Geenitehnoloogia kokkuvõte (0)

Geenitehnoloogia
Insenergeneetika – DNA valitud lõikude eraldamine,töötlemine in vitro ja siiramine kromosoomi,plastiidi või viirusesse.
Eelduseks rekombinantse DNA loomine so. DNA molekul ,mis koosneb eri liigi DNA juppide ühendusest.(1970)
restiktaasid – bakterites leiduvad ensüümid mis tagavad neile nn „immuunsuse“ viiruste vastu lõigates nende DNA juppideks.

• Bakterid omavad võõra DNA vastu nn R/M süsteemi
  
• toimub kahe ensüümi koostöö : restriktaas(R) mis lõikab DNA tükkideks ja metüültransferaan(M) mis metüleerib ära oma DNA ja kaitseb seega oma DNA-d lõhkumise eest.
  
• Restriktaasid tunnevad ära teatud järjestusega nukleotiidi paarid (4-8)DNA-s
  
• teada erinevaid restriktaase üle 3500
  
• vastavalt restriktaasi toimele lõigatakse DNA lahti kas lõikuvalt või tömbilt.
  

Kahe DNA kleepuvate otste liitumine toimub komplementaarsus printsiipide alusel ja ahelate aheald liituvad omakorda ligaasi abil.
Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ( nukleotiidsed järjestused mis ei määravalgu ehitust) ja eksonid . (sisaldavad aminohapete järjekorra informatsiooni)

• pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA, mille alusel sünteesitakse valk.
  
• Kui me tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA. - õnneks o avastatud pöördtranskriptaas (revertaas) , mis selle töö ära teeb
  
• nüüd teeb bakter sama valku mis see geen inimese rakuski teeb
  
• DNA-lt toodeti RNA-d, RNA-st lõigati välja intronid.
  

Organisme kelle genotüüpi on muudetud nim. GMO-ks( geneetiliselt muundatud organism)
GMO-sid on 2. tüüpi

organismid kellesse on viidud võõra liigi geene – transgeensed org.

Organismid kelle geen on rikutud nii ,et ta ei avaldu ja muutus pärandub edasi- nokautorganism
kuidas saab geene kohalt viia?
Transgeensete organismide puhul

• bakteri plastiididega
  
• viirusega
  
• kullapüstoliga
  
• taimedesse agrobakteriga( kasvajat tekitav bakter taimel)
  

Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud. Näiteks kasutatakse GFP( helendav ) geeni markerina. Seda saadakse süvavee meduusidest.
Kui uuritava geeni lõppu , enne stoppkoodonit on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne ,kui ka GFP -valk on valmis
Bakterid toodavad inimese valke alates 1978. aastast

• esimene oli insuliin
  
• Inimese kasvuhormoon
  
• erütropoietsiin aneemia raviks
  
• interferoon , mis reguleerib immuunsüsteemi
  
• vere hüübimisfaktorid
  
• Difteeria ja teetanuse vaktsiin
  
• pärmiseened teevad b-hepatiidi vaktsiini
  
• putukarakud toodavad papilloomi vaksiini
  

Transgeensed loomad
Esimenetransgeene hiir saadi 1981.a.- roti kasvuhormooniga kasvas 2x suuremaks
Neoon kalad( meduusi geenidega)
tartus planeeritakse luua lehm ,kes toodab insuliini( Sulev Kõks ja Ülle Jaakmaa)
transgeensete suurimetajate saamine keerukas:

• munaraku kahjustumine - tänapäeval viiakse üha enam geene in vitro embrüonaalsese tüvirakku. Need omakorda uude varajasse embrüosse
  
• embrüosiirdamine ei ole sageli edukas
  
• ei ole olemas geenivektorit, mis integeeruks alati vajalikus kohas( kahjustab olemasolevaid geene)
  
• siiratav geen vajab veel koespetsiifilist promootorit, et ta hakkaks tööle õiges kohas ja ajas
  
• väga suur katsete arv! - võib mõjutada katsealuste elukvaliteti
  

ravimeid tootvad loomad

• GM- kitse piimas antikehad kasvajate vastu
  
• GM-lehma piimas laktoalbimiin enneaegsetele lastele
  
• GM-sead toodavad inimese hemoglobiini
  

loomade tõuaretus

• sigade ja lammaste kaal kasvas 30%
  
• kalkunite munevus kasvas
  
• lihaloomad kelle tailiha ja rasva osakaal on täpselt määratud
  
• forell jt kalad kasvasid 2x suuremaks
  

transgeensed taimed
eesmärgid:

• parandada saaduste kvaliteeti
  
• suurendada vastupidavust haiguste ja kahjurputukate suhtes(pestiidiresistentsus)
  
• tõsta taluvust umbrohutõrje kemikaalide (herbitsiidiresintentus) vastu
  
• tõsta taluvust karmide keskkonnategurite vastu
  

Saamine seotud meristeempaljundusega

• agrobakter -elab mullas ja põhjustab taimede kasvajalikke muutusi , viies osa oma DNA-st taimerakku
  

taime meristeemkude viiakse söötmele

lisatakse GMO bakter

rakkude ühinemine ja muudetud DNA viimine meristeemrakkudesse

transgeensete võrsete eemaldamine uuele söötmele

juurdumine

taimede istutamine kasvuhoonesse
DNA püssi kasutamine

• meristeemrakke „ tulistatakse “ imepisikeste foframi või kulla tükikestega, mille peale on seotud võõras DNA
  
• seostumine raku kromosoomistikuga
  
• ei ole teada kuhu täpselt seostub
  
• esimene taim 1983 a. Tubakas
  
• esimene tootmisesse läinud taim 1994 kauavalmiv tomat
  

soja(89%)
mais(61%)- saagikus on tõusnud 30%
puuvill( 83%)
riis
raps
suurimad kasvatajad USA, Argentiina ,Hiina, Kanada
EL-is võib vahendada 17. GMO artiklit
GMO
1.põlvkond:
1990.a. Keskel

• herbitsiidiresistentsed
  
• parandatud valmimisajaga ja säilimiskindlad
  
• kahjurikindlad
  

2.põlvkond
möödunud kümnendi lõpul

• rõhk patentidel ja seaduslikul katsel (seemnesaaks idanemisvõimetu- ei sa levitada, oled sunnitud ostma)
  
• viirusresistentsed
  
• nematoodikindlad(parasitussid)
  
• külakindlad(lisatud kala geene)
  
• ravimitööstuse otstarbel (ravivalkude tootmine)
  
• loomad, kes toodavad ravivalke
  

3.põlvkond
alles uuringute tasemel
multifunktisonaalsus:

• vitamiinide ja mineraalainete sisalduse parandamine
  
• sisaldavad ravikomponente
  
• efektiivsemalt talitlead taimed (kasutavad paremini valgust , H2O)
  
• kuldne riis- et parandada riisi sööjae tervist. Gmo-ga on viidud riisi A-vitamiini lähteained( karoteenid ) et parandada riisisööjate nägemist
  

Nokautorganismid
geenitehnoloogia meetod, kus tekitatakse suunatud mutageneesiga geenimine
välistatakse kindla geeni avaldumine = geeninokaut ja nokautorganismid
on loodud 100-de geenide suhtes nokauti löödud hiiri
eesmärk:

• hiirtele ja inimsele ühiste geenide fenotüübilise tähenduse saamine
  
• inimeste pärilike haiguste olemuse ja avaldumise käigu uurimine hiirtel
  

tehnoloogia on geenisihtimine

• luuakse DNA-konstrekt(jupp) ,mis sisaldab suure osa sihitava geeni järjestusest,kuid seal on mingi oluline viga .nii et see geen tööle ei lähe
  
