Geenitehnoloogia I käsitletavad teemad – 2013 sügsissemester. (0)

Geenitehnoloogia I käsitletavad teemad – 2013 sügsissemester.
NB! Nii loengute kui ka Tago Sarapuu gümnaasiumiõpiku peatükid 1-4
ja Mart Viikmaa õpikust see materjal, mid üles laetud geen.ttu.ee ‘’ Õppematerjalid ’’
alla
Bioteaduste metoodika
Loodusteaduslikud sh bioloogiliste protsesside uurimisel kasutatavad meetodid jaotatakse:
VAATLUS (ing k observation ) nt anatoomia, kirjeldav embrüoloogia)
VÕRDLUS (ing k comparison ) - nt võrdlev anatoomia, geenijärjestuste võrdlus
KATSE (ing k experiment ) – kui muudetakse üht parameetrit/tingimust, ja võrreldakse tulemusi nii muudetud kui muutmata (st kontroll) tingimustega katse puhul
Biokeemilised meetodid
Biofüüsikalised meetodid (nt valkude struktuuri analüüs)
Mikroskoopia (valgus- ja elektronmikroskoopia)
Geneetilised meetodid (mutatsioonanalüüs koos molekulaargeneetikaga)
Eluslooduse organiseerituse tasemed
MOLEKULAARNE tase – molekulaarbioloogia , geenitehnoloogia, süsteemibioloogia ( BIOMOLEKULID ainult ELUSlooduses )
ORGANELLI tase – (molekulaarne) rakubioloogia
RAKU tase - rakubioloogia
KOE tase - histoloogia, arengubioloogia /embrüoloogia. Inimesel põhikoed: epiteel -, lihas-, närvi- ja sidekude
ELUNDI tase – ERI KOED (Tissues) moodustavad ELUNDID e. ORGANEID (anatoomia, füsioloogia ). Organitest moodustuvad ELUNDKONNAD e. ORGANSÜSTEEMID (füsioloogia)
ORGANISMI tase – need koos omakorda moodustavad POPULATSIOONIDES taseme
ÖKÖSÜSTEEMI TASE – organismid + keskkond (st ümbritsev elus- ja eluta lodus – ökoloogia ) – Kogu ELU KÕRGEIM TASE – BIOSFÄÄR )
Suhkrute lühiiseloomustus.
SUHKRUD ehk SAHHARIIDID (sugars/ saccharides) – LIHT ja LIITSUHKRUD - Peamine toitaine /energia(varu)aine
Suhkrud e süsivesikud - orgaanilised ühendid, mille koostisesse kuuluvad süsinik, vesinik ja hapnik. Suhkruid jagatakse 3 rühma:
1)Monosahhariidid e lihtsuhkrud (üks tsükkel )- kõige lihtsamad süsivesikud, mis koosnevad 3-6 süsinikuaatomist. Tähtsamad neist on:

• 5-süsinikuga e pentoosid
  

riboos (C5H10O5)- kuulub RNA (nukleotiidi) koostisesse.

desoksüriboos (C5H10O4)- kuulub DNA (nukleotiidi) koostisesse.

• 6-süsinikuga e heksoosid
  

glükoos e viinamarjasuhkur (C6H12O6)- tähtis energiallikas . Taimedes moodustub glükoos fotosünteesi käigus ja tihti talletatakse see tärklisena. Loomad saavad glükoosi toiduga nt tärklise lõhustamisel seedeelundkonnas.

Fruktoos e puuviljasuhkur (C6H12O6)- puuviljades ja mees esinev monosahhariid . Seda samuti kasutatakse energiaallikana.
2)Oligosahhariidid-süsivesikud, mis koosnevad 2-10-st omavahel liitunud monosahhariidist.Looduses on enam levinud disahhariidid:

• sahharoos (lauasuhkur)- koosneb glüükoosi ja fruktoosi ühenenud molekulidest. Esineb taimemahlades.
  
• maltoos ( linnasesuhkur )- koosneb kahest glükoosijäägist.Moodustub taimedes ja tärklise lõhustumisel loomades .
  
• laktoos ( piimasuhkur )- koosneb glükoosi ja galaktoosi molekulist. On piimas esinev suhkur, mis on imetajatel toiduks nende järglastele.
  

3) Polüsahhariidid - polümeerid, mille monomeerideks on monosahhariidide jäägid. Need on:

• tärklis- koosneb glükoosijääkidest, taimed kasutavad varu-energiaallikana.
  
• tseluloos- koosneb glükoosijääkidest,taimede ehitusmaterjal (nt taimede rakukestad).
  
• kitiin - koosneb lämmastikku sisaldavast suhkrust . Lülijalgsete toeses ja seente rakukestades.
  
• glükogeen- koosneb glükoosijääkidest, energiarikas varuaine loomadel.
  

Kokkuvõtte- süsivesikute tähtsus

• Struktuurne : kitiin ( lülijalgsed , seenerakukestad) ja tselluloos (taimerakukestad)
  
• Varuaine: tärklis (taimedes) ja glükogeen (loomades)
  
• Toite: piimasuhkur imetajate piimas
  

Lipiidide lühiiseloomustus.
Lipiidid - ühendid, mis koosnevad rasvhapete jääkidest ja glütseroolist. Seepärast need ei lahustu vees: neil on hüdrofiilne osa- glütserool - ja hüdrofoobne osa – rasvhappe jääk. Liipide võib jagada neljaks rühmaks :
1)Lihtlipiidid:

• vedelad rasvad - taimsed õlid . Taimedel on peamiselt küllastumata rasvhapped –enamasti vedelas olekus (õlid). Süsiniku aatomite vahel kaksiksidemed.Taimedes energiaallikaks ning seemnetes varuaineks.
  
• tahked rasvad- loomsed rasvad. Loomadel on peamiselt küllastatud rasvhapped. Süsiniku aatomite vahel üksiksidemed. Talletatakse rakkudes ja kasutatakse energiaallikana.
  

2)Vahad- taimsed ja loomsed. Taimsed vahad on nt puuviljadel, okastel ning täidavad kaitse funktsiooni; loomsed vahad on nt mesilasvaha (mesilaste kärjed); vill on kaetud pehme loomse vahaga ( lanoliin ).
3)Liitlipiidid e fosfolipiidid - üks rasvhappejääk on asendunud fosfaatrühmaga. Kuuluvad rakumembraan koostisesse. Moodustavad kahekihilise struktuuri- membraani (vt.8 küsimus)
4)Tsüklilised lipiidid e steroidid. Peamiselt hormoonid, mis moodustuvad sisesekretsiooninäärmetes. Vees ei lahustu.
Esinevad loomakudedes. Nt

• kolesterool - on vajalik loomarakkuse mambraanide ehituses: annab tugevuse (vt. 8 küsimus)
  
• hormoonid-
  

testosteroon ( meessuguhormoon ),

östrogeen (naissuguhormoon),

progesteroon (naissuguhormoon).

neerupealiste hormoonid.

D- vitamiin – hormoon , mida meie keha sünteesib päikesevalguse abil.
Kokkuvõte- liipide funktsioonid

• Energeetiline funktsioon. Lipiidide koostises olevad rasvhapped on olulised energia saamise seisukohast – lipiidid on kõige energiarikkamad inimtoidu komponendid: 1g annab 38,9 kJ, so 9,3 kcal
  
• Ehituslik funktsioon. Fosfolipiidid ja kolesterool kuuluvad rakumembraani koostisse.
  
• Varuaine funktsioon. Loomadel varurasv , taimedel õlid seemnetes, viljades ja mesilaskärjed (vahad).
  
• Ainevahetuslik funktsioon. Metaboolse vee teke - lipiidide lõplikul lõhustumisel moodustuvad vesi ja süsihappegaas . Omane kõrbeloomadele nagu kaamel või koile, kes üldse ei joo.
  
• Kaitsefunktsioon.
  

Nahaalune lipiidide kiht, kui ka siseorganite ümber olevad lipiidid kaitsevad mehhaaniliste põrutuste eest.

Nahaalune lipiidide kiht kaitseb keha mahajahtumise eest.

Veelindudel kaitseks märgumise eest.

Rasvkoes võivad talletuda kehavõõrad ained (mürgid).

Pruun rasvkude , kus toimub aktiivne rasvhapete lõhustumine on oluline imikute soojusregulatsioonis, samuti talveunest ärkavatel loomadel aga ka talisuplejatel.

Lahusti funktsioon. Veres olevad lipoproteiinid kannavad rasvlahustuvaid vitamiine organismi kõikidesse kudedesse.
Aminohapete ja valkude lühiiseloomustus.
Valgud e proteiinid - on polümeerid, mille monomeerideks on aminohapped . On 20 erinevat aminohapet (neist 8 asendamatud ja 12 , mida rakud saavad ise sünteesida), mis võivad kuuluda valkude koostisesse. Amonihappeid iseloomustab amino- ja karboksüülrühmad. Valgu molekulisaminohapete vahel on peptiidsidemed: N-H ja
karboksüülrühma( COOH ) vaheline kovalentne side. Peptiidsideme moodustamisel eraldub üks molekul vett .Valkudes on kolm osa: N-terminaalosa, peptiidsidet moodustav osa ja C-terminaalosa. Peptiidsidemete süntess toimub alati kindlas suunas: N- terminus→C-terminus. Valkude omadused sõltuvad:

aminohapete järjestusest valgu molekulis

aminohapete arvust (DNA→valk→tunnus)
Oluline on, et valgumolekul on lineaarne, ei hargne ega on tsülklis. Valgu süntees vt. küsimus 28
Valke jagatakse:

lihtvalgud -koosnevad aminohappejääkidest;

liitvalgud- koosnevad valgulisest ja mittevalgulisest osast.
Valkudel on neli struktuuri:
1) primaarstruktuur - on kõikidel valkudel. Selle aminohapete järjestuse järgi on näidatud valkude omadused.
Aminohapped on ühendatud peptiidsidemetega.
2)sekundaarstruktuur- tekib aminohappeahela keerdumisel spiraaliks -α-heeliks- või kõrvalahelate kokkuvoltimisel-
b – struktuur. Seda struktuuri hoiab koos vesiniksidemed (O ja H vahel). (kõõluste, kõhrede, juuste, küünkarvade valgud, soomuste, ämblikuniidi valgud )
3) tertsiaalstruktuur - moodustub aminohappeahela edasisel kokkukeerdumisel. Seotud vesiniksidemetega.Sellise struktuuriga valgu nimetatakse gloobuliks. ( ensüümid , antikehad , vereplasma valgud)
4)kvaternaalstruktuur- tekib mitme gloobuli on ühinemisel. On ühendatud vesiniksidemetega. (hemoglobiin)
Valkude struktuur võib muutuda järgmiste protsdesside tulemusena:

denaturatsioon - hävitatakse valgu kõrgemat järku struktuur, mille tulemusena aminohappeahel muutub sirgeks. See võib toimuda
Mehaanilisel teel

Kõrge temperatuuriga

Keemilisel teel

Kiirguse toimel

renaturatsioon - valkude kõrgemat järku struktuuri taastamine.
Valkude ülesanned:

• ensümaatiline - ensüümid kiirendavad reaktsioone. Ensüümi tööks on vaja kindla vitamiini juuresolek.
  
• struktuurne - rakumembraanide ehitus, karvad, küüned, suled, kabjad, sarved , viiruste kapslid.
  
• transport- hemoglobiin transpordib hapnikku, membraanides valgulised transportijad.
  
• regulatoorne- hormoonid- bioaktiivsed ained, mis vere kaudu reguleerivad elundite tegevust. (nt. insuliin ).
  
• retseptoorne- rakumembraani pinnaretseptorid annavad välissignaale edasi.
  
• liikumise- algloomade viburid , ripsmed, lihaskoe valgud ( aktiin , müosiin), mitoosi kääviniidid .
  
• kaitse- valgud on antikehade koostises; toodavad antikehasid. Antigeen - võõras aine organismis. Antikehad-seostuvad kindlate antikehadega. Ka verehüübimisvalgud, kattevalgud.
  
• energeetiline- väga madal -1g valkude lõhustumisel vabaneb 17,6 kJ energiat (nagu glükoosil). Valke lagundatakse ainult pärast sahhariide ja lipiide.
  

Aminohapped ehk aminokarboksüülhapped on keemilised ühendid, mis sisaldavad funktsionaalsete rühmadena nii aminorühmi kui ka karboksüülrühmi. Aminohapped on karboksüülhapped , mille alküülradikaalis on üks või mitu vesiniku aatomit asendunud aminorühmaga.
Nukleiinhapete lühiiseloomustus.
Nukleiinhapped - on polümeerid, mille monomeerideks on nukleotiidid . Nukleiinhappeteks on :

RNA ( ribonukleiinhape ) – geneetilise informatsiooni kandja, mis koosneb ribonukleotiididest.

DNA (desoksüribonukleiinhape)- geenetilise informatsiooni vahendaja , mis koosneb desoksüribonukleotiididest.
Nukleotiiddi koosnevad kolmest komponendist:

viiesüsinikuline suhkur e pentoos :

• RNA – riboos,
  
• DNA- desoksüriboos (teise süsiniku juures OH asemel on H)
  

lämmastikalus:

• RNA- Adeniin, Guaniin, (C) tsütosiin, Uratsiil.
  
• DNA- Adeniin, Guaniin, (C) tsütosiin, Tümiin.
  

fosfaatrühm .
DNA ehitus:

DNA on lineaarne polümeer . Seda moodustavate nukleotiidide vahel on fosfordiester side. See side moodustub ühe nukleotiidid 3-süsüniku juures oleva hüdroksüülrühma ja teise nukleotiidi 5. süsiniku juures oleva fosfaatrühma vahel. Nikleiinhapete sünteesil on kindel suund: 5´ (prim) ots+ 3´ (prim) ots.

Kahealaline, nn biheeliks . Ahelad on antiparalleelsed: üks ahel:-5´ ots, teine-3´ots.

Nukleotiidide vahel on vesiniksidemed: A jaTvahel 2 ja G ja C vahel 3 veseniksidet.Leiab aset komplementaarsusprintsiip: A=T, G=C.

DNA´l on kolm strisktuuri:

• DNA esmane struktuur - nukleotiidijääkide hulk ja järjestus DNA üksikahelas. Üksikahelaline DNA esineb rakus sünteesiprotsessides ja teatud viirustes.
  
• 2) DNA sekundaarstruktuur - DNA levinuim esinemisvorm. (biheeliks ja kaksikspiraal)
  
• 3) DNA tertsiaalstruktuur - tekib DNA ja valkude koosmõjul. DNA + valgud = kromosoomid .
  

RNA ehitus:

RNA esmane struktuur - primaarstruktuur. Nukleotiidijääkide hulk ja järjestus RNAs. Tekib sünteesijärgselt.

Teisane struktuur. Molekul , milles üksikahelalised lõigud vahelduvad kaksikahelaliste lõikudega. Omavahel paarduvad (tRNA)
RNA on ebastabiilne, et seda saaks vajaduse korral lagundada. See võimaldab rakul kasutada uute RNA järgi sünteesitud valke. Ilma selleta ei oleks rakk võimeline kiiresti vastata väliskeskkonnast telenevatele signaalidele.
5. Nukleotiidid on kolmekomponendilised süsteemid, mis koosnevad:

5C suhkrust ehk pentoosist

N-alusest

ühest või mitmest fosforhappe jäägist
Biofunktsioonid

kolme fosforhappe jäägiga nukleotiidid osalevad energiasalvestamises (ATP ja GTP osalevad energia salvestamises, neil on makroergilised sidemed)

