Molekulaar- ja rakubioloogia (0)

Bioloogia - Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

5 VÄGA HEA

Vlada Šiposa
Molekulaarbioloogia praktikumi aruanne
YAGB41 Kevad 2014
Molekulaarbioloogia praktikumi aruanne

Praktikum – pipepteerimine.
Töötasime erineva suuruse pipettiga: 1000, 200, 20 ning 10 µl. Igale pipettile sobib oma suurusega otsik. Otsikud on steriilsed ja neid ei tohi neid näpuga katsuda . Pärast kasutamist tuleb otsikud ära visata spetsiaalsele konteinerisse. Otsik peab istuma tihkelt, kuna kui istub liiga lõdvelt, siis sissetõmbav kogus on tegelikult vähem, kui oodetud (tõmmatakse sisse ka õhk). Otsiku ei tohi panna liiga sügavalt lahusesse, kuna jallegi sissetõmmatav kogus võib erineda oodatavatest. Liiga külma või kuuma lahuse pipeteerimise käigus tekitavad vead, sellega, kui on võimalus, tuleb lahus kas soendada/jahtuda toatemperatuureni.
Pipetteeriv vedelik peab olema homogeene: enne pipepteerimist tuleb kas fuugida, et saada kondensati kätte või vortexiga segada.
Täidetud pipett ei tohi jaatta horisontaalseisundil , seest on suur oht pipetti vedelikuga saasta.
Tavaliselt pipeteeritakse suuremad kogused esimesena, ning pärast lisatakse väiksemad kogused peale.
Selleks, et olla kindel, et kogu pipeteeriv vedelik läks otsikust lahusesse, mina suspendeerisin paar korda edasi-tagasi (eriti kui pipeteeriv kogus on väga väike), kuna isegi kui teostada pipeteerimist korrektselt, jaavad mõned tillukesed otsiku senal. Mõnikord sama otsikuga on mugav selle lahuse segada, aga kindlasti tuleb lahusega kontamineeritud otsik ära visata.
Viskoosse lahuse pipeteerimine tekkitas mul probleeme: pesuvahend vahutas ja ei õnnestunud kogu tõmmatud lahust kätte saada. Selles ettapis oli minu poolt tehtud viga – pipeteerisin liiga kiiresti ja ei kasutanud pahupidi tehnikat .
Ülejäänud harjutamisülesanned ei tekitanud mul suure reskusi, vaid ainult täpsuspipeteerimise käigus käsi hakkas värisema, aga pärast õiget asendi leidmist , edasi pipeteerimisega probleeme polnud.

Praktikum – PCRi teostamine
Polümeraas ahel reaktsioon kasutatakse teatud DNA fragmenti paljundamiseks. Selleks, et PCRi alustada, enne on vaja disainida 2 praimerit (pärissuunalist ja vastassuunalist), mis on komplementaarsed selle fragmenti 5’-otsatega (ja ei ole kompementaarne fragmendi teise järjestusega ega omavahel ei moodusta dimeere), kuna polümeraas ei ole võimeline esimesi nukleotiide ise sunteesida.
PCRi teostamiseks on vaja ette valmistada 20 µl segu, milleks on vaja pipeteerida kokku:

11,3 µl MQ vett
2,4 µl 2mM dNTP
2 µl polümeraasi puhvrit, mis sisaldab erinevaid sooli
2 µl 25mM MgCl2 (Mg2+ on polümeraasi kofaktoriks, samuti praimer-DNA seondamise stabilisaatoriks)
1 µl DstFlin forward praimeri
1 µl DstRlin reverse praimeri
0,2 µl template -DNAd – L-Desmo pEGFP-C2, mis on 335 bp pikk.
0,1 µl HotFIRE Pol® polümeraasi mis on stabiilne kõrge temperatuuri juures. Polümeraas ei oma eksonukleaarsset aktiivsust, sellega teeb ta 1 vea 1000 nukleotiidi kohta.

Kui kõik reagentid on segatud kokku (vortexiga) ja seinte peal olevad tilgad on fuugitud, on vaja epsi panna PCRi masinasse, kus toimuvad järgmised etapid:

Esimene aste PRCis on polümerasi aktiveerimine(15min), mis toimub 95̊С juures. 2. DNA kaksikahela denatureerimine (10 sek) 95̊С juures
3. Pärast masin jahtub 56 ̊С –ni (sõltub praimeri pikkusest ning CG nukleotiitide sisaldusest) , et praimerid hübridiseeruksid DNAle (20sek).
4. 20 sekundi möödudes , masin soendub 72 ̊С –ni. Selle temperatuuri juures 3 min väitel toimub komplementaarse DNA ahelasüntees. Selle etappi lõpus saame 2 template DNAd.
5. Alates 2. punktist tsüklid korduvad veel 21 kord. Sellega DNA ahela paljundamine toimub ekpotentsiaalselt.
2.2 Praktikum – geeli valmimine
Esialgu tuleb valida mille kontsentratsiooniga geeli on vaja valmistada. Kuna mul oli tegu lühe DNA lõiguga (335 bp), valisin PCRi produkti detekteerimiseks 1,5% geeli. Geelistavaks aineks on agaroos, mis on pärit vetikatest.
Segasime kokku 100 ml 1x TAE puhvrit ja 1,5 g agaroosi. Kuna agaroos ei lahustu hästi, kuumutame segu mikrolaineahis keemiseni (mitte päris keemiseni, et ei keeks üle!) ja vahepael loksutame ringjate liigutusega kuni kõik agaroos on sulanud ja lahus on homogeenne .
Pärast jätame segu jahtuma tasakesi loksutades (et ei tarduks ära) ~ 50 ̊C-ni, et pärast lisada 0,5 µl DNA visualiseerimise reagenti – EtBr . Kuna aine on orgaaniline, siis kõrgema temperatuuri juures on oht, et ta hakkab lagunema. EtBr seostub kaheahelalise DNAga ning uv-lainete all fluorestseerub oranžide viirgudena. (Suur oht! Mutageen !)
Kui geel on piisavalt jahtunud , valasime geeli alusele (konstrollisime, et alus asetsetus horisontaalselt ), tegime augu hammastega ning panime üleöö tarduma.
3.1 Praktikum – DNA lahutamine geelis
Visualiseerime ona PCRi produkti selleks, et kontrollida, kas reaktsioon toimus nii, kui oli oodetud (mitte inhibeeritud, kas kõik komponendid oli lisatud õigesti, kas programm oli koostatud ilma veata jne).
Selleks lisasime PCR segule 4 µl 6xDNA värvi, et DNA ilusti hambasse vajuks ja tema migreerumisteekond oleks nähtav. Kandsin kogu segu TAE geelile ja jäätsime geelis lahutama 15min jooksul konstantse pinge all (100V).
DNA lahutamine toimub geelis tänu tema fosfaat- selgroo negatiivsele laengule – kui rakendada elekrtiväli, DNA fragmentid hakkavad liikuma katoodile. Mida väiksem on DNA jupp, seda kiiremini ta liigub geelis, sellega väiksemad jupid elektoforeesi lõpus asuvad geeli põhjas (katoodi lähemale) ka suuremad geeli ülemises osas.
Et umbkaudu teada oma DNA fragmenti pikkus, panime ka jooksma DNA ladderi, mille järgi saab võrrelda ja ennutada DNA pikkused.
15 minuti möödudes, meie DNA fragmentud lahutusid ja geelilõik on valmis pilldistamiseks. Pildistamine toimub uv-lampide all, ning DNA lõigud on nahtavad tänu nende interkaleerumisele EtBr-ga. Analüüsides oma PCR produkti, saab öelda, et bänd on piisavalt tugev ja ka õige pikkusega, sellega saab öelda, et kõik eelnevad etappid oli teostatud korrektselt ja sellega saab töötada edasi.
3.2 PCRi produkti puhastamine
1. Lõikasin UV-laual skalpelliga minu bänd välja. Proovisin seda tega võimalikult hoolikalt, et tükk oleks võimalikult väike ja sisaldaks kogu DNAd.
2. Eelnevalt kaalusin tuubi (1,01g), panin selle tuubi sisse oma geelitükk, ning kaalusin neid kokku. Sain, et lõiku kaal on 1,18g – 1,01g = 0,17g.
3. Lisasin 0,1g geeli kohta 0,3 ml, ehk 17*0,3 = 0,51ml = 510 µl ADPd (Agarose Dissolving Buffer), mis lahustab geeli, ning panin inkubeerida 55 ̊C juures geeli täeliku sulamiseni. Vahepeal nipsutasin tuubi, et kiirustada sulamist.
4. DNA – geeli – puhveri segu pipeteerisin Zymo-SpinTM kolonni (mis oma korda koosneb kolonnist ja kogumistopsist. Kolonn sisaldab ränifiltri, läbi mille me laseme oma segu jooksma. DNA seostub räniiksiidi osakestega, sellega ta ei saata kogumistopsi, vaid jääb kolonni filtri peale. Kolonni saagis minu DNA lõigule on vahemikus 70-90%) ja tsenrifugeerisime 30sek ja viskasin läbivoolatud puhver välja.
5. Lisasin 200µl pesupuhvrit ja jalle fuugisin 30 sek x2 korda, et olla kindel, DNA on puhas.
6. DNA elueerimiseks kasutasime MQ vett, mille pH oli > 6.0 (teisel juhul, DNA võib kahjustuda). Panin 10µl MQ vett peale ja fuugisin 1 min jooksul. DNA vabanes ränioksiidist ja sai kogumistopsiku sisse.
7. Kontrollin , kas eluaat sisaldab minu DNA lõiku, või puhastamise jooksul tekkisid vead: segasin kokku 1,8 µl DNA värvi, µl MQ H2O ja µl eluaati, ning panin jooksma kontrollgeelile (kokku on 10,8 µl).
Kontrollgeeli pilt näitas õige bändi olemasolu, sellega saan järeldada, et kõik etappid oli tehtud õigesti ja saab topsis jäänud DNA-ga töötada jätkata.

Praktikum – Rekombinantse plasmiidi ligeerimine
Selleks, et meid huvitava amplifitseeritud DNA paljuneda, on vaja teda sisestada vahuvektorisse(plasmiidi). Selleks on vaja kokku ligeerida meie järjestus (L-Desmo) ja pSTBlue-1 vektor . Selle praktikumi käigus kasutasimi vektorit, mis oli enne lõigatud niimodi , et kleepuvad osted sisaldasid T- otsad . Taq polümeraas ei oma eksonukleaarset aktiivsust, sellega suure tõenäosusega lisab iga PCR produkti sabale lisa A-nukleotiidi. Sellega meil on ilusti kokku kleebuvad otsad: inserti A sabad on komplementaarsed vektori T otsaga ja ligaas heameelega kleepub neid kokku.
Meie valitud vektor sisaldab ka antibiootikumiresistentsuse geeni ka β-galaktosidaasi kodeerivat lacZ operooni. Kui inserd ligeeris vektoriga kokku, siis see vektor enam ei kodeeri ensüümi, mis lõhub β-galaktosidaasi, kuna inserdi sisestamisel me rikkume selle geeni lugemisraamid. Selle alusel põhineb meie sini-valge selektsioon : bakterid lõhuvad galaktosidaasi – ei sisalda inserdi, ei lõhu – sidaldavad. Selle protsessi saab ka visualiseerida.
Ligeerimiseks segasime kokku:

1,5 µl MQ vett
1 µl puhastatud PCR produkti – L-Desmo
1 µl plasmiidi, ehk pSTBlue-1 vektorit
1 µl T4 DNA ligaasi , mis on kauem aktiivne ja teeb ligeerismist täpsemalt 4 kraadi juures.
0,5 µl 10xligeerimis puhvrit

Kuna töötasime väga väikese mahuga, siis segasin kõik reagendid pidevalt suspendeerides ja segasin segu otsikuga. Homogeniseerin segu ka vortexi abil. Epsi korgis märgistasin vajalikud asjad markeriga ning jätsin segu üleöö ligeerima +4 ̊C juures.

Praktikum – Tranformeerimine
Transformeerimise käigus vektor (pSTBlue-1) viiakse bakterirakku sisse läbi membraani. Tava bakteri membraan ei lase sisse DNA molekuli, sellega tuleb neid kompententiseerida, ehk teha rakumembraani läbilaskvaks plasmiidile. Selleks rakud töödeldatakse Ca2+ ja Cl- sisaldava soolalahusega ning jahutatakse 0 ni ja järsku soendatakse 50-ni - Heat shock. Selle protsessi tulemusena on see, et membraanis tekivad augud ning augud kannavad positiivse + laengu. Kuna meie DNA on negatiivse laenguga, siis erinimelised laengud tõmbuvad ja DNA ilmub bakteri sees.
Transfoneetimise põhimõtte on paljuneda konstrukti. Bakteri sees plasmiidid paljunevad tuhandeid- miljoneid korda ja mutatsiooni tõenäosus on väga väike.
Transformeerimiseks:

Inaktiveerisin ligaasi, 10 min jooksul 70 ̊C juures.
Võtsin -80 ̊C juurest 10 min jääle sulama komptentsed rakud
Võtsin 20 µl rakke ja lisasin ligatsioonisegule ja inkubeerisin 30 min jääl
Teostasin Heat shocki: inkubeerisin 90 sek väitel 42 ̊C juures transfoneeritud segu, kohe tõstsin 2 minutiks jääle (membraaniaugu sulegemiseks)
Lisasin segule 500 µl vedelsöödet ja panin inkubeerima 30 min-ks inkubeerima 37 ̊C juures (et rakud jaguksid)
Tsentrifugeerisime bakterid põhja 3000 rpm 2 min ja rakupeal olev sööde valasin kraanikaussi

Meie huvipakuvad bakterid nüüd sisaldavad ampitsiliiniresistentsus geeni ja ei sisalda glaktosidaasi – see on meie selektsiooni põhimõtte. Nüüd tuleb neid paljundama ja selekteerida. Selleks paneme neid kasvama sööde peale. Valmistasime söödet, kuhu panime ampitsiliini (antibiootikumi toimel surevad ära kõik ilma plasmiidita bakterid) ja X-gali, mis on laktoosi analoog, vaid glükoosi asemel on indool, mis vabaneb glükosiidsideme hüdrolüüsi käigus, ning oksüdeerub ja värvub siniseks.
Sööde valmistamiseks:

Sulutasime LB(steriilne sööde)+Agar söödet mikrolaineahjus sulemiseni, jahtusime pidavlt segades (et ei tarduks ära) ~50 kraadini.
Lisasime 200 µl X-gal, 200 µl ampitsiliini ja 25 µl IPTG-d – lac promootorit aktiveeriva reagenti
Valasime sööde Petri tassile ja panime tarduma

Bakteri kasvamiseks sööde peale:

Suspendeerisin bakrerid topsis edadi -tagasi ning pipeteerisin tardunud söötmega Petri tassile
Selleks, et bakterid asutsid ühtlaselt, panin klaaskullikesed tassile ja loksutasin.
Valasin kullikesed etanooli lahusesse ja jäätsin tass inkubaatorisse üleöö kasvamiseks.

2 päeva möödudes tulin tagasi laborisse. Minu tassi peal kasvasid nii valged, kui ka sinised kolooniad (nende suhe oli ~ 50/50). Sinised kolooniad sisaldasid plasmiidi, vaid ei sisaldanud inserdi, aga valged sisaldasid õige plasmiidi. Valisin kõige suurema valge koloonia ja panin neid kasvama:

Võtsin epsi, kus tegin augu (ilma hapnikuta bakretid suervad ära)
Lisasin 1ml Amp-i sisalav vedelsööde
Otsikuga katsusin valge kolooniat ja panin otsik epsi sisse
Panin bakterid loksutavasse inkubaatorisse 16 tunniks kasvama 37̊ C juures

Praktikum – minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil
Eesmärgiks on bakteris paljundatud plasmiidi välja puhastamine.

Võtsin üleöö kasvanud bakterid ja fuugisin bakterid põhja
Eemaldasin supernatanti
Re-suspendeerisin pellet 0,2 ml-s E1 lahuses (50mM glükoos – teeb lahuse isotooniliseks, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10nM EDTA -Na2 – seob katioone, inhibeerides ensüüme(DNAaasid) ja destabiliseerib raku membraani, RnaasA 10 µl/ml – eemaldab bakteriaale RNA prepsist).
Lisasin 0,2 ml E2 lahus(0,2 N NaOH, 1% SDS – detergent , lõhustab bakteriraku membraani, denatureerib valku ja laseb aluse DNAd degradeerima. Kuna plasmiidne DNA on tsirkulaarne, siis ahelad ei eralduvad), suspendeerisin.
Inkubeerin laua peal 5 minutit.
Lisasin peale 0,2 ml E3 lahus(5 M KOAc – peatab lüüsi, mille tagajärjel valgud ja genoomne DNA sadenevad välja. Reageerib SDS-da, tekitades ka mittelahustava sadet. 10% äädikhape pH normaliseerimine . Plasmiid DNA renatureerub ja asub nüüd supernatandis, ulejäänud – sade.) ja raputasin kuni see täesti ühtlane
Tsentrifuugisin 10 min maksiumpööretel toatemperatuuril, ning tõstin supernatandi uude epsi
Uue epsi lisasin 0,42 ml isopropanooli ja segasin hoolikalt (alkohooli ja soola lisamine varjab DNA negatiivsed laengud ja nüüd DNA sadeneb välja)
Fuugisin plasmiidne DNA põhja 10 min RT ja eemaldasin supernatant
Lisasin sademele 20µl 70% EtOH (sadet sooladest puhastamiseks) ja tsentrifuugisin 5 min RT ja eemaldasin supernatant (ettevaatlikult!)
Kuivatasin DNA sade läbipaistvaks, et vabaneda ka etanooli jääkidest
Suspendeerisin 20 µl MQs

Praktikum – Kontroll – restiktsioon
Kontroll teostatakse selleks, et kontrollida DNA juppide suuruste järgi, et aru saada, kas välja puhastatud plasmiid on õige. Selleks lõikame restriktaasiga inserdi vektorist .

Pipeteerisin kokku 5,5 µl vett, 3 µl puhastatud plasmiidset DNA-d, 1 µl restriktaasi x10 puhvrit ja 0,5 µl EcoRl restrikaasi
Segasin, fuugisin ja inkubeerisin 30 min 37 C juures, ning pärast fuugisin veel kord, et koguda kogu kondansaat
Lisasin 2 µl 6x DNA värvi ja pipeteerisin segu agaroosgeelile ja sain järgmist pilti:

Kui vaadata geelipilti, siis on näha, et minu DNA sisaldas 2 lõigu – vektor ~2500 bp ja minu insert ~350 bp (nagu oodatud). Sellega saab järeldada, et kõik etappid oli teostatud õigesti ja katte saadud plasmiidne DNA sisaldab õige järjestusi ja saadud plasmiidi täpsemaks analüüsimiseks on vaja see sekvineerima.

