BIO- JA GEENITEHNOLOOGIA, EKSAM (0)

Bio- ja geenitehnoloogia eksami kordamisküsimused 1. Mis on rekombinantne DNA tehnoloogia, selle ajalugu, meetodid  ja rakendused. Rekombinantse DNA tehnoloogia on tehnoloogia, mis  võimaldab DNA'd sünteesida ja manipuleerida mittelooduslikul teel. Mikroobe on kasutatud toiduproduktide tootmiseks nagu leib, juust ja alkohol.  Tuhandeid aastaid on kasutatud selektiivset ristamist nii taimede kui  loomade puhul. 20ndal sajandil hakkasid teadlased ära kasutama bakterite  loomulikku ainevahetust tootmaks tööstuslikul skaalal butanooli, atsetooni,  antibiootikume. Tänapäeval on spetsiifilisi geene võimalik eraldada peaaegu  ükskõik millisest doonororganismist (nagu nt inimene, taimed või bakterid)  ning viia (kloneerida) see peaaegu ükskõik millise teise retsipient organismi  genoomi. 1:9-12. 2. Kirjeldage võrdlevalt eu- ja prokarüootset geeni. Prokarüüotsel  puuduvad intronid, DNA rõngaskromosoomina ehk plasmiidina, DNA ei ole  liitunud valkudega, replikatsioon algab vaid ühest puntkist, replikatsioon ja  transkriptsioon kiiremad, kiire paljunemine, iga mutatsioon satub kohe  loodusliku valiku alla, kuna on haploidne kromosoomistik, on RNA, geenide  rekombinatsioon paraseksuaalne, puudub tuum. 3. Mis on intronid ja eksonid ja kus neid esineb? Mittekodeerivad ja  kodeerivad geeniosad. Esineb geenides. 4. Kui palju on looduslikke aminohappeid? 22, kuid 20 on universaalsed. 5. Mis on mutageenid? Mutageenideks nimetatakse mutatsioone  põhjustavaid füüsilisi ning keemilisi mõjureid.1:18. 6. Mis on pöördtranskriptaas ja mida see teeb? 1:19.  Pöördtranskriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse RNA matriitsahelalt  komplementaarne DNA (cDNA) ahel. 7. Mis on cDNA ja kuidas seda toodetakse? 1:20-21. cDNA on  komplimentaarne DNA ahel ning kasutatakse pöördtranskriptaasi mRNA 


maatritsilt komplementaarse cDNA sünteesimiseks. 8. Mis on sünteetilised nukleiinhapped? 1:22-29. Aminohappeid, mis on  sünteesitud arvuti poolt kontrollitava robotiga. Saab kasutada kindlalt valku  tootva geeni sünteesimisel. Kui teada on nii geneetiline kood kui ka  huvipakkuva valgu aminohappeline järjestus on selle info põhjal võimalik  sünteesida seda valku sünteesiv geen. 9. Mis on restriktsiooniensüümid? 1:30-36. Ensüümid, mis lõikavad DNA'd  spetsiifiliselt järjestustest ning neid nim. ka restriktsiooni kohtadeks. Looduses kasutavad  bakterid restriktsiooniensüüme kaitseks neid nakatavate bakteriofaagide  eest. Bakteriofaagi sisenedes bakteri rakku restsiktsiooniensüümid lõikavad  viiruse DNA mittefunktsionaalseteks väikesteks tükkideks ning päästavad  bakteri infektsioonist. 10. Milliseid tüüpe restriktsiooniensüüme te teate ja millised on  nende toimimise mehhanismid? Esimeseks restriktsiooniensüümide  alamtüübi esindajaks on EcoRI, mis lõikab DNA'd kahest ahelast erinevast  positsioonist mille tagajärjel on saadud DNA fragmendil kleepuvad otsad ning need võimaldavad vesiniksideme teket neile komplementaarse järjestusega.  Erinevatest allikatest ja organismidest pärit selliseid DNA fragmente saab  kasutada rekombinantse DNA molekuli loomiseks. Teise alamtüübi  esindajateks on nt HindII ja SmaI (Serratia marcescens), mis lõikavad DNA  läbi mõlemast ahelast täpselt samast kohast mille tagatärjeks on tömbid  DNA otsad. Selliste fragmentide eeliseks see, et kuna nad on  mittespetsiifilised siis võimaldab see üksteisega liita komplimentaarsete  järjestusteta molekule. 11. Kust me leiame restriktsiooniensüüme looduses? Bakterid  kasutavad neid kaitseks bakteriofaagide vastu. 12. Mis on vektorid ja kuidas me neid kasutada saame? 1:37-42.  Geenide rakkudesse viimiseks kasutatakse vektoreid mis on nukleiinhappe  molekulid nagu: viiruste genoomid, transposoonid, plasmiidid, ning 


