genoomi keskkonna e mõjutuste– eest Genoom DNA või RNA, Kasutatakse Kapsiid sisaldab pärilikku infot Geenitehnoloogias, Ümbris – aitab kui tahetakse Kael peremeesrakku ära bakterisse viia kindlat us Saban tunda Valgu infot sisaldav DNA. d d Kinnitusniid
Evolutsiooni käigus on viirused tekkinud peaaegu kõikidele organismidele: viirused, mis nakatavad inimest, ahve, baktereid . Viiruseid on erineva korrapärase kujuga (kera, pulk, bakteriofaag). Bakteriofaag – on viirus, mis nakatab baktereid. DNA on pakitud päisesse. Nakatumise käigus surutakse viiruse DNA ohvrisse läbi „kaela“ ja „saba“. Kasutatakse bakteriaalsete haiguste raviks. Kasutatakse ka geenitehnoloogias, kui tahetakse bakterisse viia kindlat infot sisaldav DNA. Viiruse elutsüklid: Lüütiline elutsükkel: 1)Bakteriofaag kinnitub rakule (nakatumine) 2)Nukleiinhappe sisenemine rakku 3)Nukleiinhappe replitseerumine 4)Moodustatakse uued viirus- osakesed 5)Viiruseosakesed väljuvad rakust ja rakk hukkub. Lüsogeenne elutsükkel: 1) Bakteriofaag kinnitub rakule (nakatumine) 2)Nukleiinhappe sisenemine rakku 3)nukleiinhape seostub kromosoomiga 4) nukleiinhape jääb inaktiivseks
Kus leidub? Levib pinnavetes – järvedes, jõgedes, ojades, ka soojendatud majapidamisvees. Kuidas ennetada? Selleks, et olla veenunud, et joogivee kaudu ei satuks organismi mikroobset saastet, tuleks vett enne joomist kuumutada vähemalt 60 kraadini. Enterohemorraagiline E-coli (EHEC) See bakter esineb veiste ja teiste mäletsejate soolestikus. Levivad kehva hügieeni tõttu ning võivad põhjustada vereeritusega kõhulahtisust. Neerupuudulikkuse korral võib bakterisse nakatumine lõppeda surmaga. 2013. aastal registreeriti 1612 haigusjuhtu. Kus levib? Mõningatel juhtudel toores kapsas, aga ka veiselihas ja toorpiimas. Kuidas ennetada? Loomseid saadusi tuleks kuumutada. Toiduga tegeledes tuleb olla hoolikas (pesta lõikelaudu ja nuge ning pärast tualetis käimist pesta hoolikalt käsi).
* täiustada tehnoloogiat, et luua inimesele kasulikke GMO-sid Meetodid: * geenide rekombinatsioon plasmiidsete vektoritega * geenide rekombinatsioon viirusvektoritega * DNA, RNA analüüsi meetodid: PCR, sekveneerimine, geel elektroforees Plasmiidid geenide vektorid Looduses kanduvad üle ühest bakterist teise geenide horisontaalne ülekanne Kui võõrad geenid plasmiidi DNA-sse sisestada lähevad üle teise bakterisse koos plasmiidiga Inimese kasvuhormooni geen GH1 (growth hormone) E. coli plasmiidi Kui GH1 muteerunud, ei tooda hüpofüüs kasvuhormooni kasv peatub lapseeas täiskasvanul kääbuskasv Kasvuhormoon: 191 AH valk AH järjestus teada, geeni GH1 nukleotiidne järjestus mitte Kasvuhormooni geeni kloneerimine Plasmiidid paljunevad rakus paljundavad ka inimese geeni Geeni kloneerimine miljonid koopiad geenist Geeni defektiga lapsele süstida kasvuhormooni
siis kui palju vektorit peame 50ng inserdi kohta võtma? Soovitud vektori:inserdi suhe on 1:5. Vektor : 5000bp Insert: 1000bp 10ng Kuna suhe peab olema 1:5 50ng Vektor on aga 5 korda pikem kui insert, seega on see ka 5x raskem massi poolest, ehk peame selle 10ng viiega korrutama, et saada reaalse massi. Peame võtma 50ng vektorit. Praktiline töö nr. 6: Transformeerimine Eesmärk: Plasmiidi sisestamine bakterisse selekteerimise ja paljundamise eesmärgil. Materjalid: 5 µl Ligeeritud DNA segu Plasmiid, mis hakkame sisestama 100 µl E.coli kompetentsed Rakud, kuhu sisestame plasmiidi rakud(TOP10), kompetentsuse aste 107 kokku Steriilne tardsööde LB Kus peal oma rakke kasvatame 200ml 200 µl Ampitsilliini vesilahus 100mg/ml Selektsioonimarker
igaühel oma “äratundmiskoht” DNA-l. Restritaasid lõikavad DNA sagely nii, et tekivad üheahelalised otsad - “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA lõike on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? - üle viidavale geenile on markergeen külge pandud (GFP-geen). Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meis on intronid ja eksonid, kuid bakteris neid ei ole. Kui tahame bakterisse geeni via, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA, seda protsessi, pöördtranskriptsiooni viib läbi PÖÖRDTRANSKRIPTAAS. Edasi saab cDNA juba liita bakteri DNA-ga ning ta hakkab tootma inimese organismis esinevat valku. Kui kasutame baktereid sel viisil mõne teise liigi geenide säilitamiseks, same genoomipanga. Mudelorganismid geneetikas: kiire põlvkondade vahetus, suhteliselt vähe geneetilist materjali, sarnasus inimorganismiga, odav pidamine, varasem hea läbiuurituse tase.
