alleelide kindlaktegemisel (mida endast kujutavad, miks on vaja).
Alleelne redel on komplekt erinevaid alleele, mis on kokku pannud enamlevinud alleelivariantidest. Kapillaarides jooksutatakse paralleelselt kaks proovi: ühes kapillaaris pikkusmarker + uuritav DNA, teises pikkusmarker + alleelne redel. Pikkusmarkeris on alati teadaoleva pikkusega produktid ja seda kasutatakse erinevate proovide omavaheliseks võrdluseks. Proovis võivad esineda ka alleelid, mida pole alleelses redelis ­ need on mikrovariantsed alleelid.
Veske 1. Numbriliste ja struktuursete kromosoomi anomaaliate klassifikatsioon
Numbrilised:
* polüploidia ­ kromosoomistiku mitmekordsus * miksoploidia ­ kaks või enam rakuliini erinevate kromosoomide arvuga o kimäärsus ­ eri rakuliinid eri sügootidest o mosaiiksus ­ eri rakuliinid pärinevad samast sügoodist + polüplodine mosaiiksus ­ diploid/triploid + aneuplodne mosaiiksus ­ normaalne/trisoomia 21 * aneuploidia ­ teatava kromosoomi lisandumine või kadu
Struktuursed (seotud kromosoomide murdumisega):
* 1 murre ühes kromosoomis ­> terminaalsed deletsioonid * 2 murret ühes kromosoomis ­ inversioonid (regioon murdekohtade vahel pöördub 180°), sisemine deletsioon (murrete vaheline osa deleteerub, terminaalsed fragmendid ühinevad), rõngaskromosoomid (murdekohtade vahel tekib fusioon ) * 2 murret eri kromosoomides ­ retsipookne translokatsioon (aksentriliste fragmentide balansseeritud vahetus), tsentriline translokatsioon (kahe akrotsentrilise kromosoomi tsenterfragmentide fusioon) * 3 murret, 2 vähemalt samas ­ insertsionaalne translokatsioon (regioon kahe murdekoha vahel lülitatakse kolmandasse murdekohta samal või teisel kromosoomil )
2. Mosaiiksus ja kimäärsus
Mosaiiksuse puhul muutus geneetilises materjalis , kimääride puhul kahest sügoodist pärit rakkude vahetus või fusioon.
3. Genoomi ebastabiilsus
Harvad pärilikud haigused mille puhul on suurenenud somaatiliste mutatsioonide ning kromosoomide ümberkorralduste, murdumiste sagedus. Viivad eelsoodumuseni vähi tekkeks. Suures osas tingitud reparatsioonigeenide defektidest.
Bloom syndrome, ataxia telangiectasia, fanconi anemia
4. Uniparentaalne diploidia ja disoomia, vermimine
Uniparentaalse diploidia puhul on karüotüüp arvuliselt "normaalne". Sellest hoolimata on normaalne areng häiritud, kuna kõik kromosoomid on pärit samalt vanemalt ­ patoloogiline seisund. Isalt ­ koorioni kartsinoom ( platsenta ülivohamine), emalt ­ ovariaalne teratoom (loote rakumass areneb, mõned koed on ülispetsialiseerunud ­ näiteks hambad vormitus rakumassis). Androgeneetilise (ehk isapoolse) geenikomplekti puhul loode põhimõtteliselt puudub ja aborteerub. Günogeneetilise puhul sureb 40 somiidi staadiumis.
Uniparentaalne disoomia ­ mõne kromosoomi mõlemad homoloogid ühelt vanemalt
Uniparentaalne isodisoomia ­ 1 kromosoomi identsed koopiad on ühelt vanemalt
Nt PraderWilli sündroom ­ puuduvad isapoolsed alleelid. Angelmani sündroomi puhul puuduvad emapoolsed alleelid.
Gene imprinting - geenide "vermimine" [mõned ema- või isapoolsed alleelid metüleeritakse erinevalt, mistõttu ekspresseeritakse neid erinevalt, näiteks ainult ühte neist; imetajate geenidest moodustavad "vermitud" geenid umbes 0,1 %
5. Klassikalised kromosoomide värvimistehnikad
* G ­ bänding: kromosoome töödeldakse trüpsiiniga ja värvitakse Giemsa värviga. Tumedalt värvitud vöödid tuntud. Soosib A-T rikkaid alasid. * R ­ bänding: enne Giemsaga värvingut denatureeritakse kuuma ja sooladega. Värving vastupidine G-bändinguga * Q ­ bänding: kromosoome värvitakse florestseeruvate värvidega, seostuvad eelsitatult AT rikastele aladele . Kromosoome vaadeldakse UV valguses. Sarnane G-bändingule. * C ­ banding : värvitakse heterokromatiinne osa telomeeride piirkonnas (va y-kromosoom, mis värvub häguselt üle kogu kromosoomi). Kromosoome denatureeritakse BaOH'ga ja seejärel Giemsa.
6. FISH ja tema variatsioonid
FISH ­ fluorescent in situ hybridization ­ tsütogeneetiline meetod, millega määratakse DNA lõike ja asukohta kromosoomis. Meetod kasutab hübridisatsiooni sondi, mis seondub ainult sellele kromosoomi osale, millel on väga kõrge samasuse aste. Sond on iseenesest lühike DNA jupp (100 ­ 500 ap), mis on denatureeritud üheahelaliseks ning seejärel markeeritud flurestseeruvate markeritega. Fluorestents mikroskoopia abil saab üles leida kromosoomi piirkonna, kuhu sond on seostunud.
Cod-FISH: (chromosome orientation and direction FISH) määrab kromosoomi 3' ­ 5' orientatsiooni ja inversioone (ümberpööratud jupp). Suuna annab C-rikka ahela telomeerses piirkonnas hübridiseerinud sond.
Q-FISH: telomeeride pikkuse tuvastamine . Kasutatakse telomeerspetsiifilisi PNA'sid (peptiidsidemetega nukleiinhapped), võimaldab võrrelda individuaalsete telomeeride pikkusi. Subtelomeersed deletsioonid nõrgamõistuslikkuse sage põhjus. Q-FISH'i edasiarendus on Flow- FISH: kasutatakse interfaasi rakke, hübridiseeritakse lahuses (3D keskkond) ­ paljude rakkude üheaegne analüüs. Signaal tuvastatakse FACSiga.
LT-FISH (low temp) ­ madalal temperatuuril (37), mitteensümaatiline, kromosoomide analüüs skaneeriva lähivälja optilise mikroskoobi abil, eelis kromosoomide ja kromatiini intaktsuse säilimine (ehk näeb terveid kromosoome, mis kõrgemal temperatuuril katki läheks). Fragile X puhul on hea kasutada seda meetodit.
COMBO-FISH: eelmise edasiarendus, põhineb faktil, et 1-2% inimgenoomist on ~14 aluspaarilised homopuriinid või homopürimidiini järjestused, proovina homopuriinid või homopürimidiini järjestused, mis moodustavad DNA-ahelaga kolmikahela, DNA denatureerimine pole vajalik. LT edasiarendus; kasutatakse lühikesi oligonukleotiide, mis mahuvad DNA ahela pöörde ( groove 'i) vahele ­ pole vaja räiget DNA töötlust ja denaturatsiooni.
Fiber -FISH: Lahutusvõime paar kb (väga hea!); kasutatakse interfaasi kromosoome (väljavenitatud kromosoomikiud) ­ DNA on fiibritena, katkeb kergesti. Näha on intron- ekson struktuur.
SKY-FISH: FACSis sorteeritud kromosoomid (terve karüotüüp) on eraldi purkides, neid saab värvida erinevate värvidega. Segu hübridiseerime meid huvitava karüotüübi vastu. Kadunud regioonis ei anna signaali ja näha on kõik suuremad kromosomaalsed ümberkorraldused, mida vähirakkude puhul on kõvasti. Saab kiiresti täielikult ülevaatliku pildi situatsioonist.
m-FISH: tulemus umbes sama, mis SKY'l, muidu natuke erinev (näiteks eksitatsioon). Tehakse spektraalanalüüs.
