Ensüümikineetika (1)

ENSÜÜMIKINEETIKA

1. Keemilise kineetika põhimõisted
reaktsiooni kiirus – aeg, mille jooksul reaktsioon toimub, tähistatakse v tähega. Reaktsiooni kiirus sõltub (enamasti, mõnikord mitte, ntx null-järgu reaktsioon ei sõltu) reageerivate ainete (alg)kontsentratsioonist (ehk kui meil on aine A ja see muutub aineks P, siis kiiruse valem on selline v = d[P]/dt = -d [A]/dt = k [A]). Keemiline kineetika ongi see teadusharu , mis tegeleb reaktsioonide kiiruse uurimisega.
kiiruskonstandid – kiiruskonstandid on vidinad, mis seovad reaktsioonikiiruse reageerivate ainete kontsentratsioonidega , tähistatakse tähega k (vt ka eelmist mõistet).
reaktsiooni järk – see näitab, kuidas sõltub reaktsiooni kiirus reageerivate ainete kontsentratsioonidest (kontsentratsioon näitab kui palju ainet ehk selle aine osakesi on meil hetkel lahuses ehk teises aines, mis on keskkonnaks, mäletatavasti on moole avogaadro arvuga sidudes väga lihtne lahti teha osakeste arvuks). Reaktsiooni järke on põhimõtteliselt kolm (ka rohkem, aga see on ebatõenäoline et neli molekuli järsku omavahel reageerivad, ehk mängu tuleb reaktsiooni molekulaarsus – kui palju molekule omavahel “suhtlevad”, kui kaks, siis tegu on monomolekulaarse reaktsiooniga, kui kaks, siis bimolekulaarsega)
I järku reaktsioonide võrrandid ja kiiruskonstandid – selline reaktsiooni järk, milles reaktsiooni kiirus on võrdne aine algkontsentratsooniga, ehk -dC/dt = k1C0 1= k1C.
II järku reaktsioonide võrrandid ja kiiruskonstandid - selline reaktsiooni järk, milles reaktsiooni kiirus on võrdeline substraadi algkontsentratsiooni ruuduga - -dC/dt = k2C0 2= k2 C2 .
Kõigis neis järkudereaktsioonides on C0 substraadi algkontsentratsioon ja k-d vastavate reaktsioonide kiiruskonstandid .
2. Monosubstraatse ensüümireaktsiooni täielik ja lihtsustatud võrrand, kiiruskonstantide tähendus ja dimensioonid.
Monosubstraatne reaktsiooni nimetus vihjab ilmselt sellele, et tegemist on ühe ensüümi reageerimise teise ainega. Sellise ensüümireaktsiooni järk sõltub aine kontsentratsioonist, ehk kui tegu on madala kontsentratsiooniga , on reaktsioon 1 järku, kui kõrge konts. siis 0 järku (e.
reaktsiooni kiirus ei sõltu aine algkontsentatsioonist)
See toimub eeldusel, et ES kompleks saavutab kiiresti tasakaalulise kontsentratsiooni, mis ei muutu ajas.
E – ensüüm
S – substraat
P – produkt
Konstantide Km , Vmax , kcat sisuline tähendus.
Selleks, et saaks üldse rääkida neist võrranditest ja kiirustest, peaks enne lahti mõtestama järgnevad mõisted:
Km – see on kineetiline aktiveerimiskonstant (ühik M), mida saab avaldada ES (ehk ensüüm+substraat) kompleksi moodustumise ja lagunemise kiiruskonstantide kaudu:
See on ka substraadi konts. mille juures kiirus on pool maksimaalsest kiirusest. Km näitab peale dissotsiatsioonikonstandi määratlemise ka kompleksi tugevust, ehk väike aktiveerimiskonst. vastab tugevale sidumisele ja kõrge Km tähendab nõrka sidumist ensüümi ja aine vahel.
Vmax – konstant, mis iseloomustab ensüümi. See on teoreetiline maksimaalne reaktsoonikiirus, mida tegelikkuses kunagi ei saavutata (kuna selle saavutamiseks peaksid KÕIK ensüümi molekulid olema seotud ainega) [ k2*[Et (kõik ensüümimolekulid on seotud)]]
kcat – on molekulaarse aktiivsuse mõõt , substraadi molekulide arv, mis muudetakse ühe ensüümi molekui poolt ühes ajaühikus produktiks, tingimusel, et ensüüm on ainega küllastatud (arvutatakse
Vmax jagamisel ensüümi ja substraatide komplekside arvuga (mis peab olema täielik, ehk kõik ensüümi molekulid on seotud substraadiga)
Ensüümi aktiivsuse mõiste ja ühikud.