• lisatud markeering
  
• geen viiakse embrüonaalsetesse tüvirakkudesse in vitro
  
• liitunud geeniga rakud viiakse uude embrüosse
  
• embrüo siirdatakse hiire emakasse
  
• areneb kimäär-kahte erinevat genotüüpi omav organism
  
• ristamist korratakse
  

geeninokaut
geen lülitatakse välja
tehnika keeruline

• geenivektor (vigane geen+marker) viiakse hiire embrüonaalsetesse tüvirakkudesse
  
• vektor satub ristsiirdega genoomi
  
• selektiivsöötmel jäävad ellu mutantsed rakud , need on nokautrakud
  
• nokautrakud siirdatakse uude embrüoblasti
  
• tekib kimäärne embrüo
  
• see embrüo viiakse hiire emakasse
  
• sünnivad kimäärsed hiired
  
• järgneva ristamise tulemusena sünnivad ka homosügootsed nokauthiired
  

mudelhiired- haiguse uurimiseks ; organite kasvatamiseks GM-loomade baasil
Kiired tulemused
Kahjurid võivad muutuda immuunseks
Geenid teistelt liikidelt
Geenid võivad üle kanduda umbrohule
Geenide avaldumist saab reguleerida
Erinevate organismide geenide koostoime võib olla ettearvamatu
Põldudel kasutatakse vähem keskkonnamürke
GM-taimede maitseomadused on tavaliselt halvemad
See on täppissordiaretus
Geeniteraapia
ehk geenirav on normaalselt talitleva geeni viimine raske geneetilise puudega inimese mingi koe rakkudesse
inimesel on teada üle 3000 päriliku puude
2võimalust:

asendada haige geen tervega

vaigistada haige geen

• neid tegevusi ei tehta munarakuga , need e pärandu järglastele edasi
  
• on kohati häid tulemusi kui enamjaolt mitte
  
• sarnaneb transgeeniga-sama liigi geene siirdatakse
  
• geeniravi sõltub puude olemusest
  

• ravi mis on seotud vererakkudega(olemas kogu aeg üvirakud
  
• teisel juhul vajalik ka koespetsiifiline promootor- keeruline
  

immuunpuudulikkuse ravi oli 1990.a suhteliselt edukas
Parkinsoni tõve ravi ajutiliselt
geenivaigistamiseks kasutatakse mikroRNA molekule. kui mikroRNA -d ühinevad mRNA-ga siis viimane lagundatakse
nii saaks ravida huntingtoni haigust
Geenivaigistamine on täiesti uus suund
muud rakendused geenitehnoloogiale

molekulaargeneetiline diagnostika

• enamasti põhineb mutantsete geenide äratundmisel
  
• DNA- kiibid – võrdlus DNA lõigud, millega patsiendi geene kõrvutada- saab tuvastada haigusi ja siis vastavalt määrata ravi
  
• paljude haiguste puhul võimalik: rinnavähk, kurtus, tsüstiline fibroos, huntingtoni tõbi
  

DNA sõrmejälgede metoodika

• võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust
  
• lookust saab DNA-st välja lõigata ja paljundada väga kiiresti polümerasse ahelreaktsiooni (PCR) meetodit kasutades
  
• lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid lahuses segamini
  
• see proov pannakse geeli, geel pannakse elektrolüüsi vanni
  
• DNA lõigud jooksevad pooluste poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on
  
• PCR meetod- ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid , DNA polümeraas, oma DNA lahus, praimerid(lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema otsaga
  
• ependorf pannakse 3h PCR masinasse
  
• toodetakse DNA lõiku miljonites kordades
  
• PCR masin e termotsükler - - toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuri vaheldumisele
  
• uuritava DNA lõike on paljundatud vähemalt 30 miljonini
  
• nii suurt kogust saab näha geelelektoforeesil
  
• PCR masinast võetud Dna proov pannakse geeli
  
• umbes 1h pärast näeme UV-kiirguses lahustatud DNA-lõikude „bände“
  

• saame üksteise sarnasusi või erinevusi näha ja võrreldakse
  
• vanemal ja lapsel ei või olla ühtegi erinevat lookust