3D-FISH: Interfaasi rakus on kromatiin lahti pakitud ja aktiivne, aga kromosoomide asukoht ei ole suvaline . Kromosoomide territooriumid näeb ära konfokaalmikroskoopiaga funktsioneerivas intaktses tuumas: reaalajas transkriptsiooni, splaissingu jm vaatamine.
7. Võrdlev genoomne hübridisatsioon
... on molekulaar -tsütogeneetiline meetod, mis uurib geenikoopiate numbri muutusi kasvajarakkudes. Meetod baseerub fluorestseeruvalt värvitud tuumori ja punaselt värvitd (rhodamiin) normaalse DNA võrdluses. Meetod detekteerib vaid mittebalanseeritud muutusi. Erinevalt värvitud DNA'd segatakse, lisatakse cot-1 DNA'd (et alla suruda korduvaid DNA järjestusi). Segu hübridiseeritakse normaalsete metafaasi kromosoomidega. Värvingust on seejärel aru saada, mis osad on puudu või juures.
Teiste sõnadega:
Võtad normaalse genoomi (näiteks miljoni raku oma), värvid ühe värviga. Võtad vähikahtlusega proovi, eraldad genoomse DNA, värvid teist värvi, lisad cot-1 DNA, mis hoiab ära mittespetsiifilise hübridiseerumise, korduvad järjestused. Selle seguga värvid normaalse karüotüübi. Vähirakkudes on suured deletsioonid/duplikatsioonid, mistõttu haige ja terve DNA hübridiseerumisel tekivad ülejäägid, kui mõlemat täpselt samapalju panna. Üleliigsetest osadest jääb värvi üle, puudujääkide korral ei värvita kogu normaalset karüotüüpi ära. Nii saab teada, millised osad on vähiga genoomis üles ja/või puudu ja kas üldse on tegu vähiga.
8. Mikrokiipide variandid, kasutamine, põhimõtted
Mikrokiibid on väiksed silikoon-või klaasislaidid, mille pinnale pandud tuhandeid DNA üheahelalisi sünteetilisi fragmente, mis kokku moodustavad uuritava geeni. Kasutades erinevaid hübridisatsioone mõõdetakse nende ekspressioonitaset, andmed kogutakse kasutades laseraktiveeritud fluorestsentsloendurit, kogu protsess "ultrakiire ja ökonoomne". Kuna kiibitehnoloogia on suhteliselt uus asi, siis on see eelkõige uurimistööriist. Loodetakse kasutada ulatuslikel populatsiooniuuringutel
Kasutusvõimalused meditsiinis: · Haigusseoseliste geenide leidmine · Õige ravikuuri määramine · Ravimite kõrvalmõjude ja vastuse ennustamine · Täpse diagnoosi andmine, sadade eri parameetrite põhjal · Geenikoopiate arv ( array CGH) · Uute ravimite sihtmärkide leidmine, ravimite testimise ning avastamise hõlbustamine jpm.
Kontrollimaks , kas patsiendil on uuritav mutatsioon näiteks võetakse patsiendilt proov ning ka proov puhast, kindlasti muteerumata materjali. Proovid denatureeritakse, DNA lõigatakse lühemateks juppideks, märgistatakse erinevate fluorestseeruvate markeritega (patsiendi oma rohelisega , kontroll DNA punasega ). Mõlemad proovid siiratakse kiibile ning lastakse kiibil olevate (normaalsete) geenijuppidega hübridiseeruda/seostuda. Juhul, kui patsiendil mutatsiooni ei esine, senduvad mõlemad kiibile. Kui mutatsioon esineb, ei saa muteerunud osa korralikult seostuda vastavale osale. Vastavat regiooni on seejärel võimalik lähemalt uurida.
Veel tavalisi kasutusvõimalusi: · ekspressioonitaseme võrdlemine · sekveneerimine · genotüpiseerimine · kvantifikatsioon ­ genoomide analüüs: mutatsioonide, SNPde tuvastamine · kvalifikatsioon ­ ekspressiooni profileerimine · Eri patogeenide tuvastamine ( tollis ) Loetakse fluorestsentsanduritega.
Affymetrix Gene ChipTM: Klaasil kovalentse linkeri abil fotoaktiivsed järjestused, mask ees. Vahel avatakse teatud positsioonid maskis ja lisatakse mingi nukleotiid , mis ühineb -> protekteeritakse -> mask ette tagasi -> avatakse järgmised positsioonid. Nii sünnibki jupphaaval oligonukleotiid . Oligokiibid: Uuritakse absoluutset geeniekspressiooni taset kui palju saab sekveneerida (?) SNPde genotüpiseerimine
Spotitud cDNA mikrokiibid: DNA kloonid klaasile, kuhu hübridiseeritakse RNA, millest tehtud cDNA, mis värvitakse ja hübridiseeritakse microarrayga. Kahe laseriga (punane, roheline) mõõdetakse tulemit. Arvuti arvutab välja ekspressioonitasemete pildi: midagi on tõusnud, midagi langenud, midagi samaks jäänud. Näiteks anname rakukle kuumasoki ja siis analüüsime 2000 geeni reaktsiooni. plussid: odavamad, paidlikumad, võrreldakse paralleelseid proove; miinused: vaja olla 100% kindel, mida kiibile paned, mõõdetakse suhtelist ekspressioonitaset (ekspressioonitasemete vahe). Spotterid e tilgutusnõelad -> tilk klaasile, kus igas augus on järjestus. Kasutamine: SNPd mutatsioonid ekspressioonianalüüs interaktsioon Põhiplatvormid: cDNA kiibid lühikeste oligote kiibid pikkade oligodega kiibid Põhiprobleemid:
9. Koekiibid
Organiseeritud kudede prafiinilõigud, koostatud sadadest prooviblokkidest. Metoodikad:IHC, ISH, FISH, HC. Uute antikehade sobivuse testimine , prognostiliste antigeenide leidmine, arengubioloogilised küsimused, võimalused kiirpatoloogilisteks uuringuteks, võimalik edasiarendus rakukiip, kudede omadused muutuvad sügavuti, paljud antikehad ei tööta parafiinilõikudel, ICH on raskesti kvantifitseeritavad.
Koelõik tuleb fikseerida nii, et seal olevad koe molekulid ei laguneks: sisestatakse parafiini, lõigutakse mikrotoomiga, värvitakse antikehadega või in situ hübridisatsiooniga (RNA vaatlemine märgistatud cDNAga või RNAga). Paari millimeetrise läbimõõduga toru lüüakse läbi koetüki, pannakse ~100 toru raamile ja vastuvõtvasse parafiinblokki, parafiin lõigatakse viiludeks -> kiibile saab palju koetükke korraga.
Kasutamine: · Immunohistokeemia · In situ hübridisatsioon · FISH · Klassikaline histokeemia
+/-: · Hea diagnostiline antikeha on väga pirtsakas. · Saab erinevaid antikehi korraga testida · Kiirdiagnostikas kasutatav · Edasiarendus: rakukiip (tulevikuteema) · kudede omadused muutuvad sügavusest ja suurendusest sõltuvalt (raku tase vs koe tase) · kallis · raskesti kvantifitseeritav · paljud antikehad parafiinlõikudel ei tööta
10. Rakukiibid
new appliance to allow the screening of DNA molecules on droplets in cell chips. The aim is to cultivate series of eukaryote cells in drops, individually set on a support that will be engineered so as to carry out the screening of the DNA molecules and analyse the modifications of the transcriptome brought by the transfection. In the drops, the cell can adhere to the support or maintained in suspension
kasutatakse rakkude "high-throughtput" testidena uurimaks geenifunktsioone pärast mõjutamist. Positsioonilised kiibid on tehnika kus kasutatakse võrdluseks kindlaid cDNA klastreid X,Y koordinaadistikus. cDNA kloneeritud vektoritesse ja seotud mikroskoobi slaidile, pärast transfektsiooni adhereeruvad rakud moodustavad korrapärase array, eeliseks natiivne vorm.
11. Valgukiibid
Valgukiipide eelis - vaheetappide puudumine, otseste interaktsioonide määramine, valguekspressiooni muutuste tuvastamine. Võimaldab tuhandete parameetrite üheagset analüüsi ühes eksperimendis. Valgukiibile on immobiliseeritud valgud, mida kasutatakse eelkõige valk- valk interaktsioonide tuvastamiseks. Rakendustest : antikehade kiibid diagnostikas, uued interaktsiooni partnerid , prognostika, farmakoloogia .
Valgukiipidele on kinnitatud: · Antigeenid · Antikehad · Aptameerid (ka DNA v RNA) · Retseporid · Substraadid (madalmolekulaarsed) · Ensüümid
Valkude seostumisvõime pinnale sõltub laengust pH'st, viskoossusest, soola kontsentratsioonist jne. Seostumine võib toimuda läbi diffusiooni, absorbtsiooni, kovalentse sisemega, affinse seostumisega.
12. LCM
Laser Capture Microdissection ­ laserpüüdur mikrodissektsioon LCM (Emmert-Buck; NIH) võimaldab valmistada ülipuhtaid mikroanalüütilisi preparaate teiste ,,high-throughput" genoomika ja proteoomika meetodite jaoks või otseseks diagnostikaks. Põhineb inverteeritud mikroskoobi ja madalsagedusega infrapunalaseri (et proovi ei vigastataks) kombinatsioonil ­ koeslaidist lõigatakse välja vajalikud rakud või koetükid, mis viiakse edasiseks analüüsiks ebsi.
Tavalisele koeslaidile paigutatakse film , millele laseri toimel fikseeritakse valitud rakud või koeosad. Neid kasutatakse omakorda kas DNA, RNA või valgu eraldamiseks. Saadud materjale kasutatakse kas mRNA profileerimisel, DNA aberratsioonide leidmisel, proteoomikas jne.
13. Mittepositsionaalsed kiibid
Rakud märgistatakse erinevalt, segatakse kokku, jaotatakse laiali. Andmepunktid on seotud algselt erinevalt märgistatud rakkudega. Nt Quantum Dot märgistab fluorestseeruvate nanokristallidega, populatsioonile saab anda kindla ribakoodi: arvuti loeb täppidel olevad omadused. Pharmaseq nanotehnoloogia : ülekandjad viiakse lahusesse, igal ülekandjal on erinev oligo küljes. Lahus sisaldab fluorokroomidega ühendatud DNAd. Pärast hübridisatsiooni ergastatakse proovid laseriga, mis põhjustab kindla koodiga raadiosignaali tekke ülekandjal. Nii on võimalik sekveneerida.
Põhinevad mitte andmepunktide kogumisele X,Y koordinaadistikus vaid andmepunktid on assotseerunud unikaalsete eri päritolu koodidega, andmeanalüüs kas FACS või mikroskoopia. Pharmaseq tehnoloogia ­ testi ajal viiakse ülekandja lahusesse, mis sisaldab fluorokroomidega ühendatud DNA-d. Pärast hübridisatsiooni ergastatakse proovid laseriga, mis põhjustab raadiosignaali tekke, ja ülekandja identiteedi tuvastamise.
14. Mutatsioonide tüübid
· nukleotiidi asendus ­ suhteliselt tavalised . Transversioon (pürimidiin asendus puriiniga ja vastupidi), transitsioon ­ sagedasem (pürimidiin asendus pürimidiiniga ja puriini asendus puriiniga). A->G või C->T on väga palju sagedasemad. · Insertsioon ­ paarialuspaarilised sagedased mittekodeerivas DNA's, triplet ekspansioonid harvad, kuid patogeensed . · Deletsioon ­ paarialuspaarilised sagedased mittekodeerivas DNA's, suured deletsioonid esinevad korduvjärjestustega regioonides. Tavaliselt patogeensed. · Kromosomaalsed vead ­ numeraalsed ja struktuurilised, harvad ja patogeensed, tihti vähirakkudes.
Sünonüümne mutatsioon ­ aminohape ei muutu nukleotiidi asendudes; mittesünonüümne on tavalisem .
· Tsütosiini deaminatsioon: C->U · Depurinatsioon viib deletsioonini · Alküleerivad ühendid rikuvad guaniini ära · Aluspaaride analoogia · T dimeerub UV toimel · metülatsiooni vead: adeniin -> hüpoksantiin · replikatsiooni, rekombinatsiooni vead
Võib jagada veel funktsiooni kaotavad mutatsioonid (retesessiivsed ­ nt geeni deletsioon, geenistr. muutus mRNA stabiilsuse muut, lugemisraami nihe , stoppkoodoni teke jne.) või funktsiooni muutvad ( dominantsed ­ üleekspressioon, retseptor pidevalt aktiveeritud, uus substraat , ioonkanalite funkts. Muut; geenidoosi efekt duplikatsioonide tõttu jne) mutatsioonid.
Nomenklatuur: · aminohappe asendus: R117H [positsioonis 117 R->H] · nukleotiidi asendus: · 621+1(G->T) [621 on eksoni viimane ja +1 introni esimene nukleotiid; +1 positsioonis toimus G->T]; · 621-1(G->T) [621 on eksoni esimene ja -1 introni viimane nukleotiid; -1 positsioonis toimus G->T]; · IVS7-3(C->T) [7. introni -3 positsioonis C->T] · deletsioonid, insertsioonid: · 2632(del5) [sealt 5 nukleotiidi deleteerunud] · 364(ins4) [sinna toimund 4 nukleotiidi insertsioon]
15. "Suurte" geenmutatsioonide tuvastamise meetodid
Suured on üle 1000 aluspaarilised deletsioonid ja duplikatsioonid, tuvastatakse kas tsütogeensete meetoditega või:
Southern Blot: Näide: kadunud on üks EcoRI restriktsioonisait. Paneme koos normaalse geeniga kokku, lisame EcoRI, mis lõikab kõik juppideks. Lisame fosforiga märgistatud sondi, mis hübridiseerub EcoRI restriktsioonisaidiga. Geelil tuleb välja, sond hübridiseerus erinevate bändidega. [kahtlen sügavalt teksti õiguses]
dHPLC ­ denatureeriv kõrgsurve vedelikkromatograafia. Normaalne kõrgsurve kromatograafia denaturatsioonikolonniga. Kolonn lahutab produkte. Hetero- ja homodupleksid tulevad erineval ajal läbi kolonni, sest denatureeriv mõju neile on erinev. Väga kiire, väga täpne, väga kallis. Üldiselt kasutatakse teadaolevate mutatsioonide leidmiseks.
SSCP ­ punktmutatsioonide tuvastamiseks (90% 1 nukleotiidi vahetustest leiab üles). 1- ahelaline geenifragment amplifitseeritakse, denatureeritakse, kantakse mittedenatureerivale polüakrüülamiidgeelile, kus ta paardub iseendaga , võttes ühe neljast võimalikust kõige vähem energiat nõudvast konformatsioonist. Erineva konformatsiooni tõttu liiguvad liiguvad jupid geelis erinevalt ­ kõige rohkem pakitud versioon kõige kiiremini.
Heterodupleks test ­ segad kontrollDNA paljude teistega kokku, kuumutad ja paned geelile. Ahelad hübridiseeruvad, mittesobivuse korral tekib ahelasse mull (mutatsioonide korral). Mulliga liiguvad tavaliselt aeglasemalt ja on geelis ootamatute kohtade peal. RFLP ­ ensümaatilisel restriktsioonil põhinev polümorfismide analüüs. Esinevad polümorfismid, mis tekitavad või kaotavad restriktsioonisaite. Regioon amplifitseeritakse ja pannakse restriktaas juurde. Kui restriktsioonisait on kadunud, siis tekib üks suur bänd 2 väikese asemel. Reaalselt on sel vähe kasutusvõimalusi.
DGGE ­ Spetspraimerid, mille otsas on GC- clamp 'id, mille sulamistäpid on arvutatavad. Amplifitseeritakse kontroll- ja uuritav proov. Produkt hakkab denatureeruma ( uurea vmt toimel) erinevates piirkondades sõltuvalt mutatsiooni olemasolust. Keemiline RNAas vahendatud: üks praimeripaar on biotiiniga märgistatud. Kui tekib heterodupleks ja seal on mullike (mittepaardumine)....(?) Kui on fluorestseeruv praimer , saame lisapiigi.
Valgu lühenemise test: Stoppkoodonite tuvastamiseks. In vitro translokatsioon. Tohutult suure geeni korral kasutada hoopis RNAd , sest see on palju lühem. Tehakse sealt cDNA, kasutatakse praimereid, kus on promootoralad (nt sp6) ­ sellised cDNAsid saab in vitro transleerida/transkribeerida.
Multipleks PCR skriining : Näeb, kui suur ala erinevatel patsientidel geenist kadunud on.
16. Dünaamiliste mutatsioonide tuvastamine
Need on mittemendeliaalselt päranduvad mutatsioonid; peamiselt tripletid ja põhjustavad enamasti neuromuskulaarseid haigusi: Fragile X (levinuim X-liiteline idiootsus), mutatsioonid intronites (mõjutavad transpordi, splaissingut jne). Testimine: Geneetiline testimine: PCR või mõni analoog . Geelidel on kõik näha, kui geele võrrelda. Tavaliselt kasutatakse verd, suukaapeid, koorioni biopsiat, blastotsüsti materjali, juukseid, sperme, arhiveeritud materjali (surnute oma), Guthrie kaarte (tittedelt võetakse verd paksule paberile, kuhu DNA hästi jääb, pärast materjale elueeritakse ja uuritakse). · SNPd: Sagedased asendused, kodeerivadi on keskmiselt 6tk geeni kohta. Sünonüümsed asendused ei ole nii süütud kui paistab ­ võib juhtuda, et moduleeritakse splaissingut või tehakse alternatiivne splaissing ja siis on juba halvasti. ApoE ­ teatav haplotüüp (variant) on Alzheimerile väga soodus. Mis siis, et esmapilgul pole üldse seotud sellega. Mittekodeerivad SNPd võivad muuta ekspressioonitaset. Teatud genoomiblokid on konserveerunud SNPde poolest. · Minisekveneerimine: 1 kaupa märgistatud nukleotiidide lisamine. · Reaalaja PCR spetsproovidega, SNPde deletsiooniks. Mõõdetakse fluorestsentsi teket. · Polümeraasipõhine ekstensioonitehnika
17. TaqMan ja Molecular Beacon töötamisprintsiip
Homogeensed hübridisatsioonitestid, kasutades reaalaja PCR-i ja fluorostsentsil põhinevat detektsiooni. Põhinevad energia ülekandel, kus fluorestsents detekteeritakse tänu muutusele füüsikalises distantsis fluorokroomi ja vaigistaja vahel pärast proovide hübridisatsiooni. Iga SNP vajab spetsiaalpraimerit. Kõige efektiivsemad väheste SNP-de ja suure hulga proovide puhul.
18. Suure võimsusega genotüpiseerimise võimalused
1. (DNA) polümeraasipõhised ekstensioonitehnikad: 1. tillukse jupikese amplifitseerimine, kus on SNP sees. Üks ahel biotinoleeritakse, hiljem streptavidiiniga kerakestega püütakse välja. Streptavidiin on suur molekul, biotiin on tilluke vitamiin . Biotiin seostub väga afiinselt avidiinile ja streptavidiinile. Avidiini on väga palju munarebus, sest ta on antimikrobiaalne, sest ta seob biotiini. Biotiin on enamuse mikroobide elutegevuseks vajalik vitamiin. Järgmine aste: hübridisatsioon mingi praimeriga, mis lõpeb enne uuritavat positsiooni. Lisatakse ainult 1 nukleotiid vastavalt sellele, kas seal on C või G ja polümeraas nii et ekstensioon toimub ainult 1 nukleotiidi võrra. Selle ahela peseme välja (denatureerides ta enne). Kerakesed saab välja fuugida või siis kui ta on magnetomadustega, saab magnetiga välja tõmmata. Kui selle oligonukleotiidi oleme välja saand , mis on 1 nukleotiidi võrra pikem, saadame oligomassspektromeetriasse, mis mõõdab ära ja ütleb, et miuke nukleotiid lisati. 2. Uuritav PCR produkt koos praimeriga, mis enne uuritavat nukleotiidi lõpeb, viiakse kandjale, tekib kiip . Praimer peab PCRi produktile kinnituma. Lisatakse DNA Pol ja didesoksünukleotiid, mis blokeerib Pol-reaktsiooni. See nukleotiid on florokroomiga märgistatud, ekstensioon 1 nukleotiidi võrra ja pärast konfokaalse skänneriga loetakse kiipi ja saadakse teada, kus tuleb värv esile. 2. DNA-Pol põhised pürosekveneerimistehnikad: väga kiire ja võimas. 1. Klassikaline oligonukleotiidide kiip, millel on erinevad oligonukleotiidi, millel 1 positsioonis on erinev nukleotiid. Ja meid huvitav produkt hübridiseerub ainult ühele neist ja annab fluorestseeruva signaali. Sekveneeritakse väga lühikesi DNA ahelaid, tavaliselt tehakse 2 aluspaari. Oluline on see, et proov võib olla väga lahja . Põhimõte on see, et kui polümeraas liidab mingi nukleotiidi DNA ahelale ja pürofosfaat liitub? Lisatakse adenosiin-5-fosfosulfaat ja ATP sünteesitakse neist kahest ühendist kokku. Lisades lutsiferaasi, saab valguse. Kui lisame nukleotiidi, mis sinna positsiooni sobib, saamegi valguse. 3. Hübridisatsioonipõhised 4. alleelspetsiifilised ligatsioonitehnikad 1. põhimõte: veereva ratta replikatsioon . Vaja on kolme erinevat oligod. Üks neist (3) lõpeb täpselt enne meid huvitavat positsiooni ja teised kaks lõpevad G või Cga. Vastavalt sellele, kumb neid paardub (ligeerub) tänu ligaasidele oligo 3ga... teine pestakse välja. Polümeraas hakkab rulluma, kasutades üht ahelat maatriksiks ja amplifitseerib selle. Saab väga tugeva ja selge signaali. 5. alleelspetsiifilised nukleaasi restriktsioonitehnikad: 1. Flap endonukleaas on seal. 3 proovi, kus 2 alleelspetsiifilist proovi, kus uuritavas positsioonis T või C. Overhang jääb. Flap lõikab selle märgistatud alleelspetsiifilise jupi maha ja seda saab detekteerida.
19. Preimplantatsiooniline diagnostika
(Konspektis on olemas meetodid)
Indikatsioonideks-ema vanus, eelnev laps kromosomaalse hälbega, perekonnas kromosomaalse hälbega juhus , perekonnas monogeensed haigused, perekonnas neuraaltoru või teised strukturaalsed defektid, hälbed tuvastatud raseduse käigus, kokkupuuted sagedaste riskifaktoritega. Amniotsentees, koorionibiopsia, ultraheli . PGD puhul kasutatakse testimiseks munaraku või varajase loote materjali. Pärast testimist kasutatakse ülekandeks emakasse ainult terveid embrüosi
Raseduse ajal testimine: Ema seerumi uuringud: kasutatakse rutiinselt defektide ja Down'i sündroomi tuvastamiseks, verd võetakse 16. rasedusnädalal, tuvastatakse 75% neuraaltoru defektidest ja 60% Downi sündroomidest. Uuritakse ka looterakke ema veres.
