Kordamisküsimused Geenitehnoloogia I (0)

Kordamisküsimused Geenitehnoloogia I Restriktaasid. Restriktaasid on ensüümid, mis lõikavad DNA-d spetsiifilise nukleotiidse järjestuse
järgi. Nad teevad seda kõikide DNA’de puhul samamoodi. Neid spetsiifilisi järjestusi
nimetatakse restriktsiooni aladeks.  Selliseid ensüüme on leitud bakteritest kaitsmaks
neid kahjulike viiruste eest. DNA kloneerimine baseerub restriktaaside avastamisel.
DNA järjestuse äratundmine varieerub erinevate restriktaaside vahel, lõigates tekivad
eri pikkusega “kleepuvad” üleulatuvad osad. “Kleepuvad” üleulatuvad osad võivad
olla nii peaahelal kui “komplementaarsel” ahelal. Selliste otstega DNA ahelaid on
komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita, tekib rekombinantne DNA. Restriktaasid   on   ensüümid,   mis   katkestavad   hüdrolüüsi   fosfordiester   sidemel,
tunnevad ära 6 järjestust iga restriktaas tunneb erineva.  DNA kloneerimise etapid.  Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik  Vektor-DNA ettevalmistamine  Kloonitava DNA ettevalmistamine  Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil  Rekombinantse DNA sisendamine peremeesorganismi  Rekombinantide selekteerimine  Rekombinantide analüüsimine   Etapp 1. Valitud DNA tükk lõigatakse päritoluorganismist restriktsiooniensüümide 
abil.   Etapp 2. DNA tükk „kleebitakse“ vektorisse ja DNA otsad liidetakse vektori DNA-ga 
ligeerimise teel.  


Etapp 3. Vektor sisestatakse peremeesrakku, sageli bakterisse või pärmi. 
Peremeesrakud kopeerivad vektori DNA koos oma DNA-ga, luues sisestatud DNA-st 
mitu eksemplari/koopiat.   Etapp 4. Vektor-DNA eraldatakse peremeesraku DNA-st ja puhastatakse. Mis on rekombinantne valk, selle tootmise võimalused? Rekombinantne valk on 
valk, mida kodeerib rekombinantne DNA. 
On DNA kloneerimise teel saadud valk. Selliseid valke saab toota nt bakterite abil või
transgeensete loomade abil. Mis on cDNA?  cDNA (komplimentaarne DNA) on pöördtranskriptsiooniga saadud
DNA   koopia.  Pöörd-transkriptaas  on   ensüüm,   mille   abil   sünteesitakse   mRNA’lt
cDNA’d. cDNA’d kasutatakse eukarüootsete geenide kloonimiseks prokarüootsetes
organismides. Bakteri rakkudesse geenide viimisel peame me mRNA alusel tegema
DNA. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Rekombinantsed valgud
on meile väga praktilised, kuna saame neist toota erinevaid ravimeid nt. insuliini.
Kasutatakse veel toidutööstuses ensüümid (piim, juust), keskkonnakaitses (toksiliste
jääkide likvideerimine bakterite abil). 
Kloonitud   geenid   on   kasulikud   tegemaks   uuritavast   geenist   kergesti   hallatavaid
koopiaid ja tootmaks selle põhjal vajaminevat valku.  Sangeri sekveneerimise põhimõte.
Kasutatakse didesoksüribonukleotiide, mis erinevad desoksüribonukleotiididest selle
poolest, et suhkrujäägis ei ole 3’ otsas hüdroksüülrühma, mille tõttu ei saa ahel edasi
minna,   vaid   süntees   jääb   selle   koha   peal   pidama.   Sekveneeritav   DNA  pannakse
reaktsioonianumasse   tavaliste   desoksüribonukleotiididega   ja   sünteesitud
didesoksüribonukleotiididega. Reaktsioonid viiakse läbi iga lämmastikalust sisaldava
nukleotiidiga eraldi: igas eri anumas on sama tähega lõppevad lõigud. Järjestuse paika
panemiseks viiakse läbi  geel-elektroforees.  Kõik tekkinud DNA lõigud on erineva
pikkusega ja see mõjutab nende liikumist geelis: lühemad lõigud liiguvad kaugemale,
pikemad lähemale. Kuna on teada, millise tähega iga eri pikkusega lõik lõppeb, siis
saab teada, kus milline täht sekveneeritavas DNAs paikneb. Järgmise põlvkonna sekveneerimismeetodid.
Järgmise põlvkonna sekveneerimistehnoloogia pidi lahendama kõik Sangeri meetodil
esinevad probleemid nagu nt kõrge hind ja suhteliselt vähese informatsiooni saamine.
Seda iseloomustavad platvormid, mis toodavad miljoneid lühikesi DNA järjestusi.
Võimaldab järjestada paralleelselt suurt hulka DNA molekule. 
Esimene turule jõudnud tehnika oli pürosekveneerimine (roche, GS20), mis toimub
DNA   sünteesi   käigus,   mille   läbi   viivaks   ensüümiks   on   DNA   polümeraas.   DNA
paljundamiseks   kasutab   see   PCR-   meetodit.   Reaktsiooni   keskkonnaks   on   veetilga
sarnane   emulsioon(õlitilk),   kus   igas   üksikus   tilgas   paljundatakse   DNA lõiku.   Iga
nukleotiidi lisandumisel uude ahelasse vabaneb prüofosfaat. Pürosfaat on substraadiks


erinevate   reaktsioonide   toimumiseks,   mille   tulemusel   vabaneb   valguskiirus,   mis
registreeritakse ja tänu millele saab järjestada terve ahela.
