Rakubioloogia teine kursus kordamine (0)

1. Eukarüootide ja prokarüootide põhilised erinevused.

• Prokarüootsed ( eeltuumsed ) – bakterid ja arhed , rakutuumata, esineb ainult üks kromosoom , rõngas, superspiraliseerunud. Geenide hulk 400 – 4000. Rakkudel esineb rakusein, mis koosneb peptidoglükaanidest. Vastavalt rakuseina ehitusele toimub jaotus Gram (+)(ainult ühe membraanikihiga) ja Gram (-) (raku seina peal täiendav membraan , membraanide vaheline ala – periplasmaatiline ala) bakteriteks. Bakteritel esinevad rakumembraani sissesopistused mida nim mesosoomideks. Mesosoomid on seotud DNA sünteesi ja valkude sekreteerimisega. Prokarüootsel rakul võivad esineda väljakasvud. Kui need on lühikesed, siis neid nim pili’deks ja need on vajalikud pinnaga seostumiseks. Suuremad väljakasvud kannavad nime viburid (flagella) ja on olulised liikumises. Bakterite viburid erinevad eukarüootide viburitest. Ei sisalda mikrotorukesi. On raku pinnaga seotud valgust koosneva rõngaste struktuuri vahendusel. Bakterid võivad olla väga vastupidavad ebasoodsatele keskkonnatingimustele, moodustades endospoore – rakusiseseid tugeva kestaga moodustisi, milles tsütoplasma on dehüdreerunud. Aktinomütseedid on hargnevate rakkudega bakterid, mis produtseerivad näit streptomütsiini.
  
• Eukarüootsed – rakutuumaga. Tuumas paikneb DNA, mis on muust raku sisaldusest tuumamembraaniga eraldatud. Rakud on ruumalalt ~1000 korda suuremad kui prokarüootsed rakud. Lisaks tuumale ka teised organellid – mitokondrid , kloroplastid , lüsosoomid, endoplasmaatiline võrgustik (ER), Golgi kompleks jt. Eukarüootsetes rakkudes esinevad ka mittemembraansed võrkjad moodustised, nn tsütoskelett. Tsütoskelett annab rakule vormi ja osaleb organellide ja rakkude liikumises. Info selle kohta, milliseid valgu molekule rakk on suuteline sünteesima, paikneb DNA koostises ja info liigub valgu sünteesil ribosoomidesse mRNA vahendusel. (DNAmRNAvalk). DNA hulk haploidses rakus on 107 – 1011 bp. Suurem osa DNA-st mittekodeeriv (inimesel 98,5%). Eukarüootse raku DNA ( genoom ) on jagunenud erinevate kromosoomide vahel, mis on tuumas nähtavad ainult mitoosi ajal.
  

2. Rakutuum. Valgusmikroskoobis on ta kõige paremini nähtav raku osa. Hōlmab ca 10% raku kogu ruumalast, sinna on koondunud peaaegu kogu rakus olev DNA.
Tuumaümbris (tuuma lamiinid , tuuma poori kompleks, perinukleaarne ruum). Tuum on ümbritsetud kaksikmembraaniga, millest välimine membraan on otseses ühenduses tsütoplasmavõrgustiku membraaniga.Tuuma sise- ja välismembraani vahelist osa nim perinukleaarseks ruumiks. Sarnaselt tsütoplasma võrgustikuga võivad tuuma välismembraanile kinnituda ribosoomid . Tuuma sisemise membraani sisepinnal on ōhuke kiht nn. tuuma lamiine. Need on valgud , mis kuuluvad intermediaarseid filamente  moodustavate valkude hulka. Lamiinid toetavad tuuma sisemist membraani seestpoolt. Rakutuumas paiknev kromatiinaine on lamiinide vahendusel seotud tuumamembraani sisepinnaga. Väljastpoolt on tuum ümbritsetud intermediaarsete filamentide vōrgustikuga. . Tuuma ümbrises on teatud vahemikega spetsiaalsed struktuurid , nn. tuuma poori kompleksid  ( nuclear pore complex- NPC), mis on moodustunud oktagonaalselt organiseeritud teatud kindlatest valkudest (nukloepoorid). NPC-s osalevaid valke arvatakse olevat 60- 100 erinevat, üks poorikompleks koosneb ca 1000-st valgumolekulist.Tuumapoori valgud seovad tuumapoori servadel tuuma sise- ja välismembraani kokku. Vaatamata sellele ei difundeeru sisemembraanis olevad molekulid välismembraani ja vastupidi, ning sise- ja välismembraan jäävad oma koostiselt distinktseks.