Amniotsenteesi puhul võetakse umbes 10 ­ 20 ml lootevedelikku niipea, kui vedelikku on loote ümber piisavalt (alates 13 nädal, tavaliselt 15 ­ 20 nädalal), tulemus kahe nädala jooksul, abordi risk 0.5 ­ 1%. Koorionbiopsia puhul tulemus kiire, 24 h jooksul, abordi risk 2-3%. Võetakse platsenta koeproov 10 ­ 12 nädalal, vanematel või kõrgenenud downi sündroomi riskiga rasedatelt
20. Fertiilsuse säilitamise võimalused
Infertiilsus defineeritakse kui võimetus saada lapsi pärast 1 aastast pidevat üritamist. Meeste infertiilsuse põhjused: spermide liikuvus madal, ebanormaalsed spermid , liiga vähe sperme, leukotsüüdid spermas. Naistel sigimatuse peamised põhjused ovulatsioonihäired (27%), ja anatoomilised probleemid (22%)
Munaraku krüopreservatsioon- kasutatakse eelkõige vähihaigete puhul aga ka diagnoositud varajase menopausi ajal, võrreldes loote külmutamisega väheedukas, ohtudeks külmutatud ootsüüdi metafaasi käävi muutused, mis võivad pärast fertilisatsiooni anda aluse karüotüüpiliselt defektsele embrüole.
Ovariaalsete kudede krüopreservatsioon ja ootsüütide hilisem küpsemine in vitro- eemaldatakse biopsia materjal, mida saab pärast siirdada või eemaldada munarakk IVF-ks, katseliselt töötab hästi loomadel. Meestel sperma säilitamine väga lihtne ja levinud, problemaatiline prepuberteedieas poiste puhul, kasutatake testikulaarsete kudede biopsiate säilitamist, hulgalisetl eetilisi probleeme
Kelve
NB!!! NEED ON EELMISE AASTA OMAD, MA EI TEA KAS NEED SEE AASTA ÜLDSE KEHTIVAD, ÜLE VAST TASUB IKKA VAADATA
1) GM põllukultuuride võimalik mõju keskkonnale ja inimesele;
GM põllukultuuride puhul on kaks kardetavamat ohtu inimesele: allergeensus ja geeniülekanne (geenide võimalik ülekanne GM toidult inimese keharakkudele või seedetrakti bakteritele ­ nt antibiootikumresistentsuse geenid)
Keskkonna koha pealt kardetakse:
* väljaristamine ­ ülekandumine GM taimelt metsikule. Vältimiseks nõutav piisava laiusega eraldusriba GM põllu ümber * geeni püsimajäämine peale saagi koristust * mitte-sihtorganismide vastuvõtlikkus geeniproduktidele (nt kahjutud putukad) või kahjulikel resistentsuse kujunemine * uued taimepatogeenid * taimede mitmekesisuse vähenemine * põllumajandus-kemikaalide kasutamise suurenemine * vahelduvate külvikordade süsteemi kasutamise vähenemine
2) GMO-de ja neid või nende komponente sisaldavate toiduainete turustamise reguleerimine;
Turustamist reguleerivad nt Codex Alimentarius (toidualane) ja Cartagena protokoll ( keskk .). Nõutav on GM toidu märgistamine. EL'is on toidus sisalduva lubatud GM ainete määraks võetud 0.9 % (ilma märgistuseta).
3) GM põllukultuurides kasutatavad kodeerivaid järjestused - nimetada ja iseloomustada vähemalt kolme neist. 2-5A süntetaas:
CP4EPSPS: pärit Agrobacterium tumefaciens'st, soodustab taimes kasvuks vajaliku ensüümi EPSPS sellise vormi sünteesi, mis on vastupidav herbitsiidi RoundUp suhtes e annab taimele herbitsiiditaluvuse.
Cry1 Ab: pärineb bakterist Bacillus thuringiensis (Bt), kasutatakse Bt-maisi tegemiseks, annab taimele insektitsiidsed omadused (Bt toksiin ).
Pat: Bt-maisis, annab herbitsiiditaluvuse, pärinev mullabakterist.
Geenidest ­ cry, gox, bla, nptII
Promootorjärjestus ­ enamlevinud CaMV 35 s P-nos
Terminaatorjärjestused ­ sagedamini T-nos, pärit mullabakteri Agrobacterium tumefaciens nopaliinsüntaasi geenist, ka T-35s, T-ocs
4) RR soja - geneetilised võõrelemendid; iseloomustada nende sisestamise abil muundatud biokeemilisi mehhanisme.CTP järjestus - milleks?
RR soja ­ roundup ready soja. Kaitseb end glüfosaati sisaldava herbitsiidi Roundup(R) vastu. Sellesse maisi on viidud tavalisest mullabakterist Agrobacterium tumefaciens võetud geen, mis suurendab taimes selle kasvuks vajaliku ensüümi EPSPS sellise vormi tootmist, mis on glüfosaadi suhtes tolerantne . EPSPS ensüüm on taimeraku sikimaatraja ensüüm. Sikimaatrada on biokeemiline rada, mis osaleb aromaatsete aminohapete ja teiste aromaatsete ühendite sünteesis. Kui tavalisi taimi töödelda glüfosaadiga, mis inhibeerib EPSPS ensüümi, ei suuda need taimed kasvuks ja eluks vajalikke aromaatseid aineid sünteesida. EPSPS esineb kõigis taimedes, bakterites ja seentes . Imetajates see rada puudub ja need ei suuda ise aromaatseid aminohappeid sünteesida. Kuna see biokeemiline rada imetajates, lindudes ja vees olevates eluvormides puudub, siis ei ole glüfosaat neile oluliselt toksiline. CTP ­ chloroplast transit peptide
5) Cry1 Ab ja pat geenid - mida kodeerivad , milleks vajalikud. Tooge konkreetseid näiteid (kummagi kohta 2 - otsida ise internetist).
6) GMO-de määramismeetodid. Miks eelistatakse DNA analüüsi - põhjendada.
Transgeense taime genoomi on sisestatud võõr-DNA järjestus (järjestused). Enamasti ekspresseeritakse uut järjestust taimerakkudes ning see annab taimele uued omadused, näiteks herbitsiiditaluvuse. Iga GMO detekteerimiseks kasutatava tehnoloogia aluseks on erinevuse leidmine modifitseerimata taime ja transgeense taime vahel. Seda võib teha nii võõr-DNA kui sellelt transkribeeritava mRNA kui sellelt transleeritava valgu detekteerimise abil.
* PCR - eeldab analüüsitava geneetilise modifikatsiooni tundmist: genoomi sisestatud geeni struktuur ja regulatoorsed elemendid. Ärmiselt tundlik, seetõttu väga suur kontaminatsiooni oht (valepositiivne tulemus!) * Võõrvalgu detekteerimine - vähem tundlik kui PCR (vähem valepositiivseid tulemusi), väljatöötamine kallis ( spetsiifiliste antikehade saamine ja valgustandardite saamine); proovi hind odav, praktiline ja efektiivne taimes ekspresseeritava võõrvalgu detekteerimiseks; denatureeritud või hüdrolüüsitud valgu määramiseks ei sobi 7) PCR-l põhinevate GMO määramismeetodite jaotus sihtmärgi spetsiifilisuse suhtes.Iseloomustada neid kõiki.
1.Sõeluuringu meetodid (sihtmärgi spetsiifilisus madal) Promootor - ja/või terminaatorjärjestused, antibiootikumi-resistentsust kodeerivad järjestused
2. Geenispetsiifilised meetodid
3. Konstruktispetsiifilised meetodid Geenikonstrukti koosseisu kuuluvate külgnevate elementide ühenduskohad (näiteks promootori ja geeni vahel)
4. Liinispetsiifilised meetodid (sihtmärgi spetsiifilisus kõrge) Peremeesgenoomi ja inserteeritud DNA vahelised integratsioonilookused Võimalik probleem: geenide kuhjumine (stacking) Pesa pCR- 2 praimeri paari (teine paar on esimese lõigu sisene-> tundlikkuse tõstmine) Multiplex PCR- mitu paari praimereid-> mitu järjestust. Hübridiseerimistemp peavad sarnased olema. RRsoja- kahe elemendi vaheline ala amplifitseeritakse (konstrukti spetsiifiline). Efektiivsus sõltub DNA kvaliteedist. Probleemiks: koopiate arv genoomis, heterosügootsus ja ploidsus .