Illumina   Solexa  tehnoloogia   puhul   algab   töö   genoomse   DNA fragmeteerimisega
ultraheli   vahendusel,   mille   tulemusel   saadakse   suhteliselt   ühtlase   pikkusega   DNA
segu.  Seejärel   liidetakse   nende   DNA  lõikude   otstesse   adapteroligonukleotiidid   ja
puhastatakse. Nüüd järgneb DNA amplifitseerimine, mis Illumina platvormi puhul
toimub tahkele kandjale seotult. Selleks kasutatakse nn. Flow-Cell-i, kus paiknevad
adapteritega   komplementaarsed   oligonukleotiidid,   millele   liidetakse   DNA
fragmendid.   Sildamplifikatsiooni   tulemusena   tekivad   Flow-Cell   põhja   identse
järjestustega DNA klastrid 
Sekveneerimiseks   kasutatakse   eemaldatava   floresentsiga   terminaatnukleotiide   ja
vastavat   DNA   polümeraasi.  Ühe   sekveneerimise   tsükli   kohta   liidetakse   üks
komplementaarne nukleotiid, loetakse ära sellega seotud fluorestsentsmärge 8 ning
siis eemaldatakse antud fluorofoor ja blokaatorgrupp. 
SOLID  tehnoloogia põhineb sünkroonsetes ligeerimistsüklites. SOLID tehnoloogia
kasutab   DNA   amplifitseerimises   emulsioon-   PCR   meetodit.   DNA   fragmentide
raamatukogu   valmistatakse   mikrokuulidel.   PCR-i   lõpptulemusena   on   iga   kuulike
kaetud   tuhandete   koopiatega   algsest   fragmendist.   Seejärel   vastavalt   rakendusele
asetatakse kuulid klaaspinnale. Fluorestsentsvalgus eraldub alles siis kui üksikahel
ligeeritakse   olemasoleva   fragmendiga.   SOLiD   kasutab   samuti   nelja   värviga
fluorestsentsmarkeerimist, et kaardistada võimalike nukleotiidide kombinatsioone  Miks on oluline teada organismide genoomide täispikki järjestusi?
Selle   abil   on   võimalik   koostada  evulutsiooni   puid  või   arendada   välja   kindlaid
mehhanisme   sihtivaid  ravimeid.  Näiteks   meditsiinis   saab   seda   kasutada   haiguste
identifitseerimiseks   ja   potentsiaalselt   ka   ravi   väljatöötamiseks   erinevatele
geneetilistele haigustele.
Tänu geenijärjestamise tehnoloogia täiustumisele loodavad teadlased loomade DNA
kaudu   jõuda   lähemale   inimhaiguste   mõistmisele,   täiendades   ühtlasi   teadmisi
bioloogiast   ja   evolutsioonist.   Looma   DNA võrdlemine   inimese   omaga   võib   anda
meditsiiniteaduse   seisukohalt   olulist   informatsiooni   ning   seetõttu   valmisidki
kõigepealt selliste laialdaselt laboriloomadena kasutatavate loomade genoomid nagu
rott, hiir ja koer.  Genoomika - täispikkade genoomide uurimine.  Igal inimesel on pisut erinev genoom, need erinevused võivad mõjutada inimese 
tervist. Genoomi täispikka järjestust kasutades saab tegeleda personaalmeditsiiniga, 
sest on võimalik teada, kuidas patsient ravimile reageerib ja selle põhjal määrata just 
talle sobiv ravi. Polümeraasi ahelreaktsioon.
Esmalt tuleb DNA denatureerida. PCR-i puhul on vaja teada lühikesi järjestusi kahel
pool   sünteesitavat   piirkonda.   Külgnevate   järjestuste   järgi   on   sünteesitud
komplementaarsed praimerid, tavaliselt 15–25 nukleotiidi pikkused oligonukleotiidid.
Nende seondumine DNA-ga on vajalik, kuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on
fragmentide   sünteesi  initsiaatoriteks.  Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel   mõlemale   poole   piirkonda.   Kui


praimerid   on   amplifitseeritava   DNA   järjestuse   kahelt   poolt   kindlaks   teinud   ja
piiranud,   sünteesib  termostabiilne   DNA   polümeraas  praimerite   3’   otsast   alates
mõlemale   DNA   üksikahela   fragmendile   komplementaarse   fragmendi,   kasutades
selleks segusse lisatud nukleotiide.  Näitab mis järjestus DNA-s on.  DNA   polümeraas   pikendab   olemasolevat   DNA   ahelat,   kuid   selleks   et   DNA
polümeraas saaks DNA- le  kinnituda on vaja RNA molekule (praimerid),  mis  on
komplementaarsed DNA molekuliga.  Praimeri abil toimub ka sekveneerimine, sest
siis on erinevate DNA molekulide algused samad. Milline meetod on reaalaja PCR?
Reaktsiooni   segusse   pannakse   täiendav   praimer,   mis   jääb   polümeerile   ette.   Selle
küljes on floresents. Kui polümeraas  teeb praimeri  katki  tekib  floresentsi  signaal,
mille järgi saab teada et toimub DNA süntees.
DNA küljes on floresents, kui tuleb polümeraas lükkab ta floresentsid lahti ja tekib
värv.