suuremad vektorid nagu bakteri (BAC) ja pärmi (YAC) tehislikud  kromosoomid. Vektoriks nimetatakse DNA molekuli mida kasutatakse  tehislikult võõra geneetilise materjali ühest rakust teise viimiseks kus seda  geneetilist informatsiooni replitseeritakse ja/või ekspresseeritakse. 13. Mis on vektorite toimimiseks hädavajalikud komponendid?  Kõikidele vektoritele on omane replikatsiooni alguspunkti (origin of  replication (Ori)), multikloneerimiskoha ja selektsioonimarkeri olemasolu.  Samuti peavad nad olema rakus elujõulised ning piisavalt väikesed, et  nendega laboris tööd teha. 14. Mis on YAC ja BAC ja kuidas nad üksteisest erinevad? Pärmi ja  bakteri vektorid. Furthermore, the size of the insert carried by YAC vectors is  100-1000 kb while the size of the insert carried by BAC vectors is 100-200  kb.  YAC sisaldab pärmseente replikatsiooni molekulaarseid komponente,  kuid BAC vektorid sisaldavad bakterite replikatsiooni molekulaarseid  komponente. YAC on valmistatud pärmi kromosoomi spetsiifiliste piirkondade põhjal ning BAC  toodetud F-plasmiidi põhjal. YAC on lineaarne fragment, kuid BAC sirkulaarne. YAC and BAC vectors are two types of artificial vector  systems designed to clone large genomic DNA fragments. They have  multiple applications in the preparation of genomic and cDNA libraries.


  15. Kirjelda kloneerimise protseduuri. Mis on kloneerimiseks  hädavajalikud komponendid ning tingimused? Geeni kloonimine (ingl.  gene cloning) eeldab mitut järjestikust protseduuri, milledeks on uuritava  geeni: 1) isoleerimine; 2) viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi  (plasmiidi või viirusgenoomi); 3) amplifikatsioon ehk paljundamine; 4)  uuritava geeniga rekombinantsete kloonide selektsioon. 16. Mis on geeniraamatukogud? 1:43. Geeniraamatukogu on bakteri või  faagikloonide kogumid millest iga kloon sisaldab meid huvitavast  geneetilisest materjalist ühte konkreetset alamosa. 17. Kirjelda polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimist detailselt 


(komponendid, temperatuurid, aparatuur, metoodika, eesmärk,  tüübid). 2:6-10. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on on tänapäeva  molekulaarbioloogide üks põhilisi meetodeid, mis võimaldab sünteesida suurt hulka identseid DNA molekule in vitro. PCR metoodika väljatöötamine sai  võimalikuks, kui avastati kuumaveeallika bakter, kes suurepäraselt elab ja  paljuneb üle 70-kraadises vees. Tema DNA-polümeraasi kasutatakse PCR- meetodis, mis võimaldab in vitro paljundada ehk amplifitseerida konkreetset, uuritavat DNA fragmenti. See meetod on loodud ülilihtsal põhimõttel:  temperatuuride muutmisel. Selleks on PCR-masin, millesse asetatakse 0,2  ml-sed tuubid DNA-proovidega ja käivitatakse programm, mis automaatselt  kuumutab-jahutab kindlal temperatuuril kindlate ajavahemike järel. (PCR) vajalikud komponendid (joonis 5.2.2.4.):  DNA proov, mida uuritakse;
 DNA-plümeraas, täpsemalt on see kuumaveebakteri nimest tulenev  Taq-polümeraas;  Nukleotiidid – A, G, C, T, mida läheb DNA molekuli sünteesiks vaja;
 2 praimerit (tavaliselt 15–25 nukleotiidi pikkused DNA lõigud ), millest  üks on komplementaarne  uuritava DNA-lõigu ühe otsaga ja teine on  komplementaarne teise otsaga;  puhverlahus, mis on keskkonnaks. PCR ETAPID 1) tuubis oleva dna denatureerimine. Temperatuur tõstetakse 90–95 °C  juurde, mille käigus DNA biheeliks laguneb kaheks üksikahelaks -  denatureerub. 2) Praimerite seondumine DNA ahelatega. Temperatuur langetatakse 50–70 °C  juurde. 3) DNA süntees. Temperatuur tõstetakse 72 °C juurde, mis on Taq-polümeraasi  „töötemperatuur“. Polümeraas saab alustada DNA sünteesi ainult praimerite  vabast 3’ otsast ja seetõttu liikuda sünteesiga ainult ühes suunas.  Tulemusena tekib mõlemale DNA üksikahelale komplementaarne ahel. 4) Eelpoolmainitud etappe (tsükleid) korratakse 20–30 korda, et amplifitseerida  piisav arv DNA molekule.


