Ensümoloogia (0)

ENSÜMOLOOGIA
Lp tudengid. See konspekt on kirjutatud tudengite , kelle nimed on mulle paraku teadmata, poolt. 2013 aastal täiendas konspekti magistrant Karl Annusver, kes lisas joonised ja tegi võrrandid paremini jälgitavaks. Konspekt on kirjutatud seotult loengus näidatavate slaididega. Konspekt on minu poolt läbi vaadatud ja suuremaid möödalaskmisi ei sisalda. Päris iseseisvaks õppimiseks see siiski mõeldud ei ole.
Edukat ensümoloogia õppimist ja tänud anonüümsetele autoritele ning Karl Annusverile!
Priit Väljamäe
20.11. 2017
„Structure and mechanism on protein science “ – Alan Fersht
Biokeemia põhiõpik, kus ensümoloogia ka sees.
Ensüüm – keemiliste reaktsioonide katalüsaator (kiirendaja). Iseloom molekulina pole oluline, struktuur pole samuti. Vaatame ainult, mida ta teeb! Substants , mis kiirendab keemiliste reaktsioonide toimumist on katalüsaator. Ise jääb reaktsiooni lõppedes muutumatule kujule. Keemilisele reaktsioonile vahendaja . Üks katalüsaaatri molekul võib katalüüsida mitmeid reaktsioone, temaga endaga midagi ei juhtu.
Miks on reaktsioonide kiirus oluline? Väga vähe reaktsioone organismis, mis pole katalüüsitavad. Elusorganismid omavad kontrolli valkude üle, oma katalüsaatorite üle. Tänu sellele saab omada kontrolli endas toimuvate keemiliste reaktsioonide üle. Kui katalüüsi ei vajaks, poleks võimalik kontrollida. Elu kineetilise kontrolli all.
„Aeg sai alguse Suurest Paugust, mis enne seda oli, ei tea“ Liikumine on asukoha vahetus teise keha suhtes, kui on üks keha, siis järelikult ei saa liikumisest rääkida ja pole ka ajast mõtet rääkida.
Keemilise reaktsiooni kiirus
Tähiseks v. Millegi muutumine ajas on kiiruse ülddefinitsioon, sisaldab alati aega! Keemiliste reaktsioonide puhul reageerivate ainete kontsentratsioonide muutus ajas. Nt [ATP] on õige tähis. Mõõtmiseks kasutame molaarset kontsentratsiooni. Molaarne kontsentratsioon on numbriline konts, näitab osakeste arvu ruumala ühikus –1M=1mol/L. Milli (-3), mikro (-6), nano (-9), pento (-12), fento (-15). Vee c on ülempiir.
Reaktsiooni kiiruse määrab kokkupõrge. Kokkupõrke sagedus sõltub osakeste arvust.
Numbriline konts – üks molekul põrkab teisega , toimub reaktsioon sõltumata molekulide massist vms.
v=dc/dt ( hetkkiirus ). v=∆c/∆t=c2-c1/t2-t1 (keskmine kiirus), seega ∆=lõppolek-algolek. Kui ∆ lõpmata väike, siis d.
∆ on muutus ja see tähendab erinevust lõppoleku ja algoleku vahel. ∆C= Ct2- Ct1. ∆ abil väljendamine – diskreetne suurus – mingi kindel väärtus.
Keskmine kiirus vaatab ainult kahe oleku vahet, see, mis vahepeal toimus, seda ei näe. näiteks. Δ=lõpp-algus
Hetkkiirus – diskreetne muutus on asendatud lõpmata väikese muutusega ( diferentsiaal ). Hetkkiirus on keskmine kiirus vaadatuna nii, et ajavahemik on lõpmata pisike. (dc/dt)t
Algkiirus – kui aeg läheneb nullile . See vaieldamatult kõige olulisem ensümoloogias!
Keskmised kiirused ei pruugi peegeldada algkiirust, aga võivad.
Eelstatsionaarne faas on tavaliselt väga lühike, seda ei nähta. ms ajaskaalasse jääb pikkus.
Hetkkiirus on võrdne kontsentratsiooni tuletisega aja järgi ehk võtame tuletise [P]=f(t)-st. Tuletis on tan α. α on funktsioonile antud punktis tõmmatud puutuja ( sirgjoon ) tõusunurga tan. Avaldub kui,
Hetkkiirus väheneb antud näites, sest substraati jääb vähemaks. Punase joone tõus on algkiirus, rohelise joone tõus on hetkkiirus 30 min järel, sinise joone tõus on hetkkiirus 1 h järel.
Kiirus tee endale hästi selgeks!! Ensüümid mõjutavad reaktsiooni kiirust ainult, ei saa panna midagi tekkima , kui seda ei ole, siis pole, ensüüm ei aita sellisel juhul!
Reaktsiooni skeem aA+bB↔uU+rR. Suured tähed ained ja väikesed stöhhiomeetria kordajad . Biokeemias enamasti need 1 ehk 1 molekul ühes reaktsiooni tsüklis. Pärisuund vasakult paremale, vastasuund paremalt vasakule. v(päri)=reaktsiooni skeem+ massitoimeseadus , seega vpärivõrdeline[A]a[B]b, vpäri=kpäri[A]a[B]b. Vaata edasi massitoimeseaduse juurest!
vvastas=kvastas[U]u[R]r
Reaktsiooni kiiruse koostamine reaktsooni skeemist ülioluline!
Ensümoloogias räägitakse algkiirustest.
Kineetika uurimine – tingimuseks on see, et produkti tekib ajas lineaarselt (võttes arvesse viga).
Hetkkiirus vs keskmine kiirus – keskmine kiirus on alati suurem kui hetkkiirus antud aja jooksul. See kehtib juhul, kui hetkkiirus ajas langeb (valdav juhtum). Keskmine kiirus on suurem, sest see võtab arvesse ka varasemat kiiremat faasi. Hetkkiirus ei arvesta seda, mis ennem oli.
Kui produkti moodustumine ajas on lineaarne, siis on algkiirus, keskmine ja hetkkiirus omavahel võrdsed, kiirus on konstantne . Sirge võrrand y=ax+b. Kui produkti tekib ajas lineaarselt, siis [P]=at+b. Muutujad on produkti konts (y) ja aeg (x). Summa tuletis on esimese tuletis + teise tuletis. Korrutise tuletis – esimese tuletis∙korda teine+ teise tuletis∙korda esimene. at tuletis on a.
Hetkkiirus d[P]/dt=a (sirge tõus)
Massitoimesadus – reaktsioonikiiruse avaldise koostamine – keemilise reaktsiooni kiirus on võrdeline reaktsioonist osavõtvate ainete molaarsete kontsentratsioonidega, kusjuures stöhhiomeetria kordajad lähevad c astme näitajateks.
a, b, c, d - näitavad stöhhiomeetriat, mitu mooli ainet osaleb antud reaktsioonis. Ensümoloogias on see enamasti 1.
Lähteained kirjutatakse vasakule, produktid kirjutatakse paremale. Pärisuunaline reaktsioon on vasakult paremale, vastassuunaline on paremalt vasakule. Konstandid seovad suurusi omavahel. Universaalne gaasikonstant R seob omavahel energiat ja temperatuuri, ühik on J/K∙mol. kB (Bolstmani konstant) on J/K. Kiiruse ühik on molaarsus sekundis – v=M/s, kuna aega ei ole selles võrrandis, siis seetõttu tuleb sisse kiiruskonstant . Kiiruskonstantide ühikud sõltuvad sellest, mis järku reaktsioonide kiiruskonstandid nad on.
v+ = k+[A]a[B]b
kui a=b=1, siis k+=v+/[A][B] → M/s∙M∙M=1/M∙s
Erinevused reaktsiooni kiirustes saavadki toimuda tänu erinevatele k väärtustele . Ensüüm suurendab k väärtust!
Reaktsiooni järk ja molekulaarsus
Järk on kontsentratsioonide astmenäitajate summa reaktsioonikiiruse avaldises.
Kui a=b=1, siis järk=1+1=2. Kogu reaktsioon on teist järku.
Näites on pärisuunaline a+b järku, vastassuunaline on u+r järku.
Reaktsiooni järk on puhtalt kineetiline suurus, sest ta defineeritakse kiirusavaldise kaudu. Järk võib seega olla ka mitte täisarvuline keerulisemate reaktsioonide puhul.
Aine A ja aine B suhtes on reaktsioon aga vastavalt a ja b järku.
Kiiruskonstandi järk= kogu reaktsiooni järk
Järk aine suhtes: aine A suhtes a järku.
Reaktsiooni molekulaarsus – näitab reaktsiooni elementaaraktist osavõtvate osakeste/molekulide arvu. Kui monomolekulaarne reaktsioon, siis võtab elementaaraktist osa ainult üks osake, sellel osakesel on sisemine omadus muutuda teiseks osakeseks, see ei sõltu teise reagendi põrgetest, aine teeb seda oma energeetilisest seisust lähtudes. Monomolekulaarne reaktsioon on radioaktiivne lagunemine – radioaktiivsel tuumal on sisemine tõenäosus laguneda, see paika pandud sisemise kella poolt. Bimolekulaarne reaktsioon hõlmab kahe molekuli kokkupõrget. Trimolekulaarne reaktsioon – vaja on kolme molekuli kokkupõrget. Keerulisemad reaktsioonid lähevad tavaliselt läbi vaheetappide, ntx A+B+C→P. Selline kolmikkokkupõrge on vähetõenäoline, seetõttu toimuvad vaheetapid – A+B→AB, AB+C→P.
Monomolekulaarne on lagunemisreaktsioon, ühest saab kaks.
Bimolekulaarne nõuab kahe molekuli kokkupõrget.
Enamik mono - või bimolekulaarsed reaktsioonid.
21.11. 2017
Esimest järku pöördumatu reaktsioon – kõige lihtsam!
1A→B (→k1)(radioaktiivne lagunemine ntx)
v=d[B]/dt= -(d[A]/dt)=k1∙[A]1 – kiiruse avaldis
Kiiruskonstandi juurde tema järku reeglina ei tooda. Mida suurem kiiruskonstant k1, seda kiirem reaktsioon.
k sõltub paljudest asjadest, aga ei sõltu reageerivate ainete kontsentratsioonidest, sest seob omavahel kiirusi ja kontsentratsioone, seega ei saa neist ju sõltuda. k sõltub temperatuurist ja teistest keskkonnatingimustest. Ühik sõltub reaktsiooni järgust. Esimest järku kiiruskonstandi ühik on aja pöördväärtus s-1. Teist järku ühikuks aja pöördväärtus korda kontsentratsiooni pöördväärtus: s-1M-1.
Esimest järku reaktsioon ei nõua kokkupõrget, on molekuli sisemine omadus.
Nt isomerisatsioon (need siiski tihti pöörduvad), radioaktiivne lagundamine tüüpiline I järku pöördumatu reaktsioon.
Produkti moodustumine esimest järku pöördumatus reaktsioonis
Kui aga kiirus teada, siis kuidas produkti konts sõltub ajast, kuidas väljendub?
Selleks on vaja diferentsiaalvõrrandist lahti saada, sest muidu näittavad ainult muutust ajas.
v=d[B]/dt= k1*[A]1 = -d[A]/dt
k1 [A]1 = -d[A]/dt
Kui tahame teada, mis on kontsentratsioon mingil ajahetkel, siis on [A]= f(t). Diferentsiaalvõrrand tuleb integreerida. Muutujad tuleb viia ühele poole võrdusmärki.
Konstandi võib tuua integreerimismärgi alt välja.
-k∙∫dt= -kt (diferentsiaali integraal on asi ise ∫dx=x)
, kus α on integreerimiskontant, selle saab leida piirtingimusest.
Kui n=-1, siis n+1=0, nulliga aga jagada ei tohi. Seetõttu ka erandjuht ln[A].
ln[A]+α= - k1∙t, see sama mis ln[A]= - k1∙t + α
Kui t=0 (lähteaine A algkonts on [A]0), siis α=ln[A]0
ln[A]= - k1∙t + ln[A]0  ln[A]-ln[A] 0=- k1∙t  t 