Praimerite vahel on kolmas praimer mille otsad on keemiliselt plokeeritud, ja selle
küljes on floresseeruv molekul, kui polümeraas teeb praimeri katki tekib värv.
Floresentsi saab mõõta, ning näeme kui palju seda konkreetset DNA lõiku juurde
tekib. (kvantitatiivne meetod, mõõdab hulka)  Kuidas on polümeraasi ahelreaktsioon muutnud geenitehnoloogiat?
PCR-meetod võimaldab väga väikesest DNA lõigust luua miljoneid koopiaid.
Haiguste diagnostikas mängib olulist rolli, AIDS-i nakatumise diagnoosimine väga
varajases   staadiumis,   muteerunud   geenide   uurimisel,   genoomide   sekveneerimisel,
uute   ravimite   väljatöötamisel   ning   laboratoorsetel   ning   kliinilistel   katsetel,
kriminalistikas.  Milleks kasutatakse bioloogias tsentrifuugimist?
Kasutatakse   väikeste   koguste   bioloogiliste   molekulide   eraldamiseks   ja   koostise
uurimiseks. Tsentrifugaaljõudu kasutatakse bioloogiliste osakeste koostise uurimiseks.
Selle   abil   saab   eraldada   nt.   ribosoome,   proteiine   ja   viirusi,   samuti   uurida
rakumembraani   kihte.   Saab   nt.   kindlaks   teha   missugustest   aminohapetest   koosneb
valk jne. 
 Molekulid kas lahustuvad tsentrifuugi käigus, vajuvad põhja või moodustuvad kihid.  Geel-elektroforees
on elektroforeesi rakendus, mida kasutatakse erinevate elektriliselt laetud molekulide
(DNA, RNA, valgud)   eraldamiseks  pikkuse,   laengu  või  konformatsiooni järgi agaroosist. 
Negatiivselt   laetud nukleiinhapete (DNA,   RNA)   molekulid   liiguvad   agaroosgeelis
elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile, agroosis peatuvad pikemad molekulid
lähemal alguskohale (hambale). Lisaks molekulide erinevale suurusele mõjutab nende
liikumist ka konformatsioon –  tsirkulaarsed  molekulid liiguvad kas aeglasemalt või
kiiremini kui sama pikad lineaarsed molekulid. 


Tiheduselt   sarnane   vedelikele   kuid   füüsikalised   omadused   sarnanevad   tahketele
ainetele. Geel ujub vedeliku sees. Vannis on 2 elektroodi (+ ja -) Geeli otsas on kamm
mis teeb geeli (agaroosi) sisse augud. Osakesed hakkvad agaroosis erinevatel kiirustel
liikuma. Milleks tuleb valkude geel-elektroforeesil kasutada naatrium-dodetsüülsulfaati
(SDS)? 
Sest agroosgeelis saab valke eraldada vaid laengu järgi, sest geeli poorid on valkude
suuruse järgi eristamiseks liiga suured. Mass-spektromeetria.
Valgu segude analüüsiks, toimub vaakumis, võimeline separeerima suuri molekule. 1. proov sisestatakse massispektromeetria aparatuuri ja aurustatakse; 2. ühendid ioniseeritakse, mille tulemusena tekivad laetud osakesed (ioonid) 3. ioonid   eraldatakse analüsaatoris elektromagnet-   või magnetväljade abil sõltuvalt nende massi ja laengu suhtest 4.  ioonid detekteeritakse mõne kvantitatiivse meetodiga; 5. saadud signaalist koostatakse massispekter. Nukleiinhapete hübridiseerimine.
nukleiinhappe (DNA või RNA)   ahela   kinnitamine komplementaarse DNA või   RNA
ahela   külge.   Seda   tehakse   kuumutamisega,   millele   järgnevalt
tuvastatakse vaatlusega uuritava sondi ehk märgistatud ahela asukoht. Seda meetodit
saab   kasutada   selleks,   et   lokaliseerida   DNA   järjestusi kromosoomides,   tuvastada
RNA-d või viiruslikku DNA-d
Kahe erineva päritoluga komplementaarse nukleiinhappe üksikahela kokkusegamisel 
toimub nendevaheline hübridisatsioon, mille käigus nende nukleiinhapete ahelad 
paarduvad moodustades hübriidse kaksikahela. Hübridisatsioonitehnika on meetod 
uuritava nukleiinhappe molekuli eristamiseks heterogeenses nukleiinhappe 
molekulide populatsioonis proovi ja sihtmärgi (target’i) komplementaarsuse alusel.  Proov (teadaolev järjestus) koosneb tüüpiliselt identifitseeritud nukleiinhappe 
molekulide homogeensest populatsioonist (kloonitud DNA või keemiliselt sünteesitud
oligonukleotiidid) ja sihtmärgi (otsitavad järjestused) moodustab nukleiinhapete 
segust koosnev heterogeenne populatsioon. Hübridiseerimise eesmärgiks on proovi 
teadaolevaid järjestusi kasutades tuvastada homoloogilisi järjestusi sihtmärk DNA-s. 
Kui proov või sihtmärk on kaheahelalised, siis kõigepealt nad denatureeritakse, kas 
kuumutamisel või töötlemisel aluselises keskkonnas, seejärel segatakse proovi ja 
sihtmärgi üksikahelad kokku ja lastakse komplementaarsetel aluspaaridel 
reassotsieeruda. Seejuures võivad moodustuda nii homodupleksid proovi ja sihtmärgi 
DNA ahelate vahel kui ka heterodupleksid proovi ja sihtmärgi DNA ahelate vahel.  Nukleiinhappe kiibid.


Keemiliselt sünteesitud oligonukleotiidid kinnitatakse kiipidele. Me teame molekulide
nukleotiidide   järjestust.   Kui   meid  huvitavad  järjestused   hübridiseeruvad
oligonukleotiididega jäävad komplementaarsed molekulid kiibi külge kinni ja meid
huvitav molekul on märgistatud. Õhukese kihi kromatograafia.
Ained   (proov   ja   standardühendite   lahused)   kantakse   väikeste   täpikestena   plaadi
alaserva lähedale stardijoonele. Seejärel asetatakse plaat püstiselt  elueerimisnõusse,
mille   põhjas   on  eluent  (lahusti või   lahustite   segu),   ja   nõu   suletakse.   Eluent
tõuseb kapillaarjõudude mõjul   piki   plaati   ülespoole   ja   sellega   koos   hakkavad
ülespoole liikuma  ka stardijoonele kantud ained, kusjuures komponendid, liikudes
erineva   kiirusega,   eralduvad   üksteisest   laikudena.   Plaat   võetakse   nõust   välja,   kui
eluendi   tase   on   jõudnud   plaadi   ülaserva   lähedale.   Plaat   kuivatatakse   ja   vajadusel
komponentide   laigud   ilmutatakse   näiteks joodi aurudega või fosformolübdeenhappe lahusega.
Planaarkromatograafia on kromatograafia liik, mille puhul statsionaarseks faasiks on 
adsorbendi õhuke kiht (paber, metall-lehele kantud silikageel vmt), milles mobiilne 
faas (ehk vooluti ehk eluent) liigub kapillaarjõudude toimel. Kolonn-kromatograafia.
Praktikas juhitakse ainete segu läbi kolonni täidise sobiva vedeliku vooluga (eluent
ehk liikuv faas). Sorptsiooni ja desorptsiooni tulemusena jaotuvad segu komponendid
liikumatu   ja   liikuva   faasi   vahel   vastavalt   kindlatele  koefitsientidele,   mida
nimetatakse jaotuskoefitsientideks.   Selle   protsessi   paljukordse   kordamise   tagajärjel
liiguvad komponendid edasi erinevate kiirustega. See viib komponentide lahutumisele
ning moodustuvad vastavad kiiremini ja aeglasemalt liikunud komponentide tsoonid.
Kui  mobiilne   faas  on   vähem polaarne võrreldes   statsionaarse   faasiga,   siis   vähem
polaarne aine liigub kiiremini ja polaarsem aine aeglasemalt (jääb tahapoole).
Kromatograafia kolonn koosneb klaas- või metallkestast ja poorsest täidisest selle 
sees. Poorse täidise pind toimib statsionaarse faasina. Eluent voolab läbi kolonni 
raskusjõu mõjul või pumba survel. Kolonnist väljuvate ühendite identifitseerimise 
jaoks saab kolonni järele ühendada detektori, milleks võib olla näiteks fotomeeter  Kuidas saavutatakse organismis antikehade mitmekesisus?
Lümfotsüütide küpsemise käigus tekivad DNA ümberkorraldused (antikehade geenide
pealt   DNA-st),   kus   mõned   DNA   osad   lõigatakse   välja.   Lõplik   geen   mille   pealt
antikehi   toodetakse   on  lühem.   Erinevates  rakkudes  on  need   erinevad   ja  seekaudu
tekitatakse   juhuslikult   lõpmata   palju   antikehasid.   (transkriptsiooni   käigus)   See
tõestab, et on olemas rakke kus genoom ei ole samasugune.  Antikehade kasutamine molekulaarbioloogias.
Märgistatud antikehad seonduvad uuritava molekuliga (valguga) Saab teha kindlaks
nende valkude sisalduse proovis.   Saab panna ensüümi valgu antikeha külge ELISA  värvime antikehi floresseeruvate molekulidega visualiseerimiseks 
 hübridiseerid filtrit antikehadega western blotting Millised on monoklonaalsed antikehad?


Monoklonaalne antikeha - antikeha, mis on produtseeritud ühe raku
või   rakuliini   poolt,   mis   on  ühest  rakust  arenenud.   On   identsed   ja
omavad   unikaalset   aminohappe   järjestust,   kasvavad   identselt.
Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Homogeenset
antikehade populatsiooni on võimalik saada B lümfotsüütide liitmisel
kasvajarakkudega. Saadud rakuliine kutsutakse hübridoomideks . 
Monoklonaalsed antikehad tekivad kui ühendada B-lümfotsüüdid kasvajarakkudega,
need   on  hübridoomid.  Selektiivsöötmel  jäävad   ellu   ainult   hübridoomid.   Nüüd   on
puhas kultuur ühte tüüpi antikehi tootavatest, hästi paljunevatest rakkudest. Mis on roheline fluorestseeruv valk, milleks ja kuidas seda kasutatakse?