18. Millist polümeraasi kasutatakse PCR protseduuril ja miks?  Mikroorganismist Thermus aquaticus pärit DNA Taq polümeraasi, kuna see  on kuumale vastupidav ning ei denatureeri 94º C juures. 19. Mis on praimerid? 15-25 nukleotiidi pikkused komplementaarsed  oligonukleotiidid, mida kasutatakse PCR-is. Praimer on lühike (tavaliselt  umbes kümme aluspaari pikkune) nukleiinhappe lõik, mis on DNA  replikatsiooni alguskohaks. 20. Kes töötas välja PCR meetodi? 2:2-3. PCR meetodi leiutas 1983 Kary  Mullis. 21. Mis on geel-elektroforees ja milleks seda kasutatakse? 2:11-15.  Elektroforees on meetod mis võimaldab eri tüüpi molekule üksteisest  lahutada järgnevate karakteristikute järgi: elektriline laeng, suurus, kuju.  Geel-elektroforeesi kasutatakse DNA molekulide isoleerimiseks. Geeliks  kasutatakse agarist puhastatud suhkrut agaroosi. Agaroosil on poorjas  struktuur mis takistab DNA fragmentide vaba liikumist ja seega lahutab DNA  fragmendid vastavalt nende suurusele, st väiksemad molekulid liiguvad  kiiremini ja jõuavad kaugemale kui suuremad. Pärast geel eletroforeesi  kasutamist saab dna fragmente: PCR-iga paljundamine, kloneerimine  vektoritesse, geeni-raamatukogus säilitamine, mikrokiibi analüüs,  järjestamine ehk sekveneerimine 22. Mis on Southern, Western, Northern, Eastern Blot ja Dotplot?  Milleks neid kasutatakse ja millised on meetodite erinevused? Ühe  molekuliga tuvastatakse teist, molekul kantakse üle kandjale. Southern DNA geenivariandi tuvastamine ja pikkuse määramine. Western spetsiifiliste  valkude tuvastamine kompleksproovides. Northern kindla RNA järjestuse  tuvastamiseks kompleksproovides. Eastern kindlate posttranslatsiooniliste  valkudes aset leidnud muutuste leidmiseks. Dotbloti saab kasutada kõikide  eelmiste tuvastamiseks, ainult et analüüt pannakse otse kandjale ja ilmub  nähtavale täpina. 23. Millised mikrokiipe te teate ning kuidas toimub vastav  protseduurika? Millised on vastava analüüsi jaoks kriitilised 


komponendid ja parameetrid? 3:3-22. Et patsiendi haiguse geneetilist  põhjust kindlaks määrata, on välja töötatud DNA-mikrokiiptehnoloogia.  Mikrokiip on väike silikoon- või klaasplaat vm, mille pinnal on kindla mustrina suur hulk sünteetilisi oligonukleotiidseid või cDNA-proove, mida saab  hübridiseerida uuritava DNA-ga. Kiibile saab kanda üle 300 000 markeri.  Patsiendi DNA proovid kantakse kiibile ja võrdluse tulemust saab kasutada  haiguste diagnoosiks. Seda küll juhul kui teatakse haigust põhjustavaid  geenimuutusi. 24. Mis on geeniontoloogiad - Gene Ontology? 4:27. Geeniontoloogia on projekt, mille ülesandeks on geenide ja nende funktsioonidega seotud  mõistete struktuuri arendamine. 25. Mis on GO andmebaas ja mis on selle koostamise eesmärk? 4:27.  Geeniproduktide iseloomustamine. Ontoloogiate eesmärk on geenide rollide  ja toimimispiirkondade standardiseerimine organismist sõltumatult.  Andmebaasides kirjeldatakse geeniprodukte nendega seotud liigist  sõltumatute terminitega. 26. Mis on GO sõnavarad ja nende koostamise eesmärk ning kuidas  neid kasutatakse? 4:29-30. GO projekt on välja töötanud kolm  struktureeritud ja kontrollitud sõnavara (ontoloogiat) mis kirjeldavad  geeniprodukte neid iseloomustava: bioloogilise protsessi, rakulise  komponendi, molekulaarse funktsiooni nomenklatuuri abil liigist sõltumatul  moel. Go projekti iseloomustab ontoloogiate arendus ning hooldus ja  tarkvaraarendus (võimaldab ontoloogiate loomist, hooldamist ja kasutamist) 27. Mis on järjestamine? 4:3. DNA sekveneerimine e. järjendamine  tähendab protsessi, mille käigus selgitatakse DNA nukleotiidne järjestus. 28. Milliseid molekule saab sekveneerida? DNA, RNA, valgud. 29. Kirjeldage tähtsamaid sekveneerimise ajalooga seotud  verstaposte. Mis oli nende avastuste ja tehnoloogiate tähtsus? 4:6- 10, 4:14. 


