Molekulaarbioloogia praksi kontrolltöö vastused (0)

Kordamisküsimused 1. prax :

• Mis on rakuliin ja rakkude primaarkultuur , mille poolest erinevad?
  

Primaarne rakukultuur on otseselt koest eraldatud rakkudest koosnev ja piiratud jagunemisvõimega kloon . Rakuliin on imortaliseeritud kloon, mis on võimeline paljunema/ jagunema piiramatult. Immortaliseeritud liine saab kas iseeneslike mutatsiooni tagajärjeliste transformatsioonide kaudu, ka eraldades rakke kasvajatest. Tekitada kunstlikult telomeraasi sisseviimisel rakku. Rakuliin sageli aneupolidne- kromosoomide arv normaalsest erinev (tavaliselt suurem). Eri rakutüübid transformeeruvad eri sagedusega, suured liikidevahelised erinevused.

• Milleks on söötmesse lisatud seerum , antibiootikumid ja aminohapped ?
  

Et rakud end hästi tunneksid. Seerum-keskkond + mitogeenid=kasvufaktorid ja muud proliferisatsiooniks vajalikud substansid. Antibiootikumid-et bakterid vohama ei hakkaks , meie rakud olid antibiootikumile resistentsed ( vist ). Aminohapped- loomarakk ei ole võimeline kõiki ah ise sünteesima.

• Milline on seerumi keskkond, kas seerum on puhverdatud lahus?
  

Seerumi keskkond võiks olla neutraalselähedane (pH 7,2- 7,4) Puhverdatus küsitav....
Serum- watery fluid of the blood that resembles plasma but contains fibrinogen.

• Millised tingimused on vajalikud loomarakkude kasvatamiseks kultuuris, miks nad peavad olema just sellised?
  

Loomsed rakud vajavad rikastatud söödet: essentsiaalsed aminohapped (Lys, His, Leu, Ile, Met, Phe, Thr, Trp, Val; Cys, Glu, Tyr), Kasvufaktoreid, Vitamiine, Seerumit,(Kinnitus maatriksit (ECM kinnituseks ) koosneb kollageenist, hüaluroon happest ja teistest ECM valkudest). Osad võivad kasvada ka 3D geelis ja suspensioonis.

• Mida nimetatakse transfektsiooniks, milliseid alternatiivseid meetodeid saab kasutada?
  

Transfektsioon on võõra DNA viimine rakku.
Keemilised meetodid.
Kaltsiumfosfaadi meetod, DEAE dekstraan
Füüsikalised meetodid. Mikroinjektsioon ja elektroporatsioon
Membraanide fusioonid. Liposoomid, katioonsed lipiidid ja DNA kompleks lipofektsioon
(DNA) konstrukti sisestamine viiruste abil. DNA viirused = näit. SV 40 (simian virus ) pôhinevad vektorid

• Mis on GFP, milliseid konkreetseid ekspresioonikonstrukte praktikumis kasutati?
  

GFP- green fluoroescent protein , GFP võib funktsioneerida kui proteiin tag, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents-efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav.Ekspressioonikonstruktid olid plasmiidid GFP järjestuse ja erinevate signaalidega, mille tõttu ekspresseerus GFP erinevates rakupiirkondades. PEI – polüetüleenimiin – pakib DNA kokku ja interakteerub membraaniga ja difundeerub läbi membraani.

• Kas transfekteeritud DNA integreerub genoomi v on rakus episomaalselt?
  

Võõras DNA ei lähe genoomi koosseisu, sest on tsirkulaarne. Enne tuleks lineariseerida. Lisaks GFP-le peavad olema antibiootikumide resistentsusgeenid- nii saab rakke ära tunda.

• Kas saab transfekteerida ka lineaarset DNA molekuli?
  

Saab, aga see on juhuslik ja väikese efektiivsusega.

• Lisaks GFP-le teised liitvalgu tag’id
  

His-tag- 6-8 his jääki
Flag-tag
GST-tag

Kordamisküsimused 2.prax:

• Mida nimetatakse diferentseerumiseks? Mis on raku arengupuu ja kus selles asuvad terminaalselt diferentseerunud rakud?
  