ühe fosforhappe jäägiga nukleotiidid nt AMP ja GMP on nukleiinhapete ehitusüksusteks

mitmed nukleotiidid on liitensüümides mittevalguliseks osaks (tavaliselt kohaks, kus toimub reaktsioon )

osad nukleotiidid on antibiootilise toimega (tapavad baktereid)

tsüklilise ehitusega nukleotiidid nt cAMP on biosignaalide vahendajad (virgatsühendid ehk käskjalad)

disainitud ehitusega nukleotiidid on kasvajate vastased ravimid (keemiaravi ehk kemoteraapia )
Peamised erinevused DNA ja RNA vahel.
Peamisteks erinevusteks on 3, 1 ja 4
Tunnus
DNA
RNA
1) monomeer
desoksüribonukleotiid
ribonukleotiid
2)pentoos
desoksüriboos
riboos
3)N-alused
A=T, G=C
A=U, G=C
4)struktuur
biheeliks , so kaks ahelat , mis on kruvikujuliselt keerdunud
üks ahel
5) klassid
tRNA, rRNA, mRNA jt
6)ülesanne
päriliku informatsiooni säilitamine ja edasiandmine
pärilikkuse realiseerimine
7)leidmine
tuumas, mitokondrites, kloroplastides
tuumas, mitokondrites, klooplastides, ribosoomis, tsütoplasmas
Põhilised RNA-de klassid rakkudes, nende funktsioonid.
On kolm põhilist RNA-de klassi:

informatsiooni RNA (mRNA)- sünteesitakse rakutuumas DNA ühe ahela järgi. See toob geneeetilise info rakutuumas asuvatest kromosoomides tsütopalsmas olevatesse ribosoomidesse.

transport RNA (tRNA) ülesandeks on mRNA molekuliga ribosoomidesse saabunud geneetilise info lahtimõtestamine. Vastavalt sellele toovad tRNA molekulid kohale ”õiged” aminohapped ja lülitavad need sünteesitava valgu ahelasse. Selle lülitamise koha tunneb tRNA antikoodon .Iga tRNA suudab siduda ainult üht kindlat aminohappet.

ribosoomi RNA (rRNA)- kuulub ribosoomi koostisesse ja sünteesib peptiidsidemeid aminohapete vahel.
Kujundlikult öeldes mRNA ”ütleb, kuidas valku teha”,tRNA toob selleks ”ehituskive” ning rRNA on ”tootmishoone” üheks moodustajaks.
Prokarüootsete ja eukarüootsete rakkude peamised erinevused.
Prokarüootsed e eeltumsed rakud
Eukarüootsed e päristuumsed rakud
1)tüübid
bakterid
taimede, loomade, seente rakud ja protistid
2)tuum
puudub, selle asemel on tuumapiirkond
on kaksikmembraaniga ümbritsetud tuum
3)tuumamebraan
puudub
on olemas
4)DNA
Dna hulk on väiksem, on üks rõngaskromosoom
DNA´d on rohkem, on lineaarsed (alguse ja lõpuga) kromosoomid
5)sisemembraanistik(tsütopalsma-võrgustik, organellid )
puudub
on arenenud(nt.sER, rER)
6) tsütoplasma
jäik ja liikumatu
vedelam ja liikuv
Raku- ja rakutuumamembraani lühiiseloomustus.
Rakumembraan koosneb lipiitidest, millel on hüdrofiilne pea ja hüdrofoobne lõpposa. Tänu oma sellele ehitusele lipiidid sattudes vette muutuvad liposoomiks- lipiidide struktuur vees: lipiidid moodustava kaksikkihti, kusjuures iga kihi lipiitide ( hüdrofiilsed ) pead on pööratud vee poole ja (hüdrofoobsed) saabad on pööratud kihi sisse poole (üksteisele vastu), kus ei ole vett. Selline struktuur on väga stabiilne ja kord vesikekskkonnas tekkinud ei lagune enam.
Membraanis olevad lipiidid võivad vahetada koha, pöörata enda ümber. Membraanise võivad siseneda ka teised molekulid, millel on hüdrofiilne pea ja hüdrofoobne saba. Kui selline molekul siseneb, siis väheneb membraani dünaamilisus, aga just sellised molekulid reguleerivad rakumembraani dünaamilisust. Üheks selliseks ühendiks on kolesterool, mis paikneb lipiidide vahel. Membraanis peale lipiide on ka valgu molekulid. Valgu molekuli osa (või terve valk), mis koosneb aminohapetest, mis ei lahustu vees, pannakse membraani sisse. Sel korral tekib staabiilne olukord ja valgu hoidmiseks membraani sees ei ole vaja kuulutada energiaat. Kahe kõrval asuvate valkude vahel toimub ainete liikumine keskkonnast raku sisse ja vastupidi.
Selline membraan on vaga mugav selle poolest, et see on stabliiilne, lubab aine vahetust ja on dünaamiline (rakk ju kasvab, jagab jne).
Iga membraan koosneb lipiitide kaksikkihist, kaksikmembraan aga koosneb kahest lipiitide kaksikkihist.
Membraansete organellide ehitus ja funktsioon (endoplasmaatiline retiikulum , lüsosoomid , Golgi kompleks ).
Raku tsütoplasmat läbib endoplasmaatilise retiikulum e tsütoplasmavõrgustik. Eristatkse siledapinnalist ja karedapinnalist tsütolasmavõrstik.

siledapinnaline tsütoplasmavõrgustik e sile endoplasmaatiline retiikulum (sER) on membraanse ehitusega kanalikeste ja tsisternite süsteem. sER ülesanneks on lipiidide ja süsivesikute süntees ning ainete transport.

karedapinnaline tsütoplasmavõrgustik e kare endoplasmaatiline retiikulum (rER) on membraanse ehitusega kanalikeste ja tsisternite süsteem. rER pinnal paiknevad ribosoomid , mis sünteesivad valku. Peale seda rER ülesannek on ainete transport raku sees.
Ribosoom on rakuorganell, mis koosneb kahest osast: suur ja väike subühikud. Need omakorda koosnevad valkudest ja rRNA´st. Suur ja väike subühik on suurem osa ajst eraldatud teine teisest ja ühinevad ainult valgu sünteesiks.
Ribosoomide ülesanneks on valkude süntees.
Ribosoomid moodustuvad tuumakestes. Sünteesijärgselt liiguvad nad mööda tuumamembraanide pooride tsütoplasmasse. Seal kinnitub osa neist tsütoplasmavõrgustikule. Ribosoome võib leida ka mitokondrites ja kloroplastides.
Lüsosoomid on membraaniga ümbritsetud põiekesed , mis sisaldavad ensüüme. Ensüümid lõhustavad rakkudesse transporditud toitaineid, jääkprodukte ja surnud organelle.
Ühed lüsoomid sisaldavad üksnes ensüümvalke, teised lagundatavaid aineid ja neid lõhustavaid ensüüme.
Golgi kompleks on lamedate kohakuti paiknevate membraansete tsisternikeste ja põiekeste süsteem.
Golgi kompleksi ülesanneks on valkude kõrgemat järki struktuuride kujundamine ja pakkkimine sekreedipõiekestesse ja lüsosoomidesse ning ainete pakendamine. Golgi kompleks osaleb ka rakumembraani uuendamises ja taimerakkudes ka rakukesta moodustamises.
Mitokondrite ja kloroplastide ehitus ja funktsioon.
Mitokonder on rakuorganell, mis on ümbritsetud kahe membraaniga. Sisemembraan moodustab arvukaid kurde ja sopistusi, mida nimetatakse harjakesteks. Mitokondri vedelat sisekeskkonda nimetatakse maatriksiks. Seal leidub mitokondrile omaseid DNA ja RNA molekule. Mitukondri DNA sisaldab geneetilist infot organellille vajalike RNA ja rakkude sünteesiks. Valke sünteesitakse mitokondri sees olevates ribosoomides.
Mitukondri ülesanneks on rakuhingamine , energiarikaste ühendite(ATP) süntees (raku varustamine energiaga).
Kloropalstid- on plastiidide liik, mis sisaldavad rohelist pigmenti klorofüüli, mis on oluline fotosünteesiprotsessis. Kloroplastid paiknevad peamiselt lehtede rakkudes.
Kloroplast on ümbritsetud kahe membraaniga. Kloroplasti sisemuses paiknevad membraanidest moodustunud kotjad moodustised- lamellid . Need on paigutatud üksteisega kohakuti ja moodutavad lamellide kogumikke. Lamellide membraanides on klorofüüli molekulid. Lisaks sellele on kloroplasti sisemuses DNA, RNA ja valgu molekule. DNA omab pärilikku infot kloroplastile omaste RNA ja valkude sünteesiks. Kloroplast sisaldab ka ribosoome, mis sünteesivad sellele organellile vajalikke valke.
Kloroplastides toimub fotosüntees- suhkrute moodustamine süsihappegaasist ja veest valgusenergia abil.
Tsütoskeleti funktsioonid.
Tsütoskelett - on raku tsütoplasmas asuv valguliste niidikeste ja kanalikeste võrgustik. Tsütoskelett on raku tugi- ja liikumissüsteem.
Tsütoskeleti ülesandeks on oraganellide liigutamine või teatud asendis hoidmine, see on raku toes, mis hoiab kuju ja vormi.
Bakteriraku ehitus
Raku sein ümbritseb rakku ja kaitseb rakku lõhkemise eest. See koosneb süsinikuhüdraadi ja aminohappe segust .
Plasma membraan kontrollib materjalide liikumist rakust sisse ja välja. Mõned ained pumbatakse sisse ja välja aktiivse transpordi abil.
Tsütoplasma membraani sees sisaldab kõiki ensüüme, mis on vajalikud raku keemiliste reaktsioonide jaoks. See samuti sisaldab geneetilist materjali.
Kromosoom  on rakus tsütoplasmas, nukleoidi regioonis. DNA pole seotud ühegi valguga (DNA prokarüootses rakus on  paljas ). Bakterid sisaldavad lisaks väikseid DNA ringe , mida nimetatakse plasmiiditeks. Viimased paljunevad iseseisvalt ja võivad ühelt rakult teisele üle minna.
Ribosoomid leiduvad prokarüootsetes rakkudes, kus nad sünteesivad valke. Neid esineb suurtes numbrites rakkudest, mis aktiivselt toodavad valke.
Rakukesta ehitus ja funktsioon.
Taime rakukest koosneb tselluloosist, samuti on kesta ehituses mitmeid biopolümeere ja muid keeruka ehitusega orgaanilisi ühendeid.
Seene rakukest koosneb peamiselt kitiinist. Kitiinist kest on elastsem ja õhem kui taime oma. Kest ei takista raku kasvamist ning on gaasidele ja vedelikele mõlemas suunas läbitav. Enamik seeni toitub kogu keha pinnaga ning vesi ja selles lahustunud ained liiguvad läbi kesta ja membraani raku tsütoplasmasse osmoosi teel.
Bakteri rakukest koosneb polüsahhariididest, kuid selles on ka valke ja liitlipiide.
Rakukestal on kaitse-, tugi- ja transpordifunktsioon.
Eukarüootide riigid ja nende peamised tunnused.
Taimed, loomad, protistid, seened.
Eukarüoodid on oma nime saanud selle järgi, et neil asub geneetiline informatsioon (kromosoomidena) rakutuumas, mis on membraaniga ümbritsetud  organell .
Eukarüootide kõige olulisemaks tunnuseks ongi membraansete organellide olemasolu rakus, mis võimaldab biokeemilised reaktsioonid ruumiliselt eraldada. Nendeks organellideks onendoplasmaatiline retiikulum ja  rakutuum  (nende membraanid on omavahel ühenduses), mitokondrid  (mõnel eukarüoodil need puuduvad või on
taandarenenud), kloroplastid (paljudel puuduvad), Golgi kompleks, lüsosoomid ja  peroksüsoomid.
Eukarüootide oluliseks tunnuseks on veel tsütoskelett mikrofilamentide (aktiin) ja mikrotorukeste ehk mikrotuubulite (tubuliin) näol. Aktiinifilamendid määravad raku kuju ja mikrotuubulid tegelevad organellide ümberpaigutamisega, osalevad rakujagunemisel (mitoos ja meioos) ja on viburite koostisosaks.
Seeneraku ehitus.
Seenerakk koosneb rakukestast, mis koosneb kitiinist. Rakukest on taime rakukestast elastsem ja õhem. Seeneraku keskosas asub kahe membraaniga ümbritsetud rakutuum. Sellest väljapoole jäävas tsütoplasmas paiknevad mitoondrid, mis varustavad seenerakku vajaliku energiaga. Seenerakus esinevad ka mitmesugused päristuumsetele rakkudele iseloomulikud membraansed struktuurid: tsütoplasmavõrgustik, Golgi kompleks ja lüsosoomid. Seenele vajalike valkude süntees toimub ribosoomides, kuid nende ehitus erineb mõnevõrra taime- ja loomaraku risbosomide omast.
Taimeraku ehitus.
Taimerakkudepõhiliseks iseärasuseks on nendele ainuomaste organellide-plastiidide- esinemine. Lisaks sellele arenevad taimerakkude tsütoplasmas suured vakuoolid , mis teistel päristuumsetel organismidel puuduvad. Enamik taimerakke on ümbritsetud tiheda rakukestaga, mis koosneb tselluloosist.
Loomaraku ehitus. Põhilised loomsed koed (epiteel-, lihas-, närvi ja sidekude).
Loomarakk koosneb peamiselt topeltmembraaniga rakutuumast, milles on tuumake ja kromatiinid (rakutuumas paiknevad lahtikeerdunud kromosoomid). Tuumas on plasma, mida nim. karüoplasmaks. Tuum sisaldab valke, DNA-d, RNA-d, ja mitmesuguseid madalmolekulaarseid ühendeid. Tuuma membraani sees on poorid . Raku sees on tsütoplasma, tsütoplasmavõrgustikud (kareda (valkude süntees)- ja siledapinnaline (sahhariidide ja lipiidide süntees)), Golgi kompleks (valkude töötlemine), ribosoomid, mikrotuubulid (valgulised torukesed, mis on mõnede organellide koostises), mitokondrid (ATP-süntees) ,tsentrioolid (loomaraku tsentrosoomi osa, mis koosneb 27 valgulisest mikrotuubulist), lüsosoomid(ühekordse membraaniga põieke , kus lagundataksemitmesuguseid makrmolekule), ribosoomid (koosneb rRNA-st ja valgumolekulidest. Toimub valgusüntees ).
Epiteelkude: rakud paiknevad tihedalt üksteise kõrval - rakuvaheaine (ekstratsellulaarne maatriks ) peaaegu puudub;
-- moodustab naha pindmise osa ja ümbritseb siseorganeid
-- kaitseb organismi ja selle kudesid keskkonnamõjutuste eest (nt haavad, patogeensed mikroorganismid );
--moodustab kõige pealmise katte ( epiteeli ) nii looma välispinnale kui ka sisemistele õõnsustele - sealhulgas kattekihid õõnsate organite ‘’luumenile’’ (siseõõnsustele) ( seedetrakt , erituselundid, kopsude alveoolid, veresooned jne);
-- läbi epiteelkoe saab võimalikus ainevahetus organismi ja väliskeskkonna vahel
Epiteeli näiteid: nahal, sisekõrvas reageerib välisärritusle (õhuvõnked!); epiteelrakulised higinäärmed , neeruepiteel, sooleepiteel jne
- limaskestad epiteelkude eritib lima (näiteks ninaõõnes)
Lihaskude

• Lihaskiud ( müofibrillid ) ja lihasrakud e. Müotsüüdid on pikliku kujuga ja sisaldavad valgulisi (proteiinseid) müofibrille;
  
• Müofibrillid võimaldavad muuta rakkude mõõtmeid
  
• Vöötlihaskude (striated muscle ) – skeletilihastes (allub tahtele)
  
• Siselihaskude –nt soolestiku ehituses; südamelihaskude
  
• Närviimpulsi toimel lihasrakud lühenevad ja koos sellega tõmbuvad kokku (kontrakteeruvad) ka lihasrakkudest koosnevad lihased
  

Närvikude – kesknärvisüsteem (pea- ja seljaaju ) ja perifeerne (e piirdenärvisüsteem: motoorsed , sensoorsed närvid, dorsaaljuure ganglionid)
Närvirakud – koosnevad rakukehast (soomast, kus rakutuum) ja pikkade jätketega :
St ühe aksoniga – signaali edasiviiva jätkega, ja paljude dendriitidega - signaali vastuvõtvate jätketega
Kesknärvisüsteem – koosneb pea-ja seljajust
Piirde (e perifeerne) närvisüsteem – ajutüvest ja seljaajust lähtuvad närvid, närvisõlmed (ganglionid)
Närvikoele on iseloomulik erutuvus ja erutuvuse (närvi-
Impulsi) juhtimine.
Närvisüsteem ühendab neuraalse regulatsiooni abil organismi ühtseks tervikuks!
Sidekude (connective tissue) ühendab elundite (organite) koostisse kuuluvad koed ühtseks tervikuks ja täidab ühtlasi kaitseülesannet
Sidekoe rakud asetsevad hajusalt, enamasti ühendab neid palju rakuvaheainet
Funktsioonid – toetada struktuure, täidab lihastevahelist ruumi, seob naha teiset organite külge
Luukude – skeleti funktsioon, toruluudel –vereloome
Kõõlused – vahendavad lihase kinnitumise luudele
Kõhr – katab toruluude otsi, andes neile elastsuse ja sileduse
Rasvkude – kaitseb siseorganeid, reguleerib kehakaalu hoemostaasu (tasakaalu)
Veri – transpordib hapniku, toitained , gaase jne, immuunsüstemmi rakke jne
Lümfikude – transpordib lümfi
Sidekude: toetab struktuure (kõhr kõrvas),täidab vahemiku lihaste vahel, nahaalusel rasval – pehmendav toime löökidele jms
Sidekoe liigid: kohev sidekude, rasvkude, kõhrkude, luukude, (veres vereplasma).
Kudede uuenemine: rakkude jagunemine, suremine ( apoptoos ), tüvirakud , diferentseerumine .
Hulkraksetes organismides on spetsialiseerunud ehk terminaalselt (lõplikult) diferentseerunud rakud (nt neuronid , nahapinna rakud) sageli jagunemisvõime kaotanud.
Kude uuendatakse tänu tüvirakkudele (stem cells), mis jagunevad assümeetriliselt – st üks tütarrakk kahest suudab edasi jaguneda, kuid teine tütarrakk asub diferetsneeruma ehk eristuma, omandades antud rakutüübile spetsiifilsied tunnused (kuju, funkstsiooni jne). Vanad rakud surevad programmeeritud rakusurma ehk apoptoosi käigus.
Rakkude juures keskonnas asuvad spetsiifilised valgulised (kasvu) faktorid ja signaalmolekulid suunavad rakkude diferentseerumist. Induktsiooni abil – näiteks lahustuv signaalmolekul indutseerivast rakust seostub tüviraku rakupinna retseptorile, mis seejärel omandab ensümaatilise aktiivsuse ja edastab signaali järgnevatele molekulidele nende ensümaatilise modifitseerimie abil (nt fosforüülimise ehk fosforo lisamise aminohapetele seriin, türosiin või treoniin ). Need omakorda modiftseerivad järgmisi valke. Signaaliülekande raja (ahela) (signal transduction pathway) viimane aktiveeritud lülivalk liigub tuuma ja osaleb antud rakutüübi funktsioneerimiseks vajalike geenide ‘’sisselülitamises’’.
Tüviraku potentsus (võime diferetseeruda eri rakutüüpideks) väheneb diferentseerumise käigus järk-järgult.
Rakkudevaheline signaliseerimine.
Milleks on vaja rakkudevahelist signaliseerimst – näiteks nelja (loomade) embrüo arengus olulise protsessi kontrollimisel (proliferation – rakkude jagunemine)
1) rakkude jagunemine
2) rakkude spetsialiseerumine / diferentseerumine
3) rakkude interaktsioonid (ehk rakk-rakk interaktsioonid)
4) rakkude liikumine
Signaale vahetavad nii ühe- kui ka hulkraksed organismid (unicellular and multicellular organism cell signaling), st nii üherakuliste organimside ses kui ka hulkraksete organismi sees selle rakkude vahel
Kõige rohkem on uuritud rakkudevahelist signaliseerimist/interaktsioone organismi sees selle eri rakkude vahel 1) organismi tekkel arengu käigus (st embrüogeneesis); 2) täiskasvanud organsmid.
Eksisteerib ka organismidevahelisi signaalide ülekannet:

Imetaja varased embrüod suhtlevad emaorganismiga emakas

Seedetraktis vahetavad bakterid signaale üksteisega ja soole epiteelirakkude ja immuunrakkudega