Sekveneerimise tulemuste analüüs
Mina valisin analüüsimiseks sekvents nr 13 L-Desmo_t7_e02 (tõenäoliset saadud minu plasmiidist, kuna märgistasin oma pridukti L tähega). Kopeerisin sekvensi Chromast Blasti ja võrreldades Word failis oleva järjestusega, sain teada, eti minu insert kleepus vektoriga kokku valepidi, ehk mul tegu on reverse complementiga.
Selleks, et leida mutatsiooni kohta, leidsin minu sekvensi reverse complemendi. Kuna peaaegu kõik nukleotiidid on komplementaarsed võrrelduva järjestusega ja sekvents tuli normaalne, saan öelda, et minu katse õnnestus ja kõik etappid oli tehtud korrektselt(kui mitte arvestada seda, et minu insert läks valepidi sisse).
AATCTGAATTCGTCGACAAGCTTCTCGAGCCTAGGCTAGCTCTAGACCACACGTGTGGGGGCCCGAGCTCGCGGCCGCTGTATTCTAAGCTCGGTACCACGCATGCTGCAGACGCGTTACGTATCGGATCCAGAATTCGTGATTTGAATTCAATACCCTCAGGAAGCGTAGAGTGGTCATAGTTGACCCAGAAACCAATAAAGAAATGTCTGTTCAGGAGGCCTACAAGAAGGGCCTAATTGATTATGAAACCTTCAAAGAACTGTGTGAGCAGGAATGTGAATGGGAAGAAATAACCATCACGGGATCAGATGGCTCCACCAGGGTGGTCCTGGTAGATAGAAAGACAGGCAGTCAGTATGATATTCAAGATGCTATTGACAAGGGCCTTGTTGACAGGAAGTTCTTTGATCAGTACCGATCCGGCAGCCTCAGCCTCACTCAATTTGCTGACATGATCTCCTTGAAAAATGGATCCA
Rakubiloogia praktikum*
*Praktiline osa oli tehtud 2014 aastal, seega aruanne on koostatud 2014a protokolli põhjal, kuid arvesse võetud ka need parandused, mis oli tehtud 2016a protokollis, samuti aruanne sisaldab ka vastuseid 2016a protokolli küsimustele.

Praktikum - rakkude sulatamine ja paljundamine
Sissejuhatus
Praktikumi eesmärg on tutvustada loomarakkude kasvatamise aluseid, vajalikku aparatuuri, materjale ja põhilisi töövõtteid, loomarakkude külmutamise, säilitamise ja sulatamise põhialuseid.
In vitro saab kasvatada erinevaid rakke – nii primaarsed (võetud koest, normaalsed rakud ja olenevalt organiismi vanusest ja rakutüübist jagunevad piiratud arv kordi ), kui ka rakuliini – rakud, mis ei ole normaalsed ja nende jagunemine on piiramatu (embrüonaalsed rakud, kasvaja rakud).
Praktikumis kaustati hiire embrüonaalseid fibroblaste, mis oli säilitanud vedelas lämmastikus, lühemat aega säilivad ka -80 °C juures. Selleks, et rakke kaitsa, lisatakse DSMO-d ja seerumit. Rakke on vaja külmutada selleks, et pidurdada kõike molekuraalse protsessi ja krüokaitse on vaja selleks, et takkistada veekristallide tekkimist, muidu rakud lähevad lõhki. Rakud tuleb sulatada aeglaselt 1 °C ni ning kiiresti 37 °C ni, sest nemad on töödeldatud DSMOga, mis on mürg .
Loomarakud on suhteliselt õrnad ja satuvad kergesti stressi. Nendega kokkupuutuvad lahused peavad olema eelsoojendatud (v.a DMSO) vähemalt toatemperatuurini.

Praktikum – rakkude kasvatamine
Esialgu on vaja valmistada sööde, mille koostlis on sobilik rakkude kasvatamiseks, selleks:

Valasin tuubi 44,5 ml DMEMi (komertsiaalne, sisaldab aminohappeid , glükoosi, soolaid ja vitamiine, pH indikaator – selleks, et veenduda et pH on normis 7,2-7,4. Kui indikaator muutub oma värvi, tõenäoliselt tegu on saastusega. Saastunud tassid tuleb viia kiiresti rakukultuuri ruumidest ära ja desinfitseerida . Rakud visata ära)
Lisasin 5 ml FBSi, mis sisaldab albumiine, kasvufaktoreid, vitamiine, rasvhappeid , lipiide ja teisi komponenti. Seerum sisaldab rakkude kasvuks ja paljunemiseks vajalikke faktoreid.
Lisasin 0,5 ml 100x penitsiliini ja streptomütsiini ( PEST ) varulahust – et vältida bakterite paljunemist.
Segasin ja soendasin 37°C ni

Rakkude kasvatamiseks kasutatavate söötmete põhikomponendid :
destilleeritud vesi, anorgaanilised soolad – aitavad hoida osmootset tasakaalu ja membraanipotentsiaali; süsivesikud energiaallikaks, näiteks glükoos ja galaktoos ; vitamiinid - mitmesuguste kofaktorite eellasteks , näiteks riboflaviin, tiamiin, biotiin ; aminohapped –vaid L-glutamiini, mis laguneb aja jooksul (kui sööde on pikka aega seisnud) tuleb seda juurde lisada.
Rakkude sulatamine:
NB! Rakkudega töötades on vaja tagada steriilsed tingimused ja kasutada aseptilist tehnikat, töötada puhta laminari all!

Pipeteerisin 15 ml tuubi 5 ml söödet ja 6 cm tassile 4 ml söödet.
Võtsin külmast krüoviaaliga NIH3T4 rakud ja sulatasin käes kiirelt (DMSO!)
Lisasin viaali 0,5 ml sooja söödet ja tõstsin rakud 15 ml tuubi ringi.
Fuugisin rakud põhja 5 min 1000 rpm toatemperatuuril (tegemis on õrna rakkudega, seega fuugimine peab olema madala kiirusega)
Tõmmasin sööde vaakumpunbaga nii, et rakud jäid põhja
Tassilt tuubile rakkudega lisasin 0,5 ml söödet, suspendeerisin ning panin tagasi tuubist tassile, ühtustasin rake ja panin tass CO2 inkubaatorisse, kus tingimused – temperatuur, rõhk ja CO2 % onn sarnased tingimustega organiismi sees, eh 37 °C ja CO2 5% - stabiliseerib pH.