Diferentseerumine tähendab geenide valikulist ekspressiooni. Ühe organismi kõik rakud, vaatamata nende väga erinevale diferentseeritusele, omavad ühesugust genoomi (eranditeks on erütrotsüüdid, B-lümfotsüüdid). Rakkude diferentseerumise käigus muutub geenide ekspressiooni tase ja muster (ka splaising ). Diferentseerunud rakud sisaldavad sama genoomi, nende proteoom aga on erinev. Seetõttu erinevad need rakud nii funktsionaalselt kui morfoloogiliselt jagunevatest, arenguliselt primitiivsematest rakkudest.
Raku arengupuu:?
... Determineeritud tüvirakk -> päritolu- seoseline (commited) tüvirakk -> amplifitseeruvad rakud -> end cells. kolm esimest on progenitorid e. eellasrakud, mis jagunevad

• Milleks kasutatakse kultuuris hoitavate rakkude diferentseerimist?
  

Rakuteraapiaks
päris suur kasutusala, kuid enamus veel seisab hüpoteetilistel väljunditel, kuna loodetakse, et vahendite paranedes muutuvad paljud ravimata haigused ravitavateks. Kultuuris hoidvate embrüoa rakke on võimalid diferentseerida paljudeks raku tüüpideks. Neid on väga kasulik kasutada geneetiliselt muundatuid hiiri ja terapeutilist tuleviku võimalust ntx Alzheimeri ja Parkinsoni puhul.

• Mida iseloomustab tüvirakkude arenguline potentsus?
  

Enamik diferentseerunud rakkudest ei jagune kuid nad ei ole siiski asendamatud. Paljudes kudedes osa rakke pidevalt vananeb ja hävib ning need asendatakse uutega. Kuigi väga paljud diferentseerunud rakud pole küll ise enam jagunemisvõimelised, on siiski võimalik neid juurde tekitada. See toimub tüvirakkude abil. Tüviraku all mõistetakse selliseid rakke mis: ei ole ise terminaalselt diferentseerunud võivad piiramatult jaguneda (vähemalt organismi eluea jooksul) säilitavad ise oma populatsiooni, s.t. jagunemisel tekkinud tütarrakkudest osa jääb edasi tüvirakkudeks, osa aga alustab lõplikule diferentseerumisele viivat rada.Tüvirakku vajatakse seal, kus on pidev tarvidus diferentseerunud rakkude järele, mis ise ei ole jagunemisvõimelised. Kuigi tüvirakk on lõplikult diferentseerumata , on ta siiski determineeritud - ta saab diferentseeruda ainult teatud kindlates suundades (tema arengupotentsiaalid on piiratud). Neid tüvirakke, mis annavad ainult üht tüüpi diferentseerunud rakke, nimetatakse unipotentseteks ( epidermise tüvirakud, skeletilihase satelliitrakud e. müoblastid, spermatogoonid). Kui üks tüvirakk annab alguse mitmetele rakutüüpidele, nimetatakse teda pluripotentseks. Tüüpiline pluripotentse tüviraku näide on vereloome tüvirakk.

• Kas on looduses esineb erinevate diferentseerunud raku tüüpide vahelisi üleminekuid? Too näiteid.
  

Üldiselt mitte, aga…

• Mis on retinoolhape? Kuidas retinoolhape mõjutab rakku ( retseptorid , tsütoplasmaatilised RA- siduvad valgud , TRIP kompleks; cis-elemendid)?
  

Retinoolhape- Vitamiin A derivaat .
Retinoic acid (RA) is a powerful morphogen, bound by a family of cytoplasmic RA receptors (RAR) which with bound RA translocate into the nucleus and bind DNA. This mechanism is similar to that seen with steroidal hormones and their receptors. The RAR has 3 domains: N- terminal , DNA-binding and C-terminal RA binding domain .
Retinoolhape indutseerib mitmeid kasvufaktoreid ja ka protoonkogeene.
Vitamiin A :(retinool): organismile tasakaalu ja kaitset pakkuv antioksüdant, tagab silmade, limaskesta ja maksa tervise, vajalik luukoe , hammaste ja kõhrede arenguks, oluline spermatosoidide ja platsenta arenguks ja rakkude ehituseks kasvavale organismile.
Retinoic acid is a derivate of vitamine A and a member of the steroid supefamily. Retinoic acid activates a unique class of transcription factors -
retinoid receptors- that modulate the expression of a number of target genes . Peptide hormone provide another class of inuctive signals , including those that belong to the fibroblast growth factor (FGF) and transforming growth factor(TGF) families . Ano
their petide hormone essential for neural induction is sonic hedgehog(shh). These molecules, like retioic acid are produced by a variety of embryonic tissues including the notochord the floorplate, and the neural ectoderm
itself, they bind to cell surface receptors, many which are protein kinases.
Retinoic acid (RA) may act as a regulator of differentiation at various stages of vertebrate embryogenesis. In particular , the results of exogeneous RA treatment have implicated RA in antero- posterior patterning both along the body axis and in developing Limb bud. A variety of abnormalities, including Neural tube defects, craniofacial abnormalities, and limb defects, have been reported after treatment of pregnant mammals with RA. The recent discovery that RA interacts with nuclear Receptors related to the steroid and thyroid hormone receptors, a family of proteins that function as ligand- dependent transcription factors, suggests that the morphogenetic functions of RA may result at least in part , from activation of developmentally regulated genes by RA receptor (RAR) complexes . An additional feature of retinoid physiology is the existence of a distinct class of molecules, the cellular retinol- and RA-binding proteins (CRBPs and CRABPs), which may modulate the accessibility of RA to the receptors. Representatives of each binding protein also show spatially restricted patterns of expression in the embryo. The complexity of retinoid action was demonstrated further by the recent finding that specific interactions between RARs and other nuclear proteins, including the thyroid hormone receptors and AP-1 transcription factor, can modulate their transcriptional activity .
Retinoic Acid receptors (RARs) are nuclear receptors related to the steroid and thyroid hormone Receptors, a family of proteins that function as ligand-dependent transcription factors. Several loci encoding RAR isoforms have been identified in mammals - RAR- alpha , - beta and gamma - as well as novel nuclear receptors known as RXR (Retinoid X receptor), which are distantly related to RARs and respond to high concentrations of RA. The RARs show spatially restricted distribution patterns during embryogenesis, which have led to speculation on a variety of roles for RA in developmental processes. As with other enhancer -binding proteins, nuclear receptors act as transcription factors by binding to specific DNA recognition sequences generally located upstream of responsive genes. Although RARs can activate gene expression through binding to thyroid hormone response elements , a much more specific and potent RA response element ( RARE ) has been identified recently within the promoter of the RAR-beta gene. This RARE is essential for RA induction of the RAR-beta gene and, when linked to heterologous promoters, can confer transcriptional activation via all three RARs.

• Nimeta RA-reguleeritud märklaud geene.
  

Some of these genes are the homeotic genes that specify the position of the cell along the anterior -posterior axis and therefore will cause the cell to display different characteristics . (2) They repress the activity of the AP-1 transcription factor. This transcription factor is important in activating those genes responsible for cell division and for the production of metalloproteinases that often permit cell migration .
Nimeliselt…HOX 1-4

• Missugune on lisatava retinoolhappe töökontsentratsioon? Miks just selline? Millised RA konversioonid rakus toimuvad ja missugused on erinevate derivaatide afiinsused erinevatele retseptoritele?
  

• Kirjelda RA retseptorite sidumissaite.
  

RAR has 3 domains: N-terminal, DNA-binding and C-terminal RA binding domain. DNA siduv sait on vist tsink -sõrm tüüpi…

• Loetle teisi tuumahormooniretseptorperekondi.
  

Androgeeniretseptorid
Östrogeeniretseptorid
Glükokortikoidretseptorid

• Mis juhtub arengus, kui loode on eksponeeritud RA kõrgetele kontsentratsioonidele? Mis on teratogeen ?
  

teratogeen: med. aine või tegur, mis põhjustab loote väärarengu

• kui loode on eksponeeritud RA kõrgetele konsentratsioonidel on tulemuseks väärareng, kuna RA on teratogeen.
  

Malformations are largely analogous to those associated with synthetic
retinoid teratogenicity in humans , such as anencephaly, spinabifida, cleft lip, cleft
palate, micronathia, microphthalmia, several types of malformation to the ear, teeth,
salivary glands and aortic arch, ventricular septal defects, imperforate anus ,
omphalocele, renal agenesis, polycystic kidney, hydronephrosis, phocomelia, digit
malformation, certain defects of the genitalia, pituitary, thyroid, thymus, skull ,
vertebrae, ribs, and muscles and situs inversus.

• Mis on neuroblastoom? Neuroblastoomide kliiniline taust ja prognoos. Missugusi rakutüüpe neuroblastoomide diferentseerumisel esineb? Kas on hetkel kasutusel ravimeid, millega neuroblastoomide diferentseerumist esile kutsutakse? Kui efektiivsed need on?
  

Neuroblastoom-med närvirakk- kasvaja .
Malignant tumor containing embryonic nerve cells; usually metastasizes quickly.
http://www.cancer.gov/cancerinfo/pdq/treatment/neuroblastoma/healthprofessional/
Neuroblastoma is predominantly a tumor of early childhood, with two thirds of the cases presenting in children younger than 5 years. In rare cases, neuroblastoma can be discovered prenatally by fetal ultrasonography. Neuroblastoma originates in the adrenal medulla or the paraspinal sites where sympathetic nervous system tissue is present. The most common symptoms are due to a tumor mass or to bone pain from metastases. Proptosis and periorbital ecchymosis are common and arise from retrobulbar metastasis. Extensive bone marrow metastasis may result in pancytopenia. Abdominal distention with respiratory compromise due to massive liver metastases occurs in infants . Because they originate in paraspinal ganglia, neuroblastomas may invade through neural foramina and compress the spinal cord, causing paralysis. Fever , anemia, and hypertension are found occasionally. Multifocal neuroblastoma occurs rarely, usually in infants, and generally has a good prognosis. Rarely, children may have severe watery diarrhea due to the secretion of vasoactive intestinal peptide by the tumor.
Diagnoosiks:

An unequivocal pathologic diagnosis made from tumor tissue by light microscopy (with or without immunohistology, electron microscopy, or increased levels of serum catecholamines or urinary catecholamine metabolites); or 2) The combination of bone marrow aspirate or trephine biopsy containing unequivocal tumor cells (e.g., syncytia or immunocytologically- positive clumps of cells) and increased levels of serum catecholamines or urinary catecholamine metabolites as described above .

The prognosis for patients with neuroblastoma is related to their age at diagnosis, clinical stage of disease, and (in patients older than 1 year) regional lymph node involvement. Other conventional prognostic variables include the site of the primary tumor and tumor histology .
Cellular ClassificationOne clinicopathologic staging system involves evaluation of tumor specimens for the amount of stromal development, the degree of neuroblastic maturation, and the mitosis-karyorrhexis index of the neuroblastic cells. Favorable and unfavorable prognoses are defined on the bases of these histologic parameters and on patient age. The prognostic significance of this classification system, and of related systems using similar criteria, has been confirmed in several studies. Neuroblastomas containing many differentiating cells, termed ganglioneuroblastomas, tend to have favorable biological properties and have a better prognosis

Ravi: madalariskiga juhtudel peamiselt operatsioon (+kemoteraapia). Keskmise riskiga: operatsioon+kemoteraapia, Kõrge riskiga: agressiivne kemoteraapia.

Radiation therapy is reserved for patients with symptomatic life-threatening or organ-threatening tumor that does not respond rapidly enough to chemotherapy, or for intermediate-risk patients whose tumor has responded incompletely to both chemotherapy and attempted resection and also has unfavorable biologic characteristics. Radiation therapy to the primary site is recommended for high-risk patients even in cases of complete resection

• Mõtle välja alternatiivne tee neuroblastoomi kasvajalise vohamise peatamiseks.
  

………………………………………………………………………………………
Kordamisküsimused 3.prax:

• Nimeta rakutsükli faasid ja kirjelda sündmusi, mis nende vältel toimuvad
  

G1 faas kestab 10 tundi ning sel ajal toimub rakus normaalne metabolism , rakk kasvab suuremaks, tema sisalduvate organellide arv kahekordistub ja toimub ettevalmistus DNA replikatsiooniks S faas algab DNA replikatsiooniga ning kestab ligikaudu 9 tundi. S faasi lõpuks koosnevad kromosoomid kahest tütarkromatiidist. Kui replikatsioon on lõppenud, läheb rakk faasi G2, mis kestab neli tundi. Selles faasis jätkub raku kasvamine ja ta valmistub mitoosiks. Mitoos (M faas) e. raku jagunemine kestab ligikaudu tunni. Selle käigus liiguvad tütarkromatiidid jaguneva raku vastaspoolustele. Teineteisest eraldunud tütarrakud on geneetiliselt identsed.