Ensüümi aktiivsus näitab kui palju ja kui kiiresti substraadi molekule ta on võimeline produktiks muutma. Kui ensüümi molekulaarsete kontsentratsiooni pole teada, väljendatakse tema kogust aktiivsuste kaudu.
ühikud:
rahvusvaheline ühik ehk IU – see on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mikromooli produkti teket 1 min jooksul
katal – 1 kat on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mol substraati reaktsiooniproduktiks 1 sek jooksul
1 katal = 6*107 IU
eriaktiivsus – ensüümiaktiivsus 1 mg ensüümvalgu kohta
3. Michaelis-Menteni kineetiline võrrand – matemaatiline ja graafiline väljendus ja
teisendused.
[S] – substraadi kontsentratsioon, mis iseloomustab siduvust
See võrrand toimib järgmistel eeldustel (pluss siis veel tasakaalulise konts. saavutamine):

tekib ensüüm-substraat kompleks [ES]

ES kompleks on tasakaalus vaba ensüümiga

ES lagunemine produktiks on aeglasem kui ES moodustumine ja ES lagunemine
Km , Vmax arvväärtuste määramine
Vaata nende mõisteid (seal on valemid)
Teisendused (neid valemi teisendusi peaks oskama)
Leanweaver- Burk :
Hanes – Wolff (mis on parem, kuna 1) selles on vähem vigu; 2) tänapäeval levinud arvutiprogrammid kasutavad seda, kus sisestatakse otseselt v versus [S] katseandmed):
4. Kiirust mõjutavad tegurid. (temperatuur, pH, kontsentratsioon, Km ja Vmax väärtused)
Ensüümide inhibiitorid, inhibeermise tüübid, nende analüüs.
Ensüümide inhibiitorid on vahendid, mis madaldavad reaktsooni kiirust (võimaldades neid paremini kontrollida). Nad moodustavad ensüümiga kovalentse sideme (pöördumatud) või mittekovalentse sideme (pöörduvad).
Pöörduva inhibeerimise tüübid:

• konkurentne: inhibiitor seondub ainult E, mitte ES kompleksiga ehk I ja S konkureerivad sama sidumistsentri pärast aktiivtsentris
  
• mittekonkurentne: inhibiitor seondub mõlemaga – nii E kui ka ES kompleksiga (I sidumine ensüümile ei mõjuta S sidumist, kuna neil on erinevad sidumistsentrid. Inhibiitor ei mõjuta Km-i, kuid vähendab Vmax väärtust)
  
• ebakonkurentne: inhib. seondub ainult ES kompleksiga (hüpoteetiline)
  

Esineb ka segatüüpi mittekonkurentne inhibeerimine ehk inhibiitori sidumine ensüümile mõjutab aine sidumist ensüümi poolt (muutuvad nii Km kui Vmax väärtused)
Konkurentse inhibeerimise juures arvestada tuleks seda, et kui [S] on lõpmata suur, siis inhibiitori lisamine reaktsiooni Vmax ei mõjuta.
Kiiruse sõltuvus temperatuurist ja keskkonna pHst – põhjendused, graafilised sõltuvused
pH mõjutab:
aminohapete ioniseeruvate külgahelate, valkude protesteetiliste rühmade ja substraatide dissotsiatsiooni, ek Km ja/või Vmax väärtusi
Temperatuur:
tõustes ensüümreaktsioonid kiirenevad kaks korda iga 10 kraadi kohta. Igal ensüümil on teatud optimum (enaikel 50 kraadi ringis ), millest alates reaktsiooni kiirus taas alaneb termilise denaturatsioon tõttu ehk hakkavad lagunema nõrgad sidemed.
5. Bisubstraatsete ensüümreaktsioonide põhiskeemid. Graafilised väljendused kordinaatides 1/v vs 1/A substraadi B konts. suurenemisel.
Enamik reaktsioone toimub enam kui ühe aine osavõtul, seetõttu moodustub ka mitu produkti. Selliste reaktsioonide jaoks on põhimõtteliselt kaks võimalust:
1) Ühekordse ümberasetusega mehhanism – mõlemad (või enam) aineid seonduvad ensüümiga ja vabanevad vastavad produktid, eristakse veel juhuslikku (pole oluline milline aine seondub esimesena) ja korrastatud (üks ainetest nn juhtiv substraat seostub enne):
2) Topelt ümberasetusega e ping- pong tüüpi bisubstraatne mehhanism – substraat seostub ensüümiga, modifitseeritakse uuele kujule ja eraldub esimene produkt. Seejärel reageerib järgmine aine modifitseeritud ensüümiga, tekib uuesti endine ensüüm ja vabaneb järgmine produkt: