Mõisted: 1. Nukleosiid koosneb lämmastikalusest ja suhkrust 2. Nukleotiid Lämmastikalus( puriin v pürimidiin) + suhkur+fosforhappe jääk ( fosforüül) 3. Oligonukleotiid RNA v DNA jupp, mis koosneb mitmest nukleotiidist( tavaliselt kuni 20 nukleotiidi) oligonukleotiid on lühike DNA/RNA järjestus 4. Geen- DNA molekuli funktsionaalne lõik, mis tavaliselt sisaldab informatsiooni ( mRNA vahendusel) ühe VALGU sünteesiks ( rRNA ja tRNA geenid ei kodeerivalgumolekule 5. DNA denaturatsioon - vesiniksidemete katkemine ja polünukleotiidiahelate lahknemine ( kõrge temp. 85 90 ºC)v tugeva aluse v happe mõjul 6. DNA renaturatsioon e noolutamine - termodenatureerunud DNA aeglasel jahutamisel toimuv ahelate reassotsiatsioon
kasutamine. Millisel DNA polümeraasi omadusel, lisaks 5'-3' sünteesi aktiivsusele, põhineb antud tehnoloogia? a) DNA polümeraasi 3'-5' eksonukleaassel aktiivsusel b) DNA polümeraasi 5'-3' eksonukleaassel aktiivsusel c) DNA polümeraasi termostabiilsusel 3. Milliseid mehhanisme kasutatakse rakus geeniekspressiooni inhibeerimisel antisense DNA oligonukleotiididega? a) Moodustuva antisense oligonukleotiid/mRNA kompleksi katkilõikamine restriktsioonilise endonukleaasiga b) Translatsiooni blokeerimine oligonukleotiidi poolt c) DNA oligonukleotiid/mRNA kompleksi degradatsioon Dicer ensüümi poolt d) RNaasH vahendatud mRNA degradatsioon oligonukleotiid/mRNA dupleksist 4. Milline järgnevatest nukleiinhappe ahelate dupleksitest on hübridisatsioonil kõige stabiilsem? a) DNA:RNA b) DNA:DNA c) RNA:RNA 5. Mis on ribosüüm?
kandjaMobiilne DNA- DNA, mis saab ringi liikuda genoomi siseselt: transposoomid (retro-, DNA transposoomid, lisajärjestused), plasmiidid, bakteriofaagid, II rühma intronid. Transkrip Faktor- tugeva seostumisvõimega valgud st järjestusspetsiifiline DNAd siduv valök . vabastavad DNA keerulisest kromatiidsest koostisest. NMD ebakorrektselt splaisitud mRNA de lagundamine(kui stop koodon asub enne viimast ekson-ekson liidest) PTC-enneagne stopp-koodon. praimer -lühike oligonukleotiid, mille külge DNA polümeraas DNA replikatsiooni ajal kinnitubHAT- histoon atsetüül tansferaasidel on võime panna atsetüülrühm histooni N terminuse külge. Vähendavad interaktsiooni DNA ja histooni vahel. Soodustavad teiste valkude DNA pol ligipääsemist. HDAK- deatsetülaasid. Lõikavad atsetüülrühmas lüsiini jääkide küljest ära ja pärsivad aktiivust, fosfolüreelivad histooni. Promootor- TATA elementi sis geeni ala. Koht kuhu seondub RNA polümeraas. Ülavoolu asuv ala.
Replikatsiooni läbi viiv ensüüm DNA ( või RNA) polümeraas saab nukleotiide liita vaid 3'C külge. Seega jääb DNA/RNA ,,ülemisse" otsa nukleotiid vaba 5' OH-rühmaga ja reaktsiooni saab nim 5'-3'suunaliseks. 15. Millise sideme kaudu on ühendatud nukleotiidijäägid DNA ahelas? (sama küsimus ka RNA kohta). Nukleotiid=lämmastikalus + suhkur+ monofosfaat Nukleotiidijäägid on ühendatud fosfordiestersidemega. 16. Milline oligonukleotiid omab kõrgemat ,,sulamistemperatuuri" Tm. Miks? GC rikas, sest need annavad 3 vesiniksidet, AT vaid kaks. 17. Mitu aluspaari tuleb ühe B-DNA heeliksi pöörde kohta? 10 18. Ligikaudu mitut aluspaari sisaldab inimese genoom? Inimese genoom sisaldab ligikaudu 3x109 aluspaari, mis koosneb 23 kromosoomist. 19. Miks sisaldab enamikust organismidest eraldatud DNA ligikaudu võrdsel hulgal A ja T ning G ja C nukleotiide?