• Kuidas on võimalik määrata rakutsükli S-faasi, kirjelda meetodit.
  

S-faasis toimub DNA süntees. S-faasi algust on võimalik täpselt fikseerida kasutades märgistatud tümidiini (esineb vaid DNAs) või tümidiini analoogi broomdesoksüuridiini (BrdU). S-faasis toimub ka intensiivne histoonide süntees.

• Mida võid öelda rakutsükli kohta DNA koguse järgi?
  

DNA kogus on kahekordne M ja G2 faasis, S faasis 1-2 kordne ja 1 kordne G1-s

• Nimeta mehanismid, mille kaudu kontrollitakse rakutsüklit.
  

Rakutsüklit viivad läbi põhiliselt kahte tüüpi valgud : tsükliin-sõltuvad kinaasid (CDK) ja tsükliinid, mis seostuvad CDK-dega ja kontrollivad nende aktiivsust. CDK-de ja tsükliinide komplekside moodustumine toimub tsükliliselt, need tekivad ja lagunevad igas rakutsüklis. Tsükliine on 2 põhilist klassi: mitootilised tsükliinid, mis seostuvad CDK-dega G2- faasis ja mis on vajalikud rakkudes M-faasi käivitamiseks, ning G1-tsükliinid, mis seostuvad CDK-dega G1-faasis ja on vajalikud S-faasi käivitamiseks.
Rakutsükli kulgemist kontrollivad süsteemid tagavad selle, et järgmine etapp ei käivitu enne, kui eelmine on lõpetatud:

• Pidurdatakse M-faasi algust kuni DNA replikatsiooni lõppemiseni.
  
• Kontrollitakse kromosoomide kinnitumist kääviniitidele.
  
• Inhibeeritakse rakutsükli M-faasi käivitumist DNA vigastuste korral. Nt. imetajate rakkudes pidurdatakse kahjustatud DNA-ga rakkudel rakutsükkel G1 faasis. Mehanism on p53 sõltuv ja juhul, kui p53 funktsioonides esinevad häired ( mutatsioonid ), siis selliste DNA kvalteedikontrolli puudumine võivad jaguneda ka muteerunud DNA-d sisaldavad rakud. Paljude kasvajate puhul on näidatud, et p53 funktsioonides esineb häireid.
  
• Ekstratsellulaarsed faktorid , mis reguleerivad rakutsüklit koes
  

• Missugused transkriptsiooni faktorid osalevad rakutsükli kontrollimises? (Rb, E2F). Millel põhineb Jordan-Sciutto ja kolleegide (neur.allenpress.com/pdfserv/i0022-3069-061-04-0358.pdf) Alzheimeri tõve võimalikke mehanisme puudutav hüpotees (Jordan-Sciutto et al., 2002)) ?
  

G1 faasist S faasi- transkriptsiooni faktoriteks on retinoblastooma pRb ja E2F geeni perekonnad. E2F geeni perekond seob DNA ja aktiveerib transkriptsiooni DP proteiinidega

• Kas on rakutsükli regulatsioon on koespetsiifline? Missugused rakutsükli komponendid on teadaolevalt koespetsiifilise ekspressiooniga?
  

Rakutsükli kestvus varieerub rakutüüpide lõikes. Näiteks maksarakud jagunevad 1x aastas, T-lümfotsüüdid võivad olla jagunematud aastaid. On rakke, mis ei jagune kunagi , näiteks närvirakud ja ja neuronid .

• Millised ensüümsüsteemid viivad läbi rakutsüklit?
  

Tsükliinsõltuvad kinaasid ja tsükliinid.

• Missugused mehanismidega kontrollitakse rakutsükli toimumise korrektsust? Mis juhtub, kui kontrollisüsteemidega on “avastatud viga”?
  

Rakutsükli kulgemist kontrollivad süsteemid tagavad selle, et järgmine etapp ei käivitu enne, kui eelmine on lõpetatud:

• Pidurdatakse M-faasi algust kuni DNA replikatsiooni lõppemiseni.
  