8) PCR meetodite detektsioonipiir ja kvantiseerimispiir. Konkreetselt.
Detektsioonipiir (limit of detection, LOD) on kõige väiksem usaldusväärselt detekteeritav kogus (mis ei pea tingimata olema kvantiseeritav). ENGL kriteeriumide järgi loetakse GMO-de määramisel sobivaks meetod, mille LOD koopiat .
Analüütilise protseduuri kvantiseerimispiir (limit of quantification, LOQ) on kõige väiksem usaldusväärselt kvantiseeritav kogus. ENGL kriteeriumide järgi loetakse GMO-de määramisel sobivaks meetod, mille LOQ 1. Mis on geneetiliselt muundatud organismid?
Termin "geneetiliselt modifitseeritud organismid" on võetud kasutusele niisuguste organismide kirjeldamiseks, mille geneetilist materjali on modifitseeritud looduses mitteesineval viisil. Geneetiliselt modifitseeritud e. geneetiliselt muundatud organism ise on bioloogiline ühik, mis on võimeline paljunema või geneetilist materjali üle kandma.
2. Erinevus traditsioonilise sordiaretuse teel ja geenitehnoloogiliste meetodite abil saadud taimede vahel
Ehkki ka traditsioonilise sordiaretuse käigus muutub taime DNA järjestus ning sinna satub palju teise liigi geene, mis natiivselt antud taime DNAsse ei kuulu, ei loeta sel viisil saadud taimi transgeenseteks, sest ülekantavate geenide hulk ja koostis ei ole kontrollitavad . 3. Mida teate geneetiliselt muundatud loomade kohta (millised, kus kasutatakse, kas on müügil)?
farmakoloogiliste valkude tootmine piimanäärmes vm. koes, transgeensed sead doonororganite saamiseks.
Suunad on liha jms. toodangu kvaliteedi tõstmine ja haigusresistentsed loomad. Kasvuhormooni ekspresseerimine ei õnnestunud kariloomadel nii hästi kui hiirtel ­ kaasnes palju kahjulikke kõrvalmõjusid. Tööd selles suunas jätkuvad, aga püütakse ekspresseerida kasvuhormooni toimet vahendavaid valke jne. P.s. püütakse mõjutada loomsete produktide - eelkõige piima ­ omadusi.
Müügil transgeenne sebrakala. Transgeensetest kaladest tegeldakse peamiselt lõhe, forelli , karpkala ja veel mõne GM liini loomisega . Kõige varem võib oodata sellise Atlandi lõhe müügiletulekut, millesse on viidud Vaikse ookeani lõhe kasvuhormoon külmumisvastase geeni promootori kontrolli al
4. Mida teate geneetiliselt muundatud mikroorganismide kasutamise kohta tööstuses? Tooge vähemalt kolm konkreetset näidet.
1) toidulisanditena, 2) starter - ja valmitusorganismidena.
Väga suure tööstusliku tähtsusega on plasmiiditehnoloogia abil saadud uued piimahappebakterite tüved kiirema ja efektiivsema fermenteerimise saavutamiseks, näiteks juustu tootmisel ja valmitamisel. Üks piimhappebakterite geneetilise modifitseerimise eesmärke on nende muutmine resistentseks destruktiivsete bakteriofaagide vastu. Piimhappebaktereid on ammust ajast kasutatud toidukomponendina ja seetõttu sobivad nad n.ö. ohutute bakteritena suurepäraselt ka toidutehnoloogias kasutatavate ensüümide, näiteks peptidaaside tootmiseks. Näiteks juustutootmises kasutatavat (lehma maos leiduvat) kümosiini (ehk renniini) toodetakse nüüd rekombinantsena piimhappebakterites. Sama ensüüm on ekspresseeritud ka pärmis. Muide ­ transgeenses pärmis ekspresseeritud kümosiin oli esimene geneetiliselt modifitseeritud organimsist pärinev ensüüm, mis sai loa toiduks kasutamiseks. Samuti kasutatakse õlletööstuses geneetiliselt modifitseeritud pärmitüvesid vähese süsivesikute- sisaldusega õlle tootmiseks. Nimelt on olemas Saccharomyces cerevisiae tüvi, mis ei sobi õlle kääritamiseks, aga mis toodab tavaliselt õlle kääritamisel alles jäävat tärklist hüdrolüüsivat amülaasi. Sellest tüvest pärinev amülaasigeen on viidud plasmiidi abil tavalistesse õllepärmi tüvedesse, mis konverteerivad kaloririkkad tärklisejäägid fermenteeritavaks suhkruks. (Seega saadakse kas kõrgema alkoholisisialdusega või siis vastavalt väiksema kalorisisaldusega lahjem õlu.)
5. Taimekahjurite suhtes resistentsete kultuurtaimede saamine ­ milliste kahjurite vastu, milline põhimõte. Kirjeldage vähemalt ühte konkreetset liiki tema genoomis tehtud muudatuste kaudu. Kirjeldage sama liigi kahjuriresistentsuse mehhanismi.
Kõige levinumaks maisi (ka hirsi ja erinevate umbrohuliikide) kahjuriks on varreleedik (Ostrinia nubilalis), kes tungib kohe pärast koorumist taimelehtede tagaküljel olevatesse leherootsudesse, maisil aga tõlvikutesse. See on üks suuremaid maisikasvatajate vaenlasi .
Kahjurite, eelkõige varreleediku, suhtes resistentseid taimi saadakse kahjureid hävitavat toksiini kodeeriva geeni sisseviimisel taime DNA-sse. Näiteks viiakse taime genoomi Bt toksiin, mida kodeeriv geen pärineb bakterist Bacillus thuringensis. Seega toodab taim ise insektitsiidi ning kahjurid hävivad sellisest taimest toitumisel. Eelised: väheneb insektitsiidsete kemikaalide kasutamine; suureneb saagikus ja seega ka kasum; väheneb riknemine hallituse tõttu nii enne kui pärast koristust, kuna kahjuritest põhjustatud epiteelkoe vigastusi on vähem.
Puudused: kahjurid võivad muutuda taimesisese toksiini suhtes resistentseks; teatud kahjurite hävitamine võib avaldada negatiivset mõju toiduahelale; kultuurtaime ja metsiku liigi vahel võib toimuda geeniülekanne, mistõttu tekivad kahjurite suhtes resistentsed superumbrohud. See sõltub ristumiseks sobivate liikide lähedusest.
6. Taimedele täiendava viirusresistentsuse andmine geenitehnoloogilisel teel - põhimõte, sisseviidavate järjestuste liigid.
Viirushaiguste eest kaitsmiseks viiakse taime tavaliselt mõni viiruse enda geen, sageli kattevalgu geen, mis muudab taime selle viiruse suhtes resistentseks. Võib saada ka mitmese viirukaitsega taimi (vt. 2-5A süsteem). (Loomset 2-5A süntetaasi ekspresseeriv kartul . Monsanto viirusresistnente magus kartul, mis jõudis põllukatsetsse 2001. aastal.) Bakteriaalsete haiguste vastu võitlemiseks viiakse vastavasse taime mõne muu liigi geen, mis on võimeline tootma bakteritsiidset valku.