2. Praktikum – rakkude paljundamine
Selleks, et arvutada lahjendused ja veenduda et rakud ei ole surnud, on vaja hinnata nende tihedust ja paiknemist. Selleks kasutataske mikroskoobi :
Rakud ei ole saastanud ega surnud (üksikud mittekleepunud ujuvad rakud on, kuid enamus on Figure 1NIH3T3 mouse fibroblasts, Wikipedia
kinnitunud), kleepinud tassile ja paiknevad ühtlaselt, kuid nende tihedus on umbes 20%. NIH3T3 rakud on fibroplastid, seega nende kuju on omapärane, näha mitut adhesiooni kohta.
Rakkude tassilt lahti võtmine ja paljundamine (NB! Aseptika !):

Pestsin rakke tassi kallutades 4 ml 1x PBSiga (Phosphate-buffered saline), selleks et vabaneda surnutest rakkudest ja seerumi - ja söötmijaakidest ja valmistada rakud trüpsiiniga töötlemiseks
Imesin vaakumiga PBS
Lisasin 0,2 ml trüpsiin -EDTA 5 min-ks. Trüpsiin on proteaas, mis lõikab katki rakuadhesiooni valgud selleks, et rakud plastiku küljest lahti saada.
Lisalin 1 ml söödet (DMEM + 10% FBS + PEST) selleks, et inhibeerida proteaasi. Suspendeerisin rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti.
Tassile peab jääma rakkude tihedus 10%. Meie hinnatud rakkude tihedus on 20%, seega tassile peab jääma 600 μl rakususpensiooni. Ülearustest rakkudest (600 μl) tehakse lüsaati, seega tõstsin rakud pipetiga uue epsi.
Lisasin 3,4 ml söödet, tegin 8-kujulisi liigutusi ning panin tass CO2 inkubaatorisse.

3. Praktikum - rakkudest lüsaadi valmistamine (2014):
Genoomse DNA eraldamine imetajarakkudest
Rakud lüüsitakse puhvris, mis sisaldab SDS-i (lahustab rakumembraanid), NaCl, EDTA-d (inhibeerib nukleaase) ja proteinaas K-d (lagundab valgud) pidevalt segades 37°C või 55°C juures. DNA sadestatakse isopropanooliga või etanooliga, mille tulemusena tekkib lahusesse DNA pundar, mille saab otsiku abil tõsta puhtasse tuubi. DNA lahustamiseks kasutatakse enamasti Tris-HCl puhvrit EDTA-ga.
DNAd saab edasi kasutada genotüüpiseerimiseks, mingite lõikude amplifitseerimiseks, kloneerimiseks jne.
RNA eraldamine imetajarakkudest
RNA eraldamiseks kasutatakse tänapäeval enamasti spetsiaalseid komplekte ehk kitte. Võib kasutada ka Trizol vms. reagenti, mille põhimõte on RNA ekstraheerimine guanidiin-isotiotsüanaadi ja fenool-kloroformiga. Kasutatakse ka vedelat lämmastikku. RNA eraldamisel on väga oluline hoida puhtust, sest RNAaase on peaaegu igal pool ja RNA laguneb suhteliselt kergesti.
RNAd kasutatakse enamasti cDNA sünteesiks ja seda omakorda amplifitseeritakse, et määrata erinevate mRNA-de ekspressioonitasemeid rakkudes (qPCR).
Valkude eraldamine imetajarakkudest
Valkude eraldamiseks lüüsitakse rakud pehmemates tingimustes kui DNA eraldamisel. Lüüsipuhver peab sisaldama puhverdavaid aineid, mis hoiavad pH enam-vähem neutraalse (Tris-HCl, HEPES-NaOH), NaCl osmootse tasakaalu säilitamiseks (100-500 mM), detergenti membraanide lahustamiseks (SDS, Triton X-100, NP-40), lisaks veel glütserooli , vajadusel EDTA-d või muid lisandeid. Lüüsipuhvri koostis sõltub sellest, milliseid valke täpselt uurida soovitakse.
Saadud valgulüsaati kasutatakse edasi n. immuunosadestamiseks, Western blotiks, ELISA analüüsiks.
Lüüsipuhvri valmistamine
Segada omavahel 15 ml tuubis:

250 μl 1M Tris-HCl lõppkonts. 50 mM,
150 μl 5M NaCl (lõppkonts. 150 mM)
0,5 ml 10% Triton-X 100 (lõppkonts. 1%) – detergent, lõhestub bilipiidse membraani
1 ml 50% glütserooli (lõppkonts. 10%)
20 μl 0,5M EDTA (lõppkonts. 2 mM)
3,08 ml MQ-d
Panna puhver jääle.

Imetajarakkudest valgulüsaadi valmistamine, selleks on vaja:

Fuugida põhja trüpsiniseerimisel üle jäänud rakud (3 min 1000 rpm)
Eemaldada supernatant
Lisada 1 ml PBSi (et eemaldada söötmejäägid), loksutada õrnalt, fuugida uuesti, eemaldada supernatant
Asetada rakud jääle, lisada 200 μl lüüsipuhvrit ja 4 μl 50x proteaaside inhibiitorite segu. Korralikult suspendeerida ning asetada epsid rakkudega 30 minutiks +4°C juurde
Pärast tsentrifuugida 3 mint, et lahusesse jäid valgud ja sade koosneks membraani komponendidest ja nukleiinhappetest
Teha proovidest uude epsi 2x lahjendus lüüsipuhvriga (selleks pipeteerida 15 μl lüsaati ja 15 μl puhvrit kokku)
Mõõta saadud lüsaatide kontsentratsioonid BSA kitiga

BSA lahjendusterea ettevalmistamine
BSA standardlahuse kontsentratsioon on 2 mg/ml. Sellest tuleb teha 2x lahjenduste rida: 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0 mg/ml ehk puhas MQ.

Panna ritta kuus epsi, kirjutada peale vajalikud kontsetratsioonid (esimene on 2 mg/ml).
Pipeteerida igasse epsi 50 μl MQ.
Esimesse epsi lisada 100 μl alglahust (konts-ga 2 mg/ml).
Teisse epsi lisada esimesest epsist 50 μl. Suspendeerida korralikult 5 korda. Saadud lahuse kontsentratsioon – 1 mg/ml.
Järgmisesse epsi lisada teisest epsist (sama otsikuga) 50 μl lahust. Jälle suspendeerida 5 korda.
Korrata tegevust lõppuni. Viimasesse epsi konts-ga 0 mg/ml jääb puhas MQ.

BSA töölahuse ettevalmistamine
BSA töölahust kuulub 100 μl 96-augulse plaadi ühe augu kohta. Iga proovi peab panema kahte auku (lahjendamata ja 2x lahjendus), seega 4 welli paari peale. Kui meie rühmas oli 7 paari, siis on vaja lahust kokku 4 ∙ 7+6 = 34 welli jaoks + 2 welli puhta lüüsipuhvri jaoks, et määrata lüüsilahuse enda background = 36 welli
100 μl ∙ 36 = 3600 μl + 10% = 3960 μl
Segada 50 osa reagenti A ja 1 osa reagenti B kokku. Saadud lahus oli heleroheline.
Reaktsiooni kokkusegamine

Jagada A+B 100 μl kaupa aukudesse.
Pipeteerida esmalt lahjenduste reast kõiki proovi 5 μl, lisaks puhas lüüsilahus.
Pipeteerida oma proovi 5 μl (2 tk) ja selle 2x lahjendust 5 μl (2 tk).
Raputada plaadid segamiseks. Reaktsiooni tulemusena muutub lahuse värvus lillaks (mida rohkem valku, seda tumedam lilla).
Aurumise vältimiseks kaetakse plaat kaane või teibiga, inkubeeritakse 30 min 37°C juures, mõõdetakse neeldumist 562 nm juures ning saadud väärtuste järgi arvutatakse valgulüsaadi kontsentratsioon.

Keskmine valgukontsentratsioon on 0,34 μg/μl. Valgu sisaldus tehakse kindlaks kalibreerimiskõvera järgi. Kalibreerimiskõver ise ehitatakse standaarse valgu järgi (lahjendusterea järgi), kus x teljel on kontsentratsioonid ja y teljel on mõõdetud optilise tihedus.
Figure 2 illusteeriv pilt
4. Praktikum - transfektsioon
Transfektsioon on võõr-DNA (plasmiidid) või RNA (siRNAd) viimine loomarakku.
Transfekteerimiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: keemilised meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid ) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon).
Meie majas on kasutusel ka Amaxa Nucleofector – aparaat , mis kombineerib elektroporatsiooni
ja keemilisi transfekteerimise meetodeid . Võimaldab efektiivsemalt transfekteerida rakke, mis
muude meetoditega hästi ei taha transfekteeruda.
Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab:

komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (origini- prokarüootset replikatsiooni alguspunkt, antibiootikumi resistentsusgeeni)
kloneerimisala (MCS) – sisaldab paljude erinevate restriktaaside lõikekohti
uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul)
eukarüootset promootorit (CMV, SV40 ) ja polüadenüleerimisjärjestust(SV40)

Sageli ka:

reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus
märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP)
selektsioonimarkeri ekspressioonikasset

Praktikumis on kasutusel pEGFP (enhanced green flourescent protein ) ekspressioonivektor, mis:
• võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes
• võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus
• replitseerub episomaalsena rakuliinides, kus on ekspresseeritud SV40 viiruse large T-antigen (Cos1, Cos7), mis tähendab tugevamat ekspressiooni
Figure 3 pEGFP C1 ekspressioonivetori kaart (Clontech). Joonisel on tähistatud plasmiidi funktsionaalsed osad ning numbriliselt on välja toodud kaugus mõttelisest plasmiidi alguspunktist .
Esimene päev – rakkude transfekteerimine PEI (polyethyleneimines)-ga
Attachment promoter
Polyethyleneimines are used in the cell culture of weakly anchoring cells to increase attachment. PEI is a cationic polymer; the negatively charged outer surfaces of cells are attracted to dishes coated in PEI, facilitating stronger attachments between the cells and the plate. However, polyethylenimine expresses some toxicity if excess is left in solution .
Transfection reagent
Poly (ethylenimine) was the second polymeric transfection agent discovered , after poly-l-lysine. PEI condenses DNA into positively charged particles, which bind to anionic cell surface residues and are brought into the cell via endocytosis. Once inside the cell protonation of the amines results in an influx of counter -ions and a lowering of the osmotic potential. Osmotic swelling results and bursts the vesicle releasing the polymer-DNA complex (polyplex) into the cytoplasm. If the polyplex unpacks then the DNA is free to diffuse to the nucleus .] PEI is extremely cytotoxic, by two different mechanisms, the disruption of the cell membrane leading to necrotic cell death (immediate) and disruption of the mitochondrial membrane after internalisation leading to apoptosis (delayed).
Esialgu tuleb vaadelda rakkud mikroskoobis ja hinnata nende seisukorra ja tiheduse. Rakud ei ole saastanud ega surnud. Rakkude tihedus on umbes 90%.
Transfektsioonisegu ettevalmistamine:

Kõigepealt tuleb lahjendada seerumvabas rakusöötmes (DMEM) eraldi epsides DNA ja PEI.

Esimeses epsis segada 25 μl DMEMi ja 2 μl pEGFP-C1d (250 ng/μl) kontrollplasmiid – sisaldab pEGFP, ehk kui transfekteerimine õnnestub, rakud peavad flouriseerima flouristent mikroskoobi all.
Teises epsis segada 25 μl DMEMi ja 0,5 μl pEGFP/FoxO3a (conc 1000 ng/μl) uuritav konstrukt. Ehk plasmiidid, mis korrefivad EGFP ja, mis sisaldab FoxO3a geeni kodeeriva järjestuse. FoxO3a on transkripstiooni faktor, valk on reguleerib apoptoosi ja kaitseb raku oksüdatiivse stressi eest. On näidatud , et valgu madal ekspessioon on seotud tumorgeneesiga.
Kolmandas epsis segada 50 μl DMEMi ja 2 μl PEI lahust

Pärast agada segu kolmandast epsist võrdselt DNA segudele (52:2=26 μl kaupa), segada, fuugida ja inkubeerida 15 min toatemperatuuril. Selles etapis tekivad DNA ja PEI kompleksid ja lahus muutub häguseks.

Tõstsin katteklaasid steriilsete pintsettide abil 24-augulise plaadi kahte auku. Pipeteerisin transfektsioonisegud klaasidele.

Rakkudelt imesin vaakumiga sööde ja pestsin 1 ml PBSiga. Lisasin 0,2 ml trüpsiin-EDTA lahust, inkubeerisin 5 min. Lisasin 1 ml DMEM + 10% FBS, seekord ilma antibiootikumideta, et vältida antibiootikumi reaktsiooni teiste komponentidega ja kõrvaldada nende toksilisuse riski, suspendeerisin rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti.

Rakkude külvamine 24-augulisele plaadile

Valmistasin söötmega sobiv lahjendus, et rakkude lõpptihedus 24-augulisel plaadil oleks 30%. Minu rakkude algne tihedus on 90%, seega:

• tiheduse suhe: 90%/30% = 3x
• pindalate suhe (6cm plaat vs 24 auguline plaat): 21cm2/1,9cm2 = 11,05x
• lahjendus: 3 ∙ 11,05 = 33,15x
• 1200 μl / 33,15 x = 36,20 μl rakke
1 welli kohta võtame 500 μl, seega kohta welli kohta (+10%) 2 ∙ 500μl ∙ 110%=1100 μl rakususpensiooni.
• 1100 μl – 2,2 ∙ 33,15 μl = 1100 μl – 72,93 μl (rakud) = 1027,10 μl (sööde)

Pipeteerisin rakususpensioon klaasidel olevatele transfektsioonisegudele, loksutasin. Panin rakud CO2 inkubaatorisse 37°C, 5% CO2.

Teine päev – mikroskoopia
Mõlemates wellides suspensioon oli punase värvi, seega pH on rakkudele paras , seega saastus ei olnud, vaatamata sellele, et antibiootikum pole olnud lisatud. Saab järjledada, et aseptika oli jälgitud.
Selleks, et teha kindlaks, et meie plasmiid on raku sees on vaja kasutada Fluorestsentsmikroskoobi. Fluorestsents - aine omadus emiteerida valgust pärast ergastamist kindla lainepikkusega kiirgisega.Kui vaatlesime mikroskoobi all mõlemaid proovi, siis nägime rakke kujuga, mis on iseloomustav NIH3T3 rakkudele. Lülitades flourisensi sisse nägime, et rakud annavad rohelise signaali EFGP (rohelised täppid). Kui võrrelda tihedused, siis on kindlasti näha, et rohelist signaali rakke on 2x vähem, seega tranfekteerimise effektiivsus on umbes 50%. Aga kuna signaal on, saab järjeldada, et plasmiidid on raku sees ja tranfekteerimine õnnestus.
Rakkude immuunotsütokeemiline värvimine
Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis - ja emissioonispektrid.
Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid.
• Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt
• Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid.
Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist, sest ühe primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Samuti kaob siis ära vajadus iga primaarse antikeha fluorokroomiga konjugeerimiseks.
Esimene päev – rakkude fikseerimine
Enne antikehadega värvimist tuleb rakud fikseerida , ehk töödelda neid kemikaalidega, mis peatavad neis bioloogilist protsessi, seega ka lagunemist. Rakud muutuvad vastupidavamaks. Antud juhul fikseerimiseks kasutame PFA lahust, kuid saab fikseerida ka teiste meetoditega, kuid PFA on üks õrnemastest ja ei muutu valke nii tugevalt nagu näiteks atsetoon.
Fikseerimiseks on vaja valmistada lahused:

Fikseerimislahus: 4% PFA 1x PBSis, 10 ml

0,4 g PFA puru
1 ml 10x PBSi
9 ml vett

2) 1x PBS, 50 ml

5 ml 10x PBSi
45 ml MQ3

3) PBS- Tween : 1x PBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50 ml

5 ml 10x PBSi
45 ml MQ
50 μl Tween

4) Permeabiliseerimislahus: 50 mM NH4Cl , 0,5% Triton X-100 PBSis, 1 ml. Raku membraan permeabiliseeritakse ehk muudetakse läbilaskvaks detergendiga (Triton-X-100, saponiin, jt.), et antikehad rakku ja eelkõige rakutuuma pääseksid. See etapp on oluline siis, kui meil on vaja vaadata mingi valgu ekspressiooni raku sees. Kui me vaatame valkguekspessiooni rakupinnal (nt. FACS), siis jätama see etapp vahele.

50 μl 1M NH4Cl Ammoniumkloriid neutraliseerib jääk-PFA
50 μl 10% Triton X-100 - detergent, mis lahustab osaliselt rakumembraanide lipiidid, et antikehad hiljem rakku pääseks.
100 μl 10x PBSi
800 μl MQ

5) Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2 ml.

0,04 g BSA-d
20 μl 10% NaN3 NaN3 kasutatakse konservandina (takistab bakterite elutegevust). Väga toksiline aine.
1,98 ml MQ

Fikseerimine:

rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde
lisada 0,5 ml fikseerimislahust. PFA tekitab kovalentsete sidemete võrgustiku säilitades valkude ja DNA asukoha rakus ning seeläbi jääb püsima ka raku kuju. Rakud ei lagune, seega saab vaadata kus kohas paiknes uuritav valk fikseerimise ajal.
inkubeerida 15 min
pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. Ülearune vaba PFA tuleb välja pesta, et hiljem ei reageeriks BSA ega antikehadega.

Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine:

lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust
inkubeerida 15 min
pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga.

Blokeerimine :

lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust
jätta seisma +4°C juures.

Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist.
Teine päev – immuunotsütokeemia
Immuunotsütokeemias kasutatakse valkude detekteerimiseks rakus antikehasid.
Rakubioloogias kasutatakse kahte tüüpi antikehasid: monoklonaalsed ja polüklonaalsed. Monoklonaalsed antikehad on toodetud kindla peptiidi vastu, samas kui polüklonaalsed antikehad tunnevad ära ühe valgu mitut piirkonda ehk epitoopi. Epitoop võib olla konformatiivne kui ka liniaarne. Konformatiivne epitoop on selline epitoop, mida antikeha tunneb 3D struktuuri, ehk natiivsel kujul. Mõned kemikaalid või termiline töötlus võivad seda struktuuri muuta. Liniaarne epitoop on primaarne peptiidjärjestus. Monoklonaalsed antikehad üldjuhul spetsiifilisemad, aga polüklonaalsed antikehad annavad tugevama signaali kuna neidseondub märklaud valgule rohkem. Lisaks eristatakse antikehi selle järgi, kas nad on peptiidijärjestuse spetsiifilised või tunnevad valgu ära konformatsiooni ja domääni, sellest sõltub millise meetodi jaoks antikeha sobib.
Rakkudes immuunofluorestsentsi vaatamiseks inkubeeritakse rakupreparaate fluorestseeruva
märgisega (FITC, Alexa, Cy, jne.) konjugeeritud antikehadega. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon - esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehi, mis tunnevad valgu ära tema natiivses vormis ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seonduvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist, sest ühe primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Samuti kaob siis ära vajadus iga primaarse antikeha fluorokroomiga konjugeerimiseks, mis võimaldab varieerida sekundaarset antikeha ja temaga seotud fluorokroomi erinevates katsetes ja see on ka palju soodsam .
Inkubatsioon primaarse antikehaga, selleks on vaja:
Valmistada 0,2% BSA-PBS lahus (200 μl):

20 μl 2% BSA lahust
180 μl 1x PBSi
Mouse anti tubuliin 1:500 0,4 μl
Lisada lahus rakkudele ja inkubeerida 60-90 min toatemperatuuril, mille jooksul primaarne antikeha seondub oma sihtmärgiga
Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga seondumata antikeha eemaldamiseks

Inkubatsioon sekundaarse antikehaga, selleks on vaja:
Valmistada 0,2% BSA-PBS lahus (400 μl):