• Kontrollitakse kromosoomide kinnitumist kääviniitidele.
  
• Inhibeeritakse rakutsükli M-faasi käivitumist DNA vigastuste korral. Nt. imetajate rakkudes pidurdatakse kahjustatud DNA-ga rakkudel rakutsükkel G1 faasis. Mehanism on p53 sõltuv ja juhul, kui p53 funktsioonides esinevad häired (mutatsioonid), siis selliste DNA kvalteedikontrolli puudumine võivad jaguneda ka muteerunud DNA-d sisaldavad rakud. Paljude kasvajate puhul on näidatud, et p53 funktsioonides esineb häireid.
  
• Ekstratsellulaarsed faktorid, mis reguleerivad rakutsüklit koes
  

Viga-> apoptoos .

• Loetle kromosoomide segregratsioonihäiretega seostatud haigusi.
  

Kromosoomide jagunemisega seotud häired nagu Down, Turner jne Segregatsioon on kromosoomide lahknemine mitoosi käigus, kui kääviniidid kokku tõmbuvad jne. Sellega seotud haigused on Downi sündroom, Klainefelteri, Turneri sündroom ja teised polü- ja aneuploidiad.

• Rakutsükkel ja vähk. Kas on kliinilistes uuringutes kasutusel rakutsüklit otseselt mõjutavaid ravimeid? Millistes uuringutes ja mis ravimid ning mis on rakutsükli märklauad?
  

p53 on kasvajate korral teadaolevalt enim muteerunud tuumorsupressorgeen. Mutatsiooniuuringud p53 geenis võivad anda vastuseid kasvaja prognoosi ja/või vajaliku ravitaktika suhtes.
Normaalsel kujul takistab geen p53 rakkude ebanormaalset jagunemist, taastab kahjustatud DNA-d ja käivitab vajadusel raku hävitamise protsessi.
Avastati leukeemiat soodustav geen
Briti teadlased on avastanud enamlevinud leukeemia vormiga seotud geenivariandi. Aastaid on teatud geeni p53 rollist vähi tekkes . Normaalsel kujul vastutab p53 organismi geneetilise materjali tervise eest, kaitstes organismi vähi ehk ebanormaalsete rakkude leviku eest. Juhul kui vigase geenivariandiga rakku pole võimalik parandada, see hävitatakse geeni p53 abil. Briti Leukeemia Uurimise Fondi teadlased on avastanud, et geeni ATM mutatsioon võib avaldada pärssivat mõju p53 geenile. Normaalne ATM geen osaleb vigaste geenide või DNA järjestusega rakkude identifitseerimises. Muteerunud kujul võib ATM geen takistada p53 toimet ja seega aidata kaasa vähirakkude levikule. Geenimutatsiooni identifitseerinud teadlased loodavad, et avastust on võimalik rakendada leukeemia ravimiseks.
A pill that can reduce the progress of a deadly form of cancer called chronic myeloid leukaemia (CML) is being launched in the UK.
The drug could provide an alternative to current treatments, which include a risky bone marrow transplant operation and powerful chemotherapy.
Glivec, which works by precisely targeting the molecules thought to cause the cancer, has produced highly promising results in clinical trials on over 7,500 patients world- wide .
The drug normalised the blood count in over 90% of patients, and reduced leukaemia cells in the bone marrow.
Kordamisküsimused 4. prax:

• Defineeri apoptoos ja nekroos .
  

Apoptoos- raku programmeeritud surm, mis on käivitatud raku enda poolt.
Nekroos- raku mitte programmeeritud surm, rakk lendab tükkideks, tekitab põletikke.

• Kirjelda protsesse, mis eristavad apoptoosi nekroosist.
  

Apoptoos on kiirem kui nekroos, apoptoosi puhul rakk lüüsub, st tema tsütoplasma komponendid ei satu ekstratsellulaarsesse ruumi, vastupidiselt nekroosile. Apoptoos on feneetiliselt kodeeritud ja apoptoosilises rakus toimuvad kindlad biokeemilised ja morfoloofilised muutused, mis lõpevad raku lagunemisega väikesteks membraaniga ümbritsetud vesiikuliteks, mis fagotsüteeritakse.

• Kirjelda apoptootilisi sündmusi, millised on varajased ja millised hilised sündmused.
  

1. Morfoloogilisi muutusi pole näha, suureneb transglutaminaasi transkriptsioon ning aktiveeritakse kaspaasid;
2. Kromatiin kondenseerub, aktiveeritakse nukleaasid, mis lagundavad kromatiini nukleosoomi suurusteks fragmentideks, tuum fragmenteerub;
3. Tsütoplasma kondenseerub, kuna desmosoomsed kontaktid ja intermediaarsed filamendid lagundatakse; raku membraanis toimuvad muutused, mis markeerivad apoptootilise raku fagotsütoosiks (fosfatidüülseriin eksponeerub raku välismembraanile) rakk laguneb membraaniga ümbritsetud vesiikuliteks.

• Kas apoptoos on pöörduv ja kui jah, siis millistes faasides on see võimalik?
  

Kui pöörduv siis ainult esimeses faasis

• Miks fragmenteerub DNA 100 aluspaarilisteks lõikudeks?
  

Raku tuum fragmenteerub ja kromatiin kondenseerub, millega kaasneb endonukleaasne aktiveerimine , mis lõikab läbi kromatiini (DNA) nukleosoomide vahelise nn. linker DNA , selle tulemusel tekivad iseloomulikud DNA fragmendid

• Mis on anneksiin ja miks saab seda kasutada apoptoosi määramiseks? Missiguseid markereid (molekulaarseid protsesse) veel kasutatakse apoptoosi määramiseks?
  

Anneksiin on valk, mis seondub fosftidüülseriiniga ning muudab apoptoosis oleva raku nähtavaks.DNA- fragmentatsioon, immuunotsütokineetliliselt.

• Mis juhtub rakkudega, mis on läbinud apoptoosi?
  

Apoptootilises rakus toimuvad kindlad biokeemilised ja morfoloogilised muutused, mis lõpevad raku lagunemisega väikesteks membraaniga ümbritsetud vesiikuliteks, mis fagotsüteeritakse kiiresti makrofaagide poolt

• Kas apoptoosi on võimalik esile kutsuda ka retseptorvahendatult? Nimeta üks apoptoosi indutseeriv faktor.
  

On küll võimalik. Tsütotoksilised T-lümfotsüüdid indutseerivad apoptoosi viirusest infitseeritud rakkudes ja kasvaja rakkudes.

• Missugune roll apoptoosiprotsessis on mitokondritel?
  

• Kuidas määrata apoptoosi poolt aktiveeritud kaspaase? Kirjelda protsessi.
  

Kaspaadid lõikavad valku peale aminohapet aspartaati (asp). Kaspaase on terve perekond ja nende iseloomulikuks omaduseks on see, et nad on ülispetsiifilised aspartaadi suhtes, selle aminohappe olemasolu on absoluutselt vajalik kaspaasile äratundmiseks. Kaspaasid aktiveeruvad kaskaadselt, kõigepealt aktiveerub kaspaas 8, see omakorda aktiveerib teisi. Kaspaaside toimel aktiveeruvad ka nukleaasid, mis asuvad lõikama DNA-d. Nukleaas on rakus seotud inhibitoorse valguga, mille kaspaas lagundab ning seejärel toimubki nukleaasi aktiveerumine. Kaspaaside kaskaadi käivitumisel toimub rakustruktuuride süstemaatiline purustamine, sündmused toimuvad kindlas järjekorras ja ette-ennustatavalt. Rakk purustatakse kiiresti, 30-60 minuti jooksul.
Immunotsütokeemiliselt on võimalik detekteerida aktiveeritud kaspaase vastavate antikehadega. Selliseid interaktsioone saab hiljem määrata mikroskoopiliselt või kasutades FACS-i

• Milliste avastuste eest said Nobeli preemia 2002.a. Sydney Brenner ja H. Robert Horvitz?
  

Avastuste eest, mis puudutavad organite arengu ja programmeeritud surma geneetilist regulatsiooni.

• Mitokondrite osa apoptoosis.
  

Tsütokroom C – hingamisahela ensüüm (mitokondri sisemembraan). Apoptoos -> läbi mitokondri.
Kordamisküsimused 5. prax:

Millised taimeraku iseärasused takistavad taimerakke transformeerimast samamoodi kui loomarakke. Milliste tehnoloogiate abil sellest üle saadakse?
Erinevalt loomarakust ümbritseb taimerakku paks tsellulooskest, mis on märksa tõsisemaks takistuseks kui lihtsalt membraan .
Perhaps the most successful method involves the pathogenic bacterium Agrobacterium tumefaciens, which has the innate ability to transfer DNA to plant cells. In nature , this transfer results in formation of plant tumors (crown galls) at the infection site. Molecular biologists, however , have disarmed this bacterium and constructed domesticated strains that no longer cause tumors but transfer any DNA of interest to plant cells. The major disadvantage of the highly efficient Agrobacterium system is that it does not work with all plant species, most notably the cereals .
Other techniques use physical or chemical agents to transfer DNA into plant cells. Protoplasts, plant cells that have been stripped of their protective cell walls, will take up pure DNA when treated with certain membrane-active agents or with electroporation, a rapid pulse of high- voltage direct current. Once inside the cell, the DNA is integrated and the foreign gene will express. These two techniques largely depend upon the development of protoplast systems that retain the capacity to regenerate intact plants. Transgenic corn, rice , and soybean have been produced with these techniques, especially electroporation. Success rates, however, are low, and the techniques not very reproducible.
DNA can also be microinjected into target plant cells using very thin glass needles in a method similar to that used with animals . Microinjection, however, has produced only a few transgenic plants. The technique is laborious, technically difficult, and limited to the number of cells actually injected.
Biolistics, involves accelerating very small particles of tungsten or gold coated with DNA into cells using an electrostatic pulse, air pressure , or gunpowder percussion. As the particles pass through the cell, the DNA dissolves and becomes free to integrate into the plant-cell genome. This improbable technique actually works quite well and has become, along with electroporation, one of the methodologies of choice. Biolistics has the advantage of being applicable to whole cells in suspension or to intact or sliced plant tissues. For example, plant meristems or tissues capable of regeneration can be targeted directly. Unlike transformation or electroporation, the technique does not require protoplasts or even single -cell isolations. Using biolistics, transgenic corn and soybean plants have been produced that contain heritable copies of the inserted gene.

Millised omadused muudavad bakteri Agrobacterium tumefaciens unikaalseks kogu eluslooduses ? Vt eelmist punkti

Milliste taimeliikide genoom on täielikult sekveneeritud? Mida oskate öelda õistaimede genoomi iseloomustamiseks?
Täielikult on sekveneeritud Arabidopsis thaliana ja Sativa africana ( riis )
Õistaimede genoomis on suhteliselt suur osakaal transposoonidel (arabidopsises 10%, sativas 25%).
Õistaimedel esineb tihti polüploidia, loomadel on see üldjuhul letaalne .

Milline on kloroplastide biokeemiline funktsioon? fotosüntees

Milleks vajavad taimed õhulõhesid? gaasivahetus keskkonnaga

Kirjelda lühidalt sugulise viljastumise mehhanismi õistaimedel.
Isastaimede tolmukates küpsevad isasgameedid, mis õietolmuna levivad emakasuudmele emastaimel. Õietolm levib tuulega , putukatega, veega ja mõnel taimel isegi väikeste lindudega.
Tolmuterast areneb tolmutoru, mis kasvab emaka sisse, selle kaudu kanduvad edasi 2 isassugutuuma. Üks neist ühineb munarakuga, millest moodustub viljastatud munarakk e.sügoot. teine isassugurakutuum ühineb teistuumaga ning sellest saab alguse endospermi areng.

Mis on totipotentsus? Võrdle taimerakke loomade tüvirakkudega.
Totipotentsus on võime diferentseeruda kõigiks keharakkudeks. Totipotentsest tüvirakust võib areneda terve uus organism. Taimerakud on küll lõpuni diferentseerunud, ent nad on võimelised tagasi totipotentseks muutuma moodustades kallust ehk haavakude . Sellistest rakkudest võib terve uus taim kasvada.

Loomaviirused sisenenevad enamasti peremehe rakku endotsütoosi abil, kasutades spetsiifilisi rakupinna retseptoreid. Taimeviiruste pääs rakku sõltub enamasti raku mehaanilistest vigastustest. Miks?
Taimerakke ümbritseb paks tselluloosist rakukest .