See on meduusist saaadud geen, mis floresseerub rohelises vahemikus ja mis teise
valguga liitudes seda ei mõjuta, kuid näitab meile kus see valk ekspresseerub. Millised  on   objektide   detektsiooni   piirid   valgusmikroskoopias,   millised
elektronmikroskoopias? Valgusmikroskoopia võimaldab meil vaadelda objekte mis
pole   väiksemad   kui   valguse   lainepikkus   100nm,   elekrtronmikroskoopia   aga
võimaldab 0,1nm. Defineeri palun mõiste “geneetiliselt muundatud organism”
Geneetiliselt   muundatud   organism   (GMO)   on   selline   organism,   kelle
pärilikkusetegureid on muudetud viisil, mis looduslikul teel ei ole võimalik.  GMO-
elusolend (bakter, seen, taim, loom), kelle pärilikkuse ainet (DNA-d) on  kunstlikult
muudetud. Organismi genoomi on siirdatud võõrliigi geene. Kuidas konstrueerida transgeenset looma?
Hulkraksete organismide puhul peab DNA järjestus jõudma nende sugurakkudesse. 
Samuti   võib   ka   emrüo   siserakke   organismist   võtta   ning   neid   kasvatada   ja
transformeerida. Hiljem süstitakse need tagasi embrüosse. Pärast moodustavad need
juhusliku osa sündinud organismi rakkudest. Sorteerime järglastest välja need kellel
on DNA sugurakkudes. Nende järglased on täielikult transgeensed. Transgeenne loom- loom, mille kõikide rakkude DNA järjestused sisaldavad võõra DNA- järjestuse. Et saada ühet transgeenset looma võib: 1)    võtta viljastatud munarakku ja viia selle tuuma plasmiidi abil laboris valmispandud DNA-lõigu.Siis  viia munarakk asendusema emakasse ja oodata laste sündimist. 2)    võtta looma emakast blastotsüstid, eralda neist tüvirakud ja lisada neile plasmiid DNA´d. 
Kui plasmiid DNA integreerub tüvirakkude kromosoomidesse, viia need tagasi blastotsüsti ja 
blastostüst viia aesendusema emakasse.  Millistel viisidel on võimalik rakku viia võõrast DNA-d?
DNA saab rakku siseneda kui rakku töödelda kemikaalidega ja rakku tekkivad poorid.
DNA võib panna ka vesiikulisse, mille rakk alla neelab. 
DNA võib panna kullapartiklitele ja pommitada nendega rakku. 
DNA-d võib ka rakku süstida.
DNA võib viia rakku viirustega


Taimede puhul agro bakteritega.
Bakteri plasmiidiga. Mis on embrüonaalsed tüvirakud? Embrüonaalsed   tüvirakud on pluripotentsed tüvirakud,   mis   on saadud embrüo varajase   staadiumi blastotsüsti sisemisest   rakumassist.   Tüvirakud
võivad areneda peaaegu igat tüüpi koe rakkudeks.
Arvatakse, et embrüonaalsete tüvirakkude plastilisust ja potentsiaali piiramatuks 
paljunemiseks saab kasutada taastusravis ja vigastatud või haigete kudede 
asendamiseks. Meditsiinis võiks pluripotentsete tüvirakkude abil ravida palju vere ja 
immuunsüsteemiga seotud haigusi ja häireid, vähkkasvajaid, laste diabeeti, 
Parkinsoni tõbe ja selgroovigastusi. Geneetiliselt muundatud selgroogsete kasutusalad.
Kasutatakse rekombinantsete valkude tootmiseks ja meitsiinilisel eesmärgil.Loomade
tõuaretuses.   Samuti   on   olemas   kiire   kasvuga   kalad   ja   floresseeruvad   kalad.
molekulaargeneetika uurimisel • GM-kitse piimas antikehad kasvajate vastu • GM-lehma piimas laktoalbumiin enneaegsetele lastele • GM-sead toodavad inimese hemoglobiin • lehm kes toodab insuliini Geneetiliselt muundatud mikroorganismide kasutusalad.
nt kasutatakse transgeenseid pärme rekombinantsete valkude tootmiseks (bhepatiidi
vaktsiin) ja juustu tootmiseks ensüüme.Viiruseid kasutatakse geeniteraapias. Bakterid
toodavad   erinevaid   valke   haiguste   raviks   (insuliin,   inimese   kasvuhormoon,   vere
hüübimis   faktorid).   DNA   kloneerimiseks   kasutatakse   baktereid.   Saab   kasutada
keskkonna tehnoloogias, saaste eemaldamine. Mis on nokaut hiir?
Nokout   organism-   organism   kellel   on   teatud   geen   maha   surutud.   Geeneetiliselt
muundatud hiir, kus teadlased on välja lülitanud olemasoleva geeni, seda asendades
või segades seda mingi teise DNAga. Ühe geeni välja lülitamisega saab uurida seda,
mida see geen tavaliselt teeb. 
Knockout-hiir või knock-out hiir on geneetiliselt muundatud hiir milles teadlased on
inaktiveerinud või "lülitanud välja" olemasoleva geeni, asendades selle või häirides
seda kunstliku DNA tüki abil. Need on olulised loomamudelid, et uurida geenide rolli,
mis on järjestatud, kuid mille funktsioone ei ole kindlaks määratud. Põhjustades mingi
geeni   mitte   aktiivsust   hiires   ja   jälgides   erinevusi   tavapärasest   käitumisest   või
füsioloogiast, saavad teadlased järeldada geeni tõenäolist funktsiooni. GMO-de kasutamine põllumajanduses. GMOd kasutatakse põllumajanduses, sest see tagab suurema saagikuse,  taimed on  vastupidavamad kahjuritele ning külmale. Kõige enam on 
geneetiliselt muudetud sojauba, maisi, riisi, kartulit jne. Eestis on lubatud 
müüa GMO taimi, kuid põldudel ei kasva GMO taimi.