40 μl 2% BSA lahust
60 μl 1x PBS-Tweeni
Goat anti mouse 1:2000 Alexa568 (punane värv) 0,2 μl
Inkubeerida 45-60 minutit toatemperatuuril, kaitsta valguse eest. Sekundaarse antikeha valikul tuleb jälgida, millises loomas on tehtud primaarne antikeha. Sobiv fluorokroom tuleb valida selle järgi, milliseid teisi fluorokroome veel samal preparaadil kasutate. Praktikas kasutatakse korraga tavaliselt 2-3 antikeha, on võimalik ka rohkem. Fluorokroomid on üldiselt tundlikud valguse suhtes, sellepärast on vajalik ka neid liigse valguse eest kaitsta.
Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga
Pesta 1 kord 1 ml MQga

Alusklaasidele panemine ehk sulundamine, selleks on vaja:
• Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Sulundamislahus “kleebib” rakku
Dega katteklaasi alusklaasile ning aitab preparaadil pikemaajaliselt säilida ning ei lase fluorokroomidel aja jooksul tuhmuda.
• Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit.
• Asetada katteklaas (rakud allpool) sulundamislahuse tilga sisse, vältides mulli tekkimist
• Lasta kuivada ja säilitada pimedas (valgustundlik!)
Kolmas päev – fluorestsentsmikroskoopia
Oma rakkude vaatlemiseks kasutame 60x õliobjektiivi, mille kasutades tuleb esmalt katteklaasile lisada tilk immersiooniõli.
Vaatlesime rakke rohelises, punases ja sinises kanaalis:
Figure 4. pEGFP/FoxO3a-ga transfekteerunud rakud. Roheline – FoxO3 liitvalk (ekspresseerub koos EGFPga. Liitvalk asub nii tsütoplasmas kui ka tuumas, kuna ta on transkriptsiooni vaktor. Tuumas signaal on tunduvalt tugevam, mis on täesti oodatav. FoxO3a on transkripstiooni faktor, valk on reguleerib apoptoosi ja kaitseb raku oksüdatiivse stressi eest. On näidatud, et valgu madal ekspessioon on seotud tumorgeneesiga.
tugevamtu
Figure 5 Primaarse antikehaga mouse anti tubuliin ja sekundarse antikehaga (goat anti Mouse Alexa568-ga, seob primaarse antikehadega) märgistanud rakud, sekundaarse antikeha küljes on punane fluorokroom Alexa 568 (absorbatsioon 578 nm juures ja emit 603 nm juures).On näha kuidas paiknevad rakus mikrotuubulid.
Figure 5 DAPIga margistanud rakud, mis seondub DNAle ja fluoriseerub sinise värviga. Ergastumine UV-ga (absorb 358 nm ja emit 461 nm). On näha värvinud tuumad , eukromatiin.

.DOCX Laadi alla originaalfail 25 lk · .docx · 78 allalaadimist

50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.

~ 25 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2016-05-02 Kuupäev, millal dokument üles laeti

78 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

vladaviva Õppematerjali autor

Molekulaar- ja raku bioloogia Praktikumi Aruanne, kaitstud a. 2016, kiidetud heaks

rakud antikeha plasmiid geel praktikum membraan antikehad fluorokroom

Sarnased õppematerjalid

docx

Molekulaarbioloogia aruanne

Tallinna Tehnikaülikool Matemaatika-loodusteaduskond Geenitehnoloogia Instituut Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum YTM0012 MOLEKULAARBIOLOOGIA PRAKTIKUM Pipeteerimine Automaatpipetiga pipeteerimise põhitõed  Pipeteerimisel on kõige olulisem võtta õige suurusega pipett  Pipeteeritav vedelik peab olema homogeenne. Seintelt ja korgi küljest tuleks tilgad ja kondensaat põhja fuugida  Enne pipeteeritavasse lahusesse viimist vajuta kolb esimese astmeni alla. Pipeti

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

doc

Molekulaar- ja rakubioloogia

Tallinna Tehnikaülikool Matemaatika-Loodusteaduskond Geenitehnoloogia Instituut Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum Aruanne Koostanud: Luise Tiks YASB61 112332 Tallinn 2014 Pipeteerimine Harjutus 1 1 ml pipetti kasutades pipeteerisin 15-ml falconisse 1,65 ml detergenti, 3,85 ml vett (kokku 5,5 ml 30% lahust). Detergendi pipeteerimiseks kasutasin pahupidi tehnikat.

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

docx

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum ARUANNE Ave Tüür 155356 YAGB41 Kevadsemester 2017 Tallinna Tehnikaülikool Pipeteerimine 8. veebruar I HARJUTUS Eesmärk: Õppida õigesti pipeteerima. Materjalid: Arvutused:  Pesuvahendi kontsentraat Pesuvahendit on vaja: 5,5 ×30  Vesi 100 = 1,65ml  Pipetid ja otsikud 5,5−2 ×1,55=2,4 ( ml )  15ml falkon tuub 2,4 ÷ 0,2=12  1,5 ml tuubid  PCR plaadi tükk Töö käik:  Teen 15-ml falkon tuubi 5,5ml 30% homogeenset pesuvahendilahust  Võtan kaks 1,5ml- tuubi ning pipeteerin mõlemasse 1,55ml lah

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

docx

Molekulaarbioloogia protokoll

Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2012 a) Nimi: Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin metüleeritakse (replikatsioonijärgselt aitab eristada värskelt sünteesitud DNA ahelat vanast ahelast). Ekspresseeruvate geenide promootorpiirkondi ei metüleerita. Metüleeritud tsütosiin allub kergesti spontaansele de

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

doc

Molekulaarbioloogia praktikumi protokoll

Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2013 a) Nimi: YAGB41 Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin metüleeritakse (replikatsioonijärgselt aitab eristada värskelt sünteesitud DNA ahelat vanast ahelast).

Molekulaarbioloogia

docx

Immunoloogia praktikumi protokoll

Tallinna Tehnikaülikool IMMUNOLOOGIA Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB41 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,, laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri, mis on kindla suurusega valkude segu (selle järgi teeme hiljem kindlaks enda uuritud valgu suuruse, kD). Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine geel), Kontsentreeriv geel (ülemine 10% geel) , 4% Vesi

Meditsiin

docx

Immunoloogia praktikumi protokoll

Tallinna Tehnikaülikool Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: Agnes Kivistik 112483YAGB42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES  Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist.  Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH - rühma tõttu.  Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine Kontsentreeriv geel geel), (Ülemine geel) , 4% 10% Vesi 4,5 ml 3 ml 4x separating(

Immunoloogia i

docx

Immunoloogia praktikumi protokoll

Tallinna Tehnikaülikool Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB-42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,,laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Ge

Immunoloogia i

Rohkem sarnaseid