moodustavad mittefunktsionaalse geeni asendamisega seotud tööd, on teatud olukordades vajalik töötava geeni(de) (üle) ekspressiooni suunatud inhibeerimine. Seda on võimalik saavutada erinevatel tasemetel.(2) DNA tasemel A) Funktsionaalse geeni inaktivatsioon in situ homoloogilisel rekombinatsioonil vastavalt muteeritud geenikoopiaga.(2) B) Oligonukleotiidide kasutamine. Teatud tingimustel võib DNA moodustada kolmekordse heeliksi. Selleks disainitakse geenispetsiifiline oligonukleotiid, mis paardub kindla sihtmärk geeni järjestusega kaheahelalises DNA-s ja inhibeerib selle geeni transkriptsiooni. Üheahelalise oligonukleotiidi seostumine kaheahelalise DNA-ga toimub nn. Hoogsteen'i paardumise kaudu (vesiniksidemed). Selliste sidemete puhul on kõige stabiilsemad G seondumine G-ga GC aluspaaris ja T seondumine A-ga AT aluspaaris.(2) RNA tasemel Antisense oligod või antisense geen, ribosüümid.(2) Valgu tasemel Polüpeptiidi funktsiooni inhibeerimine
REPLIKATSIOON Replikatsiooni lähtepunkt (origin) DNA piirkond, kus toimub pöördumine biheeliks mõttelise telje ümber ja ahelate lahtikeerdumine (despiraliseerumine). Eukarüootse DNA replikatsioon algab üheaegselt mitmest lähtepunktist. Replikatsiooni hark replitseeruva DNA Y- kujuline piirkond, kuhu seostuvad komplementaarsed nukleotiidid ja kus formeeruvad uued ahelad. Lähteained Nukleosiidtrifosfaadid dATP,dGTP, dTTP, dCTP, DNA sablonahel (template standart), RNA-praimer oligonukleotiid (4...60 nukleotiidi). Ensüümid ja katalüüsitavad protsessid. Helikaas DNA biheeliksi despiralisatsioon, DNA-polümeraasid polünukleotiidahelate süntees 5' 3' suunas (seotakse ühe nukleotiidi 3'-OH ja teise 5'- P). DNA-primaas oligonukleotiidse RNA-praimeri süntees. DNA-ligaas mahajääva ahela fragmentide ühendamine. Kuna uute polünukleotiidahelate süntees toimub 5' 3' suunas, siis üks ahel kasvab pidevalt juhtiv ahel (leading strand), teine
Guaniin ning kolme vesiniksidemega. 13. . Kas DNA esineb eukarüootses rakus reeglina ühe- või kaheahelalise molekulina? Kaheahelaline. RNA on tavaliselt üheahelaline. 14. . Miks toimub DNA ahela süntees alati 5´otsast 3`otsa suunas? Sest replikatsiooni läbiviiv ensüüm DNA/RNA polümeraas saab nukleotiide liita vaid 3' otsa, seega jääb vabaks 5' OH rühmaga. 15. Millise sideme kaudu on ühendatud nukleotiidijäägid DNA ahelas? Fosfodiestersidemega 16. Milline oligonukleotiid omab kõrgemat ,,sulamistemperatuuri" Tm. Miks? GC rikas, sest GC omab kolme vesiniksidet, AT vaid kahte. 17. . Mitu aluspaari tuleb ühe B-DNA heeliksi pöörde kohta? 10 18. Ligikaudu mitut aluspaari sisaldab inimese genoom? 3 x 10^9 19. Miks sisaldab enamikust organismidest eraldatud DNA ligikaudu võrdsel hulgal A ja T ning G ja C nukleotiide? Sest nad on paaris omavahel. A-T ja G-C ning seetõttu on neid ühepalju, nad on nagu komplekt. 20
(sama küsimus ka RNA kohta). V: Enamasti on geneetiline informatsioon kodeeritud kaheahelalises DNA-s (kuid esineb ka viirusi, mille genoom koosneb üheahelalisest DNA-st või RNA-st.) 14. Miks toimub DNA ahela süntees alati 5´otsast 3`otsa suunas? (sama küsimus ka RNA kohta). 15. Millise sideme kaudu on ühendatud nukleotiidijäägid DNA ahelas? (sama küsimus ka RNA kohta). a) fosfodiesterside b) fosfoanhüdriidside c) vesinikside 16. Milline oligonukleotiid omab kõrgemat ,,sulamistemperatuuri" Tm. Miks? a) AT rikas b) GC rikas Kuna G-C aluspaar on stabiliseeritud kolme vesiniksideme poolt, siis kulub tema lõhkumiseks rohkem energiat. Samuti on van der Waalsi interaktsioonid G-C aluspaari puhul tugevamad. H°' suurem G-C rikaste nukleiinhapete puhul ja järelikult on suurem ka vastav Tm 17. Mitu aluspaari tuleb ühe B-DNA heeliksi pöörde kohta? a) 10 b) 25 c) 50 18. Ligikaudu mitut aluspaari sisaldab inimese genoom?
Replikatsiooni läbi viiv ensüüm DNA (või RNA) polümeraas saab nukleotiide liita vaid 3'C külge. Seega jääb DNA/RNA "ülemisse" otsa nukleotiid vaba 5'OHrühmaga ja reaktsiooni saabki nimetada 5'3' suunaliseks. 15.(111) Millise sideme kaudu on ühendatud nukleotiidijäägid DNA ahelas? a) fosfodiesterside Nukleotiid lämmastikalus + suhkur + monofosfaat Nokleotiidid on ühendatud lineaarseks polümeeriks nukleiinhappeks 3'5' fosfodiestersidemega 16.(112) Milline oligonukleotiid omab kõrgemat ,,sulamistemperatuuri" Tm. Miks? b) GC rikas, sest Gd ja Cd seovad omavahel 3 vesiniksidet, aga Ad ja Td 2. 17.(113) Mitu aluspaari tuleb ühe BDNA heeliksi pöörde kohta? a) 10 18.(114) Mitut aluspaari sisaldab inimese genoom? c) 3 x 109 19.(115) Miks sisaldab enamikust organismidest eraldatud DNA ligikaudu võrdsel hulgal A ja T ning G ja C nukleotiide? DNA kaksikheeliks on stabiliseeritud vastasahelate lämmastikaluste vaheliste vesiniksidemete moodustumise kaudu (n.ö
Seega jääb DNA/RNA "ülemisse" otsa nukleotiid vaba 5'OHrühmaga ja reaktsiooni saabki nimetada 5'3' suunaliseks. 15.(111) Millise sideme kaudu on ühendatud nukleotiidijäägid DNA ahelas? (sama küsimus ka RNA kohta). a) fosfodiesterside b) fosfoanhüdriidside c) vesinikside Nukleotiid lämmastikalus + suhkur + monofosfaat Nokleotiidid on ühendatud lineaarseks polümeeriks nukleiinhappeks 3'5' fosfodiestersidemega 16.(112) Milline oligonukleotiid omab kõrgemat ,,sulamistemperatuuri" Tm. Miks? a) AT rikas b) GC rikas GC rikas, sest Gd ja Cd seovad omavahel 3 vesiniksidet, aga Ad ja Td 2. 17.(113) Mitu aluspaari tuleb ühe BDNA heeliksi pöörde kohta? a) 10 b) 25 c) 50 18.(114) Mitut aluspaari sisaldab inimese genoom? a) 3 x 105 b) 3 x 107 c) 3 x 109 19.(115) Miks sisaldab enamikust organismidest eraldatud DNA ligikaudu võrdsel hulgal A ja T ning G ja C nukleotiide?
· Nukleiinhappeid sünteesitakse 5' -> 3' suunas. Fosfodiesterside moodustub ahela viimase nukleotiidi 3'-OH rühma ja lisanduva nukleotiidi 5' süsinikuga seotud fosfaadi vahele. · Ensüümid, mis viivad läbi nukleiinhapete sünteesi: DNA polümeraas sünteesib ühele DNA ahelale komplementaarse DNA ahela; vajab praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga (praimer lühike oligonukleotiid DNA või RNA ahel) RNA polümeraas sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA; seondub spets. promootorjärjestusega ; praimerit pole vaja Pöördtranskriptaas ehk revertaas sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA; vajab sünteesil praimerit · Muud ensüümid: DNA helikaas katalüüsib DNA ahelate üksteisest eraldumist
d) K+ - primaarne aktiivne transport e) Aminohapped - sekundaarne aktiivne transport f) Rasvhapped - sekundaarne aktiivne transport 5. HARJUTUSTUND Nukleiinhapete komponendid. Polünokleotiidahela ehitus 1. Selgitage järgmisi mõisteid a) Nukleosiid - lämmastikalus + suhkur, mis on omavahel ühendatud N-glükosiidsidemega b) Nukleotiid - nukleosiidfosfaat. N-alus + suhkr + 1-3 fosforüülrühma c) Oligonukleotiid - kahest kuni kümnest nukleotiidist koosnev ahel d) Geen - pärilikkustegur kromosoomi kindlas piirkonnas, mis määrab otseselt või kaudselt mingi tunnuse arengu. Komplementaarsed N-alused - T:A / U:A ning G:C, omavahel ühendatud vesiniksidemetega 2. Lämmastikalused jaotatakse põhistruktuuri alusel pürimidiinideks ja puriinideks. (rühma nimetus). Joonistage nende rühmade üldstruktuurid ja nimetage, millised konkreetsed lämmastikalused kuuluvad neisse rühmadesse. Üldstruktuurid:
· kvantifikatsioon genoomide analüüs: mutatsioonide, SNPde tuvastamine · kvalifikatsioon ekspressiooni profileerimine · Eri patogeenide tuvastamine (tollis) Loetakse fluorestsentsanduritega. Affymetrix Gene ChipTM: Klaasil kovalentse linkeri abil fotoaktiivsed järjestused, mask ees. Vahel avatakse teatud positsioonid maskis ja lisatakse mingi nukleotiid, mis ühineb -> protekteeritakse -> mask ette tagasi -> avatakse järgmised positsioonid. Nii sünnibki jupphaaval oligonukleotiid. Oligokiibid: Uuritakse absoluutset geeniekspressiooni taset kui palju saab sekveneerida (?) SNPde genotüpiseerimine Spotitud cDNA mikrokiibid: DNA kloonid klaasile, kuhu hübridiseeritakse RNA, millest tehtud cDNA, mis värvitakse ja hübridiseeritakse microarrayga. Kahe laseriga (punane, roheline) mõõdetakse tulemit. Arvuti arvutab välja ekspressioonitasemete pildi: midagi on tõusnud, midagi langenud, midagi samaks jäänud. Näiteks anname rakukle kuumasoki ja siis
Matriitsina toimib üksikahelaline nukleiinhape. Seega peab kaksikahelaline DNA replikatsiooni initsiatsioonisaidist olema eelnevalt viidud üksikahelaliseks. DNA ahelate eraldumist teineteisest katalüüsib DNA helikaas. Nukleiinhapete sünteesi läbiviivad polümeraasid: 1. DNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Toimub DNA replikatsioon. Vajab sünteesil praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga. Praimeriks on lühike oligonukleotiid (DNA või RNA ahel) 2. RNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootrorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit. 3. Pöördtranskriptaas e. revertaas ensüüm, mis sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela.
Matriitsina toimib üksikahelaline nukleiinhape. Seega peab kaksikahelaline DNA replikatsiooni initsiatsioonisaidist olema eelnevalt viidud üksikahelaliseks. DNA ahelate eraldumist teineteisest katalüüsib DNA helikaas. Nukleiinhapete sünteesi läbiviivad polümeraasid: 1. DNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Toimub DNA replikatsioon. Vajab sünteesil praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga. Praimeriks on lühike oligonukleotiid (DNA või RNA ahel) 2. RNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootrorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit. 3. Pöördtranskriptaas e. revertaas ensüüm, mis sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela.
65 NUKLEIINHAPPE DENATURATSIOON. PCR reaktsiooni toimumiseks peab sihtmärgina kasutatav nukleiinhape olema üheahelaline. Sihtmärgina kasutatav DNA vabastatakse mikroorganismist kas kuumutamisel, keemilisel või ensümaatilisel meetodil. Prokarüootsete organismide, eriti bakterite puhul võib DNA vabastamiseks bakterirakku kuumutada üle 90°°C. PRAIMERI SEOSTUMINE (ANNEALING). Praimer on lühike nukleiinhappe lõik (oligonukleotiid pikkusega 20-30 nukleotiidi), mis vastavalt komplementaarsusele seostub (annealing) teatud kindla nukleiinhappe järjestusega. Igal mikroorganismi liigil, geenil, operonil on mingi unikaalne järjestus, mida on võimalik määrata sekveneerimisel, leida need andmed andmebaasidest (GENBANK jne.). Praimerid valitakse ja disainitakse nii, et nad asetseksid huvipakkuvast geenist või nukleotiidide järjestusest „väljaspool“ ja nende vahele jääks 50 kuni 1000 nukleotiidipaari. Kui
annaabi.ee 