Eesmärgid (näiteks):
 haigus- ja kahjurikindlus: putukad, viirused jne.
 resistentsus umbrohutõrjevahenditele (herbitsiididele)
 säilivusaeg
 toiteväärtus (vitamiinid, rasvhapped, jne.) Kuidas konstrueerida üht putukkahjuritele resistentset transgeenset taime? 
Transgeensete   taimede   tegemise   puhul   kasutatakse   agro   baktereid,   mis   viivad
looduslikul teel ühe osa oma plasmiidsest DNA-st taimele. Seega saame agro bakteri
geenid asendada meid huvitavate geenidega ja viia need taime rakku. Ja kasvatada
sellest transgeenne taim.
Bt-toksiini määrav geen on viidud taimesse. Võetakse cry geen bakterist, mis toodab
putukspetsiifilist toksiini. See toksiin on putukatele kahjulik. Kuidas konstrueerida üht herbitsiididele tolerantset transgeenset taime?
glüfosaat, glüfosinaat blokeerib aminohapete sünteesi. glüfosaat (herbitsiit) plokeerib
ära   ühe   ensüümi   mis   vastutab   aminohapete   tootmise   eest   (EPSPS   ensüüm   ,EPSP
süntaas).
Et muuta taim herbitsiidi tolerantseks   võiks talle siirdada, mõne teise organismi geene, mis kodeerivad sama  ensüümi, aga vähe teisel kujul nii et herbitsiid sellega ei seondu.  Võib ekspresseerida ka ensüümi, mis muudab herbitsiidi nii, et see ei seondu  aminohapet sünteesiva ensüümiga. Mis on “Kuldne riis”?
Üks varasemaid näiteid säärastest GMOdest on kuldne riis. Tavalise riisi sisse viiakse
beta-karoteeni  sünteesi jaoks vajalikud muudatused ja valmib veidi kollaka värviga
riisisort,   mis   võib   päästa   sadade   tuhandete   laste   elu,   kes   surevad   vitamiin   A
puudusesse igal aastal. 
Kuldne riis on GMO riis, mis erineb valgest riisist selle poolest et selle terades 
avaldub beta-karoteen  Mille poolest erineb organismide kloneerimine DNA kloneerimisest?
DNA kloneerimise käigus viiakse võõras geen peremeesorganismi, mis muudab tolle
geneetilist materjali, mis looduslikult poleks võimalik.
Organismide kloneerimise käigus jääb geneetiline materjal samaks. DNA kloonimine- on teatud DNA lõigu paljunemine. St. meil on juba üks DNA 
lõik ja me tahame saada selle koopiad. Ja DNA kloonerimist me võime läbi viia 
katseklaasis. Me saame täpsed DNA koopiaid. Organismide kloneerimisel me peame toimima keerulisemalt: tuleb eraldada 
viljastatud munarakust tuum, ja viia selle tuuma asemele teise looma somaatilise raku 
tuum. Siis seda  munarakku viiakse asendusema emakasse ja sünnib kloneeritud loom.
See loom ei ole 100% oma ema (kellest somaatilisest rakust on võetud tuum) koopia, 
vaid see on väga sarnane loom. Kuidas kloneerida imetajat?


Selleks tuleb võtta viljastamata munarakk ja kõrvaldada sellest rakutuum. Seejärel
tuleb isendi rakust keda soovitakse kloonida võtta rakutuum, ning viia see algsesse
munarakku. Edasi viiakse munarakk organismi tagasi ja sünnibki kloonitud loom. Identse genoomiga organismi loomine  ehk tuumkloonimine (reproduktiivne 
kloonimine)  Võetakse tüvirakk, mis on võimeline määramatult paljunema.  Rakust eemaldatakse geneetilist informatsiooni.  Munarakust eemaldatakse rakutuum ja asemele siirdatakse  tüviraku tuum.  Soodustatakse munaraku jagunemist ja kasvamist.  Saadud embrüo siirdatakse emaslooma emakasse.  Arenev organism sünnib tüviraku andja identse koopiana. Millised rakud on totipotentsed, millised pluripotentsed?
Totipotentsus (kõikvõimeline) on raku võime jaguneda ja luua kõiki liigile omaseid
raku tüüpe. Täielikult diferentseerunud rakud on võimelised võtma taas totipotentset
vormi (nt. viljastunud munarakk) Võib kasvada organismiks ja toota ka lootekesta
väliseid kudesid. 
Rakubioloogias   tähendab   pluripotentsus   raku   võimet   diferentseeruda   osaks   ühest
kolmest lootelehest. Saab regenereerida terve organismi.
Raku pluripotentsus on pidev olek, mis algab täielikult pluripotentsete rakkudega, 
mis on võimelised diferentseeruma kõigiks embrüo rakkudeks, nagu 
näiteks embrüonaalsed tüvirakud ja indutseeritud pluripotentsed rakud, lõppedes 
mittetäielikult või osaliselt pluripotentsete rakkudega, mis suudavad muutuda küll 
kõigi kolme lootelehe rakkudeks, kuid millel ei esine kõiki teisi pluripotentsete 
rakkude tunnuseid. Pluripotetne rakk on midagi diferentseerunud ja totipotentsete 
rakkude vahepealne. Sellised rakud on võimelised moonduma ühte tüüpi raku 
erinevateks vormideks, aga mitte millekski totaalselt erinevaks. 