7. Taimedele stressitaluvuse omaduste lisamine geenitehnoloogilisel teel ­ tooge vähemalt kolm näidet, kirjeldage.
Eelkõige püütakse luua transgeenseid taimi, mis suudaksid kasvada vähese niiskusega mullas (väheneb niisutavatate maade pindala). Prantsusmaal on loodud maisisordid, mis kannavad looduslikult väga vastupidavast sorgost pärinevat geeni ja kasvavad hästi ka kuivas pinnases. Põuakindlate taimede loomisel lähtutakse selliste kõrbetaimede biokeemiliste radade geneetilise aluse väljaselgitamisest, mis kuivaga näivad täiesti surnutena, kuid vihma käes ärkavad uuesti ellu. Nende komponentide lülitamine põllukultuuride genoomi aitab vältida saagi täielikku kadu põua tingimustes. Mõni aeg tagasi ilmus PNAS-is töö stressitaluva riisi kohta. Riisitaime genoomi on lülitatud bakteriaalsed geenid, mis vastutavad spetsiaalse suhkru ­ trehaloosi ­ sünteesi eest. Trehaloos on disahhariid, mida toodetakse bakterites ja seentes, ka kõrgemates seentes, samuti paljudes selgrootutes, eriti putukates. Taimedes on seda vähe, välja arvatud spetsiifilised kõrbetaimed. See suhkur kaitseb taimeraku erinevaid komponente (tal on eriline vee absorbeerimise võime) ning taimed suudavad kasvada kuivas soolases pinnases. Praegu jätkatakse samalaadset tööd stressitaluva maisi ja nisu (hirsi, soja, suhkrupeedi) loomiseks.
Teine suund on taimede soolataluvuse tõstmine. Soolase pinnase probleem esineb paljudes maades, seda enam, et kestev niisutamine toob maapinnale soola juurde. Soolataluvuse eest vastutavaid geene on juba üle kantud samblalt testtaimedele, nüüd toimuvad katsetused põllukultuuridega. Arvatakse, et paari aasta pärast on turul soolasel pinnasel kasvav tomat.
Üle 40% troopiliste piirkondade pinnasest on happeline. See tähendab, et pinnases sisalduv alumiinium on taimedele kättesaadavam, samas on ta aga taimele toksiline. On näidatud, et sidrunhappe lisamisel mulda seob see alumiiniumi ja teisi toksilisi metalle ja laseb taimedel normaalselt kasvada. Sellest lähtudes on loodud transgeensed, bakterist pärinevaid sidrunhappe sünteesi eest vastutavaid geene kandvad tubaka- ja papaiataimed, mis toodavad ise oma juurtes sidrunhapet. Loomisel on samalaadne mais, mille turulejõudmist on oodata paari lähema aasta jooksul.
8. Muudetud rasvhappelise koostisega õlitaimed. Konkreetselt ­ milliseid taimi soovitakse luua, milliseid mehhanisme selleks kasutatakse.
Erinevatest õlitaimedest toodetud õlid erinevad oma rasvhappelise koostise poolest ning vastavalt sellele on nende kasutusalad erinevad. Geneetiliselt muundatud taimed on võimelised tootma soovitud rasvhappelise koostisega õli ning jääb ära hilisem segamine ja töötlemine. Saab toota tervislikumaid tooteid, kus on madal transrasvhapete ja kõrge küllastamata rasvhapete sisaldus. Näiteks vähese küllastatud rasvhapete (saturated fatty acids, SAFA) sisaldusega raps (3%, võrreldes tavalise rapsi 7, päevalille 12, oliiviõli 15 ja palmiõli 51%-ga). Samuti hästi kõrge mono -küllastamata rasvhapete (MUFA) sisaldusega õlid. Edasipidi väga oluliste polüküllastamata omega-3 rasvhapete tootmine. Praegu saadakse neid põhiliselt kala(maksa)õlist, keda toidetakse vetikatega, mis ongi omega-3 rasvhapete esmasteks tootjateks. (Vähendab haigestumist südame- veresoonkonna haigustesse.) Seega on loomisel transgeensed taimed, mis oma genoomis kannavad vastavaid vetikaensüüme.
9. Kõrgendatud anitoksüdantide sisaldusega taimed. Milliseid teate? Milliste antioksüdantide sisaldust soovitakse tõsta ja milleks?
Esimene turuletoodud GM kultuurtaim oli FlavrSavr (R) tomat (1994 USA-s). (Ei lähe seistes pehmeks.) Sellest valmistatud pasta oli esimene GMO sisaldav toiduaine, mis Euroopas müügile tuli (Inglismaal 1996). 2001. aastal ilmusid esimesed tööd flavonoolide sisalduse suurendamise kohta tomati koores (antioksüdandid, südamehaiguste ja vähitekke suhtes profülaktilise toimega, leidub ka tees ja sibulas). Selleks on tomatisse viidud teise taime (petuunia) geen, mille tagajärjel flavonoolide tase tomati vilja kestas tõuseb ligi 80 korda (seejuures maitset mõjutamata). Oluline on, et nende ühendite sisaldus ei muutu tomati töötlemisel pastaks. Selliste tomatite turulejõudmine võtab aga veel aega.
Mõni aasta tagasi teatati teist tüüpi antioksüdandi ­ lükopeeni ­ sisalduse tõstmisest transgeensetes tomatites. Selleks transformeeriti tomatisse pärmist eraldatud geen, mille tagajärjel tõusis tomati lükopeenisisaldus 2-3 korda. Lükopeen annab tomatile iseloomuliku värvuse ja samas on ta väga hea antioksüdant. (Näiteks meestel, kes söövad nädalas kümme tomatit või joovad vastavalt tomatimahla, on eesnäärme vähki haigestumise risk alanenud poole võrra.) Muide - on leitud, et antioksüdandid mõjuvad tomati koostises efektiivsemalt kui puhta toidulisandina. (Probleem omega-3-rasvhapetega, s.h. alfa- linoleenhape ­ regulaarsel puhtalt tarvitamisel võib viia insuldini, sest toimib südame- ja ajuveresoontele erinevalt).
Vitamiin E (antioksüdant) sisalduse tõstmine ja isovormide suhte parendamine maisis (alfa- tokoferool on aktiivsem, aga tavaliselt on 80% tokoferoolist gamma -vormis). Lõplik väljatöötamine ja turuletulek võtab veel aastaid (praegu on vitamiin E biosünteesi raja vastavad ensüümid viidud ainult Arabidopsis ' esse).
10. Farmatseutiliste preparaatide tootmine taimedes ­ kirjeldage vähemalt kolme näidet.
Praegu toodetakse paljusid ravimeid rakukultuuris või fermenteris. Praegu on väljatöötamisel taimsed vaktsiinid (millest on palju juttu olnud). Hea taim selleks on banaan . Kliinilised katsetused käivad hepatiit B vaktsiini tootmisega salatis ja marutaudi vastase vaktsiini tootmisega spinatis. Arvatakse, et nende lõplikuks väljatöötamiseks kulub veel ainult 2-3 aastat.
Ravimitest on turule oodata maisis ekspresseeritavat lipaasi (rasva hüdrolüüsivat ensüümi), mis ei laguneks happelise maomahla toimel ja mida saaks setõttu patsientidele suukaudselt manustada. Selle produkti esmatarbijad oleksid tsüstilise fibroosi haiged (geneetiline haigus, mille puhul on iseloomulik eriti paksu ja kleepuva lima kogunemine kopsudesse ja pankreasse. Selletõttu ei jõua seedeensüümid soolde , toit seedub väga halvasti ja haiged ei omasta toitu). Praegu antakse haigetele sea pankrease ekstrakti, aga see ei ole alati efektiivne, laguneb maos kergesti. Maailmas on 130 000 tsüstilise fibroosi haiget, neist 30 000 Euroopas. See taimes toodetav ensüüm on Saksamaal ja Prantsusmaal kliiniliste katsetuste lõppjärgus ning selle turuletulekut on oodata 2004. aastal.
11. Milliseid geneetiliselt modifitseeritud põllukultuure kasvatatakse maailmas kõige rohkem. Loetlege vähemalt viis.
geneetiliselt modifitseeritud herbitsiiditolerantne soja 61% (41,4 milj. ha), millele järgnes transgeenne Bt-mais (23%, 15,5 milj. ha) (JOONIS 3). Valdavate GM põllukultuuride hulka kuuluvad veel geneetiliselt modifitseeritud puuvill (11%, 7,2 ha) ja geneetiliselt modifitseeritud raps (5%, 3,6 milj. ha). Lisaks neile kasvatatakse laialdaselt transgeenset suvikõrvitsat ja papaiat, ülejäänud liike märkimisväärselt vähem.