Kahe DNA kleepuvate otste liitumine toimub komplementaarsus printsiipide alusel ja ahelate aheald liituvad omakorda ligaasi abil. Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid( nukleotiidsed järjestused mis ei määravalgu ehitust) ja eksonid. (sisaldavad aminohapete järjekorra informatsiooni) · pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA, mille alusel sünteesitakse valk. · Kui me tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA. - õnneks o avastatud pöördtranskriptaas (revertaas) , mis selle töö ära teeb · nüüd teeb bakter sama valku mis see geen inimese rakuski teeb · DNA-lt toodeti RNA-d, RNA-st lõigati välja intronid. Organisme kelle genotüüpi on muudetud nim. GMO-ks( geneetiliselt muundatud organism) GMO-sid on 2. tüüpi 1. organismid kellesse on viidud võõra liigi geene transgeensed org. 2
otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen- taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA , mille alusel sünteesitakse valk. Kui tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA - õnneks on avastatud pöördtranskriptaas, mis selle töö ära teeb. Nüüd teeb bakter sama valku, mis see geen inimese rakuski teeb. Rakendusbioloogia kasutusalad: Pesuvahendites Ensüümid saadakse bakteritest ja seentest. Intelligentsed pesupulbrid lagundavad lipiide, valke, polüsahhariide jne. Tööstuses Bioplast laguneb looduses kiiremini.
valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFPvalk on valmis. Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA , mille alusel sünteesitakse valk. Kui tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA õnneks on avastatud pöördtranskriptaas, mis selle töö ära teeb. Nüüd teeb bakter sama valku, mis see geen inimese rakuski teeb. Bakterid toodavad inimese valke alates 1978.a. Esimene oli insuliin. Inimese kasvuhormoon Erütropoietiin aneemia raviks Interferoon, mis reguleerib immuunsüsteemi Vere hüübimisfaktorid Difteeria ja teetanuse vaktsiin Pärmseened teevad Bhepatiidi vaktsiini
koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA , mille alusel sünteesitakse valk. Kui tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA - õnneks on avastatud pöördtranskriptaas, mis selle töö ära teeb. Nüüd teeb bakter sama valku, mis see geen inimese rakuski teeb. Bakterid toodavad inimese valke alates 1978.a. Esimene oli insuliin. Inimese kasvuhormoon Erütropoietiin aneemia raviks Interferoon, mis reguleerib immuunsüsteemi Vere hüübimisfaktorid Difteeria ja teetanuse vaktsiin Pärmseened teevad Bhepatiidi vaktsiini
geene võidakse edasi anda ka teistele nii sama kui võõra liigi bakteritele. Faagid on aga „elusad“ organismid, mis on võimelised evolutsioneeruma. Kui mõnes bakteris tekib resistentsus mõne kindla faagi suhtes, siis võivad toimuda selles faagis mutatsioonid, mis võimaldavad ületada tekkinud resistentsuse barjääre. Näiteks kui tekivad mutatsioonid bakterite endonukleaasides, mille tõttu lagundatakse bakterisse sattunud faagi DNA, siis võivad faagis vastukaaluks tekkida mutatsioonid DNA-s, mille tõttu ei ole enam bakterite endonukleaasid võimelised degradeerima faagi DNA-d (Carlton, 1999). Uute faagisüsteemide arendamine on palju odavam kui uute antibiootikumide välja töötamine ning erinevalt antibiootikumidest, ei mõjuta faagid ning nende produktid eukarüootseid rakke. Seega kõrvalmõjusid esineb faagiteraapias vähem kui antibiootikumidega ravimisel (Matsuzaki, 2005).