 1951. aastal tegi Frederick Sanger kindlaks veise insuliini  aminohappelise järjestuse. Esimene sekveneeritud molekul oli seega  valk!  1953. aastal avaldasid James D. Watson ja Francis Crick artikli DNA  kaksikheeliksmudeli kohta.   Sek.  meetodi looja oli 1977.aastal Frederick Sanger  1990. aastal alustati projektiga sekveneerimaks inimese genoomi
 2001. aastal avaldasid nii Human Genome Project kui ka Celera inimese  esialgsed genoomide järjestused 30. Mille poolest on oluline Human Genome Project – inimese  genoomi sekveneerimisprojekt? 4:8-9. See projekt loodi aastal 1990  eesmärgiga kaardistada kogu inimese pärilikkuse materjal ehk genoom, st  tuvastada DNA molekuli primaarse struktuuri nukleotiidne järjestus  sekveneerimismeetodil.Sekveneerimise kaudu on võimalik uurida geenide  funktsiooni.Geeni funktsiooni teadmine on oluline, kuna see sisaldab  informatsiooni pärilikkuse kohta. Inimese terve nukleotiidilise järjestuse  teadmine annaks võimaluse leida haiguse tekkes osalevaid geene ning  õppida paremini tundma haiguste tekkemehhanisme. Hõlbustaks ja  täpsustaks haiguste diagnoosimist ning seeläbi tõstaks meditsiini kvaliteeti. Millised olid projekti väljakutsed ning läbimurded ja kuidas on see  kujundanud kaasaegse genoomika arengut?  31. Kirjeldage klassikalist Sangeri sekveneerimise protseduuri. 4:11- 13 Ahela terminatsiooni meetod vajab üheahelalist DNAd, DNA praimerit, 
polümeraasi, vastavaid desoksüribonukleotiidtrifosfaate (dNTP) ja modifitseeritud  nukleotiide (didesoksüNTP-d e. ddNTP), millel puuduvad sünteesi jätkamiseks  vajalikud 3’-OH rühmad. Kõigepealt liituvad DNA praimerid DNA maatriksmolekuliga  täpselt samast kohast, siis seondub sinna DNA polümeraas. Piisava koguse  algmaterjali ja reaktsioonikemikaalide korral toimub süntees samaaegselt paljudelt  DNA molekulidelt ja reaktsioonianumas tekib igas pikkuses fragmente.  Igas  reaktsioonisegus on madalas kontsentratsioonis ka üks terminaatornukleotiid, mis  lõpetab DNA-fragmendi sünteesi kas A-, G-, C- või T-terminaatoriga. Ahela  terminaatoritena kasutatakse enamasti ddTNP-sid, kus puuduvad 3-OH rühmad.


32. Kirjeldage pürosekveneerimise protseduuri. 4:15-22. DNA mass- sekveneerimise meetod, kus erinevalt Sangeri didesoksüribonukleotiididega  DNA-ahela sünteesi terminatsioonist kasutatakse sünteesiga järjestamist,  mispuhul detekteeritakse nukleotiidide lülitamisel toimuvat pürofosfaadi  vabanemist. 33. Kirjeldage Illumina sekveneerimise protseduuri. 4:23. 5:5-10. 
Kiibil on nukleotiidid ja DNA polümeraas. Need nukleotiidid on fluorestsentsiga  märgistatud, kus teatud värv vastab alusele. Neil on ka terminaator, nii et lisatakse  ainult üks nukleotiid korraga. Kiipidest tehakse pilt. Igas lugemiskohas on  fluorestsentssignaal, mis näitab lisatud nukleotiidi. Seejärel valmistatakse kiip ette  järgmiseks tsükliks. Terminaatorid eemaldatakse, et saaks lisada järgmist nukleotiidi ja fluorestseeruv signaal eemaldatakse, takistades sellega järgmise pildi saastamist. Protsessi korratakse, lisades korraga üks nukleotiid ja igat nukleotiidi pildistatakse  eraldi. Seejärel kasutatakse arvutit nukleotiidide asukoha tuvastamiseks igas pildis,  et konstrueerida nukleotiidide jada. Kõikide readide järjestused on sama pikkusega.  Readide pikkus sõltub sooritatud tsüklite arvust. 34. Mis on 16S sekveneerimine ja milleks seda kasutatakse?  https://www.youtube.com/watch?v=3UHiveJ1jzM 35. Kirjeldage Oxford Nanopore sekveneerimise protseduuri.  https://nanoporetech.com/how-it-works 36. Kirjeldage Ion Torrent sekveneerimise protseduuri. 5:25-29. on  DNA sekveneerimise meetod, mis põhineb DNA polümerisatsiooni käigus  vabanevate vesinikioonide tuvastamisel. See on meetod "sünteesi teel  sekveneerimiseks", mille käigus komplementaarne ahel on konstrueeritud  matriitsi ahela järjestuse alusel. 37. Kirjeldage Nanopore sekveneerimise protseduuri. 5:30-34. MinION ™ seade on väike instrument, mis ühenadatakse otse sülearvutisse või lauaarvutisse USB kaudu.  See on iseseisev seade tarnimiseks reaalajas eksperimentaalseid andmeid. Ionivool juhitakse läbi  nanopoori, tekitades pinge üle selle membraani. Selle voolu mõõtmine võimaldab kindlaks  määrata, mis molekuliga on tegu. 38. Kui suur on inimese genoom? Umbes 20 000 geeni, millest 5%  kodeeriv, 3,2 miljardit aluspaari, 23 kromosoomi paari.