Pärm (haploidses olekus) võib paarituda /paarduda (mating) ja moodustada diploidse pärmiraku– paardumist initsieerib peptiidsignaal (mating factor pheromone), mida rakud vabastavad keskkonda
A) vahemaa järgi, mille tagant nad toimivad :
1)jukstakriinsed (juxtacrine) – otsene, st signaali andev ja vastuvõttev rakk kõrvuti, nii ligandmolekul signaali andvas rakus kui retseptormolekul signaali vastuvõtvas rakus on transmemmbraansed (st asuvad rakumembraanis )
2) parakriinne – signaali edastamine lühikese vahemaa taha (nt neurotransmitterid ehk sünapsites toimivad signaalmolekulid)
3) endokriinne signaliseerimine – signaali edastamine pika vahemaa taha (hormoonid – nt insuliin, kasvuhormoon ) (autokriinne (rakust vabanev rakk mõjutab sama rakku)
B) spetsiifiliste signaali edastamiseks ja vastuvõtmiseks kasutatavate molekulide järgi, mida antud signaalirajas kasutatakse (sonic hedgehog, notch, retseptor -türosiinkinaasid)
Signaaliülekande rajad koosnevad mitmest etapist, kus osaleb palju valke (efekt ‘’otse’’ – nt muutes tsütoskeleti kuju, elektrilist signaali – aktsioonipotentsiaali - neuronis või läbi mitme vaheetapi geeniregulatsiooni kaudu jne).
Geenitehnoloogia mudelorganismid.
Sebrakala, hiir, mais, lehmad , bakterid
DNA pakkimine, kromosoomide ehitus.
Kromosoom- DNA ja valgu molekulide kompleks(nukleoproteiin), milles sisalduvad geenid määravad pärilikke tunnuseid.
Kromosoomid koosnevad DNA´st ja sellele kinnitunud valgumolekulidest. Valgu molekule nimetatakse histoonideks. Kromosoomides asuvad geenid.
Replikatsioon .
Replikatsioon- matriitssüntees , mille tulemusena saadakse ühest DNA molekulist kaks ühesuguse nukleotiidse järjestusega DNA molekuli. Päristuumsetel rakkudel toimun enne mitoosi ja meioosi.. Matriitssüntees- st, et DNA , RNA ja valgud sünteesitakse olemasolevate molekulide (DNA või RNA) ahelate alusel, mis määravad sünteesitavate molekulide monomeeride järjestuse.Sel teel tagatakse geeneetilise info ülekanne.
Geen ja genoom .
Geen- DNA molekuli lõik, mis määrab ära ühe RNA molekuli sünteesi. Enamikult geenidelt toimub mRNA molekulide süntees.
Genoom- liigiomase ühekordses kromosoomikomplektis sisaldusv geneetiline materjal.
Transkriptsioon .
Transkriptsioon- matriiksüntees, mille käigus saadakse DNA molekuli ühe ahela nukleotiidse järjestusega komplementaarne RNA molekul. Transkriptsioonil saasakse mRNA, tRNA ja rRNA molekulid.
mRNA struktuur prokarüootidel ja eukarüootidel.
Bakteriaalne mRNA on reeglina polütsistroonne, st. üks mRNA kodeerib mitut valku. Valku kodeerivat järjestust nii mRNA’l kui DNA’l nimetatakse ka avatud lugemisraamiks, lühend ORF ( open reading frame ). Avatud lugemisraam on nukleiinhappe järjestus, mis sisaldab järjestikuseid aminohappeid kodeerivaid koodoneid ja mis algab initsiaator-koodoniga ning lõpeb stop-koodoniga. mRNA’d sisaldavad lisaks kodeerivale järjestusele (ORF’le) ka speisserjärjestusi. Enne (5’ poolselt) ORF’i asub liiderjärjestus ja peale viimast ORF’i on treilerjärjestus. Erinevate lugemisraamide vahel asuvad inter-tsistroonsed speisserid. Initsiatsiooniprotsessi käigus otsib ribosoom üles ORF’i alguskoha st. initsiaator-koodoni, mis on enamasti AUG. Bakteriaalsetel mRNA’del eelneb initsiaator-koodonile ribosoomi sidumispiirkond RBS (ribosome binding site).
Eukarüootide mRNA
mRNA ehitus eukarüootides on võrreldes prokarüootsete mRNA-dega oluliselt erinev:
Eukarüootne mRNA on reeglina (>90%) monotsistroonne ja kodeerib seega ainult ühte valku. Prokarüootne mRNA on reeglina polütsistroonne st. kodeerib mitut erinevat valgu molekuli (ühes mRNA molekulis on mitu ORF’i ehk avatud lugemisraami).
mRNA prosessing.
Prokarüootidel on geeni poolt määratav esmane transkript võrdne mRNA-ga ning ta on ka kohe transleeritav. Eukarüootides toimub aga esmalt eellas- ehk pre-mRNA süntees, misjärel toimub nn. eellas-mRNA protsessing küpseks mRNA-molekuliks.
Protsessimise käigus toimub enne translatsiooni pre-mRNA-lt spetsiifilise järjestuse kõrvaldamine ning transkripti mõlema otsamodifikatsioon. Enamikus eukarüootsetes geenides on mittekodeerivad järjestused e.  intronid , mis lõigatakse RNA protsessingul RNA-st välja, ühendades sellega RNA-s geeni kodeerivad järjestused ehk  eksonid . Hulkraksete intronid on reeglina palju pikemad (1500 nukleotiidi) kui eksonid (500 nukleotiidi).
Intronite väljalõikamise protsessi nimetatakse geeni splaissinguks. Kogu info introni väljalõikamise (splaissmise) kohta paikneb intronis endas. Valku kodeerivate geenide pre-mRNA splaissing peab toimuma väga täpselt, et mRNA saaks kodeerida funktsionaalset valku.Intronite täpne väljalõikamine peab toimuma nukleotiidi täpsusega, vastasel juhul läheb lugemisraam  paigast ära.
Enne splaissingut lisatakse pre-mRNA 5’-otsa 7-metüülguanosiinmüts ja 3’otsa transkriptsioonijärgselt pärast splaissingut 20–200nukleotiidi  pikkune polü-(A)-järjestus ehk polü-(A)-saba. 7-metüülguanosiinmüts aitab kaitsta kasvavat RNA-ahelat nukleaasidedegradatsiooni eest ning eukarüootide mRNA polü(A)-saba suurendab oluliselt transkripti stabiilsust ja tal on tähtis roll mRNA transportimisel tuumast tsütoplasmasse. Küpses mRNA-s on ka mittekodeerivad piirkonnad (ingl. UTR-untranslated regions) – liider (alguses, 5’ osas), treiler (lõpus, 3’ osas).
Splaissingu läbiviimiseks moodustub makromolekulaarne struktuur, mida nimetatakse splaissosoomiks. Kõik nimetatud protsessid toimuvad tuumas. Protsessitud mRNA transporditakse tsütoplasmasse, kus ta transleeritakse.  Translatsioon  on mRNA-s nukleotiididejärjestusena salvestatud informatsiooni ülekandmine aminohapete järjestuseks sünteesitava valgu molekulis. mRNA nukleotiididetriplettide vastavust aminohapetele valgu molekulis nimetatakse geneetiliseks koodiks.
Järelikult on transkriptsioon ja translatsioon eukarüootidel ajaliselt ja ruumiliselt lahutatud. Seevastu prokarüootsetes rakkudes toimuvadtranskriptsioon ja translatsioon järjestikku: sünteesitud mRNA osaleb kohe ka  translatsioonil .
Geneetiline kood.
Geneetiline kood- on vastavus, kus mRNA kolm järjestikust nukleotiidi (st. koodon ) määravad ära ühe aminohappe paigutuse valgu molekulis. Geneetiline kood on unuversaalne ja omane kõikidele orgasmidele Maal.
Translatsioon, tRNAde ja ribosoomide ehitus.
Translatsioon- valgu süntees ribosoomides. Translatsioon on mRNA põhjal ribosoomides valguahela sünteesimine ehk lihtsamalt öeldes valgu süntees. Translatsiooniprotsess loob geneetilise koodi ehk vastavuse mRNAde nukleotiidahelate ja valkude polüpeptiidahelate vahel.
Tänaseks on teada paljude tuhandete tRNA molekulide primaarstruktuur väga pajudes eri liikidest. Kõigi tuntud tRNA molekulide ruumiline struktuur on sarnane nii sekudaar- kui tetsiaarstruktuuri tasemel. tRNA molekulide pikkus varieerub tavaliselt 74-92 nukleotiidini, kuigi üksikud erandid on mõnevõrra lühemad või pikemad. tRNA nukleotiidid on nummerdatud ühtse nomenklatuuri alusel, esimene nukleotiid on 5’ otsas.
Sekundaarstruktuur on tRNA molekulidel samuti konserveerunud, mida iseloomustatakse ristikheina lehe kujuga. tRNA sekundaarstruktuuri moodustavad 4 kaksiahelalist osa (õlga) ja 4 üksikahelalist piirkonda.
tRNA molekuli otsad asuvad lähestikku, nende paardumisel tekkiv kaksiahelaline osa e. õlg kannab nime aktseptoorne õlg. Viimase pikendus on üheahelaline osa 3’ otsas, millele liidetakse estersidemega karbonüülradikaali kaudu aminohape . Aktseptor -õlg on 7 aluspaari pikk.
T-õlg on saanud oma nime modifitseeritud lämmastikaluste pärast, mis asuvad T-aasas. Need alused on ribosüültümidiin (tRNA sünteesi käigus on sellel kohal harilik U nukleotiid, mis muudetakse tümidiiniks juba tRNA koosseisus nn. post-transkriptsiooniline modifikatsioon ) ja pseudouridiin (ka pseudouridiin tekib transkriptsioonijärgse modifitseerimise tulemusena).
Antikoodon õlg on alati 5 aluspaari pikk ja nagu nimi ütleb, sisaldab antikoodon ling kolme nukleotiidist antikoodonit, mis määrab tRNA koodoni spetsiifika.
D-õlg, mis koosneb tavaliselt 4 aluspaarist ja kannab D- lingu , on saanud nime dihüdrouridiinjääkide (jällegi RNA sünteesijärgne modifikatsioon).
Lisaks neile sisaldavad paljud tRNA molekulid lisaõlga.
Valgusünteesi regulatsioon .
1. Transkriptsiooni tasandil: kui RNA-d ei sünteesita, siis translatsioon ka ei saa toimuda. Seda reguleerib repressorvalk, mis istub promootoril ja ei lase RNA-polümeraasil seostuda.
2. Translatsiooni tasandil: kui mRNA lagundatakse, siis lõpeb valgusüntees.
Ribosüümid ja RNA maailm.
Ribosüüm- ensüüm , mis ei ole valguline, aga koosneb RNA ahelatest. Sellks on näiteks ribisoom.Seda peetakse ensüümiks, sest ribosooomi koosseisu kuuluv rRNA valgusünteesi käigus sünteesib peptiididemeid aminohapete vahel.
Geeniekspressioon , selle regulatsioon.
Geeni ekspressioon : Geeni transkriptsioon (ja translatsioon).
Tüübid
a. Konstitutiivne
Geenidel, mille produkte on igas rakus igal ajal vaja (ribosoomi RNAd ja valgud, ainevahetuse ensüümid, tsütoskelett jne) = housekeeping geenid.
b. Muutuva tasemega ( induktsioon ja repressioon)
Mõnede geenide ekspressioonitase muutub vastavalt vajadusele: vastavalt välistele signaalidele või raku enda arengulisele programmile.

Geeni ekspressiooni reguleeritakse mitmel eri tasandil.
Transkriptsiooni initsiatsioon on üks tähtsamaid.
Transkriptsiooni reguleerivad:

Kindlad DNA järjestused

Regulatoorsed valgud

DNA-valk seondumise ja valk-valk seondumise mõjud

RNA polümeraas
Geeniekspressiooni regulatsioon, sarnasused ja erinevused prokarüootidel ja eukarüootidel.
a. Regulatoorne DNA järjestus
Prokarüootidel:
Operon koosneb: struktuurgeenid , promootor , operaator ja muud regulatoorsed järjestused.
Promootor-DNA järjestus, millele RNA-Pol seostub ja initsieerib transkriptsiooni.
Operaator-DNA järjestus, millele seostub repressorvalk, et kõrvalpaiknevate struktuurgeenide transkriptsiooni inhibeerida.

Regulatoorsed valgud
Prokarüootidel:

• σ-abifaktor ( sigma ): soodustab RNA-Pol seostumist kindlatele DNA järjestustele.
  
• Aktivaator: seostub DNAga, soodustab transkriptsiooni initsiatsiooni.
  
• Repressor : seostub operaatoriga ja takistab initsiatsiooni = negatiivne regulatsioon.
  

Eukarüootidel:

• Regulatoorsed valgud on transkriptsioonifaktorid (TF).
  
• TF seostudes teiste geenide cis elementidega reguleerivad nende geenide ekspressiooni: “trans- acting ” faktorid.
  

Lac ja Trp operonid, nende reguleerimise sarnasused ja erinevused.
lac operonil on nõrk promootor (ei vasta konsensusjärjestusele), madala basaalse ekspressioonitasemega.
CAP seostumissait (-60 bp).
CAP (Catabolite gene activator protein ), positiivne regulaator seostub DNAga ja cAMPga.
Trp operon
trp operon on konstitutiivne, ekspresseerub pidevalt.
trp operon kodeerib Trp (aminohape trüptofaan) sünteesiraja 5 ensüümi.
trp repressor avaldub, kuid ei seostu ise operaatoriga.
Kui [Trp] on kõrgem kui rakul vaja, moodustab repressor kompleksi Trp-ga. See seostub operaatoriga, blokeerides ekspressiooni (ja Trp sünteesi).
Cis-elemendid, trans-faktorid.
DNA järjestusi, mis mõjutavad oma läheduses paikneva geeni ekspressiooni, nimetatakse
“cis-acting” elementideks.
Transkriptsioonifaktorid seostudes teiste geenide cis elementidega reguleerivad nende geenide ekspressiooni: “trans-acting” faktorid.
DNA-valk interaktsioonid.
regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste.
mitte-kovalentsed
Rekombinantse DNA metoodika alused.
Rekombinantseks DNA-ks nim. DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA fragmendid .
Metoodika
1.Sama restriktaas (restriktsiooniesüüm) tunneb ära sama järjestuse DNA erimolekulides.
2.Restriktaas „lõikab“ DNA ahelad pooleks nii,et tekivad „kleepuvate“ otstega DNA lõigud.
3.Eri päritolu DNA lõigud viiakse lahuses kokku; ühinevad komplementaarsuse alusel; „kleepuvate“ otste vahele tekivad vesiniksidemed.
4. Ensüüm ligaasi abil ühendatakse eri päritolu DNA lõigud omavahel kovalentsete sidemetega kokku- tekib rekombinantne DNA molekul.
Restriktaasid.
Restriktaasid on ensüümid, mia lõigavad katki DNA´d. On järjestusspetsiifilised ristriktaasid ja need restriktaasid, mis lõigavd DNA ahelat suvalistes kohtades.
Restriktaasidel on omadus lôigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lôikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev.
Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) vôi siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente vôib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita.
Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”.
Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita.
Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA.
Plasmiidid .
Plasmiid - rõngas DNA molekul, mis asub bakterirakkudes. Plasmiidid sisisaldavad geene, mis on vajalikud bakteri kasvukeskkkona eripärast tulenevate ensüümide sünteesiks. need aitavad lagunadada ümbritsevas keskkonnas leiduvaid orgaanilisi aineid. See on vajalik bakteri toitumiseks, aga ka elutegevusele kahjulike ainete lagundamiseks või nende toime vältimiseks. Nii näiteks sisaldavad plasmiidid geene, mille põhjal sünteesitud valgud võimaldavad bakteritel elada antibiootikumide keskkonnas.
DNA kloneerimise etapid.
DNA kloneerimine - ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena.
Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised:
1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide);
2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga;
3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine;
4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid.
6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest.
DNA sekveneerimine .
DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus.
Polümeraasi ahelreaktsioon.
PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel , mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes.
Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust.
Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat - 8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks.
PCR pôhietapid on järgmised:

topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek);

praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks;

komplementaarse DNA ahela süntees DNA-polümeraasi toimel (72 °C juures aeg sôltub lôigu pikkusest, kuid ca 1-3 min). Ensüüm on termostabiilne ja on isoleeritud kuumavee allikates elavatest bakteritest (näit. Thermus aquaticus ja temalt saadud ensüümi nimetatakse TaqI).
Reaktsioonis kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukkleotiidid- viiakse kohe algselt ühte katsutisse. Kuna ahelreaktsiooni etapid toimuvad erineva temperatuuri juures, siis on kogu protsess juhitav temperatuuri abil ja vastavaid tsükleid vôib korrata kümneid kordi . Igas tsüklis DNA hulk teoreetiliselt kahekordistub. Praktiliselt hilisemates tsüklites on reaktsiooni efektiivsus väiksem, kuna ensüümi aktiivsus langeb, samuti lôpevad otsa vabad nukleotiidid. Neid juurde pole aga vôimalik lisada. Saadud koopiate arv ulatub aga 30 tsükli järel juba miljonitesse, mis on rohkem kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi.
PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis.
PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel.
Elektroforees .
Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektriravi üks alaliike .
Nukleiinhapete hübridiseerimine.
NH hübridiseerimine pôhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerumise fenomenil, mis seisneb selles, et teatud tingimustel denatureeritud NH ahelad on vôimelised uuesti renatureeruma ja moodustama ka vabade komplementaarsete NH ahelatega topeltahelaid.
See on vôimaldanud luua kôrge tundlikkusega meetodid spetsiifiliste NH järjestuste avastamiseks uuritavas materjalis.
Selleks kasutatakse puhastatud vôi kloonitud NH ahelate fragmente, millel on kindlaksmääratud NH järjestus ja mis on märgistatud kas keemilise markeri vôi radioaktiivse isotoobiga ( signaal ). Selliselt töödeldud DNA fragmente nimetatakse DNA sondideks (ingl. k. probes).
Sondide abil on vôimalik määrata geenide lokalisatsiooni kromosoomides, defektgeenide olemasolu, geenide talitluslikku aktiivsust määrates nende poolt produtseeritava informatsiooni RNA hulka tsütoplasmas, aga ka näiteks viirusliku RNA vôi DNA olemasolu ja lokalisatsiooni kudedes ning rakkudes.
NH hübridiseerimise eri juhuks on ka sellised meetodid nagu Southern blotting ja Northern blotting ("lõuna" ja "pôhja" märgistamine). E.M. Southern töötas välja meetodi DNA fragmentide kindlakstegemiseks agaroosgeelis.
Restrikataasi abil lôhustatud kaksikahelalise DNA fragmentide elektroforeetilise lahutamise järel denatureeritakse DNA topeltahelad üksikahelateks NaOH abil. Denatureeritud ahelad kantakse üle nitrotselluloos kilele. Kile viiakse sondi sisaldavasse lahusesse. Sond hübridiseerub vastava üksikahelise DNA fragmendiga ja tema asukoht elektroforegrammil on vôimalik kindlaks määrata, kuna sond on märgistatud.
Northern blotting'iks nimetatakse RNA fragmentide määramist samal meetodil.
Kromatograafia valkude puhastamisel.
Valkude eraldamine kromatograafiliselt (st puhta või rikastatud valgu eraldamine bioloogilistest materjalist (taimeleht, organell, aju, rakukultuur, bakterimass) ‘’segudest’’’ – nt lüüsitud rakkudest/kudedest)

Segu lahustatakse vedelikus - nn ‘’mobiilne faas’’, mis voolutatakse (flow) läbi nn ‘’statsionaarse faasi’’.