antibiootikumiresistentsust määravat geeni Inimese kasvajat põhjustavale geenile on lisatud GFP- geen. See on viidud hiire rakkudesse ning nüüd on võimalik jälgida kasvaja arengut, siirdeid jne. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA , mille alusel sünteesitakse valk. Kui tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA - õnneks on avastatud pöördtranskriptaas, mis selle töö ära teeb. Nüüd teeb bakter sama valku, mis see geen inimese rakuski teeb. RNA trans- kript http://faculty.ircc.edu/faculty/tfischer/images/introns-exons.jpg Bakterid toodavad inimese valke alates 1978.aastast Esimene oli insuliin. Inimese kasvuhormoon Erütropoietiin aneemia raviks Interferoon, mis reguleerib immuunsüsteemi
28. Makroliidid on kitsa toimespektriga/laia toimespektriga ühendid, toimivad peamiselt G-positiivsesse mikrofloorasse/ G-negatiivsesse mikrofloorasse (bakteriostaatiline toime) 29. Makroliidide resistentsuse põhjusteks on a) ribosomaalse RNA metüleerumine b) antibiootikumi inaktivatsioon mikrobiaalsete ensüümide toimel c) suurenenud effluks pumba mehhanism 30. Milline tekitaja on õige? Makroliidid toimivad - Mycoplasma ja Clamydia bakteritesse, Legionella bakterisse 31. Klooramfenikool kuulub ... a) mikroobi nukleiinhapete metabolismi innhibiitorite hulka. b) mikroobi rakumembraani funktsiooni häirivate inhibiitorite hulka c) mikroobi rakuseina sünteesi inhibiitorite hulka d) mikroobi valgu sünteesi inhibiitorite hulka e) toimib 50S alaühikul 32. Milline väide kehtib klooramfenikooli kohta? Klooramfenikool ... a) imendub hästi suukaudsel manustamisel b) jaotub ühtlaselt organismis c) läbib
Kloonitava DNA ettevalmistamine Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil Rekombinantse DNA sisendamine peremeesorganismi Rekombinantide selekteerimine Rekombinantide analüüsimine Etapp 1. Valitud DNA tükk lõigatakse päritoluorganismist restriktsiooniensüümide abil. Etapp 2. DNA tükk „kleebitakse“ vektorisse ja DNA otsad liidetakse vektori DNA-ga ligeerimise teel. Etapp 3. Vektor sisestatakse peremeesrakku, sageli bakterisse või pärmi. Peremeesrakud kopeerivad vektori DNA koos oma DNA-ga, luues sisestatud DNA-st mitu eksemplari/koopiat. Etapp 4. Vektor-DNA eraldatakse peremeesraku DNA-st ja puhastatakse. Mis on rekombinantne valk, selle tootmise võimalused? Rekombinantne valk on valk, mida kodeerib rekombinantne DNA. On DNA kloneerimise teel saadud valk. Selliseid valke saab toota nt bakterite abil või transgeensete loomade abil. Mis on cDNA
vajadusel fuugida ning jäta ligeerimiseks järgmise päevani +4 °C juures. Ligeerimissegu: 1 μl puhastatud PCRi produkti 1 μl pSTBlue-1 vektorit (9 ng/μl) 0,5 μl 10x puhvrit 1 μl T4 DNA ligaasi (sünteesib fosfodiester sidemeid) 1,5 μl MQ vett 48. 49.Transformeerimine 50. Eesmärgiks on peale ligeerimist saadud DNA molekuli viimine kompetentsetesse E. Coli bakterisse ja see on oluline selleks, et saaksime kiiresti ja odavalt ning väga väikese vigade hulgaga palju seda plasmiidi (paljundame seda bakteris). Bakterid on eelnevalt töödeldud divalentsete katioonidega (Ca2+, Mn2+), mis muudab rakuseina laengu positiivseks. Plasmiidse DNA lisamisel kinnitub see rakuseinale. Bakteri rakke kuumutatakse lühikest aega ning kuna E. Coli rakke töödeldakse külmades tingimustes, toimub temperatuuri muutus
sagedust, välistades teatud mutatsiooni täielikult. KOMBINATIIVNE MUUTLIKKUS Esineb kahes vormis: mittehomoloogiline (bakteritel) ja homoloogiline (suguliselt paljunevatel päristuumsetel) Mittehomoloogiline muutlikkus bakteritel - kombineeritakse mõ - 7nevõrra erinevaid geneetilisi struktuure ja see toimub ühepoolselt. 1. Transformatsioon bakter sureb, laguneb, tema DNA vabaneb keskkonda, hakkab osaliselt lagunema, osa tema DNAst kandub uude bakterisse ja koos sellega uus bakter omab eelneva bakteri geene. Ja juhul kui need määravad kahjulikke tunnuseid, omandab uus bakter ka need. Nakkushaigustesse surnud (bakternakkus) loomade, inimeste laibad tuleks põletada. 2. Transduktsioon viirus kannab oma DNA bakteri raku genoomi (haploidne kromosoomistik) ja põhjustab sellega muutlikkuse. Faag bakterrakku ründav viirus 3. konjugatsioon plasmiidi ülekanne ühelt bakterilt teisele piili vahendusel. Plasmiid -
eksogenoodiks. Retsipiendi DNA on endogenoot. Bakteritel toimuvad horisontaalsed üleknaded 3 mehhanismi abil, milledeks on transformatsioon, transduktsioon ja konjugatsioon 52 TRANSFORMATSIOON,TRANSDUKTSIOON Transduktsioon Transduktsioon on gneetilise informatsiooni (DNA) ülekanne doonorbakterilt retsipientbakterile bakteriofaagi osalusel. Transduktsioonis osalevad peamiselt mõõdukad faagid. Doonorrakust kantakse retsipientrakku bakteriaalse DNA segment. Kui faag satub bakterisse, siis ta põhjustab bakterite lüüsi, samaaegselt toimug ka uute faagide süntees ja kokkupakkimine. Teatud faagidesse võib sattuda bakteri genoomi osakesi, mistõttu võivad tekkida nn. ,,defektsed" faagid. Selline ,,defektne" faag võib tungida nüüd retsipientrakku ning kombineruda seal bakteriraku genoomi homoloogilises regioonis. Enamasti ta aga degradeeritakse. Harva võib see ülekantud osake jääda tsirkuleerima ka tsütoplasmasse molekulina (tegemist on siis nn
Seega võib arvata, et erütsomütsiin seondub ribosoomis nii suurema subühiku valkudega kui 23S rRNA'ga. Makroliidide sidumispiirkond ribosoomis kattub osaliselt kloroamfenikooli sidumiskohaga. Makroliidide ja kloroamfenikooli seondumine ribosoomidele on teineteist välistav. Erütromütsiini, nagu paljude teiste antibiootikumide resistentsus bakterites, saavutatakse ka teiste mehhanismide abil peale mutatsioonide ribosoomi komponentides, näiteks permeaablust (ravimi transport bakterisse) mõjutavad mutatsioonid. Linkomütsiin ja klindamütsiin (linkoosamiidid) inhibeerivad samuti peptiidsideme sünteesi ribosoomidel. Nad blokeerivad aminoatsüül-tRNA 3'-otsa (aktseptorsubstraadi) fikseerimist ribosoomi peptidüültransferaases tsentris ja on selle omaduse poolest sarnased kloroamfenikooliga. Viimasega aga samuti makroliididega on neil osaliselt kattuv sidumispiirkond ribosoomidel. Mõned 23S rRNA mutatsioonidest, mis tagavad makroliidide resistentsuse annavad ka
Et seda tõenäosust tõsta, viiakse sisse lisakoopia rekombinaasi geeni, mis on üks spetsiifiline rekombinaas, mis väga suure sagedusega homoloogilist rekombinatsiooni kordab. 1000x suurendab sagedust. Kui see kaheahelaline DNA viia sellistesse bakteritesse, toimub homoloogilise rekombinatsiooniga insertsioon. Siis bakter asendab selle geeni mingi vanaga. Vana eemaldatakse ja sellest saadakse lahti. Markergeeniks sobib antibiootikumi resistentsus. Bakter ise ei ole resistentne, aga geen on. Bakterisse viiakse sisse rekombinaasi geen – spetsiifiline, mis tõstab homoloogilise rekombinatsiooni sagedust. Bakter muutub resistentseks antibiootikumi suhtes, aga ühtlasi kaotas ära geeni, mis oli sellel kohal enne Replikatsiooni mehhanismi kasutamine - saab kasutada GMO-de tekitamiseks (uurimustöö, tootmine). Hiired tehakse cre kombinaasiga, katked tekivad kahe cre järjestuse vahele. Cre calgu koespetsiifiline integreerimine.
kas prootonite ülehulgast endast või mängivad rolli siin agmatiini kontsentratsiooni tõus tsütoplasmas. Membraani sisekülje positiivse laenguga takistatakse prootonite tungimist tsütoplasmasse positiivse laenguga. E. coli tsütoplasma pH homöostaasi hoidmisel on oluline roll ClC kanalil, mis reguleerib Cl- ioonide liikumist väliskeskkonna ja tsütoplasma vahel. Välja on pakutud kaks hüpoteesi. Esimese kohaselt siseneb bakterisse HCl, mis mao madala pH tõttu on maos laenguta, kuid bakteri tsütoplasmas laguneb H + ja Cl- ioonideks. Prooton kasutatakse ära aminohapete dekarboksüleerimise käigus, kuid ClC transporter viib Cl- iooni tsütoplasmast välja vältimaks membraani hüperpolariseerumist (siseküljele antav negatiivne laeng suurendab prootonite sissetungi). Teise hüpoteesi kohaselt Cl - ioone tuuakse rakku H+/Cl- antiporteri abil, et ära hoida membraani sisekülje liiga kõrget positiivset laengut ning
annaabi.ee 