Aine A-ga toimuva reaktsiooni kiirus sõltub ainest A, tema kontsist ise.
[A]=[A]0∙e - k1∙t
Võrrandi vaatamisel tuleb vaadata piirjuhtusid tuleb vaadata muutujaid, konstante .
Kui t=0 → siis exp=1
Kui t→∞, siis aste läheneb ∞, exp→0
Eksponentliikme väärtused saavad olla vahemikus 1→0. See on osa lähteainest, mis on reageerimata, näitab seda fraktsiooni, mis on reageerimata.
[A]+[B]=[A]0
[A]0-[B]=[A]0∙
[B]= [A]0 -[A]0∙
[B]= [A]0∙(1-)
Kui aeg t→0, siis [B]=0,
Kui t→∞, siis [B]= [A]0, sest kogu lähteaine on ära reageerinud .
Liiget [A]0 nimetatakse amplituudiks.
Esimest järku reaktsioone iseloomustatakse nende poolestusaja kaudu – t1/2 . Poolestusaeg on aeg, mille jooksul on pool algsest ainest kadunud. Poolestusaeg on pöördvõrdeliselt seotud kiiruskonstandiga, mida suurem kiiruskonstant, seda väiksem on poolestusaeg ja seda ebastabiilsem on aine (lühiealine).
Otsime aega t, mille puhul eelnev tingimus kehtiks.
Astmest t välja toomiseks peame logaritmima mõlemat poolt.
Fosfori poolestusaeg on 14,3 päeva. Radioaktiivne C poolestusaeg on 5470 aastat. Fosfor on karm kiirgus, aga kaob kiiresti, süsinik on pehme kiirgus, aga ei kao kiiresti, seetõttu tuleb olla jäätmete käsitlemisel ettevaatlik.
Eluiga=pooleluiga. Alguses on lähteaine konts A0, siis pooleluea möödudes on teda poole vähem, kahe pooleluea pärast aga ei ole 0. Molekulaarsed protsessid on tõenäosuslikud ei saa öelda, et kõik aine on ära reageerinud. Lähteaine konts pole üks asi, seetõttu ei saa rääkida täiselueast. Lähteaine koosneb paljudest aatomitest ja poolestusaeg on aeg, mille jooksul neid aatomeid nn poole vähemaks jääb. Ükskõik kust punktist lähtuda, siis poolestuasja möödudes on pool jälle läinud, aga pool läheb ju järjest väiksemaks. Kahe poolestusaja möödudes on lähteaine konts veerand algkontsentratsioonist, kadunud on ¾.
b) kui ajatelg lineaarne, konts aga logaritmiline, siis tegemist sirgjoonega (lähteaine kontsentratsiooni sõltuvus ajast).
[A]=[A]0∙e - k1∙t
ln=-k1∙t →see on sirge võrrand, mille koordinaadid on ln ja t. Selle sirge tõus on negatiivne, sest läteainet jääb ajas vähemaks, tõus=-k1
c) kolm erinevat lähteaine kontsi on kujutatud, algkiirused on siniste joonte tõusud.
d) eelmiselt graafikult saadud andmed on pandud sõltuvusse aine A algkontsentratsioonist. Algkiirus erinevatel substraatide kontsidel. Kiirus d[A]/dt= k1∙[A]
Algkiiruse puhul tuleb lähtuda sellest, et aine konts [A] ≈ [A]0, siis d[A]/dt= k1∙[A]0. See on sirge võrrand pm, mille puhul tõus=k1.
Pooleluiga sõltub kõigest sellest, millest sõltub kiiruskonstant. Üheks selliseks faktoriks on temperatuur.
Läbimisaeg on lihtsalt k pöördväärtus ehk
(kasutatakse geneetikas).
Teist järku reaktsioon ja pseudo-esimest järku reaktsioon
Kaks lähteainet moodustavad kaks produkti pöördumatult.
k2 on teist järku kiiruskonstant.
Meid huvitab olukord, kus ühe aine algkonts on palju suurem kui teise. Olgu aine B algkonts palju, palju suurem aine A algkontsist B0>> A0, B0 >>[P]
Kui üks liige on võrreldes teisega suur, siis arvestame ainult seda suuremat liiget, väiksema liikme võib summast arvestamata jätta. Seetõttu võib öelda, et B0-[P]=B0 
Võrrandi mõlemaid pooli võib läbi korrutada ühe ja sama liikmega , antud juhul A0-[P]ga, sest tahame kätte saada A0.
Nüüd tuleb jagada mõlemaid pooli jagada läbi -ga
Summas ja vahes tuleb mõlemaid liikmeid läbi korrutada ja jagada.
Esimest järku puhul k1→ teist järku võrrandi puhul on see B0∙k2. M∙1/M∙s=1/s
Pseudo-esimest järku kiiruskonstant on k2B0. B0 on konstant.
Pseudo-esimest järku kiiruskonstant on teist järku kiiruskonstandi ja kontsentratsiooni korrutis. B0k2 ühik peab olema aja pöördväärtus, aja ühik peab e astmest ära kaduma (astmenäitajates ja logaritmimärgi all olevad suurused peavad olema ühikuta suurused).
pH=-log[H]+, siin eeldatakse vaikimisi sisse, et [H]+ on läbi jagatud tema standardkontsentratsiooniga ([H]+0), tehe mis kaotab logaritmimärgi all ühikud ära. Keemias on [H]+0 = 1M.
Kui vastupidine olukord, kus A0>> B0, siis tulemus peaks sama tulema ainult, et A ja B on omavahel kohad ära vahetanud
22.11.2017
Null järku reaktsioon
Kiirus ei sõltu reageeriva aine kontsist, katalüüsitavad reaktioonid enamasti. Null järku reaktsioonid on enamasti katalüüsitavad reaktsioonid olukorras, kus katalüsaator on substraadiga küllastunud. Null järku kiiruskonstandi ühik on M/s, sest v=k0. , esimest järgku mõõtühik s-1, pesudoesimest sama, teist järku M-1s-1.
(Kõrgemat järku reaktsioonid on enamasti vaheetappide kaudu)
! Võrranditesse ei märgita kiiruskonstantidele nende järku juurde. Järgust saab aimu reaktsiooni skeemi vaadates, aga ka tehetest tuleb see välja.
e(k1+k2[S]+k3)∙t, sulgudes olev avaldis ühik peab olema 1/s, sest ajaga korrutades peab ühik ära kaduma. Liita ja lahutada tohib ainult sama ühikuga suurusi, seega peavad sulus liidetavad olema sama ühikuga. k1 ja k3 on seega 1/s, k2 on teist järku kiiruskonstant. Teist järku kiiruskonstandid on vaja läbi korrutada substraadi kontsentratsiooniga (kui esinevad liitmistehtes koos esimest järku kiiruskonstandiga).
Esimest järku pöörduv reaktsioon – tasakaaluolek
Kogu reaktsiooni
Ainet B tekib juurde ainest A kiiruskonstandiga k1. Ainet B jääb vähemaks, sest pöördreaktsiooni tõttu läheb tagasi, seetõttu tuleb lahutada.
Need rajad, mis viivad ainet ära, need on miinusmärgiga, rajad, mis toovad ainet juurde, need on plussmärgiga !!!
Kui
Kui reaktsioon on jõudnud tasakaalu, siis konts on konstantsed. Tasakaalus seega
k1[A]eq=k-1[B]eq
Tasakaalukonstant on . Tasakaalukonstant aega enam ei sisalda, ei ütle midagi reaktsiooni kiiruse kohta. K käib alati reaktsiooni mingi suuna kohta. Antud K on pärisuunalise reaktsiooni tasakaalukonstant.
(p on peal, seega produktid on peal)
Vastandsuunalise reaktsiooni tasakaalukonstant (K-) on vastupidine, seega K=1/K­-
Tasakaalukonstandist rääkides peab reaktsiooni suund defineeritud olema, peame teadma, mis on lähteained ja mis produktid.
Amplituud – näitab vahemikku
Teine parameeter eksponendi kiiruskonstant – kui kiiresti amplituudi ära teeb. Mida suurem k, seda kiiremini platoo saavutatakse . Poolestusaeg – aeg mille jooksul on ronitud poolele platoole.
k reaktsiooni kõdumise kiiruskonstant.
Platoo tasakaalu aeg.
Tasakaaluolek – valgu seostumine ligandiga
Ligand on see, mis seostub valguga, aga ei läbi keemilist reaktsiooni. Ligandid võivad olla inhibiitorid , teised valgud jne. Ensüüm ei tee ligandiga midagi. Seostub ja tuleb lahti samal kujul. Substraadiga võib ensüüm muutusi.
Võib olla ka kasutusel: kon – ühinemiskonstant ja koff – dissotsiatsioonikonstant
kon on teist järku kiiruskonstant (1/M∙s), k-off on esimest järku kiiruskonstant, sest on ensüümi ja ligandi dissotsiatsiooni kiiruskonstant (1/s)
Pärisuunaline reaktsioon on ühinemisreaktsioon, k1 on assotsiatsiooni kiiruskonstant.
- ühik on (1/M)
Kass on assotsiatsiooni konstant.
Vastassuunalise reaktsiooni tasakaalukonstant on dissotsiatsioonikonstant.
– ühik on (M)
Kui pool valku ligandiga kompleksis ja pool valku on vaba, siis dissotsiatsioonikonstant võrdub [L]. Kui Kd=[L], siis
Dissotsiatsiooni konst näitab vaba ligandi kontsi, mille juures pool valku on vaba ja pool valku on seotud ligandiga. Mida väiksem on Kd väärtus, seda tugevam on seotumine ja seda stabiilsem on kompleks .
Kd võib olla ntx 10μM, 1μM, 20pM. Seostumine Kd-ga 20pM on tunduvalt tugevam. Juba 20 pM kontsi juures piisab sellest, et pool valku viia kompleksi. Kompleksi moodustumine nõuab kahe molekuli kokkupõrget, seetõttu sõltub kontsist. Lagunemine aga ei sõltu kontsist, vaid on antud kompleksi sisemusest sõltuvalt. Mida väiksem on vaba ligandi konts, mis tagab selle, et pool valku on kompleksis, seda tugevam on kompleks, seda kiiremini ta moodustub ja seda vähem ligandi on vaja vms. Tugevad seostumised jäävadki pM kanti .
Peab siiski meeles pidama , et meil on tegu olukorraga, kus [L]0>>[E]0 ja seega [L]0~[L]eq.
Et saada ilus seostumiskõver, siis peaks [L]0 valima nii, et [L]0 jääb vahemikku 0,1Kd-10Kd.
Tasakaalukonstant K
Ei ütle midagi kiiruskonstantide väärtuste kohta, sest aeg kaob välja. Tasakaalukonstandi väärtuse alusel ei saa me öelda, kui kiiresti reaktsioon toimub.
Tasakaalukonstandid on suure K-ga, kiiruskonstandid on väikse k-ga.
Tasakaalukonstant:

• Sõltub temperatuurist jt keskkonnatingimustest
  
• Ei sõltu reaktsioonist osavõtvate ainete kontsentratsioonidest
  
• Kehtib näidatud või nimetatud reaktsiooni suunal – päri- ja vastassuunaline peab olema defineeritud
  

K = [produktid]/[lähteained], (lähteained all produktid peal)

• Ühik sõltub reaktsiooniskeemist
  
• Mida suurem, seda suhteliselt kiirem on pärisuunaline reaktsioon
  
• On kiiruskonstantide suhe
  
• Ei ütle midagi üksikute kiiruskonstantide väärtuse kohta
  
• Ei ütle midagi reaktsiooni toimumise kiiruse kohta
  
• On määratud reaktsiooni lõpp- ja algoleku energeetilise erinevusega (ΔGº)
  

Reaktsioonikiiruse sõltuvus temperatuurist
Kui tõsta temp 10 kraadi võrra, siis reakt kiirus kasvab ≈2 korda. Temperatuuri koefitsient Q10 – näitab mitu korda kasvab reaktsioonikiirus temperatuuri kasvades 10 kraadi võrra.
Vee keemistemp ja sulamistemp vahe on võrdne 100 kraadiga. K ja C skaalas on 1 kraad sama suur, aga absoluutväärtused on erinevad. Arvutustes kasutatakse alati K skaalat .
t°C=T(K)-273
T(K)= 273+t°C
-100°C=173K
K skaalas on 0K minimaalne temp, seetõttu on K skaala alati positiivne.
T1=273+t1
T2=273+t2
∆T=T2-T1= 273+t2-273-t1=∆t
, seega kui ΔT=10, siis
Q10 väärtus jääb enamasti vahemikku 1-3.
v1 – kiirust t1 juures
v2 – kiirus t2 juures
Q10 võib sõltuda millest milleni 10 on, võib sõltuda temperatuurist, pigem empiiriline parameeter. Võib olla erinev kui on 40 kraadist 50 kraadini vs 70 kraadist 80 kraadini
Kõigepealt leidis van’t Hoff reaktsiooni tasakaalukonstandi K kohta:
∆H0 on reaktsiooni standartne entalpiamuutus ehk soojuse sisaldus.
R universaalne gaasikonstant (8,314 J/Kmol)
T absoluutne temperatuur (°K)
Arrhenius näitas, et samasugune seos kehtib ka kiiruskonstandi kohta, aga pole reaktsiooni standartne entalpiamuutus, vaid on konstant, mida nim reaktsiooni aktivatsiooni energiaks Ea.
Mõlemad võrrandid on empiirilised (kogemusest tulenev – ei tea sellise käitumise taga olevaid mehhanisme , aga katsetulemused näitavad vastavaid tulemusi). Empiiriline võrrand kõlbab kasutada küll, kui katseliselt on asjad läbi proovitud Empiiriline seos kehtib rangelt ainult teatud tingimuste kohta, teiste tingimuste puhul tuleb läbi proovida, et kas ikka töötab.
Kui võrrand ära integreerida (avaldada lnk), siis logaritm konstandist on ikkagi konstant.
Vanasti üritati kõike viia sirge võrrandi kujule, sest polnud arvuteid. Mittelineaarseid seoseid paberil analüüsida on aga väga keeruline. Kaliiberkõver – konts x- teljel ja y-teljel on signaal .
Kui y-teljel lnk ja x-teljel 1/T, siis on tõus x kordaja -Ea/R ja vabaliige lnA on see punkt, mis ühtib y-teljega. Kui temp läheneb ∞, siis läheb 1/T nulli ja lnk läheneb lnA le.
Mida kõrgem on aktivatsioonienergia (Ea), seda teravamalt sõltub reaktsiooni kiiruskonstant temperatuurist. Kui akt energia on madal, siis võib öelda, et kiiruskonstant selle reaktsiooni jaoks on suur. Kui aktivatsioonienergia on 0, siis kiiruskonstant temp ei sõltugi nagu, on oma maksimaalse väärtuse peal (T→∞).
Kui on tegu mitmeetapilise reaktsiooniga, kus üks on palju kiirem etap , kui teised, siis määrab kogu reaktsiooni kiiruse selle aeglasema reaktsiooni kiiruskonstant.
, kus , kui k2>>k1, siis k~k2, kui k1>>k2, siis k=k1
23.11.2017
Aktiivsete põrgete teooria
Vaatame võrrandi
eksponentkuju
– selle sisu on tõenäosus, et antud põrkel on energia Ea või üle selle.
RT on keskmine soojusliikumise energia, energiad on sellega läbi jagatud. 25° juures on RT (8,314J/mol∙K)∙298K≈2,5kJ/mol.
Tuleb vaadata, kuidas muutub:
Kui T→0, siis 1/, siis eksponent läheneb 0-le (exp→0) järelikult kiiruskonstant on 0.
Kui T→∞, siis eksponent läheb 1-ks (exp→1).
Eksponent on positiivne ja väärtused jäävad 0 ja 1 vahele. Sisuliselt tähendab tõenäosust, et osakene omab energiat, mis on suurem või võrdne kui aktivatsioonienergia. Võib öelda, et aktivatsioonienergia ise on temperatuurist sõltumatu – siis näha, et mida suurem temp, seda suurem on nende osakeste hulk, mis omavad energiat Ea ja üle selle. Kui temp on 0, siis tõenäosus, et osakesed omavad energiat Ea ja üle, on 0. Kui temp läheneb ∞, siis on tõenäoline, et kõik osakesed omavad energiat Ea ja rohkem.
Molekuli energia soojusliikumise energia. Soojusliikumise energia on RT. Kui on 25kraadi, siis saame arvutada E=8,314*298=2477,57 J/mol=2,48kJ/mol.
Reaktsioonist lähevad läbi ainult need põrked, mis omavad piisavalt energiat – aktiivsete põrgete teooria.
A – kiiruskonstandi ülempiir, on määratud teoreetilise põrgete arvuga (Z) ja korrektse orientatsiooniga põrgete tõeäosuse (P) poolt.
A=PZ
Ainult teatud osa põrgetest on korrektse orientatsiooniga, seetõttu realiseerub kiiruskonstandi ülempiir võttes arvesse õige orientatsiooniga põrkeid, mitte ainult põrgete arvu.
Molekulide kineetiline energia, Maxwelli jaotus
y-teljel on antud osakeste suhteline hulk antud energiavahemikus (tõenäosus korda 100, siis %), x-teljel on kineetiline energia (kJ/mol). Kõvera alune pind peab integreerides olema 100%. Kui temp kasvab, siis kõrgema energiaga osakeste hulk kasvab, nihkub ka optimum – energiavahemik, kus on kõige rohkem teatud energiaga osakesi.
Molekulaarsed protsessid on kõik jaotused , olemas madalama energiaga ja kõrgema energiaga osakesed. Alati olemas mingi osa osakesi, millel on piisav energia, et läbi viia keemilist reaktsiooni.
Üleminekuoleku teooria
Väidab, et reaktsiooni teel lähteainest produktideni esineb mingi hüpoteetiline olek, mis on maksimaalse energiaga – kõige kõrgema energiaga olek reaktsiooni teel. Reaktsiooni tee on ka hüpoteetiline. Tee substraadist produktini – võib olla sideme pikkuse muutus vms.
Alumine graafik : 6 aatomilise tsükli kahe vormi üleminek, paat →tool (kaks konformatsiooni). Konformatsioon – üks saab teiseks üle minna nii, et kovalentsed sidemed ei katke . (Konfiguratsioon ei saa üle minna ühest olekust teise ilma kovalentsete sidemete katkemiseta). Reaktsiooni tee on pm üks nurk. Vaheolek (pool-tool) on energeetiliselt kõige kõrgem. Algoleku energia on kõrgem kui lõppoleku energia – üleminek on seega energeetiliselt soodne. Kui alguses vedelikus paat-olek, siis tasakaaluolekus on rohkem tool-konformatsiooni. Mida stabiilsem on energeetiliselt osake, seda suurem on tema esinemise tõenäosus.
Üleminekuolek on defineeritud mäe tipus – struktuur, mis vastab maksimaalse energiaga olekule, see on mäe tipus. Üleminekuolek on hüpoteetiline, kui tekib, siis kohe kaob, pm teda nagu ei eksisteeri. Üleminekuolek on energia maksimum mäe otsas.
Kõik energiad lähevad alati Gibbsi energia vähenemise suunas.
Mida kõrgem energia, seda ebastabiilsem on, sest kõik tahavad minna energia vähenemise suunas.
Energeetiline barjäär määrab ära kiiruskonstandi väärtuse. Kui teeme seda madalamaks, läheb kiiruskonstant suuremaks .
Ensüümid stabiliseerivad üleminekuolekut!
y-teljel E ja x-teljel S ja P. Reaktsiooni teel esinevad teatud mäed ja lohud . Lohkudes on metastabiilne vaheühend - nende energia on kõrge, aga on siiski energia miinimumis. Olemas kogu reaktsiooni aktivatsioonienergia, aga saame rääkida ka vaheühendite moodustumise aktivatsioonienergiast. Mida väiksemad kühmud, seda madalamad on aktivatsioonienergiad ja seda kiiremini reaktsioonid lähevad. Kui aktivatsioonienergiat pole, siis mäge pole ja järelikult kiiruskonstanti pm pole. Aktivatsioonienergia on vahe lähteoleku energia ja maksimaalse energia vahel.
AB≠ - üleminekuolek, on lähteainetega termodünaamilises tasakaalus, mida kirjeldab tasakaalukonstant K.
∆G0=-RTlnK →see on seos Gibbsi vabaenergia ja tasakaalukonstandi vahel.
∆G≠=∆H≠-T∆S≠
Peab teadma reaktsiooni koordinaate, siis saab arvutada. Peab teadma deltaE ja siis saab välja arvutada kiiruskonstandi.
Planki konstant h, seob omavahel energiat ja võnkesagedust, E=hν. Boltzmani konstant
Ea=∆H≠+RT
Arhheniuse aktivatsioonienergia võrdub entalpia +RT, seega peab ikka aktivatsioonienergia veidi temperatuurist sõltuma, katseliselt on seda sõltuvust aga väga raske määrata.
Mida teeb katalüsaator?
Katalüsaatori juuresolekul reaktsiooni kiiruskonstant kasvab, aktivatsioonienergia on väiksem.
Katalüsaator alandab reaktsiooni aktivatsioonienergiat:

• üleminekuoleku stabiliseerimine – katalüsaatori juuresolekul on üleminekuoleku moodustumine, läbimise tõenäosus suurem (vaheoleku seostumine ensüümile on soodsaim). Ntx kui keemilise reaktsiooniga kaasneb vastasmärgiliste laengute lahknemine (seda eriti ei toimu). Vahepeal on olek, kus laengud pole lahus, on lähestikku, aga liiguvad lahku. Selline olek on stabiliseeritud siis, kui seotud katalüsaator - COO- laeng stabiliseerib pos osalaeng , NH3+ laeng aga stabiliseerib negatiivset osalaengut. Vastasmärgiliste laengute esinemine õiges kohas stabiliseerivad antud vaheühendit.
  

Aktivatsioonienergia esineb eksponendi astendajas ja seetõttu muutused aktivatsioonienergias kutsuvad esile väga suuri muutusi kiiruskonstandis, sest muudame ju astmenäitajat.

• erinev reaktsiooni tee – katalüüsitav reaktsioon läheb läbi teistsuguse reaktsiooni tee kui katalüüsimata reaktsioon. Ntx ensüümiga saab olla vaheühendeid, ilma ensüümita reaktsioonis aga teatud vaheühendeid ei saa olla.
  

Katalüsaator ei mõjuta aga tasakaaluolekut, ainult kiirendab tasakaalu saabumist. Tasakaalukonstanti ensüüm ei mõjuta.
Ensüümide puhul on oluline see, et katalüüsi vahendav rühm on teatud kindlas paigas – seal, kus teda vaja on. Ensüümide efektiivsuse taga on struktuur – väga täpne rühmade paigutus . Sellepärast peavad ensüümid suured olema, et luua õige ruumiline aktiivtsenter, seda ei saa väikese arvu aatomitega/molekulidega moodustada.
Varasem ajalugu – nimetus ensüüm kujunemine
Ensüümide kohta öeldakse ka tänapäeval veel ferment. Ensüüm tuleb kreeka keelsest sõnast e`n zi`mi (in yeast) (1878)
Liebig – fermentatsiooni eest vastutavad mingid keemilised ühendid. Organiseerimata ferment Saadi teada, et see õige!
Pasteur – fermentatsioon on elusast lahutamatu – kui elu pole, siis pole ka fermentatsiooni. Organiseeritud ferment= mikroorganism .
Buchner näitas, et fermentatsioon on võimalik ka surmatud pärmi rakkudega, seega pole elus olemine vajalik fermentatsiooni läbiviimiseks.
1926 näidati, et ensüümid on kristalliseeritavad nagu ka teised keemiast tuntud ühendid.
Varasemas ensümoloogias oli uurimisobjektiks invertaas . Invertaasi reaktsioon sõltub keskkonna happelisusest, reakt kiirus langeb substraadi äratarbimisel jne. Invertaas ise reaktsiooni käigus ei muutu, on tõeline katalüsaator, oli võimeline katalüüsima 100 000 kordse enda massi sahharoosi hüdrolüüsi.
Sahharoos +vesi=glükoos+ fruktoos
Ensüümid on väga spetsiifilised . Glükoosi molekul (α-all, β-üleval, peal, teise C juures on OH all, 3 juures üleval, 4 juures all ja 5 C juures on CH2OH). α- galaktoos on samasugune, aga 4 juures on OH üleval. β-glükosidaas katalüüsib reaktsioone glükoosi derviaatidega, galaktoosi derivaate aga ei aktsepteeri . Galaktosidaas aga tunneb ära galaktoosi derivaate. Ensüüm on nagu lukk ja substraat on nagu võti, sellest ka kõrge spetsiifilisus.
Luku-võrme teooria: seletus ensüümide kõrgest spetsiifilisusest. Üks lukk ja teine võti, mis sobituvad ideaalselt. Ei seleta katalüüsi siiski!
Henri pani paika ES kompleksi idee keemiliselt ja matemaatiliselt korrektsetel alustel.
Michaelis-Menten-( Henry ) (MM)
Kaasaegse ensümoloogia rajajad. Just katselise poole pealt, sest mõõtsid algkiiruse kohta!
Mõõtsid algkiirusi erinevatel substraatide kontsidel. Küsimuseks oli, et kuidas sõltub ensüüm-katalüüsitava reaktsiooni kiirus substraadi kontsist.
v=f([S])
Keemikud mõõtsid reaktsioonikiiruse sõltuvust reagentidest nii, et alustasid kõrgest reagendi kontsist ja siis jälgisid toimuvat ajas – mõõtsid kineetikat. Y-teljel [S] (substraadi konts) ja x-teljel on aeg, jälgitakse, kuidas substraadi konts ajas väheneb. Kui leida joont kirjeldav tuletisfunktsioon, siis saame kiiruse . Igas katsepunktis on võimalik leida vastav kiirus jne. Õiged tulemused saab ainult siis, kui kiiruse languse taga on ainult substraadi kontsi vähenemine.
Ensüüm-katalüüsitud reaktsioonde puhul on asi keerulisem, sest tulevad mängu teised faktorid , mis mõjutavad reaktsiooni kiirust ja mille mõju võib aja jooksul tugevamaks muutuda. Ntx produkti akumuleerumisel saab oluliseks produkt - inhibitsioon , selle osa suureneb ajas, sest produkti konts suureneb. Lisaks on suur osa ensüüme õrnad molekulid – neil on kalduvus denatureeruda, inaktiveeruda, ajas ensüümi osaline inaktiveerumine progresseerub. Varasemad ensümoloogid uurisid asju keemikute moodi.
Michaelis ja Menten võtsid kasutusele uue lähenemise - mõõtsid ainult algkiirusi. Nad vaatasid ainult seda osa, kus ajakõver on lineaarne. Y-teljel on [P] ja x-teljel on t. S01, S02, S03. Substraadi konts on konstantne, pole jõudnud produkt akumuleerida, sest algkiiruse mõõtmine on lühiajaline kineetika jälgimine. Lühikese aja jooksul on ensüümi inaktiveerumine vähem oluline. Algkiirus – produkti ajas tuleb lineaarselt, järelikult on see empiiriline.
Kiirustest rääkimine on seega algkiirustest rääkimine!!!
M-M kasutasid atsetaatpuhvreid ja kontrollisid pH-d.
MM võrrand algkiiruse kohta!
MM võrrandi eeldused
Eesmärgiks on leida seos reakt kiiruse ja substraadi kontsi vahel. Antud juhul lähtutakse kaheastmelisest reaktsiooniskeemist.
(k1 on teist järku kiiruskonstant, k-1 ja k2 on esimest järku)
EP kompleks peaks ka olema. Katalüüs pöördumatu, see samuti skeemi lihtsustus. MM võrrandit kasutades võime välistada pöördreaktsioonid.
Eeldused:

• v on algkiirus
  
• substraat on ensüümiga võrrelduna ülehulgas S0>>E0 (1000+ korda rohkem)
  
• reaktsiooni teine osa (ESE+P) on pöördumatu
  

(Ülehulgal pole midagi pistmist küllastumisega!!! Ntx varieerime substraati [S] 0,1-20mM, võib teha nii, et ensüüm on 0,1mM või 0,1μM või 0,1nM. Substraadi kontsentratsiooni varieerimise vahemiku määrab ära MM konstant, aga ülehulga asja saab määrata selle järgi, et kui palju võtame ensüümi. 0,1 mM E0 ei rahulda ntx antud tingimust, et substraadi oleks ensüümiga võrreldes ülehulgas.)
Algkiiruste mõõtmine välistab:

• ensüümi denaturatsioon
  
• produktinhibitsioon
  
• võimalik pöördreaktsioon
  

pH kontroll ka oluline.
Kaheastmeline reaktsiooniskeem:
I aste – seostumine
II aste – keemiline aste, kus toimub substraadist produkti moodustumine
EX! MM võrrand ja selle tuletamine . Seda tuleb osata teha kahel eeldusel , tulemus on erinev.
1.MM võrrandi tuletamine kiire tasakaalu eeldused
Produkti tekib ainult ühte noolt pidi, seetõttu saab massitoime seaduse abil kirjutada, et
(reaktsioon on pöördumatu, midagi ära ei lähe, seega ei pea midagi ka maha lahutama )
Kuidas leida ensüüm-substraat kompleksi kontsi ja kas see ka ajas muutub? Selle küsimuse lahendamiseks peame kiiruse avaldama millegi mõõdetavaga, millegagi, mida me teame. Me teame substraadi kontsi, sest ise segame lahused kokku, teame ka kogu ensüümi kontsi. Me ei tea ensüüm-substraat kompleksi kontsi [ES]. Selle kontsi avaldamiseks mõõdetavate teadaolevate suuruste kaudu, siis tuleb kasutusele võtta kiire tasakaalu eeldus.
Eeldus on, et k -1>>k2
See annab aluse öelda, et seostumine ehk esimene aste on tasakaalus ja pole mõjutatud teisest astmest (E+P tekkest ). Tasakaal on kiire võrreldes keemilise etapiga. See eeldus annab võimaluse avaldada otsitava ensüüm-kompleksi kontsi tema dissotsiatsiooni tasakaalu konstandi kaudu Ks
Me räägime vabast substraadist ja vabast ensüümist [E]. Mängu tuleb eeldus, et S0>>E0 (palju suurem)
See osa substraadist, mis on ensüümiga seotud, see on tühine, sest [ES]≤[E0] ja me võime vaba substraadi kontsentratsiooni asendada kogu substraadi kontsentratsiooniga.
Kogu ensüüm võrdub vaba ensüüm + substraat-kompleksis olev ensüüm→ E0=[E]+[ES]
[E]=E0-[ES]
Kui võrrandeid on vähem kui tundmatuid, siis asi ei lahene. Praegu saab lahendada.
E0 – on kogu ensüümi konts
[S] – substraadi konts
Ks – konstant. Tasakaalukonstant . Ühik on sama, millega mõõdame substraadi kontsi.
Kõik on mõõdetavad
Kiiruse leidmiseks:
, seega:
Näeme, et kiirus võrdub konstant korda substraadi konts jagatud mingi konstant+substraadi konts.
Rangelt võttes on [S] vaba substraadi kontsentratsioon, seega peab meeles pidama, et [E]0k-1). Produkti tekib ainult ühte rada pidi:
ES-i tekib ainult ühte rada pidi, on teist järku reaktsioon, samas läheb ES-i ära ka, seetõttu tuleb maha lahutada
Need vanad ütlesid, et substraat-ensüüm kompleksi konts ajas ei muutu , seega
Kuna, siis
Kiirus:
MM said, et
VC said, et
2.MM võrrandi tuletamine statsionaarse faasi eeldused
Kiire tasakaalu eeldus sai väga palju kriitikat, pole õigustatud. Briggs ja Haldane pakkusid välja üldisema lahenduse, ei teinud kiire tasakaalu eeldust . Nad ei teinud eeldusi üksikute kiiruskonstantide väärtuste kohta.
Reaktsiooniskeem on ikka kaheastmeline
(k1 on teist järku kiiruskonstant, k-1 ja k2 on esimest järku)
Juurde toob ainult üks nool, + märgiga seega k1. Ära viivad kaks noolt, mõlemad tuleb maha lahutada.
Diff võrrandist lahti saamiseks on hea eeldada, et [ES] ajas ei muutu, seega
← see on statsionaarse faasi eeldus. Väitsid, et eksisteerib olukord, kus ensüüm-substraat kompleksi konts ajas ei muutu, sest teda juurde toovate ja ära viivate radade summarsed kiirused on võrdsed. Statsionaarne olek – juurde toovate ja ära viivate radade summaarsed kiirused on võrdsed. Ei teinud eeldusi üksikute kiiruskonstantide suhtes.
Vabast ensüümist saame lahti seose kaudu
Kiiruse leiame:
BH said, et
( Michaelise konstant)
MM ütlesid, et k2k-1, siis k -1=0 →
KM on näiline dissotsiatsioonikonstant, tõeline disskonstant oleks siis, kui k –1>>k2, et pm MM asi vist .
Stats : juurdetoovate ja äraviivate radade summaarsed kiirused! Kui kiirused samad, siis saab öelda, et ainel stats c.
Kui statsionaarse faasi eeldust ei tee, siis otsene integreerimine annab tulemuseks pika, keerulise võrrandi, mis sisaldab endas ka aega. Muidu on nagu MM võrrand, aga lugejas esineb eksponentliige. Võrrand arvestab ka eelstatsionaarset faasi. Esineb ajavahemik, mil [ES] pole saavutanud püsivat väärtust, see ongi eelstatsionaarne faas
→see kirjeldab ensüüm-substraat kompleksi kontsentratsiooni
ES kompleksi kontsentratsiooni kujunemine ajas, [ES]ss on statsionaarne konts, platoo väärtus ja kõver kirjeldab minemist platoole. Kui aeg läheb suureks, siis läheb sulgudes olev eksponentliige 0-i ja platoo väärtus saavutatud. Kui pikk aeg kulub platoo saavutamiseks, see aeg on määratud kiiruskonstantide summa poolt.
peaks olema k+
Michaelis Menteni võrrandi üldkuju
Üldkujul k-sid ei tõlgendata mingite noolte kaudu nagu varem. Ei teata reaktsiooniskeemi.
Üldkuju pm on
(c-d on konstandid)
MM kehtib väga paljude reaktsioonimehhanismide kohta, seetõttu kirjutatakse üles üldisemal kujul:
kcat – katalüütiline konstant. kcat keemilise reaktsiooni kiiruskonstant. Vastab substraadi molekulide arvule, mida on vaja selleks, et saaks ära reageerida. Alati esimest jätku, ühikuks 1/s. Ta iseloomustab komplekside reaktsioonivõimet – ensüüm-substraat kompleks, ensüüm-produkt kompleks. Väärtus ei saa olla suurem kui ühegi üksikult võetud esimest järku kiiruskonstant (pärisuunalise reaktsiooni).
Ntx: ES→ES`→EP→E+P
Kõik → on esimest järku kiiruskonstandid, katalüütiline konstant ei saa suurem olla kui ükski neist üksikutest kiiruskonstantidest. Kui mingi kiiruskonstant on väga väike, siis katalüütiline konstant läheneb sellele, sest reaktsiooni katalüütiline konstant ei saa olla suurem kui kõige aeglasem lüli. Katalüütiline konstant võib olla ka kombinatsioon erinevatest kiiruskonstantidest, ALATI on esimest järku. kcat ei viita mingile kindlale konstantidel vms.
Varem polnud teada ensüümi konts ja seetõttu kombineeriti kaks konstanti üheks – Vmax=kcat∙E0, ühik on M/s, reaktsiooni kiiruse ühik! Vmax on piirkiirus, MITTE maksimaalne kiirus. Ei ole fundamentaalne ensüümikineetika parameter, sest sõltub ensüümi kontsentratsioonist. Vmax -ide omavaheline võrdlus ei anna midagi, kui pole ära mainitud ka ensüümi kontsi.
Murru nimetajas on KM. Eelmine loeng . Tegelikult võib KM olla ka tõeline dissotsiatsioonikonstant, võib olla keeruline kombinatsioon. KM on näiline dissotsiatsioonikonstant ja iseloomustab ensüümi ja substraadi vahelise seostumise tugevust. Mida väiksem on KM, seda kõrgem on ensüümi afiinsus substraadi suhtes. Kui teame KM väärtust ja valmistame sellise substraadi kontsiga lahuse, siis mõõdetud kiirus vastab poolele Vmax-ist. Tema ühik on sama, millega mõõdetakse substraadi kontsentratsiooni. KM võiks väljendada hoopis nii –
KM oma olemuselt tasakaalukonstant, näiline dissotsatsioonikonstant, dissotsatsioontasakaalukonstant. KM on substraadi c, mis tagab poole piirkiirusest. Ühikuks ühik, millega substraadi c mõõdetakse, sest me liidame neid.
Spetsiifilisuse konstant ks (s näitab seda, mille kohta konstant kehtib, antud juhul on s nagu substraat). Ks iseloomustab vaba ensüümi ja substraadi vahelist reaktsiooni, alati teist jätku! On väga oluline konstant, tuletatav kahest eelpool toodust konstandist:
See ei saa olla suurem kui ükski eraldi võetud teist järku kiiruskonstant pärisuunalise reaktsiooni teel.
27.11.2017
MM võrrandi poolt kirjeldatud kõver: v versus [S]
Matemaatiliselt on ristkülikukujuline hüperbool. Võrrandi paremaks mõistmiseks on hea vaadata piirjuhte. X-teljel on substraat ja y-teljel on kiirus. Vaateme kolme piirjuhtu.
Asümptoot: läheneb sellele, aga kunagi päris ei jõua sinna, ei jõua platoole.
Kui substraadi konts on palju suurem kui KM:
1.[S] >>KM, siis KM + [S]→[S] (läheneb S-ile)
v=kcat∙E0=Vmax
piirkiirus on asümtoot – sirgjoon, millele funktsioon läheneb, aga kunagi ei jõua selleni. Kunagi pole võimalik pm piirkiiruseni jõuda. Piirkiirust võiks tegelikult tähistada Vlim-ga, aga ajalooliselt on korrektse (aga siiski ebatäpsem) Vmax.
2. [S]= KM
[S]+[S] (see on KM asemel)=2[S]
v=½kcat∙E0=½Vmax ehk kiirus on saavutanud poole piirkiirusest.
3. substraadi konts on palju väiksem kui KM ehk [S]>k3, siis hüpe läheneb ensüümi kontsentratsioonile – π→E0.
Ntx on tegemist aktiivtsentrisse suunatud pöördumatu inhibiitoriga ( inhibiitor reageerib ensüümiga ja ensüüm sealt enam ei vabane), siis k3=0, sest edasist reaktsiooni ei teki. Sellisel juhul hüpe π=E0 ja ajas näeksime, et et toimub kiire reaktsioon ja siis platoo. Eelmisel juhul oli kiire reaktsioon ja siis aeglane lineaarne tõusmine vms.
Tiitrimise mõte oli määrata aktiivtsentrite kontsentratsiooni, see võimalik ainult teatud tingimustel (kui tagumine reaktsioon pole esimesega võrreldes kiirem, siis saame hüppe väiksema kui ensüümi kontsi ja siis jama vist). Esimest etappi saame kiirendada substraadi kontsi tõstes, sest k´1 kasvab substraadi kontsentratsiooni tõstes. Originaaltöös leidsid autorid, et hüpe oli 60%. Hüpe ei saa olla kunagi suurem, kui on ensüümi kontsentratsioon. Hüpe ei saa olla kõrgem kui 1 nM, kui teeme 1nM ensüümiga kontsiga katset.
Ensüümi kontsentratsiooni mõju reaktsioonikiirusele
Reaktsioonikiirus on lineaarselt seotud ensüümi kontsentratsiooniga.
Kõrvalekalded lineaarsusest
Jooned allapoole kõverad, põhjused:

• Reaktsioonis esineb limiteeriv komponent
  
• Pöörduva inhibiitori esinemine ensüümpreparaadis E+I↔EI. Kui võtame rohkem ensüümi, suurendame mõlema kontse , proportsioon on küll sama, aga kontsid on erinevad – kompleksi tekib rohkem. Lisaks proportsioonile on oluline ka konts – mida kõrgem konts, seda rohkem on E+I komplekse ja siis tulemuseks allapoole suunatud kõver.
  