Tuuma ja tsütoplasma vaheline ainete transport. Tuuma ja tsütoplasma vaheline ainete transport käib tuuma pooride kaudu. Transort läbi NPC on kas passiivne difusioon ( ioonid , väikesed valgumolekulid) või aktiivne transport, mis vajab energiat ning teatud lubava signaali olemasolu. Iga üksik NPC toimetab nii importi kui eksporti.
Rakutuumas sisaldub peale DNA suur hulk valkusid ( histoonid , DNA- ja RNA polümeraasid, geeni regulaatorvalgud, jne.), mis sünteesitakse tsütoplasmas ning mis peavad pääsema tuuma. Samal ajal on terve hulk makromolekule ning neist moodustunud supermolekulaarseid komplekse, mis sünteesitakse tuumas, kuid mis funktsioneerivad tsütoplasmas (mRNA, tRNA, ribosoomide subühikud). 
Passiivne ja aktiivne transport läbi tuuma pooride. Valkude transport tsütoplasmast tuuma. Tuuma lokaliseerumise signaal (NLS) ja seda äratundvad faktorid tsütoplasmas (importiin). Läbipääsuloaks raku tuuma pääsemiseks on valkudel teatud aminohappeline järjestus, mis sisaldab tavaliselt positiivselt laetud aminohappeid Lys ja Arg . Seda järjestust nim. nukleaarse lokalisatsiooni signaaliks (NLS), NLS võib valgul paikneda ükskõik millises kohas. Info NLS järjestuse jaoks on kodeeritud vastavas geenis. Eukarüootne rakk määrab oma geenide poolt mitte ainult valgu struktuuri, vaid ka koha, kus valk rakus peab paiknema. Laias laastus on NLS järjestusi kahte tüüpi: lühike 4-7-st aluselisest aminihappest koosnev järjestus või pikemad kaheosalised NLS-id, mis koosnevad 2-st aluseliste aminohapete blokist, mida eraldab ca 10 aminohapet. Valgu transport läbi tuumapooride on temperatuurist sōltuv ning ATP hüdrolüüsi vajav protsess. Kõik valgud ei pea tuuma pääsemiseks olema varustatud NLS- ga. See sõltub valgu suurusest . Alla 5000 Da molekulmassiga molekulid läbivad tuumapoore ilma mingi takistuseta. Üle 60 000 Da molekulmassiga valk ei suuda aga ilma NLS-ta tuuma siseneda. Väikesed valgud ja ioonid läbivad NPC pidevalt avatud keskkanalit (9 nm). NLS-ga varustatud valgud aga põhjustavad keskkanali ajutist laienemist kuni 26 nm-ni. NLS järjestust ei lõigata pärast tuuma sisenemist valgu küljest ära, pärast seda kui valk on tuuma transporditud. Pōhjuseks see, et NLS-i läheb korduvalt tarvis. Kui rakk alustab mitootilist jagunemist, siis tuumamembraan lahustub ning tuumavalgud satuvad taas tsütoplasmasse. Kui tütarrakkudes formeerub uus tuumaümbris, siis on vaja tuumavalgud tsütoplasmast taas kokku korjata. Importiin on valk, mis tunneb ära NLS-i. See valk koosneb kahest subühikust, mida tähistatakse a ja b . Esimene neist seostub vahetult NLS-ga, b -subühik aga aitab seostuda tuuma poori kompleksiga. Importiini mõlemad subühikud transporditakse kompleksis ‘laadungiga’ tuuma, kus see kompleks laguneb ning importiini subühikud saadetakse tuumast tsütoplasmasse tagasi.