Segu (mixture) eri koostisosad constituents liiguvad erinevad kiirusega ja nad lahutatakse üksteisest

Eraldus põhineb liikuva faasi erinevate koostisosade erinevas ‘’külgejäämises’’ statsionaarsele faasile.
Preparatiivne -uuritava valgu puhastamiseks segust – et puhastatud materjali edasisteks analüüsideks kasutada
Analüütiline – et kindlaks teha uuritavate koostisosade olemasolu ja või suhtelisi proportsioone segus
Valkude struktuuri ja funktsiooni (valk-valk interaktsioonide) uurimise meetodid.
VALK-VALK interaktsioonid: enamasti tänu paljudele MITTEkovalentsetele sidemetele valkude vahel (3-D konformatsioonid sobituvad nagu ‘lukk-võti.
Valkude analüüsi näiteid:
valkude ja valk-valku interaktsioonide (koostöö – protein-protein interactions) detekteerimise (ehk tuvastamise) ja analüüsi meetodid (sh geenitehnoloogiliste meetoditega)
In vitro (katseklaasis) bioloogilise protsessi või molekuli analüüs väljaspool organismi ;
+ võimalik uurida puhastatud valke suures koguses (3d struktuuri analüüs, ensüümide
kineetikat (reaktsioonikiirust), valk-valk või dna-valk ja rna-valk interaktsioone (koostööd) jne
+ katsed kontrollitud tingimustel;
- võimalik, et uuritav molekul käitub väljaspool organismi erinevalt (nt organismis on lisafaktorid, mis molekuli lahutamise järel oma partneritest on eemaldatud)
In vivo : bioloogilise protsessi või molekuli analüüs organismi (või raku) sees
+ uuritava molekuli füsioloogiline konteksti pole muudetud
- tehniliselt komplitseeritud ja kallis
Antikehade ja liitvalkude kasutamisvõimalusi.
Flourentsmikroskoopia:
Väga laialt on levinud rakubioloogias nn. immuunfluorestsentsi meetod, mis põhineb fluorestseeruvat värvainetega konjugeeritud antikehade kasutamisele. Enamlevinud fluorokroomidena antikehade märgistamiseks kasutatakse FITC (fluorestsiin-isotiotsüanaat), TRITC (tetrametüül-rodamiin- isotiotsüanaat ) PE (fükoerütriin) jt. Fluorestsentsmikros-koobis on valgusallikaks elavhõbedalamp, mis annab lühilainelist kiirgust (paljudel lainepikkustel).
Immuunfluorestsents:
Elavhõbedalambiga valgustatakse helendavate värvainetega märgistatud antikehasid.
Epitope tagging – märgitud liitvalkude ( fusion proteins) tehnoloogia . Liidesega valk ehk liitvalk (näiteks lisatakse uuritvale valgule – täpsemalt seda kodeerivale dna-le fluorestseeruva valku nagu green fluorscent protein - gfp kodeeriv dna või peptiide järjestuse (kuni 8-12 aminohapet, nt flag, muc, v5, e2 (tartus välja töötatud!) Dna, nende tag’ide äratundmiseks on olemas kommertsiaalselt saadaval antikehad.
Niisugust ‘’tägitud’’ valku kodeeriv cdna viiakse tootmiseksbakteri- või eukarüootsetesse rakkudesse. Epitoop –immunoloogias see osa (uuritavast) valgust, mida (spetsiaalselt katseloomas toodetud) spetsiifiline antikeha (ka valk) ära tunneb.
Transgeensete/ geneetiliselt muundatud organismide tootmine ja kasutamisvõimalusi.
Transgeensed organismid ehk GMO-d ehk geneetiliselt muundatud organismid on elusolendid, sh. taimed ja ka nendest saadud tooted, nt. loomasööt , kelle pärilikkuse ainele ( geenidele ) on biotehnoloogiliste meetodite abil kunstlikult lisatud teiste elusolendite pärilikkuse ainet või kelle pärilikkuse ainet on muul viisil nüüdisaegse geenitehnoloogia abil muudetud.
Transgeneesi puhul sisestatakse võõr-DNA embrüorakkudesse, millele järgneb sisestatud DNA insertsioon peremeesraku kromosoomidesse. Embrüorakkudena kasutatakse kas viljastatud munarakke või siis väga varasest embrüost pärinevaid rakke.

• Kui võõr-DNA integreerub viljastunud munarakku kromosoomidesse, siis on saadud loom täiesti transgeenne , sest kõik tema tuumaga rakud peaksid sisaldama transgeeni.
  
• Kui integratsioon kromosoomi toimub hiljem, siis on antud loom mosaiikne, st. mõnedes rakkudes on transgeen ja mõnedes mitte.
  

Geenitehnoloogia abil on juba praeguseks konstrueeritud suur hulk uute omadustega baktereid, taimi ja loomi, kes toodavad bioloogiliselt aktiivseid aineid: mitmesuguseid raviühendeid, nagu näiteks kasvufaktoreid, verehüübimisfaktoreid, peptiidseid ravimeid, antikehi jms.
Viiruste peamised klassid ja omadused.
BakteriofaagidDNA- viirused , RNA-viirused, DNA-ja RNA-viirused.
Viirused on eluta ja elusa looduse piirimail olevad rakulise ehituseta ainult elusrakkudes paljunevad bioloogilised objektid.
Viirus on rakuta moodustis , tema koostises on vähemalt:

• genoom (nukleiinhape- DNA või RNA)- nikleiinhaped säilitavad pärilikku info. Viirusel peab olema vähemalt kolm geeni
  
• kapsiid (valgud)- kaitseb genoomi keskkonnamõjutuste eest ja aitab viiruse genoomi peremeesrakku.
  

Nendele võib lisanduda ümbris, mille viirus rakust väljudes kaasa võtab. St. viiruse ümbris koosneb rakumembraani koostisosadest : lipiitidest ja valkudest. Kapsiid ja ümbriis on genoomi kaitseks, aga ka viiruse rakku tungimise tagamiseks ( taku äratundmiseks). Viiruse ümbrise pinnal on valgus, mis käituvad signaalidena. Kui raku membraani pinnal plevad valgud seonduvad viiruse valkudena, siis rakk arvab , et see on mingi signaal ja viirus viiakse raku sisse..Siis viirus alustab raku sees oma tegevust.
HIVi molekulaarbioloogia
HIV on retrovirus ehk RNA-viirus.
HIVi genoom on veidi alla 10 kb suurune.
HIVil on kolm ühisgeeni:
gag- määrab kapsiidvalgu
pol- määrab transkriptaasi, integraasi ja ribonukleaasi.
env- determineerib viiruse ümbrises asuva glükoproteiini.
Inimese retroviirus HIV infitseerib immuunsüsteemi rakke ja põhjustab eluaegse haigestumise AIDS´i.
Inimese HIVi elutsükkel
Viirusvalk gpe20 ja raku CD4 retseptorvalk interakteeruvad ja viirus saab tungida rakku. Pöördtranskriptsioonil sünteesitakse viiruse dsDNA, mis integreerub raku DNA-ga. Viiruse dsDNA-lt sünteesitakse viiruse ssRNA , mis liigub peremeesraku tsütoplasmasse, kus teda transleeritakse ja kasutatakse uute viirusosakeste assambleerimisel. Viirusosakesed väljutatakse rakust ja kaetakse rakumembraaniga.
HIV nakkuse epidemioloogia ja mehhanismid .
Põhjalik informatsioon:
http://www.kliinikum.ee/infektsioonikontrolliteenistus/doc/oppematerjalid/IV/HIV%20prax.pdf
HIV-vastase ravi võimalusi.
• HIV-infektsiooni spetsiifiline ravi seisneb viiruse replikatsiooni pidurdamises ja seega
immuunsüsteemi funktsiooni säilitamises
• Ravi eesmärgiks on viiruse hulga vähenemine alla laboratoorselt määratava taseme ning immuunrakkude (CD4- lümfotsüüdid ) arvu suurenemine
• Ravi alustamise kriteeriumiks on kliiniline sümptomaatika ja CD4-lümfotsüütide ning
viiruste hulk (RNA koopiat /ml)