• Mõõtmismeetodite piiratus – signaali peaks kalibreerima (punktid peaksid jääma kaliibri mõõtevahemikku).
  

Jooned on allapoole kõverad:

• Fikseeritud mõõteprioodi kasutamine algkiiruse asemel
  
• Reaktsioonisegus esineb limiteeriv komponent
  
• Pöörduva inhibiitori esinemine ensüümpreparaadis
  
• Mõõtmismeetodi piiratus
  

Jooned on ülespoole kõverad:

• Mittespetsiifiline seondumine
  
• Väikese koguse toksilise ühendi esinemine reaktsioonikeskkonnas
  
• Pöörduva aktivaatori esinemine ensüümpreparaadis (E+A↔EA Mida rohkem ens võtame, seda rohkem ensüümi kompleksis aktivaatoriga)
  
• Ensüüm on aktiivne multimeersena E+E↔E2
  

Produkti moodustumine erinevatel ensüümi kontsidel – võime mõõta keskmisi kiirusi ja paneme teljestikku ja näeme, et 1 min tagant võtud lineaarne ens kontentratsiooniga, aga 30 min läheb alla, st et peame lähtuma algkiirusest.
Abireaktsioonide kasutamine
Põhireakt on:
A→B pole jälgitav, siis kasutame abireaktsiooni, mis kasutab B-d substraadina C tegemiseks ja see reaktsioon on pidevalt jälgitav.
Kasutatakse juhul kui:

• Uuritav reaktsioon ei ole jälgitav – reaktsioonile ei järgne sobivat signaali. Kasutatav abireaktsioon peab olema jälgitav. Ntx kui põhireaktsioon pole pidevalt jälgitav, peame proove välja võtma (ajapunktid), siis saab abireaktsiooni abil muuta pidevalt jälgitavaks.
  
• Uuritav reaktsioon on tugevalt produktinhibeeritud – eemaldame abireaktsiooniga inhibiitori.
  
• Uurime tasakaalulist reaktsiooni vähemeelistatud suunal
  

Ntx heksokinaasi reaktsioon:
Glükoos+ATP→glükoos-6- fosfaat +ADP
See reaktsioon pole jälgitav, kasutame abireaktsiooni:
Glc-6-P+NAD+→Glükonolaktoon-6-P+NADH+H+
NADH on aga spektrofotomeetriliselt jälgitav, ε340nm=6,22mM-1cm-1.
Kui küvetis on 1mM, siis on neeldumine 6,2, 1μM lahus dA=0,0062. Sellele lisandub veel ka taust – vesi annab kvarts küvetis 0,05.
Otsime:
Mõõdame:
Abireaktsioonide kasutamine
Abireaktsiooni kiirus ei tohi limiteerida.
X-teljel t ja y-teljel [C], lag-faas on. Abireaktsioon peab olema piisavalt kiire, et lag-faas ei oleks pikk. Reaktsiooni kulgedes hakkab ka põhireaktsiooni kiirus ajas langema , uuritava ühendi (B) konts peab saavutama statsionaarse väärtuse enne, kui põhireaktsiooni kiirus on jõudnud oluliselt langeda – lag-faas peab olema küllaltki lühike. Kui kahekordistada abiensüümi kontsi, siis ei tohi tulemused sellest muutuda – see näitab, et abireaktsioon pole limiteeriv. Uuritava reaktsiooni kiirus peab olema proportsionaalne uuritava ensüümi kontsentratsiooniga – suurendame põhireaktsiooni kiirust (lineaarne seos).
Ntx Inhibiitori eemaldamine abiensüümi kasutamisega:
Väljamäe katse, abiensüüm on glükosidaas vms. Juurde pandud ka tselluloos , sealt vabaneb midagi, mis on inhibiitor, beeta-glükosidaas eemaldab inhibiitorit vms.
Kaks või enam abiensüümi
Tahame uurida, kuidas eelnev reaktsioon on inhibeeritav glükoos-6- fosfaadi poolt. Sama abireaktsiooni ei saa kasutada. Võimaluseks on jälgida ADP teket, seda saab teha kahe abireaktsiooni kaudu.

• ADP+PEP→ATP+püruvaat (PEP – fosfoenoolpüruvaat, katalüüsib püruvaadi kinaas – võimeline fosfaati üle andma ADP-le, väga makroergiline reaktsioon)
  
• Püruvaat+NADH+H+→ laktaat +NAD+ (katalüüsib laktaadi dehüdrogenaas)
  

NAD+ valgust ei neela, saame jälgida ainult redutseeritud vormi (NADH) kadu. Taustaks on NADH kogus, mis alguses küvetti lisasime.
Meil on rohkem abiensüüme, eelstatsionaarne faas pikeneb selle tõttu, tuleb optimeerida mõlemat abireaktsiooni.
Abireaktsioone saab kasutada ka astmelise põhireaktsiooni määramiseks . Ntx huvitab mind glükoosi konts, siis saab glükoosi määramiseks kasutada heksokinaasi reaktsiooni (glükoos+ATP) koos glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaasi reaktsiooniga. Siis on NADH mõõtmine madalal taustal. *Võime kasutada kineetikat – teeme kaliiberkõvera, kus x-teljel on glükoos ja y-teljel dA340. Siis saame kalibreerida, tulemus peab olema lineaarne. *Võime mõõta signaali kiirust, signaal peab olema proportsionaalne glükoosi kontsentratsiooniga. Kui võimalik, siis lõpp-punkti määramine annab suurema signaali ja see lihtsam ka. X-teljel t ja y-teljel dA340.
Arvestamist vajavad asjaolud

• Abiensüümid võivad reageerida uuritava reaktsiooni substraatidega – Glc-6-P dehüdrogenaas katalüüsib mingil määral ka glükoosi oksüdeerimist. Tihti ei toimu reaktsioonis molekulide struktuuris väga suuri muutusi – B võib olla sarnane oma struktuurilt lähteainele A. Abiensüüm ei tohiks üldse tegelikult Ad ära tunda, see sõltub aga ensüümi spetsiifikast jne.
  
• Abiensüümi puhtus – preparaat peab olema antud rakenduse jaoks piisava puhtusega. Täiesti puhtsaks abiensüümi teatud juhtudel pole vaja puhastada (liiga ajakulukas ja mõttetu).
  
• Hind
  

Katsete planeerimine (ensüümkineetikas)
Mis meid huvitab?

• Lihtsalt ensüümpreparaadi aktiivsus
  
  • Kõrgem substraadi konts annab reeglina parema tulemuse
    
• Ensüümkineetika parameetrite leidmine
  
  • Vahemik, milles varieerime substraadi kontsi, see sõltub KM-ist. KM hinnangu saab kui varieerida substraadi konts väga suures skaalas (x-teljel [S], y-teljel v, saab kätte info, et madal substraadi konts küllastab ensüümi ära. Siis tuleb teha uuesti katse, kus [S] on 0-st kuni selle leitud kontsini. Siis vb tulla ka vale, aga samas võib tulla parem joonis. Kui võimalik, siis [S]=0,2-10KM. 10 KM annab 90% küllastuse. Kui Vmax ei saa määrata, siis ei saa määrata ka KMi. Kui kõrgemaid substraadi kontse ei saa kasutada, siis ainuke saadav parameeter, mille kätte saame on spetsiifilisuse konstant – . Saame määrata Vmax ja KM suhte, aga kumbagi eraldi määrata ei saa.
    
  • Arvestama peame taustasignaali, kui [S]=0, siis v=C . Kui tausta signaal sõltub substraadi kontsentratsioonist, siis on väga tülikas, peab iga [S] jaoks uuesti tausta mõõtma. Sellisel juhul c=k[S]
    
• Kordusmõõtmiste kasutamine – viisakas on tulemused esitada vuntsidega ehk standardhälvetega. Süstemaatilisest veast kordusmõõtmiste abil lahti ei saa, kordusmõõtmised aitavad juhuvigade vastu. Mudel ei tohi kalduda punktidest eemale rohkem kui standardhälve, sellisel juhul pole mudel hea. Kui võrrand kirjeldab katsetulemust hästi, see ei tähenda, et meie katses kehtib mehhanism , mille järgi antud võrrand saadud vms. Eksed on need punktid, mis kalduvad keskmisest kõrvale rohkem kui +/- 2 standardhälvet, siis on pm õigus see punkt katsest välja visata (nässuläinud punktide eemaldamine).
  

Valk-ligandi soestumine
MM võrrand;
v=kcat[ES]
, kus
vastab küllastusastmele
Seostumine→kcat=0
Ensüümi ja ligandi seostumisel
[L]b on sestunud ligandi konts (bound), [L]f – vaba ligandi konts (free), Kd – ensüüm-ligand kompleksi dissotsiatsioonikontsant
(kon on teist järku kiiruskonstant, koff on esimest järku kiiruskonstant kompleksi lagunemise kohta)
n näitab seda, mitu ligandi seostumiskohta ühe ligandi molekuli küljes on. Tavaliselt seob üks ligand ühe ensüümi.
KM on näiline dissotsiatsioonikonstant, antud juhul tõeline dissotsiatsioonikonstant vms. Isoterm – temp konstantne. Isobaar – rõhk on konstantne.
Kui x-teljel [L]f ja y-teljel [L]b, siis saame ristküliku kujulise kõvera ja asümtoot on nE0. Kd on see vaba ligandi konts [L]f, mille juures pool seostumiskohtades on täidetud. Seostumist võib esitada ka assotsiatsioonireaktsiooni konstandi kaudu Kass=1/Kd, siis:
Seostumine peab olema tasakaalus, kui sellist analüüsi tegema hakata. Seostumine peab olema jõudnud tasakaalu, seostunud ligandi konts ajas enam ei muutu – platoole jõudnud. Probleemiks on see siis, kui tugev seostumine, madal Kd. Kd määramisel peab ligandi kontsi varieerima Kd suhtes. Kui Kd väga väike, siis peab kasutama hästi väikseid ligandi kontsentratsioone – isegi kui kon on suur (seostumine on kiire), siis aeglaseks teeb asja see, et ligandi konts on niivõrd väike. Tugevamate seostumiste puhul on Kd-d 10-14 M, siis tasakaalu saavutamine võtab aega nädalaid.
Küllastus on ligandi kontsentratsioon Kd suhtes!!
Valk-ligandi seostumiskonstantide määramine
Kui määrata ensüümiga kompleksis olevat ligandi, teame kogu ligandi, siis saab vaba ligandi arvutada. X-teljele läheb vaba ligand.

• Tasakaaluline dialüüs – kaks kambrit, mis omavahel eraldatud poolläbilaskva membraaniga. Ühes kambris on ensüümkoos ligandiga (tekib tasakaal, osad seostuvad, osa ei seostu), teises kambris on ilma ensüümita ligand (alguses pole pm midagi). Ligand liigub läbi pooride läbi, vaba ligandi konts ühtlustub mõlemal pool membraani. Kui süsteem lasta tasakaalu, mõlemas kambris määrata ligandi (ligand radioaktiivne, siis ühest kambrist saame [L]b+[L]f, teisest saab [L]f (ainult ligandiga kamber).
  
• Tasakaaluline geelfiltratsioon – põhineb geelfiltratsiooni kolonnil, mis suudab eristada valku ja ligandi. On kolonn , mis on tasakaalus puhvri ja ligandiga mingis kindlas kontsentratsioonis. Paneme peale valgulahuse, milles ka tasakaaluline lahus sees vms. Tulemuseks on see, et (y-teljel ligandi signaal, x-teljel vol – platoo, jõnks üles, platoo, jõnks alla, platoo). Valk veab osa ligandist endaga kolonnist kaasa. Platoo on ligandi taustajoon. Valk veab ligandi välja, kust tuleb valk välja, sealt tuleb ka ligand välja. Lohk on seal, kust peaks tulema välja ligand, aga ligand tuli juba valguga koos välja.
  

Ntx kolonn on tasakaalustatud tsellobioosiga. Mõõdetakse tsellobioosi hulka ja valgu hulka. Mida pikemad on elueerimisajad, seda laiemaks lähevad jõnksud vist. Kui Kd on suur, siis peab valku olema ka samas suurusjärgus – siis aga ei saa seda meetodit kasutada. Ei saa 2 mM valku läbi lasta, ei lahustu.

• Ultratsentrifuugimine - ensüüm ja tRNA, mõlemad suured molekulid, kompleks liigub tsentrifugaaljõu väljas kiiremini (suurem mass), kui kumbki komponent eraldi, sedasi võimalik eraldada komplekse.
  
• Adsorptsioon filtritele – meil filter , mis jääb valgu külge kinni. Tuleb kähku pesta – peame eemaldama vaba ligandi filtri küljest, määrame ligandi, mis on ensüümi tõttu filtri küljes.
  
• Spektroskoopilised meetodid - seostumine kutsub valgus või ligandis esile mingi spektrimuutuse. Fluorofoorid valgus on trüptofaanid ( emissioon on 300-400nm kandis ). Trüptofaanide fluorestsents on sõltuv nende lähiümbrusest – millises keskkonnas on (kas hüdrofoobne või hüdrofiilne keskkond). Valgu sisesed trüptofaanid on hüdrofoobses keskkonnas, aktiivtsentris trüptofaanid võivad olla solvendile eksponeeritud ja seal on hüdrofiilne keskkond. Ntx kui ensüümi tunnelis on trüptofaanid, kui ligand seostub sinna ja seostub trüptofaanidele, siis fluorestsents muutub. Nii saab mõõta ensüümi hulka, mis on ligandiga kompleksis.
  
• Mikrokalorimeetria – põhineb reaktsiooni soojusefektil. Masin, mis mõõdab vooluhulka, hoiab temp konstantsena. Ligandi seostumisel valguga vabaneb soojus , soojusefekt ja seda on võimalik mikrokalorimeetri abil detekteerida.
  

Pinna plasma resonants (surface plasma resonance) – kullaplaat, kuhu on immobiliseeritud ligand mingi vahelüliga (välistab ruumiefekti, pole liiga pinnalähedal ja valk saab seega seostuda). Mõõdetakse valguse käitumist, kuidas peegeldub ja see sõltub pinna omadustest. Kui valk istub ligandi peale, siis muudab pinna omadusi. Kui kana istuks viljakõrre otsa, siis vajuks viljakõrs ju maha Väga suur ligand ei tohi olla – kui väga jäme tuugas, siis kana istumine mingit efekti ei oma
Osa 4. Inhibitsioon
Inhibiitorid on ained, mis alandavad ensüümkatalüütiliste reaktsioonide kiirust. Me vaatleme inhibiitoreid, mis mõjuvad ensüümile, kui katalüsaatorile. Teatud solvendid denatureerivad valku, mõjuvad valgule sõltumata katalüüsitavast reaktsioonist, neid aga ei käsitle.
Täielik inhibitsioon – ensüüm on täielikult inhibeeritud, jääkaktiivsust pole.
Osaline inhibitsioon – mingi jääkaktiivsus jääb järgi. Näilised ensüümkineetika parameetrid sõltuvad inhibiitori kontsist hüperboolselt.
Pöörduva inhibitsiooni puhul moodustab ensüüm inhibiitoriga dünaamilise, mittekovalentse kompleksi – pidev formeerumise ja lagunemise prosess. Inhibiitori efektiivsust sõltub sellest, kui tugev on seostumine – Ki väärtus oluline.
Mida väiksem Ki, seda tugevam on inhibiitor.
E+I↔EI

• Konkurentne ehk spetsiifiline inhibitsioon
  
• Ebakonkurentne ehk katalüütiline inhibitsioon
  
• Sega tüüpi inhibitsioon
  
• Mittekonkurentne inhibitsioon – segatüüpi inhibitsiooni üks erijuhtudest.
  