Valkude ja RNA-de eksport tuumast. Ka valgu väljumisel tuumast on vajalik teatud signaaljärjestuse olemasolu, mis erineb aga oluliselt impordiks vajalikust NLS-järjestusest. Ekspordi signaali on hakatud tähistama NES (nuclear export signal ). Tuuma ekspordi signaalina toimivad järjestused, kus hüdrofoobsed aminohapped (Leu ja Ile) esinevad teatud kindlas asetuses. On teada ka vastav retseptorvalk , mis analoogselt importiinile tunneb ära ekspordi järjestust ning aitab valgud tuumast välja – eksportiin.
Miks on rakule kasulik hoida DNA eraldatuna valgusünteesiaparaadist? Kuigi pole lõplikku vastust küsimusele, miks selline kompartmentaliseeritus on vajalik, võib oletada, et valkude ja RNA vahetuse kontroll tuuma ja tsütoplasma vahel vōimaldab täiendavat geeni ekspressiooni ja DNA replikatsiooni kontrolli.
3. Tuumakese ehitus ja funktsioonid. Elektronmikroskoopiliselt eristatakse tuumakeses 3 eri piirkonda: 1) fibrillaarne tsenter , sisaldab DNA-d mida parasjagu ei transkribeerita; 2) tihe fibrillaarne komponent, sisaldab sünteesitavat RNA-d; 3) granulaarne komponent, sisaldab formeeruvaid ribosoomi partikleid. Tuumakeses toimub ribosoomi subühikute formeerumine rRNA-st ja valkudest.
Tuumakese organisaator (NOR), ribosoomi subühikute formeerumine RNA-st ja valkudest. Tuumake moodustub ribosomaalse RNA (rRNA) geene sisaldavate kromosoomilõikude ümber. Vastavat kromosoomi osa, kus see geeniklaster paikneb, nim. tuumakese organisaatori piirkonnaks (NOR). Inimese genoomis leidub NOR 5-l eri kromosoomil (13.,14.,15.,21. ja 22. kr.). NOR- d paiknevad kromosoomide lühikeste ōlgade otstes . Seega inimese diploidses rakus olevas tuumakeses on vastav DNA pärit 10-st kromosoomist, s.t. 10 kromosoomi NOR-d osalevad tuumakese moodustamisel. Kokku on inimese genoomis ca 200 rRNA koopiat, mis on tandeemselt organiseerunud. Iga rRNA geen annab ühesuguse transkripti, mis on tuntud kui 45S RNA. Sellest tekib edasise protsessingu teel 3 erinevat RNA-d (28 S, 5.8 S ja 18 S RNA), mis lähevad ribosoomi kas suure vōi väikese subühiku koosseisu. Nende 3 RNA pärinemine ühest transkriptist kindlustab selle, et neid saab vōrdsel hulgal.
Tuumakeste arv ja suurus. Tuumakese suurus peegeldab tema aktiivsust ja ta varieerub oluliselt erinevates rakkudes ning muutub ka ühes ja samas rakus rakutsükli eri faasides . Tuumake on väga väike neis rakkudes, kus elutegevus on väga aeglane (sünteesiprotsessid aeglased) kuid võib hõlmata kuni 25% tuuma ruumalast neis rakkudes, kus toimub intensiivne valgusüntees.