Pluripotentsed tüvirakud ei saa kasvada organismiks, kuid on võimelised 
diferentseeruma rakkudeks, mis on pärit ühest kindlast lootelehest kolme lootelehe seast Nad ei suuda muutuda muudeks rakkudeks kui vererakud.
totipotentne/ tüvirakud /diferentseerunud (töötlemine)
sügoot /pluripotentsed (eksperiment)
Mõned somaatilised rakud mis inimese poolt diferentseerunud rakud võivad omandada 
tüvirakulised omadused. Me kutsume neid pluripotentseteks rakkudeks või indutseeritud 
pluripotentseteks tüvirakkudeks.  Mida kujutavad endast indutseeritud pluripotentsed rakud?
Indutseeritud pluripotentsed tüvirakud on pluripotentsete rakkude tüüp, mis on saadud
mitte pluripotentsete rakkude, vaid täiskasvanud somaatiliste (keharakud) rakkude,
geenide   ja transkriptsioonifaktorite ekspressiooni   mõjutades. Mõjutatavad transkriptsioonifaktorid   mängivad   olulist   rolli   raku   diferentseerituse   määramisel.
Selline   täiskasvanud   (somaatilise)   raku   pluripotentsuse   taastamine   näitab   ka,   et
täiskasvanud somaatilistes rakkudes on olemas sama geneetiline informatsioon, mis
on   olemas   varajastes   embrüonaalsetes   rakkudes.  Rakkude   pluripotentsuse


indutseerimiseks kasutati 2006. aastal hiire fibroblaste ja nelja transkriptsioonifaktorit,
milleks olid: Oct4, Sox2, Klf4 ja c-Myc
Täiskasvanud tüvirakud ehk somaatilised tüvirakud ehk keha tüvirakud on 
diferentseerumata rakud, Milline on Dolly tähtsus bioloogia ajaloos? 1. Tõestati,   et   kõikides   vegetatiivsetes   somaatilistes   rakkudes   säilib   kogu genoom, et areneda uus organism. Dolly kasvatati piimanäärme rakkudest. 2. Tehnoloogilinetähendus– põllumajandusloomad. Nt Hea piimaand. Ristamisel ei pruugi antud tunnus nii jääda, kuna50% on isa genoomist pärinev. Selline
tehnoloogia võimaldab meil saada palju identseid kloone. Suur tehnoloogiline
tähendus põllumajandusloomade puhul. 3.Filosoofiline   tähendus–   tehnoloogiliselt   mehi   ei   ole   vaja.   Nii   saaksid   naised paljundada end ilmameesteta. Dolly ei ole geneetiliselt muundatud organism, temasse ei viidud viidud võõrast DNA järjestust.  Mida kutsutakse terapeutiliseks kloonimiseks?
Protsess, kus munaraku tuum asendatakse doonorraku tuumaga, et saada tüvirakkude
populatsioon,   millel   on   sama   genotüüp   kui   doonorrakul.   Kloonitud   rakke   saab
kasutada selleks, et asendada nendega organismi mittefunktsioneeruvaid rakke. Terapeutiline kloonimine e. “embrüo kloonimine” – tehnoloogia, millega tekitatakse organeid embrüonaalsete tüvirakkude kaudu.  Tüvirakkudest samasuguse DNA-nukleotiidjärjestusega rakkude saamine 
ehk terapeutiline kloonimine (ravikloonimine). Tüvirakud võivad areneda peaaegu igat tüüpi koe rakkudeks. Tüvirakke saadakse 
mõne päeva vanusest embrüost  Eraldatakse tüvirakud ja kultiveeritakse (kasvatatakse ja paljundatakse)  laboratooriumis.  Ravimiseks siirdatakse tüvirakke otse haigesse koesse, kus nad muunduvad  vastava koe rakkudeks ning asendavad kahjustatud rakke. Alternatiivina võib tüvirakkudest vajalikud rakud kasvatada ka laboris enne nende 
organismi siirdamist. Geeniteraapia kasutusalad.
Sellega   on   hea   ravida   monogeenseid   haigusi.   Somaatilise   geeniteraapia   puhul   ei
kandu   muutused   üle   järgmistele   põlvkondadele.   Geeniteraapia   kasutamine
sugurakkudel   kandub   aga   edasi   järgmistele   põlvkondadele.  Peamiselt   töötavad
teadlased   nende   raames   välja   ravi   seni   ravimatutele   või   ebaadekvaatse   raviga
haigustele, nagu kasvajad, südame-veresoonkonna ja pärilikud ühe geeni põhjustatud
haigused.


Ex vivo geeniteraapia. Organismiväline   geeniteraapia.  Patsiendilt   rakkude  eraldamine,  nende   koekultuuris
kasvatamine, nendesse funktsionaalse geeni sisseviimine ning geneetiliselt muudetud
rakkude tagasiviimine samasse organismi.
Võtame organismist rakud ja kasvatame ja transformeerime neid viirusega ja viime
need rakud tagasi organismi. In vivo geeniteraapia. Organismisisene geeniteraapia. Patsienti koos vektoriga viidud geeni konstrukt, kui
patsiendi kromosoomides see geen puudub või on defektne. Viiruse genoomi modifitseeritakse nii et selles oleks modifitseeritav tunnus ja samas  oleks kadunud vastava viiruse avaldumist põhjustavad geenid. Patsient nakatatakse viirusega, st et viirus siseneb rakku ja hakkab replitseeruma ja  nüüd lisaks viirusele toodab organism ka raviks mõeldud geeni. Suur miinus on see et viirus on siiski endiselt patogeen ja asjad võivad minna väga  valesti. Lisaks ei osata veel tagada, et viirus siseneks just sellisesse rakku, kuhu vaja ja ei  rikuks seejuures mõnd elutähtsat geeni ära Millised on geeniteraapias kasutatavad vektorid? 1. Üldiselt pole võimalik geene otse inimese rakkudesse viia, selleks kasutatakse nn   kandjat,   mida   nimetatakse   vektoriks.   Geeniteraapias   jagatakse   vektorid
kaheks:   viirusvektorid   ja   mitteviiruslikud   vektorid.   Viirusvektorid   on
levinuimad, kuna viirustel on võime eri rakke nakatada ning oma geneetiline
materjal rakkudesse viia. Samuti integreerivad mõningad viirused oma DNA
peremeesorganismi raku genoomi. Geeniteraapias kasutatavatelt viirustelt on
eemaldatud haigusi põhjustavad geenid, et nad oleksid võimalikult ohutud.
Samas   peavad   alles   jääma   geenid,   mille   abil   viirus   sisestab   oma   genoomi
peremeesorganismi raku genoomi. Viiruse genoomi sisestatakse geen, millega
soovitakse raviefekti saavutada – näiteks insuliini tootev geen diabeedi korral.
Rakkude nakatamisel sisestab viirus oma genoomi koos uue geeniga sihtmärk-
rakku,   kus   hakatakse   tootma   normaalset   funktsioneerivat   valku,   mis   aitab
haigusega võidelda ja selle tulemusena haigus peatub või isegi taandareneb.


Paljud   geeniteraapia   kliinilised   uuringud   kasutavad   vektorina   peamiselt
adenoviirusi. Retroviirusete kasutamine on aastatega vähenenud nende tõsiste
kõrvaltoimete tõttu. Mitteviiruslike vektorite korral sisestatakse terapeutiline geen rakku füüsilisel
või elektrokeemilisel teel. Võrreldes viiruslike vektoritega on mitteviiruslikud
vektorid  odavamad,  neid   on  lihtsam  toota  ja  need  on  vähem  patogeensed.
Lisaks   võimaldavad   mitteviiruslikud   vektorid   transportida   suuremat   kogust
pärislikkusainet. Mitteviiruslike vektorite populaarsust pärsib nende väiksem
efektiivsus võrreldes viirusvektoritega CRISPR/Cas9 süsteemi bioloogiline funktsioon bakterites.
On prokarüootide DNA-s esinevad lühikesed kordusjärjestused. CRISPR järjestustes
asuvate   viirustelt   või   plasmiididelt   omandatud   lõikude   pealt   transkribeeritakse
sissetungiva   võõr-DNA-ga   komplementaarsed RNAlõigud,   mille   vahendusel
prokarüoodi immuunsüsteem tunneb ära võõr-DNA ning lagundab selle. CRISPR järjestused mängivad olulist rolli bakterite kaitsesüsteemis ning annab aluse
genoomi   editeerimise   tehnoloogiale CRISPR-Cas9   süsteem,   mida   kasutades   on
võimalik erinevatesse organismidesse sisse viia püsivaid geenimodifikatsioone.[
CRISPR/Cas   on prokarüootide immuunsüsteemi   osa,   mis   annab   resistentsuse
mitteomaste   geneetiliste   elementide,   näiteks   plasmiidide   või faagide   suhtes.
RNA lisab vahejärjestusi, mis aitavad Cas valkudel ära tunda ning seejärel lõigata
eksogeense päritoluga DNA-d. Võõr-RNA-d suunavad lõikama Cas valgud. CRISPR/Cas9 süsteemi kasutusalad geenitehnoloogias.
Laboris  on  meil  võimalik   transkribeerida  kindla  järjestusega     RNA-kiidid  mis  on
komplementaarne DNA järjestusega mida tahetakse muuta ja seondada need CAS
kompleksiga. See omakorda seondub DNA-ga lõigates DNA katki. Samuti viiakse
organismi doonor DNA järjestus, millega soovitakse asendada ära lõigatud DNA-d.  Kuidas   DNA   redigeerimise   meetodid   võivad   muuta   tuleviku
molekulaarbioloogiat? 
Selle   tehnoloogia   abil   oleks   tulevikus   võimalik   valesid   geene   ära   parandada   ja
kontrollida   milline   DNA   järjestus   selle   geeni   asemele   läheb.   Selle   kaudu   oleks
võimalik raskeid pärilikke haigusi ravida. See oleks kasulik nt HIV ravis, kui oleks
võimalik kaitsta rakke HIV-ga nakatumise eest ja ka eemaldada integreerunud HIV-d
nakatunud rakkudest. Tänu DNA redigeerimisele on meil olemas oskus kohandada ja muuta geene otse  rakus endas, see võimaldaks meil tulevikus ravida geneetilisi haigusi ilma et 
peaksime riskima viiruste vms kasutamisega.  Ühtlasi aitaks see parandada ja muuta näiteks toidutaimede omadusi (seentelt võeti  ära omadus õhuga kokkupuutel pruuniks minna jms).