12. Kirjeldage RoundUp Ready soja genoomi sisse viidud võõrjärjestusi ja selgitage, kuidas see on lähtetaime omadusi muutnud.
esimene geneetiliselt modifitseeritud soja, töötati välja 1996. aastaks. Kaitseb end glüfosfaati sisaldavate herbitsiidi Roundup(R) vastu. JOONIS 8. Sellesse maisi on viidud tavalisest mullabakterist Agrobacterium tumefaciens võetud geen, mis suurendab taimes selle kasvuks vajaliku ensüümi 5-enoolpüruvüülsikimaat-3-fosfaatsüntaasi (EPSPS) sellise vormi tootmist, mis on glüfosaadi suhtes tolerantne. EPSPS ensüüm on taimeraku sikimaatraja ensüüm. Sikimaatrada on biokeemiline rada, mis osaleb aromaatsete aminohapete ja teiste aromaatsete ühendite sünteesis. Kui tavalisi taimi töödelda glüfosaadiga, mis inhibeerib ensüümi EPSPS aktiivsuse, ei suuda need taimed kasvuks ja eluks vajalikke aromaatseid aineid sünteesida. EPSPS esineb kõigis taimedes, bakterites ja seentes. Imetajates see rada puudub ja need ei suuda ise aromaatseid aminohappeid sünteesida. Kuna see biokeemiline rada imetajates, lindudes ja vees olevates eluvormides puudub, siis ei ole glüfosaat neile oluliselt toksiline.
13. Kirjeldage Bt11 maisi genoomi sisse viidud võõrjärjestusi ja selgitage, kuidas see on lähtetaime omadusi muutnud.
See geneetiliselt modifitseeritud maisisort sisaldab kahte võõrgeeni ­ cry1 Ab ja pat, mis teevad selle sordi vastupidavaks nii putukate kui herbitsiidide vastu. Cry1 Ab geen on pärit tavalisest mullabakterist Bacillus thuringensis (Bt) ning kodeerib looduslikku endotoksiini, mille tõttu antud taimest toituvad putukad ( Lepidoptera , varreleedik) hukkuvad. Valk, millega maisitaimi on transformeeritud, on CRY1A(b) delta -endotoksiini lühendatud vorm ja see kaitseb maisi nende kahjurite poolt söömise eest. See valk seostub putuka soole epiteeli retseptoritele ja kutsub esile pooride tekkimise, mis rikub rakkude osmootilise potentsiaali ning putukavastsed ei saa enam süüa ja surevad. Imetaja soolerakkudes puuduvad selle toksiini retseptorid ning vastav valk on imetajale kahjutu .
Lisaks on BT11 maisisorti transformeeritud ka geeniga pat, mis annab tolerantsuse herbitsiidi glüfosinaatammooniumi suhtes. Glüfosinaatammoonium on fosfinotritsiinherbitsiidide (Basta®, Rely®, Liberty® jt.) aktiivne koostisosa . ). Fosfinotritsiini herbitsiidne aktiivsus põhineb glutamiinsüntetaasi inhibeerimisel, mille tulemusena koguneb taime letaalne annus ammooniumi. PAT ensüüm katalüüsib fosfinotritsiini atsetüleerimist ja elimineerib seega selle herbitsiidse aktiivsuse. Pat geen on pärit mullabakterist Streptomyces viridochromogenes. Imetaja seedetraktis degradeeritakse PAT nagu iga teine toiduks kasutatav valk.
14. Seadusandlus GMO-de sisalduse kohta toidus ­ Eestis, Euroopa riikides, USA-s. Nii Euroopa Liidu direktiivid kui Eesti toiduseadus nõuavad GM toidu märgistamist. Geneetiliselt muundatud komponenti võib tootes sisalduda vähesel määral, ilma et vastavat toodet peaks spetsiaalselt märgistama. Euroopa Liidus on GMO-sisalduse määraks võetud 0,9% (0,9% GMO-d vastavast komponendist ) - s.t. üle 0,9%-lise GMO sisaldusega tooted peavad olema vastavalt märgistatud, alla 0,9%-list sisaldust loetakse kokkuleppeliselt juhuslikuks saastumiseks ja sel juhul toote märgistamist ei nõuta. Euroopa Liidu seadus GM toidu ja sööda kohta koos uue seadusega GMO-de märgistamise ja nende jälgitavuse kohta võeti vastu septembris 2003 ja jõustus 18. aprillil 2004. GM sisalduse 0,9%-line piirmäär kehtib nii toidu kui loomasööda kohta. Jälgitavus tähendab seda, et juhul, kui DNA (või valk) ei ole uuritavas proovis (näiteks toiduõlis) detekteeritav, tuleb analüüsida õli tootmiseks kasutatud toorainet ning märgistamisreeglid kehtivad selle toooraine kohta (vastav teave peab olema märgitud ka sellest toorainest saadud õlile ­ näiteks: "valmistatud GM-maisist"). Seemnete GM-sisalduse piirmäära ei ole kokku lepitud; arvatavasti kehtestatakse selleks 0,5%.
Muide ­ Norras on selleks piiriks 2%, Jaapanis al. 2001.a. 5%, Koreas 3%. Venemaal oli seni GM märgistamise piiriks 5%, aga selle aasta (2004) aprillis kooskõlastati GM piirsisaldus Euroopa Liidu nõuetega ja nüüd on ka Venemaal lubatud piirmääraks 0,9%. USA-s spetsiaalselt GMO märgistamist ei nõuta, küll aga on öeldud, et toiduainete märgistamine peab olema tõene ja mitte segadusse ajav.
15. GMO-de sisalduse detekteerimine toidus. Milliseid meetodeid kasutatakse? Võrrelge neid omavahel.
Transgeense taime genoomi on sisestatud võõr-DNA järjestus (järjestused). Enamasti ekspresseeritakse uut DNA järjestust taimerakkudes ning see annab taimele uued omadused, näiteks herbitsiiditaluvuse. Iga GMO detekteerimiseks kasutatava tehnoloogia aluseks on erinevuse leidmine modifitseerimata taime ja transgeense taime vahel. Seda võib teha nii võõr- DNA kui sellelt transkribeeritava mRNA kui sellelt transleeritava valgu detekteerimise abil.
Põhimõtteliselt on võimalikud ka teised analüüsiviisid, näiteks ensümaatilise reaktsiooni produkti detekteerimine keemilise analüüsi abil (juhul, kui võõrgeenilt ekspresseeritakse ensüümi) või siis fenotüübiline iseloomustamine (herbitsiiditaluvuse järgi).
Reaalselt kasutatakse geneetiliselt modifitseeritud taimede eristamiseks looduslikest kahte meetodit:
ELISA ­ transgeenilt ekspresseeritavate spetsiifiliste valkude olemasolu produktis detekteeritakse nende kui antigeenide seostumise järgi vastavate spetsiifiliste antikehadega;
PCR ­ põhineb võõr-DNA spetsiifilise järjestuse detekteerimisel.
Need meetodid ei ole vastandlikud, vaid täiendavad teineteist.
16. Taimede geneetilisel muundamisel enamkasutatavad regulatoorsed nukleotiidjärjestused.
· NptII ­ kodeerib neomütsiin fosfotransferaasi · delta-endotoksiin - tal on väga palju erinevaid versioone, enamasti looduslikest lühemad ja modifitseeritud · par, bar · EPSPS (ensüüm) ­ sisaldub taimes nagunii , aga RoundUp inaktiveerib ta, mistõttu taim sureb. GMOdesse viiakse EPSPSi modifitseeritud versioon, mida RoundUp ei suuda lagundada. RoundUp Ready Soja. · Bt11 mais ­ cry1 Ab ja pat (herbitsiidivastane)
Geenidest cry, CP4EPSPS, nptII, gox, bla
Terminaatoritest T-35S, T-nos nda T-tml, T-ocs
Promootoritest 35S P-nos