4. Kromatiin ja kromosoomid . Kromatiini all mõistetakse rakutuumas olevat DNA-d, mis on seotud valkudega. Rakus kahes eri seisundis: 10% aktiivne (sisaldab DNA-d, mida atud rakus transkribeeritakse) ja 90% inaktiivne. DNA-ga seonduvaid valke on laias laastus kahte sorti: struktuursed ja regulatoorsed. Kõige paremini on uuritud struktuursed valgud histoonid, mis esinevad kõigil eukarüootidel. Histoonid on suhteliselt väikesed valgud suure hulga positiivselt laetud aminohapetega (Lys, Arg). Histoone on 5 tüüpi, mis jagunevad kahte rühma: nukleosoomsed histoonid (H2A, H2B, H3, H4) ja histoon H1.
Inimese haploidne genoom sisaldab ca 3 miljr. nukleotiidi paari, mis on jagatud 24-ks kromosoomiks (22 erinevat autosoomi ja 2 erinevat sugukromosoomi).
Histoonid ja DNA nukleosoomne struktuur. DNA pakkimine kõrgema järgu struktuuridesse. Kõikides eukarüootides on DNA kaksikahela esimeseks kõrgemaks organiseerituse astmeks nn. nukleosoomne struktuur. Nukleosoomi südamiku moodustavad nukleosoomsed histoonid, mida on igat molekuli 2 eksemplari, seega on nukleosoomi südamikus kokku 8 histooni molekuli. Übmer nukleosoomi südamiku on keerdunud 166bp pikkune DNA lõik. Kahe nukleosoomi vahele jäävat DNA lõiku nim. linker -DNA-ks, sinna seondub histoon H1, mis vastutab DNA pakkimise eest järgmisse kõrgema järgu struktuuri (30 nm kiud). Suur osa kromatiini rakutuumas ongi kokku pakitud kõrgema järgu struktuuridesse.
Heterokromatiin. Aktiivne ja inaktiivne kromatiin. Osa inaktiivsest kromatiinist on rakutuumas tugevasti kokku pakitud ja moodustab nn. heterokromatiini. Heterokromatiinis on kromatiin pakitud kõrgema järgu struktuuridesse. Heterokromatiin lokaliseerub tuuma ümbrise läheduses ja paistab elektronmikroskoobis hästi tumedana. Molekulaarbioloogilised uuringud on näidanud, et enamik heterokromatiini koostises olevat DNA-d on kõrgkordus DNA, mida praktiliselt üldse ei transkribeerita. Aktiivne kromatiin erineb ülejäänust selle poolest, et ta pole nii tugevasti kokku pakitud ning seetõttu on ta kergemini kättesaadav nukleaasidele (DNase I). Ta erineb ka biokeemiliselt muust kromatiinist.
Barr ’i kehake. X-kromosoomi inaktivatsioon . Kõikide emaste imetajate teine X-kromosoom kondenseerub ning seal olevad geenid inaktiveeruvad. X-kromosoomi inaktiveerumine algab kromosoomi kindlast piirkonnast , inaktivatsiooni tsentrist, ja see levib lineaarselt üle kogu kromosoomi. X-kromosoomi kondenseerumine toimub praktiliselt kõikides emaslooma somaatilistes rakkudes ning see on nähtav rakutuumas tumeda, tuuma membraani läheduses paikneva struktuurina, mida nim. Barr'i kehakeseks. X-inaktivatsioon toimub varajases embrüonaaleas. Kumb X-kromosoom inaktiveerub, kas isalt (Xp) või emalt (Xm) pärinev, see toimub juhuslikult. X-inaktivatsioon pole siiski täiesti pöördumatu. Meioosi läbimisel reaktiveeritakse kondenseerunud X-kromosoom ning tekkinud munarakkudes on nii isalt kui emalt päritud X-kromosoomid jällegi vōrdselt aktiivsed.
Kromatiini struktuur ja geenide ekspressioon. Lihtsustatud mudeli järgi struktuursed valgud ja transkriptsioonifaktorid konkureerivad DNA-ga seostumise suhtes, kusjuures struktuursed valgud takistavad nendega seoses oleva DNA kättesaadavust transkriptsiooni masinavärgile. Kui in vitro tingimustes lisada DNA-le histoone, et moodustuks nukleosoomne struktuur, surutakse transkriptsioon alla. Eriti tugevalt mõjub H1 lisamine. Aktiivselt transkribeeritavad geenid on nõrgalt seotud H1-ga või see puudub hoopis. Teatud piirkonnad kromosoomides (DNA ahelas) on nukleosoomi-vabad ning vastavad geeni regulaatorpiirkondadele.
Kromatiini struktuuri muutused rakutsüklis. Kui rakk alustab mitootilist jagunemist, kondenseerub kromatiin ning individuaalsed kromosoomid muutuvad valgusmikroskoobis nähtavaks. Peale mitoosi lõppu kromatiin dekondeseerub uuesti. Kondenseerumine-dekondenseerumine on täpselt reguleeritud, kusjuures oluline on H1 pöörduv fosforüleerumine.
Kromosoomide ehitus ( tsentromeer , telomeerid , replikatsiooni alguspunkt). Selleks, et kromosoom saaks säiluda ühest raku jagunemisest teise, peab ta sisaldama järgmisi funktsionaalseid piirkondi: tsentromeer, kaks telomeeri, replikatsiooni alguspunktid
Tsentromeer on kromosoomi unikaalne järjestuselement. Tsentromeeri ülesanne on hoida koos tütarkromatiide kuni mitoosi anafaasini (või meioosi II jagunemise anafaasini). Tsentromeeri külge moodustub jagunevas rakus spetsiaalne valguline struktuur - kinetohoor. Selle külge kinnituvad omakorda mikrotuubulid , ning saab toimuda kromosoomide lahknemine anafaasis.
Telomeer on kromosoomi otstes leiduv järjestuselement. Telomeerid võimaldavad kromosoomide replitseerimise kogu ulatuses. Telomeeridega on arvatavasti seotud nn. “kellamehhanism”, mis takistab kõrgemate organismide normaalsete rakkude piiramatut jagunemist. Iga jagunemistsükliga jäävad telomeerid järjest lühemaks(telomeerseid järjestuselemente ei lisata 3’ otsa juurde) ning teatud kriitilisest piirist alates raku jagunemine seiskub. Need rakud, mis peavad aga organismis kogu aeg paljunema (näit. idurakud, vereloome tüvirakud) lahendavad küsimuse sellega, et neis aktiveeritakse ensüüm telomeraas . See uuendab pidevalt telomeere.
Replikatsiooni alguspunkt - See on teatud järjestuselement kromosoomis, kust algab DNA replikatsioon . Replikatsiooni alguspunkte on võimalik nähtavaks muuta. Sellisel moel on näha, et ühel kromosoomil liigub palju replikatsiooni kahvleid. Peale selle on näha, et osa replik. alguspunkte paikneb tihedasti koos, klastritena, teatud piirkondades DNA molekulis, kromosoomi teistes osades nad aga puuduvad.
5. Tsütoplasma võrgustik (TV). Tsütoplasmavõrgustik e. endoplasmaatiline retiikulum (ER) on ühekordse membraaniga ümbritsetud terviklik kompartment, mis on iseloomulik kõigile eukarüootidele. ER-i membraan moodustab üle poole kogu raku membraanistikust. ER mängib keskset osa biosünteesiprotsessides. ER-i membraanis paiknevad ensüümid, mis sünteesivad kõikide teiste rakuorganellide membraanides vajaminevaid lipiide ja kolesterooli. Samuti toimub seal steroidhormoonide süntees, detoksifitseeritakse mitmeid kahjulikke aineid, modifitseeritakse sünteesitud valke. ER-i membraan ja valkude süntees on omavahel olulisel määral seotud, nimelt ER-i membraan seob ühe osa ribosoomidel sünteesitud valke.
Valkude kotranslatsiooniline