Need tüübid on defineeritud selle järgi, kuidas nad mõjutavad Vmax ja KM.
Pöördumatu inhibitsiooni puhul moodustatakse pöördumatu kompleks – aktiivset ensüümi enam tagasi ei teki. Seda nim ka inaktivatsiooniks. Inhibiitoreid, mis toimivad pöördumatult, neid nim katalüsaatorite mürkideks, sest toimivad väga väikestel kontsidel väga efektiivselt.
Näilised ensüümkineetika parameetrid
Näiline tuleb sellest, et enamiku inhibitsiooni juhtude puhul jääb MM võrrand kehtima ka inhibiitori juuresolekul. Kui ei tea, et inhibiitor sees on, siis ei saagi seda teada, saadavad parameetrid on näilised parameetrid. Kui puhas ensüüm olemas, saame teadlikult uurida inhibiitorit (lisada), siis näeme, et näilised ensüümkineetika parameetrid sõltuvad inhibiitori kontsist ja teevad seda viisil, mis on määratud inhibitsiooni tüübi poolt.
Näilisi parameetreid tähistatakse ülaindeksiga app (näiteks ) ja võrrandid on vastavalt:
Konkurentne inhibitsioon (kõige tavalisem ) – Kic
Kõige tavalisem, konkureerivad inhibiitor I ja substraat S vaba ensüümi pärast, mõlemad tahavad sinna seostuda. Kui üks on ensüümile seostunud, siis teine seostuda ei saa. Inhibiitor seostub AINULT vabale ensüümile.
Kiiruse võrrandi leidmisel peab arvestama, et koguensüüm E0=[E]+[ES]+[EI] (E on vaba ensüüm)
Kic – konkurentse inhibitsiooni konstant.
Ensüümi ja inhibiitori seostumiskohad on ruumiliselt samad või kattuvad. Võrrandist on näha, et Vmax ei sõltu inhibiitori juuresolekust. Vmax-i saavutamiseks kulub lihtsalt rohkem substraati, Vmax on asümptoot, kuhu kiirus läheneb substraadi kontsi suurenemisega. Kui üks inhibiitori konts ja varieerimine substraadi kontsi, siis saame kiirusvõrrandisse konstandi – näiline KM
Kui [I]=Ki, siis
Ki väärtus näitab vaba inhibiitori kontsi, mille juures pool ensüümi on inhibiitoriga kompleksis ja pool on vaba.
Vmax/KM sõltub ka inhibiitori kontsentratsioonist, see langeb inhibiitori juuresolekul.
Kui [I]=0, siis
Kui [I]→∞, siis
(tühine seostumine)
Edaspidi, kui räägime mõjust Vmax-le, siis mõtleme tegelikult mõju kcat-le.
04.12.2017
Ebakonkurentne inhibitsioon (uncompetitive) - Kiu
Kiu – ebakonkurentse inhibitsiooni konstant
Inhibiitor seostub ainult substraat-ensüüm kompleksile, vabale ensüümile ei saa seostuda. Substraadi seostumine peab ensüümis indutserima konformatsioonilise muutumise, mille tõttu saab võimalikuls inhibiitori seostumine. Lähtudes statsionaarse faasi eeldusest võime välja kirjutada kiirusvõrrandi.
Näeme, et inhibiitorist sõltuvad nii Vmax kui ka KM. Vaatame kuidas kiirus sõltub substraadi kontsist – substraadi muudame ise, kiirust mõõdame, inhibiitor on ühel kontsil (paneme või on seal). Inhibiitori kontsi võib lugeda konstandiks, sest see ei muutu. MM võrrand jääb üldkujul kehtima.
Ebakonkurentse inhibiitori juuresolekul on piirkiirus madalam, väljakonkureerimise võimalust pole, piirkiirus on mõjutatud inhibiitori kontsist.
Näiline substraadi seostumine on tugevam – KM on inhibiitori juuresolekul väiksem. See tuleneb sellest, et üks substraati sisaldav kompleks on juures üks substraati sisaldav kompleks ESI on juures). Näiline KM on inhibiitorist samamoodi mõjutatud kui piirkiirus.
pole aga inhibiitorist mõjutatud. MM võrrandi teljestiku algtõus jääb samaks, see faas jääb inhibiitorist mõjutamata.
Sega tüüpi inhibitsioon
Sisaldab mõlemat tüüpi. Inhibiitor seostub nii vabale ensüümile kui ka kompleksile (erinevate tugevustega). Nende skeemide kohaselt on konstandid tõelised dissotsiatsioonikonstandid – tupikreaktsioonid, edasi ei reageeri. Kiiruse sõltuvus substraadi kontsist – üldkuju on sama, aga K-sid tuleb juurde. Vmax on madalam, Vmaxi mõjutab ebakonkurentne osa Kiu. KM on suurem tänu konkurentsele komponendile Kic ja väiksem tänu ebakonkurentsele komponendile Kiu. Vmax/KM on väiksem tänu suuremale Michaelise konstandile konkurentse inhibitsiooni elemendi tõttu. Tihti on konkurentne komponent tugevam, ebakonkurentne esineb nõrgemalt – seda saab siis pm ignoreerida.
Kirjanduses seda väga tihti ei kohta.
Inhibiitor seostub nii vabale ensüümile kui ka ensüüm-substraat kompleksile.
Mittekonkurentne inhibitsioon – noncompetitive
Tegemist on sega tüüpi inhibitsiooni erijuhuga, kus mõlemad inhibitsioonikonstandid on võrdsed Kic=Kiu (inhibiitor seostub sama tugevalt nii E-le kui ka ES-le)
Vmax mõjutatud inhibiitori kontsist, on väiksem, KM aga ei sõltu inhibiitori kontsentratsioonist.
Vmax langeb, spetsiifilisusekonstant langeb, Km inhibiitorist mõjutamata.
Inhibitsiooni tüübi ja tugevuse määramine
Teadlikult inhibitsiooni uurima hakates peab olema mingi kaudne Ki väärtus olemas, vaja on hinnangut Ki väärtuse kohta. Eksperiment seisneb selles, et teostame rida kaitseid, igaüks erineva inhibiitori konts juures. Me varieerime substraadi, mõõdame kiirust – x-teljel [S], y-teljel v, tulevad kõverad, kus [I]=0, järgmine joon teise I kontsiga jne umbes 5 graafikut. Me näeme umbes, kas Vmax on mõjutatud või ei ole mõjutatud inhibitsioonist. Substraati varieerime näilise KM-ga (KappM).
Ki väärtuse leidmiseks peab koostama graafiku, kuidas näilised parameetrid, nende kombinatsioone mõjutab inhibiitori konts vms.
Näiteks varieerime
Iga graafiku pealt saab ühe
paari, seda edasi analüüsides saab õiged tulemused.
Konkurentne inhibitsiooni graafiliselt
– sirge võrrand, kus KM on vabaliige ja KM/Kic on sirge tõus. Võimalik leida Ki väärtus, Kic=vabaliige/tõusuga.
Mittekonkurentne inhibitsiooni graafiliselt
KM ei sõltu inhibiitori kontsist. Vmax langeb koos inhibiitoriga.
(ülevalt esimene): Vmax väiksem, KM kõigil on sama, seetõttu võib kasutada kõigil ühte ja sama substraadi kontsi.
Piirkiirus langeb tänu ebakonkurentsele komponendile.
(võtame pöördväärtuse)
(teeme summaks lahti)
(tuleb sirge võrrand)
Osalise inhibitsiooni puhul on hüperboolne inhibitsoon, näiliste parameetrite vaatamisel saamegi hüpberboolsed sõltuvused. Kui kõrvalekalded lineaarsusest pole väga suured, siis võib sirge võrrandi läbi tõmmata.
Sega tüüpi inhibitsioon graafiliselt
Mõlemad on mõjutatud inhibiitori kontsist – nii KM kui ka Vmax. Substraat tagab sama küllastusastme vms. Vaja on leida kaks inhibitsioonikonstanti, selleks vaja kahte graafikut. Üks on eeltoodud Vmax pöördväärtus, teine on KM/Vmax.
Vabaliige on KM/Vmax.
Lihtsusatud lähenemine inhibitsioonile – IC50
IC50 – inhibiitori kontsentratsioon, mis alandab reaktsiooni kiirust poole võrra.
Võetakse üks substraadi konts, mõõdetakse algkiirusi, varieeritakse inhibiitori kontsi. Analüüsida on sobiv teljestikus vi/v0 y- telg ( varieerub 0-1), x-telg on [I] (1st langev kõver)
IC50 on see inhibiitori konts, kus vi/v0 on 0,5.
IC50 sõltub substraadi kontsist, mida kasutatakse. See, kuidas ja kas üldse sõltub, see on määratud inhibitsiooni tüübi poolt. IC50 määrama hakates peaks teadma inhibitsiooni tüüpi.
IC50 konkurentse inhibitsiooni korral
Mida kõrgem on substraadi konts, seda suurema IC50 saame. Seost IC50 ja substraadi konts vahel ei pea pähe õppima, saab tuletada
Inhibiitori puudumisel:
vi/v0=0,5 ja v0/vi=2 (See on IC50 definitsioonist ette antud)
Fundamentaalne parameeter on Ki –kui tahad lihtsustatud lähenemist kasutada, siis tingimused tuleb sättida nii, et leitud IC50 oleks võimalikult lähedalt Ki-le. Substaadi konts peab olema madal KM-iga võrreldes.
Kui [S]1 (modifitseeritavat valku on vähem, madalamas kontsis kui KM-id). Rv-s kaovad summad ära ja tulemuseks on 81 → regulatsioon siis ei toimi. Mida väiksemad on K-d, seda väiksemaks läheb koefitseient R, seda teravam on regulatsioon. Piirjuhuks on see, kui K1=K2koff, siis N=kcat/koff. Kui katalüütiline konstant on 1000 s-1, koff aga 0,1 s-1, siis N=10 000 (keskmine protsessiivsus).
Protsessiivsete ensüümide struktuuri iseloomustab

rohkem või vähem suletud aktiivtsentri topoloogia . Suletus vähendab dissotsiatsiooni tõenäosust

• osaliselt suletud struktuurid – polümeer on osaliselt ümbritsetud valgu poolt, aga mitte täielikult. Võib seostuda ka polümeeri keskele – endo . . Endotsellulaasid on väiksema protsessiivsusega – mida suletum, seda kõrgem on protsessiivsus.
  

• suletud assümeetrilised struktuurid – T7 puhul DNA seondumisel tekib suletud olek, tioredoksiin on protsessiivsusfaktor, sest selle puudumisel pole ensüüm protsessiivne. Punktiirjoon – natiivselt arvatakse, et on sealt ühendatud, aga kristallstruktuuris ei paista välja.
  
• suletud sümmeertilised struktuurid ehk torroidid – ümbritseb täielikult substraati, dissotsieerumise tõenäosus väike. Ensüümid on pm lõpmatu protsessiivsusega, liiguvad niikaua, kuni töö on tehtud.
  

rea polümeeri kordusühikute seostumiskohtade esinemine – polümeeriga interakteerutakse läbi mitme monomeeri ühiku. Kui üks interaktsioon katkeb, siis ensüüm ei dissotsieeru kohe. Protsessiivsuseks on vajalik, et oleks substraadi küljes kõvasti küll kinni, aga pärast katalüüsi akti on vaja edasi liikuda . See saavutatakse siis, kui on rida nõrku interaktsioone (mitte paar tugevat interaktsiooni ). Ensüümid, mis opereerivad rakust väljaspoolt, neile ei kulutata ATPd, energia peab tulenema sideme lõhustumise energiast pm (tsellobiohüdrolaasi kohta). Kahe domeeni vahel on kooperatiivne seostumine – kui üks juba seostunud, siis suurema tõenäosusega seostub teine ka.
Kristallstruktuurid annavad ensüümidest jäigema pildi kui nad tegelikult on, mobiilsed osad valgust jäävad kirstallstruktuuris häguseks. CERN -põrguti
Molekulaarsetel liikumistel pole suunda, aga liikumissuuna saavutamiseks on vaja kulutada energiat. Endo-protsessiivne (võib alustada ahela keskelt, seostumisega kaasnevad konfromatsioonilised muutused) tsellulaas – aktiivtsentris on ülemineku seostumiskoht. Punktiirjoontega on tähistatud kahe ühiku vahel esinevad seostumiskohad vms. Tunnel , mis läheb õlitatult alla energiagradienti vms:S
DNA polümeraas interakteerub välja ulatuslikult.
Paljud polümeeridel opereerivad ensüümid kasutavad „soodustatud“ difusiooni. Kui ensüüm peab leidma oma märklaua, aktsioonikoha, siis võimalikult paremini tegemiseks kasutatakse soodustatud difusiooni – vähendavad dimensionaalsust. Redutseeritakse difusiooni dimensionaalsust – 3D→2D (lateraalne difusioon ). Lateraalne dimensioon – membraanides, tsellulaasid otsivad pm pinnalt. →1D (mööda ahelat ) Ühe dimensionaalsust kasutavad restriktsiooniensüümid, sest vaja leida spets järjestus). Mittespetsiifiline kompleks liigub DNA ahela peal, kui tuleb oma järjestus, siis tekib spetsiifiline kompleks ja enam ei liigu. Suunda pole. Restriktaas pendeldab juhuslikult DNA peal – võib ka dissotsieeruda, kui protsesssiivsus oleks väga kõrge, siis oleks korduv kontrollimine, jääb pendeldama. Seetõttu on mõistlik aegajalt maha hüpata ja mujale liikuda. Suunatud liikumise jaoks on vaja energiat juurde anda.
Klassikaline, massitoimeseadusel põhinev ensüümkineetika ei pruugi kehtida tingimustes, kus 3D difusioon on piiratud. Massitoimeseadus – keemilise reakt kiirus on võrdeline reageerivate ainete kontsiga. Kui reaktsiooni toimudes kontsentratsioon väheneb (ensüüm ja 10 substraati ümber alguses, pärast on 5 substraati ära regeerinud), siis toimub difusioon piisavalt, et kogu aeg on kogu süsteemis ühtlane konts, mis langeb süsteemis. Kui 3D difusioon takistatud, siis substraat ei pääse ligi, ensüümid võivad olla filamentide küljes, siis pole difusioon piisav, et tagada kontsentratsiooni ühtlust. Keemilises kineetikas eeldatakse alati, et kontsentratsioon on ühtlustunud. Segunemiselement on relevantne ainult bimolekulaarsete reaktsioonide puhul.
T+T→S
Kui isesegunemine pole piisav, siis on kiiruskonstant sõltuv ajast.
k(t)=k0∙t-h
k0 on siis, kui oleks piisav segunemine .
Reaktsioonil oleks just nagu mälu. Ntx kaks fraktalanumat (difusioon on piiratud, isesegunemine pole piisav). Vaageldaval ajahetkel on konts mõlemas anumas võrdne, ühes reakt kestnud 4 sek ja teises 100 sek (lähteaine konts oli lihtsalt suurem). Kiirus peaks siis olema pm võrdne, aga fraktalanumate puhul on esimeses anumas reaktsioon 5 korda kiirem. Lisaks aine kontsile süsteem nagu mäletaks kaua reaktsioon on käinud, sest ajas käib maha kiiruskonstant. Mida rohkem aega, seda rohkem kustutame reaktsioonitsentri lähedalt substraati ära ja difusioon ei too tagasi ka. Fraktalkineetika on rakkude puhul väga relevantne.
66