39. Kui suur on neardertaallase genoom ja kui palju see inimese  omast erineb? 99,7% on identne meie omaga. Erinesid sellised geenid  nagu RPTN (kaltsiumi siduv geen epidermis), SPAG17, CAN15, TTF1, FOXP2  (geen, mis vastutab kõnevõime arengu eest, samas neandertallastel leiti  mingeid mutatsioone sellest) ja PCD16. N. mtDNA erineb meie omast 202 bp. 40. Kes juhtis neandertaallaste genoomi sekveneerimise projekti?  Rootsi teadlane Svante Pääbo. 41. Kui kaua kestis inimese genoomi sekveneerimise projekt ning  kes olid selles osalised? Kirjelda asjaolusid ja osalisi täpselt. 2006-2009, algatas 454 Life  Sciences (Conneticut), rahvusvaheline tiim. Max Plancki Instituut (Leipzig,  nemad rahastasid), mida juhtis Pääbo, veel olid Johannes Krause, Adrian  Briggs, Richard E. Green. Koostöö Life Sciences’iga (presidendiks oli tollal  Michael Egholm). 2006 avaldasid esimesed miljon aluspaari. Uurisid kolme  Horvaatiast leitud fossiili, kasutati 454 sekveneerimist ja ja ka Solexat.  Testisid lisaks nendele fossiilidele ka teisi, et kontrollida, kas teistel  neandertaallastel samalaadne järjestus. 42. Mis on korduselementide funktsioonid genoomides? Nende  funktsiooni ei teata, nimetatakse rämps DNA-ks. 43. Mis on SINE ja LINE? Kordusjärjestused (Short/Long Interspersed  Nuclear Repeats), esimene 100-300 bp (13% meie genoomist), teine 6000- 8000 (21%). 44. Mis on SNP-d, nende tüübid ja tähtsus? Detailsed kirjeldused.  Single Nucleotide Ploymorphysm – 1 1400 nukleotiidist on erinev indiviididel.  Asukoha järgi on mittekodeerivas regioonis, kodeerivas regioonis:  sünonüümsed ehk vaikivad, mittesünonüümsed: missense ja nonsense. SNP- d esinevad keskmisel iga 100-300 nukleotiidi järel. Ei ole organismile  kahjulikud, kuna ei põhjusta aminohapete mutatsioone. Kasutatakse  biomarkeritena.geneetilises kaardistamises, populatsioonigeneetikas.  Praeguseks teada 9 miljonit erinevat SNP-d. 45. Mis ORF ja kuidas seda kindlaks määrata saab? Open Reading 


Frame jaotab nukleotiidid triplettideks, algab ATG alguskoodoniga alati, 5’  otsast 3’ otsani. Saab määrata nende piirkondade järgi, mis sarnanevad juba  teadaolevate lookustega või DNA järjestuse omaduste põhjal geenide  tuvastamisega (nt bakteritega see lihtne, kuna neil puuduvad intronid) splice signaalidega, nt keskmistel ja algus eksonitel v intronitel puuduvad  lõppkoodon, keskmisel eksonil algab peale AG-d ja signaal lõpeb enne GT-d.  Algusekson lõpeb enne GT-d, algab promootoriga. Viimane ekson lõpeb  stoppkoodoniga, millele järgneb veel polüadenooli signaal. 46. Millised on inimese genoomis leiduvad kordusjärjestused?  Kirjeldage neid detailselt. SINE, LINE, transposoonid, retroposeerunud  pseudogeenid, mini- ja mikrosatelliidid, tandeemsed järjestused (nt ATTCG  ATTCG ATTCG) , intronid keskmiselt 2000 bp. 47. Millised on kõige olulisemad mudelorganismid mida  molekulaarbioloogiliste uurimistööde läbiviimisel kasutatakse  (nimeta vähemalt 5 eesti- ja ladinakeelset nimetust)? Pärm  Saccharomyces Cerevisiae, varbuss Caenorhabditis elegans, kolibakter  Escherichia coli, puuviljakärbes Drosophila melanogaster, koduhiir Mus  musculus.   48. Millised on teadaolevalt suurimad ja väikseimad genoomid?  Varem oli suurim teadaolev marmorjal (?) kopskalal (133 miljardit bp), nüüd  aga protist Polychaos dubium (670 mld bp). Taimeviirus rice yellow mottle  virus satellite (220 bp) väikseim. 49. Mis on antikeha? Antikehad on immuunsüsteemi efektiivsed tööriistad  kahjustavate haigustekitajate ja võõrühendite spetsiifiliste struktuuride  äratundmisel ja eemaldamisel. Antikehad on B lümfotsüütide ehk B  rakkude poolt produtseeritud glükoproteiinid, mis tunnevad ära antigeene,  mitmekesise struktuuriga makromolekule (peamiselt valke, polüsahhariide,  vähem lipiide), mis enamasti on kehavõõrad. 50. Milline on antikehade struktuur ja selle erinevate osade  funktsioonid? Detailsed kirjeldused. Antikeha molekul (molekulmass 150


kDa) koosneb kahest identsest raskest (H) ja kergest (L) polüpeptiidahelast,  mis on omavahel seotud disulfiidsidemetega, nii et tekib kaks H L paari.  Antikeha ahelad koosnevad sarnase struktuuriga korduvatest regioonidest e.  Ig domeenidest. Ig domeenid on umbes 110 aminohapet pikad ja  moodustavad iseloomuliku globulaarse β silindri struktuuri. Nii antikeha  raskel kui kergel ahelal on üks varieeruv domeen (Vh ,Vl), konstantseid  domeene on kergel ahelal üks (Cl), raskel ahelal kolm või neli (Ch3-4),  moodustades antikeha konstantse osa. Vt hüpervarieeruva ala küssi. 51. Mis saavutatakse organismide puhul knock-out, knock-in ja  knock-down tehnoloogiate abil? Kirjeldage vastavaid mehhanisme?  Knock-outiga eemaldatakse geen, et välja selgitada geeni funktsioon,  knock-iniga lisatakse/asendatakse (transgeensed loomad) ja knock- downiga vähendatakse geeni funktsiooni ning see on pööratav protsess.  Knock-in tehakse homoloogse rekombinatsiooni või YAC/BAC meetodiga  (Sophie Imbeulti loeng slaid 5). 52. Millised on inimese antikehade klassid? Detailsed kirjeldused.   Viis klassi: IgM, G, D, A ja E. IgG sagedaseim. Vt loeng 04.04 slaid 8 ja 9  struktuure. 53. Mis on antikehade hüpervarieeruvate alade funktsioonid?  Paiknevad Vh (hard) ja Vl (light) domeenis, nende alade aminohappeline  erineb enim antikehade vahel, osalevad seondumisel antigeeniga. On  antikehade mitmekesisuse aluseks, ligikaudu 110 aminohappe pikkused. 54. Mis on monoklonaalsed antikehad ja kuidas neid eri tüüpideks  eristatakse? Tooge välja nimetused ja päriotolu erinevused. Monokloonsed on pärit ühe B-raku  järglaskonnast ja seega identsed. Katselooma, kimäärsed, humaniseeritud ja  inimese omad, eristatakse päritolu järgi. Loeng 04.04 slaid 15. Kasvajaraku ja B-lümfotsüüdi hübriidimisel saadakse sellised hübriidsed immortaliseeritud  rakukloonid, mis on in vitro tingimustes võimelised tootma vaid üht kindlat  tüüpi antikeha, mis on ülimalt spetsiifiline mingi kindla aine suhtes ja mis  seondub vaid ühe epitoobiga – sellega, mille vastu ta on saadud. Seda osa, 


mis antigeeni molekulist on oluline antikeha seondumiseks, nimetatakse  epitoobiks. 55. Mis on backcrossing? Analüüsiv ristamine  - analüüsitava  dominants(et)e tunnus(t)ega isendi tagasiristamine retsessiivse vanemaga.  Kui analüüsitav organism on homosügootne, siis lahknemist ei toimu, kui  heterosügootne, siis saame ühesugused geno- kui ka fenotüübiilised  lahknemissuhted (1:1). 56. Mis on hübridoomi meetod ning milleks seda kasutatakse?  Detailsed kirjeldused. Töötati välja 1975. Selleks liitsid teadlased hiire  kasvajalised müeloomirakud (B rakuline kasvaja), millel on võime piiramatult  jaguneda, immuniseeritud hiire põrnarakkudega, mille hulgas on  immuniseerimisel kasutatud antigeeni vastaseid antikehi tootvad B rakud.  Ainult tekkinud hübriidsed rakud e. hübridoomid suudavad kasvada  selektiivsel söötmel ning neil säilivad vanemrakkude kasulikud omadused  võime piiramatult jaguneda ja samas toota kindlate omaduste ja  spetsiifilisusega antikehi ehk monokloonseid antikehi. Soovitud spetsiifikaga  antikehi produtseerivad hübridoomide kloonid on võimalik isoleerida ning  kasvatada rakukultuuris antikehade tootmiseks. Kasutatakse haiguste raviks, kuid ei olnud eriti edukas, sest esiteks ei käivitanud hiire antikehad inimese  Fc retseptorite ja komplemendivalkudega seotud efektormehhanisme, samuti oli antikehade poolväärtusaeg lühike. Teiseks, inimestel tekkis hiire  antikehade vastane immuunvastus (HAMA - human anti mouse antibody),  mis vähendas terapeutiliste antikehade toimet veelgi ja võis olla seotud  kahjulike kõrvaltoimetega. 57. Mis on geenikandlustest ja milleks see vajalik on? Carrier test  ehk geenidefekti kandluse test aitab välja selgitada, kas mutatsioon  kandub edasi järglasele. 58. Mis on IVF ja ICSI? IVF – in vitro fertilization on katseklaasis 4-6  munaraku viljastamine seemnerakkudega, lastakse embrüotel areneda nädal aega ning valitakse välja 1-3, mis siirdatakse emakaõõnde. ICSI –  intracytoplasmic sperm injection on seemneraku süstimine munarakku 


katseklaasis, mehepoolse viljatuse korral, üks IVF protseduure. 59. Millal ja miks langeb naiste ning meest viljakus? Stress, keskkond,  vanus, geneetika, suguhaigused, toit, ebakorrapärane öö-päeva rütm,  suitsetamine, alkohol, kohv. Meestel oluline testiste temperatuur, tänapäeval liiga kõrge, kuna tehakse kitsast aluspesu. Raske füüsiline töö, kodukeemia  nt PCB. 60. Mis on ekstratsellulaarsed vesiikulid – kui suured, kuidas  jaotatakse ja milleks neid kasutada saab? Detailsed seletused.  Fosfolipiidse kaksikmembraaniga ümbritsetud osakesed suurusvahemikus 50 nm – 1 mikrom, mida eritavad rakud.  Jagunevad suuruse järgi suurteks  (>200 nm sEVs) ja väikesteks (<100/200 nm m/l EVs). Kasutatakse haiguste  varaseks diagnoosimiseks, koe taastamiseks, tahetakse teha ka vaktsiine,  prenataalses diagnostikas, kosmeetikatööstuses, haiguste ravis (ravimi  kohale viimine sihtrakku). 61. Milline on eksosoomide päritolu? Pärit rakust, rakumembraani  sisesopistumine, endosoom, ESCRT valkude sorteerimine, MVB  (multivescular body) ehk nn hiline endosoom, 2 rada: lüsosoomi minek  lagundamiseks või eksotsütoos. 62. Mis on nn liquid biopsy ahk vedelbiopsia? Vedelate bioloogiliste  proovide analüüsimine, peamiselt vere. Kasutatakse haiguste  monitoorimiseks ja diagnoosimiseks, on mitteinvasiivne, seega saab teha  tihedamini. Saab vaadelda ka vähiravimi mõju ja kasutada peale haiguse  taandumist patsiendi jälgimiseks. 63. Mis on ELISA – meetodi põhimõte ja milleks seda kasutatakse (2  näidet)? Immunoensüümmeetod, mida kasutatakse selektiivsete valkude  tuvastamiseks ja kvanitatiivseks iseloomustamiseks määramispiiriga alla 1  nanogrammi. On mugav ja kiire, kasutab sihtmärkide tuvastamiseks antikehi  ja värvimuutust. ELISA toimib spektrofotomeetrilise meetodina tänu  ensüümidele, mis katalüüsivad substraadist värvilise produkti teket. Ensüüm  on kovalentselt seotud antikehaga, mis tuvastab spetsiifiliselt huvipakkuva  antigeeni. Antigeeni olemasolu korral seostub sellega antikeha-ensüüm 


kompleks. Signaal tekib, kui uuritav lahus sisaldab antigeeni. Tavaliselt on  signaaliks värvimuutus. Juhul, kui lahus ei sisalda antigeeni, ensüümi- antikeha kompleks pinnale ei seondu ning substraadi lisamisega signaali ei  kaasne. ELISA katse läbi viimiseks peab vähemalt üks antikeha olema  spetsiifiline konkreetse antigeeni suhtes. Teadmata hulgal antigeeni sisaldav  proov immuniseeritakse tahkele pinnale kas mittespetsiifiliselt (adsorptsioon) või spetsiifiliselt (kihiline ELISA). Pärast antigeeni immuniseerimist lisatakse  tuvastusantikeha, mis moodustab antigeeniga kompleksi. Tuvastusantikeha  võib kovalentselt seonduda ensüümiga. Teise võimalusena võib  tuvastusantikeha tuvastada sekundaarse antikehaga, mis on seotud  ensüümiga biokonjugatsiooni abil. Iga etapi vahel pestakse üldjuhul plaat  pesulahusega, et eemaldada valgud või antikehad, mis pole spetsiifiliselt  seondunud. Pärast viimast pesu lisatakse substraat nähtava signaali  saamiseks, mis näitab antigeeni kogust proovis. ELISA on heterogeenne  meetod, mis immobiliseerib analüüdi lahusest tahkele faasile ehk pinnale.  Proovilahus lisatakse eriliste sidumisomadustega statsionaarsele faasile.  Üksteise järel lisatakse mitmed reagendilahused, inkubeeritakse ja pestakse.  Sellele järgneb lõpplahuse värvimuutus, millest mõõdetakse analüüdi hulka.  Kvalitatiivne lugemine põhineb tavaliselt valguse intensiivsuse mõõtmisel  spektrofotomeetriga. Tuvastamise intensiivsus sõltub signaali võimendusest  analüütilise reaktsiooni vältel. Kuna ensüümireaktsioonid on väga hästi  tuntud võimendusprotsessidena, tekitatakse signaal ensüümidega, mis on  seotud tuvastusantikehade külge kindlates kogustes, et võimaldada täpne  kvantitatiivne määramine. Kasutatakse haiguste diagnostikas, oli esimene  laialdasem HIV tuvastusmeetod, rotaviirus väljaheidetes, malaaria.  Toiduallergeenide tuvastamine toidutööstuses. Saab tuvastada kiirelt ka  teatud narkootikume. 64. Mis on fagemiidid ja milleks neid kasutatakse? Kloonimisvektor,  mis sisaldab nii faagi kromosoomist kui ka plasmiidist pärit komponente.  Kasutatakse antikeha-raamatukogu faagikuva meetodis. 65. Mis on faagikuva? Varaseim ja enim kasutatud meetod antikehade 


selekteerimiseks raamatukogudest, kus antikeha fragmendid kuvatakse  filamentse bakteriofaagi pinnal pinnavalgu p3 koostises. Võeti kasutusele  90ndatel. 66. Mis on terapeutilised antikehad ja kuidas neid jaotatakse?  Detailsed kirjeldused. Terapeutilised antikehad on immunoglobuliinid või  nende fragmendid, mida kasutatakse haiguste raviks. Mono- ja  polükloonsed lähtuvalt päritolust. Monokloonsed: pärit ühe B-raku  järglaskonnast ja seega identsed ja kindla seondumisspetsiifikaga, jagunevad omakorda neljaks kodeerivate geenide päritolu põhjal (katselooma,  kimäärsed, inimese ja humaniseeritud, vt 04.04 slaid 15). 67. Mis on biopannimine? Biopannimine ehk ristamine on antikeha- raamatukogu faagikuva kolmandas etapis kasutatav protsess, kus faagid  valitakse välja märklaud antigeenide suhtes, seondunud faagid elueeritakse  (keemias kasutatav protseduur, mille korral rakendatakse täidiskolonnis  toimuvaid sorptsiooni ja desorptsiooni protsesse kasutades eluendi (gaas,  vedelik) kolonni täidisest läbivoolutamist. Eesmärgiks võib olla ainete  puhastamine või kuivatamine (adsorptsiooni- ja absorptsioonikolonnis),  ainete segu lahutamine (kromatograafilises kolonnis) või kolonni täidise  regenereerimine), paljundatakse bakterites ja korratakse 2-4 korda, kuni  saadakse ainult antigeeniga seonduvad faagid. 68. Mis on optimeeritud efektorfunktsioonidega terapeutilised  antikehad? Antikehad, mille Fc regiooni on modifitseeritud lisaks  seondumisomadustele, suurendab või vähendab efektorfunktsioone nt  fagotsütoosi, ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity), CDC  (complement-dependent cytotoxicity), peamised muutused on Fc regiooni  glükosüülimine või aminohapete asendusmutatsioonid. Nimetatakse ka  bioparemateks ehk biosuperior antikehadeks. 69. Millega tegeleb meditsiinigeneetika? Pärilike sündroomide diagnoosi  ja raviplaani koostamise ning haldamisega. 70. Mis on autosoomne dominantne pärandumine (näited)?  Esinemisrisk 50% nii poistel kui ka tüdrukutel võrdselt, üks muteerunud 


geenikoopia, varieeruva penetrantsusega. Haigus avaldub igas põlvkonnas.  Nt Marfani sündroom, perekondlik pärasoolevähk, Huntingtoni tõbi. 71. Mis on penetrantsus? Sagedus (%), millega mingi konkreetne  genotüüp avaldub selle kandjate fenotüübis. Tavaliselt kasutatakse seda  mõistet mingi dominantse mutantse alleeli avaldumissageduse hinnanguna  heterosügootide hulgas. Täieliku penetrantsuse korral avaldub kõigil  heterosügootidel vastav mutantne tunnus (puue, haigus), mittetäieliku (e.  osalise) penetrantsuse puhul aga ainult teatud osal (nt. 90%) vastava  genotüübiga indiviididest. Penetrantsus sõltub nii genotüübilisest taustast  (nn. modifikaatorgeenidest) kui ka keskkonnatingimustest, milles indiviidid  arenevad ja elavad. 72. Mis on autosoomne retsessiivne pärandumine (näited)? Haigus  esineb 25% järglastest ja 50% on kandjad, mõlemad vanemad kannavad  sama geenimutatsiooni. Mõlemal sool võrdselt. Nt tsüstiline fibroos,  sirprakuline aneemia, fenüülketonuuria. Haiguse avaldumiseks peab olema  mõlemas geeni alleelis mutatsioon, kuna tegu on retsessiivse  pärandumisega. 73. Mis on X-seoseline pärandumine (näited)? Haigestuvad peamiselt  pojad ja kandub edasi emaliini pidi tavaliselt, pojal 50% risk olla haigestunud  ja tütardel 50% tõenäosus olla kandjad. Haigusi teada umbes 500 nt  daltonism, hemofiilia. Haige mees saab geeni edasi anda tütardele, kuid  pojad ei saa olla kandjad, kuna mehed on hemisügoodid st neil ainult üks X  kromosoom. 74. Mis on mitokondriaalne pärandumine (näited)? MtDNA  pärandumine nii meestele kui ka naistele. Emaliini pidi, kõigil kandjast ema  lastel esineb mutatsioon. Täpsemalt tingitud mitokondri hingamisahela  defektidest ja on seotud muteerunud mitokondrite arvuga. Nt MELAS,  müopaatia, Leberi päritav optiline neuropaatia, Pearsoni luuüdi-pankrease  sündroom. 75. Mis on multifaktoriaalne pärandumine (näited)? Haiguse 


avaldumist mõjutavad nii keskkond kui ka geneetilised tegurid nt  intelligentsus, pikkus, kaal. Laktoositalumatus.